JP6736574B2 - 検出方法及びキット - Google Patents
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Description
本発明は一般に、水、食物、土等の複合マトリックス中に存在する汚染物質への暴露を評価することに関する。本発明は更に、創薬プログラムにおける分子スクリーニングにも有用であり得る。
アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）は、合成化学物質及び環境化学物質や食物分子及び内在性分子を含めた広範な化学物質によって結合及び活性化されるタンパク質である。ＡｈＲは、特定の生理学的状況に対する応答として遺伝子転写を刺激することができる化学物質／生体異物依存性の細胞内受容体である。
近年、この受容体への関心が高まっている。多くの分子は、世界中に存在する汚染物質である多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）のようなＡｈＲを介して結合し、その効果を発現することが示されている。ダイオキシンＴＣＤＤ（現在知られる最も有力な非遺伝毒性腫瘍促進物質の１つ）の毒性は、この受容体を介してほぼ排他的に媒介される。
また、ＡｈＲの正確な役割は依然として分かっていないが、最近の研究では腫瘍発生における役割が示唆されている。ＡｈＲはいくつかの分子と結合することができ、これらは二次メッセンジャーシグナルを介して毒性を発揮するアゴニストとして、又はアンタゴニストとして作用して、あらゆる活性をブロックすることができる。例えば、緑茶及び紅茶中の色素等の分子は、それらの抗酸化機能（腫瘍発生におけるＡｈＲ活性の遮断）の基礎をなすと考えられるアンタゴニスト活性を有する。
アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）は、種々の疎水性天然及び合成化学物質の生物学的及び毒物学的作用の多くを媒介するリガンド依存性転写因子である。
現在、ＡｈＲへの結合をインビトロで測定するためのキットがいくつか市販されているが、以下に示すように、いずれも免疫アッセイ（Ａｈ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（登録商標）キット）、細胞培養（Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ）、又は放射性標識分子に基づくものである。
・Ａｈ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（登録商標）キット（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）は、取り扱いが複雑であり、抗体及び特定の追加的なタンパク質を使用するため比較的コストが高い。
・Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ ＰＸＲは、ＣＹＰ１Ａ２プロモーターを有する特定のＡｈＲ調節レポーター遺伝子を有する安定なヒト１Ａ２−ＤＲＥ細胞株を使用することにより、細胞における受容体活性化の定量化を可能にする。この場合のシステムでは、必ずしも全ての研究室において一般的とはいえない、細胞培養の専門知識が必要とされる。さらに、細胞培養は時間もコストもかかる技術である。
・放射性標識法は、低親和性リガンド（Phelan D, Winter GM, Rogers WJ, Lam JC, and Denison MS, 1998, Activation of the Ah receptor signal transduction pathway by bilirubin and biliverdin. Arch Biochem Biophys 357: 155-163）の競合を可能にする［３Ｈ］ダイオキシンや［１２５Ｉ］ダイオキシン等の放射性標識リガンドに基づく標識法である。これらの技術では、一般的でない放射性化合物を処理するための設備及び要員が必要となる。さらに、ダイオキシン類は腫瘍形成性化合物である。
したがって、既存の解決策は、高価な抗体を使用するもの、感度が不十分であるもの、又は、毒性若しくは放射性化学物質を使用するものであるため、アッセイに時間を要するとともに技術的にも煩雑で高コストである。
Phelan D, Winter GM, Rogers WJ, Lam JC, and Denison MS, 1998, Activation of the Ah receptor signal transduction pathway by bilirubin and biliverdin. Arch Biochem Biophys 357: 155-163
本発明の一目的は、取り扱いが単純で感度も高く結果が短時間で得られる、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）結合活性のアッセイを提供することである。
上記問題の少なくともいくつかを解決し、上記目的を達成するために、本発明は、第１の態様において、好ましくは定量分析のための結合アッセイにおける、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの蛍光リガンドプローブとしての使用を提案する。特に好ましい一態様において、本発明は、とりわけ競合結合アッセイにおける、組換えアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）タンパク質と組み合わせた、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの蛍光リガンドプローブとしての使用に関するものである。
実際、本発明者らは、エチル‐５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートが、疎水性条件下のスペクトルと比較して、親水性環境では著しく異なる発光スペクトルを有する蛍光シグナルを示すことを見出した。実際、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、２８０ｎｍ励起時、疎水性有機溶媒中では３２８ｎｍ及び４５０ｎｍに発光ピークを示すのに対して、親水性環境では３３０ｎｍでしか発光しない。
また、本発明者らは、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートが、特に既知の毒性化合物や汚染物質等の一般的なＡｈＲリガンドによる競合結合アッセイの形態の結合アッセイに適した、ＡｈＲに対する結合能力を示すことも見出した。実際、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、この受容体と他の化合物との競合を可能にする程度の高い結合親和性を示したが、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートをＡｈＲから置換できなくなるほど（したがってかかる化合物の存在下で蛍光修飾ができなくなるほど）過度に高い結合親和性は示さなかった。実際、５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートをＡｈＲに加えると、ＡｈＲの活性部位に結合することにより（親油性環境）、約４５０ｎｍ±１０ｎｍに最大値を有する発光ピークが現れることが確認されている。このような発光ピークの存在及び強度により、ＡｈＲタンパク質、特に組換えタンパク質のような適切なタンパク質に対するエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの結合を定性的に測定すること、より重要なことには定量的に測定することが可能となる。
他の一態様において、本発明は、試料中の疑わしいアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）リガンドの検出又は定量分析方法であって、
（ａ）少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドを含む可能性のある試料を準備するステップと、
（ｂ）前記試料と、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートに既に結合され、又は、結合可能な若しくは結合前の 組換えＡｈＲタンパク質を含む組成物とを混合するステップと、
（ｃ）蛍光分光法によって前記試料中の前記少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドの存在又は総量を判定するステップとを含む方法を提供する。
（ａ）少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドを含む可能性のある試料を準備するステップと、
（ｂ）前記試料と、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートに既に結合され、又は、結合可能な若しくは結合前の 組換えＡｈＲタンパク質を含む組成物とを混合するステップと、
（ｃ）蛍光分光法によって前記試料中の前記少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドの存在又は総量を判定するステップとを含む方法を提供する。
したがって、かかる方法によれば、約４５０ｎｍ±１０ｎｍの発光ピークを測定することにより、競合結合アッセイにおけるＡｈＲ結合部位上のエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートと競合する化合物の存在又は量を判定することも可能となる。なお、上記ステップ（ｂ）において、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、ＡｈＲタンパク質に既に結合されていることが好ましいが、別法として、両化合物が結合可能な状態にあること、つまり、本発明の文脈では混合中に別々に加えてもよいことに留意されたい。競合分子が存在しない場合にピークは最大となるが、競合化合物の量が増加すると、ＡｈＲの関連部位におけるエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの存在がその分減少し、それにより前記波長における発光強度も減少する。したがって、４５０ｎｍ前後の発光ピークの強度は、試料中の疑わしいＡｈＲリガンドの検出に加えて定量分析にも問題なく使用することができる。
本方法の好ましい一実施形態において、組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォーム、好ましくはＡｈＲ２アイソフォームによってコードされる６００アミノ酸組換えタンパク質である。特に、該ＡｈＲアイソフォームは、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームの配列をコードする遺伝子を大腸菌中で発現させることによって得ることができる。
本方法の他の好ましい一実施形態において、蛍光分光法は分極蛍光分光法である。
前述のとおり、試料中の疑わしいアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）リガンドの既知の検出又は定量分析方法は、時間がかかり技術的に煩雑で高コストである。本発明の方法は、これら従来の方法と以下の点で異なる。まず、従来の方法と比較して高速な点が挙げられる。例えば、上記ステップ（ｂ）及び（ｃ）は６時間以内に、好ましくは３時間以内に完了する。次に、技術的に簡単な点が挙げられる。基本的には試薬と試料を混合するだけでよく、ＡｈＲタンパク質からのエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの競合的置換が一定のインキュベーション時間で達成でき、既存の一般的な蛍光装置を用いて４５５ｎｍピークの測定を行うことができる。最後に、特別な装置も多数の試薬も必要としないので、既知の方法に比べて低コストである。本方法において、蛍光分光法は、親水性環境における発光スペクトルと疎水性条件における発光スペクトルとに基づいて判別されることが好ましい。
他の一態様として、本発明は、試料中の疑わしいアリール炭化水素受容体リガンドの検出又は定量分析用キットであって、２つの組成物において別々に結合した、又は好ましくは単一の組成物において結合した、組換えＡｈＲタンパク質と、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートとを含むキットを提供する。好ましくは、組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームによりコードされる６００アミノ酸組換えタンパク質であり、好ましくは、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームの配列をコードする遺伝子を大腸菌中で発現させることによって得られる。
本発明は、様々な応用例及び用途に有用であり得る。したがって、他の一態様において、本発明は、例えば、未知の化合物のＡｈＲに対する結合能力を判定するためのスクリーニング；ＡｈＲに結合可能なリガンドの存在を評価するための未知の化学的混合物の分析；水、食物、若しくは堆積物からの多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）のスクリーニング；水、食物、若しくは堆積物中のＰＡＨ若しくはダイオキシン様化合物のスクリーニング；水及び廃水処理プラントでの汚染物質除去試験；水の再利用試験；焼却炉プラントでのダイオキシン様化合物の存在試験；又はＰＡＨ若しくはダイオキシン様化合物に暴露されたヒト若しくは動物の体液試験のための、本明細書に記載の方法又はキットの使用も企図する。ただし、これらは本発明を実施することによって決定され得る用途の単なる例示にすぎない。特許請求の範囲に包含される他の用途及び応用例も本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。
以下、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態を例示する。
非限定的な実施形態に関する以下の詳細な説明を添付の図面と併せて読めば、本発明の更なる詳細及び利点が理解されるであろう。
本発明者らは、大腸菌細胞中のゼブラフィッシュ由来のＡｈＲ２のコード遺伝子配列を発現させて、６００アミノ酸の組換えタンパク質を高収率で産生させた。タンパク質の精製は、ヒスチジンタグアフィニティーカラムを使用して行った。本例で用いたプロトコルでは、正しく折りたたまれた純粋なタンパク質の良好な収率を得ることができた。
本発明者らは、既知の方法の代替としてアリール炭化水素受容体結合活性についてのアッセイを開発し、どの分子がインビトロリガンドとして競合結合アッセイを構築し、該分子を蛍光性にする又は該分子の蛍光性を高める上で最も適しているかを調査した。本発明者らは、２８０ｎｍ励起時に、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートが疎水性有機溶媒中では３２８ｎｍと４５６ｎｍに発光ピークを示す高蛍光発光体となることを見出した（図１、３２８ｎｍの１番上の線参照）。エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、濃度が同じでも水性緩衝液環境中では非常に低い蛍光シグナルを有する（図１、３２８ｎｍの１番下の線参照）。緩衝液環境のＡｈＲタンパク質（図１、３２８ｎｍの下から２番目の線参照）は、２８０ｎｍ励起時に約３３０ｎｍでしか発光しない。Ａｈｒ（図１、３２８ｎｍの上から２番目の線参照）にエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートを常に同じ濃度で加えると、エチル５，１１−ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートのＡｈＲの活性部位への結合により、４５０ｎｍに最大の発光ピークが現れる。実際、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートがＡｈＲのリガンドである場合、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、水性環境（緩衝液）からより疎水性の高い環境（ＡｈＲ受容体の疎水性内部結合部位）に移動するが、これにより４５０ｎｍの蛍光発光が増加する。
＜競合アッセイ＞
エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートがＡｈＲの活性部位の内部で実際に結合していることを確認するために、更なる検討を行った。本発明者らは、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートを置換する競合分子として既知のリガンドを添加することにより、４５０ｎｍでのシグナルの減少を観察できるかどうかを試験した。エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、活性部位に結合している場合にのみＡｈＲから線形的に置換すべきである。ＡｈＲとエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートのプレインキュベート溶液に４種の異なる競合物質を濃度を増加させながら添加した。いずれの場合も、競合物質の濃度が増加するほど４５０ｎｍのピークが減少した。添加は１０分ごとに行った。本アッセイは、０〜０．２μＭ（０〜２００ｎＭ）の範囲で線形応答を示す。この濃度範囲では競合物質の存在を定量化することができる。より高い濃度の競合物質ではシグナルはそれ以上低下せず、つまり、いずれの５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートもＡｈＲの活性部位から置換されている。競合物質は、反応の総体積が変化することでシグナルの変動が生じないように、ごく少量だけ加えた。４５０ｎｍでのピーク強度の減少が溶媒効果によるものではないことを実証するために、緩衝液及び溶媒のみを使用して競合物質を溶解した対照試料も調製した。
エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートがＡｈＲの活性部位の内部で実際に結合していることを確認するために、更なる検討を行った。本発明者らは、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートを置換する競合分子として既知のリガンドを添加することにより、４５０ｎｍでのシグナルの減少を観察できるかどうかを試験した。エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、活性部位に結合している場合にのみＡｈＲから線形的に置換すべきである。ＡｈＲとエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートのプレインキュベート溶液に４種の異なる競合物質を濃度を増加させながら添加した。いずれの場合も、競合物質の濃度が増加するほど４５０ｎｍのピークが減少した。添加は１０分ごとに行った。本アッセイは、０〜０．２μＭ（０〜２００ｎＭ）の範囲で線形応答を示す。この濃度範囲では競合物質の存在を定量化することができる。より高い濃度の競合物質ではシグナルはそれ以上低下せず、つまり、いずれの５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートもＡｈＲの活性部位から置換されている。競合物質は、反応の総体積が変化することでシグナルの変動が生じないように、ごく少量だけ加えた。４５０ｎｍでのピーク強度の減少が溶媒効果によるものではないことを実証するために、緩衝液及び溶媒のみを使用して競合物質を溶解した対照試料も調製した。
図２には、ＡｈＲとエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートのプレインキュベート溶液の蛍光発光スペクトルと、ＡｈＲの既知のリガンドの連続添加量を示す。
図２の左側のグラフには、ＡｈＲとエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートのプレインキュベート溶液の蛍光発光スペクトル（４５０ｎｍにおける最も高いスペクトル）と、既知のリガンドの連続添加が示されている。右側のグラフには、既知のリガンドの濃度増加に伴う４５０ｎｍのピーク強度変化が示されている。
これらの結果は、汚染物質及び毒性に関連する重要な物質の中でもとりわけＡｈＲリガンドを検出及び測定するための、特にＡｈＲタンパク質と組み合わせた蛍光分光法による定性的及び定量的検出において、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートが問題なく使用できることを示している。
Claims (15)
- エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの、蛍光リガンドプローブとしての使用。
- 前記エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートを定量分析のための結合アッセイに使用する、請求項１に記載の使用。
- 組換えアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）タンパク質と組み合わせた、請求項１又は２に記載の使用。
- 前記エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートを競合結合アッセイに使用する、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
- 試料中の疑わしいアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）リガンドの検出又は定量分析方法であって、
（ａ）少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドを含む可能性のある試料を準備するステップと、
（ｂ）前記試料と、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートに結合した又は結合可能な組換えＡｈＲタンパク質を含む組成物とを混合するステップと、
（ｃ）蛍光分光法によって前記試料中の前記少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドの存在又は総量を判定するステップと
を含む方法。 - 前記ステップ（ｃ）における判定は、４５０ｎｍ±１０ｎｍの波長における発光ピーク強度の測定に基づいて行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- 前記組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームによりコードされる６００アミノ酸組換えタンパク質であることを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
- 前記組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームの配列をコードする遺伝子を大腸菌中で発現させることによって得られることを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
- 蛍光分光法が分極蛍光分光法であることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ（ｂ）及び（ｃ）が６時間以内に完了することを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光分光法が、親水性環境における発光スペクトルと疎水性条件における発光スペクトルとに基づいて判別されることを特徴とする、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中の疑わしいアリール炭化水素受容体リガンドの検出又は定量分析用キットであって、２つの組成物において別々に結合した、又は単一の組成物において結合した、組換えＡｈＲタンパク質と、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートとを含むキット。
- 前記組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームによりコードされる６００アミノ酸組換えタンパク質であることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
- 前記組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームの配列をコードする遺伝子を大腸菌中で発現させることによって得られることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載のキット。
- ＡｈＲに対する結合能力を判定するための未知の化合物のスクリーニング；
ＡｈＲに結合可能なリガンドの存在を評価するための未知の化学的混合物の分析；
水、食物、若しくは堆積物からの多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）のスクリーニング；
水、食物、若しくは堆積物中のＰＡＨ若しくはダイオキシン様化合物のスクリーニング；
水及び廃水処理プラントでの汚染物質除去試験；
水の再利用試験；焼却炉プラントでのダイオキシン様化合物の存在試験；又は
ＰＡＨ若しくはダイオキシン様化合物に暴露されたヒト若しくは動物の体液試験
のための、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法又は請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のキットの使用。
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