JP6736574B2 - 検出方法及びキット - Google Patents
検出方法及びキット Download PDFInfo
- Publication number
- JP6736574B2 JP6736574B2 JP2017546881A JP2017546881A JP6736574B2 JP 6736574 B2 JP6736574 B2 JP 6736574B2 JP 2017546881 A JP2017546881 A JP 2017546881A JP 2017546881 A JP2017546881 A JP 2017546881A JP 6736574 B2 JP6736574 B2 JP 6736574B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ahr
- recombinant
- dihydroindolo
- carbazole
- carboxylate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 8
- 102000003984 Aryl Hydrocarbon Receptors Human genes 0.000 claims description 78
- 108090000448 Aryl Hydrocarbon Receptors Proteins 0.000 claims description 78
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 28
- BOPARTZFXUIWDL-UHFFFAOYSA-N ethyl 5,11-dihydroindolo[3,2-b]carbazole-12-carboxylate Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C1C3=CC=CC=C3NC1=C2C(=O)OCC BOPARTZFXUIWDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims description 10
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims description 10
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 claims description 10
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 125000005575 polycyclic aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 8
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000185 dioxinlike effect Effects 0.000 claims description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 claims description 5
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 claims description 4
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 claims description 4
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 claims description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 claims description 2
- UZRJWXGXZKPSJO-UHFFFAOYSA-N 9h-carbazole-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2C3=CC(C(=O)O)=CC=C3NC2=C1 UZRJWXGXZKPSJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 4
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 4
- HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin Chemical compound O1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2OC2=C1C=C(Cl)C(Cl)=C2 HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- LCYJXEOHLAEURY-UHFFFAOYSA-N 5,11-dihydroindolo[3,2-b]carbazole-12-carboxylic acid Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C1C3=CC=CC=C3NC1=C2C(=O)O LCYJXEOHLAEURY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N Biliverdin Natural products CC1=C(C=C)C(=C/C2=NC(=Cc3[nH]c(C=C/4NC(=O)C(=C4C)C=C)c(C)c3CCC(=O)O)C(=C2C)CCC(=O)O)NC1=O GWZYPXHJIZCRAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N Biliverdin IX Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(\C=C/2C(=C(C)C(=C/C=3C(=C(C=C)C(=O)N=3)C)/N\2)CCC(O)=O)N1 RCNSAJSGRJSBKK-NSQVQWHSSA-N 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N biliverdin-IXalpha Natural products N1C(=O)C(C)=C(C=C)C1=CC1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C=C)C(=O)N3)C)=N2)CCC(O)=O)N1 QBUVFDKTZJNUPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- HIZVCIIORGCREW-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxene Chemical compound C1COC=CO1 HIZVCIIORGCREW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000008144 Cytochrome P-450 CYP1A2 Human genes 0.000 description 1
- 108010074922 Cytochrome P-450 CYP1A2 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000006468 Thea sinensis Nutrition 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 235000020279 black tea Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002013 dioxins Chemical class 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000003256 environmental substance Substances 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 235000009569 green tea Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 102000027411 intracellular receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008582 intracellular receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 231100000804 nongenotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 239000000717 tumor promoter Substances 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002034 xenobiotic effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
本発明は一般に、水、食物、土等の複合マトリックス中に存在する汚染物質への暴露を評価することに関する。本発明は更に、創薬プログラムにおける分子スクリーニングにも有用であり得る。
アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）は、合成化学物質及び環境化学物質や食物分子及び内在性分子を含めた広範な化学物質によって結合及び活性化されるタンパク質である。ＡｈＲは、特定の生理学的状況に対する応答として遺伝子転写を刺激することができる化学物質／生体異物依存性の細胞内受容体である。
近年、この受容体への関心が高まっている。多くの分子は、世界中に存在する汚染物質である多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）のようなＡｈＲを介して結合し、その効果を発現することが示されている。ダイオキシンＴＣＤＤ（現在知られる最も有力な非遺伝毒性腫瘍促進物質の１つ）の毒性は、この受容体を介してほぼ排他的に媒介される。
また、ＡｈＲの正確な役割は依然として分かっていないが、最近の研究では腫瘍発生における役割が示唆されている。ＡｈＲはいくつかの分子と結合することができ、これらは二次メッセンジャーシグナルを介して毒性を発揮するアゴニストとして、又はアンタゴニストとして作用して、あらゆる活性をブロックすることができる。例えば、緑茶及び紅茶中の色素等の分子は、それらの抗酸化機能（腫瘍発生におけるＡｈＲ活性の遮断）の基礎をなすと考えられるアンタゴニスト活性を有する。
アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）は、種々の疎水性天然及び合成化学物質の生物学的及び毒物学的作用の多くを媒介するリガンド依存性転写因子である。
現在、ＡｈＲへの結合をインビトロで測定するためのキットがいくつか市販されているが、以下に示すように、いずれも免疫アッセイ（Ａｈ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（登録商標）キット）、細胞培養（Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ）、又は放射性標識分子に基づくものである。
・Ａｈ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（登録商標）キット（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）は、取り扱いが複雑であり、抗体及び特定の追加的なタンパク質を使用するため比較的コストが高い。
・Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ ＰＸＲは、ＣＹＰ１Ａ２プロモーターを有する特定のＡｈＲ調節レポーター遺伝子を有する安定なヒト１Ａ２−ＤＲＥ細胞株を使用することにより、細胞における受容体活性化の定量化を可能にする。この場合のシステムでは、必ずしも全ての研究室において一般的とはいえない、細胞培養の専門知識が必要とされる。さらに、細胞培養は時間もコストもかかる技術である。
・放射性標識法は、低親和性リガンド（Phelan D, Winter GM, Rogers WJ, Lam JC, and Denison MS, 1998, Activation of the Ah receptor signal transduction pathway by bilirubin and biliverdin. Arch Biochem Biophys 357: 155-163）の競合を可能にする［３Ｈ］ダイオキシンや［１２５Ｉ］ダイオキシン等の放射性標識リガンドに基づく標識法である。これらの技術では、一般的でない放射性化合物を処理するための設備及び要員が必要となる。さらに、ダイオキシン類は腫瘍形成性化合物である。
したがって、既存の解決策は、高価な抗体を使用するもの、感度が不十分であるもの、又は、毒性若しくは放射性化学物質を使用するものであるため、アッセイに時間を要するとともに技術的にも煩雑で高コストである。
Phelan D, Winter GM, Rogers WJ, Lam JC, and Denison MS, 1998, Activation of the Ah receptor signal transduction pathway by bilirubin and biliverdin. Arch Biochem Biophys 357: 155-163
本発明の一目的は、取り扱いが単純で感度も高く結果が短時間で得られる、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）結合活性のアッセイを提供することである。
上記問題の少なくともいくつかを解決し、上記目的を達成するために、本発明は、第１の態様において、好ましくは定量分析のための結合アッセイにおける、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの蛍光リガンドプローブとしての使用を提案する。特に好ましい一態様において、本発明は、とりわけ競合結合アッセイにおける、組換えアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）タンパク質と組み合わせた、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの蛍光リガンドプローブとしての使用に関するものである。
実際、本発明者らは、エチル‐５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートが、疎水性条件下のスペクトルと比較して、親水性環境では著しく異なる発光スペクトルを有する蛍光シグナルを示すことを見出した。実際、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、２８０ｎｍ励起時、疎水性有機溶媒中では３２８ｎｍ及び４５０ｎｍに発光ピークを示すのに対して、親水性環境では３３０ｎｍでしか発光しない。
また、本発明者らは、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートが、特に既知の毒性化合物や汚染物質等の一般的なＡｈＲリガンドによる競合結合アッセイの形態の結合アッセイに適した、ＡｈＲに対する結合能力を示すことも見出した。実際、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、この受容体と他の化合物との競合を可能にする程度の高い結合親和性を示したが、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートをＡｈＲから置換できなくなるほど（したがってかかる化合物の存在下で蛍光修飾ができなくなるほど）過度に高い結合親和性は示さなかった。実際、５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートをＡｈＲに加えると、ＡｈＲの活性部位に結合することにより（親油性環境）、約４５０ｎｍ±１０ｎｍに最大値を有する発光ピークが現れることが確認されている。このような発光ピークの存在及び強度により、ＡｈＲタンパク質、特に組換えタンパク質のような適切なタンパク質に対するエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの結合を定性的に測定すること、より重要なことには定量的に測定することが可能となる。
他の一態様において、本発明は、試料中の疑わしいアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）リガンドの検出又は定量分析方法であって、
（ａ）少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドを含む可能性のある試料を準備するステップと、
（ｂ）前記試料と、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートに既に結合され、又は、結合可能な若しくは結合前の 組換えＡｈＲタンパク質を含む組成物とを混合するステップと、
（ｃ）蛍光分光法によって前記試料中の前記少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドの存在又は総量を判定するステップとを含む方法を提供する。
（ａ）少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドを含む可能性のある試料を準備するステップと、
（ｂ）前記試料と、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートに既に結合され、又は、結合可能な若しくは結合前の 組換えＡｈＲタンパク質を含む組成物とを混合するステップと、
（ｃ）蛍光分光法によって前記試料中の前記少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドの存在又は総量を判定するステップとを含む方法を提供する。
したがって、かかる方法によれば、約４５０ｎｍ±１０ｎｍの発光ピークを測定することにより、競合結合アッセイにおけるＡｈＲ結合部位上のエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートと競合する化合物の存在又は量を判定することも可能となる。なお、上記ステップ（ｂ）において、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、ＡｈＲタンパク質に既に結合されていることが好ましいが、別法として、両化合物が結合可能な状態にあること、つまり、本発明の文脈では混合中に別々に加えてもよいことに留意されたい。競合分子が存在しない場合にピークは最大となるが、競合化合物の量が増加すると、ＡｈＲの関連部位におけるエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの存在がその分減少し、それにより前記波長における発光強度も減少する。したがって、４５０ｎｍ前後の発光ピークの強度は、試料中の疑わしいＡｈＲリガンドの検出に加えて定量分析にも問題なく使用することができる。
本方法の好ましい一実施形態において、組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォーム、好ましくはＡｈＲ２アイソフォームによってコードされる６００アミノ酸組換えタンパク質である。特に、該ＡｈＲアイソフォームは、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームの配列をコードする遺伝子を大腸菌中で発現させることによって得ることができる。
本方法の他の好ましい一実施形態において、蛍光分光法は分極蛍光分光法である。
前述のとおり、試料中の疑わしいアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）リガンドの既知の検出又は定量分析方法は、時間がかかり技術的に煩雑で高コストである。本発明の方法は、これら従来の方法と以下の点で異なる。まず、従来の方法と比較して高速な点が挙げられる。例えば、上記ステップ（ｂ）及び（ｃ）は６時間以内に、好ましくは３時間以内に完了する。次に、技術的に簡単な点が挙げられる。基本的には試薬と試料を混合するだけでよく、ＡｈＲタンパク質からのエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの競合的置換が一定のインキュベーション時間で達成でき、既存の一般的な蛍光装置を用いて４５５ｎｍピークの測定を行うことができる。最後に、特別な装置も多数の試薬も必要としないので、既知の方法に比べて低コストである。本方法において、蛍光分光法は、親水性環境における発光スペクトルと疎水性条件における発光スペクトルとに基づいて判別されることが好ましい。
他の一態様として、本発明は、試料中の疑わしいアリール炭化水素受容体リガンドの検出又は定量分析用キットであって、２つの組成物において別々に結合した、又は好ましくは単一の組成物において結合した、組換えＡｈＲタンパク質と、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートとを含むキットを提供する。好ましくは、組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームによりコードされる６００アミノ酸組換えタンパク質であり、好ましくは、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームの配列をコードする遺伝子を大腸菌中で発現させることによって得られる。
本発明は、様々な応用例及び用途に有用であり得る。したがって、他の一態様において、本発明は、例えば、未知の化合物のＡｈＲに対する結合能力を判定するためのスクリーニング；ＡｈＲに結合可能なリガンドの存在を評価するための未知の化学的混合物の分析；水、食物、若しくは堆積物からの多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）のスクリーニング；水、食物、若しくは堆積物中のＰＡＨ若しくはダイオキシン様化合物のスクリーニング；水及び廃水処理プラントでの汚染物質除去試験；水の再利用試験；焼却炉プラントでのダイオキシン様化合物の存在試験；又はＰＡＨ若しくはダイオキシン様化合物に暴露されたヒト若しくは動物の体液試験のための、本明細書に記載の方法又はキットの使用も企図する。ただし、これらは本発明を実施することによって決定され得る用途の単なる例示にすぎない。特許請求の範囲に包含される他の用途及び応用例も本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。
以下、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態を例示する。
非限定的な実施形態に関する以下の詳細な説明を添付の図面と併せて読めば、本発明の更なる詳細及び利点が理解されるであろう。
本発明者らは、大腸菌細胞中のゼブラフィッシュ由来のＡｈＲ２のコード遺伝子配列を発現させて、６００アミノ酸の組換えタンパク質を高収率で産生させた。タンパク質の精製は、ヒスチジンタグアフィニティーカラムを使用して行った。本例で用いたプロトコルでは、正しく折りたたまれた純粋なタンパク質の良好な収率を得ることができた。
本発明者らは、既知の方法の代替としてアリール炭化水素受容体結合活性についてのアッセイを開発し、どの分子がインビトロリガンドとして競合結合アッセイを構築し、該分子を蛍光性にする又は該分子の蛍光性を高める上で最も適しているかを調査した。本発明者らは、２８０ｎｍ励起時に、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートが疎水性有機溶媒中では３２８ｎｍと４５６ｎｍに発光ピークを示す高蛍光発光体となることを見出した（図１、３２８ｎｍの１番上の線参照）。エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、濃度が同じでも水性緩衝液環境中では非常に低い蛍光シグナルを有する（図１、３２８ｎｍの１番下の線参照）。緩衝液環境のＡｈＲタンパク質（図１、３２８ｎｍの下から２番目の線参照）は、２８０ｎｍ励起時に約３３０ｎｍでしか発光しない。Ａｈｒ（図１、３２８ｎｍの上から２番目の線参照）にエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートを常に同じ濃度で加えると、エチル５，１１−ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートのＡｈＲの活性部位への結合により、４５０ｎｍに最大の発光ピークが現れる。実際、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートがＡｈＲのリガンドである場合、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、水性環境（緩衝液）からより疎水性の高い環境（ＡｈＲ受容体の疎水性内部結合部位）に移動するが、これにより４５０ｎｍの蛍光発光が増加する。
＜競合アッセイ＞
エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートがＡｈＲの活性部位の内部で実際に結合していることを確認するために、更なる検討を行った。本発明者らは、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートを置換する競合分子として既知のリガンドを添加することにより、４５０ｎｍでのシグナルの減少を観察できるかどうかを試験した。エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、活性部位に結合している場合にのみＡｈＲから線形的に置換すべきである。ＡｈＲとエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートのプレインキュベート溶液に４種の異なる競合物質を濃度を増加させながら添加した。いずれの場合も、競合物質の濃度が増加するほど４５０ｎｍのピークが減少した。添加は１０分ごとに行った。本アッセイは、０〜０．２μＭ（０〜２００ｎＭ）の範囲で線形応答を示す。この濃度範囲では競合物質の存在を定量化することができる。より高い濃度の競合物質ではシグナルはそれ以上低下せず、つまり、いずれの５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートもＡｈＲの活性部位から置換されている。競合物質は、反応の総体積が変化することでシグナルの変動が生じないように、ごく少量だけ加えた。４５０ｎｍでのピーク強度の減少が溶媒効果によるものではないことを実証するために、緩衝液及び溶媒のみを使用して競合物質を溶解した対照試料も調製した。
エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートがＡｈＲの活性部位の内部で実際に結合していることを確認するために、更なる検討を行った。本発明者らは、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートを置換する競合分子として既知のリガンドを添加することにより、４５０ｎｍでのシグナルの減少を観察できるかどうかを試験した。エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートは、活性部位に結合している場合にのみＡｈＲから線形的に置換すべきである。ＡｈＲとエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートのプレインキュベート溶液に４種の異なる競合物質を濃度を増加させながら添加した。いずれの場合も、競合物質の濃度が増加するほど４５０ｎｍのピークが減少した。添加は１０分ごとに行った。本アッセイは、０〜０．２μＭ（０〜２００ｎＭ）の範囲で線形応答を示す。この濃度範囲では競合物質の存在を定量化することができる。より高い濃度の競合物質ではシグナルはそれ以上低下せず、つまり、いずれの５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートもＡｈＲの活性部位から置換されている。競合物質は、反応の総体積が変化することでシグナルの変動が生じないように、ごく少量だけ加えた。４５０ｎｍでのピーク強度の減少が溶媒効果によるものではないことを実証するために、緩衝液及び溶媒のみを使用して競合物質を溶解した対照試料も調製した。
図２には、ＡｈＲとエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートのプレインキュベート溶液の蛍光発光スペクトルと、ＡｈＲの既知のリガンドの連続添加量を示す。
図２の左側のグラフには、ＡｈＲとエチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートのプレインキュベート溶液の蛍光発光スペクトル（４５０ｎｍにおける最も高いスペクトル）と、既知のリガンドの連続添加が示されている。右側のグラフには、既知のリガンドの濃度増加に伴う４５０ｎｍのピーク強度変化が示されている。
これらの結果は、汚染物質及び毒性に関連する重要な物質の中でもとりわけＡｈＲリガンドを検出及び測定するための、特にＡｈＲタンパク質と組み合わせた蛍光分光法による定性的及び定量的検出において、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートが問題なく使用できることを示している。
Claims (15)
- エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートの、蛍光リガンドプローブとしての使用。
- 前記エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートを定量分析のための結合アッセイに使用する、請求項１に記載の使用。
- 組換えアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）タンパク質と組み合わせた、請求項１又は２に記載の使用。
- 前記エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートを競合結合アッセイに使用する、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
- 試料中の疑わしいアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）リガンドの検出又は定量分析方法であって、
（ａ）少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドを含む可能性のある試料を準備するステップと、
（ｂ）前記試料と、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートに結合した又は結合可能な組換えＡｈＲタンパク質を含む組成物とを混合するステップと、
（ｃ）蛍光分光法によって前記試料中の前記少なくとも１つの既知又は未知のＡｈＲリガンドの存在又は総量を判定するステップと
を含む方法。 - 前記ステップ（ｃ）における判定は、４５０ｎｍ±１０ｎｍの波長における発光ピーク強度の測定に基づいて行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- 前記組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームによりコードされる６００アミノ酸組換えタンパク質であることを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
- 前記組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームの配列をコードする遺伝子を大腸菌中で発現させることによって得られることを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
- 蛍光分光法が分極蛍光分光法であることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ（ｂ）及び（ｃ）が６時間以内に完了することを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光分光法が、親水性環境における発光スペクトルと疎水性条件における発光スペクトルとに基づいて判別されることを特徴とする、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中の疑わしいアリール炭化水素受容体リガンドの検出又は定量分析用キットであって、２つの組成物において別々に結合した、又は単一の組成物において結合した、組換えＡｈＲタンパク質と、エチル５，１１‐ジヒドロインドロ［３，２‐ｂ］カルバゾール‐６‐カルボキシレートとを含むキット。
- 前記組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームによりコードされる６００アミノ酸組換えタンパク質であることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
- 前記組換えＡｈＲタンパク質は、ゼブラフィッシュ由来のＡｈＲアイソフォームの配列をコードする遺伝子を大腸菌中で発現させることによって得られることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載のキット。
- ＡｈＲに対する結合能力を判定するための未知の化合物のスクリーニング；
ＡｈＲに結合可能なリガンドの存在を評価するための未知の化学的混合物の分析；
水、食物、若しくは堆積物からの多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）のスクリーニング；
水、食物、若しくは堆積物中のＰＡＨ若しくはダイオキシン様化合物のスクリーニング；
水及び廃水処理プラントでの汚染物質除去試験；
水の再利用試験；焼却炉プラントでのダイオキシン様化合物の存在試験；又は
ＰＡＨ若しくはダイオキシン様化合物に暴露されたヒト若しくは動物の体液試験
のための、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法又は請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のキットの使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15158044.6A EP3064946A1 (en) | 2015-03-06 | 2015-03-06 | Detection method and kit |
| EP15158044.6 | 2015-03-06 | ||
| PCT/EP2016/054497 WO2016142252A1 (en) | 2015-03-06 | 2016-03-03 | Detection method and kit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018508784A JP2018508784A (ja) | 2018-03-29 |
| JP6736574B2 true JP6736574B2 (ja) | 2020-08-05 |
Family
ID=52736823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017546881A Expired - Fee Related JP6736574B2 (ja) | 2015-03-06 | 2016-03-03 | 検出方法及びキット |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10830772B2 (ja) |
| EP (2) | EP3064946A1 (ja) |
| JP (1) | JP6736574B2 (ja) |
| WO (1) | WO2016142252A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106918695B (zh) * | 2017-02-21 | 2018-09-25 | 东华大学 | 一种芳香烃受体与其介导的抗体的免疫检测方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6127136A (en) * | 1995-10-23 | 2000-10-03 | Paracelsian, Inc. | Detection of dioxin-like compounds by detection of transformed Ah receptor/ARNT complex |
| US6001868A (en) * | 1997-05-30 | 1999-12-14 | The Regents Of The University Of California | Indole-3-carbinol (I3C) derivatives and methods |
| JP2004201526A (ja) * | 2002-12-24 | 2004-07-22 | Toshiba Corp | 被検物質の体内残留性を検出する方法、核酸、蛋白質、細胞およびプローブ固定化チップ |
| US8877434B2 (en) * | 2012-04-19 | 2014-11-04 | Hsinyu Lee | Method and system of detecting dioxin-like compounds |
| WO2014050588A1 (ja) * | 2012-09-28 | 2014-04-03 | 新日鉄住金化学株式会社 | 有機電界発光素子用材料及びこれを用いた有機電界発光素子 |
-
2015
- 2015-03-06 EP EP15158044.6A patent/EP3064946A1/en not_active Withdrawn
-
2016
- 2016-03-03 WO PCT/EP2016/054497 patent/WO2016142252A1/en active Application Filing
- 2016-03-03 EP EP16707765.0A patent/EP3265816B1/en not_active Not-in-force
- 2016-03-03 JP JP2017546881A patent/JP6736574B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2016-03-03 US US15/556,148 patent/US10830772B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2016142252A1 (en) | 2016-09-15 |
| EP3265816B1 (en) | 2018-11-28 |
| US20180045731A1 (en) | 2018-02-15 |
| US10830772B2 (en) | 2020-11-10 |
| EP3265816A1 (en) | 2018-01-10 |
| JP2018508784A (ja) | 2018-03-29 |
| EP3064946A1 (en) | 2016-09-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Behnisch et al. | Bioanalytical screening methods for dioxins and dioxin-like compounds—a review of bioassay/biomarker technology | |
| US6511815B1 (en) | Method for quantitating competitive binding of molecules to proteins utilizing fluorescence polarization | |
| US20230120665A1 (en) | Composition and method for measuring thallium influx and efflux | |
| Eggen et al. | The potential of mechanism-based bioanalytical tools in ecotoxicological exposure and effect assessment | |
| Bernhard et al. | Two novel real time cell-based assays quantify beta-blocker and NSAID specific effects in effluents of municipal wastewater treatment plants | |
| JP3887670B2 (ja) | タンパク質またはペプチド間の結合を測定するための蛍光強度法 | |
| JP6736574B2 (ja) | 検出方法及びキット | |
| Song et al. | A dual-state-emission chalcone-based supramolecular probe for ratiometric detection of penconazole in environmental samples | |
| US20090113563A1 (en) | Probe for detecting nuclear receptor agonist or antagonist and method for screening agonist or antagonist to nuclear receptor with the use of the same | |
| JP2010520759A (ja) | 「順モード（ｆｏｒｗａｒｄｍｏｄｅ）」調節化合物において、ナトリウム−カルシウム交換体（ＮＣＸ）を調節する化合物を検出ための蛍光ベースのアッセイ | |
| Coriano et al. | Monitoring ligand-activated protein–protein interactions using bioluminescent resonance energy transfer (BRET) assay | |
| Wang et al. | Detection of target proteins by fluorescence anisotropy | |
| Umezawa et al. | Methods of analysis for chemicals that promote/disrupt cellular signaling | |
| Kim et al. | Dioxin-induced thrombocyte aggregation in zebrafish | |
| Feltus et al. | Detection of biotin in individual sea urchin oocytes using a bioluminescence binding assay | |
| JP3768916B2 (ja) | 内分泌撹乱物質のスクリーニング方法とそのためのキット | |
| WO2020232350A1 (en) | Assays for synthetic cannabinoids | |
| US20110117574A1 (en) | Fluorescence based assay to detect sodium/calcium exchanger "forward mode" modulating compounds | |
| Frauli et al. | Molecular Biology Techniques Applied to GPCR Allosteric and Biased Ligands | |
| JP2010075064A (ja) | 微量化学物質を検出するための核酸および方法 | |
| Nijman et al. | A Review of In Vitro Methods for the Study of Thyroid Disrupting Chemicals | |
| EMBSI | Test Substances | |
| JP2003075442A (ja) | 標的物質測定試薬、それを用いた標的物質の測定方法 | |
| Bilash et al. | Benzo [a] pyrene its influence on human organism and new nanophotonic detection method | |
| Protein-Coupled et al. | 9 High Throughput |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181128 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191001 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190930 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20191224 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200228 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200616 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200715 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6736574 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |