JPH05508772A

JPH05508772A - 蛍光エネルギー転移を利用する分析物の検出

Info

Publication number: JPH05508772A
Application number: JP91512652A
Authority: JP
Inventors: ツィエン，ロジャー，ワイ．; テイラー，スーザン，エス．; アダムス，スティーブン，アール; ジー，ユィング
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバーシティオブカリフォルニア
Priority date: 1990-07-02
Filing date: 1991-07-01
Publication date: 1993-12-09
Anticipated expiration: 2016-09-10
Also published as: EP0537270A1; US5439797A; DE69130171T2; EP0537270B1; WO1992000388A1; JP3208486B2; ATE170980T1; DE69130171D1; EP0537270A4; DK0537270T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】蛍光エネルギー転移を利用する分析物の検出本発明は、総合医療科学の国家協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＧｅｎｅｒａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ）により付与された認可番号ＧＭ３１００４及び０Ｍ１９３０１、並びに神経性及び伝染性疾患の国家協会（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）により付与された認可番号Ｎ５２７１７７のもとでの政府の援助によりなされた。

政府は本発明において一定の権利を所有する。

発明の背景本発明は分析物濃度を決定するためのフルオロクロム標識化タンパク質問のエネルギー転移に関し、そしてより詳しくは標識化ｃＡＭＰ依存性依存性タンパク− キナーゼるｃＡＭＰ濃度の決定方法に関する。

数多くの生物学的分子の機能はタンパク質及びタンパク質複合体との相互作用を介して仲介されている。数多くのこのような分子は生存細胞中で非常に微量にて見い出せる。しかしながらそれらの濃度は生理学的刺激に応答して過渡的に変化しうる。あらゆる場合において、細胞の代謝状態、ホルモン応答及び一定の病気を診断するためにこのような分子の濃度を測定することが重要である。このような微量濃度にてそのレベルがたとえ数倍変化したとしても、このような変化は検出不能である。

タンパク質相互作用を介して生物学的機能を仲介するあるこのような重要な分子はサイクリックＡＭＰ　（ｃＡＭＰ、アデノシン３’、５’−サイクリック−リン酸）である、サイクリックＡＭＰは全ての原核及び有核動物細胞において、現在までに研究された細胞内反応を調節する。これは遍在的な細胞内メディエータ −として、又は種々のホルモン誘発作用の第二メツセンジャーとして働き、この第一メツセンジャーは細胞外ホルモンである。　ｃＡＭＰレベルの上昇により仲介されるこのようなホルモン誘発作用には例えば、エピネフリン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）　、グルカゴン又は甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）により誘発される脂肪組織におけるトリグリセリド分解：バソプレシンによる腎臓における水吸収；筋肉及び肝臓におけるグリコーゲン分解；エピネフリンによる心拍数の増大及び黄体形成ホルモンに対する応答における卵巣によるプロゲステロン分泌が含まれる。　ｃＡＭＰに対するこのような種々の応答は細胞表層でのホルモン−レセプター相互作用により誘発され、そしてｃＡＭＰの細胞内合成をもたらす、従って、種々の標的細胞は、異なるが特徴的な方法においてｃＡＭＰレベルにおける上昇に応答する。

ｃＡＭＰが第二メツセンジャーとして働くためには、その細胞内濃度は厳びしくコントロールされていなくてはならず、且つホルモン−レセプター結合に応答して迅速に変化可能でなければならない０通常、ｃＡＭＰレベルは約１μＭ以下であり、そしてホルモン刺激に基づいて約５倍に上昇する。ｃＡＭＰレベルにおける上昇は酵素アデニレートサイクラーゼによるＡＴＰからの合成に基づく、この過渡的な上昇に続いて、ｃＡＭＰレベルはホスホジェステラーゼの作用を介して正常レベルにまで急速に戻る。

ｃＡＭＰ依存性ホルモン応答及びその生理学的メカニズムを効率よ（研究するには、微量濃度のｃＡＭＰを正確に測定する必要がある。より本質的には、遊離をｃＡＭＰ濃度を測定することが重要であり、なぜなら一般的に細胞内メツセンジャーの生物学的活性は遊隣なメツセンジャーの濃度によりコントロールされ且つ関連するからであり、組織破壊後に測定される総濃度は生物学的に無関係な部位に結合した物質を含んでいる。　ｃＡＭＰ濃度を測定する従来の方法は伝統的な競合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイを採用しており、そして数千又は数百万個の細胞からの抽出操作及び調製を必要としている。

このような方法は劣った空間的及び時間的分析をもたらし、そして、　全ｃＡＭＰ又は隔絶されたｃＡ肝由来の遊離又は生物学的に活性なｃＡＭＰレベルを区別することができない、更に、これらの方法は有害な腐敗し易いアイソトープの利用を必要とし、そしてそれ放置用がかかる。

有機分子、例えば腫瘍−促進ホルボールエステルはシグナル変換及び細胞生理において非常に重要である。このような分子の生物学的に活性な濃度の正確な測定はホルモン応答及び生理学的メカニズムの効率的な研究にとっても重要である。

しかしながら、単純な無機イオン、例えばカルシウムを除いて、例えばこのような分子の生物学的に活性な濃度を測定する指標システムはない、細胞内の遊離なｃＡＭＰ濃度の測定について存在しているこのような欠点のほとんどは、同様に上記の分子についても存在している。

従って、単独の生存細胞の中の遊離な細胞内ｃＡＭＰ濃度及びその他の有機分子を迅速に、効率的に、且つ非破壊的に測定するための方法の要望がある。このような発明はホルモン調節の理解にとって重要である０本発明はこの要望を満たし、且つ同様に関連する利点を提供する。

発明の概要本発明は、ｃＡＭＰ、その他の第二メツセンジャー及び有機分子の存在を決定するのに適切な標識化タンパク質を提供する。このタンパク質はフルオロクロムによって独立して標識され、これらは密接に空間的に近位している、好ましくは約６ｎ−以下にあるとき、一方のフルオロクロムから他方へのエネルギー転移を介して相互作用する。

課題の組成物（Ｓ＋ｇＡ）、（ＳｔｘＤ）−ｚを提供する（ココテ、ｓｌ及びＳ２はある状態においては会合している二種類のタンパク質であり、そして別の状態においては実質的にＭＩＩＩシており、その間の平衡は遊離な分析物の濃度によってコントロールされており、そしてＡ及びＤはフルオロクロムであり、フルオロクロムＤの発光波長はフルオロクロムＡの励起波長と重っており、そしてＡとＢの距離はこれらのフルオロクロム間のエネルギーの無放射性転移を十分に可能とするほど密接に近接している］、ＡとＤは種々のアクセプター、ドナーベアー、例えばフルオロクロムとテトラメチルローダミン及びそれらの誘導体より選ばれうる。サンプル中の分析物、例えばｃＡＭＰの濃度は、サンプルを（Ｓ■Ａ）−＋　（ＳｔｘＤ）＋ａｇと接触させ、Ｄの励起波長に近いエネルギーを提供し、そしてＡ又はＤの蛍光を測定することによって決定されることができ、ｃＡＭＰ及びその他の前記分析物の濃度はＤの発光対人の発光の比によって決定され、この比は既知の分析物濃度の対照溶液によって予め検量しておく。

図面の簡単な説明図１はｃＡＭＰを測定するために蛍光エネルギー転移の利用を表わした図解である。

図２は種々の濃度のｃＡＭＰでΦ標識化ｃＡＭＰｄＰＫの発光スペクトルを示し、そして挿入図は種々のｃＡＭＰ濃度での５２０ｎｍ対５８０ｎｍでの発光の比をプロットしている。

図３は平滑筋細胞を膜浸透性ｃＡＭＰｌ［似体によって処理した際の処理した際の単独の細胞内のｃＡＭＰの測定を示す。

初学的機能を示すアミノ酸の線状配列を表わす、この線状配列には天然タンパク質、タンパク質のドメイン及びその機能が維持されている限りタンパク質のフラグメントが含まれる。この語はポリペプチド及びペプチドも含む。

本明細書で用いる語「会合」とは、二種類のタンパク質例えば酵的に解離」又は「解離」なる語は、全ての接触領域の欠如を含む、ブユニットが会合状態にあるときを意味する。この複合体は２種類のタンパク質のそれぞれの分子を複数個含みうる。

本明細書で用いるｒ　ｃＡＦＩＰｄＰＫ」なる語は、本明細書に参考として組入れたＡｌｂｅｒｔｓら（１９８９）のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌ。

Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｔｎｇ、　Ｉｎｃ、及び５ｌｉｃｅとＴａｙｌｏｒ、　（１９８９）＋　Ｊｔ　８ｉｏ１゜Ｃｈｅｗｉ、　２６４　；　２０９４０−２０９４６に詳細のサイクリックＡＭＰ依存性タンパク質複合体を意味する。この複合体は二種類のタンパク質より構成され、これらは調節及び触媒ＩＩｉ能を示す、この語は調節及び触媒性囲でエネルギーを放出することのできる分子を意味する。従って、「励起波長」とはフルオロクロムがエネルギーを吸収する波長の範囲を意味する。「発光波長」なる語は、フルオロクロムがエネルギー又は蛍光を放出する波長の範囲である。フルオロクロムなる語はその誘導体、例えばタンパク質への結合のための化学成分も含んでいる。フルオロクロムの例はフルオロクロム及びテトラメチルローダミンである。それぞれの誘導体はフルオロセインイソチオシアネート及びテトラメチルローダミンイソチオシアネートである。

本明細書で用いる語「サンプル」は、分析物を含むと予測される材料、例えば溶液、抽出物又は完全細胞を意味する。

本明細書で用いる語「標識化」は化学成分、例えばフルオロクロムのタンパク質への結合化を意味する。この結合は典型的には共有結合を介するが、しかし同様に非共有相互作用も含みうる。従って、「標識化タンパク質」なる語は化学成分、例えばフルオロクロムが結合されているタンパク質を意味する。

本発明は（ＳＩＫＡ）−＋　（Ｓ□Ｄ）、を含んで成る課題の組成物を提供し、ここで３１及びＳｔは二種類のタンパク質であり、それらはある状態において会合しており、そして別の状態において実質的に解離しており、そしてＤ及びＡは異なるフルオロクロムであり、一方のフルオロクロムの発光波長は他方のフルオロクロムの励起波長と重複しており、ＤとＡの距離はフルオロクロム間のエネルギーの無放射・　性転移を可能とするほど十分に密接に近づいており、そしてｎｌ及びｎ２は前記タンパク質の化学量数を示し、そしてここでＳ、又はＳ２は分析物Ｘと結合することが可能であり、Ｘの結合はＳｌ及びＳ、の互いに対する親和性に影響を及ぼす。

二種類のタンパク質Ｓ、及びＳｔであってフルオロクロムにより！１識されているものは典型的には酵素のサブユニットであるが、会合及び実質的解離状態を示す任意の二種類のタンパク質を含みうる。

このようなタンパク質ペアーの例には、ｃＡＭＰ依存性依存性タンパク−キナーゼＭＰｄＰに）に関するサブユニット、ＧＴＰ−結合性タンパク質のサブユニット、カルモジュリン及びカルモジニリンタンパク質キナーゼ、並びにタンパク質キナーゼＣの調節及び触媒性ドメインである。

会合状態にあるとき、このサブユニットはタンパク質複合体、例えばホロ酵素を形成する。この複合体におけるタンパク質の数はＳＩとＳｔとの化学量数に依存して変化しうる。更に、この複合体はＳｔ及びＳ、以外のタンパク質を含みうる。この複合体におけるこのようなその他のタンパク質は、それらがＳｌ又はＳｔのいづれかとの安定な会合を維持している限り、ＳＩ又はＳ、の成分として考えらえば、ｃＡＭＰｄＰＫに関する解離状態は遊離な触媒性と調節タンパク質又はサブユニットより成る。同様に、ＧＴＰ−結合性タンパク質はアルファーとベーター−ガンマ−サブユニットへと解離し、カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼはカルモジュリンから解離し、そしてタンパク質キナーゼＣの調節及び触媒性ドメインはまず離ればなれになり、そしてタンパク質分解によってその後分離する。

無放射性エネルギー転移はフルオロクロムの生物物理学的性質を基礎とする。これらの原理はＬａｋｏｗｉｃｚ＋　Ｊ、＋　（１９８３）のＰｒ１ｎｃｉｐｌｅｓｏｆ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｃｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｗｏｒｋ及びＪｏｖｉとＪｏｖｉｎ　（１９Ｂ９）の、Ｃｅ１ｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｍｉｃｒｏｓｐｅ−ｃｔｒｏｆｌｕａｒｏｍｅｔｒｙ　（Ｅ、Ｋｏｂｅｎ　とＪ、Ｇ、旧ｒｓｃｈｂｅｒｇｌｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓに記載されており、両方とも本明細書に参考として組入れている。

簡単に述べると、フルオロクロムは特定の波長で光エネルギーを吸収する。この波長は励起波長としても知られている。フルオロクロムにより吸収されるエネルギーはその後種々の経路を介して放出され、その一つは蛍光を提供する光子の放射である。放射される光の波長は発光波長として知られ、そしてこれは特定のフルオロクロムの固有の特徴である。無放射性エネルギー転移は、一方のフルオロクロムの励起状態でのエネルギーが第二のフルオロクロムへト事実上光子放射を伴わずに転移される量子力学過程である０次にこのエネルギーはその後第二フルオロクロムの発光波長で放出されうる。

第一フルオロクロムは一般にドナー（供与体）（Ｄ）と呼ばれ、そしてアクセプター（受容体）（Ａ）と呼ばれる第二のフルオロクロムよりも高いエネルギーの励起状態を有する。この過程の本質的な特徴は、ドナーの発光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルが重複しており、そしてこのドナーとアクセプターが十分に近いことにある。無放射性エネルギー転位が有効となる距離は、ドナーの蛍光量子効率、アクセプターの吸光係数、これらに対応するスペクトルの重複の程度、媒体の屈折率及び二種類のフルオロクロムの遷移モーメントの相対的配向を含む数多（の要因に依存するが、典型的なドナー及びアクセプターの好ましいベアーにとってはそれは４〜６ｎ−である０分子間距離の最適範囲を超えると、距離の６乗の逆数としてこのエネルギー転移効率は低下する。

Ｓ、又はＳｔのいづれかと結合することのできる分析物Ｘは例えば第二メツセンジャー、例えばＣＡＭＰ％カルシウム、ｃＧＦｉＰ及びジアシルグリセロール；関連ホルモンレセプター複合体；又はを機分子、例えばホルボールエステルでありうる。このような分子と結合したとき、Ｓ、及びＳアは会合又は解離状態のいづれかとなりうる。

本発明は、Ｓｔ及びＳ、が複合体、例えばホロ酵素のタンパク質又はサブユニットである課題の組成物を提供する。このようなホロ酵素は例えばｃＡＭＰｄＰＫ、ＧＴＰ〜結合タ結合タンパクルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ及びタンパク質キナーゼＣでありうる。

あるｍ様において、本発明はＳＩがｃＡＭＰｄＰＫの調節サブユニットであり、そしてＳ２がｃＡＭＰｄＰＫの触媒性サブユニットであり、且つそれらが異なるフルオロクロムであって一方の発光波長が他方の励起波長と重複しているものにより標識されている課題の組成物も提供する。

例えばｃＡＭＰの非存在下においては、ｃＡＭＰｄＰＫの調節ＣＲ）及び触媒性（Ｃ）サブユニットは図１において示す１ｈｃｔの化学量数を有する。この複合体はキナーゼとしては不活性であり、なぜならＲサブユニットはＣサブユニットのキナーゼドメインを阻害せしめるからである。ＲへのｃＡＭＰの結合に基づき、ＲサブユニットはＣサブユニットから解離し、この後者の生物学的活性が示されるようになる。

本発明は、Ｒサブユニットを一方のフルオロクロムによって、且つＣサブユニットを別のフルオロクロムによって標識化せしめることを含み、従って完全Ｒ，Ｃ２複合体における一方のフルオロクロムによって吸収された光エネルギーは無放射性エネルギー転移の過程によって他のフルオロクロムへと転移される。この現象は、一方のフルオロクロム、即ちドナー（Ｄ）由来の蛍光発光の波長が他のフルオロクロム、即ちアクセプター（Ａ）の励起波長と重複し、且つＤ及びＡ成分がこのフルオロクロムペアー間のエネルギーの無放射性転移を可能とするほど十分に密接に近づいていることを必要とする。

フルオロセイン及びテトラメチルローダミンの場合において、この距離は約４〜６ｎ＋ｗ以下である。その他のフルオロクロムのベアーに関しては、この距離は当業者によって決定されうる。Ｄ及びＡに間する適切な選択がなされることを条件として、この密接な近位の条件はホロ酵素複合体、例えばｃＡＭＰｄＰＫに関して現実的によ（満足され、従ってかなりの効率性を伴ってエネルギー転移が生ずる。

この転移されたエネルギーはＤにより吸収される波長での励起によって容易に検出され、なぜならＤからの発光は消光し、そしてその代りとしてＡの発光の特徴である長めの波長にてエネルギーが現れるからである。

サブユニットＩ？、ＤとｃｘＡが（ＲＩＤ）　ｚ　（Ｃ＊Ａ）　ｘをなすように組合されることができ、又はＲＫＡとＣＫＤが（ＲｘＡ）　２　（ＣＫＤ）　ｚへと組合されることができ、ここでＫは表示のフルオロクロムが連結されていることを表わしている。　ｃＡＭＰがＲをＣから解離させたら、これによってＤ及びＡは互いから広く隔てられ、そしてＤからＡへのエネルギーの転移がされなくなる。サブユニットが解離することにより、Ｄにより吸収される波長での照光はＡではなく単にＤからの蛍光発光をもたらし、従って複合発光スペクトルはＤの短めの波長へとシフトする。

前記した通りに二種類のフルオロクロムにより標識されたホロ酵素は、天然のホロ酵素と本質的に同じｃＡＭＰに対する感受性を有することが見い出せた。この特性はタンパク質複合体例えばｃＡＭＰｄＰＫの利用を、種々の生物学的分子のための測定因子又はセンサーとして利用できることを可能にする。更に、このセンサーはこのような生物学的分子例えばｃＡＭＰに対して最適な親和性を有することが保障され、なぜなら天然のホロ酵素はｃＡＭＰにとっての主要な内因性センサーであり、そして対象物の濃度はまさにこの酵素に影響を及ぼすものであるからである。更に、ｃＡＭＰによる刺激に基づくキナーゼとしての標識化酵素の活性は、同様に刺激された天然のホロ酵素と同じであることが見い出された。この特性は有用であり、なぜならこれは、このセンサーが導入されている細胞内におけるｃＡＭＰの生物学的効率の任意の変動を最小にするからである。もしこのセンサーが有効なキナーゼでないならば、それに結合している任意のｃＡＭＰは生物学的活性を及ぼすことが阻止され、従ってこのセンサーは活性が測定されようとされているシグナル経路を固有に妨害することになるであろう、しかしながら、もしこのセンサーが正常なキナーゼなら、これに結合したｃＡＭＰ分子は生物学的に完全に有効であり、従ってこのような現象の仲介からはずされることはない。

本発明は更に、サンプル中の分析物の濃度を決定する方法であって標識して（ここでＳｌ又はＳ８はこの分析物に結合することが可能であり、且つＳ、及びＳ８はある状態において会合しており、そして他の状態においては実質的に解離しており、その平衡は遊離なこの分析物の濃度によってコントロールされ、このフルオロクロムは一方のフルオロクロムの発光波長が他方のフルオロクロムの励起波長と重複するように選ばれる）標識化タンパク質（ＳＩＤ）、（ＳｚＡ）−ｚ又は（ＳＩＡ）−＋　（ＳｔＤ）−ｔを形成せしめ；（ｂ）この標識化タンパク質をこのサンプルと接触せしめ；（ｃ）Ｄ又はＡの励起波長付近のエネルギーを提供せしめ；（ｄ）Ａ及びＤそれぞれの発光波長にて発せられた蛍光を測定し、そしてＤからＡへのエネルギー転移の程度をその発光増幅の比によって、又はＤの蛍光寿命によって、又はＤの光漂白化（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）の速度によって決定することを含んで成る方法を提供する。全てのこれらのパラメーター、しかしながら最も好都合には発光増幅の比は、既知の分析物濃度サンプルにより確率した検量曲線によって分析物濃度へと換算されうる。

ある態様において、例えばＣサブユニットにおいてフルオロセインにより標識され、そしてＲサブユニットにおいてテトラメチルローダミンにより標識されたホロ酵素が試験管内及び生体内でのｃＡＭＰの濃度の測定に利用することができる。前者に関しては、４９０〜５００ｎ■での励起に随行するこの酵素の蛍光発光を測定しながらこれをｃＡＭＰによって滴定する。既知濃度のｃＡＭＰに対する発光比のプロット（５２０：　５８０ｎ−が最適波長である）が、同じ条件のもとての未知溶液におけるｃＡＭＰ濃度の決定のための標準曲線として用いることができる。生存細胞内の生体内ｃＡＭＰ濃度を測定するためには、マイクロインジュクシッン、エレクトロポレーション、リポフェクシッン、ビーズ装入、スクレープ装入又は任意のその他の同等且つよく知られた技術による対象の細胞の中への標識化ホロ酵素の取り込ませを必要とする。このような方法はＲｉａｂｏｗｏｌら（１９８８）　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　５ｙｍｐｏｓｉｎ　ｏｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５３：８５−９０　；　５ａａｘｂｒｏｏｋらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８９）　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、及びＡｓｕｂｅｌらＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ３１　（１９８７Ｌ　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓに詳細されており、これらは本明細書に参考として組入れた。蛍光顕微鏡のもとての４９０〜５００ｎｍでの励起及び二種類の最適波長（５２０及び５８０ｎｍ　）付近の発光の検出はホトメーター又はテレビジョンカメラによって行われる。

最小及び最大比の値の検量は、ホロ酵素の解離を阻害するｃＡＭＰ拮抗薬アデノシン−３’、５’−サイクリックモノホスホチオエート、ＲＰ−異性体ＣＲｐ− ｃＡＭＰ）の添加によってまずゼロのｃＡＭＰ濃度値を設定することにより行われる。このｃＡＭＰ拮抗薬のその後の除去及び膜浸透性ｃＡＭｐＨ１体の添加は完全な解離を提供し、それ故中間のｃＡＭＰ値は試験管内試験に由来する標準曲線を用いて決定できる。

現状好ましいフルオロクロムの選択は、ドナー色素にとってはフルオロセインであり、これは約５１０〜５５０ｎｍの発光波長を有し、そしてアクセプターにとってはテトラメチルローダミンであり、これは約５１０〜５５０ｎ−の励起波長を有し、両者ともリジンへの好適な反応のための条件のもとてイソチオシアネートを介してサブユニ、７トに連結されている。しかしながら、フルオロクロムＤの発光波長がフルオロクロムへの励起波長と重なり、そしてＤからＡへのエネルギー転移をもたらす限り、種々のフルオロクロム及びその誘導体が利用されうる０例えば、ＤとＡのフルオロクロムペアーは７アミノクマリンとジビロメテンーポレート、インドカルボシアニンとローダミンＸ、又はフイトエリトリンとアロフィコシアニンでありうる。

本発明は更に、タンパク質サブユニットＳ、及びＳ２を含んで成る複合体（このサブユニットＳ１及びＳオはある状態においては会合しており、そして他の状態においては実質的に解離しており、その間の平衡は遊離な分析物Ｘの濃度によってコントロールされ、そしてここで５１又はＳアはこの分析物に結合することができる）を製造する方法であって：（ａ）フルオロクロムＡを３１に結合させ（ここで該フルオロクロムＡは第二フルオロクロムＤの発光波長と重なる励起波長を有する）；　（ｂ）この第二フルオロクロムＤをＳ、に結合させ；　（Ｃ）この１ｍされたサブユニットを混合して複合体を形成せしめ（ここでこのフルオロクロムは、このフルオロクロム間のエネルギーの無放射性転移を可能にするよう十分密接に近づいている）；そして（ｄ）複合体としてのこの標識化サブユニットを回収することを含んで成る方法を提供する。

ある態様において、Ｒ及びＣを独立して組換タンパク質として、例えば２．　２ｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ）における発現から入手し、その後これを標識することができる。ところで、標識の毘作がホロ酵素への再会合又はその後のｃＡＭＰ感受性及びキナーゼ活性を阻害しないような反応条件の慎重なる調整が必要である。従来の論文は、フルオロセインイソチオシアネートによって標識単離せしめたＣはＲと組合さるその能力が損傷されていることを述べている；しかしながら、複合体を製造する方法を提供しくここでＳＩ及びＳｚはある状態においては会合しており、そして他の状態においては実質的に解離しており、その間の平衡は遊離な分析物Ｘの濃度によりコントロールされ、そしてここでＳｔ又はＳ８はこの分析物と結合することが可能である）、この方法は：　（ａ）フルオロクロムＡを、Ｓｌ及びＳｚを含んで成る複合物に連結させ（ここで該フルオロクロムＡは第二フルオロクロムＤの発光波長と重なる励起波長を有する）　ｉ　（ｂ）この第二フルオロクロムＤを、Ｓ、及びＳ、を含んで成る第二複合体に連結させ；　（Ｃ）前記第−及び第二複合体のサブユニ・ントを分離させて標識化サブユニット５ＩＫＤ　、　ＳｚｗＤ　、　ＳＩＫＡ及びＳ２−を獲得し；そして（ｄ）標識複合体（ＳＩｇＤ）−＋（ＳｚｘＡ）−ｚ又は（ＳＩＩＩＡ）−１（ＳｔｘＤ）−ｔを形成するため（ここで、及び、２はこの標識化サブユニットの化学量数を表わす）この標識化サブユニットを混合する（ここで前記フルオロクロムは、このフルオロクロム間のエネルギーの無放射性転移を可能とするよう十分に密接に近づいている）ことを含んで成る方法を提供する。

これに代わる方法は、予め形成せしめたホロ酵素ＲｔＣｚをＤによって標識することであり、これによってＲとＣとの相互作用部位が固有に保護されている（ＲＩＤ）　ｚ　（Ｃ＋ｔＤ）　ｚが製造される。　ＲｌＣ，の別のバッチをＡによって同様に標識化して（ＲＫＡ）　ｔ　（ＣＫＡ）　ｔを作る０次に標識化Ｒと！！識化Ｃを解離させ、そしてｃＡＭＰアフィニティーカラムに通過させて標識化Ｃが素通りする間に標識化Ｒがこれに吸着することによって分ける。Ｒは遊Ｍｃ　Ａ　Ｍ　Ｐによる溶出によってこのカラムから回収できる。この分離を各バッチに通用したとき、ＲｘＤ、　ＣｇＤ、　ＲｘＡ及びＣ−を獲得することができ、これらはその後一方の調製品とし７　（Ｄ　（ＲＥＤ）　ｚ　（ＣＩＡ）　ｚ　、そして他のものとしての（ＲｉＡ）　ｚ　（Ｃ＋ｃＤ）　ｚを作るよう異なる組合せにおいて再び組合せられる。

ｃＡＭＰｄＰＫのホロ酵素又は個々のサブユニットは、例えば本明細書に参考として組入れたＢｕｂｉｓ　ら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：２１６３−２１７０゜及びＺｉｃｋらＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、　（１９８２）２５７：２２８７−２２９３に詳細の通り哺乳類起源から調製することができる。もし組換又は哺乳類起源由来のサブユニットをホロ酵素の調製のために用いたなら、再構成は実施例に詳細の通りに行うことができる。

以下の実施例は本発明の例示であって限定ではない。

例！ｃＡＭＰ−ンバク　キナーゼ量　サブユニットのｌ春ｌ試薬は以下の会社から購入した：ヒストンｎＡ、フェニルメチルスルホニルフルオリド、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）及び牛血清アルブミン（Ｓｉｇｓａ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）　；　Ｎα−Ｐ−トシル −Ｌ−リジンクロロメチルケトン及びｃＡＭＰ　（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅ＋５ｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）　；　２　、８　−　［”Ｈ）　ｃＡＭＰ（２７Ｃｉ／ｍｓ＋ｏｌ）及び８−　Ｎｘ　（ ”　Ｐ　）　ｃＡＭＰ　（２０〜３０Ｃｉ／ｍ５ｏｌ）　（ＩＣＮ）　；セファデックスＧ−１５０及びｃＡＭＰ−アガロース（ＮＡ−ニタンスペーサー）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｌｅａｓａｎｔ　Ｈｉｌｌ、　ＣＡ）　；　ニトロセルロース（０，４５ｔｔ　ｍ　）及び電気泳動試薬（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）　；及びシトシント（ｃｙｔｏｓｃｉｎｔ）（Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｗ）　、　ＤＮＡ操作において用いた酵素はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｓ　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）のいづれからより入手し、そして製造者の仕様書に従って用いた。蛍光！Ｉ識物ばＭｏ１ｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ　（Ｅｕｇｅｎｅ、　ＯＲ）より入手し、そしてｃＡＭＰ１！似体はＢｉｏｌｏｇ　（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）より入手した。全てのその他の試薬は分析用である。

ｐＢＲ３２２において牛Ｒ１の全長ｃＤＮＡを含むプラスミド６２Ｃ１２（Ｌｅｅら（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０：３６０８−３６１２　；これは本明細書に参考として組入れる）をｃＤＮＡ発現のためにｐＬＩｃ　７　（Ｖｉｅｒａら（１９８２）　Ｇｅｎｅ、　１９：２５９−２６８、これは本明細書に参考として組入れる）の中にサブクローンせしめた。

サブクローニングに関するＤＮＡ操作は、本明細書に参考として組入れたＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、　ＮＹに従って実施した０Ｍ単に述べると、６２Ｃ１２をＮａｒ　Ｉにより消化し、そしてｃＤＮＡを含む３．６キロベース（ｋｂ）フラグメントを単離する。　ＮｃｏＩによる部分的消化の後、二種類の大きなフラグメント、即ち全長ｃＤＮＡフラグメント（１１５５塩基対（ｂｐ））及び短縮型フラグメント（１０２０塩基対）を混合物として単離し、フレノウフラグメントにより補完し、そしてＨｉｎｃ　ＩＩにより線状化せしめたｐｕｃ　７にリデートした。　’１３５塩基対フラグメントも単離し、〔ガンマ−”Ｐ）ＡＴＰにより放射性標識し、そしてこの全長インサートを含むこれらのクローンを同定するために用いた。２０個のクローンを選別し、次いでそれぞれに由来するＤＮＡを調製し、そしてＢｇ／Ｉによって消化してこのインサートの方向性を樹立せしめた。３個のクローン由来のＩ）ＮＡが、１ａｃＺ’遺伝子と関連して適切な方向においてこのＲ′コード化上セグメント挿入されていることを示唆する制限パターンを示した。これらのクローンをタンパク質の発現のμに更に特徴付けした。

Ｅ、コリにおいてはｃＡＭＰの基底値は高いため、外因性ｃＡＭＰに影響されない粗抽出物におけるＲの正確な検出のために以下の方法を考え出した。この方法は迅速なスクリーニングに利用できうる。ドデシル硫酸ナトリウムを含む１２．５％のポリアクリルアミドゲル（１，５■−）上でタンパク質サンプルをＬａｅ曽ｓｌｉ　（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５の方法に従って電気泳動させた０次にエレクトロブロッティング装置（Ｈｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてタンパク質をニトロセルロースフィルターに移した。ゲルは２〇−阿のトリス、１５４５Ｍのクリシン、２０％のメタノール（ｐＨ８，３）の中で５００ｎａにて４〜６時間エレクトロトランスファーせしめた。このニトロセルロースを室温にて、１５０５Ｍの塩化ナトリウム及び１０ｍＭのトリス（ｐＨ７，５）中で０．０５％ツイーン２０と１時間インキュベートし、次いでツイーン２０を除く同じ緩衝液で室温にて洗った。このフィルターを同じ緩衝液の中で８−Ｎｘ　［”Ｐ　）　ｃＡＭＰ　（２０ｎＭ）と、室温にて暗室の中でインキュベートした。水冷緩衝液で洗浄した後、このフィルターをυν　５−１１ランプ（２５４ｎａ）により５分間照射せしめ、再び洗い、吸い取り乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにかけた。Ｒ−サブユニットを、本明細書に参考として組入れたＫｅｒｌａｖａｇｅら（１９８２）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５７：１７４９−１７５４に詳細の通りに、２．８−　（３Ｈ）ｃＡ肝を用いたミリポア濾過によって検出した。

調節サブユニットの精製は、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ−培地５ｍｌに最も発現性の高い形質転換体を接種し、そして細胞密度が００５５０：　ｏ、ｉ−ｏ、ｓに達するまで３７℃で増殖することによって行った０次にこの培養物を、アンピシリンを含むＬ−培地１１Ｊ７トルに移し、そしてインキュベートした（１２〜１６時間）、何らかの記載がない限り、その後の全ての工程は４ °Ｃで行った。ｓｉ胞を５，０００ｘｇで３０分間遠心し、そして得られるベレットを緩衝液Ｉ　（２０ｍＭのリン酸カリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、５　＋ｗＭの２−メルカプトエタノール、１５ｍｇ／１（７）Ｎａ−Ｐ−）シルーＬ−リジンクロメチルケトン及び１５＋ｗｇ／ｌのフェニルメチルスルホニルフルオリド）の中に再懸濁させた。

この懸濁物をフレンチ加圧セルに２回通し、次いでｓ、ｏｏｏｘ　ｇで２０分間遠心した。このベレットを同一の緩衝液により再抽出せしめた。

ゆっくりと硫酸アンモニウムを加えて、プールした上滑液画分を７０％の濃度にした。１時間後、沈殿したタンパク質を１２．０ＯＯＸ　ｇで３０分間の遠心によって回収し、緩衝液Ｉに再溶解させ、そして同一の緩衝液に対して一夜透析した。Ｎ分を（’Ｈ）　ＣＡＭＰ結合性についてアッセイし、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動、それに読（前記した光標識によって分析した０次のこの透析したサンプルをｃＡＭＰ−アガロースに加え、そしてゆっくりと−庚回転させた。上滑溶液を除去した後、この樹脂を２ＭのＮａＣ１を含む緩衝液■で洗って２８０ｎｓ＋での吸光度が０に達するようにし、次いで緩衝液■で再び洗った。

Ｒ−サブユニットも緩衝液Ｉ中のｃＡＭＰ　２容量で３０℃にて１時間溶出させた。この溶出は少なくとも一回繰り返した。

ｃＡＭＰ−アガロース樹脂からの溶出液はしばしば全長Ｒの他に若干のＲのタンパク質分解生成物を含むので、この全長Ｒを２５ｍＭのリン酸カリウム、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５ｍＭのＥＤＴＡ及び１５０１のＮａＣ１（ｐＨ６，５）により平衡化し且つ溶出せしめる７０ｃｍセファデックスＧ−１５０カラムに基づいて分離させた。百分（２■ｌ）は７ｓｌ／時間の流速で集めた。Ｒ −サブユニットはボイドボリューム付近で溶出し、従って３５−　ｋＤａのタンパク質分解フラグメントからよく分離された。

組換ｃＡＭＰ依存性調節サブユニットをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ気相シーケンサ−でシーケンス化した。２ナノモルのＲ−サブユニットをシーケンス化し、そしてフェニルチオヒダントイン誘導体を、本明細書に参考として組入れた。　ＨｕｎｋａｐｉｌｌａｒとＦｌｏｏｄの（１９８３）　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｙｔｚｏｌ、、　９１：４８６−４９３の手順に従うシアノカラム（ＩＢＭ）を用いるＢｅｃｋｍａｎ　ＨＰＬＣシステムで分析した。

例■ ｃＡＭＰ−ンパク　キ　−ゼ　サブユニ・トの反ｌ曵里ネズミｃＡＭＰ−依存性タンパク質キナーゼ（Ｕｈｌｅｎら、（１９８６）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８３二１３００−１３０４　；本明細書に参考として組入れる）のα−触媒性サすユニットに関する全長クローンを含むプラスミドｐＭｃＯを突然変異誘発のためにＭ１３ｍｐ１８にサブクローンした。

組換発現のために細菌性発現ベクターｐＴ　７−７　（ＴａｂｏｒとＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ。

（１９８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８２：１０７４−１０７８　；本明細書に参考として組入れる）を用いた。触媒性サブユニットを発現させるために用いたＥ　コリ株は：Ｊ阿１０１．２２２．　Ｋ３８及びＢＬ２１（ＤＨ３）である。

この触媒性サブユニット遺伝子に、その開始メチオニンにて固有Ｎｄｅ　Ｉ制限部位を導入する前に、この触媒性サブユニットに関するコード領域を含むｐｎｃｏ由来の１．９−キロベースＳａｃ　Ｉフラグメントを切り出し、そしてＨ１３ −ρ１８の５ａｃＩ部位に再すゲートせしめた。本明細書に参考として組入れたＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈ　（１９８４）　ＤＮＡ　３：４７９−４８８に詳細の手順に従って一本鎖ＤＮＡを調製し、そして２４−塩基オリゴヌクレオチド（５’　−ＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣ−３’　）によるオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発のための鋳型として用いた。

突然変異は本明細書に参考として組入れたＳａｎｇｅｒら（１９８０）　Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　１４３：１６１−１７８に従うジデオキシシーケンシング及び制限酵素による地図化によって確認した。

ｐｌ、ｌｌ５−３の作製は、前記したＭ１３作製体から１９８８塩基フラグメントをＮｄｅ　Ｉ及び旧ｎｄｌｌｌにより切り出し、アガーゲルより精製し、そしてＰＴ７−７のＮｄｅ　ｌ−Ｈ４ｎｄＤＩ制限部位にリデートすることによって行った。このリデーション混合物を、前記したＭａｎｉａｔｉｓらにより詳細された手順を利用して、Ｅ、コリＪ？＋１０１を形質転換させるために用いた。

Ｎｄｅ　Ｉ及び旧ｎｄｌｌｌにより消化せしめたｃＤＮＡインサートを含むプラスミドＤＮＡに関する形質転換体を選別しそしてスクリーンした。　ＤＮＡをこのプラスミドｐｉｌｌｓ−３から単離し、そしてこの配列を制限酵素による地図化及び配列分析によって確認した０次にこのプラスミドをＥ、コリＢＬ２１　（ＤＥ３　）の形質転換のために用い、そしてこの形質転換体をポリアクリルアミドゲル電気泳動の後の３８　４０ＫＤａのバンドの出現をモニターすることによって触媒性サブユニットの発現についてスクリーンした。

触媒性サブユニットの発現のため、アンピシリンを含む１リツトルのし一培地（１０％のトリプトン、５％の酵母抽出物及び５％のＮａＣ１）に、ｐｌＪｓ−３により形質転換せしめたＢＬ２１　（ＤＥ３　）の定常期培養物５ｓ＋１を接種し、そして５９０ｎ■で０．５の吸光度が達せられるまで強く撹拌しながら３７ ℃で増殖させた。最終濃度０．５ｎｓ＋となるまでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加えた後、この細胞を３７°Ｃで更に３時間増殖させ、次いで遠心によって集めた。

組換触媒性サブユニットの精製は、このベレットを４℃にて６ｓＪの溶解緩衝液（３０＋ｓＭのＭＥＳ　、　ｐＨ６，４５，５０ｗＭのＫＣＬ、１ｍＭのＥＤＴＡ。

及び５ｉ＋Ｍのβ−メルカプトエタノール）に再懸濁させ、次いでフレンチ加圧セルに２回通すことにより行った。更に溶解緩衝液を加えて全容量を３０ｍ１にした。　１２，０ＯＯＸ　ｇで１５分間４℃で遠心後、この上清液を取り出し、そして氷冷水で希釈して導電率を１．３ｍ５ｈｏｓ以下にした。希釈した上滑液を緩衝液■（３０■阿のＭＥＳ　、　ｐＨ６，４５，１ｍＭのＨＤＴＡ　）により平衡にしたホスホセルロースカラム（Ｗｈａｔｓａｎ　Ｐ１１＋２、ＯＸｏ、８ｃ騙）に適用した。ＷＩ＆光度が２８Ｏｎ−で０となるまで平衡緩衝液で洗浄後、触媒性サブユニットを、緩衝液１　（５０■ｌ）から０．５Ｍのリン酸カリウムｐＨ７，０（５０■ｌ）に至る線状勾配によって溶出させた。２１の百分を集め、そしてキナーゼ活性を含むものをプールした。タンパク賀は固形ＮＨａＳＯａを常に撹拌しながらこの溶液が８０％飽和となるまでバッチ式に添加する口上により沈殿させた。この沈殿物を１２．０００ｘ　ｇで２０分間の遠心により集め、次いでＯ，ｋｌ（７）ＨＪ　ニ再懸濁させた。溶解していない物質を遠心によって除去した後、このタンパク質溶液を２５ｍＭのリン酸カリウムｐＨ６，８により平衡にした。

ウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）　ＡｃＡ４４（ＬＫＢ）ゲル濾過カラム（１，ＯＸ１１６ｃｍ）に添加した。キナーゼ活性を含む両分を混ぜ合わせ、そしてＡｍ１ｃｏｎ装置及びＰＭ　−３０膜を用いる限外濾過によって１−ｇ／■１へと濃縮した。

本明細書に参考として組入れたＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５に従うドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）の存在下において実施したポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づき、この組換触媒性サブユニットはほぼ均質であり、そしてその収量は３．５〜４．０ｓｇ／培養物のリットルであった。

組換触媒性サブユニットを２０■Ｈのトリス、ｐＨ７，５によって０．０４ｗｇ／ｍｌに希釈した。　５０−１のアリコートを氷上に保ち、次いで４９°Ｃの湯浴に入れた０表示した時間にこのチューブを取り出し、氷の上に置き、そして組換タンパク質の安定性についてアッセイした。

プレーキャストＬＫＢアンホリンバグプレートｐＨ３，５〜９．５を伴うＬＫＢマルチフォアモデル２１１７を用いて等電点電気泳動を行った。標準品は牛カルボニックアンヒドラーゼ（ｐｒ　６．５７）、ミオグロビン（ｐｌ　６．６７及び７．１６　）並びにラクテートデヒドロゲナーゼ（ｐｌ　８．５５）とした。

組換触媒性サブユニットの分子量はＬＫＢウルトロゲルＡｃＡ４４カラム（Ｉ　Ｘ１１６ｃｍ）を用いるゲル濾過により決定した。泳動緩衝液は２５−一のリン酸カリウム（ｐＨ６，８）、２００ｗＭのＫＣＬ　、及び０．２％のアジ化ナトリウムとした。標準品及びその対応のＭ値は、リボヌクレアーゼＡ　（１３，７００）　、チモトリブシノーアンＡ　（２５，０００）　、豚触媒性サブユニット（３８，０００）　、卵アルブミン（４３，０００）及び牛血清アルブミン（６７，０００）である。

組換触媒性サブユニ・ントを例Ｉに詳細の通りにＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｃｖｓ気相シーケンサ−でシーケンス化した。

例■ サブユニ・トの豚の心１ｉ（心臓４０個）をホモジナイズし、次いで遠心した。この上清液（導電率３ｓ＋ｍｈｏ）を、１５５Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ６，５，２ｍＭのＥＤＴＡ、　５　ｓＭのβ−メルカプトエタノールにおいて平衡にした。　ＤＨ−２３カラム（４Ｌ樹脂）に直接通した。タンパク質は緩衝液Ｅ（４〇−Ｈのリン酸カリウム、９Ｆ４６．５．２ｍＭのＨＤＴ＾、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）によってこの樹脂から溶出させた。プールしたキナーゼビークを直ちに４　ｍｓ＋ｈｏの導電率に調整し、この時点にて１．５１のＤＥ　−５２樹脂を加え、そしてその全てを２時間機械的に撹拌した。この上滑液を注ぎ出し、そしてこの樹脂をカラムに注ぎ入れ、次いで緩衝液已によりよ（洗い、その後緩衝液Ｆ　（１７ｓ＋Ｈのリン酸カウリム、ｐＨ６，１，２醜ＨのＨＤＴＡ、　５　ｍＭの β−メルカプトエタノールく洗った．次にＣ−サブユニットを３１の２２０ｍＭのｃＡＭＰ、それに続＜８１の緩衝液Ｆにより溶出させ、そしてこの溶出液をＣ？ｌ−セファロースカラム（５０−１容量）に通し、その後１０％グリセロール（２５０ｗＭ　）から２００ｍＭのリン酸カリウム、ｐｉｆ６．１，　１０％のグリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ，　５　ｍＷのβ−メルカプトエタノール（２５０１１′）を含む緩衝液Ｆの線状勾配により溶出させた。

例■ ｃＡＭＰ−　ンパク　キナーゼの量（ａ）サブユニットの標識化：哺乳ｌ［ｃＡＭＰ−依存性タンパク質キナーゼの組換触媒性及び！１ｇ節サブユニット（約０．５　−　２．０ｍｇ／ｇ＋１）を例Ｉ及び■に詳細の通りに精〜１５分間加えることによって消光せしめた．各タンパク質溶液をセリセロールによって溶出させることにより、過剰の色素を除去した。

のグリセロールに対して３〜５日間４°Ｃで透析した．ホロ酵素の形成は、基質としてケンプチド（Ｋｅｍｐｔｉｄｅ）を用いて測定するキナーゼアッセイにより示されうる（Ｓｌｔｃｅ　ｌ　Ｔａｙｌｏｒ，前記）。

シフ　ｐＨ８．０，　０．１ｍＭのＥＤＴＡ　ニ対して４℃で透析した，　ＰＩｇｃｔｚ及びＡＴＰを加えてそれぞれ最終濃度８ｍＭ及び５ｍＭとした．このタンパク質をフルオロ上イン５′〜イソチオシアネート又はテトラメチルローダミンイソチオシアネート（異性体Ｇ）のいづれかにより、最終濃度０、１〜０．５ｍＭにて室温で２０〜３０分間ＩＩｍ化し、次いで５ｓＭのグリシンｐＨ　８．０で１０分間消光せしめた．過剰の遊離色素は、このタンパク質溶液をセファデックスＧ−２５（３■１）のカラムに通し、Ｉ（１ｗＦ４のリン酸カリウムｐＨ　６．７、　１５０ｍ？ＩのＫＣＩ　、５■Ｈの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥｒｊＴＡ　（ＩＩ衡液Ｉ）により溶出させ、次いで最初の着色化蛍光バンドを集めることにより１部分的に）除去した。

次ニこのＩＩｗｌＲ化ホロ酵素をｃＡＭＰアフィニティーカラム（０．２５■ｌ）（Ｈｏｌｆｇａｎｇ．Ｈ．　ら、ＦＨＢＳ　Ｌｅｔｔ．９９．６２（１９７９））に約０．１ｍｌ／分の流速で通し、そして２カラム容量の緩衝液■によって４℃で溶出させた。

集めた画分はＩ！識化触媒性サブユニットを含んでいた．このカラムをＩＭのＫＣＬを含む緩衝液Ｉ　Ｃ２カラム容量）、次いで再び緩衝液！　（２カラム容量）で溶出させた．この洗浄液は若干の異なる標識化触媒性サブユニットを含みうる．標識化調節サブユニットを回収するため、カラムを緩衝液Ｉ中の３０ｍＭのｃＡＭＰ　（　４カラム容量）により室温にて２時間かけてゆっくり溶出させた。

異なって標識されたサブユニットを適当なドナー−アクセプターペアーに耳組合せし、そして２５膜Ｍのリン酸カリウムｐＨ　６．８　、　０．５ｍＭのＭｇＣ１ｚ，　０．１ｍＭのＡＴＰ．　５　ｍＭの２−メルカプトエタノール、５％のグリセロールに対して数回交換しながら３〜５日間４℃で透析した。

ｃＡＭＰｄＰＫホロ酵素の形成はキナーゼ活性の消失によりモニターされることができ、これはサイクリックＡＭＰの添加により復帰しうる。

例Ｖの励起に続（蛍光発光を測定した（図２）、明確にするため、０□においてｃＡＭＰ＃１度に関してプロットし、この比における中間最大変化は約１１００ｎのｃＡＭＰであることを示している。

例■ によりそしてＲ１サブユニットにおいてＴＲＩＴＣにより標識されていロセッサーによりディジタル化し、５００−５３０ｎ一対＞５８０ｎｍＯ比を各画素にて計算し、そしてテレビモニター上の擬似色（シュードカラー）において表わした０代表細胞における平均比を図３に示す各時浸透性ｃＡＭＰｌ［似体を加えるとこの比における徐々な上昇かもたらさて上記−の通りに発光比を測定した。以下のものの添加を行い、それ似体であるジブチリルｃＡＭＰによっては何ら更なる効果は見られなか発明の範囲を逸脱することなくなされうる。従って本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定される。

凹　ゼ強度（任意単位）Ｑぺ単−比要約書本発明はｃＡＭＰ、その他の第二メンセンジャー及び有機分子の存在を決定するのに適切な！［識化タンパク質を提供する。このタンパク質はフルオロクロムによって独立してｗｉＩ！され、これらは密接に空間的に近位している、好ましくは約６０−以下にあるとき、一方のフルオロクロムから他方へのエネルギー転移を介して相互作用する。

課題の組成物（Ｓ□Ａ）−、＋（ＳＩＤ）−ｉを提供する（ここで、Ｓ、及びＳオはある状態においては会合している二種類のタンパク質であり、そして別の状態においては実質的に解離しており、その間の平衡は遊離な分析物の濃度によってコントロールされており、モしてＡ及びＤはフルオロクロムであり、フルオロクロムＤの発光波長はフルオロクロムＡの励起波長と重っており、そしてＡとＢの距離はこれらのフルオロクロム間のエネルギーの無放射性転移を十分に可能とするほど密接に近接している）、ＡとＤは種々のアクセプター、ドナーベアー、例えばフルオロクロムとテトラメチルローダミン及びそれらの誘導体より選ばれうる。サンプル中の分析物、例えばｃＡＭＰの濃度は、サンプルを（Ｓ＋ＫＡ） −＋　（Ｓｚ＊Ｄ）ａｔと接触させ、Ｄの励起波長に近いエネルギーを提供し、そしてＡ又はＤの蛍光を測定することによって決定されることができ、ｃＡＭＰ及びその他の前記分析物の濃度はＤの発光対Ａの発光の比によって決定され、この比は既知の分析物濃度の対照溶液によって予め検量しておく。

国際調査報告 −Ｎ−−Ａ□　ＩＩｓ、　Ｐｌ：ゴ／ＵＳ９１１０ｋ６７６

Claims

【特許請求の範囲】

１．（Ｓ１ｋＡ）ｎ１（Ｓ２ｘＤ）ｎ２を含んで成る課題の組成物（ここでＳ１及びＳ２は二種類のタンパク質であり、それらはある状態においては会合しており、そして別の状態においては実質的に解離しており、それらの間の平衡は遊離分析物の濃度によりコントロールされ、そしてＤ及びＡは異なる種類のフルオロクロムであり、一方のフルオロクロムの発光波長は他方のフルオロクロムの励起波長と重なっており、ＤとＡの距離はこれらのフルオロクロム間でのエネルギーの無放射性転移を可能とするほど十分に密接に近づいており、そしてｎ１及びｎ２は前記タンパク質の化学量数を表わし、そしてここでＳ１又はＳ２はこの分析物に結合することが可能である）。
２．Ｓ１及びＳ２が酸素のサブユニットである、請求の範囲１に記載の課題の組成物。
３．このサブユニットが、ｃＡＭＰｄＰＫに関するサブユニット、ＧＴＰ−結合性タンパク質サブユニットのサブユニット、カルモジュリンとカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ、並びにタンパク質キナーゼＣの調節及び触媒性ドメインより成るタンパク質ペアーの群から選ばれる、請求の範囲２に記載の課題の組成物。
４．Ｓ１がｃＡＭＰｄＰＫがの調節サブユニットであり、そしてＳ２がｃＡＭＰｄＰＫの触媒性サブユニットである、請求の範囲１に記載の課題の組成物。
５．Ｄ及びＡが、フルオロセインとテトラメチルローダミン、７アミノクマリンとジピロメテン−ボレート、インドカルボシアニンとローダミンｘ、及びフィコエリトリンとアロフィコシアニン、又はそれらの誘導体より成る群から選ばれ、この選ばれたペアーが蛍光エネルギー転移を示すことを条件とする、請求の範囲１に記載の課題の組成物。
６．Ｄの発光波長及びＡの励起波長が約５１０〜５５０ｎｍである、請求の範囲１に記載の課題の組成物。
７．フルオロクロムがフルオロセイン及びテトラメチルローダミン又はそれらの誘導体である、請求の範囲５又は６に記載の課題の組成物。
８．ｎ１が２であり、そしてｎ２が２である、請求の範囲４に記載の課題の組成物。
９．Ｓ１又はＳ２に結合することの可能な分子が、ｃＡＭＰ，ＧＴＰ、ホルモンレセプター複合体、カルシウム、ジアシルグリセロール及びホルボールエステルより成る群から選ばれる、請求の範囲１に記載の課題の組成物。
１０．分折物がｃＡＭＰである、請求の範囲１に記載の課題の組成物。
１１．Ｓ１及びＳ２が組換タンパク質である、請求の範囲１に記載の課題の組成物。
１２．一方のタンパク質が組換タンパク質であり、そし他のタンパク質が哺乳起源に由来する、請求の範囲１に記載の課題の組成物。
１３．Ｓ１及びＳ２が哺乳類起源に宙来する、請求の範囲１に記載の課題の組成物。
１４．サンプル中の分析物の濃度を決定する方法であって；（ａ）タンパク資Ｓ１及びＳ２をフルオロクロムＡ及びＤによって標識してにこでＳ１又はＳ２はこの分析物に結合することが可能であり、且つＳ１及びＳ２はある状態において会合しており、そにて別の状態においては実質的に解離しており、その平衡は遊離なこの分析物の濃度によってコントロールされ、このフルオロクロムは、フルオロクロムＤの発光波長がフルオロクロムＡの励起波長と重なっていることにおいて特徴付けられる）標識化タンパク質（Ｓ１ｘＤ）ｎ１（Ｓ１ｋＡ）ｎ２を形成せしめ；（ｂ）標識化タンパク質をこのサンプルと接触させ；（ｃ）Ｄ又はＡの励起波長付近のエネルギーを提供し；そして（ｄ）Ａの発光波長にて発せられる蛍光を測定し、ＤからＡへのエネルギー転移の程度を発光増幅によって決定する段階を含んで成る方法。
１５．測定段階が励起波長で発せられる蛍光を測定し、ＤからＡへのエネルギー転移の種皮をＡとＤの発光増幅の比により決定することを更に含んで成る、請求の範囲１４に記載の方法。
１６．この測定段階が、Ｄの蛍光半減期又はＤの光漂白速度を測定することを含んで成る、請求の範囲１４に記載の方法。
１７．サンプルが完全細胞を含んで成る、請求の範囲１４に記載の方法。
１８．接触段階が、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、ビーズ装入及びスクレープ装入より成る群から選ばれる方法を更に含んで成る、請求の範囲１７に記載の方法。
１９．Ｓ１及びＳ２が酵素のサブユニットである、請求の範囲第１４に記載の方法。
２０．このサブユニットが、ｃＡＭＰｄＰＫに関するサブユニット、ＧＴＰ−結合性タンパク質サブユニットのサブユニット、カルモジュリンとカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ、並びにタンパク質キナーゼＣの調節及び触媒性ドメインより成るタンパク質ペアーの群から選ばれる、請求の範囲１９に記載の方法。
２１．ＳｌがｃＡＭＰｄＰＫの調節サブユニットであり、そしてＳ２がｃＡＭＰｄＰＫの触媒性サブユニットである、請求の範囲１４に記載の方法。
２２．Ｄ及びＡが、フルオロセインとテトラメチルローダミン、７アミノクマリンとジピロメテン−ボレート、インドカルボシアニンとローダミンＸ、及びフィコエリトリンとアロフィコシアニン、又はそれらの誘導体より成る群から選ばれ、この選ばれたペアーが蛍光エネルギー転移を示すことを条件とする、請求の範囲１４に記載の方法。
２３．Ｄの発光波長及びＡの励起波長が約５１０〜５５０ｎｍである、請求の範囲１４に記載の方法。
２４．フルオロクロムがフルオロセイン及びテトラメチルローダミン又はそれらの誘導体である、請求の範囲２２又は２３に記載の方法。
２５．ｎ１が２であり、そしてｎ２が２である、請求の範囲２１に記載の方法。
２６．分析物が、ｃＡＭＰ，ＧＴＰ、ホルモンレセプター複合体、カルシウム、ジアシルグリセロール及びホルボールエステルより成る群から選ばれる、請求の範囲１４に記載の方法。
２７．分析物がｃＡＭＰである、請求の範囲１４に記載の方法。
２８．Ｓ１及びＳ２が組換タンパク質である、請求の範囲１４に記載の方法。
２９．一方のタンパク質が組換タンパク質であり、そして他のタンパク質が哺乳類起源に由来する、請求の範囲１４に記載の方法。
３０．Ｓ１及びＳ２が哺乳類起源に由来する、請求の範囲１４に記載の方法。
３１．タンパク質サブユニットＳ１及びＳ２を含んで成る複合体を調製する方法（Ｓ１及びＳ２はある状態においては会合しており、そして別の状態においては実質的に解離しており、これらの間の平衡は遊離分析物Ｘの濃度によりコントロールされ、そしてここでＳ１又はＳ２はこの分析物に結合することが可能である）であって；（ａ）フルオロクロムＡをＳ１に連結させ（ここで該フルオロクロムＡは第二フルオロクロムＤの発光波長と重なる励起波長を有する）；（ｂ）この第二フルオロクロムＤをＳ２に連結させ；（ｃ）この標識せしめたサブユニットを混合して複合体を形成させ、ここで前記フルオロクロムはこれらのフルオロクロム間のエネルギーの無放射性転移を可能とするよう十分に密接に近づいており；そして（ｄ）複合体としてこの標識化サブユニットを回収することを含んで成る方法。
３２．Ｓ１がｃＡＭＰｄＰＫの調節サブユニットであり、そしてＳ２がｃＡＭＰｄＰＫの触媒性サブユニットである、請求の範囲３１に記載の方法。
３３．フルオロクロムがフルオロセイン、テトラメチルローダミン又はそれらの誘導体である、請求の範囲３１に記載の方法。
３４．分析物がｃＡＭＰである、請求の範囲３１に記載の方法。
３５．Ｓ１及びＳ２が組換タンパク質である、請求の範囲３１に記載の方法。
３６．一方のタンパク質が組換タンパク質であり、そして他のタンパク質が哺乳類起源に由来する、請求の範囲３１に記載の方法。
３７．Ｓ１及びＳ２が哺乳類起源に由来する、請求の範囲３１に記載の方法。
３８．タンパク質サブユニットＳ１及びＳ２を含んで成る複合体を調製する方法（Ｓ１及びＳ２はある状態においては会合しており、そして別の状態においては実質的に解離しており、これらの間の平衡は遊離分析物Ｘの濃度によりコントロールされ、そしてここでＳ１又はＳ２はこの分析物に結合することが可能である）であって；（ａ）フルオロクロムＡを、Ｓ１及びＳ２を含んで成る複合体に連結させ（ここで該フルオロクロムＡは第二フルオロクロムＤの発光波長と重なる励起波長を有する）；（ｂ）この第二フルオロクロムＤを、Ｓ１及びＳ２を含んで成る第二複合体に連結させ；（ｃ）前記第一及び第二複合体のサブユニットを分けて、標識化サブユニットＳ１ｘＤ，Ｓ２ｘＤ，Ｓ１ｘＡ及びＳ２ｘＡを獲得し；そして（ｄ）この標識化サブユニットを混合して標識複合体（Ｓ１ｋＤ）ｎ１（Ｓ２ｋＡ）ｎ２又は（Ｓ１ｋＡ）ｎ１（Ｓ２ｘＤ）ｎ２を形成せしめ（ここでｎ１及びｎ２は標識化サブユニットの化学量数である）、ここで前記フルオロクロムはこれらのフルオロクロム間のエネルギーの無放射性転移を可能とするよう十分に密接に近づいている；ことを含んで成る方法。
３９．Ｓ１がｃＡＭＰＰｄＫの調節サブユニットであり、そしてＳ２がｃＡＭＰＰｄＰＫの触媒性サブユニットである、請求の範囲３８に記載の方法。
４０．Ｓ２がｃＡＭＰＰｄＰＫの調節サブユニットであり、そしてＳ１がｃＡＭＰＰｄＰＫの触媒性サブユニットである、請求の範囲３９に記載の方法。
４１．フルオロクロムがフルオロセイン、テトラメチルローダミン又はそれらの誘導体である、請求の範囲３８に記載の方法。
４２．分析物がｃＡＭＰである、請求の範囲３８に記載の方法。
４３．Ｓ１及びＳ２が組換タンパク質である、請求の範囲３８に記載の方法。
４４．一方のタンパク質が組換タンパク質であり、そして他のタンパク質が哺乳類起源に由来する、請求の範囲３８に記載の方法。
４５．Ｓ１及びＳ２が哺乳起源に由来する、請求の範囲３８に記載の方法。