DE69130171T2

DE69130171T2 - Bestimmung von analyten durch übertragung von fluoreszenzenergie

Info

Publication number: DE69130171T2
Application number: DE69130171T
Authority: DE
Inventors: Stephen R. Poway Ca 92064 Adams; Ying San Diego Ca 92122 Ji; Susan S. Del Mar Ca 92014 Taylor; Roger Y. La Jolla Ca 92037 Tsien
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1990-07-02
Filing date: 1991-07-01
Publication date: 1999-06-24
Anticipated expiration: 2011-07-02
Also published as: WO1992000388A1; EP0537270B1; JPH05508772A; EP0537270A1; EP0537270A4; DE69130171D1; DK0537270T3; US5439797A; JP3208486B2; ATE170980T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf die Energieübertragung zwischen mit Fluorochrom markierten Proteinen, um die Analyt-Konzentration zu bestimmen, und insbesondere auf Verfahren zur Bestimmung der cAMP-Konzentration unter Anwendung von cAMP- abhängiger Proteinkinase.
Die Funktion von vielen biologischen Molekülen wird vermittelt durch Wechselwirkungen mit Proteinen und Protein-Komplexen. Viele dieser Moleküle finden sich in extrem niedrigen Konzentrationen in einer lebender Zelle. Ihre Konzentration kann sich jedoch vorübergehend ändern als Reaktion auf physiologische Stimuli. In vielen Fällen ist es wichtig, die Konzentration derartiger Moleküle zu bestimmen, um den metabolischen Zustand einer Zelle, hormonelle Reaktionen und bestimmte Krankheiten zu beurteilen. Selbst wenn der Gehalt sich um ein Mehrfaches verändert, ist eine solche Veränderung bei derartig geringen Konzentrationen nicht nachweisbar.
Ein solches wichtiges Molekül, das biologische Funktionen durch Protein-Wechselwirkung vermittelt, ist cyclisches AMP (cAMP, Adenosin-3',5'-cyclisches-monophosphat). Cyclisches AMP reguliert intrazelluläre Reaktionen in allen prokariotischen und kernhaltigen tierischen Zellen, die bisher untersucht worden sind. Es wirkt als ubiquitärer intrazellulärer Mediator oder zweiter Botenstoff für eine Vielfalt von hormon-induzierten Wirkungen, wobei der erste Botenstoff das extrazelluläre Hormon ist. Derartige hormon-induzierte Wirkungen, die durch erhöhte cAMP-Gehalte vermittelt werden, umfassen z. B. Triglycerid-Abbau in einem Fettgewebe, der durch Epinephrin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Glucagon oder Schiddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH) induziert wird; Wasserresorption in der Niere durch Vasopressin; Glycogen-Abbau in Muskel und Leber; erhöhte Herzrate durch Epinephrin- und Progesteron-Sekretion durch die Ovarien als Reaktion auf lutenisierendes Hormon. Diese unterschiedlichen Reaktionen auf cAMP werden durch Hor mon/Rezeptor-Wechselwirkungen an allen Zelloberflächen induziert und führen zur intrazellulären Synthese von cAMP. So reagieren unterschiedliche Targetzellen auf eine Erhöhung von cAMP-Gehalten auf unterschiedliche aber charakteristische Weise.
Damit cAMP als zweiter Botenstoff wirken kann, muß seine intrazelluläre Konzertration eng kontrolliert werden und in der Lage sein, sich schnell zu verändern als Reaktion auf die Hormon/Rezeptor-Bindung. Normalerweise sind die cAMP-Gehalte kleiner als etwa 1 uM und erhöhen sich bei der hormonellen Stimulation auf etwa das 5-fache. Die Erhöhung der cAMP-Gehalte beruht auf der Synthese durch das Enzym Adenylatcyclase von ATP. Nach dieser vorübergehenden Zunahme kehren die cAMP-Gehalte durch die Wirkung von Phosphodiesterasen schnell auf normale Gehalte zurück.
Um die cAMP-abhängigen hormonellen Reaktionen und ihre physiologischen Mechanismen wirksam zu untersuchen, ist es notwendig, geringe Konzentrationen an cAMP genau zu messen. Vor allem ist es wichtig, Konzentrationen an freiem cAMP zu messen, da die biologische Aktivität von intrazellulären Botenstoffen im allgemeinen durch die Konzentrationen an freiem Botenstoff gesteuert wird und mit ihr übereinstimmt, während Gesamtkonzentrationen, die nach Aufbrechen des Gewebes gemessen werden, Material umfassen, das an biologisch irrelevante Stellen gebunden ist. Bei bisher angewandten Methoden zur Messung von cAMP- Konzentrationen wurden klassische Konkurrenz-Bindungs-Assays, wie Radioimmunoassays, angewandt und erforderten die Handhabung und Herstellung von Extrakten von Tausenden oder Millionen von Zellen. Diese Methoden führten zu einer geringen räumlichen und zeitlichen Auflösung und waren nicht in der Lage, zwischen Gehalten an freiem oder biologisch aktivem cAMP und gesamtem abgetrennten cAMP zu unterscheiden. Darüberhinaus erforderten diese Methoden die Verwendung von gefährlichen, instabilen Isotopen und waren daher teuer.
Zusätzlich sind zweite Botenstoffe, außer cAMP, wie cyclisches GMP (cGMP), Calcium und Diacylglycerin, sowie andere organische Moleküle, wie tumorverstärkende Phorbolester, von großer Bedeutung bei der Signalübertragung und Zellphysiologie. Eine genaue Bestimmung der biologisch aktiven Konzentrationen dieser Moleküle ist auch erforderlich, um hormonelle Reaktionen und physiologische Mechanismen wirksam zu untersuchen. Außer für einfache anorganische Ionen, wie Calcium, gibt es jedoch kein Indikatorsystem, um die biologisch aktiven Konzentrationen dieser Moleküle zu messen. Die meister der gleichen Nachteile, die bei der Bestimmung von freiem cAMP in der Zelle auftreten, treten bei diesen Molekülen ebenfalls auf.
So besteht Bedarf an einem Verfahren, um Konzentrationen an freiem intrazellulären cAMP und andere organische Moleküle in einzelnen lebenden Zellen schnell, wirksam und nicht-zerstörend zu messen. Eine derartige Erfindung wäre von großer Bedeutung für das Verständnis der hormonellen Regulation. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und liefert auch damit zusammenhängende Verteile.
Die US-A-4 868 103 beschreibt ein Assay-System, bei dem ein Analyt durch eine Bindungseinheit die einen Energieabsender E1 und einen Energieakzeptor E2 enthält, gebunden ist. Bei Bestrahlung mit einer geeigneten Wellenlänge, tritt eine Resonanzübertragung zwischen E1 und E2 auf, wenn der Analyt an E1 und E2 gebunden ist.
Die US-A-4 828 981 beschreibt ein Assay-System unter Verwendung von zwei Antikörpern, die mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Markern markiert sind. Fluoreszenzenergie-Übertragung wird angewandt, um den Bindungszustand an einen Analyten anzuzeigen, der mit einem (anti-idiopatischen) Antikörper um die Bindungsstelle an dem anderen Antikörper konkurriert.
A. McEvily et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 2593-2598, beschreiben ein Assay für den Grad der Dimerisierung von Citratsynthetase-Untereinheiten. Fluorescein und Eosin werden als Energieübertragungs-Paar angewandt, wobei jeweils eines an die Untereinheiten gebunden ist. Der Assoziationszustand der Untereinheiten zeigt sich durch die Energieübertragung zwischen den Fluorochromen.
T. Woodford et al., J. Biol. Chem. 261 (1989), 13321-13329, beschreiben cAMPdPK als ein Holoenzym, das aus zwei regulatorischen und zwei katalytischen Untereinheiten besteht, wobei die zuletzt Genannten nach Zugabe von cAMP von dem Holoenzym freigesetzt werden.
Nach E. First et al., Biochem. 28 (1989), 3598-3605, können die katalytischen Untereinheiten an zwei Stellen mit Fluorophoren markiert sein.
W. Fletcher et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 5504-5513, beschreiben die Markierung der regulatorischen Untereinheiten mit einem Fluorochrom.
Die Erfindung liefert markierte Proteine, die geeignet sind zur Bestimmung des Vorhandenseins von cAMP, anderen zweiten Botenstoffen und organischen Molekülen. Die Proteine sind getrennt mit Fluorochromen markiert, die, wenn sie sich räumlich nahe kommen, vorzugsweise auf weniger als etwa 6 nm, durch Energieübertragung von einem Fluorochrom auf das andere in Wechselwirkung treten.
Die Erfindung liefert eine Zusammensetzung, (S&sub1;kA)n1(S&sub2;kD)n2, wobei S&sub1; und S&sub2; zwei Proteine sind, wie in Anspruch 1 definiert, die in einem Zustand assoziiert und in einem anderen im wesentlichen disassoziiert sind, wobei das Gleichgewicht dazwischen kontrolliert wird durch die freie Konzentration an einem Analyten, und A und D Fluorochrome sind, wobei die Emissions-Wellenlänge von Fluorochrom D die Anregungs-Wellenlänge von Fluorochrom A überlappt und der Abstand zwischen A und D ausreichend gering ist, um eine strahlungslose Energieübertragung zwischen den Fluorochromen zu erlauben. A und D können aus einer Vielfalt von Akzeptor/Donor-Paaren ausgewählt sein, wie Fluorescein und Tetramethylrhodamin und Derivaten davon. Die Konzentration an cAMP in einer Probe kann bestimmt werden durch Zusammenbringen der Probe mit (S&sub1;kA)n1(S&sub2;kD)n2, Zufuhr von Energie, nahe der Anregungs-Wellenlänge von D und Messen der Fluoreszenz von A oder D, wobei die Konzentration von cAMP bestimmt wird durch das Verhältnis der Emission von D zu der Emission von A, mit Hilfe einer vorher gebildeten Eichkurve mit Bezugslösungen mit bekannter Analyt- Konzentration.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, das die Anwendung der Fluoreszenzenergie-Übertragung zur Messung von cAMP zeigt.
Fig. 2 zeigt das Emissions-Spektrum von markiertem cAMPdPK bei verschiedenen Konzentrationen von cAMP und die Punkte in der Einfügung zeigen das Verhältnis der Emission bei 520 nm zu 580 nm bei den verschiedenen cAMP-Konzentrationen.
Fig. 3 zeigt die Zunahme der cAMP-Konzentration, wenn eine glatte Muskelzelle mit einem membrandurchgängigen cAMP-Analogen behandelt wird.
Fig. 4 zeigt die Messung von c in einer einzelnen Zelle, wenn sie mit verschiedenen β&sub2;-adrenergen Agonisten und Antagonisten behandelt worden ist.

DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie er hier verwendet wird bezeichnet der Ausdruck "Protein" oder "Untereinheit" eine lineare Sequenz von Aminosäuren, die biologische Wirkung zeigt. Diese lineare Sequenz umfaßt native Proteine, Domänen von Proteinen und Fragmente von Proteinen, so lange ihre Funktion aufrecht erhalten bleibt. Der Ausdruck umfaßt auch Polypeptide und Peptide.
Wie er hier verwendet wird bezeichnet der Ausdruck "assoziiert" zwei Proteine, wie Untereinheiten eines Enzyms, die miteinander in Kontakt Stehen. Die Kontaktregion kann alle Teile der beiden Moleküle umfassen. Daher bezeichnet der Ausdruck "im wesentlichen disassoziiert" oder "disassoziiert" den Verlust des Kontaktes zwischen den assoziierten Regionen, einschließlich dem Verlust aller Kontaktregionen, so daß die Proteine vollständig getrennt sind, sowie den Verlust einiger Regionen, so daß die Hauptteile der Proteine sich nicht mehr in unmittelbarer Nähe zueinander befinden aber noch miteinander verbunden sein können. Der Ausdruck "Komplex", wie er hier verwendet wird, bezeichnet die Proteine oder Untereinheiten, wenn sie in assoziiertem Zustand vorliegen. Der Komplex kann mehr als ein Molekül von jedem von zwei Proteinen enthalten.
Wie er hier verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck "cAMPdPK" den von cyclischem AMP abhängigen Proteinkomplex, wie er beschrieben ist von Alberts et al., (1989), Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc. und in Slice and Taylor (1989),J. Biol. Chem. 264, 20940-20946. Der Komplex besteht aus zwei Proteinen, die regulatorische und katalytische Funktionen ausüben. Der Ausdruck soll auch alle Isotope der regulatorischen und katalytischen Proteine umfassen.
Wie er hier verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck "Fluorochrom" ein Molekül, das in der Lage ist, Energie in einem bestimmten Wellenlängen-Bereich zu absorbieren und die Energie in einem anderen Wellenlängen-Bereich als dem Absorptions-Bereich abzugeben. Daher bezeichnet der Ausdruck "Anregungs-Wellenlänge" den Wellenlängen-Bereich, in dem ein Fluorochrom Energie absorbiert. Der Ausdruck "Emissions-Wellenlänge" umfaßt den Wellenlängen-Bereich, in dem ein Fluorochrom Energie abgibt oder fluoresziert. Der Ausdruck "Fluorochrom" umfaßt auch Derivate davon, wie chemische Einheiten zur Bindung an Proteine. Beispiele für Fluorochrome sind Fluorescein und Tetramethylrhodamin. Ein Derivat von jedem ist Fluoresceinisothiocyanat und Tetramethylrhodamin-isothiocyanat.
Wie er hier verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck "Probe" ein Material, wie eine Lösung, einen Extrakt oder intakte Zeilen, von denen erwartet wird, daß sie einen Analyten enthalten.
Wie er hier verwendet wird, bedeutet der Ausdruck "Markierung" die Anbindung einer chemischen Einheit, wie eines Fluorochroms, an ein Protein. Die Anbindung erfolgt typischerweise durch eine kovalente Bindung, aber sie kann auch ebenso nicht-kovalente Wechselwirkungen umfassen. Daher bezeichnet der Ausdruck "markierte Proteine" Proteine, an die chemische Einheiten, wie Fluorochrome, gebunden sind.
Die Erfindung liefert eine Zusammensetzung, umfassend (S&sub1;kA)n1(S&sub2;kD)n2, wobei S&sub1; und S&sub2; wie in Anspruch 1 definiert, zwei Proteine sind, die in einem Zustand assoziiert und in einem anderen Zustand im wesentlichen disassoziiert sind, und D und A unterschiedliche Fluorochrome sind, wobei die Emissions- Wellenlänge eines Fluorochroms die Anregungs-Wellenlänge des anderen Fluorochroms überlappt, D und A sich in ausreichender Nähe befinden, um eine strahlungslose Energieübertragung zwischen den Fluorochromen zu erlauben, und n1 und n2 die Stöchiometrie der Proteine angeben, und wobei S&sub1; oder S&sub2; in der Lage ist, an cAMP zu binden, wobei die Bindung von cAMP die Affinität von S&sub1; und S&sub2; zueinander beeinträchtigt.
Die beiden Proteine S&sub1; und S&sub2;, die mit Fluorochromen markiert sind, sind Untereinheiten für cAMP-abhängige Proteinkinase (cAMPdPK).
In dem assoziierten Zustand bilden die Untereinheiten einen Proteinkomplex, wie ein Holoenzym. Die Anzahl der Proteine in dem Komplex kann variieren, abhängig von der Stöchiometrie zwi schen S&sub1; und S&sub2;. Außerdem kann der Komplex andere Proteine als S&sub1; und S&sub2; enthalten. Diese anderen Proteine in dem Komplex können als Komponenten von S&sub1; oder S&sub2; angesehen werden, so lange sie eine stabile Assoziation an entweder S&sub1; oder S&sub2; beibehalten.
In dem disassoziierten Zustand hat mindestens eines der Proteine seinen Abstand von dem andren Protein wesentlich verändert. Z. B. besteht cMPdPK in dem disassoziierten Zustand aus freien katalytischen und regulatorischen Proteinen oder Untereinheiten.
Die Übertragung von Fluoreszenzenergie beruht auf den biophyskalischen Eigenschaften von Fluorochromen. Diese Prinzipien sind zusammengefaßt in Lakowicz, J., 1983, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York und Jovin und Jovin, 1989, in Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry, herausgegeben von E. Kohen und J. G. Hirschberg, Academic Press. Kurz gesagt, absorbiert ein Fluorochrom Lichtenergie einer charakteristischen Wellenlänge. Diese Wellenlänge ist auch bekannt als Anregungs-Wellenlänge. Die von einem Fluorochrom absorbierte Energie wird anschließend über verschiedene Wege, von denen einer die Emission von Photonen unter Erzeugung von Fluoreszenz ist, abgegeben. Die Wellenlänge von emittiertem Licht ist bekannt als die Emissions-Wellenlänge und ist ein inhärentes Charakteristikum eines speziellen Fluorochroms. Fluoreszenzenergie-Übertragung ist ein quanten-mechanischer Prozeß, durch den die Energie des angeregten Zustandes eines Fluorochroms, ohne tatsächliche Photonen-Emission auf ein zweites Fluorochrom übertragen wird. Diese Energie kann dann anschließend mit der Emissions-Wellenlänge des zweiten Fluorochroms abgegeben werden. Das erste Fluorochrom wird allgemein als der Donor (D) bezeichnet und hat einen angeregten Zustand mit höherer Energie als derjenige des zweiten Fluorochroms, das als Akzeptor (A) bezeichnet wird. Die wesentlichen Merkmale des verfahrens bestehen darin, daß das Emissions-Spektrum des Donors das Anregungs-Spektrum des Akzeptors überlappt und daß der Donor und der Akzeptor sich ausreichend nahe sind. Der Abstand, über den die Übertragung der Fluoreszenzenergie wirksam ist, hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Fluoreszenz-Quanten-Effizienz des Donors, dem Anregungs-Koeffizien ten des Akzeptors, dem Grad des Überlappens ihrer jeweiligen Spektren, dem Brechungsindex des Mediums und der relativen Orientierung der Übertragungs-Momente der beiden Fluorochrome, er beträgt aber typischerweise 4-6 nm für günstige Donor/Akzeptor- Paare. Außerhalb des optimalen Bereichs von intermolekularen Abständen fällt die Wirksamkeit der Energieübertragung mit der negativen sechsten Potenz des Abstands ab.
Der Analyt, der entweder durch S&sub1; oder S&sub2; gebunden sein kann, ist cAMP. Wenn sie an solche Moleküle gebunden sind, können S&sub1; und S&sub2; entweder in assoziiertem oder in disassoziiertem Zustand vorliegen.
Die Erfindung liefert eine Zusammensetzung, bei der S&sub1; die regulatorische Untereinheit von cAMPdPK ist und S&sub2; die katalytische Untereinheit von cAMPdPK ist und sie mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind, so daß die Emissions-Wellenlänge des einen die Anregungs-Wellenlänge des anderen überlappt.
Z. B. haben in Abwesenheit von cAMP die regulatorischen (R) und katalytischen (C) Untereinheiten von cAMPdPK eine Stöchiometrie von R&sub2;C&sub2;, wie in Fig. 1 gezeigt. Der Komplex ist als Kinase inaktiv, da die Untereinheiten R die Kinase-Domänen der Untereinheiten C hemmen. Nach der Bindung von cAMP durch R, trennen sich die Untereinheiten R von den Untereinheiten C, wodurch die biologische Aktivität der zuletzt Genannten freigesetzt wird. Die Erfindung umfaßt das Markieren der Untereinheiten R mit einem Fluorochrom und der Untereinheiten C mit einem anderen Fluorochrom, so daß in dem intakten R&sub2;C&sub2;-Komplex Lichtenergie, die von einem Fluorochrom absorbiert worden ist, durch den Prozeß der strahlungslosen Energieübertragung auf das andere Fluorochrom übertragen wird. Dieses Phänomen erfordert es, daß die Wellenlängen der Fluoreszenz-Emission von einem Fluorochrom, dem Donor (D), mit den Anregungs-Wellenlängen des anderen Fluorochroms, des Akzeptors (A), überlappen und daß die Einheiten D und A sich in ausreichender Nähe befinden, um eine strahlungslose Energieübertragung zwischen den Fluorochrom-Paaren zu erlauben. Im Falle von Fluorescein und Tetramethylrhodamin ist dieser Abstand kleiner als etwa 4 bis 6 nm. Für andere Fluorochrom-Paare kann der Abstand von dem Fachmann bestimmt werden. Wenn eine geeignete Auswahl für D und A getroffen wor den ist, wird diese Bedingung der Nähe in einem Holoenzym-Komplex, wie demjenigen von cAMPdPK vernünftig gut erfüllt, so daß die Energieübertragung mit beträchtlicher Effizienz eintritt.
Die übertragene Energie ist leicht nachweisbar durch Anregung mit von D absorbierten Wellenlängen, da die Emission von D ausgelöscht wird und die Energie stattdessen bei längeren Wellenlängen, die für die Emission von A charakteristisch sind, auftritt.
Untereinheiten RkD und CkA können gepaart sein unter Bildung von (RkD)&sub2;(CxA)&sub2; oder RkA und CkD können kombiniert sein zu (RkA)&sub2;(CkD)&sub2;, wobei k eine Anbindung des angegebenen Fluorochroms anzeigt. Wenn cAMP einmal R von C abgespalten hat, werden D und A dadurch weitgehend voneinander getrennt und sind nicht mehr in der Lage, Energie von D nach A zu übertragen. Wenn die Untereinheiten getrennt sind, führt eine Beleuchtung miß Wellenlängen, die von D absorbiert werden, einfach zu einer Fluoreszenz-Emission von D, Ohne daß A beteiligt ist, so daß das gesamte Emissions-Spektrum sich nach der kürzeren Wellenlänge von D hin verschiebt.
Es hat sich gezeigt, daß ein mit zwei unterschiedlichen Fluorochromen markiertes Holoenzym, wie oben beschrieben, eine im wesentlichen identische Empfindlichkeit gegenüber cAMP besitzt wie das native Holoenzym. Diese Eigenschaft erlaubt die Verwendung vor. Protein-Komplexen, wie cAMPdPK, als Meßvorrichtungen oder Sensoren für eine Vielfalt von biologischen Molekülen. Darüber hinaus garantiert es, daß der Sensor die optimale Affinität gegenüber solchen biologischen Molekülen, wie z. B. cAMP, aufweist, da natives Holoenzym der endogene Hauptsensor für cAMP ist und die interessierenden Konzentrationen genau diejenigen sind, die das Enzym angreifen. Darüber hinaus hat es sich gezeigt, daß die Aktivität von markiertem Enzym, wie einer Kinase, nach der Stimulation durch cAMP identisch ist mit derjenigen von ähnlich stimuliertem nativen Holoenzym. Diese Eigenschaft ist wertvoll, da sie eine mögliche Störung der biologischen Wirksamkeit von cAMP in den Zellen, in die der Sensor eingeführt worden ist, minimiert. Wenn der Sensor keine wirksame Kinase wäre, würde etwaiges daran gebundenes cAMP daran gehindert werden, biologische Aktivität zu zeigen, so daß der Sensor unausweichlich den Weg des Signals, dessen Aktivität gemessen werden soll, hemmen würde. Wenn der Sensor jedoch eine normale Kinase ist, sind daran gebundene cAMP-Moleküle biologisch voll wirksam und nicht entfernt davon, derartige Ereignisse zu übermitteln.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe, entsprechend Anspruch 2. Das Verfahren umfaßt die Stufen: (a) Markieren von Proteinen S&sub1; und S&sub2; mit Fluorochromen A und D, wobei S&sub1; oder S&sub2; in der Lage ist, den Analyten zu binden, und S&sub1; und S&sub2; in einem Zustand assoziiert und in einem anderen Zustand im wesentlichen disassoziiert sind, wobei das Gleichgewicht dazwischen durch die freie. Konzentration an Analyten kontrolliert wird, wobei die Fluorochrome so ausgewählt sind, daß die Emissions-Wellenlänge von einem Fluorochrom die Anregungs-Wellenlänge des anderen Fluorochroms überlappt, unter Bildung von markierten Proteinen (S&sub1;D)n1(S&sub2;A)n2 oder (S&sub1;A)n1(S&sub2;D)n2; (b) Zusammenbringen der markierten Proteine mit der Probe; (c) Zuführen von Energie nahe der Anregungs-Wellenlänge von D oder A; (d) Messen der bei den Emissions-Wellenlängen von A bzw. D emittierten Fluoreszenz und Bestimmen des Ausmaßes der Energieübertragung von D nach A durch das Verhältnis ihrer Emissions-Amplituden, oder durch die Fluoreszenz-Lebensdauer von D oder durch die Geschwindigkeit des Lichtausbleichens von D. Irgendeiner dieser Parameter, aber am bequemsten das Verhältnis der Emissions- Amplituden, kann mit der Analyt-Konzentration in Beziehung gebracht werden durch eine Eichkurve, die mit Proben bekannter Analyt-Konzentration gebildet worden ist.
Bei einer Ausführungsform kann z. B. an der Untereinheit C mit Fluorescein und an der Untereinheit R mit Tetramethylrhodamin markiertes Holoenzym angewandt werden, um die Konzentration von cAMP in vitro und in vivo zu messen. Im ersten Fall wird das Enzym mit cAMP titriert, während seine Fluoreszenz- Emission nach Anregung bei 490 bis 500 nm gemessen wird. Eine Kurve des Emissions-Verhältnisses (520 : 580 nm sind die optimalen Wellenlängen) gegen bekannte Konzentrationen an cAMP kann als Standardkurve zur Bestimmung der cAMP-Konzentrationen in unbekannten Lösungen unter den gleichen Bedingungen angewandt werden. Um cAMP-Konzentrationen in vivo in lebenden Zellen zu messen, ist es erforderlich, das markierte Holoenzym in die interessierender Zellen durch Mikroinjektion, Elektroporation, Lipofektion, Perlenbeladung, Kratzbeladung oder irgend ein anderes vergleichbares und bekanntes Verfahren einzubringen. Derartige Verfahren sind beschrieben in Riabowol et al., (1988) Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 53, 85-90; Sambrock et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1987), John Wiley and Sons. Die Anregung bei 490 bis 500 nm auf einem Fluoreszenz-Mikroskop und der Nachweis der Emission nahe den beiden optimalen Wellenlängen (520 und 580 nm) wird erreicht mit einem Photometer oder einer Fernsehkamera. Die Eichung des minimalen und maximalen Verhältnis-Wertes wird erreicht, indem zunächst der 0-Wert für die cAMP-Konzentration festgelegt wird, durch Zugabe eines cAMP-Antagonisten, Adenosin-3',5'-cyclisches Monophosphothioat, Rp-Isomer (Rp-cAMP), das die Aufspaltung des Holoenzyms hemmt. Die anschließende Entfernung des cAMP-Antagonisten und der Zusatz des membrandurchgängigen cAMP-Analogen führt zu einer vollständigen Aufspaltung, und so können dazwischen liegend cAMP-Werte bestimmt werden unter Anwendung der in vitro gebildeten Standardkurve.
Zur Zeit bevorzugte Auswahlen von Fluorochromen sind Fluorescein für den Donor-Farbstoff, der eine Emissions-Wellenlänge von etwa 510 bis 550 nm hat, und Tetramethylrhodamin für den Akzeptor, der Anregungs-Wellenlängen von etwa 510 bis 550 nm hat, die beide über Isothiocyanate unter Bedingungen, die die Reaktion mit Lysinen begünstigen, an die Untereinheiten gebunden sind. Es kann jedoch eine Vielfalt von Fluorochromen und Derivaten davon verwendet werden, so lange die Emissions-Wellenlänge des Fluorochroms D die Anregungs-Wellenlänge des Fluorochroms A überlappt und zu einer Energieübertragung von D nach A führt. Z. B. können Fluorochrom-Paare D und A 7-Aminokumarin und Dipyrromethenborat, ein Indocarbocyanin und Rhodamin X oder ein Phycoerythrin und Allophycocynin sein.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung eines Komplexes entsprechend Anspruch 11, wobei das Verfahren Protein-Untereinheiten S&sub1; und S&sub2; umfaßt, die in einem Zustand assoziiert und in einem anderen im wesentlichen disassoziiert sind, wobei das Gleichgewicht dazwischen kontrolliert wird durch die Konzentration an einem freien Analyten X, und wobei S&sub1; oder S&sub2; in der Lage ist, den Analyten zu binden, umfassend: (a) Binden des Fluorochroms A an S&sub1;, wobei das Fluorochrom A eine Anregungs-Wellenlänge aufweist, die mit der Emissions-Wellenlänge eines zweiten Fluorochroms D überlappt; (b) Binden des zweiten Fluorochroms D an S&sub2;; (c) Vermischen der markierten Untereinheiten, so daß ein Komplex gebildet wird, wobei sich die Fluorochrome in ausreichender Nähe befinden, um eine strahlungslose Energieübertragung zwischen den Fluorochromen zu erlauben, und (d) Gewinnen der markierten Untereinheiten als Komplex.
Bei einer Ausführungsform sind R und C als Rekombinations- Proteine verfügbar, z. B. durch Expression in E. coli, die dann markiert sind. Es ist jedoch eine sorgfältige Einstellung der Reaktionsbedingungen erforderlich, so daß der Vorgang des Markierens eine erneute Assoziierung zu einem Holoenzym oder die anschließende Empfindlichkeit und Kinase-Aktivität nicht verhindert. In der früheren Literatur ist angegeben, daß das Markieren von isoliertem C mit Fluorescein-isothiocyanat seine Fähigkeit sich mit R zu kombinieren, zerstört; unter milderen Bedingungen wurde C jedoch nicht zerstört, wie unten angegeben.
Die Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Komplexes entsprechend Anspruch 12, wobei das Verfahren Protein-Untereinheiten S&sub1; und S&sub2; umfaßt, die in einem Zustand assoziiert und in einem anderen Zustand im wesentlichen disassoziiert sind, wobei das Gleichgewicht dazwischen kontrolliert wird durch die Konzentration an einem freien Analyten X, und wobei S&sub1; oder S&sub2; in der Lage ist, den Analyten zu binden, umfassend: (a) Binden des Fluorochroms A an einen Komplex, umfassend S&sub1; und S&sub2;, wobei das Fluorochrom A eine Anregungs- Wellenlänge aufweist, die sich mit der Emissions-Wellenlänge eines zweiten Fluorochroms D überlappt; (b) Binden des zweiten Fluorochroms D an einen zweiten Komplex, umfassend S&sub1; und S&sub2;; (c) Trennen der Untereinheiten des ersten und zweiten Komplexes, um markierte Untereinheiten S&sub1;kD, S&sub2;kD, S&sub1;kA und S&sub2;kA zu erhalten, und (d) Vermischen der markierten Untereinheiten, wobei die Fluorochrome sich in ausreichender Nähe befinden, um eine strahlungslose Energieübertragung zwischen den Fluorochromen zu erlauben, um markierte Komplexe (S&sub1;kD)n1(S&sub2;kA)n2 oder (S&sub1;kA)n1(S&sub2;kD)n2 zu erhalten, wobei n1 und n2 die Stöchiometrie der markierten Untereinheiten angeben.
Ein alternatives Verfahren besteht darin, vorgeformtes Holoenzym R&sub2;C&sub2; mit D zu markieren und dadurch (RkD)&sub2;(CkD)&sub2; zu erzeugen, bei dem die Stellen der Wechselwirkung zwischen R und C inhärent geschützt sind. Ein getrennter Ansatz von R&sub2;C&sub2; wird analog mit A markiert, um (RkA)&sub2;(CkA)&sub2; zu erzeugen. Dann werden markiertes R und markiertes C aufgespalten und durch Durchgang durch eine cAMP-Affinitäts-Säule, an der markiertes R haften bleibt, während markierte C hindurch geht, voneinander getrennt. R kann aus der Säule durch Eluieren mit freiem cAMP gewonnen werden: Wenn diese Trennung auf jeden Ansatz angewandt wird, erhält man RkD, CkD, RkA und CkA, die dann in unterschiedlichen Paarungen rekombiniert werden um (RkD)&sub2;(CkA)&sub2; als ein Produkt und (RkA)&sub2;(CkD)&sub2; als ein anderes zu erhalten.
Das Holoenzym oder individuelle Untereinheiten von cAMPdPK können aus Quellen von Säugetieren hergestellt werden wie es beschrieben ist von Bubis et al., (1985) Biochemistry, 24, 2163-2170 und Zick et al., J. Biol. Chem. (1982), 275, 2287-2293. Wenn Untereinheiten aus Rekombinations- oder Säugetierquellen zur Herstellung des Homoenzyms verwendet werden, kann die Rekonstitution wie in den Beispielen beschrieben durchgeführt werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern aber nicht einschränken.

Beispiel I

Rekombinationsexpression und Reinigung von cAMP-abhängiger regulatorischer Proteinkinase-Untereinheit

Reagentien wurden von den folgenden Gesellschaften gekauft: Histon IIA, Phenylmethylsulfonylfluorid, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) und Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO); Nα-p-Tosyl-L-lysin-chlormethylketon und cAMP (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH); 2,8-[³H]cAMP (27 Ci/mmol) und 8-N&sub3;[³²P]cAMP (20-30 Ci/mmol) (ICN); SephadexR G-150 und cAMP-Agarose (N&sup6;-Ethan-Abstandshalter) (Pharmacia, Pleasant Hill, CA); Nitocellulose (0,445 um) und Elektrophorese-Reagentien (Bio-Rad, Richmond, CA); Cytoscint (West Chem.). Bei DNA-Manipulationen verwendete Enzyme wurden entweder von Bethesda Research Laboratories (Gaithersberg, MD) oder Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) erhalten und wurden entsprechend den Angaben der Hersteller verwendet. Fluoreszenz- Markierungen wurden von Molecular Probes (Eugene, OR) erhalten und cAMP-Analoge wurden von Biolag (La Jolla, CA) erhalten. Alle anderen Reagentien waren analytisch rein.
Plasmid 62C12, Lee et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 3608-3612, worauf hier verwiesen wird, das die DNA voller Länge von Rinder-R¹ in pBR322 enthält, wurde in pUC7, Viera et al., (1982) Gene, 19, 259-268 zur cDNA-Expression subkloniert.
Zum Subklonieren wurden DNA-Manipulationen nach Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY durchgeführt. Kurz gesagt wurde 62C12 mit NarI abgebaut und das 3,6-Kilobasen (kb) Fragment, enthaltend die cDNA, wurde isoliert. Nach einem partiellen Abbau mit NcoI wurden die beiden großen Fragmente, das cDNA-Fragment voller Länge (1155) Basenpaare (bp), und ein Auslese- (truncated) Fragment (1020 Basenpaare) als Gemisch mit eingesetztem Klenow-Fragment, isoliert und in pUC7, das mit Hinc II linearisiert war, ligasiert. Das 135-Basenpaar-Fragment wurde ebenfalls isoliert, radioaktiv mit (-³²P)ATP markiert und verwendet, um solche Klone zu identifizieren, die die Einfügung voller Länge enthielten. Es wurden 20 Kolonien ausgewählt und die DNA von jeder hergestellt und mit Bg/I, abgebaut, um die Orientierung der Einfügung sicher zu stellen. Die DNA von drei Kolonien ergab ein Restriktionsmuster, das zeigte, daß das R¹-codierende Segment in der korrekten Orientierung in Bezug auf das lac-Z'-Gen eingefügt war. Diese Klone wurden weiter charakterisiert zur Expression des Proteins.
Da Grundgehalte an cAMP in E.coli hoch sind, wurde das folgende Verfahren zum genauen Nachweis von R in rohen Auszügen unabhängig von exogenem cAMP entwickelt. Dieses Verfahren konnte zum schnellen Absuchen angewandt werden. Proteinproben wurden auf 12,5% Polyacrylamidgelen (1,5 mm), enthaltend Natriumdodecylsulfat, nach dem Verfahren von Laemmli (1970), Nature 227, 680-685 durch Elektrophorese behandelt. Proteine wurden dann von diesen Gelen unter Anwendung einer Elektroplotting- Vorrichtung (Hoefer Scientific Instruments) auf Nitrocellulose- Filter übertragen. Die Gele wurden 4 bis 6 Stunden bei 500 mA in 20 mM Tris, 154 mM Glycin, 20% Methanol (pH 8,3) elektrisch übertragen. Die Nitrocellulose wurde 1 h bei Raumtemperatur mit 0.05% TweenR 20 in 150 mM Natriumchlorid und 10 mM Tris (pH 7,5) inkubiert und dann bei Raumtemperatur mit dem gleichen Puffer, außer daß TweenR 20 weggelassen wurde, gewaschen. Das Filtrat wurde mit 8-N&sub3;[³²P]cAMP (20 mM) in dem gleichen Puffer 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit eiskaltem Puffer wurde das Filter mit einer UV S-11 Lampe (254 nm) 5 min bestrahlt, wieder gewaschen, trocken tüpfelweise aufgebracht und der Autoradiographie unterworfen. Die R-Untereinheit wurde auch nachgewiesen durch MilliporeR-Filtration unter Verwendung von 2,8-[³H]cAMP, wie angegeben von Kerlavage et al., (1982), J. Biol. Chem., 257, 1749-1754, worauf hier verwiesen wird.
Die Reinigung der regulatorischen Untereinheit wurde durchgeführt durch Beimpfen von 5 ml L-Brühe, enthaltend Ampicillin (50 ug/ml), mit dem höchsten Expressions-Transformanten und Züchten bei 37ºC, bis die Zelldichte OD&sub5;&sub5;&sub0; = 0,1-0,5 erreichte. Die Kultur wurde dann in 1 l L-Brühe, enthaltend Ampicillin, überführt und inkubiert (12 bis 16 h). So weit nicht angegeben, wurden alle folgenden Verfahren bei 4ºC durchgeführt. Die Zellen wurden bei 5 000 · g 30 min zentrifugiert und die erhaltene Perle wurde erneut in Puffer I (20 mM Kaliumphosphat, 5 mM EDTA, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 15 mg/l Nα-p-Tosyl-L-lysin-chlormethylketon und 15 mg/l Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert. Diese Suspension wurde zweimal durch eine French-Druckzelle geleitet und 20 min bei 5 000 · g zentrifugiert. Die Perle wurde erneut mit dem gleichen Puffer extrahiert. Ammoniumsulfat wurde langsam zu den zusammengegebenen Überstands- Fraktionen zugegeben, bis eine Konzentration vor. 70% erreicht war. Nach 1 h wurde das ausgefallene Protein gewonnen durch Zentrifugieren bei 12 000 · g während 30 min. erneut in Puffer I gelöst und über Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert. Fraktionen wurden auf [³H]cAMP-Bindung untersucht und durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und anschließendes Photomarkieren, wie oben angegeben untersucht. Die dialysierte Probe wurde dann zu cAMP-Agarose zugegeben und über Nacht leicht gedreht. Nach Entfernen der überstehenden Lösung wurde das Harz mit Puffer I, enthaltend 2 M NaCl, gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm 0 erreichte, und dann erneut mit Puffer I gewaschen. Die R-Untereinheit wurde mit 2 Volumina cAMP (50 mM) in Puffer I 1 h bei 30ºC eluiert. Das Eluieren wurde mindestens einmal wiederholt.
Das Eluat von dem cAMP-Agarose-Harz enthielt häufig einige proteolytische Abbauprodukte von R neben dem R voller Länge, das auf einer 70 cm SephadexR G-150 Säule äquilibriert und mit 25 mM Kaliumphosphat, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 5 mM EDTA und 150 mM NaCl (pH 6,5) eluiert wurde. Es wurden Fraktionen (2 ml) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 7 ml/h gesammelt. Die R- Untereinheit wurde nahe dem Leervolumen eluiert und von dem proteolytischen 35 kDa Fragment wieder gelöst.
Vor der cAMP-abhängigen regulatorischen Rekombinations- Untereinheit wurde mit einem Applied Biosystems Gasphasen Sequencer die Sequenz bestimmt. Die Sequenz wurde an 2 Nanomol der Untereinheit bestimmt und die Phenylthiohydantoin-Derivate wurden mit einem Beckman HPLC-System unter Anwendung einer Cyano-Säule (IBM) nach dem Verfahren von Hunkarpillar und Hood, (1983), Methods Enzymol., 91, 486-493 analysiert.

Beispiel II

Rekombinationsexpression und Reinigung von cAMP-abhängiger katalytischer Proteinkinase-Untereinheit

Plasmid, enthaltend den Klon voller Länge für die α-katalytische Untereinheit von cAMP-abhängiger Maus-Proteinkinase, pMCO, Uhlen et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1300-1304 wurde zur Mutagenese in M13 mp18 subkloniert. Der bakterielle Expressionsvektor pT7-7, Tabor und Richardson (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1074-1078, wurde zur Rekombinations-Expression verwendet. Die E.coli-Stämme, die angewandt wurden, um die katalytische Untereinheit zu exprimieren, waren: JM101, 222, K38 und BL21 (DE3).
Vor dem Einführen einer einmaligen NdeI-Restriktionsstelle in das katalytische Untereinheits-Gen am Beginn von Methionin wurde das 1,9-Kilobasen SacI-Fragment von pMCO, enthaltend die Codierungsregion für die katalytische Untereinheit, ausgeschnitten und erneut in die SacI-Stelle von M13mp18 eingefügt. Einzelstrang-DNA wurde hergestellt und verwendet als Matrize zur Oligonucleotid-gerichteten Mutagenese mit einem 24-Basen Oligonucleotid (5'-CACGCCGCCCATATGGGCAACGCC-3') nach dem Verfahren, das beschrieben worden ist von Zoller und Smith (1984), DNA 3, 479-488. Die Mutation wurde bestätigt durch Dideoxy- Sequenzbestimmung nach Sanger et al. (1980) J. Mol. Bio 143, 161-178, und durch Kartierung mit Restriktionsenzymen.
Der Aufbau von pLWS-3 wurde durchgeführt durch Ausschneiden eines 1988-Basen-Fragments von dem oben angegebenen M13-Konstrukt mit NdeU und HindIII, Reinigen von einem Agargel und Einfügen in die NdeI-HindIII-Restriktionsstellen von pT7-7. Dieses Ligationsgemisch wurde angewandt, um E. coli JM101 zu transformieren, unter Anwendung des Verfahrens von Maniatis et al., a. a. O.
Transformanten wurden ausgewählt und auf Plasmid-DNA, enthaltend die cDNA-Einfügung, nach Abbau mit NdeI und HindIII untersucht. DNA wurde von diesem Plasmid, pLWS-3, isoliert und die Sequenz bestätigt durch Kartieren mit Restriktionsenzymen und durch Sequenzanalyse. Das Plasmid wurde dann verwendet, um E. coli BL21(DE3) zu transformieren, und die Transformanten wurden untersucht zur Expression der katalytischen Untereinheit durch Überwachen des Auftretens einer 38-40 kDa Bande nach Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
Zur Expression der katalytischen Untereinheit wurde 1 l L-Brühe (10% Trypton, 5% Hefeextrakt und 5% NaCl), enthaltend Ampicillin, mit 5 ml einer Kultur in der stationären Phase von BL21(DE3), das mit pLWS-3 transformiert war, beimpft und unter kräftigem Schütteln bei 37ºC gezüchtet, bis eine Absorption von 0,5 bei 590 nm erreicht war. Nach Zugabe von Isopropyl-β-D- thiogalactopyranosid auf eine Endkonzentration von 0,5 mM konnten die Zellen weitere 3 h bei 37ºC wachsen und wurden dann durch Zentrifugieren geerntet.
Das Reinigen der katalytischen Rekombinations-Untereinheit wurde durchgeführt durch erneutes Suspendieren der Perle in 6 ml Lyse-Puffer (30 mM MES, pH 6,45, 50 mM KCl, 1 mM EDTA und 5 mM β-Mercaptoethanol) bei 4ºC und zweimaliges Durchleiten, durch eine French-Druckzelle. Es wurde zusätzlicher Lyse-Puffer zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 30 ml zu bringen. Nach 15 min langem Zentrifugieren bei 12 000 · g bei 4ºC wurde der Überstand entfernt und mit eiskaltem Wasser verdünnt, bis die Leitfähigkeit unter 1,3 Mho lag. Der verdünnte Überstand wurde auf eine Phosphocellulose-Säule (Whatman P11, 2,0 · 8,0 cm) aufgebracht, die vorher mit Puffer I (30 mM MES, pH 6,45, 1 mM EDTA) äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit dem Äquilibrierungs-Puffer, bis die Absorption bei 280 nm 0 war, wurde die katalytische Untereinheit mit einem linearen Gradienten von Puffer I (50 ml) bis 0,5 M Kaliumphosphat, pH 7,0 (50 ml) eluiert. Es wurden Fraktionen von 2 ml gesammelt und solche, die Kinase-Aktivität enthielten, wurden zusammengegeben. Das Protein wurde durch chargenweise Zugabe von festem NH&sub4;SO&sub4; unter konstantem Rühren ausgefällt, bis die Lösung zu 80% gesättigt war. Der Niederschlag wurde gesammelt durch Zentrifugieren bei 12 000 · g während 20 min und dann erneut in 0,8 ml H&sub2;O suspendiert. Nach Entfernen des nicht gelösten Materials durch Zentrifugieren, wurde die Protein-Lösung auf eine UltrogelR AcA 44 (LKB) Gel-Filtrationssäule (1,0 · 116 cm), die mit 25 mM Kaliumphosphat, pH 6,8 äquilibriert war, aufgebracht. Die Kinase- Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden zusammen gegeben und durch Ultrafiltration unter Anwendung einer Amicon Vorrichtung und einer PM-30 Membran auf 1 mg/ml eingeengt. Nach der Polyacrylamidgel-Elektrophorese, die in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) nach Laemmli (1970), Nature 227, 680-685 durchgeführt wurde, war die katalytische Rekombinations-Untereinheit nahezu homogen und die Ausbeute betrug 3,5 bis 4,0 mg/l Kultur.
Katalytische Rekombinations-Untereinheit wurde mit 20 mM Tris, pH 7,5, auf 0,04 mg/ml verdünnt. Anteile von 50 ul wurden auf Eis gehalten und dann in ein Wasserbad von 49ºC gegeben. Zu den angegebenen Zeiten wurden Röhrchen entnommen, auf Eis gegeben und auf die Stabilität des Rekombinations-Proteins untersucht.
Es wurde ein isoelektrisches Fokusieren unter Anwendung eines LKH Muliphors Modell 2117 mit vorgegossenen LKB Ampholine Pagplates, pH 3,5 bis 9,5, durchgeführt. Die Standards waren Rinder-Kohlensäureanhydrase (pI 6,57), Myoglobin (pI 6,67 und 7,16) und Lactat-dehydrogenase (pI 8,55).
Das Molekulargewicht der katalytischen Rekombinations-Untereinheit wurde bestimmt durch Gelfiltration unter Anwendung einer LKB UltrogelR AcA 44 Säule (1,0 · 116 cm). Der laufende Puffer war 25 mM Kaliumphosphat (pH 6,8), 200 mM KCl und 0,2% Natriumazid. Die Standards und ihre jeweiligen M-Werte waren Ribonuclease A (13 700), Chymotrypsinogen A (25 000), katalyti sche Schweine-Untereinheit (38 000), Ovalbumin (43 000) und Rinder-Serumalbumin (67 000).
Die Sequenz der katalytischen Rekombinations-Untereinheit wurde mit einem Applied Biosystems Gasphasen Sequencer, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt.

Beispiel III

Reinigung von katalytischer Untereinheit von Säugetieren

Schweineherzen (40 Herzen) wurden homogenisiert und dann zentrifugiert. Der Überstand (Leitfähigkeit 3 Mho) wurde direkt durch eine DE-23 Säule (4 l Harz) geleitet, die mit 15 mM Kaliumphosphat, pH 6,5, 2 mM EDTA, 5 mM β-Mercaptoethanol äquilibriert war. Das Protein wurde von dem Harz mit Puffer E (40 mM Kaliumphosphat, pH 6,5, 2 mM EDTA, 5 mM β-Mercaptoethanol) eluiert. Der zusammengegebene Kinase-Peak wurde sofort auf eine Leitfähigkeit von 4 Mho eingestellt und an diesem Punkt wurden 1,5 l DE-52-Harz zugegeben und das Ganze 2 h mechanisch gerührt. Der Überstand wurde abgegossen und das Harz in eine Säule gegossen und ausgiebig mit Puffer E gewaschen und anschließend ausgiebig mit Puffer F (17 mM Kaliumphosphat, pH 6,1, 2 mM EDTA, 5 mM β-Mercaptoethanol) gewaschen. Die C-Untereinheit wurde dann mit 3 l 220 uM cAMP und anschließend mit 8 l Puffer F eluiert, und das Eluens wurde durch eine CM-Sepharose- Säule (50 ml Volumen) geleitet und dann mit einem linearen Gradienten von Puffer F, enthaltend 10% Glycerin, (250 ml) zu 200 mM Kaliumphosphat, pH 6,1, 10% Glycerin, 2 mM EDTA, 5 mM β-Mercaptoethanol (250 ml) eluiert.

Beispiel IV

Herstellung von markierter cAMP-abhängiger Proteinkinase

(a) Markierungs-Untereinheit

Katalytische und regulatorische Rekombinations-Untereinheiten (etwa 0,5-2,0 mg/ml) von cAMP-abhängiger Säugetier-Proteinkinase wurden, wie in Beispiel I und II beschrieben, gereinigt und wurden getrennt gegen 25 mM Bicin, pH 8,0, 0,1 mM EDTA 4 bis 5 h bei 0ºC dialysiert. Die katalytische Untereinheit wurde mit 0,3 mM Fluorescein-5'-isothiocyanat (FITC, Molecular Probes, Eugene, OR) in Gegenwart von 8 mM MgCl&sub2; und 5 mM ATP markiert, um eine Inaktivierung der Kinase-Aktivität zu vermeiden. Die regulatorische Untereinheit wurde mit 0,5 mM Tetramethylrhodamin-isothiocyanat (TRITC, Isomer G; Molecular Probes, Eugene, OR) markiert. Heide Markierungen konnten 30 min bei Raumtemperatur ablaufen, wurden dann durch Zugabe von 5 mM Glycin während 10 bis 15 min abgebrochen. Der überschüssige Farbstoff wurde entfernt durch Durchleiten jeder Protein-Lösung durch eine SephadexR G-25 Säule (3 ml), eluiert mit 25 mM Kaliumphosphat, pH 6,8, 2 mM EDTA, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin. Die erste gefärbte oder fluoreszierende Bande wurde gesammelt.
Die mit FITC markierte katalytische und die mit TRITC markierte regulatorische Untereinheit (gleiche Gewichtsmengen) wurden dann vermischt und gegen 25 mM Kaliumphosphat, pH 6,8, 0,5 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ATP, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 5% Glycerin 3 bis 5 Tage bei 4ºC dialysiert. Die Bildung von Holoenzym konnte durch Kinase-Assay, gemessen unter Anwendung von Kempide als Substrat (Slice & Taylor, a. a. O.) gezeigt werden.

(b) Markierungs-Holoenzym

cAMP-abhängiges Proteinkinase-Holoenzym (0,5-1,0 mg/ml), hergestellt aus katalytischen Säugetier- und regulatorischen Rekombinations-Untereinheiten, wurden gegen 25 mM Bicin, pH 8,0, 0,1 mM EDTA bei 4ºC dialysiert. MgCl&sub2; und ATP wurden zugegeben, um Endkorzentrationen von 8 mM bzw. 5 mM zu erreichen. Die Proteine wurden entweder mit Fluorescein-5'-isothiocyanat oder Tetramethylrhodamin-isothiocyanat (Isomer G) bei Raumtemperatur 20 bis 30 min bis zu Endkonzentrationen von 0,1 bis 0,5 mM markiert und anschließend mit 5 mM Glycin, pH 8,0, 10 min abgebrochen. Überschüssiger freier Farbstoff wurde (teilweise) entfernt durch Durchführen der Protein-Lösungen durch eine Säule von Sephadex G-25 (3 ml), Eluieren mit 10 mM Kaliumphosphat, pH 6,7, 150 mM KCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA (Puffer I) und Sammeln der ersten gefärbten Fluoreszenz-Bande.
Die markierten Holoenzyme wurden dann durch eine cAMP-Affinitätssäule (0,25 ml) (Wolfgang, W. et al., FEBS Lett. 92, 62 (1979)) mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,1 ml/min geleitet und dann mit 2 Säulenvolumina des Puffers I bei 4ºC eluiert. Die gesammelten Fraktionen enthielten markierte katalytische Untereinheit. Die Säule wurde mit Puffer I, enthaltend 1 KCl, (2 Säulenvolumina) und wieder mit dem Puffer I (2 Säulenvolumina) eluiert. Diese Waschflüssigkeiten können etwas zusätzli che markierte katalytische Untereinheit enthalten. Um die markierte regulatorische Untereinheit zu gewinnen, wurde die Säule langsam mit 30 mM cAMP in Puffer I (4 Säulenvolumina) bei Raumtemperatur innerhalb von 2 h eluiert.
Die unterschiedlich markierten Untereinheiten wurden in entsprechenden Donor/Akzeptor-Paaren rekombiniert und gegen mehrfach gewechseltes 25 mM Kaliumphosphat, pH 6,8, 0,5 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ATP, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 5% Glycerin 3 bis 5 Tage bei 4ºC dialysiert. Die Bildung von cAMPdPK-Holoenzym konnte überwacht werden durch der. Verlust von Kinase-Aktivität, die durch Zusatz von cyclischem AMP gewonnen werden kann.

Beispiel V

Titration von cAMP mit markiertem Holoenzym in vitro

Holoenzym (20 nM), das mit 5'-Fluorescein-isothiocyanat (5'-FITC) an der katalytischen Untereinheit und Tetramethylrhodamin-isothiocyanat (Isomer G) an der regulatorischen Untereinheit markiert war, wurde bei Raumtemperatur in 135 mM KCl, 10 mM KkMOPS, pH 7,2, 2 mM MgCl&sub2;, 1 mM ATP gelöst. Die Fluoreszenz-Emission wurde nach Anregung bei 495 nm, vor und nach der Zugabe vor. 20, 50, 100, 200, 400 nM, 1 und 51 uM cAMP gemessen (Fig. 2). In Fig. 1 sind wegen der Übersichtlichkeit nur die Spektren mit 0, 50, 200, 1000 nM cAMP angegeben. Das errechnete Emissions-Verhältnis bei 520 nm zu 580 nm, normalisiert auf das Verhältnis bei 0 cAMP ist mit den cAMP-Konzentrationen in Fig. 2 (Einfügung) aufgetragen und zeigt eine halb-maximale Veränderung des Verhältnisses bei etwa 100 nM cAMP an.

Beispiel VI

In vivo Messung von cAMP in einzelnen Zellen der glatten Muskulatur

In glatte Muskelzellen (Zellinie BC&sub3;H&sub1;) wurden 60 uM Holoenzym, das mit 5'FITC an der Untereinheit C und TRITC an der Untereinheit RI markiert war, wie von Riabowol, Gilman & Feramisco, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 53, 85-90 (1988) angeben, mikroinjiziert (Fig. 3). Nach 15 bis 20 min wurden die Zellen auf einem Objektträger eines Fluoreszenz-Mikroskops bei Raumtemperatur mit Licht von 490 nM bestrahlt. Das emittierte Licht wurde nach dem Durchgang durch entweder einen 500-530 nm Bandfilter oder einen 580 nm Langfilter mit einer Silicone Intensified Target Kamera. (Dage-NTI) nachgewiesen. Die beiden Abbildungen pro Zeitpunkt wurden mit einer Bildverarbeitungs-Vorrichtung digitalisiert, das Verhältnis von 500-530 nm zu > 580 nm wurde an jedem Punkt berechnet und in Pseudofarben auf einem Fernsehbildschirm dargestellt. Das mittlere Verhältnis in einer repräsentativen Zelle wurde zu jedem Zeitpunkt bestimmt und ergab die Fig. 3. Zum Zeitpunkt 1 wurden 250 uM Dibutyryl-cAMP, ein membrandurchgängiges cAMP- Analoges, zugegeben, was zu einem allmählichen Anstieg des Verhältnisses führte, was eine Zunahme von cAMP-Analogen im Inneren der Zelle anzeigt.
In einem getrennten Versuch würden BC&sub3;H&sub1;-Zellen mikroinjiziert und das Emissions-Verhältnis wie oben beschrieben bestimmt. Es wurden die folgenden Zugaben durchgeführt, die Tabelle 4 gezeigt sind: (1) 100 nM Isoproterenol, (2) 100 nM Propranolol, (3) 50 uM Forskolin, (4) 250 uM Dibutyryl-cAMP. Die Zugabe von Isoproterenol, einem β&sub2;-adrenergen Agonisten, zeigte ein schnelles Ansteigen des Emissions-Verhältnisses und daher eine cAMP-Konzentration in der Zelle an, die anschließend durch Propranolol, (einem β&sub2;-adrenergen Antagonisten) abnahm. Eine direkte Aktivierung von Adenylatcyclase durch Forskolin führte zu einem maximalen Emissions-Verhältnis, da keine weitere Wirkung mit Dibutyryl-cAMP, einem membrandurchgängigen cAMP-Analogen, zu beobachten war.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend (S&sub1;.A)n1 und (S&sub2;.D)n2, wobei S&sub1; die regulatorische Untereinheit von Adenosin-3',5'-cyclischem-monophosphat-abhängiger Proteinkinase und S&sub2; die katalytische Untereinheit von Adenosin-3',5'-cyclischem-monophosphat-abhängiger Proteinkinase ist und wobei D und A unterschiedliche Fluorochrome sind, die Emissions-Wellenlänge von D die Anregungs-Wellenlänge von A überlappt und D und A sich in ausreichender Nähe befinden, um eine Übertragung von Fluoreszenzenergie zwischen den Fluorochromen zu erlauben, und wobei n1 und n2 die Stöchiometrie der Untereinheiten in der Zusammensetzung angeben.

2. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Adenosin- 3',5'-cyclischem monophosphat in einer Probe, umfassend:

(a) Bilden des durch die Formel (S&sub1;.A)n1 und (S&sub2;.D)n2 angegebenen Komplexes, wobei S&sub1; die regulatorische Untereinheit von Adenosin-3',5'-cyclischem-monophosphat-abhängiger Proteinkinase und S&sub2; die katalytische Untereinheit von Adenosin-3',5'-cyclischem-monophosphat-abhängiger Proteinkinase ist und wobei D und A unterschiedliche Fluorochrome sind, die Emissions-Wellenlänge von D die Anregungs-Wellenlänge von A überlappt und D und A sich in dem Komplex in ausreichender Nähe befinden, um eine Übertragung von Fluoreszenzenergie zwischen den Fluorochromen zu erlauben, und wobei n1 und n2 die Stöchiometrie der Untereinheiten in dem Komplex angeben;

(b) Zusammenbringen des Komplexes mit der Probe;

(c) Aussetzen der Probe Strahlungsenergie, nahe der Anregungs-Wellenlänge von D und

(d) Messen der bei der Emissions-Wellenlänge von mindestens einem von D und A.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Meßstufe die Messung der bei der Emissions-Wellenlänge von beiden A und D ausgesandten Fluoreszenz umfaßt, wobei das Ausmaß der Energieübertragung von D nach A bestimmt wird durch das Verhältnis der Emissions-Amplitude von A zu der Emissions-Amplitude von D.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Meßstufe die Messung der bei der Emissions-Wellenlänge von D emittierten Fluoreszenz und Bestimmung des Ausmaßes der Energieübertragung von D nach A durch die Lebensdauer der Fluoreszenz von D oder der Geschwindigkeit des Photobleichens von D umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Probe eine intakte Zelle umfaßt und die Stufe des Zusammenbringens den Einbau des Komplexes in die Zelle umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Stufe des Zusammenbringens ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Mikroinjektion, Elektroporation und Lipofektion.

7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei D und A ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus:

Fluorescein und Tetramethylrhodamin;

einem 7-Aminocumarin und Dipyrromethenborat;

einem Indocarbocyanin und Rhodamin X und

einem Phykoerythrin und Allophykocyanin oder Derivaten davon, mit der Maßgabe, daß das ausgewählte Paar eine Floreszenzenergieübertragung zeigt.

8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Emissions-Wellenlänge von D und die Anregungs-Wellenlänge von A etwa 510 bis 550 nm betragen.

9. Verfahren nach Anspruch 2, wobei n1 1 ist und n2 2 ist.

10. Verfahren nach Anspruch 2, wobei S&sub1; und S&sub2; Rekombinationsproteine sind.

11. Verfahren zur Herstellung eines markierten Komplexes, umfassend (S&sub1;.A)n1 und (S&sub2;.D)n2, wobei S&sub1; die regulatorische Untereinheit von Adenosin-3',5'-cyclischem-monophosphat- abhängiger Proteinkinase und S&sub2; die katalytische Untereinheit von Adenosin-3',5'-cyclischem-monophosphat-abhängiger Proteinkinase ist und wobei D und A unterschiedliche Fluorochrome sind, die Emissions-Wellenlänge von D die Anregungs- Wellenlänge von A überlappt und D und A sich in dem Komplex in ausreichender Nähe befinden, um eine Übertragung von Fluoreszenzenergie zwischen den Fluorochromen zu erlauben, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Vermischen der markierten Untereinheiten S&sub1;.A und S&sub2;.D unter Bedingungen, die geeignet sind zur Bildung eines Komplexes umfassend {(S&sub1;.A)n1.(S&sub2;.D)n2}, wobei n1 und n2 die Stöchiometrie der Untereinheiten in dem Komplex angeben, und wobei die Fluorochrome sich in ausreichender Nähe befinden, um eine Übertragung der Fluoreszenzenergie zwischen den Fluorochromen zu erlauben, und

(b) Gewinnen des Komplexes.

12. Verfahren zur Herstellung eines markierten Komplexes, umfassend (S&sub1;.A) und (S&sub2;.D), wobei S&sub1; die regulatorische Untereinheit von Adenosin-3',5'-cyclischem-monophosphat- abhängiger Proteinkinase und S&sub2; die katalytische Untereinheit von Adenosin-3',5'-cyclischem-monophosphat-abhängiger Proteinkinase ist und wobei D und A unterschiedliche Fluorochrome sind, die Emissions-Wellenlänge von D die Anregungs- Wellenlänge von A überlappt und D und A sich in dem Komplex in ausreichender Nähe befinden, um eine Übertragung von Fluoreszenzenergie zwischen den Fluorochromen zu erlauben, wobei ein erster Komplex, umfassend S&sub1; und S&sub2;, an das Fluorochrom A gebunden wird und ein zweiter Komplex, umfassend S&sub1; und S&sub2;, an das Fluorochrom D gebunden wird, wobei die Untereinheiten des ersten und des zweiten Komplexes getrennt werden, um markierte Untereinheiten S&sub1;.D, S&sub2;.D, S&sub1;.A und S&sub2;.A zu erhalten, wobei das Verfahren das Vermischen der markierten Untereinheiten unter Bedingungen umfaßt, bei denen die Fluorochrome in ausreichende Nähe kommen, um eine Übertragung von Fluoreszenzenergie zwischen den Fluorochromen zu erlauben, was zur Bildung von markierten Komplexen {(S&sub1;.D)n1.(S&sub2;.A)n2} oder {(S&sub1;.A)n1.(S&sub2;.D)n2} führt, wobei n1 und n2 die Stöchiometrie der markierten Untereinheiten angeben.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Fluorochrome Fluorescein und Tetramethylrhodamin oder Derivate davon sind.

14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei S&sub1; und S&sub2; Rekombinationsproteine sind.