ITTO20070687A1

ITTO20070687A1 - Nuovo mutante di gfp sensibile al ph e alla concentrazione di anioni, proteina chimerica comprendente tale mutante e procedimento di determinazione combinata del ph e della concentrazione di anioni

Info

Publication number: ITTO20070687A1
Application number: IT000687A
Authority: IT
Inventors: Daniele Arosio; Fabio Beltram; Laura Marchetti; Fernanda Ricci
Original assignee: Consiglio Nazionale Ricerche
Priority date: 2007-10-01
Filing date: 2007-10-01
Publication date: 2009-04-02
Also published as: ATE530571T1; EP2045264A3; EP2045264B1; EP2045264A2

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo:

"Nuovo mutante di GFP sensibile al pH e alla concentrazione di anioni , proteina chimerica comprendente tale mutante e procedimento di determinazione combinata del pH e della concentrazione di anioni" .

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce in generale ad una nuova proteina fluorescente sensibile al pH ed alla concentrazione di anioni, ad una proteina chimerica comprendente tale proteina fluorescente e ad un procedimento di determinazione combinata del pH e della concentrazione di anioni che impiega tale proteina chimerica.

Più in particolare, la nuova proteina fluorescente dell'invenzione è un mutante della proteina GFP ("Green Fluorescent Protein”).

La forma nativa della proteina GFP ( "wild-type-GFP", GFP) è una proteina di una medusa (Aequorea victoria) dì 238 amminoacidi e 27 kD di peso molecolare, responsabile della luminescenza verde dell'animale tramite un meccanismo di fotoconversione della luce blu emessa da una seconda proteina attivata dal calcio denominata aequorina . La caratterizzazione della proteina GFP ha dimostrato che le sue proprietà ottiche sono indipendenti da cofattori e che la sua fluorescenza può essere eccitata indipendentemente dall'aequorina con illuminazione a lunghezze d'onda caratteristiche.

La sequenza aminoacidica della GFP nativa (wtGFP) è qui rappresentata nella sezione intitolata "Elenco delle sequenze" come SEQ ID N0:1.

Nella tecnica anteriore sono descritti parecchi mutanti della proteina GFP selvatica, incluso quello denominato E2GFP, avente la sequenza amminoacidica rappresentata nell'Elenco delle sequenze come SEQ ID NO:2. Tale mutante è descritto nel brevetto italiano IT 1320791 , che designa alcuni dei presenti inventori, in cui è anche fornita la sequenza nucleotidica codificante per la proteina E2GFP.

I presenti inventori hanno proseguito gli studi relativi ai mutanti della GFP, in particolare alla proteina E2GFP, ed hanno verificato che la doppia mutazione S65T/T203Y in essa contenuta determina una marcata sensibilità della sua fluorescenza al pH e alla concentrazione di anioni. A tale riguardo ai veda ad esempio Arosio D, Garau G, Ricci F, Marchetti L, Bizzarri R, Nifosi R, Beltram F. Biophys J. 2007 Jul 1;93 (1):232-44. Epub 2007 Apr 13.

Sensori basati su proteine fluorescenti sensibili a parametri chimici quali il pH e la concentrazione di anioni sono descritti nella tecnica anteriore . La domanda di brevetto europea EP 1514922 descrive un procedimento per il monitoraggio delle variazioni della concentrazione di anioni o delle variazioni di pH che impiega come elemento sensore un costrutto comprendente una prima proteina fluorescente che è un mutante della Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP), detto mutante essendo atto a legare gli anioni ed avendo una fluorescenza che è sensibile al pH, ed una seconda proteina fluorescente che è atta a esibire FRET con il mutante della EYFP, la prima e la seconda proteina essendo collegate da un peptide linker.

Il sistema sensore descritto in EP 1514922 permette di monitorare variazioni di pH o, in alternativa, variazioni della concentrazione di anioni, ma non permette di effettuare misurazioni combinate del pH e della concentrazione di anioni.

Nell'articolo sopra citato di Arosio D., et al., 2007, gli autori accennano alla possibilità di utilizzare la proteina E2GFP come sensore combinato dì pH e ioni cloro. Questo articolo tuttavia non indica in che modo possa essere realizzato un tale sensore combinato .

La tecnica anteriore in questo settore è quindi caratterizzata da forti limitazioni, che vengono superate dal nuovo mutante della proteina GFP oggetto della presente invenzione e dalla proteina chimerica comprendente tale mutante.

Un primo oggetto dell'invenzione è quindi un mutante della proteina GFP selvatica avente la sequenza aminoacidica rappresentata nell'Elenco delle sequenze come SEQ ID NO:3, denominato D3GFP.

La sequenza di D3GFP deriva dalla sequenza della GFP selvatica a seguito delle seguenti sostituzioni: (i) sostituzione del residuo di fenilalanina (F) in posizione 64 con un residuo di leucina (L) [F64L];

(ii) sostituzione del residuo di serina (S) in posizione 65 con un residuo di treonina (T) [S65T];

(iii) sostituzione del residuo di treonina (T) in posizione 203 con un residuo di tirosina (Y) [T203Y]; e (iv) sostituzione del residuo di vaiina (V) in posizione 224 con un residuo di leucina (L) [V224L].

Le caratteristiche principali del mutante D3GFP dell'invenzione sono la capacità di legare gli ioni cloro con affinità molto elevata e la sensibilità della fluorescenza sia al pH sia alla concentrazione di anioni. L'affinità di D3GFP verso gli ioni cloro è estremamente elevata, pur variando in dipendenza del pH. La costante dì dissociazione del legame degli ioni cloro a D3GFP a pH < 6,0 calcolata dai presenti inventori è di circa 1 mM, ossia un ordine di grandezza inferiore rispetto al corrispondente valore calcolato per il mutante noto E2GFP (<c1>Ka ≈ 12-15 mM) (cfr. figura 1). Ciò significa che l'affinità del mutante D3GFP dell'invenzione verso gli ioni cloro supera di circa un ordine di grandezza quella del mutante noto E2GFP. Come verrà spiegato in dettaglio più avanti, tali caratteristiche rendono il mutante D3GFP particolarmente adatto ad essere impiegato per la costruzione di un sensore atto a misurare con elevata sensibilità sia il pH sia la concentrazione di anioni, in particolare ioni cloro, in un campione.

Il mutante D3GFP della presente invenzione può essere ottenuto mediante tecniche di mutagenesi e tecniche del DNA ricombinante di per sé note all'esperto del settore.

Le tecniche di mutagenesi prevedono la creazione di mutazioni in una sequenza nucleotidica nota di partenza - ad esempio la sequenza codificante per la proteina GFP o per un suo mutante quale E2GFP o EGFP che determinano l'alterazione della sequenza amminoacidica della proteina codificata dalla sequenza nucleotidica. Le tecniche di mutagenesi comprendono ad esempio la mutagenesi sito-specifica.

Con l'impiego delle tecniche di mutagenesi, si ottiene un acido nucleico mutato avente una sequenza nucleotidica codificante per la sequenza amminoacidica del mutante D3GFP sopra descritto.

L'esempio l illustra la preparazione della sequenza nucleotidica codificante per il mutante D3GFP dell'invenzione a partire dal gene codificante per la proteina EGFP - la cui sequenza aminoacidica differisce da quella della GFP selvatica per le due sostituzioni F64L e S65T - e la successiva amplificazione mediante PCR. L'esempio è fornito unicamente a scopo illustrativo e non è da interpretarsi in modo limitativo, in quanto la scelta del procedimento di mutagenesi impiegato non è critica ai fini dell'ottenimento del risultato desiderato.

Un secondo oggetto dell'invenzione è quindi un acido nucleico isolato comprendente una sequenza codificante per il mutante D3GFP dell'invenzione. Tale sequenza codificante per D3GFP ha preferibilmente la sequenza nucleotidica rappresentata in SEQ ID NO: 4, La proteina D3GFP dell'invenzione viene prodotta ad esempio mediante la tecnologia del DNA ricombinante a partire dall'acido nucleico ottenuto per mutagenesi. A questo scopo, la sequenza nucleotidica codificante per D3GFP viene inserita all'interno di un vettore di espressione , ossia una struttura molecolare contenente almeno la sequenza di un promotore costitutivo o inducibile in grado di facilitare la trascrizione del gene inserito. Il vettore di espressione viene a sua volta inserito in una cellula bersaglio, altresì detta cellula ospite, all'interno della quale è in grado di indurre l'espressione della sequenza peptidica codificata. Come è noto, i vettori di espressione possono includere anche sequenze di controllo dell'espressione operativamente collegate alla sequenza codificante per il prodotto proteico di interesse. Rientrano pertanto nella portata della presente invenzione un vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica codificante per la proteina D3GFP definita in precedenza ed una cellula ospite trasformata comprendente tale vettore di espressione.

Sono noti diversi tipi di vettori di espressione, ciascuno adattato per funzionare nel tipo di cellula ospite desiderata . Esempi di vettori adatti per il trasferimento e l'espressione della sequenza nucleotidica dell'invenzione sono vettori plasmidici, ad esempio costruiti per l'espressione in cellule batteriche o di lievito e vettori virali, ad esempio costruiti per l'espressione in cellule di insetto o di mammifero. Esempi di cellule ospiti adatte per 1'espressione della sequenza nucleotidica dell'invenzione sono cellule procariotiche, ad esempio cellule batteriche quale Escherichia coli, e cellule eucariotiche, ad esempio cellule di lievito, quali Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, e cellule di insetto, in particolare cellule infettabilì con baculovirus ricombinanti. Tali sistemi di espressione vettore/cellula ospite sono anch'essi ampiamente noti nella tecnica anteriore. La scelta di un particolare sistema vettore/ospite non è critica ai fini dell'ottenimento del risultato desiderato, e rientra nelle capacità del tecnico medio del settore. Il trasferimento del vettore di espressione negli organismi sopra menzionati può essere effettuato con una qualsiasi delle tecniche di trasferimento genico note, ad esempio la trasfezione di DNA plasmidico con metodi chimici, fisici o virali.

Mediante la tecnologia del DNA ricombinante è dunque possibile ottenere cellule eucariotiche o procariotiche transientemente o stabilmente trasformate con un vettore atto ad esprìmere la proteina D3GFP di interesse. La proteina D3GFP così prodotta può essere purificata dalle summenzionate cellule ospiti. Esempi di metodologie di purificazione adatte sono la purificazione tramite tecniche cromatografiche da E. coli, la fusione della proteina di interesse con epitopi riconoscibili tramite anticorpi monoclonali o policlonali, la fusione della proteina di interesse con domini proteici in grado di legarsi a colonne di affinità (ad esempio, sequenze di poli-istidine, glutatione-S-trasferasi, peptidi mimetici della biotina come strep-tag, proteina legante il maltosio, e simili).

Come menzionato in precedenza, le particolari caratteristiche di fluorescenza e di legame con gli ioni cloro del mutante D3GFP della presente invenzione rendono tale proteina particolarmente adatta per l'impiego nella costruzione di un sensore combinato per pH e anioni.

A questo scopo viene costruita una proteina chimerica comprendente una prima proteina fluorescente, designata come P1, ed una seconda proteina fluorescente, designata come P2.

P1 è una proteina le cui caratteristiche di fluorescenza variano in dipendenza sia del pH sia della concentrazione di anioni. Preferibilmente, P1 è il mutante D3GFP dell'invenzione, ma può anche essere un'altro mutante della GFP con caratteristiche similari a quelle di D3GFP, come ad esempio E2GFP.

P2 è una proteina fluorescente le cui caratteristiche di fluorescenza sono indipendenti sia dal pH sia dalla concentrazione di anioni. Inoltre, P2 è scelta in modo tale che non vi sia sostanziale sovrapposizione tra gli spettri di fluorescenza di P1 e P2, sia in emissione sia in eccitazione. Questo requisito è considerato soddisfatto quando tra le due proteine P1 e P2 non si verifica il fenomeno di trasferimento di energia indicato convenzionalmente come FRET o, al più, la FRET è così blanda da non interferire in modo significativo con le caratteristiche di fluorescenza delle due proteine.

Un esempio di proteina chimerica dell'invenzione atta ad essere utilizzata come sensore combinato di pH e anioni, in particolare ioni cloro, è la proteina chimerica costituita dal mutante D3GFP collegato alla proteina monomerica rossa fluorescente (DsRed-monomer, disponibile in commercio ad esempio da Clontech) attraverso una corta sequenza peptidica denominata "peptide linker". Un esempio di peptide linker adatto allo scopo è il peptide di 20 aminoacidi rappresentato in SEQ ID NO:5.

Altre proteine utilizzabili come proteina P2 nella chimera proteica dell'invenzione sono tutti i monomeri derivati da mRFPl, come mTangerine, mStrawberry, mCherry, mGrapel, mRaspberry, mPlum, ed inoltre TdTomato, dTomato, [Shaner, N. C.; Campbell, R. E.; Steinbach, P. A.; Giepmans, B. N. G.; Palmer, A. E. & Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol, 2004, 22, 1567-1572] DsRed [clontech] (Tsien Lab), oppure HcRed [evrogen] [Gurskaya, N. G.; Fradkov, A. F.; Terskikh, A.; Matz, M. V. ; Labas, Y. A.; Martynov, V, I.; Yanushevich, Y, G.; Lukyanov, K. A. & Lukyanov, S. A. GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett, Shemiakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Moscow, Russia ., 2001, 507, 16-20], Red EosFP [Wiedenmann, J.; Ivanchehko, S.; Oswald, F.; Schmitt, F.; Rocker, C.; Salih, A.; Spindler, K. & Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Nati Acad Sci U S A, Department of General Soology and Endocrinology, University of Ulm, 89069 Ulm, Germany., 2004, 101, 15905-15910] .

La proteina chimerica può essere ottenuta impiegando metodologie note all'esperto del settore, mediante la costruzione di vettori di espressione come descritto in precedenza, detti vettori contenendo, in aggiunta alla sequenza di acido nucleico codificante per il mutante D3GFP, anche la sequenza di acido nucleico codificante per la proteina P2 e l'oligonucleotide codificante per il peptide linker. Le sequenze di acido nucleico codificanti per la proteina P2 e per il peptide linker possono essere poste sotto il controllo dalle stesse sequenze regolative (per esempio, un promotore) che governano l'espressione di D3GFP. E' possibile in questo modo ottenere vettori di espressione e cellule procariotiche od eucariotiche in grado di esprimere in modo stabile o transiente chimere proteiche costituite da un polipeptide di fusione che presenta, oltre alle caratteristiche di fluorescenza del mutante D3GFP, anche le caratteristiche di fluorescenza tipiche della proteina fluorescente F2.

Rientrano quindi nell'ambito dell'invenzione anche un vettore di espressione comprendente un acido nucleico codificante per la proteina chimerica sopra descritta ed una cellula ospite trasformata comprendente tale vettore di espressione.

La proteina chimerica dell'invenzione è particolarmente adatta ad essere utilizzata come elemento sensore per la misurazione combinata del pH e della concentrazione di anioni in un campione, in particolare in un campione biologico, come ad esempio una coltura cellulare . Inoltre, poiché la proteina chimerica può essere transfettata all'interno di una cellula eucariotica o procariotica, sia indirizzata verso specifici compartimenti subcellulari attravesro fusione a specifiche sequenze di localizzazione o a specifiche macromolecole, sia distribuita uniformemente nella cellula stessa, la proteina chimerica può vantaggiosamente essere utilizzata per misurazioni intracellulari combinate del pH e della concentrazione di anioni, in particolare ioni cloro. L'utilizzo della proteina chimerica come sensore è reso possibile dalle sue particolari caratteristiche di fluorescenza. L'esempio 4 descrive in dettaglio lo studio delle caratteristiche di fluorescenza della proteina chimerica D3GFP-linker- DsRed-monomer (linker = SEQ ID N0:5), ma i risultati ottenuti con tale studio e le conclusioni che se ne possono trarre hanno validità generale, nel senso che sono applicabili a tutte le proteine chimeriche rientranti nell'ambito della presente invenzione.

In sìntesi, lo spettro di eccitazione di D3GFP-linker-DsRed-monomer è caratterizzato da una regione in cui la fluorescenza varia in dipendenza del pH e della concentrazione di anioni e da una regione in cui la fluorescenza è indipendente dal pH e dalla concentrazione di anioni.

L'analisi della dipendenza dello spettro di eccitazione dal pH (fig. 2B) mostra la presenza di un punto isosbestico a circa 470-475 nm con un pk di circa 6.3 , che rende possibile la determinazione del pH nell'intervallo di circa 4,5 a 8,5 a 37°C con misure ratiometriche in eccitazione. In particolare, tale determinazione può essere effettuata in base al valore di un parametro dello spettro di eccitazione denominato R1che ha la caratteristica di variare in dipendenza del pH ma non della concentrazione di ioni cloro. Confrontando il valore di R1determinato per il campione del test con una curva di calibrazione precedentemente costruita utilizzando campioni di riferimento a pH noto, è possibile determinare il valore del pH nel campione del test.

Preferibilmente, R1è dato dalla seguente formula generale :

in cui A è la fluorescenza emessa a seguito di eccitazione alla lunghezza d'onda di 488 nm e B è la fluorescenza emessa a seguito di eccitazione alla lunghezza d'onda di 458 nm.

Preferibilmente, la fluorescenza ottenuta con eccitazione alla lunghezza d'onda di 488 nm e la fluorescenza ottenuta con eccitazione alla lunghezza d'onda di 458 nm vengono misurate nel range di emissione 500-550 nm.

Inoltre, l'analisi della dipendenza dello spettro di eccitazione dalla concentrazione di ioni cloro (fig.

3), mostra l'esistenza di una correlazione fra fluorescenza di eccitazione e concentrazione di ioni cloro, che rende possibile la determinazione della concentrazione di ioni cloro nell'intervallo di circa 0,5 a 500 mM a 37°C con misure raziometriche in eccitazione . In particolare, tale determinazione viene effettuata in base al valore di un parametro dello spettro di eccitazione denominato R2, che ha la caratteristica di variare in dipendenza sia del pH sia della concentrazione di ioni cloro. Confrontando il valore di R2determinato per il campione del test con una curva di calibrazione precedentemente costruita utilizzando campioni di riferimento a concentrazioni note di ioni cloro ed aventi il pH determinato in base al parametro R1, è possibile determinare la concentrazione di anioni nel campione del test. Preferibilmente, R2è dato dalla seguente formula generale :

in cui A e B sono come definiti sopra e C è la fluorescenza emessa a seguito di eccitazione alla lunghezza d'onda di 543 nm.

Osservando la fig. 3 si nota come la fluorescenza di eccitazione alla lunghezza d'onda di 543 nm rimanga sostanzialmente invariata al variare della concentrazione di cloro. La fluorescenza a λex= 543 nm viene quindi utilizzata come normalizzazione.

La proteina chimerica dell'invenzione può essere utilizzata per la determinazione combinata del pH e della concentrazione di anioni in guaisiasi campione, preferibilmente un campione di origine biologica. Inoltre, poiché tale proteina può essere transfettata all'interno di una cellula, tale proteina può vantaggiosamente essere utilizzata per misurazioni intracellulari combinate del pH e della concentrazione di anioni, in particolare ioni cloro.

Gli esempi che seguono sono fom iti esclusivamente a scopo illustrativo e non sono intesi a limitare in alcun modo la portata della presente invenzione.

Esempio 1: Preparazione del mutante D3GFP

La sintesi del mutante D3GFP è stata effettuata a partire dal gene codificante per la E2GFP (ref. D. Arosio et al.) che possiede le quattro sostituzioni amminoacidiche F64L, S65T, T203Y e H231L. La mutagenesi sito-specifica è stata ottenuta mediante il kit di mutagenesi QuikChange<®>Site-Directed Mutagenesis .Kit (Stratagene), utilizzando oligonucleotidi disegnati per contenere sostituzioni nucleotidiche atte a determinare la sostituzione aminoacidica V224L (Forward: 5'-GTCCTGCTGGAGTTCCTGACCGCCGCCGGGATC -3' (SEQ ID NO;9)); Reverse: 5'- GATCCCGGCGGCGGTCAGGAACTCCAGCAGGAC-3' (SEQ ID NO:10)).

In questo modo è stato ottenuto l'acido nucleico codificante per la proteina D3GFP, avente la sequenza SEQ ID NO:4.

L'acido nucleico codificante è stato amplificato per POR usando oligonucleotidi che introducono i siti di restrizione compatibili con quelli di un vettore di espressione attraverso procedure standard di biologia molecolare .Nel vettore è codificata una coda di 8 amminoacidi riconosciuta dalla streptavidina (pPR-IBA 2, IBA GmbH, Germania) o una coda di poli-istidina (pET-151/D-TOPO, Invitrogen), così da facilitare la purificazione tramite cromatografia di affinità della proteina ricombinante espressa.

Il vettore di espressione contenente l'inserto codificante per D3GFP è poi stato trasferito in E. coli competenti tramite una procedura classica di shock termico . A seguito della reazione, il vettore viene riconosciuto dall'apparato replicativo e traduzionale della cellula batterica . Il vettore contiene un promotore di tipo inducibile sotto il controllo dell' induttore isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG).

La massima espressione proteica da E. coli è stata ottenuta a 30°C, 20 ore post induzione.

La proteina è stata estratta dai batteri tramite una procedura standard di sonicazione.

La purificazione della proteina dal U sato batterico è stata ottenuta mediante una prima cromatografia su colonna arricchita di streptavidina (IBA GmbH) oppure su una colonna di Nickel (HìTrap, Pharmacia) ed una seconda purificazione con una colonna a scambio ionico (Resource Q, Pharmacia) che separa le proteine in base alla loro carica, ottenendo in maniera riproducibile dei campioni perfettamente monodispersi di elevata purezza e concentrazione in un buffer di eluizione (20 mM dietanolammina pH 8,6, 250 mM Na2SO4) privo di ioni alogeni come richiesto per i successivi studi di fotofisica e affinità per gli alogeni stessi.

La monomericità delle proteine è stata accertata mediante cromatografia per esclusione.

Esempio 2: Clonaggio del costrutto E2GFP-linker-DsRedmonomer

Il costrutto tandem codificante per la proteina chimerica E2GFP-linker -DsRed-monomer è stato ottenuto mediante una reazione di ligazione standard (catalizzata dall'enzima T4 DNA ligasi) tra il prodotto dì PCR codificante per E2GFP (SEQ ID NO:2), l'oligonucleotide a doppio filamento codificante per il linker peptidico (SEQ ID NO:5) e il prodotto di PCR codificante per DsRed-monomer (SEQ ID NO:7). Tutti i costrutti sono stati successivamente sequenziati per l'intera lunghezza degli inserti(SEQ ID NO:8).

Il costrutto ottenuto è stato amplificato per PCR usando oligonucleotidi che introducono i siti di restrizione compatibili con quelli del plasmide di espressione batterica pBR-IBA 2 (IBA, GmbH) attraverso procedure standard di biologia molecolare.

La proteina chimerica ricombinante è stata espressa in batteri (E. coli) e purificata secondo la procedura descritta nell'esempio 1.

Esempio 3: transfezione della proteina chimerica E2GFP-linker-DsRed-monomer

Il cDNA del costrutto ottenuto nell'esempio 2 è stato estratto per POR dal vettore pBR-IBA 2 e subclonato nel plasmìde di espressione eucariotica pcDNA3 .1+ (Invitrogen) contenente il promotore eucariotico CMV,

Il costrutto è stato transfettato in due linee cellulari differenti:

(i) linea di fibroblasti 3T3 Swiss esprimenti CFTR umana selvatica (CFTR = proteina regolatrice della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica) (Galletta, L. J.; Haggie, P. Ni. & Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with ìmproved chloride and iodide affinities. FEBS Lett, 2001, 499, 220-224; Jayaraman, S.; Haggie, P.; Wachter, R. M.; Remington, Ξ. J. SÌ Verkman, A. S. Mechanism and cellular applications of a green fluorescent protein-based halide sensor. J Biol Chem, 2000, 275, 6047-6050);

(ii) linea cellulare HEK293 (cellule renali embrionali umane) esprimenti il recettore A dell'acido γamminobutirrico (GABAA) (Wong, G.; Sei, Ύ. & Skolnick, P. Stable expression of type I gamma-aminobutyric acidA/benzodiazepine receptors in a transfected celi line. Mol Pharmacol, 1992, 42, 996-1003).

Le cellule indicate in (i) e in (ii) sono state pìastrate su coprioggetti (diametro 18 mm) rivestiti di poli-lisina e transfettate con 400 ng di plasmide usando il kit Effectene (Quiagen) seguendo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state fatte crescere a 37°C (95% aria, 5% CO2) usando DMEM e osservate 2-3 giorni dopo la transfezione.

Esempio 4: Studio delle proprietà di fluorescenza Sono state studiate le proprietà di fluorescenza dei mutanti E2GFP e D3GFP e della proteina chimerica D3GFP-linker-DsRed-monomer dell'invenzione, ottenuta seguendo le istruzioni fornite negli esempi precedenti da 1 a 3.

Innanzitutto è stato studiato come la fluorescenza dei due mutanti della Green Fluorescent Protein E2GFP e D3GFP vari in funzione del pH. I risultati ottenuti sono rappresentati in fig. 2, che mostra gli spettri di eccitazione dei due mutanti E2GFP (A) e D3GFP (B) a valori di pH variabili, I dati sono stati raccolti con uno spettrofluorimetro Cary Eclipse (Varian) nelle condizioni descritte sotto con riferimento alla figura 3, ad eccezione della lunghezza d'onda di emissione fissata a 523 nm e della temperatura controllata a 20°C. Nei riquadri di fig. 2A e 2B sono mostrati i rispettivi rapporti fra la fluorescenza di eccitazione a 488 nm e la fluorescenza di eccitazione a 458 nm e la dipendenza di tali rapporti dal pH, modellizzata secondo l'equazione di Grynkiewicz (Grynkiewicz, G., Poenie, M, & Tsien, R. Y.;1985. J. Biol. Chem 260, 3440-3450.). I pKa di E2GFP e D3GFP sono rispettivamente di 7,0 ± 0,15 e 6,3 ± 0,2.

Successivamente è stato studiato come la fluorescenza della proteina chimerica D3GFP-linker-DsRed-monomer vari in funzione della concentrazione di ioni cloro ([Cl) mM). I risultati ottenuti sono rappresentati in fig. 3, che mostra lo spettro di eccitazione a concentrazioni variabili di ioni cloro. I dati sono stati raccolti con uno spettrofluorimetro Cary Eclipse (Varian) con emissione fissata a 590 nm, fenditura di eccitazione ed emissione a una larghezza di banda di 5 nm. La temperatura era controllata a 37°C e la forza ionica della soluzione era mantenuta a 1 M con Na3SO4e NaCl. L'andamento del rapporto fra la fluorescenza di eccitazione a 514 nm e la fluorescenza di eccitazione a 543 nm {linee dei laser ad argon e ad elio/neon presenti nei microscopi confocali più comuni) in funzione di [Cl-] mM ottenuto dagli spettri è mostrato nel riquadro a destra. La curva mostrata nel riquadro a destra è stata ottenuta con l'equazione di Grynkiewicz {Grynkiewicz, G., Poenie, M. & Tsien, R. Y., 1985. J. Biol. Chem 260, 3440-3450.).

Infine sono stati effettuate delle calibrazioni in vivo del sensore D3GFP-linker-DsRed-monomer in dipendenza dal pH {fig. 3) e da [Cl-] mM.

La proteina chimerica D3GFP-linker-DsRed-monomer è stata transfettata nelle linee di cellule 3T3 e HEK293 come descritto nell'esempio 3 . La concentrazione intracellulare di ioni cloro è stata mantenuta a 90 mM.

Le misurazioni sono state effettuate con un microscopio a scansione laser confocale TCS SP2 (Leica Microsystems) usando un obiettivo ad immersione in olio 40X/1,25 NA (Leica HCX PL APO) ed una camera di incubazione a temperatura controllata. E' stata effettuata un'analisi a tre lunghezze d'onda di eccitazione, basata sull'acquisizione sequenziale di immagini con: (ch02) eccitazione a 458 nm e rivelazione dell'emissione a 500-550 nm, (ch03) eccitazione a 488 nm e rivelazione dell'emissione a 500-550 nm, e (ch05) eccitazione a 543 nm e rivelazione dell'emissione a 570-680 nm.

L'apertura del pinhole è stata mantenuta ad 1 unità di Airy. la velocità di scansione a 400 Hz e le dimensioni dell'immagine a 512 x 512 pixels.

In fig. 4 sono mostrati i risultati ottenuti a tre valori di pH differenti (riga in alto: pH = 4,95; riga centrale: pH = 6,64; riga in basso: pH = 8,32) e alle tre lunghezze d'onda di eccitazione sopra indicate (colonna a sinistra: λex 458 nm; colonna centrale λex 488 nm; colonna a destra: λex 543 nm).

In questa figura si vede come la fluorescenza di eccitazione aumenti all'aumentare del pH alle lunghezze d'onda di 458 nm e 488nm, mentre alla lunghezza d'onda di 543 nm la fluorescenza di eccitazione rimane costante, per cui questo valore viene usato come normalizzazione .

Il rapporto Ri = ch03/ch02 viene correlato al pH intracellulare , attraverso l'equazione di Grynkiewicz (cfr. fig. 5), mentre il rapporto R2= (ch03 ch02)/ (ch05) è correlato con la concentrazioni intracellulare di ioni cloro (cfr. fig. 6).

In fig. 5 è mostrato l'andamento del parametro R1 = ch03/ch02 in funzione del pH fra circa 4,5 < pH < 8,5.

In fig. 6 è mostrato l'andamento del parametro R2= (ch03 ch02)/(ch05) in funzione di [CI-] mM a due valori di pH, 6,3 e 7,35.

ELENCO DELLE SEQUENZE

SEQ ID ΝΟ:Ι: sequenza aminoacidica di GFP selvatica (wtGFP)

MSKGEELFTG W PILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG 40 KLTLKFICTT GKLPVPWPTL VTTFSYGVQC FSRYPDHMKQ 80 HDFFKSAMPE GYVQERTIFF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV 120 NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YIMADKQKNG 160 IKVNFKIRHN IEDGSVQLIAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY 200 LSTQSALSKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGIT HGMDELYK 238

SEQ ID NO:2 sequenza aminoacidica di E2GFP MSKGEELFTG W PILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG 40 KLTLKFICTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKQ 80 HDFFKSAMPE GYVQERTIFF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV 120 NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YIMADKQKNG 160 IKVNFKIRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY 200 LSYQSALSKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGIT LGMDELYK 238

SEQ ID NO:3 sequenza aminoacidica di D3GFP MSKGEELFTG W PILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG 40 KLTLKFICTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKQ 80 HDFFKSAMPE GYVQERTIFF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV 120 NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YIMADKQKNG 160 IKVNFKIRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY 200 LSYQSALSKD PNEKRDHMVL LEFLTAAGIT LGMDELYK 238

SEQ ID NO :4: sequenza nucleotìdica di D3GFP

ATGGCTAGCTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGG CGCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT TCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGG CGACGTAAACGGCCACAAGTTCAG CGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGC ACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGC CCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGC AGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAG CAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCC CGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTT CAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGC GCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACT TCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAG CTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGT CTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAAC ATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACAC CCCCATCGGCGACG GCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAG CTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCC CAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCCTGACCGCCGCCGGGATCACTCTC GGCATGGACGAGCTGTACAAG

SEQ ID NO:5: sequenza aminoad dica del peptide linker RGSASGGGGGLVPRGSASGA

SEQ ID NO:6: sequenza nucleotidica del peptide linker CGCGGATCCGCGTCTGGTGGTGGTGGTGGTCTAGTTCCACGTGGATCTGCCTCAGGAGCA SEQ ID NO : 7 : sequenza nucleotidica di DsRed-monomer ATG AC AACAC CGAGGACGTCAT C AAGG AGT T CATGCAGTTCAAGGTGCGCATGGAGGG C T C CGTGAACGGCCACTACTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCAAGCCCTACGAGGGCACC CAGACCGCCAAGCTGCAGGTGAC CAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGT CCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTA CATGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGG CTTCACCTGGGAGCGCTCCATGAACTTCGAGGACGGC GGCGTGGTGGAGGTGCAGCAGGACTC CTCCCTGCAGGACGGCACCTTCATCTACAAGGTGA AGTTCAAGGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTGCCGGCTG GGAGCCCTCCACCGAGAAGCTGTAC CCCCAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCTCCCAC GCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGC CACTACACCTGCGACTTCAAGACCGTGTACAAGGCCA AGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCAAC CACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCAACCA CAACGAGGACTACACCGTGGTGGAG CAGTACGAGCACGCCGAGGCCCGCCACTCCGGCTCC CAGTAG

SEQ ID NO:8: sequenza nucleotidica costrutto complessivo dell'esempio 2 (E2GFP-linker-DsRed-monomer)

ATGGCTAGCTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGGCGC CGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT TCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGAC GTAAACGGCCACAAGTTCAG CGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGC ACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGG CCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGC AGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAG CACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCC CGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTT CTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGC GCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACC CTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACT TCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCA CAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGT CTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGG CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAAC ATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACG GCCCCGTGCTGCTGCCCGACAAC CACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCC CAACGAGAAGCGCGATCACATGGTC CTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTC GGCATGGACGAGCTGTACAAGCGCGGATC CGCGTCTGGTGGTGGTGGTGGTCTAGTTCCAC GTGGATCTGCCTCAGGAGCAGACAACAC CGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCAGTTCAA GGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGG CCACTACTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGC AAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCGC CAAGCTGCAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCT TCGCCTGGGACATOCTGTCCCCCCAGTT CCAGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCC CGCCGACATCCCCGACTACATGAAG CTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCACCTGGGAGCGCTCC ATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGGAGGT GCAGCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCA CCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCAAGGG CGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTAATGCA GAAGAAGACTGCCGGCTGGGAGCCCTCCACCGAGAAGCTGTACCCCCAGGACGGCGTGCTG AAGGGCGAGATCTCCCACGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACACCTGCGACTTCA AGACCGTGTACAAGGCCAAGAAGC CCGTGCAGCTGCCCGGCAACCACTACGTGGACTCCAA GCTGGACATCACCAACCACAACGAGGACTACAC CGTGGTGGAGCAGTACGAGCACGCCGAG GCCCGCCACTCCGGCTCCCAGTAG

SEQ ID NO:9 (oligonucleotide mutagenico forward) :

GTC CTGCTGGAGT TCCTGACCGCCGCC GGGAT C

SEQ ID NO:10 (oligonucleotide mutagenico reverse) :

GAT CCCGGCGGCGGT CAGGAACT CCAGCAGGA C

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Proteina fluorescente avente la sequenza aminoacidica della proteina GFP selvatica di Aequorea victoria ad eccezione delle seguenti sostituzioni aminoacidiche : (i) sostituzione del residuo di fenilalanina (F) in posizione 64 con un residuo di leucina (L) [F64L]; (ii) sostituzione del residuo di serina (S) in posizione 65 con un residuo di treonina (T) [S65T]; (iii) sostituzione del residuo di treonina (T) in posizione 203 con un residuo di tirosina (Y) [T203Y]; (iv) sostituzione del residuo di valina (V) in posizione 224 con un residuo di leucina (L) [V224L]; (v) sostituzione del residuo di istidina (H) in posizione 231 con un residuo di leucina (L) [H231L].
2. Proteina fluorescente secondo la rivendicazione 1, avente la sequenza aminoacidica SEQ ID NO:3.
3. Acido nucleico isolato comprendente una sequenza nucleotidica codificante per una proteina fluorescente secondo la rivendicazione 1 o 2.
4. Acido nucleico isolato secondo la rivendicazione 3, comprendente la sequenza nucleotidica SEQ ID NO:4.
5. Proteina chimerica comprendente una prima proteina fluorescente P1 ed una seconda proteina fluorescente P2, in cui P1 è una proteina le cui caratteristiche di fluorescenza variano in dipendenza sia del pH sia della concentrazione di anioni e P2 è una proteina fluorescente le cui caratteristiche di fluorescenza sono indipendenti dal pH e dalla concentrazione di anioni, in cui P2 è scelta in modo tale che non vi sia sostanziale sovrapposizione tra gli spettri di fluorescenza di P1 e P2 sia in emissione sia in eccitazione.
6. Proteina chimerica secondo la rivendicazione 5, in cui P1 e P2 sono collegate tramite un peptide linker.
7. Proteina chimerica secondo la rivendicazione 5 o 6, in cui P1 è scelta fra la proteina fluorescente mutante della GFP denominata E2GFP e la proteina fluorescente secondo la rivendicazione 1 o 2.
8. Proteina chimerica secondo la rivendicazione 7, in cui la proteina P1 è la proteina fluorescente secondo la rivendicazione 1 o 2.
9. Proteina chimerica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 8, in cui la proteina P2 è scelta nel gruppo che consiste di DsRFPm, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mGrapel, mRaspberry, mPlum, TdTomato, dTomato, DsRed (Tsien Lab), HcRed, Red EosFP.
10. Proteina chimerica secondo la rivendicazione 9, in cui P2 è la proteina monomerica DsRed-monomer.
11. Proteina chimerica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 10, in cui il peptide linker è la sequenza amminoacidica SEQ ID NO:5.
12 . Acido nucleico isolato comprendente una sequenza nucleotidica codificante per una proteina chimerica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 11.
13 . Vettore di espressione comprendente un acido nucleico isolato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2, 3 o 12.
14. Cellula ospite trasformata comprendente un vettore di espressione secondo la rivendicazione 13.
15 . Cellula ospite trasformata secondo la rivendicazione 14, che è una cellula procariotica.
16 . Cellula ospite trasformata secondo la rivendicazione 14, che è una cellula eucariotica.
17. Uso della proteina chimerica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 11 come sensore per la misurazione combinata del pH e della concentrazione di anioni in un campione.
18 . Uso secondo la rivendicazione 17, per la misurazione combinata del pH e della concentrazione di ioni cloro all'interno di una cellula eucariotica o procariotica .
19 . Procedimento per la determinazione combinata del pH e della concentrazione di anioni in un campione, comprendente i passaggi di: (a) porre il campione a contatto con la proteina chimerica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 11; (b) misurare un primo parametro R1 dello spettro di eccitazione della proteina chimerica, detto primo parametro Ri variando in dipendenza del pH ma non variando in dipendenza della concentrazione di anioni nel campione; (c) correlare il valore del suddetto parametro R1con il valore del pH del campione; (d) misurare un secondo parametro R2dello spettro di eccitazione della proteina chimerica, detto parametro R2variando in dipendenza sia del pH sia della concentrazione di anioni; (e) correlare il valore del suddetto parametro R2con la concentrazione di anioni nel campione.
20. Procedimento secondo la rivendicazione 19, in cui nel passaggio (c) il valore del parametro R1viene correlato con il valore del pH del campione mediante confronto con il valore del parametro R2di uno o più campioni di riferimento a pH noto.
21. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 19 o 20, in cui nel passaggio (e) il valore del parametro R2viene correlato con il valore della concentrazione di anioni nel campione mediante confronto con il valore del parametro R2di uno o più campioni di riferimento a nota concentrazione di anioni ed aventi approssimativamente il valore di pH determinato nel passaggio (c).
22. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 19 a 21, in cui il parametro R1.è rappresentato dalla formula:

in cui A è la fluorescenza emessa a seguito dì eccitazione alla lunghezza d'onda di 488 nm e B è la fluorescenza emessa a seguito di eccitazione alla lunghezza d'onda di 458 nm.
23. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 19 a 22, in cui il parametro R2è rappresentato dalla formula:

in cui A e B sono come definiti nella rivendicazione 22 e C è la fluorescenza emessa a seguito di eccitazione alla lunghezza d'onda di 543 nm.
24. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 19 a 23, in cui gli anioni sono ioni cloro.
25. Procedimento secondo la rivendicazione 25, in cui nel passaggio (a) la proteina chimerica è transfettata all'interno di una cellula ed in cui i valori di pH e concentrazione di ioni cloro misurati sono quelli intracellulari .