JP2000509987A - 増加した細胞の蛍光を有する変異アエクオレア・ビクトリア蛍光タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明に、野生型タンパク質の少くとも５倍、好ましくは20倍超の特定の緑色蛍光を有するクラゲアエクオレア・ビクトリア緑色蛍光タンパク質(GFP)の変異体に関する。他の実施形態において、本発明は、増加した青色蛍光を発する変異青色蛍光タンパク質(BFP)を含む。本発明は、広範囲の種々の工作された宿主細胞における変異GFP又はBFPをコードする核酸の発現、並びに増加した蛍光活性を有する工作されたタンパク質の単離も含む。本発明の新規変異体により、GFP又はその周知の変異体で可能であるよりかなり感度の高い工作された宿主細胞内での蛍光の検出が可能になる。これにより、本明細書に供される変異蛍光タンパク質は、GFPもしくはBFP変異体の、又は調節配列にもしくは第２のタンパク質配列に融合されたGFPもしくはBFP変異体を含むキメラタンパク質の細胞及び組織特異的発現及び亜細胞の区画化を検出するためのセンシティブなリポーター分子として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 増加した細胞の蛍光を有する変異アエクオレア・ビクトリア蛍光タンパク質 発明の分野 本発明は、一般に、遺伝子発現を検出するため並びに他のものの中から亜細胞 性標的物並びに所定のタンパク質及びペプチドの分布を視覚化するために役立つ 新規タンパク質及びそれらの生産に関する。本発明は、詳しくは、クラゲアエク オレア・ビクトリア（Aequorea victoria）緑色蛍光タンパク質（“GFP”）をコ ードする遺伝子内に変異であって、該変異が増加された緑色又は青色蛍光のいず れかを有する変異GFPタンパク質をコードする変異、並びにそれらのための使用 に関する。 発明の背景 緑色蛍光タンパク質（“GFP”）は、生物発光クラゲアエクオレア・ビクトリ アから単離することができる約27kDaのモノマータンパク質である。野生型GFPが 青色又は紫外光により照らされた時、そればブリリアントグリーン蛍光を発する 。フルオレセインイソチオシアネートと同様に、GFPは395nmの最大吸光度及び47 0nmの吸光度の小さなピークで紫外及び青色光を吸収し、509nmの最大発光及び54 0nmの小さなピークで緑色光を発する。GFP蛍光はホルムアルデヒドでの固定後で さえ持続し、そしてフルオレセインより光退色に安定である。 GFPのための遺伝子は単離されており、配列決定されている(Prasher，D.C．ら (1992)，“Primary structure of the Aequorea vi ctoria green fluorescent protein”，Gene 111：229−233)。GFP遺伝子又はcD NAを含む発現ベクターは種々の宿主細胞内に導入されている。これらの宿主細胞 は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ヒト胚腎臓細胞（HEK293）、COS -1サル細胞、ミエローマ細胞、NIH3T3マウス繊維芽細胞、PtK1細胞、BHK細胞、P C12細胞、ツメガエル(Xenopus)、ヒル、トランスジェニックゼブラフィッシュ、 トランスジェニックマウス、キイロショウジョウバエ（Prosophila）及びいくつ かの植物を含む。これらの異なる細胞により発現されたGFP分子は、ネイティブ 分子と同様の蛍光を有し、このことはGFP蛍光がいずれの種特異的補因子又は基 質も要求しないことを示す。例えばBaulcombe，D．ら(1995)，(“Jellyfish gre en fluorescent protein as a reporter for virus infections,”The Plant Jo urnal 7：1045-1053);Chalfie，M．ら(1994)，(“Green fluorescent protein a s a marker for gene expression,”Science 263:802-805);Inouye，S．& Tsuji ，F．(1994)，(“Aequorea green fluorescent protein:expression of the gen e and fluorescentcharacteristics of the recombinant protein,”FEBS Lette rs 341：277-280);Inouye，S．& Tsuji，F．(1994)，(“Evidence forredox for ms of the Aequorea green fluorescent protein,”FEBS Letters 351：211-214 );Kain，S.ら(1995)，(“The green fluorescent protein as a reporter of ge nee xpression and protein localization,”BioTechniques(印刷中));Kitts，P ．ら(1995)，(“Green Fluorescent protein(GFP):A novel reporter for monit oring gene expression in living organisms,”CLONTECHniques X(1):1-3);Lo ，D．ら(1994)，(“Neuronal transfection inbrain slices using particle-me diated gene transfer,”Neuron13：1263-1268);Moss，J.B．& Rosenthal，N．( 1994)，(“Analys is of gene expression patterns in the embryonic mouse myotome with the g reen fluorescent protein，a new vital marker，”J．Cell．Biochem.，Suppl ement 18D W161)；Niedz，R．ら(1995),(“Green fluorescent protein:an in v ivo reporter of plant gene expression,”Plant Cell Reports 14：403-406); Wu，G.-I.ら(1995)，（“Infection of frog neurons with vaccinia virus per mits in vivo expression of foreign proteins,”Neuron 14：681-684);Yu，J ．& van den Engh，G．(1995)，(“Flow−sort and growth of single bacteria l cells transformed with cosmid and plasmid vectors that include the gen e for green-fluorescentprotein as a visible marker,”“Genome Mapping an d Sequencing,”Cold Spring Harbor，p．293での1995年の会合で供された論文 の要約）を参照のこと。 活性なGFP発色団は、位置65〜67において環化したSer−デヒドロTyr-glyトリ マーを含むヘキサペプチドである。この発色団は、完全なGFPタンパク質内に埋 め込まれた時にのみ蛍光性である。発色団形成は翻訳後におこり；発生期のGFP は蛍光でない。その発色団は環化反応及び酸素分子を要求する酸化ステップによ り形成されると考えられている。 GFPのアミノ（Ｎ−）又はカルボキシ（Ｃ−）末端にタンパク質を融合させる ことができる。このように融合されたタンパク質はGFPの蛍光特性及び融合相手 の機能的特性を保持することが示されている。(Bian，J．ら(1995)，(“Nuclear localization of HIV-1 matrix protein P17:The use of A．victoria GFP in protein tagging and tracing,”(FASEB J．9：AI279);Flach，J．ら(1994)，( “A yeast RNA-binding protein shuttles between the nucleus and the cytop lasm,”Mol．Cell．Biol．14：8399-8407);Marsha 11，J.ら(1995)，(“The jellyfish green fluorescent protein:a new tool fo r studying ion channel expression and function,”Neuron 14：211-215);Olm sted，J．ら(1994)，(“Green Fluorescent Protein（GFP）chimeras as report ers for MAP4 behavior in living cells，“Mol．Biol．of the Cell 5：167a) ;Rizzuto，R.ら(1995)，(“Chimeric green fluorescent protein as a tool fo r visualizing subcellular organelles in living cells,”Ｃurrent Biol．５ ：635-642);Sengupta，P．ら(1994)，(“The C.elegans gene odr-7 encodes an olfactory-specific member of the nuclear receptor superfamily,”Cell 79 ：971-980);Stearns，T．(1995)，(“The green revolution,”Current Biol．5 ：262-264);Treinin，M．& Chalfie，M．(1995)，(“A mutated acetylcholine receptor subunit causes neuronal degeneration in C．elegans,”Neuron 14 ：871-877);Wang，S．& Hazelrigg，T．(1994)，(“Implications for bcd MRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oog enesis,”Nature 369：400-403))。 いくつかのGFP変異体が報告されている(Delagrave，S．ら（1995）(“Red-shi fted excitation mutants of the green fluorescent protein,”Bio/Technolog y 13：151-154);Heim，Ｒ．ら（1994）(“Wavelength mutations and posttrans l ationalautoxidation of green fluorescent protein,”Proc．Natl．Acad．S ci．USA 91：12501-12504);Heim，R．ら(1995)，(“Improved green fluorescen ce,”Nature 373：663-664))。Delgraveら（1995）(Bio/Technology 13：151-15 4))は、赤にシフトした励起スペクトルを有するクローン化されたアエクオレア ・ビクトリアGFPの変異体を単離した。Heim，R．ら（1994）(“Wavelength muta tions and posttransla tional autoxidation of green fluorescent protein,”Proc．Nat1．Acad．Sci ．USA 91：12501-12504)は、そこでBFP(Tyr₆₇→His)で示される青色蛍光を有す る変異体(Tyr₆₆からHis)を報告した。これらの引用文献は、それらの変異体が変 異GFPの細胞の蛍光を増加させることについて教授も示唆もしていない。 一般に、細胞内で発現されるタンパク質の蛍光のレベルはいくつかの因子、例 えば蛍光タンパク質から作られた複製の数、タンパク質の安定性、発色団の形成 の効率、並びに細胞の溶媒、溶質及び構造との相互作用による。野生型GFPから 又は報告された変異体からの蛍光シグナルは一般に豊富に発現されたGFPの又はG FP含有キメラのバルク検出に適するが、一時的な低い又は構成的に低いレベルの 発現を検出するため、又は構造的に亜細胞性の局在化を行うためには不適である 。この制限は、遺伝子発現及び形態学的研究のための生化学的及び構造的マーカ ーとしてのネイティブGFPの又は報告された変異体の使用を厳しく制限する。 発明の概要 本発明の目的は、野生型GFP又は先行技術の開示された組換えGFPより大きい細 胞の蛍光を有する改変されたGFP分子をコードする工作されたGFPコード化核酸配 列を提供することである。 本発明の更なる目的は、これらの改変されたGFPコード化核酸配列を含む組換 えベクターであって、（哺乳動物及び真核細胞を含む）種々の細胞内に挿入され 、改変されたGFPを発現することができるベクターを提供することである。 本発明の目的は、均一な改変GFPの有用な量を供することができる宿主細胞を 提供することである。 本発明の更に他の目的は、ネイティブGFP又は不変の組換えGFP より大きな細胞の蛍光を有し、微生物又は細胞の培養により研究室内で大量に製 造することができるペプチドを提供することである。 本発明のこれら及び他の目的は、その遺伝子産物が天然の又は組換え生産され た野生型GFP（“wtGFP”）に対して増加した細胞蛍光を示す変異GFPコード化核 酸を提供することにより達成された。特定の実施形態において、その改変された GFPは、改変されていないGFPのそれより50〜100倍大きい蛍光活性を有する。 本発明の改変されたタンパク質は、生じた遺伝子産物のアミノ酸配列において 改変を生じる遺伝子配列中に変異を作ることにより生産される。我々の出発材料 は、有用な制限部位を導入するために、付加的な核酸をコードするコドンが以前 に公開されたGFPアミノ酸配列（Chalfieら、1994）の位置２に挿入されているGF Pコード化核酸であった。GFPアミノ酸配列の位置２におけるアミノ酸挿入により 、我々のGFPアミノ酸のナンバリング及びアミノ酸変異の記載はもとから報告さ れている野生型GFP配列（Prasherら、1992）と比べて１つだけずれる。これによ り、我々のナンバリングによるアミノ酸65はもとから報告されている野生型GFP のアミノ酸64に相当し、アミノ酸168はもとから報告されている野生型GFPのアミ ノ酸167に相当する。 本明細書に記載される改変された野生型GFPを用いて、本明細書に記載される いくつかの特有の変異体は、wtGFPの位置65のフェニルアラニンがロイシンに変 換されている部位特異的変異誘発により得られた“SG12”と呼ばれる計画も予想 もしない変異の発見から得られる。イソロイシン168のトレオニンへの置換及び ロイシン239のアスパラギンへの置換とフェニルアラニン65のロイシンへの変換 を組み合わせた“SG11”として呼ばれる変異体は、更に増強された蛍光強度を供 した。リシン239のアスパラギンへの置換はGFPの蛍 光に影響を与えず；実際、Ｃ末端のリシン又はアスパラギンは、蛍光に影響を与 えることなく削除することができる。第３の及び更に改変されたGFP変異体は、 “SG11”を更に変異させることにより得られた。この変異は“SG25”として呼ば れ、SG11変異に加えて、更なる変異、即ちその配列中の位置66に通常見い出され るセリンのシステインへの置換を含む。 更に、本発明は、青色蛍光を発する新規GFPを含む。これらの青色変異体は、 ヒスチジンがアミノ酸位置66におけるチロシンのかわりに置換されている野生型 GFPの変異体（Heim R．ら（1994）“Wavelength mutations and posttranlation al autoxidation of green fluorescent protein,”Proc．Natl．Acad．Sci．US A 91：12501-12504）から得られる。この変異体は青色蛍光を発し、即ちそれは 青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescent Protein）(BFP)になる。 増強された青色蛍光を有する新規変異体は、このBFP(Tyr₆₇→His)を更に改変 することにより作った。SG12を作り出すのに用いた同じ変異（即ち位置65におけ るフェニルアラニンからロイシン）のBFP(Tyr₆₇→His)への導入は、“Super Blu e-42”(SB42)で示すより明るい蛍光を有する新しい変異体を生じた。位置164の バリンをアラニンに変えたBFP(Tyr₆₇→His)の第２の独立して作った変異体も増 強された青色蛍光シグナルを発し、これを“SB49”と呼んだ。上述の２つの変異 の組合せは、先の変異のいずれよりも更に大きい蛍光の増強を示す“SB5O”を生 じた。 本発明の新規GFP及びBFP変異体は、野生型タンパク質で可能であるよりかなり 大きい感度の宿主細胞における蛍光の検出を許容する。従って、本明細書に供さ れる変異体GFPは、とりわけ、GFPの又は調節配列にもしくは第２のタンパク質配 列に融合されたGFPを含むキメラタンパク質の細胞及び組織特異的発現並びに亜 細胞区画 化を検出するためのセンシティブなレポーター分子として用いることができる。 更に、これらの変異は、哺乳動物細胞内の発現を定量するための種々の１及び２ 色タンパク質アッセイを可能にする。 発明の詳細な記載 本発明は、ネイティブGFP又は不変の（“野生型”）組換えGFPのいずれよりも 大きい細胞の蛍光を有する工作されたGFPをコードする変異核酸、並びに変異GFP 自体を含む。それは更に、BFP(Tyr₆₇→His)で示される公開されたBFPから得られ た変異青色蛍光タンパク質(“BFP”)である変異GFPのサブセットであって、BFP( Tyr₆₇→His)のそれより少くとも５倍、好ましくは10倍、そして最も好ましくは2 0倍大きい細胞の蛍光を有するものを含む。本発明は、変異核酸又は変異タンパ ク質遺伝子産物のいずれかを含むベクター及び細胞のような組成物も含む。変異 GFP核酸及びタンパク質は、生きている細胞内で遺伝子発現を検出及び定量し、 並びにGFPのもしくは他のタンパク質に融合されたGFPの組織特異的発現及び亜細 胞分布を検出及び定量するのに用いることができる。 Ｉ．一般的な定義 他に示さなければ、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本 発明の属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Singleton ら（1994）(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，second edit ion，John Wiley and Sons(New York))は、本発明に用いられる用語の多くの一 般的辞書を当業者に供する。本明細書に記載されるものと似た又はそれと等価の いずれかの方法及び材料を本発明を実施し又はテストするのに用いることができ るが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目的のために、次の用語を 以下のように定義する。 本明細書に用いられる基含、略語及び定義を以下に記載する： DNA、デオキシリボ核酸 RNA、リボ核酸 mRNA、メッセンジャーRNA cDNA、相補DNA(mRNA配列から酵素合成) Ａ−アデニン Ｔ−チミン Ｇ−グアニン Ｃ−シトシン Ｕ−ウラシル GFP、緑色蛍光タンパク質 BFP、青色蛍光タンパク質 アミノ酸は、本明細書で、時々慣用的な一文字コード又は三文字コードで示さ れる。 野生型緑色蛍光タンパク質（“wtGFP”）は、Chalfieら（Science263，802-80 5，1994）により記載される239アミノ酸配列をいい、そのヌクレオチド配列を配 列番号：１に示し、そのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。この配列は、生物 発光クラゲアエクオレア・ビクトリアから単離されたもとの238アミノ酸GFPと、 １つのアミノ酸がその238アミノ酸配列の位置２の後に挿入されている点で異な る。本願の引用がGFPのアミノ酸位置になされる場合、その位置はChalfieら（前 掲）により記載され、これにより配列番号：２に記載されるものを引用して行わ れる。 用語“青色蛍光タンパク質”(BFP)とは、位置67のチロシンがヒスチジンに変 わっているwtGFPの変異体であって、青色蛍光を発する変異体をいう。非限定的 原型は本明細書でBFP(Tyr₆₇→His)で示す。 アミノ酸配列において変化を生じる変異体のための速記名称は、もとのアミノ 酸についての１又は３文字コード、wtGFP配列におけるアミノ酸の位置の数字、 次に新しいアミノ酸のための１又は３文字コードである。これにより、Phe65Leu 又はF65Lは両方とも、wtGFPの位置65のフェニルアラニンがロイシンに変わって いる変異を指す。 本明細書に記載されるいずれかのタンパク質の塩は、これらのタンパク質が種 々のpHの水溶液中に存在する（又はそれから単離される）場合に自然に発生する であろう。示される生物活性を有するペプチドの全ての塩は本発明の範囲内であ ると考えられる。例には、カルボン酸残基のアルカリ、アルカリ土類、及び他の 金属塩、アミノ酸残基の酸付加塩(例えばHCl)、並びに同じ分子内のカルボン酸 とアミノ酸残基との間の反応により形成された双性イオンを含む。 用語“生物発光”及び“蛍光”とは、発光させるのに用いられるものより、全 般的に特徴的で異なる波長である光により励起された時に、特徴的な波長の光（ “発光又は蛍光”）を発するGFPの又はその誘導体の能力をいう。 用語“細胞の蛍光”とは、細胞、特に哺乳動物細胞内で発現された時に本発明 のGFP由来タンパク質の蛍光をいう。 用語“核酸”とは、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリ ボヌクレオチドポリマーをいい、特に限定するつもりはないが、自然に発生する ヌクレオチドと同様な様式で核酸とハイブリダイズする天然のヌクレオチドの周 知のアナログを含む。他に示さなければ、特定の核酸配列は、暗に、その相補配 列、及び明示された配列を供する。本明細書に用いる場合、用語“核酸”及び“ 遺伝子”は交換可能であり、それらは用語“cDNA”を含む。 句“コードする核酸配列”とは、翻訳された時に特定のタンパク 質又はペプチドの一次アミノ酸配列を生成する配列情報を含む核酸をいう。この 句は特に、特定の宿主細胞におけるコドン選択に適合するよう導入され得るネイ ティブ配列の縮重コドン（即ち単一アミノ酸をコードする異なるコドン）を含む 。 句“核酸構成物”とは、異なるソースから得られ、当該技術で周知の方法を用 いて一緒に連結される２又はそれ超の核酸配列から構成される核酸をいう。 用語“調節配列”とは、“コード化領域”（即ちペプチド又はタンパク質のア ミノ酸配列を実際にコードする領域）の正確かつ有効な発現のために要求される 核酸配列の全ての非コード化要素、例えばポリメラーゼ及び転写因子のための結 合部位、転写及び翻訳開始及び終了配列、TATAボックス、転写を行うためのプロ モーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、エンハ ンサー要素をいう。 用語“単離”とは、そのネイティブ状態において見い出されるような通常それ に伴う構成物を実質的に又は本質的に含まない材料（例えばゲル上に１つのバン ド）をいう。本発明の単離された核酸及び単離されたタンパク質は、それらのそ の場の(in situ)環境と通常関連する材料、特に核、細胞質もしくは膜関連タン パク質又は示される核酸以外の核酸を含まない。用語“均一”とは、考慮される 組成物中に存在する実質的に全ての分子の一次分子構造（即ちアミノ酸又はヌク レオチドの配列）が同一であるペプチド又はDNA配列をいう。先の文に用いられ る用語“実質的に”は、好ましくは、少くとも80重量％より好ましくは少くとも 95重量％、そして最も好ましくは少くとも99重量％を意味する。 本発明の核酸は、RNA，cDNA、ゲノムDNA、又は種々の組合せのハイブリッドに かかわらず、試験管内で合成され、又は天然のソー スもしくは組換えクローンから単離される、本明細書でクレームされる核酸は、 形質転換されもしくは移入された完全な細胞中に、形質転換されもしくは移入さ れた細胞ライゼート中に、又は部分的に精製されもしくは実質的に純粋な形態に おいて存在する。本発明の核酸は均一な調製物として得られる。それらは、当該 技術で公知の標準的技術、例えば硫酸アンモニウム、イソプロピルアルコール、 エチルアルコール、のような物質での選択的沈殿、及び／又は排除、イオン交換 又はアフィニティーカラムクロマトグラフィー、免疫精製法等により調製するこ とができる。 句“その保存的に改変された変異体”は、タンパク質を引用して用いる場合、 その置換がタンパク質の特定の特性、例えば蛍光を本質的に変えないようにもと の及び置換されたアミノ酸が似た構造（例えばＲ基がカルボン酸を含む）及び特 性（例えばもとの及び置換されたアミノ酸が酸性である。例えばグルタミン酸と アスパラギン酸）を有する保存性アミノ酸置換をいう。保存性のアミノ酸置換は 当該技術で公知である。句“その保存的に改変された変異体”とは、核酸を引用 して用いる場合、標準核酸と比べて、所定のアミノ酸についての縮重コドンを形 成し、又は保存的アミノ酸置換をコードするヌクレオチド置換を有する核酸をい う。 用語“組換え”又は“操作（工作）された”とは、核酸又はタンパク質を引用 して用いる場合、一般に、該核酸又はタンパク質の組成又は一次配列が、当業者 に公知の実験操作を用いて自然に発生する配列から変えられていることをいう。 それは、核酸又はタンパク質が単離されもしくはベクター内にクローン化されて いること、又は核酸が、該核酸もしくはタンパク質が天然において見い出され得 る細胞もしくは細胞環境以外の細胞もしくは細胞環境に導入されもしくはその中 で発現されていることをも意味し得る。句“操作（工 作）されたアエクオレア・ビクトリア蛍光タンパク質”は、特に、野生型アエク オレア・ビクトリアGFPをコードする核酸のコード化領域内に、１又は複数の配 列変換を導入することにより得られるタンパク質であって、前記操作された核酸 の遺伝子産物が、野生型アエクオレア・ビクトリアGFPに対する抗血清により認 識される蛍光タンパク質であるタンパク質を含む。 用語“組換え”又は“操作（工作）”とは、細胞を引用して用いる場合、実験 操作の結果として、細胞が、核酸を複製もしくは発現し、又は核酸によりコード されるペプチドもしくはタンパク質を発現することを指す。ここで前記核酸の源 はその細胞に対して外来性である。組換え細胞は、その細胞のネイティブ（非組 換え）形態内で見い出されない核酸を発現することができる。組換え細胞は、核 酸が人工的手段によりその細胞内に再導入されている細胞のネイティブ形態にお いて見い出される核酸も発現することができる。 用語“ベクター”とは、ベクター配列の複製及び／又はベクター上に存在する コード化配列の発現を媒介する配列要素を含む工作された核酸構成物をいう。ベ クターの例は、真核生物及び原核生物プラスミド、ウイルス（例えばHIVウイル ス）、コスミド、ファージミド等を含む。用語“作用可能に結合”とは、第１の 核酸（例えば発現調節配列、例えばプロモーター又は転写因子結合部位のアレイ ）と第２の核酸配列との間の機能的な結合をいい、ここで発現調節配列は第２の 配列に対応する核酸の転写を指図する。１又は複数の選択された単離された核酸 が当該技術で周知の方法によりベクターに作用可能に結合し得る。 “導入（移入）”又は“形質転換”とは、細胞が外来DNAを複製及び／又は発 現できるように、外来細胞外DNAを細胞内に導入する方法をいう。一般に、選択 された核酸は最初にベクター内に挿入さ れ、そして次にそのベクターは細胞内に導入される。例えば、適切な環境条件下 で導入されたプラスミドDNAは、その形質転換された細胞内で複製を行うことが でき、そしてその複製されたコピーは、細胞分割がおこった時に子孫細胞に与え られる。結果として、そのプラスミドを有し、かつその遺伝子決定基を有する新 しい細胞系が確立される。この様式でのプラスミドによる形質転換は、そのプラ スミド遺伝子がプラスミド複製により細胞系内に維持される場合、その形質転換 するプラスミドDNAが閉じたループ形態である時に高い頻度でおこり、そして直 鎖プラスミドDNAを用いる場合はおこらないか又はまれにしかおこらない。 本開示に言及される全ての特許及び出版物は、本発明が属する当業者の技術の レベルを示し、そして全ての目的のため引用により全て個々に本明細書に組み込 まれる。 II．GFP変異体及びそれらの発現 Ａ．GFP変異体 ここで報告される単離された核酸は、野生型GFPの最大発光における蛍光より 少くとも５倍、好ましくは10倍、そして最も好ましくは20倍大きい最大発光にお いて蛍光を有するアエクオレア・ビクトリア緑色蛍光タンパク質（“GFP”）由 来の工作されたタンパク質をコードするものである。一実施形態において、核酸 はアミノ酸位置65でロイシンをコードする。このアミノ酸位置は蛍光の増加のた めに重要である。他の実施形態において、工作された単離されたGFP核酸は、ア ミノ酸位置168においてトレオニンもコードする。更なる実施形態において、工 作された単離されたGFP核酸は、更に、アミノ酸位置66においてシステインをコ ードする。 増加された青色蛍光特性を有するGFP変異体も本明細書に記載される。これら の変異体は、アミノ酸位置67にヒスチジンを、アミノ 酸位置65にロイシンをコードし、BFP(Tyr₆₇→His)のそれより少くとも５倍、好 ましくは10倍、そして最も好ましくは20倍大きい細胞の蛍光を有する工作された アエクオレア・ビクトリア青色蛍光タンパク質をコードする単離された核酸を有 する。他の単離されたBFP核酸は、その工作されたBFPがアミノ酸位置67にヒスチ ジンを、アミノ酸位置164にアラニンを有する工作されたアエクオレア・ビクト リア青色蛍光タンパク質をコードするものである。第３の工作された単離された BFP核酸配列は、アミノ酸位置67にヒスチジンを、アミノ酸位置65にロイシンを 、そしてアミノ酸位置164にアラニンを有するものである。 野生型GFPについての核酸及びアミノ酸配列を配列番号：１及び配列番号：２ に示す。その配列は公知であり、十分に開示され、そして操作及び使用について 十分に利用できる。核酸配列を有するベクターは、例えばClontech Laboratorie s，Inc.，Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，LAから市販されている。C lontechは、一系列のGFPのためのリポーターベクター、例えばChalfieら（前掲 ）により記載されるcDNA構成物、哺乳動物細胞内でのクローン化されたプロモー ターの発現をモニターするためのプロモーターのないGFPベクター、及びGFPのア ミノ又はカルボキシ末端のいずれかへの融合タンパク質を作り出すための一連の ベクターを供する。 当業者は、所定の核酸配列において変換を形成する多くの方法を認めるであろ う。これらの公知の方法は、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用 いるPCR増幅、核酸を含む細胞の、変異誘発剤又は放射線への露出、要求される オリゴヌクレオチドの化学合成（例えば大きな核酸を作り出すために連結及び／ 又はクローニングと組み合わせたもの）及び他の公知の技術を含む。例えばBerg er及びKimmel，(Guide to Molecular Cloning Techniques，Method s in Enzymology Volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego,CA(Berger));S ambrookら（1989）(Molecular Cloning - A Laboratory Manual（2nd ed．）Vol ．1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY，(Sam brook));及びCurrent Protocols in Molecular Biology，(F.M．Ausubelら.，ed s.，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associa tes，Inc．and John Wiley & Sons，Inc.，（1994 Supplement）(Ausubel));Pir rungら.,米国特許第5,143,854号;並びにFodorら.，(Science，251，767-77(1991 ))を参照のこと。生物学的試薬及び実験装置の製造元からの製品情報も周知の生 物学的方法に役立つ情報を供する。これらの製造元は、SIGMA Chemical Company (Saint Louis，MO)，R&D systems(Minneapolis，MN)，Pharmacia LKB Biotechno logy(Piscataway，NJ)，CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)，Chem G enes Corp.，Aldrich Chemical Company (Milwaukee，WI)，Glen Research，Inc .，GIBCO BRL Life Technologies，Inc．(Gaithersberg，MD)，Fluka Chemica-B iochemika Analytika（Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland）、及びAppliedB iosystems（Foster City，CA)、並びに当業者に周知の多くの他の商業ソースを 含む。これらの技術を用いて、本明細書に開示されるいずれかのGFP又はBFPをコ ードする核酸におけるいずれかのヌクレオチド、又は所定のヌクレオチド又はア ミノ酸のための本明細書に記載されるGFP又はBFPにおけるいずれかのアミノ酸を 任意に置換することが可能である。例えば、位置65においてロイシンを、そして wtGFP又はBFP(Tyr₆₇→His)のいずれかの他の位置において１，２又は３の更なる 変異を含む改変されたGFP及びBFP(Tyr₆₅→His)を任意に作り出すことが可能であ る。 クローン化された遺伝子及び合成オリゴヌクレオチドの配列は、 A.M．Maxamら（1980）(Methods in Enzymology 65：499-560)の化学的デグラデ ーション法を用いて確認することができる。その配列は、二本鎖DNA配列へのオ リゴヌクレオチドフラグメントのアセンブリーの後、Maxam及びGilbert(前掲)の 方法、又はR.B．Wallaceら（1981）(Gene，16：21-26)の二本鎖テンプレートを 配列決定するための鎖ターミネーション法を用いて確認することができる。DNA 配列決定は、ABI Model 373A DNA配列決定システムを用いて、製造元の説明に従 って、PCR関連蛍光ターミネーター法(ReadyReaction DyeDeoxy Terminator Cycl e Sequencing Kit，ABt，Columbia，MD)によっても行うことができる。配列決定 データは、市販のSequencherプログラム(Gene Codes，Gene Codes，Ann Arbor， MT)を用いて分析される。 Ｂ．変異GFPの発現 明らかに、本発明の核酸配列は、その発現されたタンパク質が上述のように蛍 光により直ちに検出され得るので、優れたリポーター配列である。その配列は、 GFPについてのデータに認められるいずれかの適用と組み合わせて、及び更によ り大きな程度の蛍光が要求される適用において用いることができる。本明細書に 記載される配列の発現は、単独で又は他の関心の配列と組み合わせて発現が要求 されるか否かにかかわらず以下に記載される。 所定の外来核酸が作用可能に結合されているベクターを、これらの所定の核酸 を宿主細胞に導入し、それらの複製及び又は発現を媒介するのに用いることがで きる。クローニングベクターは、外来核酸を複製するため及び特定の外来核酸含 有ベクターのクローンを得るために役立つ。発現ベクターは外来核酸の発現を媒 介する。特定のベクターはクローニング及び発現ベクターの両方である。 核酸を合成し又は単離し、そしてベクター内に挿入してクローン 化した後、当業者に周知の種々の組換え操作された細胞中でその核酸を発現させ ることができる。本明細書に用いる場合、“発現”とは、後の翻訳を伴わない又 は好ましくはそれを伴う核酸の転写をいう。 変異BFPの又は野生型もしくは変異GFPの発現は、形質転換された宿主内にGFP コード化核酸の多重の複製を含むことにより、宿主内で再生することが知られて いるベクターを選択してそれにより外来性の挿入されたDNAから大量のタンパク 質を生産することにより（例えばpUC8，ptac12、又はpIN-III-ompA １，２、又 は３）、又はペプチド発現を増強するいずれかの他の周知の手段により増強する ことができる。全ての場合、wtGFP又は変異GFPは、そのDNA配列がベクター内に 機能的に挿入された時に発現されるであろう。“機能的に挿入”とは、それが正 確な読み枠及び方向において挿入されることを意味する。典型的には、GFP遺伝 子は、プロモーターから下流に挿入され、終止コドンの前に挿入されるであろう 。但し、必要に応じてハイブリッドタンパク質として生産して後に開裂すること を用いることができる。 本発明の核酸のクローニング及び発現に適した細胞の例は、細菌、イースト、 糸状菌、昆虫（特にバキュロウイルスベクターを用いるもの）、及び哺乳動物、 特に組織培養において維持され得る細胞を含む。 宿主細胞は種々の手段による形質転換についてコンピテントであり又はコンピ テントにされる。動物細胞内にDNAを導入するいくつかの公知の方法がある。こ れらは、リン酸カルシウム沈殿、DNAを含むバクテリアプロトプラストとの受容 細胞の融合、DNAを含むリボソームでの受容細胞の処理、DEAEデキストラン、レ セプター媒介エンドサイトーシス、エレクトロポレーション及び細胞への直接の DNAのマイクロインジェクションを含む。 当業者に核酸のクローニング及び発現のために利用できる多数のシステムにお いて知ることができることが予想される。要約すると、天然の又は合成の核酸の 発現は典型的には、関心の核酸の（構成的又は誘導性である）プロモーターへの 作用可能な連結、及び構成物の発現ベクターへの組込みにより行われる。ベクタ ーは原核細胞、真核細胞、又は両方内での複製及び組込みに適する。典型的なク ローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、 並びに特定の核酸の発現の制御に役立つプロモーターを含む。ベクターは、任意 に、少くとも１の独立したターミネーター配列、真核細胞もしくは原核細胞又は 両方内でのカセットの複製を許容する配列（例えばシャトルベクター）並びに原 核細胞及び真核細胞システムの両方のための選択マーカーを含む遺伝子発現カセ ットを含む。例えば、Sambrook及びAwsbel（両方とも前掲）を参照のこと。 １．原核細胞内での発現 工作されたGFP又はBFPタンパク質をクローニング及び／又は発現するための原 核細胞系は、大腸菌、バチルス種（Bacillus sp.）及びサルモネラ（Salmonella ）を用いて利用できる(Palvu，Ｉら(1983)，Gene 22：229-235；Mosback，Kら(1 983)，Nature302：543-545)。クローン化された核酸、例えば工作されたGFP又は BFPをコードするものの原核細胞系において高レベルの発現を得るために、最小 で、転写を指図するための強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結 合部位、転写／翻訳ターミネーター、細菌レプリコン、組換えプラスミドを有す る細菌の選択を許容するための抗生物質耐性をコードする核酸、及び外来核酸の 挿入を許容するためのプラスミドの非本質的領域内の特有の制限部位を含む発現 ベ クターを作製することが本質的である。選択された特定の抗生物質耐性遺伝子は 重大でなく、当該技術で周知の多くの耐性遺伝子のいずれかが適切である。大腸 菌においてこの目的のために適した調節領域の例は、Yanofsky，Ｃ．（1984）(J ．Bacteriol.，158：1018〜1024)により記載される大腸菌トリプトファン生合成 経路のプロモーター及びオペレーター、並びにHerskowitz，I.及びHagen，D．（ 1980）(Ann．Rev．Genet.，14：399-445(1980))により記載されるファージラム ダ（Pc）の左側（leftward）プロモーターである。 遺伝子情報を細胞に輸送するのに用いられる特定のベクターは特に重要でない 。原核細胞内での複製、クロ-ニング及び／又は発現のために用いられる慣用的 なベクターのいずれかを用いることができる。 外来核酸は宿主細胞の染色体の非本質的領域内に組み込むことができる。これ は、宿主染色体内で挿入部位に相同なDNAの領域が隣接するように、ベクター内 に核酸を最初に挿入することにより行われる。ベクターの宿主細胞への導入の後 、外来核酸は、その隣接する配列と染色体DNAとの間の相同的組換えにより染色 体内に組み込まれる。 発現されたタンパク質の検出は、ラジオイムノアッセイ、又はウエスタンブロ ッティング技術もしくは免疫沈降法のような当該技術で周知の方法により行われ る。大腸菌からの精製は、米国特許第4,511,503号に記載される手順に従って行 うことができる。 ２．真核細胞内での発現 後に標準的技術を用いて精製される大量の工作されたGFP又はBFPタンパク質を 発現する哺乳動物、イースト又は昆虫細胞系を生産するために標準的な真核細胞 移入法が用いられる。例えば、Colleyら(1989)，（J．Biol．Chem．264：17619- 17622）、及びGuide to Protein Purification，(Vol．182 of Methods in Enzymology(Deutscher ed. ，1990))，D.A．Morrison(1977)，（J．Bact.，132：349-351）、又はJ.E．Clar k-Curtiss及びR．Curtiss(1983)，(Methods in Enzymology 101：347-362，Eds ．R．wuら.，Academic Press，New York)を参照のこと。 遺伝子情報を細胞に輸送するのに用いられる特定の真核細胞発現ベクターは特 に重要でない。真核細胞における発現のために用いられる慣用的なベクターのい ずれかを用いることができる。真核生物のウイルス、例えばレトロウイルスから の調節要素を含む発現ベクターを典型的には用いることができる。SV40ベクター はpSVT7及びpMT2を含む。ウシパピローマウイルス由来のベクターはpBV-1MTHAを 含み、そしてエプスタイン−バールウイルス由来のベクターはpHEBO及びp205を 含む。他の典型的なベクターは、pMSG，pAV009/A⁺，pMT010/A⁺，pMAMneo-5、バ キュロウイルスpDSVE、並びにSV-40早期プロモーター、SV-40遅期プロモーター 、メタロチオネインプロモーター、ネズミ乳腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス 肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は他の真核細胞内で の発現に有効であることが示されているプロモーターの指揮下でタンパク質の発 現を許容するいずれかの他のベクターを含む。 発現ベクターは、典型的には、真核細胞内での工作されたGFP又はBFP DNAの発 現のために要求される全ての要素を含む真核細胞転写ユニット又は発現カセット を含む。典型的な発現カセットは、工作されたGFP又はBFPタンパク質並びに転写 物の有効なポリアデニル化のために要求されるシグナルをコードするDNA配列に 作用可能に結合されたプロモーターを含む。 真核細胞プロモーターは、典型的には２つの型の認識配列、即ちTATAボックス 及び上流プロモーター要素を含む。転写開始部位の25 〜30塩基対上流に位置するTATAボックスは、RNAポリメラーゼにRNA合成を開始さ せることに関連すると考えられる。他の上流プロモーター要素は転写が開始する 比率を決定する。 エンハンサー要素は、結合した同種又は異種プロモーターから1,000倍までの 転写を刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位から下流又は上流 におかれた時に活性である。ウイルスから得られる多くのエンハンサー要素は、 広い宿主の範囲を有し、種々の組織において活性である。例えば、SV40早期遺伝 子エンハンサーは多くの細胞型に適している。本発明に適した他のエンハンサー ／プロモーター組合せは、ポリオーマウイルス、ヒト又はネズミサイトメガロウ イルス、ネズミ白血病ウイルスのような種々のレトロウイルスからの長い反復、 ネズミ又はラウス肉腫ウイルス及びHIV由来のものを含む。引用により本明細書 に組み込まれるEnhancers and Eukaryotic Expression（Cold Spring Harbor Pr ess，Cold Spring Harbor，N.Y．1983）を参照のこと。 発現カセットの作製において、プロモーターは、好ましくはおおよそ、その天 然の位置における転写開始部位からの距離と同じ異種転写開始部位からの距離に 位置する。しかしながら当該技術で周知であるように、この距離においていくつ かのバリエーションがプロモーター機能を失うことなく適合される。 プロモーター配列に加えて、発現カセットは、有効な終了を供するために構造 遺伝子の下流の転写終了領域も含む。そのターミネーション領域は、プロモータ ー配列と同じ遺伝子から得ることができ、又は異なる遺伝子から得ることができ る。 構造遺伝子によりコードされるmRNAが有効に翻訳されるなら、ポリアデニル化 配列も一般にベクター構成物に加えられる。正確かつ有効なポリアデニル化のた めに２つの別個の配列要素：ポリアデニ ル化部位から下流に位置したGU又はＵの豊富な配列、及び11〜30ヌクレオチド上 流に位置した６つのヌクレオチドAAUAAAの高度に保存性の配列が要求される。本 発明に適した終了及びポリアデニル化シグナルは、SV40由来のもの、又は発現ベ クター上に既に存在する遺伝子の部分的ゲノム複製を含む。 既に記載した要素に加えて、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローン 化された核酸の発現のレベルを増加させること又は移入されたDNAを有する細胞 の同定を容易にすることを意図した他の特定の要素を含み得る。例えば、いくつ かの動物ウイルスは、複製を許容する細胞系内でのウイルスゲノムの付加的な染 色体複製を促進するDNA配列を含む。これらのウイルスレプリコンを有するプラ スミドは、適切な因子がプラスミドが有する又は宿主細胞のゲノムにあるいずれ かの遺伝子により供される限り、エピソーム的に複製される。 工作されたGFP又はBFPタンパク質をコードするDNA配列は、典型的には、形質 転換された細胞によるコードされたタンパク質の分泌を促進するために開裂可能 なシグナルペプチド配列に作用可能に結合される。これらのシグナルペプチドは 、とりわけ、組織プラスミノーゲンアクティベーター、インスリン、ニューロン 成長因子、ヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)の幼若ホルモンエト テラーゼを含むであろう。カセットの更なる要素は、エンハンサーを含み、そし てゲノムDNAを構造遺伝子として用いるなら、機能的なスプライスドナー及びア クセプター部位と共にイントロンを含み得る。 ベクターは真核細胞レプリコンを含んでも含まなくてもよい。真核細胞レプリ コンが存在するなら、ベクターは適切な選択マーカーを用いて真核細胞内で増幅 可能である。ベクターが真核細胞レプリ コンを含まないなら、エピソーム増幅が可能である。かわりに、移入されたDNA は、その移入された細胞のゲノム内に組み込まれ、ここでプロモーターは要求さ れる核酸の発現を指図することができる。 ベクターは、通常、核酸増幅を生ずる選択マーカー、例えばナトリウム、カリ ウムATPase、チミジンキナーゼ、アミノグルコシドホスホトランスフェラーゼ、 ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボ シルトランスフェラーゼ、CAD(カルバミルホスフェートシンセターゼ、アスパラ ギン酸トランスカルバミラーゼ、及びジヒドロオロターゼ)、アデノシンデアミ ナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、及びアスパラギン酸シンセターゼ及びオー バイン選択(ouabain selection)を含む。あるいは、核酸増幅に関連しない高収 率発現システムも、ポリヒドリンプロモーター又は他の強力なバキュロウイルス プロモーターの指揮下での工作されたGFP又はBFPコード化配列に、例えば昆虫細 胞中のバキュロウイルスベクターを用いるのに適する。 本発明の発現ベクターは、典型的には、細菌内のベクターのクローニングを容 易にする原核細胞配列、並びに哺乳動物細胞のような真核細胞内でのみ発現され る真核細胞転写ユニットの両方を含むであろう。原核細胞配列は、好ましくは、 それらが真核細胞内でのDNAの複製も妨害しないように選択される。 外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するためのいずれかの公知の手順を用 いることができる。これらは、リン酸カルシウム、トランスフェクション、ポリ プレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リボソーム、マイクロ インジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター並びにクローン化され たゲノムDNA，cDNA、合成DNA又は他の外来核酸の材料を宿主細胞に導入するた めの他の公知の方法（Sambrookら、前掲を参照のこと）を含む。利用される特定 の遺伝子操作手順は、工作されたGFP又はBFPタンパク質を発現することができる 宿主細胞内に少くとも１の核酸を上手く導入することができることが必要とされ るだけである。 ３．昆虫細胞内での発現 バキュロウイルス発現ベクターは、外来核酸の挿入のために改変された高度に 発現され調節されるアウトグラファ・カリフオルニア(Autographa california) 核ポリヘドロシスウイルス（AcMNPV）ポリヘドリンプロモーターを利用する。ポ リヘドリンタンパク質の合成は、その感染した昆虫細胞内で封入体（occlusion bodies）を形成する。バキュロウイルスベクターは、高等な真核細胞内でおこる タンパク質改変、プロセッシング、及び輸送システムの多くを利用する。このベ クターを用いて発現された組換え真核細胞タンパク質は、それらの天然の対応す るものに抗原性的に、免疫原性的に、及び機能的に似ていることが多くの場合に 見い出されている。 要約すると、工作されたGFP又はBFPをコードするDNA配列はポリヘドリンプロ モーターから下流でバキュロウイルス配列に両端において隣接した正確な方向に 転移プラスミドベクターに挿入される。培養された昆虫細胞、一般にスポドプテ ラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞にはウイルスとプラスミドDNAと の混合物が移入される。そのいくつかは２つのDNAの間の相同的組換えから生ず る組換えウイルスである発達するウイルスはプレート当り100〜1000のプラーク でプレートされる。組換えウイルスを含むプラークは、封入体を形成するそれら の能力により視覚的に、又はDNAハイブリダイゼーションにより同定することが できる。組換えウイルスは、プラーク精製により単離される。工作されたGFP又 はBFPを発現することができる生じた組換えウイルスは、その維持又は複製 のためにヘルパーウイルスが必要とされない点で自己繁殖性である。昆虫培養物 に組換えウイルスを感染させた後、48〜72時間内に組換えタンパク質を見つけ出 すと予想することができる。感染は４〜５日間内に、本質的に溶菌性である。 工作されたGFP又はBFP核酸を挿入することができる種々の転移ベクターがある 。転移ベクターの概要については、Luckow，U.A.及びSaummers，M.D．（1988）( Bio/Technology 6：41-55)を参照のこと。好ましいのはBishop，D.H.C．（1992 ）(Seminars in Virology 3：253-264)により記載される転移ベクターpAcUW21で ある。 ４．レトロウイルスベクター レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターが標的細胞を形質導入し 、標的細胞ゲノム内に組み込む高い動率のため、真核細胞を改変するのに特に役 立つ。更に、レトロウイルスベクターを有するレトロウイルスは広範囲の種々の 組織からの細胞に感染することができる。 レトロウイルスベクターは、レトロウイルスを遺伝子操作することによって作 られる。レトロウイルスにそのウイルスゲノムがRNAであるのでRNAウイルスであ る。感染により、このゲノムRNAはDNAコピーに逆転写され、それは導入された細 胞の染色体DNAに高い程度の安定性及び動率で組み込まれる。その組み込まれたD NAコピーはプロウイルスと呼ばれ、いずれかの他の遺伝子であるとして娘細胞に 遺伝される。野生型レトロウイルスゲノム及びプロウイルスDNAは２つの長い末 端反復(LTR)配列に隣接した３つの遺伝子；gag，pol及びenv遺伝子を有する。ga g 遺伝子は内部の構造（ヌクレオキャプシド）タンパク質をコードし；pol遺伝子 はRNA依存DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードし；そしてenv遺伝子はウイ ルスエンベロープグリコプロテインをコードする。５’及び３’ LTRはビリオンRNAの転写及びポリアデニル化を促進するよう機能する。５’CTR に隣接してゲノムの逆転写のため（tRNAプライマー結合部位）及びウイルスRNA の粒子への有効な被包化のため（Psi部位）に必要な配列がある。Mulligan，R.C ．(1983)，（Experimental Manipulation of Gene Expression，M．Inouye(ed) ，155-173）；Mann，R．ら(1983)，(Cell，33：153-159);Cone，R.D．及びR.C． Mulligan(1984)，(Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A ．81：6349-6353)を参照のこと。 レトロウイルスベクターのデザインは当業者に公知である。Singer，M及びBer g，P(前掲）を参照のこと。要約すると、被包化（又は感染性ビリオンへのレト ロウイルスRNAのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから免するな ら、その結果はゲノムRNAの被包化を防ぐcis機能欠損である。しかしながら、生 じた変異体はなお全てのビリオンタンパク質の合成を行うことができる。これら の配列が削除されているレトロウイルスゲノム及び染色体内に安定に組み込まれ た変異ゲノムは当該技術で公知であり、レトロウイルスベクターを作製するのに 用いられる。レトロウイルスベクターの調製及びそれらの使用は、多くの出版物 、例えば欧州特許出願EP A 0 178220、米国特許4,405,712、Gilboa(1986)，(Bio techniques 4：504-512)，Mannら(1983)，(Cell 33：153-159)，Cone及びMullig an(1984)，（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81：6349-6353），Eglitis，M.A，ら （1988）(Biotechniques 6：608-614)，Miller，A.D．ら（1989）(Biotechnique s 7：981-990)，Miller，A.D．（1992）Nature、前掲、Mulligan，R.C．（1993 ）、前掲。及びGould，B．ら.,並びに国際特許出願WO 92/07943(“Retroviral V ectors Useful in Gene Therapy.”)に記載される。これらの特許及び出版物の 教授は引用により本明細書に組み込まれる。 レトロウイルスベクター粒子は、工作されたGFP又はBFPをコードする核酸をレ トロウイルスベクターに組換え的に挿入し、パッケージング細胞系を用いること によりレトロウイルスキャプシドタンパク質でベクターをパッケージングするこ とにより調製される。生じたレトロウイルスベクター粒子は宿主細胞内で複製す ることができず、工作されたGFP又はBFP核酸を含むプロウイルス配列として宿主 細胞ゲノム内に組み込むことができる。結果として、その被検体は工作されたGF P又はBFPを生産することができ、涸渇するまでグリコーゲンを代謝する。 レトロウイルスベクター粒子を調製するためにパッケージング細胞系が用いら れる。パッケージング細胞系は、パッケージングのために必要とされる必要なウ イルス構造タンパク質を生産するが、感染性ビリオンを生産することができない 遺伝的に作製された哺乳動物組織培養細胞である。他方、レトロウイルスベクタ ーは、構造遺伝子を欠如するが、パッケージングに必要な核酸配列を有する。パ ッケージング細胞系を調製するために、パッケージング部位が削除されている要 求されるレトロウイルスの感染性クローンが作製される。この構成物を含む細胞 は、全ての構造タンパク質を発現するであろうが、その導入されたDNAはパッケ ージングされ得ないであろう。あるいは、パッケージング細胞系は、細胞系を、 適切なコア及びエンベロープタンパク質をコードする１又は複数の発現プラスミ ドで形質転換することにより生産することができる。これらの細胞において、ga g ，pol、及びenv遺伝子は同じ又は異なるレトロウイルス由来であり得る。 本発明に適したいくつかのパッケージング細胞系を先行技術において利用でき る。これらの細胞系の例は、Crip，GPE86，PA317及びPG13を含む。引用により本 明細書に組み込まれるMillerら（1991） (J．Virol．65：2220-2224)を参照のこと。他のパッケージング細胞系の例は、 その全てが引用により本明細書に組み込まれるCone，R.及びMulligan，R.C．(19 84)，(Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A.，81：6349- 6353及びDanos，0．及びR.C．Mulligan(1988)，(Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S.A.，85：6460-6464)，Eglitis，M.A，ら（1988）（B iotechniques 6：608-614）を参照のこと。 キメラエンベロープタンパク質と共にレトロウイルスベクター粒子を生産する ことができるパッケージング細胞系を用いることができる。あるいは、アンホト ロピック又はキセノトロピックエンベロープタンパク質、例えばPA317及びGPXパ ッケージング細胞系により生産されるものをレトロウイルスベクターをパッケー ジングするのに用いることができる。 細胞を核酸で形質転換することは、例えば、ベクターの宿主範囲内の細胞での ものを含むウイルスベクター（例えばレトロウイルス又はアデノ関連ウイルスベ クター）と共に細胞をインキュベートすることを含む。Methods in Enzymology ，Vol．185，Academic Press，Inc.，San Diego，CA（D.V．Goeddel，ed.）(199 0)又はM．Krieger(1990)，（Gene Transfer and Expression -- A Laboratory M anual，Stockton Press，New York，NY,）及び本明細書に言及される引用文献を 参照のこと。 ５．アデノ関連ウイルスでの形質転換 アデノ関連ウイルス（AAVs）は、生産性の感染を行うためにアデノウイルス又 はヘルペスウイルスのようなヘルパーウイルスを要求する。ヘルパーウイルス機 能の欠如下では、AAVは宿主細胞のゲノム内に（部位特異的に）組み込むが、そ の組み込まれたAAVゲノムは病原性効果はない。組み込みステップは、AAVゲノム が、宿主細 胞が適切な環境条件（例えば溶菌性ヘルパーウイルス）に露出されるまで遺伝子 的に完全であり続け、それにより溶菌生活環に再び入ることを許容する。Samuls ki（1993）(Current Opinion in Genetic and Development 3：74-80)及び本明 細書に言及される引用文献は、AAV生活環の概略を供する。 例えば核酸及びペプチドの試験管内生産並びに生体内及び生体外遺伝子療法手 順において、標的核酸を細胞に導入するのにAAVベースのベクターが用いられる 。AAVベクターの概略についてはWestら(1987)，Virology 160：38-47;Carterら （1989）米国特許4,797,368;Carterら (1993)，WO 93/24641;Kotin(1994)，Hum an Gene Therapy 5：793-801;Muzyczka(1994)，J．Clin．Invest．94：1351及び 、Samulski（前掲）を参照のこと。 組換えAAVベクター（rAAVベクター）は外来核酸を広範囲の哺乳動物細胞に送 り出し（Hermonat & Muzycka(1984)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81：6466-64 70;Tratschinら(1985)，Mol．Cell Biol．5：3251-3260)、宿主染色体内に組み 込み（Mclaughlinｅｔal．(1988)，Ｊ．Virol．62：1963-1973）、そして細胞及 び動物モデル内のトランスジーンの安定な発現を示す（Flotteら(1993)，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 90：10613-10617）。更に、いくつかのレトロウイルスと 異なり、rAAVベクターは、非分割性細胞に感染することができる(Podsakoffら(1 934)，J．Mol．Biol．11：517-521)。rAAVベクターの更なる利点は、固有の強力 なプロモーターの欠如を含み、これにより下流の細胞の配列及びそれらの裸のエ イコサヘドラルキャプシド構造の活性化の可能性を避け、一般的に研究技術によ る濃縮と安定かつ容易にする。rAAVベクターは、本発明のインヒビターを含むrA AVベクター内に抗ウイルス転写カセットを含ませることにより、例えばウイルス 感染を阻害するのに用いら れる。 ６．組換えワクシニアウイルスが感染した細胞における発現 工作されたGFP又はBFPをコードする核酸は、組換えワクシニア、例えばpGS62( Langford，C.L．ら(1986)，Mol．Cell．Biol．6：3191-3199)を生産するために デザインしたプラスミドに挿入される。このプラスミドは外来核酸の挿入のため のクローニング部位、挿入された核酸の合成を行うためのワクシニアのP7.5プロ モーター、及び外来核酸の両端に隣接するワクシニアTK遺伝子からなる。 工作されたGFP又はBFP核酸を含むプラスミドを作製する場合、その核酸は、感 染した細胞内での相同的組換えによりワクシニアウイルスに移すことができる。 これを達成するために、適切な受容細胞は、Wyeth，Lister，WR又はCopenhagen のようなワクシニアウイルスの要求される株で既に感染された細胞内への標準的 なリン酸カルシウム沈殿技術により組換えプラスミドが移入される。相同的組換 えは、ウイルス内のTK遺伝子とプラスミド内の隣接するTK遺伝子配列との間でお こる。これは、ウイルスTK遺伝子内に挿入された、これによりTK遺伝子を不活性 化する外来核酸を有する組換えウイルスを生ずる。組換えウイルスを含む細胞は 、TK遺伝子を発現する細胞について致死性である５−ブロモデオキシウリジンを 含む媒体を加えることにより選択される。 組換えウイルスの生産の確認は、工作されたGFP又はBFPをコードするcDNAを用 いるDNAハイブリダイゼーションにより、及び発現されたタンパク質に特異的な 抗体を用いる免疫検出技術により行われる。ウイルス保存物は、HeLAS3スピナー 細胞のような細胞の感染及びウイルス子孫の収集により調製することができる。 ７．組換え培養物中での発現 GFP−又はBFPコード化核酸は、宿主細胞培養物に用いるための 種々の発現ベクターに連結することができる。本発明と合わせて用いられる細胞 の培養物は当該技術で公知である。Freshney（1994）(Culture of Animal Cells ，a Manual of Basic Technique，thirdedition Wiley-Liss，New York)，Kuchl erら（1977）(Biochemical Methods in Cell Culture and Virology，Kuchler， R.J.，Dowden，Hutchinson and Ross，Inc.)及びここに言及される引用文献は、 細胞の培養物への一般的案内を供する。組換えタンパク質の生産のために役立つ 典型的な細胞培養物は、昆虫又は哺乳動物源の細胞を含む。哺乳動物細胞系は、 哺乳動物細胞懸濁液も用いられるが、しばしば細胞の単層の形態であろう。哺乳 動物細胞系の典型的な例は、単細胞、リンパ球、マクロファージ、VERO及びHeLa 細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、W138，BHK，Cos-7又はMDCK細 胞系を含む（例えばFreshney、前掲を参照のこと）。 哺乳動物源の細胞は、例えば、工作されたGFP又はBFPの生産のために役立つ細 胞培養物である。哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞懸濁液も用いることができるが 、しばしば細胞の単層の形態であろう。哺乳動物細胞系の典型例は、VERO及びHe La細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、WI38，BHK，COS-7又はMDCK 細胞系を含む。 上述のように、宿主細胞を形質転換するのに用いられるプラスミドは、好まし くは、転写を開始するためのDNA配列及び工作されたGFP又はBFP核酸配列の翻訳 を制御するための配列を含む。これらの配列は発現調節配列と呼ばれる。典型的 な発現調節配列は、SV-40プロモーター(Science 222：524-527，(1983))，CMV) 即ちPromoter(Proc．Natl．Acad．Sci．81：659-663，(1989))又はメタロチオネ イソプロモーター（Nature 296：39-42，(1982)）から得られる。発現調節配列 を含むクローニングベクターは、制限酵素を 用いて開裂され、必要な又は要求される大きさに調節され、そして当該技術で公 知の手段により工作されたGFP又はBFPをコードする配列に連結される。 培養において細胞を形質転換するためのベクターは、典型的には、工作された GFP又はBFP遺伝子の転写及び翻訳を開始するための遺伝子配列を含む。これらの 配列は選択された宿主細胞と適合する必要がある。更に、ベクターは、好ましく は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ又はメタロチオネインのような形質転換された宿 主細胞の選択のための表現型特性を供するためのマーカーを含む。更に、ベクタ ーは、複製可能源を含み得るであろう。 上述のように、高等動物宿主細胞を用いる場合、周知の哺乳動物遺伝子からの ポリアデニル化又は転写ターミネーター配列はベクター内に組み込まれる必要が ある。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル 化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列も含まれ得る。スプ ライシング配列の例はSV40からのVP1イントロンである(Sprague，Jら(1983)，J ．Virol．45：773-781)。 更に、宿主細胞内で複製を制御するための遺伝子配列は、ベクター、例えばウ シパピローマウイルス型ベクター内で見い出されるものに組み込まれ得る（Save ria-Campo，M．（1985）(“Bovine Papillomavirus DNA a Eukaryotic Cloning Vector”in DNA Clonig VolII a Practical Approach Ed．D.M．Glover，IRL Pr ess，Arlington，Virginia pp．213-231)。 形質転換された細胞は、当該技術で公知の手段により培養される。例えばKuch ler，R.J．ら(1977)（Biochemical Methods in Cell Culture and Virology）を 参照のこと。 本発明の実施に従って組換えDNA分子及び形質転換された単細胞 生物を調製するのに用いることができる上述の一般的手順に加えて、本発明の実 施を行うために他の周知の技術及びその改良を用いることができる。例えば、バ キュロウイルス発現システムのようなウイルス発現システムが本発明の範囲内に 考慮される。多くの現在の米国特許は、プラスミド、遺伝子操作した微生物、及 び本発明の実施に用いることができる遺伝子操作を行う方法を開示する。例えば 、米国特許第4,273,875号はプラスミド及びそれを単離する方法を開示する。米 国特許第4,304,863号は、ハイブリッドプラスミドが作製され、バクテリア宿主 を形質転換するのに用いられる遺伝子操作によりバクテリアを生産するための方 法を開示する。米国特許第4,411,450号は、組換えDNA作業におけるクローニング ビヒクルとして役立つプラスミドを開示する。米国特許第4,362,867号は組換えc DNA作製法及びそれにより作られたクローニング過程に役立つハイブリッドヌク レオチドを開示する。米国特許第4,403,036号は、DNAセグメントの多重の複製を 含むプラスミドを作り出すための遺伝子試薬を開示する。米国特許第4,363,877 号は、組換えDNA転移ベクターを開示する。米国特許第4,356,270号は、組換えDN Aクローニングビヒクルを開示し、それは遺伝子操作及びそれに用いる基本的な 過程において用いられる多くの用語を定義するので、遺伝子操作の分野で限られ た経験の人のために特に役立つ開示である。米国特許第4,336,336号は、適合さ れた遺伝子及びそれを作る方法を開示する。米国特許第4,319,629号は、プラス ミドベクター及びその生産及び使用を開示する。米国特許第4,332,901号は、組 換えDNA に役立つクローニングベクターを開示するこれらの特許のいくつかは本 発明の範囲内でない特定の遺伝子産物の生産に関するが、ここに記載される手順 は、遺伝子操作の当業者により本明細書に記載される本発明の実施に容易に改良 することができる。単離されたGF P cDNAの他の発現ベクターへの移入は、大腸菌内でのGFPポリペプチドの発現を 改良し又は他の宿主内でGFPを発現させる構成物を作り出すであろう。 III．GFP及びBFP核酸及びタンパク質の検出 Ａ．一般的検出法 本発明の核酸及びタンパク質は当業者に公知のいくつかの手段のいずれかによ り検出され、確認され、及び定量される。本発明の発現されたタンパク質の特有 の質は、それらが直ちかつ容易に観察され得る増強された蛍光を供することであ る。発現されたタンパク質のための蛍光アッセイを以下に詳細に記載する。核酸 及び対応するタンパク質を検出するための他の一般的な方法は、分析用の生化学 的方法、例えば分光光度測定、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気 泳動、高性能（液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー(TLC )、超拡散クロマトグラフィー等、及び種々の免疫学的方法、例えば流体又はゲ ル沈殿反応、免疫拡散（単一又は二重）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ （RIAs）、酵素関連イムノソルベントアッセイ（ELISAs）、免疫蛍光アッセイ等 を含む。核酸の検出は公知の方法、例えばサザン分析、ノーザン分析、ゲル電気 泳動、PCR）ラジオラベリング、シンチレーションカウンティング、及びアフィ ニティークロマトグラフィーにより行われる。 核酸ハイブリダイゼーション技術を用いる特定のDNA及びRNAの種々の方法が当 業者に知られている。例えば、サンプル中の工作されたGFP又はBFPDNAの存在又 は欠如を評価するための１つの方法は、サザン転移に関する。(Southernら(1975 )，J．Mol．Biol．98：503)。要約すると、消化されたゲノムDNAは緩衝液中でア ガローススラブゲル上に展開され、そして膜に移される。上述のプロー ブを用いてハイブリダイゼーションが行われる。ハイブリダイズしたタンパク質 の視覚化により、工作されたGFP又はBFP遺伝子の存在又は欠如を定性的に決定す ることができる。 同様に、工作されたGFP又はBFP遺伝子を発現する細胞からのRNAのサンプルの 工作されたGFP又はBFP mRNAの検出のためにノーザン転移を用いることができる 。要約すると、酸グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出法を用いて所定の 細胞サンプルからmRNAが単離される。次にmRNAはmRNA種を分離するために電気泳 動され、そしてmRNAはそのゲルからニトロセルロース膜に移される。サザンブロ ットと同様に、標識されたプローブを用いて工作されたGFP又はBFP転写物の存在 又は欠如が同定される。 核酸ハイブリダイゼーション形態の選択は重要でない。種々の核酸ハイブリダ イゼーション形態が当業者に知られている。例えば、一般的な形態は、サンドイ ッチアッセイ及び競合又は置換アッセイを含む。ハイブリダイゼーション技術は 一般に、“Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach,”Ed．Hames， B.D．and Higgins，S.J.，IRL Press，1985;Gall及びPardue(1969)，(Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 63：378-383);。並びにJohn，Burnsteil及びJones(1969)，( Nature 223：582-587)に記載される。 例えば、サンドイッチアッセイは、核酸配列を検出又は単離するための商業的 に役立つハイブリダイゼーションアッセイである。これらのアッセイは、固相に 共有結合で固定された“捕獲”核酸及び溶液中の標識された“シグナル”核酸を 利用する。臨床物サンプルは、標的核酸を供するであろう。“捕獲”核酸及び“ シグナル”核酸プローブは標的核酸とハイブリダイズして“サンドイッチ”ハイ ブリダイゼーション複合体を形成する。有効にするために、シグナル核酸は、捕 獲核酸とハイブリダイズすることができない。 本発明に用いられる核酸配列は、陽性又は陰性プローブのいずれかであり得る 。陽性プローブはそれらの標的に結合し、二本鎖形成の存在に標的の存在の証拠 である。陰性プローブは予想される標的に結合できず、二本鎖形成の欠如が標的 の存在の証拠である。例えば、野生型の特定の核酸プローブ又はPCRプライマー の使用は、変異操作したGFP又はBFPのみが存在する場合、アッセイサンプル中の 陰性プローブとして機能し得る。 標識されたシグナル核酸は、本明細書に記載されたものであるか当該技術で周 知の他のものであるかにかかわらず、ハイブリダイゼーションを検出するのに用 いられる。相補的核酸又はシグナル核酸は、典型的にはハイブリダイズしたポリ ヌクレオチドの存在を検出するのに用いられるいくつかの方法のうちのいずれか １つにより標識され得る。検出の１つの一般的な方法は、³Ｈ，¹²⁵Ｉ，³⁵Ｓ，¹⁴ Ｃ、又は³²Ｐ−標識化プローブ等でのオートラジオグラフィーの使用である。他 の標識は、標識化抗体に結合するリガンド、フルオロホア、化学発光剤、酵素、 及び標識化リガンドのための特異的結合対として機能し得る抗体を含む。 ハイブリダイゼーション複合体の検出は、標的の二本鎖及びプローブポリヌク レオチド又は核酸へのシグナル発生性複合体の結合を要求し得る。典型的には、 これらの結合はリガンドとコンジュゲートしたプローブとシグナルとコンジュゲ ートした抗リガンドとの間の相互作用のようなリガンドと抗リガンド相互作用を 通しておこる。シグナル発生性複合体の結合も、超音波エネルギーへの露出によ り加速するよう直ちに変えることができる。 標識は、ハイブリダイゼーション複合体の間接的検出も許容し得る。例えば、 標識がハプテン又は抗原である場合、サンプルは抗体を用いることにより検出す ることができる。これらのシステムにお いて、シグナルは、蛍光又は酵素分子を抗体に結合させることにより、又は特定 の場合、放射性標識への結合により作り出される(Tijssen，P．(1985)，“Pract ice and Theory of Enzyme Immunoassays,”Laboratory Techniques in Biochem istry and Molecular Biology，Burdon，R.H.，van Knippenberg，P.H.，Eds.， Elsevier，pp．9-20.)。 ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出されるべき標的核酸を増加さ せる核酸増幅システムの使用により増加させることができる。分子プローブとし て用いるための配列を増幅するため又は後のサブクローニングのための核酸フラ グメントを作り出すために適した試験管内増幅技術は周知である。これらの試験 管内増幅法を通して当業者が行うのに十分な技術、例えばポリメラーゼ鎖反応(P CR)、リガーゼ鎖反応(LCR)、Ｑβ−レプリカーゼ増幅及び他のRNAポリメラーゼ 媒介性技術(例えばNASBA)の例は、Berger，Sambrook、及びAusubel、並びにMull isら（1987）、米国特許4,683,202;PCRP rotocols A Guide to Methods and App lications（Innis et al.，eds）Academic Press Inc．San Diego，CA（1990）( Innis);Arnheim & Levinson(October 1，1990)，Chem．Eng．News 36-47;J．NIH Res．（1991）3：81-94;(Kwohら(1989)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：117 3;Guatelliら(1990)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：1874;Lomellら(1989)， J．Clin．Chem．35:1826;Landegrenら(1988)，Science 241：1077-1080;Van Bru nt(1990)，Biotechnology 8：291-294;Wu及びWallace（1989），Gene 4：560;Ba rringerら(1990)，Gene 89：117、並びにSooknanan及びMalek(1995)，Biotechno logy 13：563-564に見い出される。試験管内増幅された核酸をクローニングする 改良された方法は、Wallaceら（米国特許第5,426,039号）に記載される。当該 技術で現在記載される他の方法は、核酸配列ベースの増幅(NASBA^TM，Cangene，M ississauga，Ontario)及びＱβレプリコン合成である。これらのシステムは、PC R又はLCRプライマーは選択配列が存在する場合にのみ伸長され又は連結されるよ うにデザインされる場合に変異体を直接同定するのに用いることができる。ある いは、その選択配列は、例えば、非特異的プライマーを用いて一般に増幅するこ とができ、その増幅された標的領域は、変異を示す特定の配列のために後にプロ ーブされる。 例えば試験管内増幅法におけるプローブとして用いるため、遺伝子プローブと して用いるため、又はインヒビター構成物として用いるためのオリゴヌクレオチ ドは、典型的には、例えば、Needham-VanDevunterら（1984）(Nucleic Acids Re s．12：6159-6168)に記載されるような自動合成機を用いて、Beaucage及びCarut her（1981）(Tetrahedron Letts．22（20）：1859-1862)により記載される固相 ホスホルアミジドトリエステル法に従って化学的に合成される。必要なら、オリ ゴヌクレオチドの精製は、典型的には、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動 により又はPearson及びRegnier（1983）(J．Chrom．255：137-149)に記載される ような陰イオン交換HPLCにより行われる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Ma xam及びGilbert（1980）(Grossnan及びMoldave Ceds.)Academic Press，New Yor k，Methods in Enzymology)の化学的デグラデーション法を用いて確認すること ができる。 工作されたGFP又はBFP遺伝子の発現のレベルを決定するための他の手段はイン ・シトウハイブリダイゼーションである。イン・シトウハイブリダイゼーション アッセイは公知であり、一般に、Angererら（1987）(Methods Enzymol．152：64 9-660)に記載される。イン・シトウハイブリダイゼーションアッセイにおいて、 細胞は、 固体支持体、典型的にはガラススライドに固定化される。DNAがプローブされる べきなら、細胞は熱又はアルカリで変性される。次に細胞は、工作された標識さ れたGFP又はBFP特異的プローブのアニーリングを許容する適度な温度でハイブリ ダイゼーション溶液に接触される。そのプローブは、好ましくは、ラジオアイソ トープ又は蛍光リポーターで標識される。 Ｂ．蛍光アッセイ 蛍光を発することができるタンパク質のようなフルオロホアが適切な波長の光 に露出される場合、それは光を吸収及び保存して、次にその保存された光エネル ギーを放出する。フルオロホアが吸収することができる波長の範囲は、励起スペ クトルであり、フルオロホアが発光することができる波長の範囲は、発光又は蛍 光スペクトルである。所定のフルオロホアのための励起及び蛍光スペクトルは通 常異なり、周知の装置及び方法を用いて直ちに測定することができる。例えば、 シンチレーションカウンター及びホトメーター（例えばルミノメーター）、写真 フィルム、及び固体状装置、例えば電荷結合素子を、光の発光を検出及び測定す るのに用いることができる。 本明細書に供される核酸、ベクター、変異タンパク質は、組換えタンパク質を 過剰発現するための公知の技術と組み合わせて、均一な変異GFP及びBFPの無限の 供給を得ることを可能にする。これらの増加した蛍光活性を有する改変されたGF P又はBFPは、wtGFP又は現在の診断及びアッセイシステムにおいて用いられる他 のトレーサーから置き換わる。これらの現在用いられているトレーサーは、放射 性分子又は原子及び色形成性酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼを含 む。 本発明の変異体を用いる利益は、少くとも４点ある：改変された GFP及びBFPは放射能ベースのアッセイより安全であり、改変されたGFP及びBFPは 迅速かつ容易にアッセイすることができ、大量のサンプルを同時に扱うことがで き、全体の取扱いを削減し効率を増加させる。特に重要なのは、細胞内の蛍光タ ンパク質の発現及び亜細胞分布を、いずれの他の実験操作もなく、スライド上に 細胞をおき、そしてそれらを蛍光顕微鏡を通して見ることで生きている組織中で 検出することができる。これは、固定化及び次に標識化を要求する免疫検出の方 法を超えた大きな改良を供する。 本発明の改変GFP及びBFPは、蛍光マーカーに関する標準的アッセイに用いるこ とができる。例えば、各々が他方に結合する能力を破壊することなく本発明の変 異体で改変することができるリガンド−リゲーター結合対は、本発明により包含 されるアッセイの基礎を形成することができる。これら及び他のアッセイは当該 技術で周知であり、それらの本発明のGFP及びBFPとの使用は本明細書に開示され る技術の範囲内で当業者に明らかになろう。これらのアッセイの例は、標識及び 非標識リガンドがリゲーターに競合的に結合する競合アッセイ、リガンドがリゲ ーターにより捕獲されそして直接測定され又は標識された第２のリゲーターと“ サンドイッチ”にされる非競合アッセイを含む。なお他の型のアッセイは、イム ノアッセイ、シングルステップホモジニアスアッセイ、多重ステップヘテロジニ アスアッセイ及び酵素アッセイを含む。 いくつかの実施形態において、変異GFP及びBFPは、周知の技術（例えばStawbe rら、Virol．213：439-454（1995）を参照のこと）を用いる蛍光顕微鏡と、又は 好ましくは特定の組換え構成物を発現する細胞を検出し、及び任意に精製又はク ローン化するための蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）と組み合わされる。FA CS及びその使用の概略については、Herzenbergら、1976（“Fluorescence ac tivated cell sorting"，Sci．Amer．234，108）を参照のこと。また、FLOW CYT OMETRY AND SORTING，eds（Melamad，Mullaney and Mendelsohn，John Wiley an d Sons，Inc.，New York，1979）も参照のこと。要約すると、蛍光活性化細胞ソ ーターは細胞の懸濁液をとり、そしてそれらをディテクター近くに置かれたレー ザーの光経路へ単一ファイルで通過させる。レーザーは、通常、一セットの波長 を有する。ディテクターは、各々の細胞がその装置を通過する時に各々の細胞の 蛍光発光強度を測定し、細胞数対蛍光強度のヒストグラムプロットを作り出す。 ゲート又はリミットは、ヒストグラム上に置くことができ、これにより細胞の特 定の集団を同定する。一実施形態において、細胞ソーターは、最も高いプローブ 強度を有する細胞、通常、培養細胞の小さな画分を選択するため、及び全ての他 の細胞からこれらの選択された細胞を分離するためにセットアップされる。ソー ターがセットされる強度のレベル及び選択される細胞の画分は、親培養の条件及 び単離の基準による。一般に、オペレーターは、最初に培養物のアリコートをソ ートし、そして強度対細胞数のヒストグラムを記録する。次にオペレーターは、 選択レベルをセットし、適切な数の最も活性な細胞を単離する。現在、蛍光活性 化細胞ソーターには自動化細胞クローニング装置が備え付けられる。このような 装置は、それをモノクローナル培養物に増殖させる個々の増殖ウェルに選択され た細胞を単独で析出させるための道具を与えることができる。これにより、遺伝 子均一性は、新しくクローン化された培養物内で確立される。 IV．GFP変異体のための一般的適用 本明細書に記載される変異GFP及びBFPは限定されない使用、特に関心の他の核 酸配列の同時発現のためのシグナルもしくはリポーター配列として、及び／又は 組織等内の細胞内の他の配列の位置及 び／又は動きを追跡するための使用を有する。例えば、これらのリポーター型配 列は、薬剤スクリーニングにおける病気の原因体の広がり（又はその欠如）を追 跡するのに用いることができ、又は診断に直ちに用いることができる。より興味 ある適用のいくつかを以下に記載する。 Ａ．タンパク質トラフィッキング 通常、発現された変異GFP及びBFPは、核小体を除いて細胞（特に哺乳動物細胞 ）全体を通して分散される。しかしながら、以下に記載されるように、GFP変異 体がHIV-1 Revタンパク質に融合される場合、Rev機能を保持するハイブリッド分 子を生じ、Revが見い出される核小体内に主に局在化する。HIV-1 Netタンパク質 のＮ末端ドメインへの融合は、形質膜内で検出できるハイブリッドタンパク質を 作り出す。これにより、GFP変異体は、亜細胞標的及び融合されたタンパク質の 輸送をモニターするのに用いることができる。 Ｂ．遺伝子療法 本明細書に記載される変異GFPは遺伝子療法において興味ある役立つ適用を有 する。遺伝子療法は、一般に、外来性遺伝子の発現がａ）遺伝子欠損を正す又は ｂ）遺伝子的に欠損のある細胞の破壊を引きおこすように、要求される機能をコ ードする外来性細胞の遺伝子の、その機能を欠く細胞内への挿入により遺伝子欠 損を正すことである。遺伝子療法の方法は当該技術で公知である。例えば、各々 が引用により本明細書に組み込まれる。Lu，M.，ら(1994)，(Human Gene Therap y 5：203);Smith，C．(1992)，(J．Hematotherapy 1：155);Cassel，A.,ら(1993 )，(Exp．Hematol．21-:585(1993));Larrick，J.W．及びBurck，K.L.，（GENE T HERAPY:APPLICATION OF MOLECULAR BIOLOGY，Elsevier Science Publishing Co. ，Inc.，New York，New York(1991)）及びKreigler，M．（GENE TRANS FER AND EXPRESSION:A LABORATORY MANUAL，W．H．Freeman and Company，New Y ork(1990)）を参照のこと。遺伝子療法の１つの様式は、（ａ）患者から特定の 細胞型の一次細胞の生存可能なサンプルを得ること；（ｂ）これらの一次細胞に 要求される遺伝子産物をコードする核酸セグメントを挿入すること；（ｃ）遺伝 子産物を発現する細胞及び細胞系を同定及び単離すること；（ｄ）遺伝子産物を 発現する細胞を再導入すること；（ｅ）ステップ（ｃ）から生じた細胞及びそれ らの子孫を含む組織のアリコートを患者から除去すること；及び（ｆ）前記アリ コート内のステップ（ｃ）から生じた細胞及びそれらの子孫の量を決定すること に関する。要求される遺伝子に加えてのGFP又はBFPをコードする多シストロン性 ベクターの、ステップ（ｃ）における細胞への導入は、要求される遺伝子を含み 、それを発現する生存可能な細胞の迅速な同定を許容する。 他の遺伝子療法の様式は、要求される核酸を、その場の選択された組織細胞内 、例えば癌又は病気の細胞に、その場の標的細胞を問題の遺伝子産物をコードす るレトロウイルスベクターに接触させることにより挿入することに関する。ここ で、何の又はどの細胞の集団が移入されたのかを迅速かつ信頼できるように評価 することが重要である。GFP及びBFPの同時発現は、移入された細胞の集団及び発 現のレベルの迅速な評価を許容する。 Ｃ．診断 GFP／BFP変異体の１つの可能性ある適用は診断テストにおいてである。GFP／B FP遺伝子は、種々の剤により誘導されるプロモーターの制御下におく場合、これ らの剤のための指示体として機能し得る。要求されるプロモーター下で発現され るGFP／BFPを有するトランスジェニック動物からの確立された細胞系又は細胞及 び組織は、誘導剤の存在下で蛍光になるであろう。 対応するウイルスにより活性化されるウイルスプロモーター、種々の細胞のス トレスにより誘導されるヒートショック遺伝子のプロモーター及び生物応答、例 えば炎症にセンシティブであるプロモーターは、診断において記載されるGFP／B FP変異体と組み合わせて用いることができる。 更に、選択される培養条件及び構成物（塩濃度、pH、温度、トランス機能調節 物質、ホルモン、細胞間接触、細胞表面のリガンド及び内部のレセプター）の効 果は、本明細書に供される蛍光タンパク質をコードする配列が選択された遺伝子 由来の塩酸（特に調節要素、例えばプロモーター）に作用可能に結合されている 細胞をインキュベートし、そして蛍光の発現及び位置を検出することにより評価 することができる。 Ｄ．毒物学 GFP／BFPベースの方法の他の適用は毒物学の分野である。いずれかの化合物の 変異誘発能力の評価は、その使用のために予め必要とされる。現在まで、サルモ ネラにおけるAmesアッセイ及び培養した哺乳動物細胞における染色体異常型又は 娘染色分体交換に基づくテストは毒物学において主要な道具であった。しかしな がら、両方のアッセイは限られた感度及び特異性であり、完全な生物の種々の器 官又は組織の変異誘導に基づく研究を許容しない。 トランスジェニックマウスへの、シャトルベクター内の変異標的の導入は、生 体内の異なる組織内で誘導された変異の検出を可能にした。そのアッセイは、露 出されたマウスの組織からのDNA単離、標的DNAのバクテリオファージラムダ粒子 へのパッケージング及び後の大腸菌の感染に関する。このアッセイにおける変異 標的はlacZ又はlacI遺伝子のいずれかであり、バクテリアのローン上の青対白プ ラークの定量は変異誘発評価を許容する。 GFP／BFPは組織培養及びトランスジェニックマウス手順の両方を大きく単純化 する。構成物に発現された遺伝子のプロモーターによりドライブされるレプレッ サーの制御下でのGFP／BFPの発現は、剤の変異誘発能力を評価するための迅速な 方法を確立するであろう。GFP／BFPベースの検出構成物を有する細胞系、組織又 は完全な動物の露出の後の蛍光細胞の存在は、問題の化合物の変異誘発力を反映 するであろう。標的DNA、レプレッサー遺伝子の制御下で発現されるGFP／BFPは 、そのレプレッサーが不活性化もしくは止められ、又はレプレッサー認識配列が 変異された時にのみ合成されるであろう。ディテクター細胞系又は組織バイオプ シーの直接的視覚化は、その剤の変異誘発力を定性的に評価し、他方解離した細 胞のFACSは定量的分析を供し得る。 Ｅ．薬剤スクリーニング GFP／BFP検出システムは、いくつかの現在の薬剤スクリーニング手順を促進し 、そのコストを大きく削減することもできた。GFPを標的遺伝子のプロモーター 下におきそしてBFPを構成的プロモーターから発現させる二重色スクリーニング システムは、標的遺伝子に特異的に影響を与える剤の迅速な分析を供し得よう。 DCSSでの確立された細胞系は、数時間で何百もの化合物でスクリーニングするこ とができよう。要求される薬剤は、GFPの発現に影響を与えるだけであろう。非 特異的又は細胞毒性効果は、第２のマーカーBFPにより検出されよう。このシス テムの利点は、GFP及びBFP検出のために外来物質が必要とされないこと、そのア ッセイを単一細胞、細胞集団、又は細胞抽出液と共に用いることができること。 並びに同じ検出技術で装置が極めて迅速かつ非破壊的検出のために用いられるこ とである。 細胞の転写に影響を与えることなくウイルス転写を特異的にブロ ックする抗ウイルス剤についての調査は、DCSSにより大きく改善されよう。HIV の場合、HIV LTR下でGFPを細胞の構成的プロモーター下でBFPを発現する適切な 細胞系は、HIV転写を選択的に阻害する化合物を同定することができよう。青色 でなく緑色蛍光の減少はHIVプロモーターについての薬剤特異性を示すであろう 。他のウイルスについて同様のアプローチもデザインすることができよう。 更に、抗寄生虫剤についての調査もDCSSにより助けられよう。GFPの発現が寄 生体特異的トランススプライシング配列に依存し、BFPが宿主特異的シススプラ イシング要素の制御下にある確立された細胞系もしくはトランスジェニック線虫 又は寄生虫抽出物は、選択的抗寄生体剤の迅速なスクリーニングを供し得るであ ろう。 本発明に、実例の目的のみのために含まれ、他に示さなければ本発明を限定す ることを意図しない以下の特定の実施例を引用することによりより十分に理解さ れるであろう。 実施例 変異GFP−又はBFP−コード化核酸を作り出し、宿主細胞を形質転換し、並びに 変異GFP及びBFPタンパク質を発現するために以下の一般的プロトコルを用いた。 ・wtGFP又はBFP(Tyr₆₇→His)をコードする核酸を、真核細胞又は原核細胞プロ モーターの制御下で、標準ds-DNAプラスミドにクローン化し、 ・標準的方法によりプラスミドベクターをss-DNAに移し、 ・工作を意図する部位において塩基不適正を有する40〜50ヌクレオチドDNAオ リゴマーにss-DNAをアニーリングし、 ・ss-DNAをクローン化ds-DNAプラスミドベクターに、DNAポリメラーゼ及び標 準的プロトコルの使用により移し、 ・変異誘発されたDNAで形質転換された大腸菌株からのプラスミ ドDNA単離の後、制限分析により要求される変異を含むプラスミドを同定し、 ・DNA配列決定により変異体の存在を確認し、 ・ヒト形質転換胚腎臓293細胞に、適切なプラスミドからの等量のDNAを移入し 、 ・シグナルの蛍光強度を比較する。 核酸及びベクター wtGFP cDNA（配列番号：１）をコロンビア大学のDr．Chalfieから得た。記載 される全ての変異体は、以下に記載のようにこのwtGFP配列を改変することによ り得た。 GFP及びBFPをクローンし、発現するのに用いるベクターは、市販のプラスミド pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA),pBSSK＋(Stratagene，La Jolla，CA)及びp ET11a(Novagen Madison，WI)の誘導体である。 哺乳動物細胞におけるwtGFPタンパク質発現 哺乳動物細胞におけるGFPの発現のためのいくつかのベクターを作製した： pFRED4は、サイトメガロウイルス(CMV)早期プロモーターの制御下のwtGFP配列 及びヒト免疫不全ウイルス−１(HIV)の３’の長い末端反復(CTR)のポリアデニル 化シグナルを有する。pFRED4を得るに、我々はポリメラーゼ鎖反応(PCR)により プラスミド＃TU58（Chalfieら、1994）からのGFPコード化配列を増幅した。GFP コード化領域のPCR増幅のために、プライマーとしてオリゴヌクレオチド＃16417 及び＃16418を用いた。BssH II認識配列及びHIV-1 Tatタンパク質の翻訳開始配 列を含むオリゴヌクレオチド配列＃16417：5’-GGAGGCGCGCAAGAAATGGCTAGCAAAGG AGAAGA-3’（配列番号：３）はセンスプライマーであった。アンチセンスプライ マー＃1641 8：5’-GCGGGATCCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG-3’（配列番号：４）はBamHＩ 認識配列を含んでいた。その増幅したフラグメントをBssHII及びBamHＩで消化し 、CMV早期プロモーター及びHIV-1 p37gag領域、次にいくつかのクローニング部 位及びHIV-1 ３’LTRを含むプラスミドである、BssHII及びBamHＩで消化したpCM V37M1-10Dにクローン化した。これによりp37gag遺伝子をGFPで置換してpFRED4を 作り出した。 第２のステップにおいて、StuＩ及びBamHＩ二重消化から作ったpFRED4からの1 485bpフラグメントを、pcDNA3のNruＩ及びBamHＩ二重消化から得た4747bpベクタ ーにサブクローンした。生じたプラスミドpFRED7（配列番号：５）は、早期CMV プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの制御下でGFPを発 現する。 細菌の発現 細菌の発現のために、我々はwtGFPを有するpBSSK＋誘導体であるプラスミドpB SGFP（配列番号：６）を作製した。BamHII及びBamHＩで消化し、そして次にKlen owで処理したpFRED4のGFP含有領域を、EcoRＶで消化したpBSSK＋ベクターに挿入 することによりpBSGFPを形成した。pBSGFPにおいて、wtGFPを、pBSSK＋ポリリン カー領域内に存在するβ−ガラクトシダーゼのαペプチドの43アミノ酸の下流に 融合する。wtGFPのＮ末端に加えられたアミノ酸は、余分なアミノ酸の正確な削 除を含む後のプラスミドから判断してGFPシグナルへの明らかな効果は有さない 。 GFP過剰発現及び精製のため、我々はNheＩ及びBamHＩで消化したpFRED7からの 717bpフラグメントを、pET11aのNheＩ及びBamHＩ二重消化から生ずる5644bpフラ グメントに連結することにより、我々はプラスミドpFRED13（配列番号：７）を 作り出した。pFRED13において、GFPはバクテリオファージT7 phi10プロモーター の制御下 で合成される。 GFP変異誘発に用いるオリゴヌクレオチドを、National Cancer InstituteのAB L Basic Research ProgramのDNA Support Servicesにより合成した。製造元の説 明に従って、PCRアシスト蛍光ターミネーター法（Ready Reaction DyeDeoxy Ter minator Cycle Sequencing Kit，ABI，Columbia，MD）によりDNA配列決定を行っ た。配列決定反応は、ABI Model 373A DNA Sequencing Systemで解いた。配列決 定データは、Sequencher program(Gene Codes，Ann Arbor，MI)を用いて分析し た。 酵素はNew England Biolabs（Beverly，MA）から購入し、供給元により記載さ れる条件に従って用いた。野生型及び変異タンパク質の精製のために用いる化学 品は、SIGMA（St．Louis，MO）から購入した。組織培養培地は、Biofluids（Roc kville，MD）及びGIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)から得た。コンピテント細菌細 胞はGIBCO/BRLから購入した。 変異体の調製 最初に、プラスミドpBSGFPを用いて、Schwartzら（1992）（J．Virol．66：71 76）により記載されるように、一本鎖DNA部位特異的変異誘発によりGFPコード化 配列を変異誘発した。特定のコドンを変えることに加えて、我々のストラテジー は、GFPアミノ酸配列を変えることなく潜在的な阻害ヌクレオチド配列を置換す ることによりGFP発現を改良することでもある。このアプローチは、他のタンパ ク質のために過去に成功して用いられている（Schwartzら、（1992）(J．Virol ．66：7176)。 pBSGFP変異誘発のために、以下のオリゴヌクレオチド： ＃17422（配列番号：８）： 5’-CAATTTGTGTCCCAGAATGTTGCCATCTTCCTTGAAGTCAATACCTTT-3’ ＃17423（配列番号：９）： 5’-GTCTTGTAGTTGCCGTCATCTTTGAAGAAGATGCTCCTTTCCTGTAC-3’ ＃17424（配列番号：10）： 5’-CATGGAACAGGCAGTTTGCCAGTAGTGCAGATGAACTTCAGGGTAAGTTTTC-3’ ＃17425（配列番号：11）： 5’-CTCCACTGACAGAGAACTTGTGGCCGTTAACATCACCATC-3’ ＃17426（配列番号：12）： 5’-CCATCTTCAATGTTGTGGCGGGTCTTGAAGTTCACTTTGATTCCATT-3’ ＃17465（配列番号：13）： 5’-CGATAAGCTTGAGGATCCTCAGTTGTACAGTTCATCCATGC-3’ オリゴヌクレオチド＃17426は、位置168のイソロイシン（Ile）をトレオニン( Thr)に変えるGFPの変異を導入する。Ile168Thr変換は、GFPスペクトルを変え、 最大発光において約２倍だけGFP蛍光の強度も増加させる（Heimら（1994）、前 掲）。 変異誘発混合物を用いてDH5aコンピテント大腸菌細胞を形質転換した。アンピ シリン耐性コロニーを得て、UV光での励起によりそれらの蛍光特性について検査 した。残りのものよりかなり明るい１つのコロニーは寒天プレート上で明らかで あった。このコロニーを更に精製し、そのプラスミドDNAを単離してDH5aコンピ テント細菌を形質転換するのに用いた。この時、UV光で励起させた時に全てのコ ロニーは明るい緑色であり、このことは、明るい緑の蛍光がプラスミドの存在に 関連していることを示した。p135GFPsg11と呼ぶこのプラスミドのGFPセグメント の配列（セグメントのみを示し、完全なプラスミドを示さない配列番号：14）を 次に決定した。その配列分析は、GFPのアミノ酸配列を変えないデザインされた ヌクレオチド変換、及びIle168Thr変異に加えて、第２の自発的な変異がおこっ ていることを示した。pPBSGFPsgll DNAのGFPコード化領域であ る配列番号：14の位置322のチミジンをシトシンで置換した。このヌクレオチド 配列は、GFPアミノ酸配列の位置65のフェニルアラニン(Phe)をロイシン(Leu)に 変換する。以下に記載されるであろう一連の実験は、実際に、Phe65Leu変異が蛍 光GFPシグナルの強度の増加を引きおこすことを証明した。 以下に詳述される合理的にデザインされたGFP変異コンビネーションの形成に 関する後の実験において、我々は、一本鎖DNA部位特異的変異誘発アプローチも 用いた。しかしながらこの時、テンプレートDNAはpBSGFPのかわりにpFRED7誘導 体であった。 移入及び発現 アデノウイルスで形質転換したヒト胚腎臓細胞系である293細胞系（Grahamら( 1977)．J．Gen．Virol．５：59）をタンパク質発現分析のために用いた。その細 胞を、10％熱不活性化胎児ウシ血清（FBS，Biofluids）を補給したDulbecco's改 良培養培地（DMEM）中で培養した。 上述（Grahamら(1973)，Virol．52：456：Felberら(1990)，J．Virol．64：37 34）のようにリン酸カルシウム共沈殿技術により移入を行った。プラスミドDNA は、製造元の説明（Qiagen）に従ってQiagenカラムにより精製した。最終沈殿の ml当り５〜10μｇの全DNAの混合物を、各々0.5，0.25及び0.125mlの沈殿を用い て60mm又は６−及び12−ウエル組織培養プレート（Falcon）内で細胞上に重層し た。一晩のインキュベーションの後、細胞を洗い、フェノールレッドを含まない 媒体中に入れ、プレートスペクトロフルオロメーター、例えばCytofluor II (Pe rceptive Biosystems，Framing ham，MA)において測定した。 野生型及び変異タンパク質の精製 変異GFP遺伝子と共にpFRED13又は他のpET11a誘導体を有する大 腸菌株を、wt及び変異GFP又はBFPSの過剰発現及び精製のために用いた。その細 胞を、32℃で100μｇ／mlアンピシリンを含む１リッタ−LBブイヨン内で、600mm で0.6〜0.8光学密度単位まで成長させた。この時点で、細胞を0.6mM IPTGで誘導 し、そして更に４時間、インキュベートした。細胞ペレットの収集の後、細胞抽 出液をJohnson，B.H及びHecht，M.H(1994，Biotechnol．12：1357)に記載される ように調製した。 GFP及びBFPを次のように細胞抽出液から精製した：最初にその抽出液に硫酸ア ンモニウム（AS）を加え(100gの上清当り50gのAS）でタンパク質を沈殿させた。 その沈殿を、15分の7500×ｇでの遠心により収集し、そのペレットを５mlの1M A Sに溶かした。次にサンプルをフェニルセファロースカラム（HR10/10，Pharmaci a，Piscatuway，NJ)上に充填し、20mMの2−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン 酸（MES）pH5.6及び1M ASで洗った。タンパク質を20mM MES，pH5.6への45m1勾配 で溶出した。GFP又はBFPタンパク質を含む画分を可視光下でさえ有色である。 緑色又は青色画分を、20mM Tris pH7.0から20mM Tris pH7.0，0.25M NaClへの 20ml勾配でQ-Sepharose(Mono Q，HR5/5，Pharmacia)で更に精製した。 AS沈殿ステップを４℃で行い、クロマトグラフィー手順を室温で行った。 タンパク質濃度の測定 タンパク質濃度を、標準としてウシIgGタンパク質と共に市販のBradfordタン パク質アッセイ（BioRad，Hrcules，CA）を用いて決定した。 分析用ポリアクリルアミドゲル 分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて精製されたGFP 又はBFPタンパク質の純度を視覚化した。全ての場合、（トリス緩衝液pH7.4中に 0.1％SDSを含む）１mm厚の12％アクリルアミドゲルを用い、12℃で２時間、電気 泳動を行った。ゲルをクーマシーブルーで染色してタンパク質を視覚化した。 蛍光測定 蛍光タンパク質の溶液の励起及び発光スペクトルを、Perkin Elmer L550Bスペ クトロフルオリメーター（Perkin Elmer，Advanced Biosystems，Foster City， CA）を用いて得た。 以下の表ＩのGFP変異体についての相対的蛍光データを、形質転換したヒト胚 腎臓細胞系293内で発現されたGFP変異体の細胞の蛍光を、同じ細胞系内で発現さ れたwtGFPと比較することにより得た。同様に、以下の表ＩのBFP変異体について の相対的蛍光データを、293細胞内で発現されたBFP変異体の細胞の蛍光を、同じ 細胞系内で発現されたBFP(Tyr₆₇→His)と比較することにより得た。等量の野生 型又は変異タンパク質をコードするDNAを293細胞に導入した。細胞の蛍光を、Cy tofluor IIを用いて移入後24時間、又は48時間に定置した。 導入されたアミノ酸変異体を示すGFP変異タンパク質のリストを表Ｉに示す。 実施例１：SG12 本明細書に記載される特有のいくつかの変異体は、wtGFPの位置65のフェニル アラニンがロイシンに変えられている、部位特異的変異誘発実験により得られた 計画せず、予想もしない“SG12”と呼ぶ変異体の発見から得られる。SG12は次の ように調製した：SG12を有する２つのプラスミド：哺乳動物細胞内での発現のた めのpFRED12及び大腸菌内での発現及びタンパク質精製のためのpFRED16(配列番 号：15)を作った。pFRED12は、pFRED7のAvrII及びPm1Ｉでの二重消化からの1557 bpフラグメントを、pFRED11のAvrII及びPm1Ｉ消化から生じた4681bpフラグメン トに連結することにより作製した。pFRED16は、pFRED12のNheＩ及びBamHＩでの 消化から生じた717bpセグメントを、同じ制限酵素で消化したpET11aベクターの5 644bpフラグメントにサブクローニングすることにより得た。 SG12の比活性はwtGFPのそれの約９〜12倍であった。 実施例２：SG11 イソロイシン168のトレオニンへの置換及びリシン239のアスパラギンへの置換 と共にフェニルアラニン65のロイシンへの変換を組み合わせた“SG11”と呼ぶ変 異体は更に増強された蛍光強度を供した。SGIIを次のように調製した：SG11を有 する２つのプラスミド（配列番号：16）：哺乳動物細胞における発現のためのpF RED11及び大腸菌内での発現及びタンパク質精製のためのpFRED15を形成した。pF RED11は、NheＩ及びBamHＩで消化したpBSGFPsg11からの717bp領域を、同じ酵素 でのpFRED7の消化から得られた5221bpフラグメントに連結することにより作製し た。pFRED15は、NheＩ及びBamHＩでのpFRED11の消化から生じた717bpセグメント を、同じ制限酵素で消化したpET11aベクターの5644bpフラグメントにサブクロー ニングすることにより作った。 変異SG11はその変異が、フェニルアラニン65のロイシンへの変換及びロイシン 168のトレオニンへの変換を含む工作されたGFPをコードする。Ｃ末端の1ys239の asnへの更なる変換は効果なく；Ｃ末端のlys又はasnは、蛍光に影響を与えるこ となく削除することができる。SG11の比活性はwtGFPのそれの約19〜38倍である 。表IIを参照のこと。 実施例３：SG25 第３の及び更に改変したGFP変異体は、“SG11”を更に変異することにより得 た。この変異体は、“SG25”と呼び、SG11置換に加えて、通常、配列の位置66に おいて見い出されるシステインのセリンへの更なる置換を含む。SG11は次の通り 調製した：SG25を有する２つのプラスミド（配列番号：17）：哺乳動物細胞にお ける発現のためのpFRED25及び大腸菌内での発現及びタンパク質精製のためのpFR ED63を作り出した。pFRED25は、オリゴヌクレオチド＃18217(配列番号：18)：5 ’-CATTGAACACCATAGCACAGAGTAGTGACTAGTGTTGGCC- 3’を用いて、pFRED11の部位特異的変異誘発により作製した。Ser66Cysは、発光 スペクトルの大きな変化なく最大GFP励起を変え、GFPの蛍光シグナルの強度も増 加させることが示されている（Heimら、1995）。 pFRED63は、NheＩ及びBamHＩでのpFRED25の消化から生じた717bpセグメントを 、同じ制限酵素で消化したpET11aベクターの5644bpフラグメントにサブクローニ ングすることにより作った。 変異SG25は、その変異がフェニルアラニン65のLeuへの変換、イソロイシン168 のトレオニンへの変換及びセリン66のシステインへの変換を含む工作されたGFP をコードする。SG11と同様、Ｃ末端のリシン239のアスパラギンへの更なる変換 は効果なく；Ｃ末端のリシン又はアスパラギンは、蛍光に影響を与えることなく 削除することができる。SG25の比活性は、wtGFPのそれの約56倍である。 実施例４：更なる緑色蛍光変異体 wtGFPの異なるアミノ酸の更なる変換は、SG11及びSG25と組み合わせた時、wtG FPと比べて少くとも５倍大きい細胞の蛍光を有する。これらの変異体の非限定的 リストを以下に供する。 増強された細胞の蛍光を有するGFP変異体 タンパク質 変えたアミノ酸 SG20 F65L， S66T， I168T， K239N SG21 F65L， S66A， I168T， K239N SG27 Y40L， F65L， I168T， K239N SG30 F47L， F65L， I168T， K239N SG32 F72L， F65L， I168T， K239N SG43 F65L， I168T， Y201L， K239N SG46 F65L， V164A， I168T， K239N SG72 F65L， S66C， V164A， I168T， K239N SG91 F65L， S66C， F100L， I168T， K239N SG94 F65L， S66C， Y107L， I168T， K239N SG95 F65L， S66C， F115L， I168T， K239N SG96 F65L， S66C， F113L， I168T， K239N SG98 F65L， S66C， Y146L， I168T， K239N SG100 F65L， S66C， Y152L， I168T， K239N SG101 F65L， S66C， I168T， Y183L， K239N SG102 F65L， S66C， I168T， F224L， K239N SG103 F65L， S66C， I168T， Y238L， K239N SG106 F65L， S66T， V164A， I168T， K239N 実施例５：SB42 ここ及び以下に記載される青色蛍光タンパク質は、位置67においてヒスチジン がチロシンに置換されている周知のGFP変異体(Heimら、PNAS，1994)から得た。 我々は、この周知の変異体をBFP(Tyr₆₇→His)で示した。BFP(Tyr₆₇→His)は、シ フトした発光スペクトルを有する。それは青色光を発し、即ちそれは青色蛍光タ ンパク質(BFP)である。 SG12を作るのに用いたBFP(Tyr₆₇→His)における同じ変異、即ち位置65のロイ シンのフェニルアラニンへの変異を導入することにより、我々は、我々が“Supe r Blue-42”（SB42）と呼ぶ予想されたい高い蛍光を有する新しい変異体を作り 出した。SB42は、以下のように調製した：SB42を有する２つのプラスミド（配列 番号：19）：哺乳動物細胞における発現のためのpFRED42及び大腸菌における発 現及びタンパク質精製のためのpFRED65を作った。pFRED42は、オリゴヌクレオチ ド＃bio25(配列番号：20)：5-CATTGAACACCATGAGAGAGAGTAGTGACTAGTGTTGGCC-3’ を用いて、pFRED12の部位特異的変異誘発により作製した。このオリゴオクレオ チドはTyr₆₇−His変異を SG12内に組み込み、これによりPhe65Leu，Tyr₆₇→His二重変異を作り出す。 pFRED65は、NheＩ及びBamHＩでのpFRED42の消化から生じた７17bpセグメント を、同じ制限酵素で消化したpET11aベクターの5644bpフラグメントにサブクロー ニングすることにより作製した。 変異SB42は、その変異がチロシン67のヒスチジンへの変換、及びフェニルアラ ニン65のロイシンへの変換を含む。SB42の比活性はBFP(Tyr₆₇→His)のそれの約2 7倍である。表IIを参照のこと。 実施例６：SB49 位置164のバリンをアラニンに置換するBFP(Tyr₆₇→His)の独立した変異を“SB 42”と呼ぶ。SB49を次のように調製した：プラスミドpFRED49は哺乳動物細胞に おいてSB49（配列番号：21）を発現する。pFRED49は、オリゴヌクレオチド＃190 59及び＃bio24を用いて、pFRED12の部位特異的変異誘発により作った。オリゴヌ クレオチド＃19059(5’-CTTCAATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCGCTTTGATTCCATTC-3’（ 配列番号：22）はSG12にVal164Ala変異を導入し、オリゴヌクレオチド＃bio24(5 ’-CATTGAACACCATGAGAGAAAGTAGTGACTAGTGTTGGCC-3’)(配列番号：23)はPhe65Leu 変換をwt配列にもどし、同時にTyr₆₇→His変異を組み込む。 変異SB49は、その変異がチロシン67のヒスチジンへの変換、及びバリン164の アラニンへの変換を含む工作されたBFPをコードする。SB49の比活性は、BFP(Tyr₆₇ →His)のそれより約37倍大きかった。 実施例７：SB50 上述の２つのBFP変異の組合せは、先の変異体のいずれよりもかなり大きい蛍 光の増加を供する“SB50”を生じた。SB50は次のように調製した：SB50を有する ２つのプラスミド（配列番号：24）：哺 乳動物細胞における発現のためのpFRED50及び大腸菌内での発現及びタンパク質 精製のためのpFRED67を作り出した。pFRED50は、オリゴヌクレオチド＃19059及 び＃bio25を用いて、pFRED12の部位特異的変異誘発により作製した。 pFRED67は、NheＩ及びBamHＩでのpFRED50の消化から生ずる７17bpセグメント を、同じ制限酵素で消化したpET11aベクターの5644bpフラグメントにサブクロー ニングすることにより作り出した。 変異SB50は、その変異がチロシン67のヒスチジンへの変換、フェニルアラニン 65のロイシンへの変換、及びアラニン164のバリンへの変換を含む工作されたBFP をコードする。SB50の比活性はBFP(Tyr₆₇→His)のそれの約63倍であった。 本発明のアミノ酸置換から生じた蛍光活性の劇的な増加は全く予想されなかっ た。これら変異体の細胞の蛍光は親のwtGFP又はBFP(Tyr₆₇→His)のそれより少く とも５倍、そして通常20倍超大きかった。変異体により最大発光波長が変わるこ と、上述の倍率の増加はその変異体の最大発光波長における相対的な細胞の蛍光 の最小の増 加でしかないことに注意のこと。特定の波長であるなら、その値は実質的により 大きくなり得る。即ち、変異体は、対照のwtGFP又はBFP(Tyr₆₇→His)より200倍 大きい細胞の蛍光を有し得る。このことは、蛍光を測定するための装置がしばし ばセットされた波長を有するため、又は所定の実験の限定がセットされた波長の 使用を要求するため、重要である。これにより、例えば、蛍光顕微鏡又は蛍光活 性化セルソーターの発光及び検出パラメータは、所定の変異体の細胞の蛍光が周 知のGFP及びBFPのそれより200倍大きい波長にセットすることができる。 本発明のGFP及びBFP変異体は、野生型タンパク質又は他の報告されている変異 体と対照的に、ゲノム内に安定に組み込まれたわずかの複製が存在する場合に、 生きている哺乳動物における緑色蛍光の検出を許容する。変異GFP及びBFPの高い 細胞の蛍光は、生きている細胞及び組織中での遺伝子発現の迅速かつ簡単な検出 のため、並びに種々の条件下での時間にわたる遺伝子発現のくり返しの分析のた めに役立つ。それらは、蛍光顕微鏡又は蛍光活性化細胞ソーティングにより迅速 に同定することができる安定なマークされた細胞系の作製のためにも役立つ。 実施例８ 我々は、移入後の遺伝子発現の定量のためのフルオロプレートベースのとアッ セイを確立した。いくつかの実施形態において、本発明の変異GFP又はBFPをコー ドする核酸はベクター内に挿入され、細胞内に導入されて発現される。典型的に は、GFP変異体の発現は、感染後５時間又はそれ未満で迅速に検出することがで きる。発現は、マルチウェルプレート上での単一測定により、生きている細胞に おいて時間にわたって行われる。この方法において、多くの移入を平行に処理す ることができる。 実施例９ 本明細書に供されるベクター及び核酸は、所定の遺伝子産物をコードする核酸 配列が本発明の変異GFP及び又はBFPのＣ−又はＮ−末端に融合されているキメラ タンパク質を作り出すのに用いられる。上述の新し変異GFP及び／又は変異BFP配 列を組み込むいくつかの特有のウイルス・プラスミド及びハイブリッド遺伝子構 成物を作り出した。これらは、 ・SG11又はSG25を含むHIVウイルス配列(net遺伝子内)、 ・SG11又はSG25を含むネオマイシン及びヒグロマイシンプラスミド、 ・SG25も発現するモロニー白血病ウイルスベクター（レトロウイルス） ・HIVウイルスタンパク質(rev，td-rev，tat，nef，gag，env、及びvpr)及びS G11，SG25又はSB50のいずれかを発現するハイブリッド遺伝子構成物、 ・細胞質タンパク質ran，B23、ヌクレオリン、ポリ−Ａ−結合タンパク質及び SG11，SG25又はSB50のいずれかを組み込むベクターを含むハイブリッド遺伝子構 成物。 本明細書に供される変異核酸のこれらのハイブリッドを用いて生きている哺乳 動物細胞内のタンパク質経路を研究する。野生型GFPと同様に、変異GFPタンパク 質は、核小体を除いて通常、細胞全体に分布する。他のタンパク質への融合は、 ハイブリッド内のパートナーにより、その蛍光を再分布させる。例えば、全体の HIV-1 Revタンパク質との融合は、Rev機能を保持し、Revが優先的に見い出され る核小体内に局在化するハイブリッド分子を生ずる。HIV-1 Nefタンパク質のＮ 末端ドメインへの融合は、Nef局在化の部位である形質膜内で検出されるキメラ タンパク質を作り出す。 実施例10：pCMVgfo11 pCMVgfo11は、SG11のＣ末端に融合した細菌のネオマイシンホスホトランスフ ェラーゼ遺伝子（neo）（Southern and Berg．（1982）J．Mol．Appl．Genetics l：327）を含むpFRED11誘導体である。４アミノ酸（Gly-Ala-Gly-Ala）（配列番 号：26）リンカー領域は、SG11の最後のアミノ酸を、neoの第２のアミノ酸に、 接続し、これによりハイブリッドSG11-neoタンパク質(gfo11、配列番号：25)を 作り出す。Gfo11は、CMVプロモーターから発現され、完全なSG11ポリペプチド及 び最初のMetを除くneoの全てを含む。 pCMVgfo11をいくつかのステップで作製した。最初に、pFRED11DNaeを、pFRED1 1のNaeＩ消化及び4613bpフラグメントの自己連結により作製した。NaeＩ削除はp FRED11からSV40プロモーター及びneo遺伝子を除去し、これによりpFRED11DNaeを 作り出す。次に、neoコード化領域をSG11の下流に融合するために、プライマーB io51（5’-CGCGGATCCTTCGAACAAGATGGATTGCACGC-3’）（配列番号：27）及びBio5 2(5-CCGGAATTCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGA-3’)(配列番号：28)を用いて、pcDNA 3からneo遺伝子をPCR増幅した。プライマーBio51はBstBＩ認識配列の前のBsmHＩ 部位をneoの5’末端に導入し、プライマーBio52はEcoRＩ部位をneo遺伝子の3’ に導入する。そのPCR産物をBamHＩ及びEcoRＩで消化し、pFRED11DNaeのBamHＩ− EcoRＩ消化から生じた4582bpベクターにクローン化して、これによりpFRED11DNa eBstNeoを作り出した。次に、プライマーBio49(5’-GGCGCGCAAGAAATGGCTAGCAAAG GAGAAGAACTCTTCACTGGAG-3’)(配列番号：29)及びBio50(5’-CCCATCGATAGCACCAGC ACCGTTGTACAGTTCATCCATGCCATGT-3’)(配列番号：30)を用いてpFRED11DNaeからSG 11をPCR増幅してpFRED11DNaeBstNeo内のSgII終止コドンを除去し、ClaＩ部位の 前に４アミノ酸(Gly-Ala-Gly-Ala)リンカー を導入した。そのPCR産物をNheＩ及びClaＩで消化し、pFRED11DNaeBstNeoからの 4763bp NhelBstBiフラグメントにクローン化し、これによりpCMVgfo11を作り出 した。 pCMVgfo11の、293細胞(Grahamら、(1977)，J．Gen．Virol．５：59)並びに他 のヒト及びマウス細胞系への移入の後、蛍光顕微鏡下で明るい蛍光移入体が明ら かになり、G418に耐性のコロニーを２週間後に得ることができた。 pCMVgfo11は、作って検査したいくつかのSG11-neo又はneo-SG11融合体と比べ て、蛍光発光強度及びG418耐性コロニーの数に関して最も優れたタンパク質融合 体であった。 実施例11：pPGKgfo25 pPGKgfo25はgfo内にSG11のかわりにSG25を含むpCMVgfoII誘導体（配列番号：3 1）である。pPGKgfo25内のgfo25の発現はマウスホスグリセレートキナーゼ−１( PGK)プロモーターの制御下にある。 pPGKgfo25をいくつかのステップで作製した。最初に、 ｉ）オリゴヌクレオチド＃18990(配列番号：32)(5’-GACCGGGACACGTATCCAGCCT CCGC-3’)及び18991(配列番号：33)(5’-GGAGGCTGGATACGTGTCCCGGTCTGCA-3’） をアニーリングして5’端においてPstＩ及び3’においてSacIIのための二重の標 準化アダプターを作り、 ii）このアダプターを、pPGKneobpAのPstＩ-SacII二重消化からの3423bpフラ グメントに連結し、これによりpPGKPtAfScを作り出すことにより、pPGKneobpA(S orianoら（1991）Cell：64-393)内のPGKプロモーターの下流にSacII部位を導入 した。 次に、pRED25のCMVプロモーターを、pPGKPtAfScからの（Klenowで満たされた ）565bp SaII-SacII領域を、pFRED25からの(Klenow で満たされた)5288bp BgIII-SacIIフラグメントにクローン化することによりPGK プロモーターで置き換え、pFRED25PGKを作った。最初のステップにおいて、pPGK fo25は、PGKプロモーター及びSG25を含むpFRED25PGKからの813bp BgIII-Ndelフ ラグメントを、pCMVgfo11の4185bp BgIII-NdeＩフラグメントに連結することに より作製した。 実施例12：pGen-PGKgfo25RO(配列番号：34) pGen-PGKgfo25ROは、PGKプロモーターの制御下でgfo25ハイブリッドを含むpGe n−(Sorianoら(1991)，J．Virol．65：2314)誘導体である。それは、pPGKgfo25 の2810bp SaIIフラグメントをpGenのXhoＩ部位にサブクローニングすることによ り作製した。pGen-PGKgfo25RO(以下参照）から作ったウイルスにおいて、PGKプ ロモーター起源の転写はウイルスの長い末端反復(LTR)から開始するものと逆の 方向である。 エコトロピックスはプソイドタイプウイルスを作るために、pGen-PGKgfo25RO を、pHIT60及びpHIT123DNA（エコトロピックウイルスの生産）と、又はpHIT60及 びpHCMV-GDNA（プソイドタイプウイルスの生産）と一緒に、293細胞内に同時移 入した。pHIT60及びpHIT123はCMVプロモーターの制御下で各々モロニーネズミ白 血病ウイルス（Mo-MLV）からのgag-pol及びenvコード化領域を含む（soneokaら( 1995)，Nuc．Acid Res．23：628)。pHCMV-Gは、CMVプロモーターから発現された 水泡性口内炎ウイルス(VSV)からのＧタンパク質のコード化領域を含む（Yeeら、 (1944)，Proc．Nat1．Acad．Sci．USA 91：9564)。ウイルス含有上清を移入後48 時間に収集し、ろ過し、そして−80℃で保存した。 実施例13：pNLnSG11（配列番号：35） プラスミドpFRED11からのSG11配列を 、プライマー＃17982(配列 番号：36)(5’-GGGGCGTACGGAGCGCTCCGAATTCGGTACCGTTTAAACGGGCCCTCTCGAGTCCGTT GTACAGTTCATCCATG-3’)及び＃17983(配列番号：37)(5’-GGGGGAATTCGCGCGCGTACG TAAGCGCTAGCTGAGCAAGAAATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTC-3’）でPCR増幅した。そのPC R産物をBlpＩ及びXhoＩで消化し、pNL4-3（Adachiら(1986)，J．Virol．59：284 )からの大きなBlpＩ-XhoＩフラグメントにクローン化した。pNLnSG11において、 Ｃ末端において更に４つのリンカーにコードされたアミノ酸を含む全長のSG11ポ リペプチドを、HIVタンパク質Nefの24Ｎ末端アミノ酸と共にハイブリッドタンパ ク質として発現させる。 我々は、ヒト細胞の移入に基づき緑色蛍光を作り出す我々の変異体と共に、伝 染性のHIV-1保存物を作製した。これらの伝染性HIV-1保存物は種々の条件下での 感染の速度を検出するために用いられる。特に、それらは、薬剤の感染の速度へ の効果を研究するのに用いられる。蛍光のレベル、及びその蛍光の亜細胞区分化 は、容易に視覚化され、公知の方法を用いて定量される。このシステムは、容易 に視覚化でき、劇的に、現在遅く高価である多くの実験のコストを削減する。 感染性ウイルスを作るために、pNLnSG11を293細胞に移入した。 24時間後、Jurket細胞をその移入物に加えた。感染後の種々の時点で、培地を除 去し、ろ過し、そして新鮮なJurket又は他のHIV-1-許容性細胞に感染させるのに 用いた。２日後、その感染した細胞を蛍光顕微鏡下で緑色であった。目で見える シンシチウムも緑色であった。ウイルス保存物を作り、−80℃で保存した。 本明細書に供される核酸、ベクター、変異タンパク質を遺伝子操作の当業者の 知識及び本明細書に供される案内と組み合わせると、本明細書に供される本発明 の精神又は範囲から離れることなく多くの変換及び改良をそれに行うことができ ることが当業者に明らかで あろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ストーバー，ローランド エイチ. アメリカ合衆国，メリーランド 21702, フレデリック，ハモンド コート 1820 (72)発明者 ブーナキス，ジョン エヌ. アメリカ合衆国，ニューハンプシャー 03755，ハノーバー，キャリッジ レーン ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 工作されたアエクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）蛍光タンパ ク質をコードする単離された核酸であって、該単離された核酸によりコードされ るタンパク質が、 ａ）アミノ酸位置65においてロイシンを有するタンパク質であって、野生型ア エクオレア・ビクトリア緑色蛍光タンパク質の細胞の蛍光より少くとも５倍大き い細胞の蛍光を有するタンパク質と、 ｂ）アミノ酸位置65においてロイシンを、位置168においてトレオニンを有す るタンパク質であって、野生型アエクオレア・ビクトリア緑色蛍光タンパク質の 細胞の蛍光より少くとも５倍大きい細胞の蛍光を有するタンパク質と、 ｃ）アミノ酸位置65においてロイシンを、位置168においてトレオニンを、及 び位置66においてシステインを有するタンパク質であって、野生型アエクオレア ・ビクトリア緑色蛍光タンパク質の細胞の蛍光より少くとも５倍大きい細胞の蛍 光を有するタンパク質と、 ｄ）アミノ酸位置67においてヒスチジンを、位置65においてロイシンを有する 青色蛍光タンパク質であって、BFP(Tyr₆₇→His)の細胞の蛍光より少くとも５倍 大きい細胞の蛍光を有するタンパク質と、 ｅ）アミノ酸位置67においてヒスチジンを、アミノ酸位置164においてアラニ ンを有する青色蛍光タンパク質であって、BFP(Tyr₆₇→His)の細胞の蛍光より少 くとも５倍大きい細胞の蛍光を有するタンパク質と、 ｆ）アミノ酸位置67においてヒスチジンを、アミノ酸位置65においてロイシン を、アミノ酸位置164においてアラニンを有する青色蛍光タンパク質であって、B FP(Tyr₆₇→His)の細胞の蛍光より少く とも５倍大きい細胞の蛍光を有するタンパク質と、 からなる群から選択されることを特徴とする単離された核酸。 2. 野生型GFPの細胞の蛍光より少くとも５倍大きい細胞の蛍光を有する工作 されたアエクオレア・ビクトリア緑色蛍光タンパク質（“GFP”）をコードする 請求項１に記載の単離された核酸であって、該工作されたGFPがアミノ酸位置65 にロイシンを有することを特徴とする単離された核酸。 3. 前記核酸がアミノ酸位置168にトレオニンを更にコードすることを特徴と する請求項２に記載の単離された核酸。 4. 前記核酸がアミノ酸位置66にシステインを更にコードすることを特徴とす る請求項３に記載の単離された核酸。 5. アミノ酸位置67においてヒスチジンを、及び位置65においてロイシンを有 し、並びにBFP(Tyr₆₇→His)の細胞の蛍光より少くとも５倍大きい細胞の蛍光を 有する工作された青色蛍光タンパク質（“BFP”）をコードする請求項１に記載 の単離された核酸。 6. アミノ酸位置67においてヒスチジンを、及び位置164においてアラニンを 有し、並びにBFP(Tyr₆₇→His)の細胞の蛍光より少くとも５倍大きい細胞の蛍光 を有する工作された青色蛍光タンパク質（“BFP”）をコードする請求項１に記 載の単離された核酸。 7. 前記核酸が、アミノ酸位置65においてロイシンを更にコードすることを特 徴とする請求項６に記載の単離された核酸。 8. 請求項１に記載の核酸によりコードされるタンパク質を発現する形質転換 された細胞。 9. 請求項１に記載の核酸を含むベクター。 10．請求項９に記載のベクターを含む形質転換された細胞。 11．関心の第２の核酸によりコードされたタンパク質に融合された請求項１に 記載の核酸によりコードされるタンパク質を発現する 形質転換された細胞。 12．単離され、工作されたアエクオレア・ビクトリア緑色蛍光タンパク質（“ GFP”）であって、該工作されたGFPが、アミノ酸位置65においてロイシンを含み 、ここで該工作されたGFPが野生型GFPより少くとも５倍大きい細胞の蛍光を有す ることを特徴とするタンパク質。 13．請求項12に記載の単離され、工作されたアエクオレア・ビクトリア緑色蛍 光タンパク質（“GFP”）であって、該工作されたGFPが、アミノ酸位置168にお いてトレオニンを有することを特徴とするタンパク質。 14．請求項13に記載の単離され、工作されたアエクオレア・ビクトリア緑色蛍 光タンパク質（“GFP”）であって、該工作されたGFPが、アミノ酸位置66におい てシステインを有することを特徴とするタンパク質。 15．アミノ酸位置67においてヒスチジンを、及びアミノ酸位置65においてロイ シンを含み、並びにBFP(Tyr₆₇→His)の細胞の蛍光より少くとも５倍大きい細胞 の蛍光を有する単離された青色蛍光タンパク質（“BFP”）。 16．アミノ酸位置67においてヒスチジンを、及びアミノ酸位置164においてア ラニンを有し、並びにBFP(Tyr₆₇→His)の細胞の蛍光より少くとも５倍大きい細 胞の蛍光を有する単離された青色蛍光タンパク質(“BFP”)。 17．前記BFPが、アミノ酸位置65においてロイシンを更に有することを特徴と する請求項16に記載の単離された青色蛍光タンパク質(“BFP”)。 18．所定のタンパク質又は核酸をコードする所定の核酸を含む工作された細胞 を検出及び任意に単離する方法であって、 ａ）SG11，SG12，SG25，SB42，SB49，SB50からなる群から選択されるポリペプ チドをコードする第１の核酸、及び所定のタンパク質又は核酸をコードする第２ の核酸を含むベクターを、宿主細胞の集団内の宿主細胞に安定に導入するステッ プと、 ｂ）SG11，SG12，SG25，SB42，SB49、又はSB50を発現する宿主細胞の集団内で 細胞を検出するステップと、 ｃ）任意に、SG11，SG12，SG25，SB42，SB49、又はSB50を発現する細胞を、蛍 光活性化細胞ソーターで区分けして、前記蛍光タンパク質を発現する個々の細胞 を単離するステップと、 を含む方法。 19．SG11，SG12，SG25，SB42，SB49、及びSB50をコードする配列からなる群か ら選択されるコード化配列が、所定の遺伝子の調節配列に作用可能に結合されて いることを特徴とする核酸構成物。 20．所定のポリペプチドをコードする第１のコード化配列が、遺伝子工学を用 いて、SG11，SG12，SG25，SB42，SB49、及びSB50をコードする配列からなる群か ら選択される第２のコード化配列に融合されている核酸構成物であって、該融合 された配列の発現が、前記第１のコード化配列によりコードされるポリペプチド が前記第２のコード化配列によりコードされるポリペプチドに融合されている蛍 光ハイブリッドタンパク質を作り出すことを特徴とする核酸構成物。 21．亜細胞の発現及びタンパク質のターゲッティングを調節する調節及びコー ド化配列要素を検出及びキャラクタライズする方法であって、 ａ）工作された細胞内で、所定の培養条件及び構成物の存在及び欠如下で、SG 11，SG12，SG25，SB42，SB49、及びSB50をコードする核酸からなる群から選択さ れた第１の核酸が所定の遺伝子由来の第 ２の核酸に作用可能に結合されている核酸を発現するステップと、 ｂ）蛍光シグナルの存在及び亜細胞の局在化を検出するステップと、 を含む方法。