CN115029361A

CN115029361A - 一种原位监测胞内atp含量传感器的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN115029361A
Application number: CN202210544670.4A
Authority: CN
Inventors: 沈其荣; 刘东阳; 李托; 孙鸣泽; 王拓凯
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-05-19
Filing date: 2022-05-19
Publication date: 2022-09-09

Abstract

本发明公开了一种原位监测胞内ATP含量传感器的构建方法及其应用。一种能够原位监测贵州木霉NJAU 4742胞内ATP含量的传感器，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所涉及的ATP传感器，主要包括青色荧光蛋白片段(CFP)和黄色荧光蛋白片段(YFP)以及ATP识别基团；以质粒pcDNA为模板，扩增含有HygB、基因启动子、终止子和线性化表达载体片段；利用一步克隆法将ATP传感器片段与线性化表达载体连接，形成具有潮霉素抗性的ATP荧光示踪工作原件质粒。本发明中ATP传感器，将为提高丝状真菌胞内ATP含量的精准监测和调控提供充实的理论和应用基础。

Description

一种原位监测胞内ATP含量传感器的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于应用微生物技术领域，涉及一种适用于丝状真菌胞内ATP含量原位实时监测传感器的构建方法及其应用。

背景技术

过量施用化肥、农药等化学品使我国土壤微生物区系受到极大破坏，土壤养分生物转化能力越来越弱，作物产量对化肥供应养分的依赖性越来越强，经济作物的土传病害更严重，严重影响了我国农业的可持续发展。近年来，贵州木霉菌NJAU 4742(Trichodermaguizhouense NJAU 4742，以下简称NJAU 4742)因其具有显著的促进植物生长或防控土传病害的能力以及环境友好、安全无毒的特点，在农业生产上得到越来越广泛的应用。NJAU4742定殖于植物根部后能与植物形成共生体，显著促进根际养分的转化并通过分泌次级代谢产物和植物生长调节剂来促进植物的生长，有效地施用NJAU 4742菌株及其相关的生物有机肥产品，也是减少我国农用化学品投入的重要途径之一。

不可否认，作为土壤腐生真菌NJAU 4742的代谢水平、生理活性常会受到土壤复杂环境的影响，这其中包括土壤温度、酸碱度(pH)、含水率及渗透压等因素的变化。研究结果表明，热应激、盐胁迫、营养胁迫等不同的压力源会引发真菌细胞内5'-三磷酸腺苷(ATP)的大量损失，导致细胞内ATP代谢紊乱，进而影响细胞的正常功能。此外，ATP作为所有生物体普遍存在的能量货币，几乎与所有的生命活动有关。在胁迫条件下，丝状真菌的大多数生物学过程依赖ATP进行的，包括DNA修复、错误折叠蛋白的修复、胞内质子浓度的调控及细胞膜的组分改变等。因此，丝状真菌体内ATP水平的精准调控及监测对深入了解其生命活动及胁迫响应机制十分重要。然而，传统的ATP量化方法只能提供基于细胞提取物的一组细胞的平均ATP水平，很难准确理解ATP在细胞水平的调节过程。此外，ATP在不同细胞内区室之间的分布模式尚不清楚。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种丝状真菌ATP传感器的构建方法及其应用。

本发明可提供该ATP传感器片段。

本发明可提供该ATP传感器的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种适用于丝状真菌胞内ATP原位检测的ATP传感器功能性片段，包含青色荧光蛋白片段CFP和黄色荧光蛋白片段YFP以及ATP识别基团：F0F1-ATP合酶的ε亚基

作为本发明的一种优选，所述的ATP传感器功能性片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

作为本发明的一种优选，所述的功能性片段通过以下方法构建：以质粒pDR-GWAT1.03YEMK为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物进行PCR扩增所得。

一种ATP荧光示踪工作原件质粒，为含有所述的ATP传感器功能性片段的表达载体。

作为本发明的一种优选，以质粒pDR-GW AT1.03YEMK为模板，以SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示引物PCR扩增获得ATP传感器片段，以质粒pcDNA3.1/Hygro为模板，以SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示引物PCR扩增含有潮霉素基因HygB、基因表达启动子、终止子在内的线性表达载体；利用一步克隆法将所述的ATP传感器片段与所述的线性表达载体融合，形成具有潮霉素抗性的ATP荧光示踪工作原件质粒。

一种贵州木霉NJAU 4742的基因工程菌株，含有所述的ATP传感器功能性片段。贵州木霉NJAU 4742保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CGMCC No.12166。

作为本发明的一种优选，所述的基因工程菌株，利用所述的ATP荧光示踪工作原件质粒转化贵州木霉NJAU 4742菌株所得。

作为本发明的进一步优选，所述的转化方法为原生质体转化。

所述的ATP传感器或所述的ATP荧光示踪工作原件质粒在原位监测贵州木霉NJAU4742胞内ATP含量中的应用。

作为本发明的一种优选，将所述的ATP荧光示踪工作原件质粒转入贵州木霉NJAU4742，对菌丝内质网进行染色，通过激光共聚焦成像及荧光强度分析监测贵州木霉NJAU4742胞内ATP含量。

有益效果：

本发明开发了一种适应于丝状真菌NJAU 4742的ATP传感器，其基本组成为青色荧光蛋白mesCFP、黄色荧光蛋白YFP，两者通过ε-subunit(ATP识别亚基)连接。该传感器基于基因编码荧光共振能量转移(FRET)，黄色荧光与青色荧光的荧光强度的比值(527:475nm)可用于表征ATP浓度的变化，构建原理如图1所示。该传感器可以实时监测NJAU 4742不同细胞器中ATP含量及其动态变化特征。这项发明将为提高丝状真菌ATP的精准监测和调控提供充实的理论和应用基础。

附图说明：

图1ATP传感器的结构和示意图

图2ATP传感器荧光菌株的琼脂糖凝胶电泳验证

图3菌株wt-ATP和Δparp-ATP的内质网组分ATP含量检测

图4内质网染色后wt-ATP和Δparp-ATP菌株的菌丝的共聚焦成像

图5菌株wt-ATP和Δparp-ATP的内质网上ATP含量分析

图6菌株wt-ATP和Δparp-ATP更多菌丝内质网的ATP含量统计分析

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1菌株活化与制备

1、菌株的观察：贵州木霉NJAU 4742(Trichoderma guizhouense NJAU 4742)，具有以下特征：丝状真菌，菌丝有隔丛枝状，分生孢子梗光滑，绿色，顶端膨大呈球形，上面有生小梗产生孢子，分生孢子光滑球形，绿色。

2、菌株的培养：将NJAU 4742接种到固体培养基PDA玻璃培养皿中，培养条件为：28℃、7天，将培养皿上的绿色孢子用5mL的无菌水洗刮下来，用无菌纱布过滤到灭完菌的玻璃瓶中制备成了孢子悬液备用。

实施例2NJAU 4742中ATP传感器的构建

1、菌体培养：将NJAU 4742孢子液接种到固体培养基PDA玻璃培养皿中，培养条件为：28℃、7天，将培养皿上的绿色孢子用5mL的无菌0.9％NaCl洗刮下来，用无菌纱布过滤到灭完菌的离心管中待用。

2、ATP传感器的构建：以质粒pDR-GW AT1.03YEMK(Addgene plasmid#28003)为模板，PCR扩增获得ATP传感器片段，该片段主要包括青色荧光蛋白片段(CFP)和黄色荧光蛋白片段(YFP)以及ATP识别基团(来自枯草芽孢杆菌F0F1-ATP合酶的ε亚基)；以质粒pcDNA3.1/Hygro为模板，利用引物P-F/P-R扩增含有HygB、基因启动子、终止子在内的线性化表达载体；利用ClonExpress-II一步克隆试剂盒(Vazyme Biotech，南京，中国)将ATP传感器片段与线性化表达载体连接，获得含有潮霉素抗性的ATP荧光示踪工作原件质粒。采用热激转化法将其转入大肠杆菌DH5α并挑选阳性转化子，将转化子液体摇瓶培养后利用质粒提取试剂盒大量提取质粒，并置于4℃冰箱保存备用，具体步骤如下：

单片段克隆PCR体系设置如下：

其中克隆ATP传感器片段的引物为ATP-F和ATP-R,克隆线性化表达载体的引物为P-F和P-R,序列信息如表1所示。

反应条件：

用DNA切胶回收试剂盒(OMEGA)回收PCR产物，保证DNA片段浓度大于200ng/μL。将ATP传感器片段与线性化表达载体片段通过一步克隆方法连接。

一步克隆及大肠杆菌DH5α转化具体程序如下：

一步克隆PCR反应体系为：

使用移液器轻轻吸打混合体系，短暂离心将反应液收集至管底；37℃反应30min后立即置于冰上冷却；冰上解冻克隆DH5α感受态细胞，并取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min；42℃水浴热激45s后立即置于冰上冷却2-3min；加入900μL LB培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。将添加氨苄的LB固体培养基平板在37℃培养箱中预热，5000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12-16h。挑取单克隆于5mL液体LB培养基中，以37℃，170rpm的条件过夜培养。最后提取质粒并进行PCR鉴定，同时利用引物(P-F/P-R)将PCR产物测序，引物序列参见表1。

3、NJAU 4742原生质体制备：

按要求配制200mL溶液A(含1.2M山梨醇和0.1M KH₂PO₄，pH 5.6)、100mL溶液B(含1M山梨醇、50mM CaCl₂和10mM Tris-HCl，pH 7.5)和100mL PEG溶液(含25％PEG6000、50mMCaCl₂和10mM Tris-HCl，pH 7.5)。NJAU 4742原生质体制作分如下5步完成：

1)将50μL NJAU 4742新鲜孢子悬液均匀涂布于覆盖有玻璃纸Cellophane的PDA培养基上，每个菌株准备5份，于28℃黑暗培养约16h；

2)将带有刚萌发菌丝的玻璃纸小心撕下，浸泡于含4mL无菌的细胞壁酶裂解液(由20mL溶液A和0.15g贵州木霉细胞壁裂解酶配制)的90mm平皿中，继续加入3-4张玻璃纸，每隔一张玻璃纸加4mL酶裂解液，将平皿置于28℃、100rpm条件下孵育约2h(可在孵育1h后用镊子将团聚在一起的菌丝小心拨开)；

3)取出平皿，弃去玻璃纸，用移液枪反复吸打细胞酶解液以助菌丝分开；

4)吸取细胞酶解液，用带有玻璃丝的无菌滤头滤去菌丝，可用少量溶液A冲洗菌丝，收集约30mL滤液于50mL无菌离心管中(冰上操作)；

5)在4℃、2000rpm条件下离心10min，弃去上清液，用0.5-1mL溶液B复溶细胞沉淀，即获得木霉原生质体，置于冰上待用。

4、ATP传感器载体转化

ATP传感器载体转化主要分为以下五个步骤进行：

1)吸取NJAU 4742原生质体悬液200μL于2mL离心管中，离心管置于冰上；向其中加入20μL ATP传感器表达质粒，50μL PEG溶液，小心混匀至PEG完全溶解，冰上静置20min；

2)室温下加入2mL PEG溶液，轻轻混匀，静置5min后加入3mL溶液B，轻轻混匀，室温下静置待用；

3)吸取200-500μL上述混合液至含1M蔗糖的PDA平皿(90mm)中，涂布均匀，于28℃黑暗培养12-16h；

4)次日，在该PDA(含1M蔗糖)培养基上小心倒入一层厚度约2-3mm的含200μg/mL潮霉素B的PDA(不含1M蔗糖)培养基，在28℃黑暗条件下继续培养24-48h，直至含潮霉素B的PDA平皿上长出小的木霉突变子菌落。

5、ATP传感器表达菌株筛选验证

1)用无菌枪头挑取各个转化子菌丝若干，分别置于含20μL Dilution Buffer(Phire Plant Direct PCR Master Mix试剂盒，Thermo Scientific)的PCR管中，用枪头稍微压打菌丝，破壁释放gDNA；

2)在ATP传感器上下游分别设置引物ATP-F和ATP-R；

3)PCR跑胶验证；PCR体系设置如下：

PCR反应设置如下：

所用引物见表1：筛选ATP传感器转化子用引物ATP-F/ATP-R进行验证，目的片段长度为1836bp；将菌落PCR验证为阳性的转化子置于28℃光照条件下继续培养，直至产孢；收集各阳性转化子孢子，稀释涂布于含200μg/mL潮霉素B的PDA平皿(90mm)中培养16-24h，孢子萌发后进行单胞分离，纯化菌株至新的PDA平皿(60mm)中培养，每个转化子分离5-6个单株；采用菌落PCR法进一步验证ATP传感器片段的表达，菌落PCR如上所述，所用引物为ATP-F/ATP-R。验证结果如图2所示，以木霉NJAU 4742野生型菌株(wt)作为对照，菌株wt-ATP正确导入了ATP传感器片段(E-ATP泳道)。将通过验证的纯化的阳性突变子备份保存至-80℃。

表1 ATP传感器表达及验证所用引物

实施例3 NJAU 4742中parp缺失菌株(Δparp)的ATP传感器载体的构建

在我们以前的验证中，我们发现在热胁迫下NJAU 4742中parp缺失菌株(Δparp)菌丝体的内质网ATP含量显著高于NJAU 4742野生型(wt)。因此，为了证明ATP传感器对于ATP水平监测的准确性，在此实施例中，我们构建了parp缺失菌株Δparp，并在Δparp的基础上进行了ATP传感器的转化，具体步骤如下：

1、菌体培养的方法如实施例2所述；

2、parp基因敲除：基于同源重组原理，构建基因parp敲除片段，parp基因的ORF序列如SEQ ID NO.16所示，从NJAU 4742基因组PCR克隆parp基因上游片段、下游片段；以质粒pcDNA3.1/Hygro为模板，利用引物HygB-F/HygB-R扩增潮霉素B抗性表达片段(约2300bp)；将3个片段通过融合PCR技术进行片段融合，所有引物如表1所示，具体步骤如下：

上、下游同源臂克隆PCR体系设置如下：

反应条件：

HygB抗性表达片段PCR体系设置如下：

PCR反应条件设置如下：

将上述三个片段用融合PCR技术分两步融合，具体如下：

第一步：

第一步PCR反应条件设置如下：

第二步：

第二步PCR反应条件设置如下：

将PCR产物进行凝胶电泳验证，将正确的融合片段进行切胶回收用于后续实验。

3、NJAU 4742野生型原生质体制作方法如实施例2所述；

4、parp缺失片段原生质体转化方法如实施例2所述；转化完成后2-3天，直到含潮霉素B的PDA平板上长出木霉菌落，挑取转化子菌落并在含有潮霉素(200μg·mL^-1)的PDA上继续培养2天左右，木霉突变子验证方法如实施例2所述；利用引物E-parp/E-HygB及parp-F/parp-R筛选并验证NJAU 4742的基因parp的敲除突变株；所有引物如表1所示验证结果，如图2所示，以木霉NJAU 4742野生型菌株(wt)作为对照，突变株Δparp同源缺失了parp基因(E-parp泳道和parp泳道)；纯化的阳性突变子备份保存至-80℃；

5、突变株Δparp培养的方法如实施例2野生型NJAU 4742所述；

6、突变株Δparp原生质体制作方法与NJAU 4742野生型类似，如实施例2所述；

7、突变株Δparp中ATP传感器原件的筛选验证如实施例2所述。验证结果如图2所示，以木霉NJAU 4742野生型菌株(wt)作为对照，突变株Δparp-ATP中正确导入了ATP传感器片段(E-ATP泳道)。

实施例4贵州木霉NJAU 4742中ATP传感器的原位验证

在此实施例中，我们将对野生型ATP传感器菌株(wt-ATP)和parp缺失型ATP传感器菌株(Δparp-ATP)分别进行培养与ATP水平的鉴定，以验证ATP传感器在丝状真菌细胞内的有效表达和感应。

菌株wt-ATP和Δparp-ATP菌丝的制备：将储存在-80℃冰箱中的wt-ATP和Δparp-ATP菌株的孢子液吸取2.5μL接种于PDA固体平板，28℃光照培养3天后，在萌发的菌落边缘用打孔器获取同样大小的菌块备用。

稻草粉固体平板培养基的制备：按照以下要求配制，无机盐培养基(1.4g(NH₄)₂SO₄,2.0g KH₂PO₄,0.3CaCl₂,0.3g MgSO₄,5mg FeSO₄·7H₂O,20mg CoCl₂,1.6mg MnSO₄和1.4mg ZnSO₄，定容至1L)；将1.5％秸秆粉末、1.5％的琼脂粉加入无机盐培养基中充分混匀，灭菌，即为稻草粉固体平板培养基。

NJAU 4742菌株内质网ATP含量的测定：将wt-ATP和Δparp-ATP的菌块接种于稻草粉固体培养基上，注意提前在固体培养基表明覆盖一层灭菌的玻璃纸(Cellophane)，37℃培养72h后，收集真菌菌丝体，通过内质网分离试剂盒(ER0100，Sigma)分离富集的内质网组分，使用ATP测定试剂盒(Beyotime，China)测定其ATP含量。具体操作如下：收集新鲜NJAU4742菌丝体组织，称重，磨成匀浆。通过内质网分离试剂盒差速离心获得菌株内质网组分，加入PBS缓冲液溶解，保留待测。在白色96孔板中将内质网组分与ATP检测工作稀释液混合。使用

i3x酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)测量上清液的吸光度(RLU)。根据试剂盒的说明制作ATP含量计算的标准曲线。总ATP水平以nmol·g^-1菌丝体表示。如图3所示，37℃条件下，菌株Δparp-ATP菌丝内质网ATP含量显著高于菌株wt-ATP。

NJAU4742菌株ATP传感器的激光共聚焦成像及荧光强度分析：将突变株wt-ATP和Δparp-ATP的菌块在37℃下稻草培养基上培养三天，收集菌丝体。为了验证ATP传感器对细胞器ATP水平检测的有效性，我们选择了真菌内质网进行细胞器ATP检测验证。由于需要观察菌丝内质网，因此在激光共聚焦成像之前先对菌丝内质网进行染色。具体操作如下：将特异性的内质网染料ER-Tracker^TM Red(ThermoFisher，目录号M7512，Ex/Em＝587nm/615nm)浓度调整为100nM，并将突变株wt-ATP和Δparp-ATP的新鲜菌丝与ER-Tracker^TM Red室温下避光孵育5min；用PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤真菌菌丝三次；对于ATP传感器的激光共聚焦成像，使用60倍水浸物镜在激光共聚焦荧光显微镜(TCS SP8，Leica，Germany)上拍摄记录。ATP传感器FRET的激发波长为435nm，发射波长分别为475nm和527nm。数据以527nm和475nm信号强度的比率(527nm/475nm)给出。通过ImageJ软件中的Plot profile功能进行荧光强度和共定位分析。当内质网染色的荧光强度值有效(大于0)时，计算内质网中ATP传感器的所有荧光强度值。数据至少作为三个独立的生物复制完成。统计数据表示为所有有效像素的平均值±标准误差(SE)。如图4所示，用内质网染料对菌丝进行染色后，在wt-ATP和Δparp-ATP可以观察到三种荧光，红色荧光显示了内质网的染色情况，黄色荧光和青色荧光分别来自于ATP传感器，这说明ATP传感器在NJAU 4742中成功表达。

此外，我们使用ImageJ软件对菌株菌丝的内质网像素区域中YFP/CFP的发射比进行了分析。图5显示了wt-ATP和Δparp-ATP菌株的菌丝三种荧光的荧光强度水平。在内质网染色有效区域内，我们计算了YFP/CFP的比值。结果表明：与wt-ATP的YFP/CFP发射比(0.95)相比，Δparp-ATP的内质网检测到更高的荧光发射比(1.85)。与此同时，我们统计了来自wt-ATP和Δparp-ATP更多菌丝体内质网区域YFP与CFP的荧光比值。结果表明，相对于wt-ATP，Δparp-ATP菌丝内质网区域YFP/CFP的比值大约增加了两倍，这与ATP检测试剂盒检测结果一致(图6)。这些结果充分表明ATP传感器在丝状真菌体内成功表达，并可以对丝状真菌细胞器的ATP水平进行有效示踪及定量。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种原位监测胞内ATP含量传感器的构建方法及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1833

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacag gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgacctg gggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg taccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacat cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg cccactttaa aattcgacat aatattgaag acggcggcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccaa gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccatcgat atgaaaactg tgaaagtgaa tataacaacc 720

cctgatgggc cagtctacga cgctgatatc gagatggtgt ccgtgcgggc cgagagtggt 780

gatctcggca tcctccccgg tcacattccc acaaaggccc cactgaagat cggagctgtg 840

cggctgaaga aggacggcca aaccgagtac gtcgcagtct caggcggcac tgttgaagtg 900

cggcctgacc acgttaccat taatgctcaa gccgctgaaa cagccgaagg aatcgacaaa 960

gagagagcag aagccgcaag acagagggcc caggagcggc tgaactctca atccgatgac 1020

accgatattc gccgggccga gctggcactg cagagggccc tgaacagact ggacgtggct 1080

gaaatgaagg aattcatgga cggcggcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 1140

cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta ccagtccaag 1200

ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 1260

gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggtg gcagcggtgg catggtctct 1320

aaaggtgaag aactctttac gggcgtcgtc ccgattctcg tggaactcga tggagatgtt 1380

aatggacata agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 1440

accctgaagc tgatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 1500

accctgggct acggcctgca gtgcttcgcc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 1560

ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 1620

gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 1680

atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 1740

tacaactaca acagccacaa cgtctatatc accgccgaca agcagaagaa cggcatcaag 1800

gccaacttca agatccgcca caacatcgag taa 1833

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatggtgagc aagggcgagg a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgccagtcc cttgtatgtg c 21

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcctcgccct tgctcaccat agagagctac cttacatcaa tatggc 46

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcacatacaa gggactggcg aggtactatg gcttagatgg aataccc 47

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagagctacc ttacatcaat atggc 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtactatgg cttagatgga ataccc 26

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaattacgaa acagttggag ggtgt 25

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctggcaaaa cggtatcatc aac 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acctatagct cttcatctct cccct 25

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccatattga tgtaaggtag ctctcgagca gtagaggtga atgctgtg 48

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gggtattcca tctaagccat agtacgcggc tactgtgtaa aaatagct 48

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aatgatcggt accactgctc gca 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgcctcgaa gaaaggctgc 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atctgaacac gcaagagata gcg 23

<210> 16

<211> 2238

<212> DNA

<213> 贵州木霉菌NJAU 4742(Trichoderma guizhouense NJAU 4742)

<400> 16

atgcctcgaa gaaaggctgc ccctgcggct cctgctgctc ctgcagtgcc gccgctggac 60

ggatgcgtca ttgccatcag cggcaagttt gacaactcca agcataccca agcctctctc 120

gagcagctca tcaaatccct gggcgggagc gtcaccaaga ccgtcgccaa aagcacaacc 180

cacgttgtct gcagtgaaga tgactacaac aacaacacgg caaaggtcgc tgccggcaag 240

gccaaagact tgcctgtggt cagcccagcc tggatcttcg aggccgagaa ggagaataag 300

acaatcgacc cacagaccca tgtctggggc agcgacaagt ctgccggccc acaaaccaat 360

ggcaaaaaga gacccatcat ggtgtccaag agcgacgatg acgaagagcc cgagaccaaa 420

aaggccaaaa ccacaaaggc cgcaaaagga gcaaagggca aggctaaagc tgccgaccct 480

gagcccgagt ccgaagagaa agaagcaagc caggtggcag agggccaatt cattaaaaag 540

aaggacttca caatcccggt agacgagcac tgcccgttgg tccacaccgt ggtatacatt 600

gaccctgatt ctggcctgat atacgatgct tccctcaacc agacgaatgc atccaacaat 660

aacaacaagt tttaccgcgt ccaggtgagt ttgagtccag ttcgtgtctt ctgaccacat 720

actgatccgc gtctgcccag gttgtatttg atgccaaagc aaatcaatac aagacatgga 780

ctcggtgggg ccgtgtcgga gaaaccggtc aaagtgccat tctcggcaac ggcacatcag 840

cggatgcaat caagaacttt gaaaagaagt ttaaagacaa gtctggtttg tcttgggaca 900

acaggggtga taatccaaag ccaggaaagt atgcctttgt tgagcgaagt tacaatccag 960

acgacgagga cgaggacgat gccgacaagg ccgacgacaa ggccggtgtg aaaaaagaag 1020

acgatgaaga ggtcaagatt gcggattgca ctcttgagcc ccaagtcaag tcacttatgg 1080

agctcatctt caaccagcag tatttccagg ccactatgac tgccctgaat tacgatgcga 1140

acaagctccc tcttgggaag ctgagcaaga cgaccatcac tcgtggtttt caacagctca 1200

aagatctcgc ggccttgatg gacgatgcct ctctcgcggc cagcaagtgg aacactaccg 1260

ttgctaatgc cacggaaatg ctttccaaca tgtattactc catcattcct cacgcatttg 1320

gccgcaaccg tcctcctatt atccgagaca atgtcctgct caagaaggag attgagctgt 1380

tggaaagctt gtcagacatg aaggatgctg cagacattat gaagattgac cgcaaatcaa 1440

cagacacagt ccatcccctc gataagcagt tccagagctt gggtctcaac gaaatgaccg 1500

tactagacaa ggagagcact gaattccagt atctagaaga ctaccttcac ggctccaagg 1560

gagagagcca cggtcatacc tacaaggtcc aggacatttt ccgaatcgaa agacaaggag 1620

aaaacatccg cttcgacgac tatgtcgaga agagcaagat tggcgccaac cgccgtcttc 1680

tctggcacgg ctcgcgcgct acaaatttcg gtggtatcct tagtcagggt ctgcgaattg 1740

cgccgccgga agcacccgtc tctggttaca tgtttggcaa aggtatctac ctggctgata 1800

tgtcatccaa gtcggccaac tactgttgct cgtacatctc cggaggtcaa gcgcttctgc 1860

ttctctgcga agccaagctg ggtgacccca tgcagcaatt gaccaatgca agctacaacg 1920

ccgacacttc tgcaaagtcg caaggcatgg agagtacctg gggtatgggt atgacagcgc 1980

cgccaaagtg gaaggacgct ggagaggtgc atgagagcct gaagggcatt caaattgtga 2040

gtcgattctt ccctaatttg gtctatgctc catgcatctt aaagtatgag catcagttgc 2100

taacatgagt aatagcccga cgtttcccac aagccatgtg ccaccaacgt agacggcgcg 2160

tatctcatgt acaacgagta catctgctac gatgtctcgc aggtaaagct acgctatctc 2220

ttgcgtgttc agatgtag 2238

Claims

1.一种适用于丝状真菌胞内ATP原位检测的ATP传感器功能性片段，其特征在于包含青色荧光蛋白片段CFP和黄色荧光蛋白片段YFP以及ATP识别基团：F0F1-ATP合酶的ε亚基。

2.根据权利要求1所述的权利要求1所述的ATP传感器功能性片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的功能性片段，其特征在于通过以下方法构建：以质粒pDR-GWAT1.03YEMK为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物进行PCR扩增所得。

4.一种ATP荧光示踪工作原件质粒，其特征在于为含有权利要求1所述的ATP传感器功能性片段的表达载体。

5.根据权利要求4所述的ATP荧光示踪工作原件质粒，其特征在于以质粒pDR-GWAT1.03YEMK为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物PCR扩增获得ATP传感器片段，以质粒pcDNA3.1/Hygro为模板，以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示引物PCR扩增含有潮霉素基因HygB、基因表达启动子、终止子在内的线性表达载体；利用一步克隆法将所述的ATP传感器片段与所述的线性表达载体融合，形成具有潮霉素抗性的ATP荧光示踪工作原件质粒。

6.一种贵州木霉NJAU 4742的基因工程菌株，其特征在于含有权利要求1所述的ATP传感器功能性片段。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌株，其特征在于利用权利要求4或5所述的ATP荧光示踪工作原件质粒转化贵州木霉NJAU 4742菌株所得。

8.根据权利要求7所述的哈茨木霉NJAU 4742的基因工程菌株，其特征在于所述的转化方法为原生质体转化。

9.权利要求1所述的ATP传感器或权利要求4或5所述的ATP荧光示踪工作原件质粒在原位监测贵州木霉NJAU 4742胞内ATP含量中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于将权利要求4或5所述的ATP荧光示踪工作原件质粒转入贵州木霉NJAU 4742，对菌丝内质网进行染色，通过激光共聚焦成像及荧光强度分析监测贵州木霉NJAU 4742胞内ATP含量。