CN105247069A - 用于fret的新化合物及与其相关的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于分子内荧光共振能量转移(FRET)的化合物及与其相关的方法、试剂盒和组合物，所述化合物包含基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式和可在445至540nm的波长激发且最大发射大于560nm的第二荧光团。

Description

用于FRET的新化合物及与其相关的方法
技术领域
本发明涉及用于分子内荧光共振能量转移(FRET)的化合物及与其相关的方法、试剂盒和组合物，所述化合物包含基于碳代NADH(carbaNADH)的第一荧光团的氧化形式和可在约445至约540nm的波长激发且最大发射大于约560nm的第二荧光团。
背景技术
许多生物分析方法基于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的氧化状态。NAD具有多个环形结构，其经历了烟酰胺环内的氧化还原反应。密切相关的NADP分子是在腺苷核糖环的2'位上磷酸化的。
NAD和NADP可通过正式加入氢负离子可逆地还原，并且这两种分子在可逆反应中作为辅酶起作用。因此，基于NAD和NADH的酶反应适于进行荧光分析。
许多氧化还原酶可使用这些辅因子在分子之间转移氢基团。因为这些分子的还原形式在其吸收光的能力上不同于它们的氧化形式，所以基于在340nm的光吸收或通过在445nm光的荧光发射已经定量反应。
酶的脱氢酶反应可采用如下特性：NAD和NADP的还原形式吸收波长为340nm的光，而氧化形式则不能。类似地，当在340nm激发时，还原形式能够在445nm发射荧光，而氧化形式则不能。这些特性使得定量直接涉及这些辅因子的氧化状态变化的反应成为可能。例如，当在三磷酸腺苷(ATP)存在下，将磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶用于催化由NADH形成NAD时，三磷酸腺苷的浓度可以荧光强度降低进行测量(美国专利4,446,231和4,735,897)。
氧化还原酶在血糖水平的定量测量中也相当普及，参见例如EP0293732A2、US2005/0214891A1和US2006/0003397。所有这些公开均描述了用于测量葡萄糖的类似的测试方案，其中使用含有酶-辅酶对葡萄糖脱氢酶(GlucDH)/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的试剂系统。GlucDH起作用后，氢负离子从葡萄糖转移至NAD，从而形成NADH。所得NADH的量与葡萄糖的浓度直接相关。NADH为强荧光团，其浓度可以通过测量荧光强度来测定。样品中的分析物浓度通常是通过使测量的荧光强度与用已知分析物浓度得到的校正曲线相关联来确定。
显然，基于酶的测量系统用于生化分析是临床相关分析方法的重要组成部分。这主要是涉及分析物(例如代谢物或底物)的测量，其直接或间接借助酶进行测定。借助酶-辅酶复合物将分析物转化并随后进行定量。在该过程中，待测定的分析物与合适的酶和辅酶接触，其中酶通常以催化量使用。辅酶是变化的，例如通过酶反应进行氧化或还原。该过程可例如光度测定进行检测。校正提供测量值与待测定的分析物浓度之间的直接关联。
辅酶是与酶共价或非共价结合且通过转化分析物而变化的有机分子。辅酶的突出实例是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，由此通过还原分别形成NADH和NADPH。
现有技术已知的许多基于氧化还原酶的测量系统具有有限的保质期且需要谨慎处理，诸如冷却或干燥贮存，以达到足够的贮存寿命。因此，可发生不正确、未察觉的贮存不良引起的结果。特别是由基本包装开口和长时间使用周期引起的干燥剂的耗竭可导致测量误差。
上述基于酶的测量系统的基本组成部分，即酶和辅酶，均可独立地有助于这种有限的稳定性。例如，已知辅酶诸如NAD和NADP相当不稳定。
NAD和NADP是文献中描述的降解途径的碱不稳定性分子(参见例如N.J.OppenheimerinThePyridineNucleotideCoenzymesAcademicPress,NewYork,London1982,J.Everese,B.Anderson,K.Yon,Editors,chapter3,pages56-65)。ADP-核糖基本上是在通过裂解核糖和吡啶单元之间的糖基键而降解NAD或NADP过程中形成的。NADH和NADPH的还原形式是酸不稳定的；例如差向异构化是已知的降解途径。
NAD/NADP和NADH/NADPH的不稳定性是由于核糖和吡啶单元之间的糖基键的不稳定性。但是，即使在不激烈的条件下诸如在水溶液中，辅酶NAD和NADP可能仅仅由于环境湿度就已经被水解。
碳代NAD类似于NAD，其中核糖被碳环糖单元替代。碳代NAD(或碳-NAD)具有下列结构(I)：
然而，即使当使用更稳定的辅酶碳代NAD时，仍有一系列相当根本的问题与荧光强度的测量有关，其包括以下：
基于荧光强度测量的测量误差的一个重要来源来自非特异性光，其到达来自环境的探测器且可引起非特异性信号。
所测量的荧光的强度不仅仅是荧光团的量的函数。相反，它也明显受其样品中分子环境的影响。具体而言，在术语荧光猝灭下概述的方法导致测量误差。
分子的位置和定位可在吸收与发射之间变化，因为在统计学方法中呈纳秒量级的时间在分子的激发和光量子的发射之间经过。由此导致的干扰影响涉及荧光强度，具体为温度依赖性。
荧光一般由紫外线激发。电子激发态的光化学反应可引起荧光团的漂白。这是另一个误差源。
在此基础上，本发明的一个目的是提出一种方法，其允许具体涉及所述稳定性问题、测量误差和干扰的改进的测量。
发明内容
本发明涉及一种化合物，其包含
(1)基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式，和
(2)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二荧光团，
具体地其中基于碳代NADH的第一荧光团和第二荧光团共价连接。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于测定样品中分析物浓度或量的基于荧光的方法。
具体实施方式
本发明涉及一种化合物，其包含
(1)基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式，和
(2)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二荧光团，
具体地其中基于碳代NADH的第一荧光团和第二荧光团共价连接。
本发明化合物具体用于分子内荧光共振能量转移(FRET)方法，例如，如本说明书中详述的方法。
在优选的实施方案中，第二荧光团的最大发射为560至750nm。
在另一个优选实施方案中，第二荧光团可用波长为445至475nm的光激发。
基于碳代NADH的第一荧光团优选可用波长为300至400nm，优选360至380nm，更优选365至385nm，最优选370至380nm的光激发。
碳代NADH最大可用波长为360nm的光激发。
碳代NADH的最大发射为465nm。
使用这种用于FRET的化合物克服了基于荧光的方法中NAD衍生的化合物的上述缺陷。如实施例中所述，化合物N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH被证明可用于FRET方法。“Cy3”定义如图2所示的一类化合物并且也被称为2-[3-[1-(己-5-酰基)-1,3-二氢-3,3-二甲基-5-硫代-2H-吲哚-2-亚基]-1-丙烯-1-基]-3,3-二甲基-5-硫代-1-(3-磺基苯基)-3H-吲哚鎓实体，其中己酰基的羰基与氨基己基的氨基连接)。
术语“基于碳代NADH的第一荧光团”仅用于指基于在400至570nm发荧光的碳代NAD/碳代NADH氧化还原系统的化合物的还原形式。酶底物通常是呈其氧化形式(碳代NAD)(也称为基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式)的本发明化合物或荧光辅酶。
本发明化合物包含碳代NAD部分，并且由此分别包含烟酰胺实体和腺苷实体。烟酰胺实体可被还原成1,4-二氢烟酰胺实体，其作为荧光团起作用。烟酰胺实体通常是未取代的。腺苷实体的其余原子可为经取代的。对本领域技术人员显而易见的是，这种取代必须与感兴趣的酶反应相容。这种取代列于Thepyridinenucleotidecoenzymes.NewYork,N.Y:AcademicPressInc.；1982.Chapter4:B.M.AndersonAnalogsofPyridineNucleotideCoenzmespp.91–134中。优选的取代基为腺苷酸实体中2’OH上的磷酸酯基团，形成碳代NADP部分。取代基优选在腺苷酸核碱基上(Thepyridinenucleotidecoenzymes.NewYork,N.Y:AcademicPressInc.；1982.Chapter4:B.M.AndersonAnalogsofPyridineNucleotideCoenzmespp.103-104tableIItemIIA)。取代的最优选位置为腺苷酸核碱基的N6和C8。N6和C8处的合适取代基独立地为C1至C12烷基、烯基或炔基(alkinyl)，其任选地被一个或多个O、N和/或S原子中断，并且其中所述C1至C12烷基、烯基或炔基任选地取代有＝O、-OH、-SH、＝S或C1至C4烷基，所述烷基任选地被一个或多个O、N或S原子取代或中断，并且其中N6或C8中的一个优选经长度为25个原子或更少的连接基分子与第二荧光团连接。将基于碳代NAD的部分理解为碳代NAD部分，其如上文所定义任选取代。
碳代NADH的氧化形式，即碳代NAD，具有上述式(I)的结构。
在一个优选的实施方案中，基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式为具有式II的基于碳代NADH的第一荧光团
其中
Q为NR1R2，其中R1和R2独立地选自H、C1至C12烷基、C1至C12烯基和C1至C12炔基，任选地其中烷基、烯基和炔基的一个或多个碳原子用O、N或S代替，和/或
任选地其中所述C1至C12烷基、烯基和炔基取代有＝O、-OH、-SH、＝S或C1至C4烷基，其中烷基的一个或多个碳原子任选地用O、N或S代替，且
J选自H、C1至C12烷基、C1至C12烯基和C1至C12炔基，任选地其中烷基、烯基和炔基的一个或多个碳原子用O、N或S代替和/或任选地其中所述C1至C12烷基、烯基和炔基取代有＝O、-OH、-SH、＝S或C1至C4烷基，其中烷基的一个或多个碳原子任选地用O、N或S代替，具体地其中J和Q中的一个经由长度为25个原子或更少的连接基分子与第二荧光团连接，且
T为氢原子或磷酸酯基团，尤其其中Q取代有N-(6-“cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基。
在另一个优选的实施方案中，基于碳代NADH的第一荧光团和第二荧光团共价连接，例如对于N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH。
在另一个优选的实施方案中，第一与第二荧光团之间的距离为1.5至5nm。
在另一个优选的实施方案中，所述化合物由以下部分组成
(i)基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式，和
(ii)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二荧光团，和
(iii)长度为25个原子或更少的连接基分子。
在N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH的情况下，连接基结构为-CH2-C(＝O)NH-(CH2)6-NH-C(＝O)(CH2)5-。该连接基长度为16个原子。
“长度为X个原子的连接基分子”理解为在连接两个其它部分(i)和(ii)的直链中具有X个原子的连接基。
优选地的连接基为亚烷基、亚烯基或亚炔基实体，其任选被一个或多个O、N和/或S原子中断，并且其中所述亚烷基、亚烯基或亚炔基任选地取代有＝O、-OH、-SH、＝S或C1至C4烷基，所述烷基任选地被一个或多个O、N或S原子取代或中断。具体地，连接基可包含-O-CH2-CH2-O-部分，酰胺基团和/或醚基。
连接基优选与基于碳代NADH的第一荧光团或下文定义的基于NADH的第一荧光团的腺苷酸部分的N6或C8原子连接。
在再一个优选的实施方案中，第一荧光团为碳代NADH。因此，在另一个优选的实施方案中，第一荧光团的氧化形式为碳代NAD。
“第一荧光团为碳代NADH”理解为本发明化合物携带作为第一荧光团的碳代NADH部分。
本发明的“荧光团”为能够在室温和水溶液中发荧光的部分。
在再一个优选实施方案中，第二荧光团的吸收小于所述第二荧光团在360nm波长处最大吸收的5％。在一个更优选的实施方案中，第二荧光团的吸收小于所述第二荧光团在360nm波长处最大吸收的3％。
这确保当第一荧光团激发时没有或仅有可忽略的第二荧光团的不期望的直接激发。
当有第一荧光团发射光谱和第二荧光团激发光谱的光谱重叠时，发生由第一荧光团至第二荧光团的有效能量转移。
本发明化合物或用于本发明方法的荧光辅酶中合适的第二荧光团的实例为包含作为核心的发色团的荧光团，所述发色团选自：2-[3-(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)-1-丙烯-1-基]-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-发色团部分(如在“Cy3”中)、5,6-二氯-2-[3-(5,6-二氯-1,3-二氢-1,3-二甲基-2H-苯并咪唑-2-亚基)-1-丙烯-1-基]-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑鎓发色团部分、1-甲基-4-[3-(1-甲基-4(1H)-喹啉亚基)-1-丙烯-1-基]-喹啉鎓发色团部分(如在频哪氰醇(pynacynol)中)和2-(4-(二乙基氨基)-2-羟基苯基)-4-(4-(二乙基亚氨基)-2-羟基环己-2,5-二烯基亚基)-3-氧代环丁-1-烯酸酯(盐)发色团部分(一种方酸菁染料(squaryliumdye))。这些发色团称为核心，因为它们还可额外地包含一个或多个取代基，其中与未取代的发色团相比，所述取代基不改变经取代的发色团的基本结构。具体地，一个或多个取代基替代存在于未取代发色团中的一个或多个氢残基。典型的取代基包括但不限于短的烷基残基，诸如甲基、乙基或丙基，或者短的烷氧基残基，诸如甲氧基、乙氧基或丙氧基。合适的发色团也示于图2和3中。
通过记录给定染料的激发和发射光谱，本领域技术人员能够选择其它合适的染料。
优选的荧光团包含作为核心的2-[3-(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)-1-丙烯-1-基]-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓-发色团部分(如在“Cy3”中)或如图2所示的核心。
N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD及其还原形式具体为本发明的优选化合物，如实施例所示。
使用NADH依赖性氧化还原酶，化合物的还原形式可再循环至氧化形式。因此，在另一个方面中，本发明还涉及本发明化合物的还原形式以及氧化和还原形式的混合物。
在一个优选的实施方案中，基于碳代NADH的第一荧光团的还原形式为具有式III的基于碳代NADH的第一荧光团
其中
Q为NR1R2，其中R1和R2独立地选自H、C1至C12烷基、C1至C12烯基和C1至C12炔基，任选地其中烷基、烯基和炔基的一个或多个碳原子用O、N或S代替，和/或
任选地其中所述C1至C12烷基、烯基和炔基取代有＝O、-OH、-SH、＝S或C1至C4烷基，其中烷基的一个或多个碳原子任选地用O、N或S代替，且
J选自H、C1至C12烷基、C1至C12烯基和C1至C12炔基，任选地其中烷基、烯基和炔基的一个或多个碳原子用O、N或S代替和/或任选地其中所述C1至C12烷基、烯基和炔基取代有＝O、-OH、-SH、＝S或C1至C4烷基，其中烷基的一个或多个碳原子任选地用O、N或S代替，具体地其中J和Q中的一个经由长度为25个原子或更少的连接基分子与第二荧光团连接，且
T为氢原子或磷酸酯基团，
尤其其中Q取代有N-(6“cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基。
在优选的实施方案中，本发明还涉及N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH、N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD或N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD和N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH的混合物。
在再一个实施方案中，本发明涉及试剂系统(也称为试剂盒)，其包含
(a)用于FRET的本发明化合物，和
(b)NAD(H)依赖性氧化还原酶。
这种试剂系统或试剂盒可用于测定样品中分析物的方法。
本发明还涉及本发明化合物或本发明试剂系统或本发明试剂盒用于测定样品中分析物的量和/或浓度的用途。
本发明还涉及用于FRET的本发明化合物或本发明试剂系统或本发明试剂盒作为FRET试剂的用途。
本发明还涉及试剂盒，其包含
(a)如本发明方法的上下文中定义的本发明化合物或荧光辅酶，和
(b)任选地NAD(H)依赖性氧化还原酶，和
(c)任选地其它试剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及使用NAD(H)依赖性氧化还原酶和荧光辅酶的氧化形式测定样品中分析物的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使NAD(H)依赖性氧化还原酶和荧光辅酶的氧化形式与样品混合，由此
(b)使分析物与包含NAD(H)依赖性氧化还原酶和荧光辅酶的氧化形式的试剂系统反应，
(c)测量还原辅酶的荧光发射，
其中所述荧光辅酶为包含以下的化合物
(1)基于NADH的第一荧光团，和
(2)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二荧光团。
在另一个优选的实施方案中，第二荧光团可用波长为445至475nm的光激发.
“基于NADH的荧光团”理解为分别包含基于NADH的部分或基于碳代NADH的部分的荧光团。
用于本发明方法的基于NADH的部分的氧化形式包含任选取代的NAD部分。相应的基于还原NADH的部分包含NADH的1,4二氢烟酰胺实体，其作为荧光团起作用且所述1,4二氢烟酰胺实体通常为未取代的。NADH部分的剩余原子可为经取代的。对本领域技术人员显而易见的是，这种取代必须与感兴趣的酶反应相容。优选的取代基为腺苷酸实体中2’OH上的磷酸酯基团，形成NADPH部分。优选的其它取代位置为腺苷酸核碱基的N6和C8。N6和C8处的合适取代基独立地为C1至C12烷基、烯基或炔基，其任选地被一个或多个O、N和/或S原子中断，并且其中所述C1至C12烷基、烯基或炔基任选地取代有＝O、-OH、-SH、＝S或C1至C4烷基，所述烷基任选地被一个或多个O、N或S原子取代或中断。更优选地，N6或C8中的一个优选经长度为25个原子或更少的连接基分子与第二荧光团连接。
在另一个优选的实施方案中，所述荧光辅酶由以下部分组成
(i)基于NADH的第一荧光团，和
(ii)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二荧光团，和
(iii)长度为25个原子或更少的连接基分子。
基于NADH的第一荧光团优选可用波长为300至400nm，优选360至380nm，更优选365至385nm，最优选370至380nm的光激发。
NADH可用波长为340nm的光激发。
碳代NADH最大可用波长为360nm的光激发。
NADH和碳代NADH的最大发射均为465nm。
NADH和碳代NADH均为本发明合适的第一荧光团。
因此，在一个优选的实施方案中，基于NADH的第一荧光团选自NADH和碳代NADH。在一个更优选的实施方案中，基于NADH的荧光团选自NADH、NADPH、碳代NADH和碳代NADPH，更优选地选自NADH和碳代NADH，最优选地为碳代NADH。
在另一个更优选的实施方案中，基于NADH的荧光团的氧化形式选自NAD、NADP、碳代NAD和碳代NADP，更优选地选自NAD和碳代NAD，最优选地为碳代NAD。第一荧光团的这种氧化形式以用于本发明方法的荧光辅酶的氧化形式存在。
在一个优选的实施方案中，用于本发明方法的荧光辅酶及其氧化形式为上述本发明化合物。
用于进行分子内荧光共振能量转移(FRET)的上述化合物包含：
(1)基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式，和
(2)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二荧光团。
分别包含基于NADH的部分或基于碳代NADH的部分的荧光团的上述优选实施方案也适用于本发明的方法。
优选地，通过基于荧光辅酶的荧光发射测定分析物的量和/或浓度实施本发明的方法。
在本发明方法的一个优选实施方案中，荧光辅酶的氧化形式的变化产生于步骤(b)。
在一个具体优选的实施方案中，所述荧光辅酶的氧化形式的变化为荧光辅酶的还原。
在另一个具体优选的实施方案中，所述辅酶的变化与分析物的量和/或浓度相关。
分析物可为例如可借助于作为酶的NAD(H)依赖性氧化还原酶直接或间接测定的代谢物或底物。分析物在酶-辅酶复合物存在下反应，然后可被定量。对此，使待测定的分析物与合适的酶、辅酶接触，其中所述辅酶通过酶反应进行还原。校正得到测量值与待测定分析物的浓度的直接关系。
所述分析物可存在于体液如血液、血清、血浆或尿，或存在于废水或食物中。作为分析物，可测定可通过NAD(H)依赖性氧化还原酶介导的氧化还原反应分析的任何生物学或化学化合物，例如作为NAD(H)依赖性氧化还原酶的底物的化合物。合适的分析物为甘油三酯、抗坏血酸、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、胆固醇、甘油、磷酸甘油、乳酸酯(盐)、酮如3-羟基丁酸酯(盐)、L-氨基酸如谷氨酸或半胱氨酸、谷胱甘肽、肽、脲、铵、水杨酸盐、丙酮酸盐、CO2、苹果酸酯(盐)、乙醇、甲醛和山梨糖醇。
在再一个优选实施方案中，所述分析物选自葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、胆固醇、甘油、磷酸甘油、乳酸酯(盐)、酮如3-羟基丁酸酯(盐)、L-氨基酸如谷氨酸、苹果酸酯(盐)、乙醇、甲醛和山梨糖醇，更优选为葡萄糖。
对本领域技术人员显而易见的是，本发明方法表明使分析物与试剂系统反应的步骤通过使用能够在辅酶中诱导荧光的光源来进行。在这种光存在下产生荧光信号，其反映辅酶的氧化还原状态的变化，与感兴趣的分析物的浓度关联并且可进行测量。
因此，本发明还涉及测定样品中分析物的浓度和/或量的方法，其包括下列步骤：
(a)使NAD(H)依赖性氧化还原酶和荧光辅酶的氧化形式与样品混合，由此
(b)使分析物与包含NAD(H)依赖性氧化还原酶和荧光辅酶的氧化形式的试剂系统反应，
(c)测量还原辅酶的荧光发射，
(d)基于荧光辅酶的荧光发射测定分析物的量和/或浓度，
其中所述荧光辅酶为本发明化合物。
在另一个实施方案中，试剂盒和/或试剂系统包含用作荧光内标物(internalfluorescencestandard)的第三荧光团，而为了避免光谱串扰，该第三荧光团具有更高的发射波长，其与第二荧光团分开最少约100nm，优选大于约140nm。为了与LED激发源相容，第三荧光团的发射波长优选为约660至约900nm。
在另一个优选的实施方案中，第三荧光团用于本发明的方法，具体用作荧光内标物。
用于测定感兴趣分析物的NAD(H)依赖性氧化还原酶通常以溶液形式或者呈干燥物质形式提供，所述溶液优选为缓冲的。优选地，酶最好用于一定的缓冲条件范围。本发明的试剂系统或试剂盒由此通常将会包含NAD(H)依赖性氧化还原酶、本发明化合物和使氧化还原酶与感兴趣的分析物进行酶反应的缓冲系统。本领域技术人员毫无疑问将会选择这种缓冲条件，因为这些条件是本领域中公知的。
试剂系统或试剂盒可以即用(readytouse)形式提供并与待分析样品混合，或者它可通过以下方式产生：使单个试剂，具体为NAD(H)依赖性氧化还原酶和本发明化合物，以及需要时任选缓冲液和/或试剂和/或第三荧光团，与样品以任何期望的顺序混合。
大量氧化还原酶或脱氢酶使用NAD(P)作为辅酶。从本发明的意义上，所有这些酶均为“NAD(H)依赖性氧化还原酶”
“NAD(P)”意欲涵盖NAD和NADP。
基于国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的命名委员会推荐的酶委员会(EC)命名法可将酶进行分类(参见，例如www.expasy.ch/sprot/enzyme.-html)。
氧化还原酶利用NADH或NADPH作为辅因子。例如，氧化还原酶分为：作用在供体的CH-OH基团上，以NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.1.1)；作用在供体的醛基或氧代基团上，以NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.2.1)；作用在供体的CH-CH基团上，以NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.3.1)；作用在供体的CH-NH2基团上，以NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.4.1)；作用在供体的CH-NH基团上，以NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.5.1)；作用在NADH或NADPH上的氧化还原酶(EC1.6)；和作用在NADH或NADPH上，以NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.6.1)。
其它氧化还原酶包括：作用在供体的硫基上，以NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.8.1)；作用在作为供体的二酚及相关物质上，以NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.10.1)；作用在作为供体的氢上，以NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.12.1)；作用在掺有分子氧的成对供体上，以NADH或NADPH作为一个供体且掺有两个原子的氧化还原酶(EC1.14.12)和以NADH或NADPH作为一个供体且掺有一个原子的氧化还原酶(EC1.14.13)；氧化金属离子，以NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.16.1)；作用在-CH2基团上，NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.17.1)；和作用在作为供体的还原型铁氧化还原蛋白上，以NADH或NADPH作为受体的氧化还原酶(EC1.18.1)。
用作本发明方法中试剂系统的部分的示例性氧化还原酶包括腺苷高半胱氨酸水解酶、L-丙氨酸脱氢酶、醇脱氢酶(ADH)、醛糖还原酶(AR)、过氧化氢酶、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DOXPR)、二氢吡啶二羧酸还原酶(DHPR)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、3-异丙基苹果酸脱氢酶(3-isopropylmalate)(IPMDH)、烯酰-ACP还原酶(EACPR)、甲酸脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、D2-羟基异己酸脱氢酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCoAR)、肌苷一磷酸脱氢酶(IMPDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、P450还原酶、D3-磷酸甘油酸脱氢酶、莽草酸脱氢酶、四氢叶酸还原酶、锥虫胱甘肽(trypanothione)还原酶、类固醇脱氢酶、胆固醇脱氢酶和二氢甾醇脱氢酶(E.C.1.1.1.145)。
在一个实施方案中，用作本发明方法中试剂系统的部分的氧化还原酶优选选自葡萄糖脱氢酶(E.C.1.1.1.47)；乳酸脱氢酶(E.C.1.1.1.27,1.1.1.28)；苹果酸脱氢酶(E.C.1.1.1.37)；甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)；醇脱氢酶(E.C.l.l.l.l)；氨基酸脱氢酶，例如L-氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1.5)；胆固醇脱氢酶和二氢甾醇脱氢酶(E.C.1.1.1.145)。
通过下列附图和实施例更详细地解释本发明。
波长上下文中的“约”意指+/-10nm，优选+/-5nm。
附图简述
图1显示反应开始前(实线)和反应完成(虚线)的N6-[N-(6-“Cy3”-氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD向N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH的酶还原的反应混合物的荧光发射光谱。在370nm至700nm记录光谱，其中激发波长为360nm。
图2显示本领域已知的Cy3的化学结构。名称Cy3涉及次甲基的编号(如图所示)，而侧链未指定。因此在文献中许多结构被指定为Cy3。R基团不必须相同。在通常使用的染料中，它们为短的脂族链，其中一端或两端以高反应性部分诸如N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺结尾。
图3显示氧杂碳菁(oxacarbocyanine)(C3)染料的结构(Fig3A)以及激发光谱(Fig3B)和发射光谱(Fig3C)。
实施例
实施例1：N6-[N-(6-氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD和N6-[N-(6-氨 基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH的合成
对于N6-[N-(6-氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH的合成，使用Lindberg,M.；Larsson,PerO.；Mosbach,K.EuropeanJournalofBiochemistry(1973),40(1),187-93所述的类似操作。
1.1N6羧基甲基碳代NAD的合成
由此将如WO2011/012270中所述合成的2g(3mmol)碳代NAD和2g(10,7mmol)碘乙酸溶于25ml水中；用约13ml2M氢氧化锂将pH调至6.5。反应混合物在室温储存7天。每天用2M氢氧化锂将pH调至pH6.5。然后用0.5M氢氧化钠将水溶液的pH调至pH11.3，并加热至75℃且保持1h。用1MHCl调节pH至pH7后，将混合物置于冰冷的丙酮(250ml丙酮用于25ml混合物)中，并将所得悬浮液在4℃储存过夜。倾析除去上清液。将剩余物溶于15ml水中并通过以下方法纯化：在DEAESephadexA25柱,d＝1,6cmh＝25cm)上的IEX色谱，在4h内施用洗脱剂A(去离子水)至2M乙酸铵的梯度。使用LC-MS监测馏分并收集含合适物质(719Da)的馏分。除去溶剂，将剩余物溶于纯净水中并冻干。(得到N6羧基甲基碳代NAD：75mg)
1.2N6-[N-(6-氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD的合成
在室温向72mg(0,1mmol)N6羧基甲基碳代NAD在5ml1M(5mmol)六亚甲基二胺中的溶液中分份加入300mg(0,7mmol)1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)-碳二亚胺对甲苯磺酸盐(methoptoluenesulfonate)。在3h内，用0,5MHCl将pH调至pH4,7并将混合物在室温搅拌20h。将混合物直接用在采用以下梯度的RP18Hypersil柱(5μm,21x250mm)色谱上：100％洗脱剂A，历时60min至100％洗脱剂B，流速9ml/min，其中洗脱剂A为0,1M三乙基乙酸铵(pH7)且洗脱剂B为0,2lA与0,8l乙腈的混合物。使用LC-MS监测馏分并收集含合适物质(818Da)的馏分。
1.3N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD的合成
在室温将1,6mgCy3NHS酯(2-[3-(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-5-硫代-2H-吲哚-2-亚基)-1-丙烯-1-基]-1-[6-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-6-氧代-己基]-3,3-二甲基-5-硫代-3H-吲哚鎓内盐，来自GEHealthcare)在100μl乙腈中的溶液加至3mgN6-[N-(6-氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD在0,6ml硼酸盐缓冲液pH8,5中的溶液中。将混合物搅拌过夜并使用旋转蒸发仪真空蒸发至干。将剩余物溶于1,2ml0,1M三乙基乙酸铵(pH7)中并使用XBridgeL18柱(5μm,10x250mm)纯化。洗脱剂A为0,1M三乙基乙酸铵(pH7)且洗脱剂B为乙腈。采用下列梯度：5min5％B并在5min内至50％B，流速4ml/min。使用LC-MS监测馏分并收集含合适物质(1433Da)的馏分。
实施例2：还原为N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH
通过葡萄糖与葡萄糖脱氢酶的酶反应，由N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD原位生成N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH(如WO2010/094632中所述)。
与200mM氯化钠、100mM葡萄糖、1mMN6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD和4μM葡萄糖脱氢酶的反应以总体积为1.5ml，在密封小瓶中，在0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，在25℃进行。在反应开始前和反应完成后直接用360nM的激发波长记录370nM至700nM的荧光光谱(参见图1)。通过在约460nm和565nm处形成的两个峰可检测生成的N6-[N-(6-Cy3氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH。在约460nm处的峰代表碳代NADH本身的荧光(参见Ketteleretal.,FluorescencePropertiesofCarbaNicotinamideAdenineDinucleotideforGlucoseSensing,ChemPhysChem(2012),13(5),1302-1306)，而在565nm处的峰则代表FRET至Cy3的结果。

Claims (15)

1.一种化合物，其包含
(1)基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式，和
(2)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二荧光团，
其中所述基于碳代NADH的第一荧光团和第二荧光团共价连接。
2.一种化合物，其包含
(1)基于碳代NADH的第一荧光团的还原形式，和
(2)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二荧光团，
其中所述基于碳代NADH的第一荧光团和第二荧光团共价连接。
3.权利要求1的化合物，其中
(a)第一与第二荧光团之间的距离为1.5至5nm，
和/或
(b)所述化合物由以下部分构成
(i)基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式，和
(ii)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二荧光团，和
(iii)长度为25个原子或更少的连接基分子，
和/或
(c)其中第一荧光团的氧化形式为碳代NAD
和/或
(d)基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式为具有式II的基于碳代NADH的第一荧光团
其中
Q为NR1R2，其中R1和R2独立地选自H、C1至C12烷基、C1至C12烯基和C1至C12炔基，任选地其中所述烷基、烯基和炔基的一个或多个碳原子用O、N或S代替，和/或
任选地其中所述C1至C12烷基、烯基和炔基取代有＝O、-OH、-SH、＝S或C1至C4烷基，其中任选地所述烷基的一个或多个碳原子用O、N或S代替，且
J选自H、C1至C12烷基、C1至C12烯基和C1至C12炔基，任选地其中所述烷基、烯基和炔基的一个或多个碳原子用O、N或S代替和/或任选地其中所述C1至C12烷基、烯基和炔基取代有＝O、-OH、-SH、＝S或C1至C4烷基，其中任选地所述烷基的一个或多个碳原子用O、N或S代替，具体地其中J和Q中的一个经由长度为25个原子或更少的连接基分子与第二荧光团连接，且
T为氢原子或磷酸酯基团，
尤其其中Q取代有N-(6“cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基。
4.权利要求2的化合物，其中
(a)第一与第二荧光团之间的距离为1.5至5nm，
和/或
(b)所述化合物由以下部分构成
(i)基于碳代NADH的第一荧光团的还原形式，和
(ii)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二荧光团，和
(iii)长度为25个原子或更少的连接基分子，
和/或
(c)其中第一荧光团的还原形式为碳代NADH，
和/或
(d)基于碳代NADH的第一荧光团的还原形式为具有式III的基于碳代NADH的第一荧光团
其中
Q为NR1R2，其中R1和R2独立地选自H、C1至C12烷基、C1至C12烯基和C1至C12炔基，任选地其中所述烷基、烯基和炔基的一个或多个碳原子用O、N或S代替，和/或
任选地其中所述C1至C12烷基、烯基和炔基取代有＝O、-OH、-SH、＝S或C1至C4烷基，其中任选地所述烷基的一个或多个碳原子用O、N或S代替，且
J选自H、C1至C12烷基、C1至C12烯基和C1至C12炔基，任选地其中所述烷基、烯基和炔基的一个或多个碳原子用O、N或S代替和/或任选地其中所述C1至C12烷基、烯基和炔基取代有＝O、-OH、-SH、＝S或C1至C4烷基，其中任选地所述烷基的一个或多个碳原子用O、N或S代替，具体地其中J和Q中的一个经由长度为25个原子或更少的连接基分子与第二荧光团连接，且
T为氢原子或磷酸酯基团，
尤其其中Q取代有N-(6“cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基。
5.权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述第二荧光团包含作为核心的发色团，所述发色团选自：2-[3-(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)-1-丙烯-1-基]-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓发色团部分、5,6-二氯-2-[3-(5,6-二氯-1,3-二氢-1,3-二甲基-2H-苯并咪唑-2-亚基)-1-丙烯-1-基]-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑鎓发色团部分、1-甲基-4-[3-(1-甲基-4(1H)-喹啉亚基)-1-丙烯-1-基]-喹啉鎓发色团部分和2-(4-(二乙基氨基)-2-羟基苯基)-4-(4-(二乙基亚氨基)-2-羟基环己-2,5-二烯基亚基)-3-氧代环丁-1-烯酸酯(盐)发色团部分。
6.权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中所述第二荧光团包含“Cy3”(＝2-[3-(1,3-二氢-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)-1-丙烯-1-基]-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓)部分。
7.权利要求1至6中任一项所述的化合物，其选自
(i)N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH，或
(ii)N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD，或
(iii)N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NADH和N6-[N-(6-“Cy3”氨基己基)氨甲酰基甲基]碳代NAD的混合物。
8.一种试剂盒，其包含
(a)权利要求1至7中任一项所述的化合物，和
(b)NAD(H)依赖性氧化还原酶。
9.权利要求1至7中任一项所述的化合物或权利要求8的试剂盒的用途，
(a)用于测定样品中分析物的量或浓度，和/或
(b)作为FRET试剂。
10.使用NAD(H)依赖性氧化还原酶和荧光辅酶的氧化形式测定样品中分析物的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使NAD(H)依赖性氧化还原酶和荧光辅酶的氧化形式与样品混合，由此
(b)使分析物与包含NAD(H)依赖性氧化还原酶和荧光辅酶的氧化形式的试剂系统反应，
(c)测量还原辅酶的荧光发射，
其中所述荧光辅酶为包含以下的化合物
(1)基于NADH的第一荧光团，和
(2)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二荧光团。
11.权利要求10的方法，其中
(a)荧光辅酶的氧化形式的变化产生于权利要求10的步骤(b)，具体地
(i)其中所述荧光辅酶的氧化形式的变化为还原，和/或
(ii)其中所述辅酶的变化与分析物的量和/或浓度相关，
和/或
(b)其中通过基于荧光辅酶的荧光发射测定分析物的量和/或浓度来实现权利要求10的方法，
和/或
(c)其中荧光辅酶为权利要求1、3和5至7中任一项所述的化合物或NADH。
12.权利要求10或11的方法，
(a)其中所述分析物选自葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、胆固醇、甘油、磷酸甘油、乳酸酯(盐)、酮如3-羟基丁酸酯(盐)、L-氨基酸如谷氨酸、苹果酸酯(盐)、乙醇、甲醛和山梨糖醇，更优选为葡萄糖，和/或
(b)其中第三荧光团用作荧光内标物，且其中所述第三荧光团的发射波长与第二荧光团的发射波长分开最少100nm，优选大于约140nm，更优选其中所述第三荧光团的发射波长为660至900nm。
13.一种试剂盒，其包含
(a)权利要求1至7中任一项所述的化合物或如权利要求10至12中任一项所定义的荧光辅酶，和
(b)任选的NAD(H)依赖性氧化还原酶，和
(c)任选的其它试剂。
14.权利要求8或13的试剂盒，还包括第三荧光团，
其中所述第三荧光团的发射波长与第二荧光团的发射波长分开最少100nm，优选大于约140nm。
15.权利要求14的试剂盒，其中所述第三荧光团的发射波长为660至900nm。
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