JPS62267666A - 免疫学的分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分測定用分析方法に関り
、特に免疫学的測定法による生物学的流体試料中の特定
微量成分を分析する方法に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に極微量含有される物質を検出する
方法として、各種分析法が開発されてきた。その分析法
は、主として免疫反応をその原理とする測定法であって
、種々のものが知られているが、最も精度の高いものと
して、免疫測定法がある。

免疫測定法は、１９５８年、ベルソン（Ｂ　ｅｒｓｏｎ
）とイアロウ（Ｙ　ａｌｌｏｗ）が、放射性ヨードで標
識したランインシュリンと糖尿病患者血清中の抗インン
ユリン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測定する
ことに成功して以来、放射免疫測定法が広く用いられて
いる。

これ以後標識化合物として、更に放射性同位元素以外の
ものが、種々開発されてきた。他の標識化合物としては
例えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バク
テリオファージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体
、有機補欠分子族、化学発光性反応体及び蛍光性分子等
が挙げられる。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、Ｂと略記する）と起さな
かった物質　（以下、Ｆと略記する）の分離（以下、Ｂ
／Ｆ分離と略記する）がある。

Ｂ／Ｆ分離の問題点を解決する方法として、Ｂ／Ｆ分離
操作を要したホモノニアス酵索免疫測定法（以下ホモノ
ニアスＥ／Ａと略記する。）が提案されでいる。この方
法は、抗原抗体反応の結果、マーカとしている酵素の活
性が変化する現象を利用し、逆に全酵素活性の変化から
抗原抗体反応生成物（バウンド）又は未反応物（フリー
）の量で測定する方法であり、米国特許４，０４０，９
０７号、同４，０４３゜８７２号、特開昭４８−５４９
１号、同５１−１０６７２４号等に詳細に記載されてい
る。

また、酵素活性の変化が抗原抗体反応によって誘起され
ない場合でも、酵素阻害剤を選択して用いることにより
、同様に酵素活性の変化が可能となり、特開昭５４−２
０１３４号に記載されている。

抗原抗体反応により生成した抗原抗体反応生成物中の＃
索と未反応物の標ａ酵素に対する阻害剤の反応性が異な
るｒこめ、抗原抗体反応生成物中の酵素の活性は保持さ
れホモジニ７スＥ／Ａが可能となる。

この方法における酵素阻害は、立法的障害によって基質
の酵素への接近を妨げることによるか、又は阻害剤が酵
素に結合することにより、酵素をフンホメーンタンに変
化させることによるかであり、二つの作用が併発してお
こることもある。よってこの方法では、測定Ｎ象が高分
子物質である場合は、抗原抗体反応生成物と未反応物に
おける酵素活性の変化は通常小さく、測定がむずかしい
。このようにホモノニアスＥ／Ａは、測定可能な対象が
低分子物質に限られること、また測定感度が低いこと等
の欠点を有している。

また、特開昭５５−１０４８９６号によれば、非可逆的
Ｍ、素阻害斉りを標識体に用いた、ホモノニアスＥ／Ａ
が提案されているが、測定対象は低分子物質である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

前記の欠点を解決する方法が特開昭５８−２０９９９４
号及び同５９−２０２０６４号に記載されている。この
方法は、抗原又は抗体と、酵素又は酵素阻害もしくは活
性化物質をいずれも固定し、しかも両方の固定相を分離
することに上って、一方の固定相に結合した抗原または
抗体と酵素または酵素阻害もしくは活性化物質との結合
物がさらにもう一方の固定相に結合する可能性を排除し
、これによって反応操作が１回であるにも拘わらず高感
度が達成できると述べられている。

しかしこの方法は、操作は改良されているが、測定範囲
、感度面等で不十分である。この方法は酵素または酵素
阻害もしくは活性化物質による競合法であり、この方法
では、抗原または抗体と抗原または抗体の固定化物との
結合反応が、測定するのに十分な量が起ってから、残存
している酵素または酵素阻害もしくは活性化物質標識と
酵素または酵素阻害もしくは活性化物質の固定化物が結
合することが好ましいが、抗原または抗体と抗原または
抗体の固定化物の反応が固液系であるために測定するの
に十分量の結合が起っているとはいいがたく、はぼ拮抗
して、酵素または酵素阻害もしくは活性化物質標識と酵
素または酵素阻害もしくは活性物質の固定化物との結合
反応が起こるため測定範囲、感度面等で不利である。

本発明の目的は、低分子量物質から高分子量物質までの
幅広い測定対象に適応可能で、かつ測定範囲ら広く、高
感度で測定でき、しかも操作が簡便な流体試料中の特定
成分の測定方法を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕 前記した本発明の目的は、流体試料中の特定成分Ａを、
該特定成分Ａ虫ｒこはその厘像体と特異的に結合する物
質Ｂを用いて測定する方法に於て、該物質Ｂと特異的に
結合するが特定成分Ａとは結合しない物質Ｃ並びにｅ！
、識物質りと特異的に結合し且つ結合によって該標識物
ｑｉＤに起因する信号を変調させる物質Ｅとを担体に固
定化した物質Ｃ並びに物質Ｅの固定化物を用いることを
特徴とする流体試料中の特定成分Ａの免疫学的分析方法
によって達成される。

尚本発明の態様に於て、前記流体試料中の特定成分Ａを
、前記標識物質りと特定成分Ａまたはその類縁体とが結
合した標識体Ｆと前記物質Ｂとを用いた競合反応によっ
て測定することによってより好しい結果かえられる。

即ち、流体試料中の特定成分Ａと特異的に結合する物質
Ｂとの結合反応と、この結合反応によって生成した結合
反応生成物と未反応物の分離（いわゆるＢ／Ｆ分離）す
なわち２Ｎの固定化物（該特定成分Ａとは結合しないが
該物質Ｂと特異的に結合する物質Ｃを担体に固定してな
る固定化物、及び標識物質りと特異的に結合し標識物質
りに起因する信号を変調させる物質を担体に固定してな
る固定化物）との結合反応を一回の操作で段階的に行う
方法である。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の溶
液、コロイド溶液が使用しうるが、好ましくは生物由来
の流体試料例えば、血液、血漿、血清、脳を髄液、唾液
、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

本発明により測定しうる流体試料中での特定成分Ａとは
、その存在又はその流体試料中での虫が測定され、その
特定成分Ａに特異的に結合する物質が得られる物質又は
物質群である。すなわち、ポリペプチド、タンパク質、
複合タンパク質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホル
モン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げら
れる。

具体的には、下記の物質、または物質群を挙げることが
できるが、これらに限定されるものではない。

（タンパク質、複合タンパク質） プレアルブミン、アルブミン、Ｃ１−酸性糖タンパク質
、Ｃ１−アンチトリプシン、α、−糖タンパク質、トラ
ンスコルチン、Ｃ１−アンチキモトリプシン、Ｃ１−リ
ポタンパク質、チロキシン結合グロブリン、セルロプラ
スミン、Ｚｎ−α、−助タンパク質、Ｇｃ−グロブリン
、インター−α−トリプシンインヒビター、Ｃ１−マク
ログロブリン、αｔ−Ｈ３−糖タンパク質、α、−マク
ログロブリン、ハプトグロビン、α、−リポタンパク質
、ヘモベキシン、トランスフェリン、β−リポタンパク
質、β、−糖タンパク質、β、−マクログロブリン、Ｃ
−反応性タンパク質、ミオグロビン、エリスロボイエチ
ン、免疫グロブリン（ＩｇＧ　、　ＩｇＭ　。

ＩｇＡ　ＳＩｇＤ　、　ＩｇＥ　）、補体系成分（Ｃｔ
ｑ−Ｃ＋ｒｓＣ＋５１Ｃｔ、Ｃ３、Ｃ４、Ｃｓ、Ｃｓ、
Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、等）フィブリノーゲン、ヘモグロビ
ン、グリコヘモグロビン、血液凝固因子、ＨＢｓ抗原、
ＨＢｓ抗体、酵素（例えば、酸性フォスファターゼ、ア
ルカリ性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼア
イソエンザイム、α−アミラーゼ、アミラーゼアイソエ
ンザイム、アルドラーゼ、コリンエステラーゼ、クレア
チンホスホキナーゼ、クレアチンホスホキナーゼアイソ
エンザイム、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）、
乳酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素アイソエンザイム、γ
−ＧＴＰ、リパーゼモノアミンオキシダーゼ、ロイシン
アミノペプチダーゼ、ブドウ糖６リン酸脱水素酵素等）
等。

（ホルモン及びホルモン様物質） 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体刺激ホルモン（ＬＨ
）、成長ホルモン（ＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴ＋（）、メラニン
刺激ホルモン（ＭＳＨ）、バリブレラシン、オキシトシ
ン、インシュリン、グルカゴン、アンギオテンシン■及
び■、プロラクチン、セクレチン、ドーパミン、セロト
ニン、リマトスクチン、サイロキシン（Ｔ、）、）リョ
ードサイロニン（Ｔ３）、ガストリン、コルチゾール、
アルドステロン、カテコラミン、エストロゲン、プロゲ
ステロン、テストステロン、胎盤性ゴナドトロピン、胎
盤性ラクトーゲン、下垂体ホルモン放出因子（Ｔ　ＩＮ
　Ｈ１ｒ’５Ｈ−ＲＨ，ＣＲＨｌＬ　Ｈ−ＲＩ−１等）
等。

（ビタミン類） ビオチン、チアミン、ビタミンＡ１ビタミンＢ７、ビタ
ミンＢ８、ビタミンＢ１１、ビタミンＣ１ビタミンＤ１
ビタミンＥ１ビタミンに１葉酸等。

（腫瘍マーカ） α−フェトプロティン、癌胎児性抗原、フェリチン、ポ
リアミン、臓癌胎児抗原、塩基性フエトプロティン、Ｍ
−タンパク、前立腺酸性ホスファターゼ、糖鎖性抗原（
ＣＡ　１９−９、ＣＡ　１２５等）、ガングリオサイズ
。

（各種の薬剤及び代謝産物） ペンゾイルエクゴニン、コカイン、コディン、デキスト
ロメトロファン、ヘロイン、リセルグ酸、モルヒネ、キ
ニジン、キニーネ、アミカシン、ゲンタマイシン、カナ
マイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、アクチノマ
イセチン、力ロマイシン、クロラムフェニコール、クロ
ロマイセチン、クロルテトラサイクリン、エリトロマイ
シン、オキシテトラサイクリン、ペニシリン、ポリミキ
シン８１テラマイシン、テトラサイクリン、ストレプト
マイシン、ジフェニルヒダントイン、エトスクシミド、
フェノバルビタール、ブリミドン、セコバルビタール、
アセタミノフェン、アミカシン、アミトリブチリン、カ
ルバマゼピン、ジゴキシン、シソピラミド、リドカイン
、メソトレキセート、Ｎ−アセチルプロカイナミド、フ
ェニトイン、プロカイナミド、プログラ１０−ル、テオ
フィリン、カナピノール、テトラヒドロカナピノール、
コリン抑制薬剤、抗ヒスタミン剤、アトロピン、ブチロ
フェノン、カフェイン、クロロプロマシン、エピネフリ
ン、グリセオフルビン、イミプラミン、Ｌ−ドーパ、メ
ペリジン、メプロバメート、メタトン、ナルセイン、ノ
ルトリブチリン、オキサゼパン、パパベリン、プロスタ
グランジン、テグレトール、バルプロン酸等及びこれら
の代謝産物。

（微生物表面マーカ） バクテリア抗原、菌類抗原、寄生虫抗原、　ウィルス抗
原。

（農薬） ハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル類、チオホスフ
ェート類、及びこれらの代謝産物。

（その他） 血液型物質、カルシオリピン、アレルゲン、本発明に使
用しうる流体試料中の特定成分Ａと特異的に結合する物
質Ｂ１および該物質Ｂと特異的に結合する物質Ｃとして
は、抗体、抗原、レクチン、プロティンＡ１特定酵素の
阻害物質などがあげられるが、測定対象によって種々選
択される。

更に該特定成分Ａと該物質Ｂの特異的結合反応が抗原−
抗体反応である場合が好しい。またこの場合、該物質Ｃ
としては、抗体、プロティンＡが好ましい。

本発明で使用する抗体は、その由来を特に限定されるも
のではなく、哺乳動物等に抗原を投与、免疫して得られ
る抗血清、腹水液をそのままか、あるいは従来公知の方
法（右田俊介編「免疫化学」中山書店第７４〜８８頁参
照）である硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸アンモニウム沈
殿法、セファデックスゲルによるゲル濾過法、イオン交
換セルロールクロマトグラフィー法、電気泳動法等で精
製して用いることができる。

あるいは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウス）Ｉ
Ｉ臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞（
ハイブリドーマ）を得てモノクローナル抗体をつくって
も良い。

また、これらの抗体はＩｇＧ、　ＩｇＭ、　ＩｇＡ、　
ＩｇＤ。

ＩｇＥ各分画を用いることができ、あるいはこれらの抗
体を酵素処理してＦ　ａｂＳＦ　ａｂ’又はＦ（ａｂ’
）２といった活性抗体７ラグメントにして使用してもよ
い、更にこれらの抗体は単一で使用しても、複数の抗体
を組み合わせて使用してもかまわない。

流体試料中の特定成分Ａと特異的に結合する物質Ｂとし
て抗体又は抗原を用いた場合、本発明の測定原理は免疫
測定法に属しその反応型式としては、競合法、２抗体法
、サンドイツチ法があげられる０本発明は免疫測定法に
おいて待に好ましく使用できるので、以下免疫測定法を
例にとって本発明の詳細な説明するが、本発明はこの説
明に限定されるものではなく、種々の応用が可能である
ことは以上に述べてきた内容からも明らかである。

本発明に適用しうる標識物質りとしては、例えば、酵素
、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の活性を変化させる物
質（酵素阻害物質、補酵素、補欠分子族、酵素前駆体を
活性化する物質など）、蛍光物質、化学及び生物蛍光物
質、色素、色素前駆体（ロイコ色素など）などが挙げら
れ、その代表的な例として下記に例示した物質を挙げる
ことができる。特に好ましく用いられるのは、酵素であ
る。

例示標識物質： １、酵素 ＥＣ１，１，１，１フルコールデヒドロデナーゼ１．１
．１．６　　　グリセロールデヒドロデナーゼ １．１．１．８　　　グリセロール−３−リン酸デヒド
ロデナーゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　！り １．１．１．２７　　　乳酸デヒドロゲナーゼ１．１．
１．３７　　　リンゴ酸デヒドロデナーゼ１．１．１．
４０　　　リンゴ酸デヒドロデナーゼ（ＮＡＤＰ’） １．１．１．４７　　　グルコースデヒドロデナーゼ１
．１．１．４８　　　、ｆラクトースデヒドロデナーゼ １．１，１．４９　　　グルコース−６−１ノン酸デヒ
ドロデナーゼ １．１．２．３　　　乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロ
ーム） １．１．３．１　　　グリコール酸オキシダーゼ１．１
．３．２　　　乳酸オキシダーゼ１．１，３．４　　　
グルコースオキシダーゼ１．１．３．６　　　コレステ
ロールオキシダーゼ１．１．３．９　　　ｆｆラクトー
スオキシダーゼ１．１．３．１７　　　コリンオキシダ
ーゼ１．１．３．−　　　Ｌ　−６−グリセロリン酸オ
キシダーゼ １．２，１．１　　　　ホルムアルデヒトデヒドロデナ
ーゼ １．２，１．１２　　　グリセルアルデヒドリン酸デヒ
ドロデナーゼ １．２．３．２　　　キサンチンオキシダーゼ１．２．
３．３　　　ピルビン酸オキシダーゼ１．２，３．４　
　　オキサル酸オキシダーゼ１．３．３．−　　アシル
ＣｏＡオキシダーゼ１．４．１．１　　７ラニンデヒド
ロゲナーゼ１．４．１．３　　　グルタミン酸デヒドロ
デナーゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　（ｐ）”） １．４．１．４　　　グルタミン酸デヒドロデナーゼ（
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　ａ １．４．３．２　　　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ１．
４．３．３　　　Ｄ　−７ミノ酸オキシダーゼ１．４．
３．４　　　アミンオキシダーゼ（７ラビン含有） １．４．：１．６　　７ミンオキシグーゼ（銅含有）１
．５．１．３　　　テトラヒドロ葉酸デヒドロデナーゼ １．５．３．１　　　プルコシンオキシダーゼ１．６．
４．２　　　グルタチオンレグクターゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　
（ｐ）Ｈ） １．６．４，３　　　ノヒドロリボアミドレグクターゼ
（ＮＡＤ”）（ジアホラーゼ） １．７．３．３　　　尿酸オキシダーゼ１．１１．１．
６　　カタラーゼ １．１１．１．７　　ペルオキシダーゼ１．１３．１２
．４　　乳酸−２−モノオキシゲナーゼ １．１３，１２．５　　　Ｒｅｎ１ｌｌａルシフェリン
−２−モノオキシゲナーゼ １．１３，１２．６　　　Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェ
リン−２−°モノオキシゲナーゼ １．１３．１２．７　　　ＰｂｏＬｉｎｕｓルシフェリ
ン＝４−モノオキシゲナーゼ （Ａ　Ｔ　Ｐ加水分解） １．１４．１３．２　４−ヒドロキシ安息６酸３−モノ
オキシデナーゼ １．１４，９９，２１　　Ｌ　ａｒｉａルシ７エリンモ
７オキシデナーゼ ２．１．３．１　　　メチルマロニルＣｏＡカルボキシ
トランスフェラーゼ ２．３．２．２　　７−ゲルタミルトランス７エラーゼ ２．７．１．１　　　へキソキナーゼ ２．７．１．２　　　グルコキナーゼ ２．７．１．１５　　　リボキナーゼ ２．７．１．２８　　　）リボキナーゼ２．７，１．４
０　　　ピルビン酸キナーゼ２．７，５．１　　　ホス
ホグルコムターゼ３．１．１．３　　　アリルエステラ
ーゼ３．１．１．４　　　ホスホリパーゼＡ２３．１．
１．７　　　アセチルコリンエステラーゼ３．１．１．
８　　　コリンエステラーゼ３．１，３．１　　　アル
カリホス７７ターゼ３．１．３．２　　　酸ホスファタ
ーゼ３．１．３．９　　　グルコース−６−ホスファタ
ーゼ ３．１，３，１１　　　フルクトースノホス７７ターゼ ３．１．３．２１　　　グリセロール−１−ホスファタ
ーゼ ３．１．４．１　　　ホスホノエステラーゼＩ３．１．
４．３　　　ホスホジパーゼＣ３，２，１，１α−アミ
ラーゼ ３．２．１，２　　　　β−アミラーゼ３．２，１．１
７　　　ライゾザイム ３．２，１．１８　　　ノイラミニダーゼ３．２，１，
２０　　　α−Ｄ−グルコシダーゼ３．２，１．２１　
　　β−Ｄ−グルコシグーゼ３．２，１，２３　　　β
−Ｄ−１’ラクトシダーゼ３．２．１．３５　　　ヒフ
ルロ／グルコサミニダー３．４．１１，６　　　アルギ
ニンアミ／ベブチグーゼ ３．４．２２．４　　１０メライン ３．５．１．１　　　アスパラギナーゼ３．５，１．５
　　　ウレアーゼ ３．５．４，２　　　アデニンテ゛アミナーゼ３．５．
４．４　　７デ／シンデアミナーゼ３．５，４．６　　
　ＡＭＰデアミナーゼ４．１．１．３　　　オキサロ酢
酸デカルボキンラーゼ ４．１．１．４１　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキ
シラーゼ ４．１，２．１３　　　フルクトースニリン酸アルドラ
ーゼ ４．２，１．２０　　　）リプト７アンシンセグーゼ５
．３．１．９　　　グルツースリン酸イソメラーゼ ６．３，４．１４　　　ビオチンカルボキシラーゼ６．
４．１．１　　　ピルビン酸カルボキシラーゼ６．４，
１，２　　　アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ ６．４．１．３　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキシ
ラーゼ（ＡＴＰ−加水分 解） ６．４．１．４　　　メチルクロトニル−ＣｏＡカルボ
キシラーゼ ６．４．１．５　　　デラ／イル−ＣｏＡカルボキシラ
ーゼ　　　　　　　　等 ２、　　基質（発光物質を含む） Ｉ】−二トロフェニルーβ−Ｄ−〃ラクトシト０−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−、ｆラクトシト４−メチルウンベ
リフェロン−β−Ｄ　−Ｗ　ラクトシト ｐ−ニトロフェニルホス７エート コルチゾール−２１−ヘミスクシネート　ランぺり７エ
ロン　コンツユデート ルミノール イソルミ７−ル Ｎ−（４−７ミ７ブチル）−Ｎ−エチル　イソルミノー
ルヘミスクシンアミド Ｎ−（６−７ミ／ヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノー
ル Ｎ−（４−アミ／ブチル）−Ｎ−エチル　イソルミノー
ル ルンデニン アクリノニウム　フェニル　カルボキシレートロフィン ピロブロール 没食子酸 シロキシン ビス（２，４，６−）リクロロフェニル）オキサレート
及びその誘導体 ３、　　Ｍ素阻害物質 フィソスチグミン メチオニン　スルホキシミン ワイルド７フイ７　（ｗｉｌｄｆｉｒｓ）ブルーデキス
トラン ０−ノアニンジン−セルロース ０−ノアニシジンーデキストラン ２−プロピニルアミン ２−クロロアリルアミン フェニルグリシン ｐ−二Ｆ口７エエルグリジン アミ／アセＦニトリル ２−７ミ／−３−ヒドロキシプロピル −１，３’　−カルボキン−３゛−７ミノー１′−プロ
ペニル−１エーテル Ｌ−２−７ミノー４−７トキシートランスー３−ブテン
酸 エタノールアミン−〇−サル７エート アルビジイン アザセリン ノアジオキソノルロイシン ノアゾオキソノ７ノルバリン Δ３−７−７ミ／セファロスポリン酸 ミモシン ２−７ミ７−４−ペンチン酸 ２−７ミ７−４−クロロ−４−ペンテン酸５−アミノイ
ン７タル酸 ３．３−ジクロロアラニン ３．３．３−トリクロロアラニン Ｄ−シクロセリン ２−ヒドロキシル−３−ブチン酸 Ｎ、Ｎ−トリメチル−２−プロピニルアミンβ−７ミノ
プロビオニトリル ２−プロピニルアミン ３−デシメイル−Ｎ〜７セチルシステアミン２．３−デ
カノイ／イル−Ｎ−７セチルシステアミン β−クロロ−し−アラニン Ｌ−セリン−〇−サルフェート β−フルオロアラニン Ｌ−ビニルグリシン Ｄ−ビニルグリシン プロパルギルグリシン ガバクリン ５−ニトロ−Ｌ−／ルパリン Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−２−プロピニルアミン３−
ジメチル７ミノー１−プロピン グリセロール ソイソプロビルホスホロ７ルオライド フェニル７タンスルホニル７ルオライトクラプラン酸 アロプリ／−ル ブチルチン ヨード酢酸 ヨードアセトアミド ベスタチン ピリドキサールリン酸 ヒドラノンとその誘導体 ニトロ７ランとその誘導体 ニトロベンゼンとその誘導体 プリン誘導体 キレート化剤 フェニル水銀とその誘導体 ４、　補酵素・補欠分子族 Ｆ　Ａ　Ｄ　（７ラビン・アデニン・ノヌクレオチド） ＦＭＮ（７ラビン、モノヌクレオチド）ヘム Ｓ−７デノシルメチオニン ＴＨＦ（テトラヒドロ葉Ｉ！２） ＴＰＰ（チアミンニリンｒ１ｋ） ＣｏＡ（補酵素　Ａ） ＵＤＰ　　Ｇｌｃ（ウリノンニリン酸グルコース）ＰＬ
Ｐ（ピリドキサールリン酸） Ａ　Ｔ　Ｖ　（７デ／シン三リン酸） ビオチン Ｃｏｌ　にコチンアミドアテ゛ニンノヌクレオチド） Ｃｏ■にコチンアミドアデニンノヌクレオチドリン酸） アデノシルツバラミン メチルコバラミン ＣｏＭ（２，２’−ノチオノエタンスルホン酸）ＣｏＱ
（ユビキノン） ５、　　アポ酵素 ７ポグルタチオン還元酵素 アポチトクローム還元酵素 アポ酵母乳酸デヒドロゲナーゼ アポグルコース・オキシダーゼ アポリボアミド・デバイドロゲナーゼ アポピリドキシン・ホスフェート・オキシダーゼ アポペルオキシダーゼ アボチトクａ−ムＣ アポキサンチンオキシダーゼ アポ酵母乳酸デヒドロゲナーゼ アポサルコシンオキシダーゼ アポｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ アポアノルーＣｏＡデヒドロゲナーゼ アポジヒドロリボ酸デヒドロゲナーゼ アポコハク酸デヒドロゲナーゼ アボホモンステインメチルトランスフエラーゼ アポグルタミン酸ホルミルトランスフェラーゼ アポトランスケトラーゼ アポコリンアセチルトランスフェラーゼアポグリコーゲ
ンシンターゼ アポアラニンアミノトランスフェラーゼアポへキソキナ
ーゼ ６、　酵素前駆体を活性化させる物質 エンテロペプチダーゼ ストレプトキナーゼ プロティンキナーゼ 酵素前駆体の各種プロテアーゼ ７、　酵素前駆体 トリプシノーゲン キモトリプシノーゲン プロコリパーゼ プロホスホリパーゼ プロレニン プロカルボキシペプチダーゼＡ プロカルボキシペプチダーゼＢ キニノーゲン プロエラスターゼ アンギオテンシノーゲン プロインシエリン プロバラチロイドホルモン プログルカゴン ブロフラーデン（可番性） 凝集因子　Ｘｌ、ＸＩＩ、Ｘｌ プロエラスターゼ プロコリパーゼ ブレカリクレイン ペプシノーゲン プラスミノーゲン フイブリノーゲン プロトロンビン ブラスミ／−デンプロアクチベータ プロアクロノン ８、　蛍光物質 フルオレセイン　イソチオシアナー）　（ＦＩＴＣ）テ
トラメチルローダミン　イソチオシアナー）　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（
ＴＲＩＴＣ）ローグミ２ロ リサミンローダミン−Ｂ　２００スルホリル　クロライ
ド　　　　　　　　　　　　（ＲＢ２０ＱＳＣ）ウンベ
リフェロン ４−メチルウンベリフェロン　　　　　（４ＭＵ）フル
オレセインチオフルバミル　　　　（ＦＴＣ）フルオレ
セインチオカルバミル−ジフェニルグリシン　　　　　
　　　　　　（ＦＴＣ　−　ＤＰＧ）テトラメチルロー
ダミン　　　　　　　（ＴＭＲ）５−（（４．６−シク
ロロトリアノンー２−イル）−アミノコフルオレセイン ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニルクロライド
　　　　　　　　　　　（ＤＮＳ　−　Ｃｌ２）フルオ
ラム ２−メトキシ−２．４−ジフェニル−３（２＋１）−フ
ラノン　　　　　　　　　　　　　（ＭＤＰＦ）７−ク
ロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−！．３ージアゾ
ール　　　　　　（ＮＢＤ−ＣＣ）１−アニリノ−８−
ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ） Ｎ−（３−ピレン）−マレイミド　　　（ＮＰＭ）Ｎ−
（７−シメチルアミノー４−メチル−２−オキシ−３−
クロロメチル）−マレイミド（ＤＡＣＭ） Ｎ−（ｐ−２−ベンズイミダゾイル−フェニル）−マレ
イミド　　　　　　　　　　（ＢＩＰＭ）アントラセン
イソチオシアナートフルオロアンチルマレイミド　　　
　　　　　　　（ＦＡＭ）希土類元素を含む各種キレー
ト及びそれらの誘導体 本発明の測定方法で使用される特定成分Ａまたはその類
縁体と標識物質りとの結合物及び物質Ｂと特定成分Ａと
の結合初更に物質Ｂと物質Ｆとの結合物は、それぞれ標
識物質りの活性及び前記物質の特異的結合能力を保持し
たまま結合されていればよく、その方法として化学的手
段等が用いられる。その方法としては、石川栄冶、回合
　忠、宮井　点線「酵素免疫測定法（第２版）」（医学
書院、１９７８年刊）や日本臨床病理学全編「臨床病理
」臨時増刊特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッ
セイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年刊
）などに記載された方法をあげる゛ことができる。

具体的な例としては、グルタルアルデヒド法、過ヨーソ
酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、活性
エステル法、イソチオシアネート法等が挙げられる。

本発明において標識物質りと特異的に結合して、該標識
物質に起因する信号を変調さける物質Ｅは、使用する標
識物質りに対応して選ばれるべきものであり、下記のよ
うな物質を例に挙げることがてきる。

１、標識物質が「酵素」である場合 ・標識物質に起因する信号 該酵素活性による基質の減少、生成物の増加、エネルギ
ーの放射及びそれらに起因する変化。

・好ましい物質Ｅ 該酵素に対する阻害剤（前記例示標識物質に挙げた阻害
物質から該酵素に対応するものを選んで使用できる。） 該酵素に対する抗体で、酵素に結合してその活性に影響
を与えるもの。

２、標識物質が「酵素基質」である場合・標識物質に起
因する信号 該基質が分析素子中に添加された酵素と反応することに
より生ずる生成物の増加、エネルギーの放射及びそれら
に起因する変化。

・好ましい物質Ｅ 該基質に対する抗体で、基質に結合することにより該酵
素反応を阻害するもの。

該基質を不可逆的阻害剤として取り込む酵素。

該基質を基質とする酵素で、その反応により本来検出し
ようとしている信号を発しないもの。

３、標識物質が「補酵素」又は「補欠分子族」である場
合 ・標識物質に起因する信号 分Ｆｒ素子中に添加された該標識物質を必要とする酵素
の反応による基質の減少、生成物の増加、及びそれらに
起因する変化。

・好ましい物質Ｅ 該標識物質に対する抗体で、該標識物質に結合してその
活性に影響を与えるもの。

該標識物質を吸収又は消費するが、その活性により本来
検出しようとしている信号を発しないもの。

４、標識物質が「アポ酵素」である場合・標識物質に起
因する信号 該標識物質はそのままでは信号を発しない。後述の吸収
物質と結合して酵素活性を発現し、その活性による基質
の減少、生成物の増加及びそれらに起因する変化を測定
できる。

・好ましい物質Ｅ 該標識物質の酵素活性を発現させる補欠分子族（萌述し
た補欠分子族から該標識物質に対応するものを選んで使
用できる）。

５、標識物質が「酵素面駆体を活性化させる物質Ｊであ
る場合 ・標識物質に起因する信号 該標識物質が、分析素子中に添加された酵素前駆体を活
性化し、その活性による基質の減少、生成物の増加、及
びそれらに起因する変化。

・好ましい物質Ｅ 該物質に対する抗体で、該物質に結合してその活性に影
響を与えるもの。

該物質が酵素である場合、その阻害剤。

６、標識物質が「酵素前駆体」である場合・標識物質に
起因する信号 該標識物質はそのままでは信号を発しない。後述の吸収
物質にいったん結合後分子の一部が切断され酵素活性を
発現し、その活性による基質の減少、生成物の増加及び
それらに起因する変化を測定できる。

・好ましい物質Ｅ 該標識物質の酵素活性を発現させる物質。

７、標識物質が「蛍光物質」である場合・標識物質に起
囚する信号 該蛍光物質に励起光をあてた際に発する蛍光。

・好ましい物質Ｅ 該標識物質に対する抗体及びその誘導体で、該標識物質
の蛍光波長・強度を変化させるもの。

上記の各種物質Ｅの具体例はいずれも当業者によく知ら
れており、あらためて開示するまでもないが本発明に理
解を助けるために、代表的な例を以下に示す。

本発明に使用しうる酵素と阻害剤の組み合せとしては、
ＳＨ酵素（グルコースオキシダーゼ、コリンオキシダー
ゼ、グリコール酸オキシダーゼ、グリセロール−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グ
ルタル酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、など）、フェ
ニル水銀誘導体、グルタル酸デヒドロゲナーゼとイソフ
タル酸誘導体、α−アミラーゼとアミラーゼインヒビタ
ー、エステラーゼとベスタチン、ビオチン酵素（ピルビ
ン酸カルボキシラーゼ、アセチルｃ０−Ａカルボキシラ
ーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキンラーゼ、メチル
マロニル−Ｃｏ　Ａカルボキシラーゼなど）と７ビシン
、ベルオキシグーゼと０−ノアニノンーデキストラン、
乳酸オキシダーゼと２−ヒドロキシル−３−ブチン酸、
モノアミンオキシグーゼとＮ、Ｎ−トリメチル−２−プ
ロピニルアミン又はβ−アミ／プロピオニトリルなどが
挙げられ、更にツヤ−ナル　オブ　ノ　アメリカン　ケ
ミカル　ソサエティー（Ｊ　、　Ａ　＋ｎ、　Ｃｈｅｍ
。

５ｏｃ）第８０巻、第４５６頁（１９５８年）：同第８
２巻、第５９［ｉ′ｒＬ（１９６０年）：アカマンンツ
　ォブ　ケミカル　リサーチ（Ａ　ｃｃ、　ＣＩｔｅＩ
Ｉｌ、　Ｒｅｓ）第９巻、３１３頁（１９７６年）：サ
イエンス（３ｃｉｅｎｃｅ）第１８５４３２０頁（１９
７４年）：化学工業１９８５？ｔＳ２１頁（１９８５年
）などに記載された、若しくは引用された酵素・阻害剤
の組合せも好ましく用いることができる。

本発明に用いられる前記物質Ｂと特異的に結合する物質
Ｃ１及び標識物質りと特異的に結合し該Ｉ＝識物質に起
囚する（３号を変調させる物質Ｅの固定化物は、種／ン
の公知の方法によりこれらの物質をアフィンクロマトグ
ラフィー、固定化酵素、免疫学的測定法に用いられる担
体の表面に物理的に吸着させるか、化学反応により直接
あるいは間接的に結合させることにより作成される。そ
の際、該物質の該特定酸°分に対する特異的結合性が失
われないように留意する必要があり、例えば石川栄冶、
何台　忠、宮井点線「酵素免疫／Ａ１１定法（第２版）
」（医学書院、１９７８年刊）や千畑一部、土佐近世、
松尾雄志著「実験と応用　アフイニテイクロマトグラフ
イー」（講談社、１９７６年刊）に記載されている方法
を好ましい方法の例として挙げることができる。また上
記の方法以外に、固定化酵素の製法に用いられる方法、
例えば千畑一部編「固定化酵素」（講談社、１９８１年
刊）も挙げられる。

本発明に用いられる担体としては、デキストランポリマ
ー、アガロース、セルロース、ゼラチン、アクリルアミ
ド、ガラスピーズ、ポリスチレンヒーズ、特開昭５５−
９０８５９号の輸送用粒状構造物、特開昭５７−１０１
７６０号、同５７−１０１７６１号、同５８１０１６３
号に記載されている自己結合型粒子結合体、繊維質多孔
性材料等が挙げられる。

本発明において前記物質Ｃ及び物質Ｅの二つの固定化物
を用いるのは、溶液中でＢ／Ｆ分離を行うためと、標識
物質に起因する信号を変調させるためである。また一方
の固定化物と結合反応生成物を形成すると、該生成物と
他方の固定化物との結合反応を起こさせないためでもあ
る。この場合一方を固定しない状態で用いると結合反応
生成物と更に結合し、測定ができなくなる。

これらの固定化物は、一方の固定化物が結合反応生成物
を形成するともう一方の固定化物と結合しないように固
定化されていればよく、担体及び固定化方法は特に問わ
ない。

本発明に用いられる標識物質に起因する信号の測定方法
は、標識物質の種類によって異なる。例えば標識物質が
蛍光物質であれば励起光をあて、蛍光強度を測定すれば
よい。標識物質が酵素であれば適当な基質、必要ならば
酵素、発色系を含む溶液を添加し、一定時間インキュベ
ートした後に該発色系に適合した波長の光（基質の種類
によっては蛍光強度、発色強度）を測定することにより
信号強度を測定できる。このような目的で用いられる基
質、発色系は、標識物質として用いる酵素の種類に従っ
て公知の方法から適当なものを選択できる。過酸化水素
及びＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨの関与する酵素系及び発色系
が好ましい組合仕の例である。

本発明の測定方法は、緩和なｐＨで実施される。

一般に特定成分の濃度変化に対する応答、各結合反応、
酵素反応等の検出反応が起りゃすいｐＨに近いｐＨで行
なわれる。ｐ　Ｈの調整に用いられる材料としては、適
当に緩衝させた水溶液、固定化物、標識酵素の基質など
である。

水性媒体には、他の極性溶媒（アルコール、エーテルな
ど）を含有していてもよく、これらの量は重量２０％以
下である。水性媒体のり１４は５〜１゜の範囲であり、
好ましくは６〜８．５の範囲である。

所望のＩ）Ｈを達成し、測定中にこのｐＨを維持するの
に各種の緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩
、トリス、バルビツール、グツド緩衝剤などがある。測
定温度は４〜４５℃で行うが、通常は１５〜４５℃であ
る。

本発明の測定方法は、競合法、サンドイツチ法、二抗体
法において適用が可能である。

次に、反応型式が競合法である場合の本発明の測定原理
を第１図によって説明する。

まづ前記した各物質即ち流体試料中の特定物質Ａ及び分
析試薬として用いろ物質Ｂ、Ｃ１標識物質Ｄ、物質Ｅ及
び標識体Ｆを夫々特定した図形によって表示した（同図
（ａ））。

また前記各物質の液相系または固液用系に於る結合反応
生成物または反応成分を括弧に括って表示した。尚結合
手２本で特異的結合を結合手１本で非特異的結合を表わ
した。また矢印線は反応の方向を示す。

図に於てｐ及びｑは夫々物質Ｃ及びＥを固定化する担体
であって、物質Ｃ，Ｅを固定化することによって夫々固
定化物Ｐ及びＱを構成する。

表面反応性を付与された前記固定化物Ｐ、Ｑ及び特定成
分Ａ及び分析試薬として加えられる物質Ｂ及び標識体Ｆ
を含む流体試料の構成する系に於ては、固定化物Ｐ及び
Ｑには実質上流体試料中での液相系反応終了後の固液相
系反応しか許されない。即ち反応成分の衝突確率の高い
液相系反応が固液相系反応より十分に速く優先して起る
ので流体試料中の特定成分Ａと物質Ｂ及び標識体Ｆと物
質Ｂの特異的結合が起り、夫々に結合反応生成物（Ａ＝
Ｂ）及び（Ｂ＝Ｆ）が生成し、固液相系反応で生成すべ
き結合物（Ｂ＝Ｃ）或は（Ｄ　＝　Ｅ　’Ｉの生成は液
相系反応が終了するまでは保留される。

液相系反応が終了し流体試料中に存在する結合反応生成
物（Ａ＝８）及び（Ｂ　＝　Ｆ　）及び標識体Ｆは固定
化物Ｐ及びＱ上の物質ＣまたはＥとの固液用反応を開始
する。

この場合結合反応生成物（Ｂ＝Ｆ）は固定化物Ｐ及びＱ
のいづれに対しても結合しうるが、物質Ｂと物質Ｃとの
結合力を標識物質りと物質Ｅとの結合力より強い組合せ
を選択することにより前記（Ｂ　＝　Ｆ　）を固定化物
Ｐに優先的に結合させることが可能である。

このようにして物質Ｂが関与する結合反応生成物（Ａ　
＝　Ｂ　）及び（Ｂ＝Ｆ）は固定化物Ｐへ、また標識体
Ｆ　１．ｔ　Ｑへ夫々分Ｒ（即ち前記Ｂ／Ｆ分離）する
ことがでさる。

標識体ＦＬｆ）標識物質りは、固定化物Ｑと物質Ｅとの
結合により１フ識物′ｆｉＤに起因する信号が変調され
るので、流体試料中の特定成分Ａの濃度と標識物質全体
の（ｉ号強度の間には、関数関係が成立する。そこであ
らかじめ特定成分Ａの濃度がわかっている流体試料（標
準試料）を数種頭用いて検量線を作成しておけば、未知
の液体試料中の特定成分Ａの濃度を知ることができる。

この測定法では溶液中に上記の物質が共存していればよ
く、その添加順序は問わない。

本発明の測定方法は、物質ＣとＥをそれぞれ担体に固定
化した該物質ＣとＥの固定化物ＰとＱを用いること１こ
より、簡単な操作で低分子から高分子物質までの特定成
分Ａの測定が可能となり、かつ測定域も広く高感度も達
成された。

〔実施例〕

以下本発明を実施例によって更に具体的に説明するか、
本発明はこれら実施例によって限定されるものではない
。

実施例　！。

（１）　　抗ヤギＩｇＧ抗体の固定化 粉末；！ＥＤ（東洋ｊ紙社製）１００９を、ブタンノオ
ールジグリシジルエーテル（米国アルドリッヂ社製）２
５０ｍｇと、２ｍ９／ｍ１２の水素化ホウ素ナトリウム
を含む０．８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２５０１との混
合液中に懸濁し、４０℃にて５時間半振盪撹拌した後、
純水約５１２で洗浄し、乾燥させた。

この官能基を持つ粉末１紙ＤＩＯｇを、１００ｍｇのウ
サギ抗ヤギＩｇＧ　（米国カッペル社製）を含む０．５
Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝ｔ＆、（ｐ
ｌ〜１１０．０）ｌｏｏｍｌ！ｌ、：懸濁し、４０℃に
て１２時間振盪撹拌した。これをｊ過し、ベレットを純
水５００ｍ１２．０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍ炭素水素ナトリウム溶液５００ｍ２．０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４
，１）　５００＋ｎ１２にて交互に洗浄した後、ＩＭ）
リス−塩酸緩衝液（＋）８８．５）　３００ｓ１２に懸
濁し、２５℃２４時間振盪撹拌して未反応基をブロック
した。これを１過し、ペレットを純水約２Ｑで洗浄し、
抗ヤギＩ［ｉＧ抗体固定化粉末ｊ紙りを得た。

（２）標識体（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識ヒト
ＩｇＧ　）の作成 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ１１０ｌｌ１を、１．２
５％グルタルアルデヒドを含むＯ，１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，８）０．２ｍ１２に加え、室温にて１０時間ゆ
るやかに撹拌して反応させた。これをあらかじめ０．１
５Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化したセファデックスＧ
−２５カラム（１，Ｏｘ　５５ｃｍ）に通し、グルタル
アルデヒド活性化グルタミン酸デヒドロゲナーゼ画分を
回収した。この両分１．ＯｍＱにヒトＩ　ｇＧ　（米国
カッペル社製）を５ｍｇ含む０．１５Ｍ塩化ナトリウム
溶液１、ｏｍＱ及び、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９，５）０．１ｍＱを加え、４℃２４時間反応させた。

この溶液に０．２Ｍリジンを０．１ｒａ１２加え、さら
に４℃にて２時間反応させた後、Ｏ，１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含むＧ、０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，［＋）で
平衡化したυｌｔｒ。

−ｇｅｌ　ＡｃＡ−３４カラム（１，５Ｘ　１００ｃｍ
）に通し、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識ヒトｔｇ
Ｇを得た。

（３）ヒトＩｇＧの測定 キュベツトにウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体固定化粉末ｊ紙Ｄ
　ｌＯ＋ａｇ、アフィゲル−５０１（＋）−クロロマー
キュリ−アニリンをアガロースに固定化したもの；バイ
オ−ラッド社製）　１ｍｇ、及びＩ］、１Ｍ　）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）２．５ｍ１２．２０Ｍ　ＮＡ
Ｄ（酸化型ニコチンアミドアデニン　ジ　ヌクレオチド
ホスフェート）溶液０．３ｍＣ及び１．５Ｍグルタミン
酸ナトリウム溶液０．２ｍ（２を加え、３７℃で５分間
プレインキューベットした後、Ｏ，１ｍｇ／ｍＩ２ヤギ
抗ヒトＩｇＧ抗体（０，０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐｉ（７６））５０μＱを加え、さらに１Ｍｇ／ｍ１
２グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識ヒトＩｇＧ　（０
，０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，６））と０
〜６４０μｇ／　ｍ（ｌ未標識ヒトＩｇＧ　（０，１１
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，６））とを等量
混合した溶液５０ａＱを加え、３７℃で１０分インキュ
ベートした。この溶液の３４０ｎｍの吸光度を測定し、
表　　１ 表１に示したように、本測定方法を用いることによって
煩雑な物理的離操作を行うことな（、溶液内でＢ／Ｆ分
離をすることができ、良好な検量線を得ることができた
。

実施例　２ （１）抗ヤギＩｇＧ抗体の固定化 実施例１−（１）と同様にウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体固定
化粉末總紙りを得た。

（２）標識体の作成 実施例１−（２）と同様にグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ標識ヒトＩｇＧを得た。

（３）ヒトＩｇＧの測定 キュベツトにウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体固定化粉末ｊ紙Ｄ
　ｌｏｍｇ、アフィゲル−５０１１ｍｇ、及び０．０１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，６）０．３ｍｆ！
を加え、３７℃て５分間プレインキューベートした後、
０．１ｍｇ／ｍＱ坑ヒトＩｇＧ抗体（０，０１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（＋）Ｈ７，６））　５０μＱを加え
、さらにｌａｇ／ｍ（ｌグルタミン酸デヒドロゲナーゼ
標識ヒトＩｇＧ　（０，０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７，６）と０〜６４０μｇ１ｍＱ未標識ヒトＩ　
ｇＧ　、　（０，０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，６））とを等量混合した溶液５０μＱを加え、３７
℃で３０分インキュベートした。この溶液に下記組成の
発色液を加え、３７℃１０分インキュベートし、溶液の
３４０ｎｍの吸光度を測定した。

この測定結果を表２に示した。

ｒｏ、ＩＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）　　２．
５＋ｎ＋２’１．５Ｍグルタミン酸ナトリウム溶液　０
．２ｎ＋＋２表　　２ 表２より明らかな様に、本測定方法を用いることによっ
て、煩雑なり／Ｆ’分離を行なうことなく、かつ、精度
よく、流体試料中の成分を測定することができた。

本実施例では、検量線の範囲はヒトＩｇＧ　Ｏ〜６４０
μｇ／ＩＩＩＱであったが、これは物質Ｂ、物質Ｃ及び
標識物質りの量比、及び親和力を調節することによって
いか様にも測定範囲を設定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の免疫学的分析方法の模式説明図である
。 Ａ・・・流体試料中の特定成分、 Ｂ・・特定成分Ａと特異的結合をする物質、Ｄ・・標識
物質、 Ｆ・・・標識体。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）流体試料中の特定成分Ａを、該特定成分Ａまたは
   その類縁体と特異的に結合する物質Ｂを用いて測定する
   方法に於て、該物質Ｂと特異的に結合するが特定成分Ａ
   とは結合しない物質Ｃ並びに標識物質Ｄと特異的に結合
   し且つ結合によって該標識物質Ｄに起因する信号を変調
   させる物質Ｅとを担体に固定化した物質Ｃ並びに物質Ｅ
   の固定化物を用いることを特徴とする流体試料中の特定
   成分Ａの免疫学的分析方法。
2. （２）前記流体試料中の特定成分Ａを、前記標識物質Ｄ
   と特定成分Ａまたはその類縁体とが結合して成る標識体
   Ｆと前記物質Ｂとを用いた競合反応によって測定するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫学的分
   析方法。