JPS62249060A - 免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分測用定分析方法に係り
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を分析する免
疫学的測定法に関する。

〔従来技術〕

生物学的流体試料中に含まれる砥微量含有される物質を
検出する方法として、各種分析法の開発がなされてきた
。その分析方法は、主として免疫反応をその原理とする
らのである。上記原理を用いる測定法として、種々のも
のが開発されてきたが、最も精度の高いものとして、免
疫測定法が知られている。

免疫測定法は、１９５８年、ベルソン（Ｂｅｒｓｏｎ）
とイアロウ（Ｙａｌｌｏｗ）が、放射性ヨーＶで標識し
た、ウシインシュリンと糖尿病患者血清中の抗インシュ
リン抗体を用いて、血？＋！７中のインシュリンを測定
することに成功して以来、放射免疫測定法が広く用いら
れている。

これ以後標識化合物として、放射性同位元素以外のもの
が種々開発がされてきた。他の標識化合物としては例え
ば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリ
オファージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有
機補欠分子族、化学発光性反応体及び蛍光性分子等が挙
げられる。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、Ｂと略記する）と起さな
かった物質（以下、Ｆと略記する）の分離（以下、Ｂ／
Ｆ分離と略記する）がある。

Ｂ／Ｆ分離の問題点を解決する方法として、Ｂ／Ｆ分離
操作を要したホモジニアス酵素免疫測定法（以下ホモジ
ニアスＥ／Ａと略記する。）が提案されている。この方
法は、抗原抗体反応の結果、マーカーとしている酵素の
活性が変化する現象を利用し、逆に全酵素活性の変化か
ら抗原抗体反応生成物（バウンド）又は未反応（フリー
）の量で測定する方法であり、米国特許４，０４０，９
０７号、同４，０４３゜８７２号、同４，１９１，６１
３号、特開昭４８−５４９１号、同５【−１０６７２４
号等に詳細に記載されている。

また、酵素活性の変化が抗原抗体反応によって誘起され
ない場合でも、酵素阻害剤を選択して用いることにより
、同様に酵素活性の変化が可能となり、特開昭５４−２
０１３４号に記載されている。

抗原抗体反応により生成した抗原抗体反応生成物中の酵
素と未反応物の標識酵素に対する阻害剤の反応性が異な
るため、抗原抗体反応生成物中の酵素の活性は保持され
ホモジニアスＥ／Ａが可能となる。

この方法における酵素阻害は、立体的障害によって基質
の酵素への接近を妨げることによるか、又は阻害剤が酵
素に結合することにより、酵素をコンホメーションに変
化させることによるかであり、二つの作用が併発してお
こることもある。

よってこの方法では、測定対象が高分子物質である場合
は、抗原抗体反応生成物と未反応物における酵素活性の
変化は通常小さく、測定がむずかしい。このようにホモ
ジニアスＥ／Ａは、測定可能な対象が低分子物質に限ら
れること、また測定感度が低いこと等の欠点を有してい
る。

また、特開昭５５−１０４８９６号によれば、非可逆的
酵素阻害剤を標識体に用いた、ホモジニアスＥ／Ａが提
案されているが、測定対象は低分子物質である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

前記の欠点を解決する方法が特開昭５３−２０９９４号
及び同５９−２０２０６４号に記載されている。この方
法は、抗原又は抗体と、酵素又は酵素阻害もしくは活性
化物質をいずれも固定し、しかも両方の固定相を分離す
ることによって、一方の固定相に結合した抗原または抗
体と酵素または酵素阻害もしくは活性化物質との結合物
がさらにもう一方の固定相に結合する可能性を排除し、
これによって反応操作が１回であるにも拘わらず高感度
が達成できると述べられている。

しかしこの方法は、操作は改良されているが、測定範囲
、感度面等で不十分である。この方法は酵素または酵素
阻害もしくは活性化物質による競合法でり、この方法で
は、抗原または抗体と抗原または抗体の固定化物との結
合反応が、測定するのに十分な量が起ってから、残存し
ている酵素または酵素阻害もしくは活性化物質標識と酵
素または酵素阻害もしくは活性化物質の固定化物が結合
することが好ましいが、抗原または抗体と抗原または抗
体の固定化物の反応が固液系であるために測定するのに
十分量の結合が起っているとはいいがたく、はぼ拮抗し
て、酵素または酵素阻害もしくは活性化物質標識と酵素
または酵素阻害もしくは活性物質の固定化物との結合反
応が起こるため測定範囲、感度面等で不利である。

本発明の目的は、低分子量物質から高分子量物質までの
幅広い測定対象に適応可能で、かつ測定範囲も広く、高
感度で一１定でき、しかも操作が簡便な液体試料中の特
定成分の測定方法を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記目的は、流体試料中の特定成分と結合しな該標識物
質に起因する信号を変調させる物質をそれぞれ担体に固
定化した固定化物を用いることにより達成された。

即ち、流体試料中の特定成分と該特定成分と特異的に結
合する物質との結合反応と、この結合反応によって生成
した結合反応生成物と未反応物のの分離（いわゆるＢ／
Ｆ分離）すなわち２種の固定化物（該特定成分とは結合
しない生物活性物質又は該生物活性物質と特異的に結合
する物質を担体に固定してなる固定化物、及び標識物質
と特異的に結合し標識物質に起因する信号を変調させる
物質を担体に固定してなる固定化物）との結合反応を一
回の操作で段階的に行う方法であるこれらの生物活性物
質及び生物活性物質と特異的に結合する物質は、後述す
る測定しようとする流体試料中の特定成分や該特定成分
と特異的に結合する物質や測定に用いる標識物質と結合
反応や相互作用をしない物質が用いられる。

本発明において用いられる生物活性物質又は該生物活性
物質と特異的に結合する物質の組み合せとしては、 酵　素　：　基質（生成物） 阻害剤 補欠分子族 補酵素 アロステリックエフェクター 抗　　体　　：　　抗原 プロティンＡ レクチン：　多糖類 糖タンパク質 核　酸　：　相補性の塩基配列 ヒ入トン 核酸 ポリメラーゼ ホルモン：　受容体 ビオチン：　７ビノン が挙げられ、好ましくは抗体と抗原、またはビオチン類
とアビノン類であり、更に好ましくはビオチン類と７ビ
ノン類である。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の溶
液、コロイド溶液が使用しうるが、好ましくは生物由来
の流体試料例えば、血液、血漿、血清、脳を髄液、唾液
、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

本発明により測定しうる流体試料中での特定成分とは、
その存在又は、その流体試料中での量が測定され、その
特定成分に特異的に結合する物質が得うる物質又は物質
群である。すなわち、ポリペプチド、タンパク質、複合
タンパク質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホルモン
類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられる
。具体的には、下記の物質、または物質群を挙げること
ができるが、これらに限定されるものではない。

（タンパク質、複合タンパク質） プレアルブミン、アルブミン、α、−酸性糖タンパク質
、α、−アンチトリプシン、α、−１１タンパク質、ト
ランスコルチン、Ｃ１−アンチキモトリプシン、α、−
リポタンパク質、チロキシン結合グロブリン、セルロブ
ラスミン、Ｚｎ−α、−朝タンパク質、Ｇｃ−グロブリ
ン、インター−α−トリプシンインヒビター、Ｃ１−マ
クログロブリン、α、−Ｈ５−ｔａタンパク質、α、−
マクログロブリン、ハプトグロビン、α、−リポタンパ
ク質、ヘモベキシン、トランスフェリン、β−リポタン
パク質、β２−糖タンパク質、β２−マクログロブリン
、Ｃ−反応性タンパク質、ミオグロビン、エリスロポイ
エチン、免疫グロブリン（Ｉ　ｇＧ　ＳＩ　ｇＭ。

ＩｇＡｌ　ｒｇＤ、ＩｇＥ）、補体系成分（Ｃ＋ｑ％Ｃ
＋ｒ、Ｑｌｓ、Ｃｔ、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ，、Ｃ７、
Ｃ，、Ｃ，、等）フィブリノーゲン、ヘモグロビン、グ
リコヘモグロビン、血液凝固因子、ＨＢ　ｓ抗原、ＨＢ
ｓ抗体、酵素（例えば、酸性フォスファターゼ、アルカ
リ性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アイ
ソエンザイム、α−アミラーゼ、アミラーゼアイソエン
ザイム、アルドラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチ
ンホスホキナーゼ、クレアチンホスホキナーゼアイソエ
ンザイム、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）、乳
酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素アイソエンザイム、γ−
ＧＴＰ、　リパ−ゼモノアミンオキシダーゼ、ロイシン
アミノペプチダーゼ、ブドウ糖６リン酸脱水素酵素等）
等。

（ホルモン及びホルモン様物質） 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体刺激ホルモン（ＬＨ
）、成長ホルモン（ＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｉ−１）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メラニ
ン刺激ホルモン（ＭＳＨ）、バリブレラシン、オキシト
シン、インシュリン、グルカゴン、アンギオテンシン■
及び■、プロラクチン、セクレチン、ドーパミン、セロ
トニン、リマトスタチン、サイロキシン（Ｔ４）、トリ
ヨードサイロニン（’ｒ　！ｌ）、ガストリン、コルチ
ゾール、アルドステロン、カテコラミン、エストロゲン
、プロゲステロン、テストステロン、胎盤性ゴナドトロ
ピン、胎盤性ラクトーゲン、下垂体ホルモン放出因子（
ＴＲＨ１Ｆ’　Ｓ　Ｈ−ＲＨＳＣＲＨＳＬ　Ｈ−ＲＨ等
）等。

（ビタミン類） ビオチン、ヂアミン、ビタミンＡ１ビタミンＢ。

ビタミンＢ６、ビタミンＢｌ！、ビタミンＣ、ビタミン
Ｄ１ビタミンＥ１ビタミンに１葉酸等。

（腫瘍マーカー） α−フェトプロティン、癌胎児性抗原、フェリチン、ポ
リアミン、臓癌胎児抗原、塩基性フェトプロティン、Ｍ
−タンパク、前立腺酸性ホスファターゼ、糖鎖性抗原（
ＣＡ　１９−９、ＣＡ　１２５等）、ガングリオサイズ
。

（各種の薬剤及び代謝産物） ペンゾイルエクゴニン、コカイン、コディン、デキスト
ロメトロファン、ヘロイン、リセルグ酸、モルヒネ、キ
ニジン、キニーネ、アミカシン、ゲンタマイシン、カナ
マイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、アクチノマ
イセチン、カナマイシン、クロラムフェニコール、クロ
ロマイセチン、クロルテトラサイクリン、エリトロマイ
シン、オキシテトラサイクリン、ペニシリン、ポリミキ
シン８１テラマイシン、テトラサイクリン、ストレプト
マイシン、ジフェニルヒダントイン、エトスクシミド、
フェノバルビタール、プリミドン、セコバルビタール、
アセタミノフェン、アミカシン、アミトリブチリン、カ
ルバマゼピン、ジゴキシン、シソビラミド、リドカイン
、メソトレキセート、Ｎ−アセチルプロカイナミド、フ
ェニトイン、プロカイナミド、プログラ１０−ル、テオ
フィリン、カナピノール、テトラヒドロカナピノール、
コリン抑制薬剤、抗ヒスタミン剤、アトロピン、ブヂロ
フェノン、カフェイン、クロロプロマシン、エピネフリ
ン、グリセオフルビン、イミプラミン、Ｌ−ドーパ、メ
ペリジン、メプロバメート、メタトン、ナルセイン、ノ
ルトリブチリン、オキサゼパン、パバベリン、プロスタ
グランジン、テグレトール、バルプロン酸等及びこれら
の代謝産物。

（微生物表面マーカー） バクテリア抗原、菌類抗原、寄生虫抗原、ウィルス抗原
。

（農　薬） ハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル類、チオホスフ
ェート類、及びこれらの代謝産物。

（その他） 本発明に使用しうる流体試料中の特定成分と特異的に結
合する物質としては、測定対象により抗体、抗原、レク
チン、プロティンＡ、特定酵素の阻害物質などが挙げら
れるが、該特定成分と該結合物質の結合反応が抗原−抗
体反応である場合が特に好ましい。本発明で使用する抗
体は、その由来を特に限定されるものではなく、哺乳動
物等に抗原を投与、免疫して得られる抗血清、腹水液を
そのままか、あるいは従来公知の方法（右田俊介編「免
疫化学」中山書店第７４〜８８頁参照）である。

硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸アンモニウム沈殿法、セフ
ァデックスゲルによるゲルｊ過性、イオン交換セルロー
ルクロマトグラフィー法、電気泳動法等で精製して用い
ることができる。

あるいは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウス）評
臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞（ハ
イブリドーマ）を得てモノクローナル抗体をつくっても
良い。

また、これらの抗体はＩｇＧ、ＩｇＭｌ　１ｇＡＩｇＤ
、ＩｇＥ各分各企画いることができ、あるいはこれらの
抗体を酵素処理してＦａｂ、　Ｆａｂ′又はＦ（ＩＩ１
１′）２といった活性抗体７ラグメント１こして使用し
てもよい。更にこれらの抗体は単一で使用してら、複数
の抗体を組み合わせて使用してもかまわない。

流体試料中の特定成分と特異的に結合する物質とし′Ｃ
抗体又は抗原を用いｔこ場合、本発明の測定原理は免疫
測定法に属し、その反応型式としては、競合法、２抗体
法、サンドインチ法があげられる。

本発明は免疫測定法において特に好ましく使用できるの
で、以下免疫測定法を例にとって本発明の詳細な説明す
るが、本発明はこの説明に限定されるものではなく、種
々の応用が可能であることは以上に述べてきた内容から
も明らかである。

本発明に適用しうる標識物質としては、例えば、酵素、
酵素基質、酵素及び酵素前駆体の活性を変化させる物質
（酵素阻害物質、補酵素、補欠分子族、酵素前駆体を活
性化する物質など）、蛍光物質、化学及び生物発光物質
、色素、色素前駆体（ロイコ色素など）などが挙げられ
、その代表的な例として下記に例示した物質を挙げるこ
とができる。特に好ましく用いられるのは、酵素である
。

例示標識物質： １　酵素 ＥＣ１，１，１，１アルコールデヒドロゲナーゼ１　、
１．　、１　、６　　グリセロールデヒドロゲナーゼ１
．１．１．８　　グリセロール−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　”） １．１゜１．２７　　乳酸デヒドロゲナーゼ１．１．１
．３７　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１．１．１．４０
　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　”） １．１．１．４７　　グルコースデヒドロゲナーゼ１．
１．１．４８　　ガラクトースデヒドロゲナーゼ１、　
、１　、１　、４９　　グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ １．１．２．３　　乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロー
ム） １．１．３．１　　グリコール酸オキシダーゼ１．１．
３．２　　乳酸オキシダーゼ ！、１．３．４　　グルコ−人オキシグーゼ１、．１．
３．６　　コレステロールオキシダーゼ１．１．３．９
　　ｆｆラクトースオキシダーゼ１．１．３．１７　　
コリンオキシダーゼ１．１．．３．−　　Ｌ−α−グリ
セロリン酸オキシダーゼ １．２．］、１　　ホルムアルテ゛ヒトヂヒドロデナー
ゼ １．２，１．１２　　　グリセルフルデヒトリン酸デヒ
ドロデナーゼ １．２．３．２　　キサンチンオキシダーゼ１．２，３
．３　　ピルビン酸オキシダーゼ１．２．３．４　　オ
キサル酸オキシグーゼ１、．３．３．−　アシルＣｏＡ
オキシダーゼ１．４．１．　ｌ　　アラニンデヒドロデ
ナーゼ１．４．１．３　　グルタミン酸デヒドロデナー
ゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　（ｒ’）” １．４．１．４　　グルタミン酸デヒドロデナーゼ（Ｎ
　Ａ　Ｄ　Ｐ“） １、．４．３．２　　Ｌ　−７ミ／酸オキシグーゼ１．
４．３．３　　Ｄ−アミノ酸オキングーゼ１．４，３．
４　　アミンオキシダーゼ（７ラビン含有） １．４，３．６　　アミンオキシダーゼ（銅含有）１．
５，１．３　　テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ １．５．３．１　　ザルコシンオキシダーゼ１．６，４
．２　　グルタチオンレグクターゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　（Ｐ
）Ｈ） １．６，４．３　　ノヒドロリボアミドレグクターゼ（
ＮＡＤす）（ノアホラーゼ） １．７．３．３　　尿酸オキシダーゼ １．１１．１．６　　カタラーゼ １．１１，１．７　　ベルオキシングーゼ１．１３．１
２．４　　乳酸−２−モ７オキシデナーゼ１．１３．１
２．５　　　Ｒｅｎｉｌｌａルシフェリン−２−モノオ
キシデナーゼ １．１３，１２．６　　　Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェ
リン−２＝モ／オキシデナーゼ Ｌ、１３．１２．７　　　Ｐ　ｂｏＬｉｎｕｓルシフェ
リン−４−モノオキシゲナーゼ（ＡＴＰ 加水分解） １．１４．１３．２　４−ヒドロキシ安息香酸３−モノ
オキシゲナーゼ １．１４．９９．２１　　Ｌ　ａｔｉａルシフェリンモ
ノオキシゲナーゼ ２．１．３．１　　メチルマロニルＣｏＡカルボキシト
ランスフェラーゼ ２．３．２．２　　γ−グルタミルトランスフェラーゼ ２．７．１．１　　へキソキナーゼ ２．７．１．２　　グルコキナーゼ ２．７．１．１５　　リボキナーゼ ２．７．１．２８　　）リボキナーゼ ２．７．１．４０　　ピルビン酸キナーゼ２．７．５．
１　　ホスホグルコムターゼ３．１．１．３　　アリル
エステラーゼ３．１．１．４　　ホスホリパーゼＡ。

３．１．１．７　　アセチルコリンエステラーゼ３．１
．１．８　　コリンエステラーゼ３．１Ｊ、ｌ　　アル
カリホスファターゼ３．１．３．２　　酸ホスファター
ゼ ３．１．３．９　　グルコース−６−ホスファターゼ ３．１．３．１１　　フルクト−スジホスファターゼ：
１．ｌＪ、２１　　グリセロール−１−ホスファターゼ ３．１．４．１　　ホスホジェステラーゼＩ３．１．４
．３　　ホスホリパーゼＣ ３，２，１，Ｌ　　　α−アミラーゼ ３．２．１．２　　　β−アミラーゼ ３．２．１．１７　　ライゾザイム ３．２．１．１８　　ノイラミニダーゼ３．２．Ｌ、２
Ｑ　　α−Ｄ−グルコシダーゼ３．２．１．２１　　β
−Ｄ−グルコシダーゼ３．２．１．２３　　β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ３．２．１．３５　　ヒアルロノグルコ
サミニダーゼ３．４．ＬＬ、６　　アルギニンアミノペ
プチダーゼ３．４．２２．４　　プロメライン ３．５．１．１　　アスパラギナーゼ ３．５．１．５　　ウレアーゼ ３．５．４．２　　アデニンデアミナーゼａ、５．４．
４　　アデノシンデアミナーゼ３．５．４．６　　ＡＭ
Ｐデアミナーゼ４．１．１．３　　オキサロ酢酸デカル
ボキシラーゼ ４．１．１．４Ｌ　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキシ
ラーゼ ４．１．２．１３　　フルクトースニリン酸アルドラー
ゼ ４．２．１．２０　　　）リプトファンシンセダーゼ５
Ｊ、１．９　　　グルコースリン酸イソメラーゼ６．３
．４．１４　　ビオチンカルボキシラーゼ６．４．１．
１　　ピルビン酸カルボキシラーゼ６．４．１．’２　
　アセチル−ＣＯＡカルボキシラーゼ ６．４．１．３　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラ
ーゼ（ＡＴＰ−加水分解） ６．４．１．４　　メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキ
シラーゼ ６．４．１．５　　ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラー
ゼ　　　　　　　　等 ２、基質（発光物質を含む） ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド０−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトシド４−メチルウンベリフ
ェロン−β−Ｄ−ガラクトシド ｐ−ニトロフェニルホスフェート コルチゾール−２１−ヘミスクシネート　ウンベリフェ
ロン　コンジュゲート ルミノール イソルミノール Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチル　イソルミノー
ル　ヘミスクシンアミド Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノー
ル Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチル　イソルミノー
ル ルシゲニン アクリジニウム　フェニルカルボキシレートロフィン ピロガロール 没食子酸 ノロキシン ビス（２，４，６−ドリクロロフエニル）オキサレート
及びその誘導体 ３、酵素阻害物質 フィソスチグミン メチオニン　スルホキシミン ワイルドファイア（ｗｉ　ｌｄｆ　１ｒｓ）ブルーデキ
ストラン ０−ジアニシジン−セルロース ０−ジアニシジン−デキストラン ２−プロピニルアミン ２−クロロアリルアミン フェニルグリシン ｐ−ニトロフェニルグリシン アミノアセトニトリル ２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル１３′−カルボキ
シ−３′−アミノ−１′−プロペニル−１エーテル Ｌ−２−アミノ−４−メトキシ−トランス−３−ブテン
酸 エタノールアミン−〇−サルフェート アルビシイン アザセリン ジアゾオキソノルロイシン ジアゾオキソノアノルバリン Δ″−７−アミツセフアロスボリン酸 ミモシン ２−アミノ−４−ペンチン酸 ２−アミノ−４−クロロ−４−ペンテン酸３．３−ジク
ロロアラニン ３．３．３−）−リクロロアラニン Ｄ−シクロセリン ２−ヒドロキシル−３−ブチン酸 Ｎ、Ｎ−トリメチル−２−プロピニルアミンβ−アミノ
プロピオニトリル ２−ブロモエチルアミン ３−デシノイル−Ｎ−アセチルシステアミン２．３−デ
カシイノイル−Ｎ−アセチルシステアミン β−クロロ−Ｌ−アラニン Ｌ−セリン−０−サルフェート β−フルオロアラニン し−ビニルグリシン Ｄ−ビニルグリシン プロパルギルグリシン ガバクリン ５−ニトロ−し−ノルバリン Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−２−プロピニルアミン ３−ジメチルアミノ−Ｉ−プロビン グリセロール ジイソプロピルホスホロフルオライド フェニルメタンスルホニルフルオライドクラプラン酸 アロプリノール ブヂルチン ヨード酢酸 ヨードアセトアミド ベスタチン ピリドキサールリン酸 ヒドラジンとその誘導体 ニトロフランとその誘導体 ニトロベンゼンとその誘導体 プリン誘導体 キレート化剤 フェニル水銀とその誘導体 １、補酵素・補欠分子族 ＦＡＤ（フラビン・アデニン・ジヌクレオチド） ＰＭＮ（フラビン・モノヌクレオチド）ヘム Ｓ−アデノシルメチオニン ＴＨＦ（テトラヒドロ葉酸） ＴＰＰ（チアミンニリン酸） ＣｏＡ（補酵素　Ａ） ＵＤＰ−（ｌｃ（ウリジンニリン酸グルコース）ＰＬＰ
（ピリドキサールリン酸） ΔＴＰ（アデノシン三リン酸） ビオチン ＣｏＩ　にコチンアミドアデニンジヌクレオチド） ＣｏＩＩにコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
） アデノシルコバラミン メヂルコバラミン ＣｏＭ（２，２’−ジチオジエタンスルホン酸）ＣｏＱ
（ユビキノン） ５、アポ酵素 アポグルタチオン還元酵素 アポチトクローム還元酵素 アポＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈデヒドロゲナーゼアポグルコー
ス・オキシダーゼ アポリボアミド・デハイドロゲナーゼ アボビリドキシン・ホスフェート・オキシダーゼ アポペルオキシダーゼ アポチトクロームＣ アポキサンチンオキシダーゼ アポ酵母乳酸デヒドロゲナーゼ アポサルコシンオキシダーゼ アポルーヒトしキシ安息香酸ヒドロキシラーゼアポアシ
ル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ アポジヒドロリボ酸デヒドロゲナーゼ アポコハク酸デヒドロゲナーゼ アポホモシスティンメチルトランスフェラーゼアポグル
タミン酸ホルミルトランスフエラーゼアボトランスケト
ラーゼ アポコリンアセチルトランスフェラーゼアポグリコーゲ
ンシンターゼ アポアラニンアミノトランスフェラーゼアポへキソキナ
ーゼ ６、酵素前駆体を活性化させる物質 エンテロペプチダーゼ ストレプトキナーゼ プロティンキナーゼ 酵素前駆体の各種プロテアーゼ ７、酵素前駆体 トリプシノーゲン キモトリプシノーゲン プロコリパーゼ プロホスホリパーゼ　　　′ プロレニン プロカルボキシペプチダーゼＡ プロカルボキシペプチダーゼＢ キニノーゲン プロエラスターゼ アンギオテンシノーゲン プロインシュリン プロパラチロイドホルモン プログルカゴン プロコラーゲン（可溶性） 凝集因子　可、■、ＸＩ プロコラゲナーゼ プロココーナーゼ プレカリクレイン ペプシノーゲン プラスミノーゲン フィブリノーゲン プロトロンビン プラスミノーゲンプロアクチベータ プロアクロジン ８、蛍光物質 フルオレセイン　イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）テト
ラメチルローダミン　イソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ
） ローダミンＢ　イソチオシアナート　（ＲＢＩＴＣ）リ
サミンローダミンＢ２００スルホリル　クロライド　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　（ＲＢ２００ＳＣ）ウンベリフェロン ４−メチルウンベリフェロン　　　　（４Ｍｔｌ）フル
オレセインチオフルバミル　　　（ＦＴＣ）フルオレセ
インチオカルバミル−ジフェニルグリシン　　　　　　
　　　　（ＦＴＣ−ＤＰＧ）テトラメチルローダミン　
　　　　　（ＴＭＲ）５−（（４，６−シクロロトリア
ジンー２−イル）−アミノコフルオレセイン ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニルクロライド
　　　　　　　　　　（ＤＮＳ　−Ｃ１，”）フルオラ
ム ２−メトキノ−２，４−′）フェニル−３（２Ｈ）−フ
ラノン　　　　　　　　　　　　　（ＭＤＰＦ）７−ク
ロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾ
ール　　　　　　（ＮＢＤ　−Ｃｆ２）ｌ−アニリノ−
８−ナフタレンスルホン酸（ＡＮｓ） Ｎ−（３−ピレン）−マレイミド　　　（ＮＰＭ）Ｎ−
（７−シメチルアミノー４−メチル−２−オキシ−３−
クロロメチル）−マレイミド（ＤＡＣＭ） Ｎ−（ｐ−２−ベンズイミダゾイル−フェニル）−マレ
イミド　　　　　　　　　　（Ｂ　Ｉ　ＰＭ）アントラ
センイソチオシアナート フルオロアンチルマレイミド　　　　（ＦＡＭ）希土類
元素を含む各種キレート及びそれらの誘導体 本発明の測定方法で使用される特定成分、該特定成分の
類祿体及び該特定成分に特異的に結合する物質と標識物
質との結合物及び生物活性物質または、該生物活性物質
と特異的に結合する物質との結合物は、それぞれ標識物
質の活性及び前記物質の特異的結合能力を保持したまま
結合されていればよく、その方法として化学的手段等が
用いられる。その方法としては、石川栄治、回合　忠、
宮井潔編「酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、１
９７８年刊）や日本臨床病理学会ｓｒ臨床病理」臨時増
刊特集第５５号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技
術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年刊）などに
記載された方法をあげることができる。

具体的な例としては、グルタルアルデヒド法、過ヨーソ
酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、活性
エステル法、イソチオシアネート法等が挙げられる。

本発明において標識物質と特異的に結合して、該標識物
質に起因する信号を変調させる物質は、使用する標識物
質に対応して選ばれるべきものであり、下記のような物
質を例に挙げることができる。

１、標識物質が「酵素」である場合 ・標識物質に起因する信号 該酵素活性による基質の減少、生成物の増加、エネルギ
ーの放射及びそれらに起因する変化。

・好ましい物質 該酵素に対する阻害剤（前記例示標識物質に挙げた阻害
物質から該酵素に対応するものを選んで使用できる。） 該酵素に対する抗体で、酵素に結合してその活性に影響
を与えるもの。

２、標識物質が１酵素基質」である場合・標識物質に起
因する信号 該基質が分析素子中に添加された酵素と反応することに
より生ずる生成物の増加、エネルギーの放射及びそれら
に起因する変化。

・好ましい物質 該基質に対する抗体で、基質に結合することにより該酵
素反応を阻害するもの。

該基質を不可逆的阻害剤として取り込む酵素。

該基質を基質とする酵素で、その反応により本来検出し
ようとしている信号を発しないもの。

３、標識物質が「補酵素」又は「補欠分子族」である場
合 ・標識物質に起因する信号 分析素子中に添加された該標識物質を必要とする酵素の
反応による基質の減少、生成物のｉ加及びそれらに起因
する変化。

・好ましい物質 該標識物質に対する抗体で、該標識物質に結合してその
活性に影響を与えるもの、該標識物質を吸収又は消費す
るが、その活性により本来検出しようとしている信号を
発しないもの。

４、標識物質が「アポ酵素」である場合・標識物質に起
因する信号 該標識物質はそのままでは信号を発しない。

後述の吸収物質と結合して酵素活性を発現し、その活性
による基質の減少・生成物の増加及びそれらに起因する
変化を測定できる。

・好ましい物質 該標識物質の酵素活性を発現させる補欠分子族。（前記
例示した補欠分子族から該標識物質に対応するものを選
んで使用できる）５、標識物質が「酵素前駆体を活性化
させる物質」である場合 ・標識物質に起因する信号 該標識物質が、分析素子中に添加された酵素面駆体を活
性化し、その活性による基質の減少、生成物の増加及び
それらに起因する変化。

・好ましい物質 該物質に対する抗体で、該物質に結合してその活性に影
響を与えるもの。

該物質が酵素である場合、その阻害剤。

６、標識物質が［酵素前駆体」である場合・標識物質に
起因する信号 該標識物質はそのままでは信号を発しない。

後述の吸収物質にいったん結合後分子の一部が切断され
酵素活性を発現し、その活性による基質の減少、生成物
の増加行びそれらに起因する変化を測定できる。

・好ましい物質 該標識物質の酵素活性を発現させる物質７、標識物質が
「蛍光物質」である場合・標識物質に起因する信号 該蛍光物質に励起光をあてた際に発する蛍光。

・好ましい物質 該標識物質に対する抗体及びその誘導体で、該標識物質
の蛍光波長・強度を変化させるもの。

上記の各種物質の具体例はいずれも当業者によく知られ
ており、あらためて開示するまでもないが本発明に理解
を助けるために、代表的な例を以下に示す。

本発明に使用しうる酵素と阻害剤の組み合せとしては、
ＳＨ酵素（グルコースオキシダーゼ、コリンオキシダー
ゼ、グリコール酸オキシダーゼ、グリセロール−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、リン酸デヒドロゲナーゼ、グル
タルミン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、など）とフ
ェニル水銀誘導体、グルタル酸デヒドロゲナーゼとイソ
フタルＷｌ誘導体、α−アミラーゼとアミラーゼインヒ
ビター、エステラーゼとベスタチン、ビオチン酵素（ピ
ルビン酸カルボキシラーゼ、アセチルＣｏ−Ａカルボキ
シラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、メ
チルマロニル−ＣｏＡカルボキシラーゼなど）とアビジ
ン、ペルオキシダーゼ°と　０−シアニジン−デキスト
ラン、乳酸オキシダーゼと２−ヒドロキシル−３−ブチ
ン酸、モノアミンオキシダーゼとＮ、Ｎ−）ジメチル−
２−プロピニルアミン又はβ−アミノプロピオニトリル
などが挙げられ、更にジャーナルオブジアメリカンケミ
カルソサイアティ−（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

５ａｃ）第８０巻、第４５６頁（１９５８年）二同第８
２巻、第５９６頁（１９６０年）：アカウンツオフケミ
カル　リサーチ（Ａｃｃ、Ｃｈｅｍ、Ｒｅ５）第９巻、
３１３頁（１９７６年）：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）第１８５巻３２０頁（１９７４年）：化学工業１９８
５第２１頁（１９８５年）などに記載された、若しくは
引用された酵素・阻害剤の組合せも好ましく用いること
ができる。

本発明に用いられる生物活性物質または生物活性物質と
特異的に結合する物質及び標識物質と特異的に結合し該
標識物質に起因する信号を変調させる物質の固定化物は
、種々の公知の方法によりこれらの物質をアフィンクロ
マトグラフィー、固定化酵素、免疫学的測定法に用いら
れる担体の表面に物理的に吸着させるか、化学反応によ
り直接あるいは間接的に結合させることにより作成され
る。その際、該物質の該特定成分に対する特異的結合性
が失われないように留意する必要があり、例えば石川栄
治、何台　忠、宮井潔編「酵素免疫測定法（第２版）」
（医学書院、■９７８年刊）や千畑一部、土佐四組、松
尾雄志著「実験と応用アフイニテイクロマトグラフイー
Ｊ　（ａ談社、１９７６年刊）に記載されている方法を
好ましい方法の例として挙げることかできる。また上記
の方法以外に、固定化酵素の製法に用いられる方法、例
えば千畑一部編「固定化酵素」（講談社、１９８１年刊
）も挙げられる。

本発明に用いられる担体としては、デキストランポリマ
ー、アガロース、セルロース、ゼラチン、アクリルアミ
ド、ガラスピーズ、ポリスチレンビーズ、特開昭５５−
９０８５９号の輸送用粒状構造物、特開昭５７−１０１
７６０号、同５７−１０１７６１号、同５８−７０１６
３号に記載されている自己結合型粒子結合体、繊維質多
孔性材料等が挙げられる。

本発明の固定化物の組み合仕は、生物活性物質と標識物
質と特異的に結合して該標識物質に起因する信号を変調
させる物質、該生物活性物質と特異的に結合し得る物質
と標識物質と特異的に結合して該標識物質に起因する信
号を変調させる物質である。

このように二つの固定化物を用いるのは、溶液中でＢ／
Ｆ分雌を行うためと、標識物質に起因する信号を変調さ
せるためである。また一方の固定化物と結合反応生成物
を形成するとらう一方の固定化物と結合させないためで
もある。この場合一方を固定しない状態で用いると結合
反応生成物と更に結合し、測定ができなくなる。

これらの固定化物は、一方の固定化物か結合反応生成物
を形成するともう一方の固定化物と結合しないように固
定化されていればよく、担体及び固定化方法は特に問わ
ない。

本発明に用いられる標識物質に起因する信号の測定方法
は、標識物質の種類によって異なる。例えば標識物質が
蛍光物質であれば励起光をあて、蛍光強度を測定すれば
よい。標識物質が酵素であれば適当な基質、必要ならば
酵素、発色系を含む溶液を添加し、一定時間インキュベ
ートした後に該発色系に適合した波長の光・（基質の種
類によっては蛍光強度、発色強度）を測定することによ
り信号強度を測定できる。このような目的で用いられる
基質、発色系は、Ｗ識物質として用いる酵素の種類に従
って公知の方法から適当なものを選択できる。過酸化水
素及びＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨの関与する酵素系及び発色
系が好ましい組合せの例である。

本発明の測定方法は、温和なｐＨで実施される。

一般に特定成分の濃度変化に対する応答、各結合反応、
酵素反応等の検出反応が起りやずいｐＨに近いＩ）　Ｈ
で行なわれる。ｐＨの調整に用いられる材料としては、
適当に緩衝させた水溶液、固定化物、標識酵素の基質な
どである。

水性媒体には、他の極性溶媒（アルコール、エーテルな
ど）を含有していてもよく、これらの１は重量２０％以
下である。水性媒体のｐＨは５〜１０の範囲であり、好
ましくは６〜８．５の範囲である。

所望のｐＨを達成し、測定中にこのＩ）Ｈを維持するの
に各種の緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩
、トリス、バルビタール、グツド緩衝剤などがある。測
定温度は４〜４５℃で行うが、通常は１５〜４５℃であ
る。

本発明の測定方法は、競合法、サンドイツチ法、二抗体
法において適用が可能である。

次に、反応型式が競合法である場合の本発明の測定原理
をｆｊＳ１図に従って説明する。

固定化担体に生物活性物質５または生物活性物質と特異
的結合する物質７を固定化し、固定化物へとする。また
、標識物質と特異的（こ結合し、標識物質に起因する信
号を変調させる物質８を固定化し固定化物Ｂとする。固
定化物Ａ及びＢ、液体試料中の特定成分１、該特定成分
１と標識物質２どの結合物３（以下標識体）、及Ｃ／該
特定成分と特異的に結合する物１１１４と生物活性物質
５との結合物６を水溶液中に共存させると、特定成分１
、標識体３、結合物６は液相に存在しているために、こ
れらの結合反応（１と６または３と６）は、固液反応系
となる固定化物へと結合物６の結合反応（結合部位は５
と７）、固定化物Ｂと標識体３の結合反応（結合部位は
２と８）よりも十分に速く起こるために、液相の結合反
応が優先的に起こると考えられる。よって結果的には、
上記の固液反応は起らず、液相系の反応が十分量起った
後に、別の固液系の反応が起こる。ａ相系の結合反応の
結果、液相に存在する未反応の標識体３特定成’ｔ＞　
１と結合物６との結合反応生成物９はそれぞれ未反応標
識体３は固定化物Ｂと結合反応（結合部位は２と８）し
、結合反応物９は、固定化物Ａと結合反応（結合部位は
５と７）する。また、標識体３と結合物６との結合反応
生成物１０は、固定化物ＡまたはＢと結合反応が可能で
あるが、５と７の結合力が２と８との結合力よりも強い
組み合せを選択することにより、固定化物Ａと優先的に
結合させることが可能である。このように、特定成分ｌ
及び特定成分と標識物質との標識体３の夫々に対する結
合物６との結合反応生成物９とＩＯは固定化物Ａに、未
反応の標識体３は固定化物Ｂにそれぞれ分離（［３／Ｆ
分離）することができる。標識体３の標識物質２は固定
化物Ｂと８との結合により標識に起因する信号が変調さ
れるので、流体試料中の特定成分の濃度と標識物質全体
の信号強度の間には、関数関係が成立する。そこであら
かじめ特定成分の濃度がわかっている流体試料（標準試
料）を数種類用いて検量線を作成しておけば、未知の液
体試料中の特定成分の濃度を知ることができる。

この測定法では溶液中に上記の物質が共存していればよ
く、その添加順序は問わない。

本発明の測定方法は、特定成分と結合しない生物活性物
質もしくは該生物活性物質と特異的に結合する物質のい
ずれか一方及び標識物質又は該標識物質と特異的に結合
して該標識物質に起因する信号を変調させる物質をそれ
ぞれ担体に固定化した該物質の固定化物を用いることに
より、簡単な操作で低分子から高分子物質までの特定成
分の測定が可能となり、かつ測定域も広く高感度も達成
された。

〔実施例〕

以下本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例によって限定されるものではない
。

実施例　ｌ。

（１）　　生物活性物質の固定化 粉末；！ＥＤ（東洋ｊ紙社製）１００９を、ブタンジオ
ールジグリシジルエーテル（米国アルドリッチ社製）２
５０ｎ（２と、２ａ＋ｙ／ａｒＱの水素化ホウ素ナトリ
ウムを含む０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２５０＋ａ
１２との混合液中に！＠蜀し、４０℃にて５時間半振盪
撹拌した後、純水約５Ｑで洗浄し、乾燥させた。

この官能基を持つ粉末；？４１ＥＤｔｏ９を、１０ｈｇ
のアビジン（米国カッペル社製）を含む０．５Ｍ炭酸ナ
トリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，８）
１０Ｏｎ＋１２に懸濁し、４０℃にて１２時間振盪撹拌
した。

これを１過し、ペレットを純水５００ｍ１２．０．５Ｍ
塩化ナトリウムを含むＯ，１Ｍ炭素水素ナトリウム溶液
５００ｍＱ、　０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むＱ、１Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，１）　５０ｈ１２にて
交互に洗浄した後、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
５）　３００ｍ１２に懸濁し、２５℃２４時間振盪撹拌
して未反応基をブロックした。これをｊ遇し、ペレット
を純水約２Ｑで洗浄し、アビジン固定化粉末１紙りを得
た。

（２）標識体（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識ヒト
ＩｇＧ）の作成 グルタミン酸デヒドロゲナーゼｌｏｍｇを１．１．２５
％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（＋
）Ｉ−１６，８）０．２ｍ１２に加え、室温にて１０時
間ゆるやかに撹拌して反応させた。これをあらかじめ０
．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化したセファデック
スＧ−２５カラム（１，ＯＸ　５５ｃｍ）に通し、グル
タルアルデヒド活性化グルタミン酸デヒドロゲナーゼ画
分を回収した。この画分１．ｏａ＋１２にヒトＩ　ｇＧ
　＜米国カッペル社製）を５ａ＋９含むＯ，１５Ｍ塩化
ナトリウム溶液１．０ｍ１２及び、１Ｍ炭酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ９，５）０．１ｓ（２を加え、４℃２４時
間反応させた。この溶液に０．２Ｍリジンを０．１ｍ１
２加え、さらに４℃にて２時間反応させた後、０．１５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，６）で平衡化したＵｌｔｒ。

−ｇｅｌ　ＡｃＡ−３４カラム（１，５ｘ　ｌｏＯｃｍ
）に通し、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識ヒトＩｇ
Ｇを得た。

（３）ヒトＩｇＧの測定 キュベツトにアビジン固定化粉末１紙Ｄ　１０ｍｇ。

アフィゲル−５０１（１）−クロロマーキュリ−アニリ
ンをアガロースに固定化したもの；バイオ−ラッド社製
）ｌＩｌｌｇ、及び０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７，６）０．３ｍ（２を加え、３７℃で５分間プ
レインキューベットした後、同緩衝液に溶解したＱ、１
ｍｇ／ｍＱビオチン・坑ヒトＩｇＧ抗体（米国カッベル
社製）　５０μＱを加え、さらに同緩衝液に溶解したｌ
μｇ／　ｍＱグルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識ヒトＩ
ｇＧと未標識ヒトｒ　ｇＧ　１０〜６４０μｇ／　ｍ（
！、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，６）
とを等量混合した溶液５０μｇを加え、３７℃で３０分
インキュベートした。この溶液に下記の組成の発色液を
加え、３７℃で１０分インキュベートし、溶液の３４０
ｎｍの吸光度を測定した。

０．１Ｍ　ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）　　２
．５ｍ＋！２０＋１１Ｍ　Ｎ　Ａ　Ｂ溶液　　　　　　
　　　０．３ｍ（２１，５Ｍグルタミン酸ナトリウム溶
液　０．２ｍ（！＊ＮＡＤ：酸化型ニコチンアミドアデ
ニンヌクレオチド その結果を表１に示した。

表　　１ 表１に示したように、本測定方法を用いることによって
煩雑な物理的離操作を行うことなく、溶液内でＢ／Ｆ分
雌をすることすができ、良好な検量線を得ることができ
た。

実施例　２ （１）　　生物活性物質の固定化 実施例１−（１）と同様にアビジン固定化粉末１紙りを
得た。

（２）標識体の作成 実施例１−（２）と同様にグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ標識ヒト［ｇＧを得た。

（３）　ヒトＩｇＧの測定 キュベツトにアビジン固定化粉末１紙Ｄ　１０ａｇ、ア
フィゲル−５０１１１１ｇ、実施例１−（３）と同組成
の発色液を加え、３７℃で５分間プレインキューベート
した後、０．１ｍｇ／ｍＲビオチン坑ヒトＩｇＧ抗体（
０，０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（＋）Ｈ７，６））
　５０μｇを加え、さらに１μｇ／　ＩＩＱグルタミン
酸デヒドロゲナーゼ標識ヒトＩｇＧ　（０，０１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝１（１）Ｈ７，６）と０〜６．４０μ
ｇ／　ｆＩｌ１２未標識１ｇＧ。

（０，０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（＋）Ｈ７，６）
）とを等ｍ混合した溶液５０μＱを加え、３７℃で１０
分インキュベートした。この溶液の３４００…の吸光度
を測定した。

この測定結果を表２に示した。

表　　２ ０　　　　　　　　　　　　　１．０３５　　　　　　
　　　　　　　０．９６１０　　　　　　　　ｊ　　　
　０．８３以上の結果から明らかなように、本測定方法
を用いることにより、煩雑な物理的分離操作を行うこと
なく、溶液内でのＢ／Ｆ分離が行なｔ）汽ヒトＴｇＧ濃
度０〜６４０μｇ／ｍ１の範囲で良好な検量線を得るこ
とがでさた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の測定法の俣式説明図である。 出願人　小西六写真工業株式会社 第１図 ！・・・特定成分 ２・・・標識物質 ３・・・特定成分と標識物質の結合物（標識体）４・・
・特定成分と特異的に結合する物質５・・・生物活性物
質（または生物活性物質と特異的に結合する物質）６・
・・特定成分と特異的に結合する物質と生物活性物質の
結合物７・・・生物活性物質と特異的に結合する物質（
または生物活性物質）訃・・標識物質と特異的に結合し
、標識物質に起因する信号を変調させる物質 ９・・特定成分と結合物６との結合反応生成物１０・・
・結合物３と結合物６との結合反応生成物Ａ・・７の固
定化物 Ｂ・・８の固定化物 ５、補正の対象 手続補正書 昭和６１年　５月１６日 特許庁長官　　殿　　　　　　　　　　　　、２．。 １、事件の表示 ／　／　　／　、ｒ’　”・：；ゝ４ 昭和６１年４月２２日付特許願（２） ２、発明の名称 免疫学的測定法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　東京都新宿区西新宿１丁目２６番２号連絡先 〒１９１ 東京都日野市さくら町１番地 小西六写真工業株式会社（電話０４２５−８３−１５２
１）特　　許　　部 手続補正書 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 明細書の第２４頁第１２行と同第１．３行の間に「５−
アミノイソフタル酸」を加入する。 昭和６２年４月　６日 特許片長「　　殿 昭和６１年特許願１９３９８６号 ２．９．明の名称 免疫学的測定法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　東京都新宿区西新宿１丁目２６番２号連絡先 〒１９１ 東京都日野市さくら町１番地 小西六写真工業株式会社（？１１話０４２５−８３−１
５２１）特　　許　　部 ５、？ｌＩｌ正の討宋 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 明細書を下記の通り補正します。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）流体試料中の特定成分と結合しない生物活性物質
   又は該生物活性物質と特異的に結合する物質のいづれか
   一方、及び標識物質と特異的に結合して該標識物質に起
   因する信号を変調させる物質をそれぞれ担体に固定した
   固定化物を用いることを特徴とする流体試料中の特定成
   分の免疫学的測定法。
2. （２）前記流体試料中の特定成分を、前記標識物質が前
   記流体試料中の特定成分又はその類縁体に結合して成る
   標識体と；前記生物活性物質又は該生物活性物質と特異
   的に結合する物質のうち固定化されていない方が結合し
   た前記流体試料中の特定成分もしくはその類縁体と特異
   的に結合する物質；とを用いて競合反応によって測定す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫学
   的測定法。