JPS6325305B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 薬物、不純物、汚染物質などの多様な有機物質
の痕跡量に対する分析の重要性により、対象とな
る低濃度の化合物のより簡単で正確な測定法を提
供する努力がなされてきた。その１群は免疫分析
法と呼ばれ、これは特定の空間および極性構成を
有する化合物を識別する、すなわちこれに特異的
に結合することができる別の化合物、通常は抗
体、の能力に基いている。この特異的結合対はリ
ガンドおよび受容体（抗リガンド）と呼ぶことも
ある。

免疫分析の実施においては、検出可能な信号を
出すラベルでリガンドをラベルし、このラベルし
たリガンドを試料中のリガンドと限定された量の
抗リガンドに対して競争（拮抗）させるのが普通
である。免疫分析法は次いで結合したラベル化リ
ガンド／抗リガンドと溶液本体中で遊離している
解離したラベル化リガンドとの識別を行なう。結
合した信号ラベルの識別は、結合した信号ラベル
から結合していない信号ラベルを分離し、この両
区分のいずれか一方の信号ラベルの量を測定する
ことにより実施できる。

しかし、好ましい方法は分離を必要としない方
法を採用することである。すなわち、結合した信
号ラベルと結合していない信号ラベルの識別は、
両者の間で信号のレベルに実質的な差異があれ
ば、これを利用して識別できる。このような方法
の問題点の１つは、測定される信号ラベルが、バ
ツクグラウンドとなるか、または信号測定の非特
異的な妨害を生ずる恐れのある分析系内の物質か
ら分離されていないことである。

対象となる多くのリガンド、特にタンパク質、
多糖類、核酸などの大きな分子に関しては、リガ
ンドを純粋な状態で得ることは困難であることが
多く、時には不可能である。さらに、抗リガンド
が抗体である場合、抗体はグロブリン類との複合
混合物として一般に単離され、その一部、通常は
50％未満の部分が対象となる抗体である。このよ
うな不純なリガンドまたは抗リガンドをラベルす
る場合、ラベルの実質的部分がそのリガンドまた
は抗リガンド以外の分子に結合されてしまう。こ
れらのラベルも検出可能な信号を出すことがで
き、このような信号は測定のバツクグラウンドと
して作用しよう。すなわち、このようなラベル
は、リガンドまたは抗リガンドに結合したラベル
から得た値に対して付加される基底値となる。２
つの大きな値の間である小さな値を測定する場
合、実質的な誤差と不確実性が入つてくる。たと
えば、ラベルに影響する非特異的な作用がある場
合、リガンドまたは抗リガンドに関連しない多量
のラベルが存在すると、各試料ごとの基準
（sample−by−sample basis）でその非特異的作
用に基く変動幅が著しく大きくなる。

したがつて、分析に関与するリガンドまたは抗
リガンドに結合し、分析における被分析物の量に
関係するラベルと、リガンドまたは抗リガンドに
付随しないで存在しているラベルとの識別を可能
にする方法を提供することが望ましい。このよう
な方法は、媒質中の被分析物の量に関連する信号
を出すラベルと、媒質中の被分析物の量に関連し
ないラベルから出ている信号とを識別できなけれ
ばならない。

なお、本発明に関連する従来技術としては次の
ようなものがある。EngasserとHorvath、
Applied Biochem.Bioengineering、１、127
（1976）Academic Pressは、酵素固定化に対す
る速度論的および拡散の効果を報告している。米
国特許第3817837には均質酵素免疫分析法が記載
されている。米国特許第3996345は、ケイ光体と
消光体という関係にある２種類の発色物質を使用
した均質免疫分析法を記載している。米国特許出
願第815636はラベルとして非酵素性触媒を使用し
た均質免疫分析法を記載し、一方米国特許出願第
815632は免疫分析における信号の変調手段を記載
している。同第906514は免疫分析用のラベルした
液体不連続相を記載し、同第667996はラベルとし
て酵素基質を使用した均質免疫分析法を記載して
いる。米国特許第3853987は放射性のケイ光体ラ
ベルと抗体を結合する粒子を開示している。米国
特許第4001400と米国特許出願第964099も免疫分
析に関連する。

本発明は、特異的結合対、すなわちリガンドと
その同族の受容体（抗リガンド）のいずれか一方
である有機被分析物の存在を測定するための方法
および組成物を提供する。この方法は、発色性物
質のもつ、発色性物質がその発色活性を保有して
いる相と、その発色活性が抑制されている相との
間での分配能力に基き、この分配の程度は分析媒
質中の被分析物の濃度に相関する。

本発明の方法は次の３種類の試薬を使用する：
(1) 特異的結合対の一員と不溶性粒子との結合体
（粒子結合体）；(2) 信号発生系の一員であるラベ
ルを該特異的結合対の一員に結合したもの（信号
ラベル結合体）；および(3) 該ラベルと相互作用
して、このラベルの信号発生への寄与を抑制する
不溶性粒子である信号抑制体。

この分析の実施においては、被分析物を含有す
ることが疑われる未知試料、上記の３種類の試
薬、および補助試薬類を所定のプロトコルにした
がつて分析媒質中で混合し、分析媒質から信号ラ
ベルを変化率または平衡のいずれかの方式により
測定する。信号ラベル結合体が粒子結合体の同族
一員に結合すると、信号抑制体は粒子結合体と結
合しているラベルと相互作用することが妨害され
る。溶液本体中に残留する信号ラベル結合体は信
号抑体と相互作用し、この信号ラベルからの信号
発生の抑制を生ずる。粒子結合体に結合すること
のできる信号ラベル結合体の数は、分析媒質中の
被分析物分子の数と相関しよう。したがつて、観
測された信号レベルは分析媒質中の被分析物分子
の数と相関する。未知量の被分析物で測定された
信号レベルを既知の被分析物濃度を有する少なく
とも１つの分析媒質で得られた信号レベルと比較
することにより、未知試料の被分析物濃度は定性
的または定量的に測定できる。

本発明により、試薬組成物およびキツトも提供
される。キツトは、分析の感度および信頼性を実
質的に最適にする所定量の組成物および補助物質
を含む。

以下に本発明をより詳細に説明する。

本発明によると、低濃度の多様な有機物質を測
定するための高感度、正確かつ簡単な分析法が提
供される。対象となる物質には、生理的活性を有
するもの、生理的液体中に存在する薬物もしくは
天然化合物、疾病関連物質、夾雑物、汚染物質な
どがある。

この方法は分離工程を利用せず、実質的に均一
な分散を維持し、バツクグラウンドの妨害も低
い。この方法は、媒質中でリガンド受容体に直接
的または間接的に結合している信号ラベルとは無
関係の物質またはラベルからの信号が少なくなつ
ている。さらに、本発明の方法は、普通には不純
な状態で存在し、容易には精製しにくい被分析物
の場合に実質的な利点を与える。

免疫分析用の試薬の調製においては、リガンド
またはその同族受容体のいずれかをラベルするこ
とが一般に必要である。同族受容体は、特に抗体
である場合には、一般に特異的および非特異的免
疫グロブリン類の混合物である。多くの抗原で
は、低濃度の抗原になると、その精製または濃縮
は手間と費用がかかつて、非効率的である。した
がつて、特異的結合対の一員をラベルするとき
に、不純な混合物をラベルすることがよくある。

不純な混合物のラベルは多くの問題を生ずる。
その１つは、分析試薬とは無関係の偶発ラベルが
かなりの量で存在することである。第２の問題点
は、多量の偶発ラベルの存在下でリガンドまたは
抗リガンドに結合した信号ラベルを測定しなけれ
ばならないことである。第３の問題点は、被分析
物の量とは無関係の試料ごとの変動を生ずる恐れ
のある偶発信号ラベルの非特異的相互作用であ
る。

本発明の方法は、独特の試薬類の組合せにより
上記の問題点を緩和または解決する。その第１の
試薬は粒子に結合した特異的結合対の一員からな
る。高分子量の粒子を使用することにより、特異
的結合対成分ならびに不純物を粒子に結合し、各
粒子結合体が分析において活性試薬となるように
することが確実にできる。

第２の試薬は、特異的結合対の一員を信号発生
系の一員でラベルした信号ラベル結合体である。
特異的結合対の構成員は純粋でも不純でもよい。
分析においては、粒子結合体に結合している特異
的結合対のラベル化成分の量が媒質中の被分析物
の量に関連する。特異的結合対の成分に結合して
いるラベルだけが粒子結合体に結合することがで
きる。

第３の試薬として分析媒質に混入されるのは、
信号ラベルと相互作用してラベルによる信号の発
生を著しく阻害する信号抑制体である。信号抑制
体は不溶性粒子であつて、粒子結合体に結合して
いるラベルとの相互作用は妨害される。したがつ
て、溶液本体中に遊離しているラベルだけが信号
抑制体により著しく阻害される。未結合の信号ラ
ベル、特異的結合対の構成員以外の化合物に偶発
的に結合した信号ラベル、または粒子結合体に結
合していない特異的結合対構成員に結合した信号
ラベルは信号抑制体と相互作用し、その信号発生
への寄与は実質的に阻害される。このようにする
と、特異的結合対の１成分の比較的不純な混合物
は、大量のバツクグラウンド信号レベルを導入す
ることになる点を懸念せずにラベルすることがで
き、このようなラベルからの信号は信号抑制体に
より実質的に抑制されよう。

粒子結合体と信号抑制体が共に分離した不溶性
粒子である。特異的結合対の反対成分との非共有
結合によつて粒子結合体に結合している信号ラベ
ルとは信号抑制体が相互作用できなくなるよう
に、粒子の性質は選択される。

被分析物は、リガンドとその同族受容体からな
る特異的結合対の一方の成分である。粒子結合体
に使用される不溶性粒子は、特異的結合対の一方
の成分に直接または間接的に共有結合または非共
有結合により結合される。受容体が被分析物であ
る例外はある。この受容体の二元性のために、２
種の特異的結合対のカツプルが使用できる。たと
えば、この受容体被分析物により認識されるリガ
ンドを粒子に結合させて、粒子結合体を形成す
る。この受容体被分析物に対する受容体（抗受容
体）はラベルに結合して信号ラベル結合体を形成
する。この方法では、受容体の性質の二元性を利
用して、１種類の特異的結合対または２種類の特
異的結合対のいずれを使用するか選択できる。

本発明の方法を実施するには、適当な分析媒質
中で被分析物含有試料、粒子結合体、信号ラベル
結合体および信号抑制体ならびに任意のその他の
試薬を混合し、分析媒質からの信号を測定する。
信号の測定値を、既知量の被分析物を有する分析
媒質から得た信号と比較することにより、対象と
なる被分析物を定性的、半定量的または定量的に
測定することができる。この分析における顕著な
要素は、２種類の粒子状成分を使用し、これらは
その物理的構造のために、一方の粒子に結合した
分子と第２の粒子または第２の粒子に結合した分
子との間の相互作用を立体的に阻害することにあ
る。第２の粒子は、第１の粒子とは結合せずに溶
液本体中に遊離しているラベルと相互作用して、
このような信号ラベルによる信号発生を実質的に
阻害することができる。

次に本明細書で使用する用語の定義を述べる。

被分析物−測定すべき化合物または組成物；こ
れはリガンドであつてもよく、リガンドはモノも
しくはポリエピトープ（mono or polyepitopic）
抗原またはハプテン、少なくとも１個の共通エピ
トープ部位を共有する単一または複数の化合物或
いは受容体である。

特異的結合対−２種類の異なる分子；その一方
の分子は他方の分子の特定の空間および極性構造
に特異的に結合する部分をその表面上または空洞
内に有している。特異的結合対の両成分は、リガ
ンドと受容体（抗リガンド）と呼ばれる。

リガンド−それに対する受容体が天然に存在す
るか、製造することができる任意の有機化合物。

受容体（抗リガンド）−或る分子の特定の空間
および極性構造、すなわち決定素またはエピトー
プ部位を認識することのできる任意の化合物また
は組成物。受容体の例には、天然受容体、たとえ
ばチロキシン結合性グロブリン、抗体、酵素、
Fabフラグメント、レクチンなどがある。

リガンドアナログ（類似体）−類似リガンドと
或る受容体に対して競合できる変性リガンド；変
性はリガンドアナログを他の分子に結合するため
の手段となる。リガンドアナログとリガンドとの
相違は、１個の水素をリガンドアナログをハブ
（hub）またはラベルに結合する結合で置換した
というより以上の相違がさらにあるのが普通であ
る。

ポリ（リガンドアナログ）−複数のリガンドま
たはリガンドアナログを、普通にはハブ核に一緒
に共有結合させたもの。ハブ核は多官能性物質で
あつて、普通はポリマーであり、通常は結合用の
部位としてヒドロキシ、アミノ、メルカプト、エ
チレン二重結合などの複数の官能基を含有する。
ハブ核は水溶性でも不溶性でもよいが、好ましく
は水溶性であり、その分子量は一般に約35000以
上であつて、時には1000万以上にも達するが、通
常は600000以下、特に300000以下である。ハブ核
の例には、多糖類、ポリペプチド（タンパク質も
含む）、核酸、イオン交換樹脂などがある。水不
溶性のハブ核は、次の粒子に関して記載したもの
と同じであつてもよい。

粒子（不溶相）−特異的結合対の１成分と結合
させる粒子は不連続の分離した粒子であつて、こ
れは液相により膨潤したものでも、膨潤しないま
まのものでもよく、また固体でも液体でもよい。
粒子は疎水性または親水性の多様な物質からな
る。粒子の役割に応じて粒子は中実、中空または
多孔性でよく、その表面は実質的に平滑または不
規則で、主に凹凸面を有し、用途によつては多孔
性、すなわちチヤンネル（みぞ）、裂け目、へこ
みを有するものが好ましい。このような細孔は、
これにより排除されるか、または拡散速度が実質
的に影響を受ける分子またはアセンブリ−（集合
体）の寸法に関して広く変化させることができ
る。別の用途に対しては、粒子は平滑または不規
則表面を有する固体であるのが望ましい。粒子は
安定な分離した液体粒子（液滴）、たとえば表面
活性剤で安定化した分散された油粒子、リポゾー
ム（細胞内脂肪粒子）などであつてもよい。粒子
は水性媒質中で容易に分散可能であり、粒子結合
体に対しては、また場合によつては、信号抑制体
を他の分子への共有または非共有結合のために多
官能性化するか、或いはこれが多官能性化できる
ことが必要である。粒子結合体の粒子は、信号発
生系により発生する信号の検出に用いる波長、特
に300〜800nｍの範囲内の光に対して、好ましく
はこの範囲全体にわたつて、実質的に透明である
のが好ましい。

信号発生系−分析媒質中の被分析物の量に応じ
て変化する測定可能な信号の発生に関与する反応
物質と生成物。信号発生系は１または２以上の成
分を含有し、少なくとも１成分は粒子に共有結合
されていない特異的結合対成分に結合される。信
号発生系は外部手段、すなわち電磁波の測定によ
つて検出できる測定可能な信号を発生し、その信
号の量（レベル）は、信号ラベル結合体が固体相
粒子の環境にある程度で変動する。信号発生系は
発色団を含有し、発色団には紫外または可視領域
で光を吸収する色素、リン光体、ケイ光体、化学
ルミネセンス発光体、発光エネルギー受容体、色
原性酵素基質などがある。ケイ光体では、ケイ光
体は光またはエネルギー供与体分子により励起さ
れうるが、化学ルミネセンス発光体では励起は化
学反応の結果として起る。

ラベル−ラベルは特定の機能を有し、別の分子
または物質に結合される分子である。本発明で
は、ラベルは粒子（粒子結合体）に結合される特
異的結合対分子であるか、または特異的結合対の
１成分もしくは粒子に結合される信号発生系の一
部である分子である。

粒子結合体−粒子に特異的結合対の１成分およ
び適宜に信号発生系の１または２以上の成分を直
接または間接的に結合したもの。特異的結合対を
介して粒子に結合した信号ラベルは、粒子表面に
より、これに十分に接近した位置で影響されるの
で、そうでなければラベルと相互作用することの
できる信号抑制体は、ラベルとの相互作用に対し
て妨害される。したがつて、信号抑制体は粒子に
結合している信号ラベルとの相互作用が妨げられ
て、信号ラベルから出る信号に影響を与える。粒
子結合体はタンパク質の非特異的結合を最小限に
するために比較的非吸着性であるのが好ましい。

結合対ラベル−粒子に直接または間接的に結合
している特異的結合対成分。

信号ラベル−結合対成分または粒子に結合して
いる信号発生系の成分。

信号ラベル結合体−結合対成分と信号発生系の
１成分（信号ラベル）との結合体。

ラベル化リガンド−特異的結合対のリガンド成
分と信号発生系の１成分との共有結合または非共
有結合による結合体；共有結合の場合には、単な
る結合、結合基またはハブ核のいずれかにより結
合される。ラベル化リガンドは１もしくは２以上
のリガンド（リガンドアナログを含む）または１
もしくは２以上のラベル、或いは両者それぞれの
２種以上を含有していてもよく、後者はポリ（リ
ガンドアナログ）ポリラベルと呼ばれる。

ラベル化受容体−受容体と信号発生系の１成分
との結合体；両者は共有または非共有結合され、
通常は結合基による共有結合である。受容体に１
または２以上のラベルが結合されるか、または１
個のラベルに１または２以上の受容体が結合され
る。

信号抑制体（signal represser）−水不溶性の、
任意に膨潤性であつてもよい粒子；これは中実、
中空または多孔性でよく、平滑または不規則表面
を有し、分子量は一般に不定であり、架橋または
非架橋物質であるが、架橋されていることが多
く、対象とする波長範囲内で吸光性を有し、特異
的タンパク質結合を受け、またはこれを受けず、
結合に対して多官能性化または非官能性化され、
信号ラベルと相互作用してこのようなラベルによ
り生ずる信号を減ずる特異的化合物に結合されて
いるか、されていない。この粒子は、結合対成分
に結合している信号ラベルおよび非特異的不純物
（これが存在する場合）に結合している信号ラベ
ルに対して親和性または吸着能を有していても、
有していなくてもよいが、信号ラベルに親和性を
有しない場合には、これを信号ラベルまたは信号
ラベル結合体に親和性を有する化合物と結合させ
ておく。信号抑制体は、その粒子の固有の特性の
ために、或いはその粒子に結合された特定の官能
基または化合物のために、その作用効果を発現す
る。信号抑制体は、これに並置または結合されて
いる信号ラベルが発する発光を阻害する作用をす
る。

方 法 本発明の分析法は、一般に最高分析感度に近い
温和なPHの水性帯域中で、分析成分または生成物
の分離を行なわずに実施される。被分析物の測定
用の分析帯域は、適当な水性媒質（普通は緩衝剤
を含有）、未知試料（予備処理を行なうこともあ
る）、粒子結合体、信号ラベル結合体、信号抑制
体、検出可能な信号を出すために信号発生系に必
要な全物質、ならびに必要に応じて特異的結合対
の成分またはその類似物質（アナログ）を使用し
て調製される。

未知試料中の被分析物（リガンドまたはその同
族受容体、すなわち抗リガンド）の存在は、粒子
結合体の分離相（この相では信号ラベルは信号抑
制体から保護されている）と分析媒質の溶液本体
（この液相では信号ラベルは信号抑制剤の作用を
受ける）との間での信号ラベル結合体の分配に影
響を及ぼす。したがつて、観測された信号は試料
中の被分析物の量に関係する。

分析の実施に水性媒質を使用するのが普通であ
る。他の極性溶媒、通常はアルコール、エーテル
などを含む炭素数１〜６、より普通には１〜４の
酸素含有有機溶媒も混入できる。通常、このよう
な共溶媒は約40重量％未満、特に約20重量％未満
の量で存在させる。

媒質のPHは通常は約４〜11、より通常には約５
〜10、好ましくは約6.5〜9.5の範囲内である。PH
は、信号発生効率を最適にすると同時に、受容体
による特異的結合の顕著な水準を維持するように
選択される。場合によつては、この両者の観点の
間で妥協がはかられる。所望PHの達成と測定中の
そのPHの維持のために各種の緩衝剤が使用でき
る。緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸
塩、トリス、バルビタールなどがある。使用する
緩衝剤の種類は本発明にとつて重要ではないが、
個々の分析において或る緩衝剤がほかのものより
好適であるということは考えられる。

本発明の分析には温和な温度を使用するのが一
般的であり、普通は測定中は一定温度を保持す
る。これは変化率測定では特にそうである。測定
温度は一般に約10〜50℃、より普通には約15〜40
℃の範囲である。

分析できる被分析物の濃度は一般に約10^-4〜
10^-5M、より普通には約10^-6〜10^-13Mである。
分析が定性、半定量または定量のいずれである
か、検出法の種類および目的とする被分析物の濃
度などを考慮して、その他の試薬の濃度を決める
のが普通である。

分析媒質中の各種試薬の濃度は一般に被分析物
の対象となる濃度範囲によつて決定されるが、各
試薬の最終的な濃度は、対象となる濃度範囲で分
析感度を最適にするように経験的に決定するのが
普通である。特異的結合対のうちの被分析物とは
逆の成分の合計結合サイトは、被分析物結合サイ
トに基いて対象となる最低濃度の約0.1倍以上で
あつて、通常は被分析物結合サイトに基いて対象
となる最大濃度の約1000倍以下であり、一般に対
象となる最大濃度の約0.1〜100倍、より一般的に
は約0.3〜10倍である。濃度とは、有効利用可能
濃度、すなわち飽和での濃度を意図し、特異的結
合対の両成分が結合に対して同等に利用可能では
ないこともある実際の濃度とは必ずしも一致しな
い。

信号発生系の種類ならびに特異的結合対の使用
法に応じて、各種結合体の量はまつたく広範囲に
及ぶ。たとえば、粒子結合体中の結合対ラベルを
非常に大過剰にすることは、まず同じ結合対成分
を含有する信号ラベル結合体を未知試料と反応さ
せ、その後粒子結合体と混合することにより可能
である。粒子結合体と信号ラベル結合体が相互の
結合対成分を含有するという点で競合方式を採用
する場合、大過剰の結合対ラベルは分析感度を低
下させる恐れがある。或る特定のプロトコルで対
象となる範囲内の濃度の被分析物と共に各種濃度
の各種試薬を使用することにより、分析感応性を
最適にする比率を決定することができる。

各種試薬類の添加順序は、ラベルの種類、この
ラベルを結合する化合物、各結合体の性質、被分
析物の性質、および被分析物と試薬の相対濃度に
応じて広範囲に変化する。ほかに添加順序に影響
するのは、測定で平衡方式と変化率方式のいずれ
を採用するかである。ケイ光体では平衡方式を採
用するのが普通である。

多くの受容体では特異的結合対成分の結合は分
析時間中にほとんど不可逆的であるので、粒子結
合体と信号ラベル結合体が特異的結合対の相互の
成分である場合には、被分析物の添加より前にこ
の２種の結合体を混合することは避けるのが普通
である。対照的に、この２種の結合体が特異的結
合対の同じ成分を含有する場合には、未知試料を
分析媒質に導入する前にこれらを混合しても構わ
ない。

本発明の分析で主に考慮すべきであるのは、粒
子結合体に結合していない信号ラベルからの検出
可能な信号の発生を阻害する信号抑制体の役割で
ある。すべてのプロコトルはこの役割を考慮に入
れなければならない。検出可能な信号の測定値
は、信号抑制体が溶液本体中にある信号ラベルに
関して実質的に平衡状態になるまでは意味をもた
ない。さらに、粒子結合体と信号抑制体との間で
の競合は望ましくない。これらの点を考えて、プ
ロトコルは普通は粒子結合体、被分析物および信
号ラベル結合体の間での実質的に完全な平衡が達
成されるように考え、その後で信号抑制体を添加
する。その後、信号抑制体が溶液本体中の信号ラ
ベルと相互作用するだけの時間をとつた後に最初
の測定値を読み取る。

信号発生系の一部として酵素が関与する場合に
は、変化率（rate）方式が採用できる。変化率方
式は光の散乱、ラベルに無関係の物質からの信号
発生、装置変動などの固有の妨害を排除するとい
う利点がある。

分析媒質の調製には１または２以上のインキユ
ベーシヨン工程が含まれることがある。たとえ
ば、抗原被分析物はラベル化受容体と共にインキ
ユベーシヨンするのが望ましい。さらに、粒子結
合体の添加後に２回目のインキユベーシヨン、お
よび信号抑制体の添加後に３回目のインキユベー
シヨンをするのが望ましいことも多い。インキユ
ベーシヨン工程を採用するかどうか、およびイン
キユベーシヨン時間の長さは、受容体のリガンド
への、および信号ラベルの信号抑制体への結合速
度にかなりの程度で依存しよう。通常、インキユ
ベーシヨン工程は約0.5分〜６時間、より普通に
は約５分〜１時間の範囲内である。インキユベー
シヨン温度は一般に約４〜50℃、より普通には約
15〜37℃である。

試薬類を混合した後、信号を測定する。測定の
方法は電磁波放射線、特に紫外および可視光線の
吸収または発光の観測である。信号は通常は紫外
または可視領域、特に約250〜750nｍ、通常は約
350〜650nｍの電磁波放射線として読み取る。

信号観測時の温度は一般に約10〜50℃、より普
通には約15〜40℃である。

既知量の被分析物を含有する複数の標準分析媒
質を用意してもよい。その後、これらの標準分析
媒質について観測された信号をプロツトして、濃
度と信号との関係を求める。標準曲線が確立すれ
ば、信号を被分析物の濃度に直接関係づけること
ができる。

信号の測定時間は、変化率または１点測定のい
ずれを採用するか、要求される感度、信号発生系
の性質などに応じて変動しよう。変化率方式に対
しては、読み取り間隔は一般に約５秒ないし６時
間、通常は約10秒ないし１時間であり、各読み取
りの時間は一般に約0.1秒ないし約１分である。

リガンドはモノエピトープでもポリエピトープ
でもよい。多くの場合、この差異は分析の実施法
には影響しない。被分析物がリガンドである場
合、粒子結合体中の特異的結合対成分はリガンド
または受容体のいずれかでよい。信号ラベル結合
体はリガンドまたは受容体のいずれかを含有しう
る。しかし、粒子結合体と信号ラベル結合体が共
に受容体を含有する場合には、リガンドはポリエ
ピトープであるか、追加試薬としてポリ（リガン
ドアナログ）（ポリ（リガンドアナログ）−ラベル
または−ポリラベルを含む）を使用してポリエピ
トープにすることが必要である。すなわち、リガ
ンドが粒子結合体に結合し、信号ラベル結合体の
粒子結合体への結合のためのエピトープ・サイト
を与えるサンドイツチ法を使用する。

受容体が被分析物である場合、粒子結合体と信
号ラベル結合体は特異的結合対の同一または異な
る成分を含有していてよいが、ただしリガンドが
両方の結合体に含有されている場合には受容体は
多価である。また、既に指摘したように、粒子結
合体として粒子に結合させたリガンドと、信号ラ
ベル結合体として抗受容体に結合させた信号ラベ
ルを使用することにより受容体の二元性を利用し
てもよい。

被分析物と２種類の結合体がすべて特異的結合
対の同じ成分を有するか、含有する場合には、他
方の同族成分を添加し、これを抗体、または多価
受容体（これが受容体である場合）、またはポリ
ハプテン（ポリ（リガンドアナログ））（これがリ
ガンドである場合）のいずれかとしてポリエピト
ープ形態で存在させることが必要である。

本発明の分析法は、信号の発生方式および試薬
類の調製の面で非常に融通性が大きい。信号発生
系の顕著な特徴は、この系が出す検出可能な信号
が抑制を受け、信号発生ラベルが特異的結合対を
介して粒子に結合しているときにはこの抑制が妨
害されうることである。抑制の方式は物理的であ
る、すなわち、信号ラベルの周囲の環境の変化に
より信号が抑制される。したがつて、信号ラベル
と信号抑制体には多様な組合せが使用できる。

粒子結合体と信号抑制体の選択においては、信
号抑制体が特異的結合対を介して粒子結合体に結
合している信号ラベルと、信号ラベル結合体とし
てまたは夾雑物への結合状態のいずれかで存在し
ている溶液本体中に遊離した信号ラベルとを識別
できるように２種類の粒子を選択しなければなら
ない。好都合には、異なるように誘導または結合
された２種類の粒子を使用できる。これらは共に
多孔性であつて、結合されている物質の実質的部
分はこの粒子のチヤンネル、細孔またはくぼみの
内部に位置する。したがつて、信号抑制体と粒子
結合体に結合したラベルとの相互作用は、粒子の
表面上に群にもつぱら限られ、粒子の細孔の内部
のラベルは保護されている。信号抑制体の粒子
は、多孔性である場合、信号ラベル結合体を入れ
るのに十分な大きな寸法のチヤンネルまたは細孔
を有することが必要である。

もちろん、信号抑制体は多孔性である必要はな
い（特に粒子結合体が多孔性である場合）。信号
抑制粒子の大部分は粒子結合体の細孔またはくぼ
みの中への侵入が阻害されるからである。同様
に、信号抑制体粒子が多孔性である場合には、粒
子結合体は必ずしも多孔性である必要はなく、粒
子の表面に結合した特異的結合成分を有していて
もよい。したがつて、両方の粒子が多孔性であつ
てもよいが、一方のみが多孔性である方が好まし
い。

また、両方の粒子が共に多孔性でなくてもかま
わない。この場合、両粒子のカサ高（かさばる）
の特性が反発、特に立体的反発を与える。したが
つて、最終的な結果が信号抑制体が粒子結合体に
結合した信号ラベルと解離した信号ラベルとを識
別することである限り、粒子の性質は多岐にわた
る。

材 料 分析に使用する成分は粒子結合体、信号ラベル
結合体、信号抑制体、信号発生系の残りの構成要
素である試薬、被分析物および適宜にポリ（リガ
ンドアナログ）である。これらの試薬の調製に使
用されるのは、粒子またはビーズ、特異的結合対
成分および信号発生系の成分である。

被分析物 本発明のリガンド被分析物はモノエピトープま
たはポリエピトープ性であるという特徴を有す
る。ポリエピトープ性リガンド被分析物は一般に
ポリアミノ酸、すなわちポリペプチドおよびタン
パク質、多糖類、核酸ならびにこれらの混合物で
ある。このような集合混合物には細菌、ウイル
ス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、細胞核、
細胞膜などがある。

たいていは、本発明で使用するポリエピトープ
性リガンド被分析物は分子量が少なくとも約
5000、より普通には少なくとも約10000である。
ポリアミノ酸の類では、対象となるポリアミノ酸
は一般に分子量が約5000〜5000000、より普通に
は約20000〜1000000であり；対象となるホルモン
は分子量が通常は約5000〜60000の範囲内である。

多様なタンパク質を、類似の構造特徴を有する
タンパク質、特定の生物学的機能を有するタンパ
ク質、特定の微生物、特に病気の原因となる微生
物に関連するタンパク質などの分類で考慮するこ
とができる。

下記は構造により関係づけたタンパク質の種類
である。

プロタミン類 ヒストン類 アルブミン類 グロブリン類 硬タンパク質類 リンタンパク質類 ムコタンパク質類 色素タンパク質類 リポタンパク質類 核タンパク質類 糖タンパク質類 プロテオグリカン類 未分類タンパク質（例、ソマトトロピン、プロラ
クチン、インシユリン、ペプシン） 人の血シヨウ中に存在する多数のタンパク質は
臨床的に重要であり、これらには次のものが含ま
れる。

プレアルブミン アルブミン α₁−リポタンパク質 α₁−酸糖タンパク質 α₁−抗トリプシン α₁−糖タンパク トランスコルチン 4.6S−ポストアルブミン トリプトフア欠乏α₁−糖タンパク質 α₁χ−糖タンパク質 チロキシン結合性グロブリン インター−α−トリプシン阻害因子 Gc−グロブリン （Gc １−１） （Gc ２−１） （Gc ２−２） ハプトグロビン （Hp １−１） （Hp ２−１） （Hp ２−２） セルロプラスミン コリンエステラーゼ α₂−リポタンパク質 ミオグロビン Ｃ−反応性タンパク質 α₂−マクログロブリン α₂−HS−糖タンパク質 Zn−α₂−糖タンパク質 α₂−ノイラミノ−糖タンパク質 エリスロポイエチン β−リポタンパク質 トランスフエリン ヘモペキシン フイブリノーゲン プラスミノーゲン β₂−糖タンパク質 β₂−糖タンパク質 免疫グロブリンＧ、（IgG）またはγG−グロブリ
ン 分子式：γ₂κ₂またはγ₂λ₂ 免疫グロブリンＡ、（IgA）またはγA−グロブリ
ン 分子式：（α₂κ₂）ⁿまたは（α₂λ₂）ⁿ 免疫グロブリンＭ、（IgM）またはγM−グロブリ
ン 分子式：（μ₂κ₂）⁵または（μ₂λ₂）⁵ 免疫グロブリンＤ、（IgD）またはγD−グロブリ
ン（γD） 分子式：（δ₂κ₂）または（δ₂λ₂） 免疫グロブリンＥ、（IgE）またはγE−グロブリ
ン（γE） 分子式：（ε₂κ₂）または（ε₂λ₂） 遊離κおよびλライト・チエイン（light
chains） 相補因子： C′₁ C′_1q C′_1r C′_1s C′₂ C′₃ β₁A α₂D C′₄ C′₅ C′₆ C′₇ C′₈ C′₉ 重要な血液凝固因子には下記のものがある。

血液凝固因子国際記号 名 称 Ｉ フイブリノーゲン プロトロンビン ａ トロンビン 組織性トロンボプラスチン と プロアクセレリン、促進剤グロブリン プロコンバーチン 抗血友病性グロブリン（AHG） クリスマス因子、血シヨウトロンボプ
ラスチン成分（PTC） スチユアート−プロワー因子、アウト
プロトロンビン XI 血シヨウトロンボプラスチン前駆体
（PTA） XII ハゲマン因子 フイブリン安定化因子 重要なタンパク質ホルモンには次のものがあ
る。

ペプチドおよびタンパク質ホルモン 上皮小体ホルモン チロカルシトニン インシユリン グルカゴン レラキシン エリスロポイエチン メラノトロピン（黒血球刺激ホルモン、インテル
メジン） ソマトトロピン（成長ホルモン） コルチコトロピン（向副腎皮質性ホルモン） チロトロピン（向甲状腺性ホルモン） 卵胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン） 黄体乳腺刺激ホルモン（ルテオトロピン、プロラ
クチン） ゴナドトロピン（胎盤性性腺刺激ホルモン） 組織ホルモン セクレチン ガストリン アンギオテンシンおよび 人胎盤性ラクトゲン 下垂体後葉からのペプチドホルモン オキシトシン バンプレツシン 放出因子（RF） CRF、LRF、TRF、ソマトトロピン−RF、
GRF、FSH−RF、PIF、MIF 対象となる他の重合体物質はムコ多糖類および
多糖類である。

微生物から誘導される抗原性多糖類の例を次に
示す。

微生物種 ヘモセンシチンの存在 化膿連鎖球菌 （Streptococcus pyogenes） 多糖類 肺炎双球菌 （Diplococcus pneumoniae） 多糖類 髄膜炎菌 （Neisseria meningitidis） 多糖類 淋菌 （Neisseria gonorrheae） 多糖類 ジフテリア菌 （Corynebacterum diphtheriae） 多糖類 アクチノバチルス・マレイ； （Actinobacillus mallei） 粗製エキス アクチノバチルス・ウイテモリ （Actinobacillus whitemori） フランシセラ・ツラレンシス （Francisella tularensis） リポ多糖類 ペスト菌 （Pasteurella pestis） 多糖類 パスツーレラ・ムルトシダ （Pasteurella multocida） きよう膜抗原 ブルセラ・アボルツス （Brucella abortus） 粗製エキス インフルエンザ菌 （Haemophilus influenzae） 多糖類 ヘモフイルス・ペルツツシス （Haemophilus pertussis） 粗製 トレポネマ・レイテリ （Treponema reiteri） 多糖類 ベイロネラ （Veillonella） リポ多糖類 エリシペロトリツクス （Erysipelothrix） 多糖類 リステリア・モノシトゲネス （Listeria monocytogenes） 多糖類 クロモバクテリウム （Chromobacterium） リポ多糖類 ミコバクテリウム・ツベルクロシス （Mycobaterum tuberculosis）90％フエノー
ル抽出したミコバクテリア
の食塩水エキスおよび菌体
の多糖類分画およびツベル
クリン クレブシエラ・アエロゲネス （Klebsiella aerogenes） 多糖類 クレブシエラ・クロアカエ （Klebsiella cloacae） 多糖類 サルモネラ・チフオサ （Salmonella typhosa） リポ多糖類、多糖類 サルモネラ・チフイームリウム； （Salmonella typhi−murium） 多糖類 サルモネラ・デルビイ （Salmonella derby） サルモネラ・プロルム （Salmonella pullorum） シゲラ・デイセンテリアエ （Shigella dysenteriae） 多糖類 シゲラ・フレクスネリ （Shigella flexneri） ゾンネ菌 （Shigella sonnei） 粗製、多糖類 リケツチア類 （Rickettsiae） 粗製エキス カンジダ・アルビカンス （Candida albicans） 多糖類 エンタモエバ・ヒストリチカ （Entamoeba histolytica） 粗製エキス 分析を受ける微生物は、そのままでも、或いは
溶解、粉砕その他の破砕処理したものでもよく、
得られた組成物またはタンパク質（例、抽出によ
り）を分析する。対象となる微生物は下記を含
む。

コリネバクテリウム属 ジフテリア菌 （Corynebacterium diptheriae） 肺炎球菌 （Pneumococci） 肺炎双球菌 （Diplococcus pheumoniae） 連鎖球菌属 化膿連鎖球菌 （Streptococcus pyogenes） ストレプトコツクス・サリバルス （Streptococcus salivarus） ブドウ球菌属 黄色ブドウ球菌 （Staphylococcus aureus） 白色ブドウ球菌 （Staphylococcus albus） ナイセリア属 髄膜炎菌 （Neisseria meningitidis） 淋菌 （Neisseria gonorrheae） 腸内菌科 大腸菌群細菌： 大腸菌 （Escherichia coli） アエロゲネス菌 （Aerobacter aerogenes） 肺炎桿菌 （Klebsiella pneumoniae） サルモネラ属： 腸チフス菌 （Salmonella typhosa） 豚コレラ菌 （Salmonella choleraesuis） ネズミチフス菌 （Salmonella typhimurium） シゲラ属： 赤痢菌 （Shigella dysenteriae） シユミツツ菌 （Shigella schmitzii） シゲラ・アラビノタルダ （Shigella arabinotarda） フレキシナー菌 （Shigella flexneri） ボイド菌 （Shigella boydii） ゾンネ菌 （Shigella sonnei） その他の腸内菌 プロテウス属： 尋常変形菌 （Proteus vulgaris） 奇怪変形菌 （Proteus mirabillis） モルガン変形菌 （Proteus morgani） 緑膿菌 （Pseudomonas aeruginosa） アルカリ大便菌 （Alcaligenes faecalis） コレラ菌 （Vibrio cholerae） ヘモフイルス−ボルデテラ族 インフルエンザ菌 （Hemophilus influenzae） ヘモフイルス・ドウクレイ （H.ducreyi） ヘモフイルス・ヘモフイルス （H.hemophilus） ヘモフイルス・アエギプチクス （H.aegypticus） パラインフルエンザ菌 （H.parainfluenzae） 百日咳菌 （Bordetella pertussis） パスツレラ属 ペスト菌 （Pasteurella pestis） 野兎病菌 （Pasteurella tulareusis） ブルセラ属 マルタ熱菌 （Brucella melitensis） 牛流産菌 （Ｂ ruella abortus） 豚流産菌 （Brucella suis） 好気性胞子形成菌 炭ソ菌 （Bacillus anthracis） 枯草菌 （Bacillus subtilis） 巨大菌 （Bacillus megaterium） セレウス菌 （Bacillus cereus） 嫌気性胞子形成菌 ボツリヌス菌 （Clostridium botulinum） 破傷風菌 （Clostridium tetani） ウエルチ菌Ａ型 （Clostridium perfringens） ノービ菌 （Clostridium novyi） セプチツクス菌 （Clostridium septicum） ヒストリチクス菌 （Clostridium histolyticum） 第三型ロデラ菌 （Clostridium tertium） クロストリジウム・ビスエルメンタンス （Clotridium bifermentans） スポロゲネス菌 （Clostridium sporogenes） ミコバクテリウム属 人型結核菌 （Mycobacterium tuberculosis hominis） 牛型結核菌 （Mycobacterium bovis） 鳥型結核菌 （Mycobacterium avium） ライ菌 （Mycobacterium leprae） パラ結核性腸炎菌 （Mycobacterium paratuberculosis） 放線菌類（真菌様細菌） 牛放線菌 （Actinomyces israelii）および
（Actinomyces bovis） アクチノマイセス・ナエスルソデイ （Actinomyces naeslundii） ノカルジア・アステロイデス （Nocardia asteroides） ノカルジア・ブラジリエンシス （Nocardia brasiliensis） スピロヘータ目 梅毒トレポネーマ （Treponema pallidum） フランベジア・トレポネーマ （Treponema pertenue） ピンタ・トレポネーマ （Treponema carateum） 小スピリルム （Spirillum minus） ストレプトバチルス・モニリホルミス （Streptobaillus moniliformis） オーベルマイエ回帰熱スピロヘータ （Borrelia recurrentis） 黄ソ出血病レプトスピラ （Leptospira icterohemorrhagiae） 犬レプトスピラ （Leptospira canicola） マイコプラズマ属 マイコプラズマ・ニユーモニアエ （Mycoplasma pneumoniae） その他の病原菌 単球菌リステリア （Listeria monocytogenes） 豚丹毒菌 （Erysipelothrix rhusiopathiae） ソ径肉芽腫菌 （Donvania granulomatis） バチルス型バルトネラ （Bartonella bacilliformis） リケツチア属（細菌様寄生虫） 発疹熱リケツチア （Rickettsia prowazekii） リケツチア・ムーセリ （Rickettsia mooseri） 斑点熱リケツチア （Rickettsia rickettsii） コノリ・リケツチア （Rickettsia conori） リケツチア・オーストラリス （Rickettsia australis） リケツチア・シビリクス （Rickettsia sibiricus） リケツチア・アカリ （Rickettsia akari） つつが虫リケツチア （Rickettsia tsutsugamushi） Ｑ熱リケツチア （Rickettsia burnetii） リケツチア・キンタナ （Rickettsia quintana クラミジア （分類不可能な寄生虫、細菌／ウイルス性） クラミジア薬剤（名称未確定） 菌 類 クリプトコツクス・ネオフオルマンス （Cryptococcus neoformans） ブライトマイセス・デルマチジス （Blastomyces dermatidis） ヒストプラズマ・カプスラツム （Histoplasma capsulatum） コクシジオイデス・イミチス （Coccidioides immitis） パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス （Paracoccidioides brasiliensis） ガロ瘡カンジダ （Candida albicans） アスペルギルス・フミガツス （Aspergillus fumigatus） かさ状ケカビ （Mucor corymbifer（Absidia corymbifera） 藻菌類： リゾプス・オリザエ （Rhizopus oryzae） リゾプス・アルリズス （Rhizopus arrhizus） リゾプス・ニグリカンス （Rhizopus nigricans） スポロトリカム・シエンキイ （Sporotrichum schenkii） フオンセカエア・ペドロゾイ （Fonsecaea pedrosoi） フオンセカエア・コンパクタ （Fonsecaea compacta） フオンセカエア・デルマチジス （Fonsecaea dermatidis） クラドスポリウム・カルリオニイ （Cladosporium carrionii） フイアロフオラ・ベルルコサ （Phialophora verrucosa） アスペルギルス・ニズランス （Aspergillus nidulans マズレラ・マイセトミ （Madurella mycetomi） マズレラ・グリセア （Madurella grisea） アレシエリア・ボイジイ （Allescheria boydii） フイアロスホラ・ゼアンセルメイ （Phialosphora jeanselmei） ミクロスポルム・ギプセウム （Microsporum gypseum） トリコフイトン・メンタグロフイテス （Trichophyton mentagrophytes） ケラチノマイセス・アジエルロイ （Keratinomyces ajelloi） ミクロスポルム・カニス （Microsporum canis） トリコフイトン・ルブルム （Trichophyton rubrum） ミクロスポルム・アンドウイニ （Microsporum andouini） ウイルス アデノウイルス類 ヘルペスウイルス類 単純性疱疹 水 痘 帯状疱疹 ウイルスＢ シトメガロウイルス 痘疹ウイルス類 天然痘（痘瘡） 種 痘 牛痘ウイルス 変態痘 伝染性軟属腫 ピコルナウイルス（Picornavirus）類 ポリオウイルス コツクスサツキーウイルス エコーウイルス（Echovirus） リノウイルス（Rhinovirus） 粘液ウイルス類 インフルエンザ（Ａ、ＢおよびＣ） パラインフルエンザ（１〜４） 耳下腺炎ウイルス ニユーカツスル病ウイルス 麻疹ウイルス 牛疫ウイルス 犬ジステンパーウイルス 呼吸シンシチウムウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス（Arbovirus）類 東部馬脳炎ウイルス 西部馬脳炎ウイルス シンドビス（Sindbis）ウイルス チクグシヤ（Chikugunya）ウイルス セムリキ森林ウイルス マヨラ（Mayora）ウイルス セントルイス脳炎ウイルス カリフオルニア脳炎ウイルス コロラドチツク熱ウイルス 黄熱病ウイルス デング熱ウイルス レオウイルス（Reovirus）類 レオウイルス１〜３型 肝炎ウイルス類 Ａ型肝炎ウイルス Ｂ型肝炎ウイルス 腫瘍ウイルス類 ラウシヤー（Rauscher）白血病ウイルス グロス（Gross）ウイルス マロニー（Maloney）白血病ウイルス モノエピトープ性リガンド被分析物は一般に分
子量が約100〜2000、より普通には125〜1000であ
る。対象となる被分析物には薬物、代謝産物、殺
虫剤、汚染物質などがある。

対象となる薬物に含まれるものとして、まずア
ルカロイドがある。アルカロイドには、モノフイ
ンアルカロイド（モルヒネ、コデイン、ヘロイ
ン、デキストロメトルフアン、これらの誘導体お
よび代謝産物を含む）、コカインアルカロイド
（コカイン、ベンゾイルエクゴニン、これらの誘
導体および代謝産物を含む）、麦角アルカロイド
（リゼルグ酸のジエチルアミドを含む）、ステロイ
ドアルカロイド、イミナゾイルアルカロイド、キ
ナゾリンアルカロイド、イソキノリンアルカロイ
ド、キノリンアルカロイド（キニーネおよびキニ
ジンを含む）、ジテルペンアルカロイド、ならび
にこれらの誘導体および代謝産物がある。

別の群の薬物はステロイドであり、これはエス
トロゲン、ゲストロゲン、アントロゲン、副腎皮
質ステロイド、胆汁酸、強心剤グリコシドおよび
アグリコン（ジゴキシンおよびジゴキシゲニン、
サポニンおよびサポゲニンを含む）、ならびにこ
れらの誘導体および代謝産物がある。ジエチルス
チルベストロールのような擬ステロイド物質も包
含される。

次の群の薬物は５または６員環のラクタムであ
り、これにはバルビツール酸化合物（例、フエノ
バルビタール、セコバルビタール）、ジフエニル
ヒダントイン、プリミドン、エトスクシミドおよ
びこれらの代謝産物がある。

次の群の薬物はアルキルの炭素数が２〜３のア
ミノアルキルベンゼンであり、これにはアンフエ
タミン、カテロールアミンの類が包含され、具体
的にはエフエドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリ
ン、ナルセイン、パパベリン、これらの代謝産物
が含まれる。

次の群の薬物は、ベンゾ複素環化合物であり、
これにはオキサゼパム、クロルプロマジン、テグ
レトール、イミプラミン、これらの誘導体および
代謝産物が含まれ、複素環はアゼピン、ジアゼピ
ンおよびフエノチアジンである。

次の群の薬物はプリンであり、これにはテオフ
イリン、カフエイン、これらの代謝産物および誘
導体が含まれる。

次の群の薬物はマリフアナから誘導されるもの
であつて、これにはカンナビノールおよびテトラ
ヒドロカンナビノールが含まれる。

次の群の薬物は、ビタミンＡ、Ｂ（B₁₂など）、
Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、葉酸、チアミンのようなビ
タミン類である。

次の群の薬物はプロスタグランジンであつて、
これはヒドロキシル化および不飽和結合の程度と
位置で各種の種類に分かれる。

次の群の薬物は抗生物質であり、これにはペニ
シリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチ
ン、テトラサイクリン、テラマイシン、これらの
代謝産物および誘導体が含まれる。

次の群の薬物はヌクレオシドおよびヌクレオチ
ドであり、これにはATP、NAD、FMN、アデ
ノシン、グアノシン、チミジンおよびシチジンが
含まれ、これらはその適当な糖およびリン酸置換
基を有する。

次の群の薬物はその他の雑多な薬物であり、こ
れにはメタドン、メプロバメート、セロトニン、
メペリジン、アミトリプチリン、ノルトリプチリ
ン、ライドカイン、プロカインアミド、アセチル
プロカインアミド、プロプラノロール、グリセオ
フルビン、バルプロイン酸、ブチロフエノン、抗
ヒスタミン剤、抗コリン剤（例、アトロピン）、
これらの代謝産物および誘導体がある。

次の群の化合物はアミノ酸および小さなペプチ
ドであり、これにはポリヨードチロニン（例、チ
ロキシンおよびトリヨードチロニン）、オキシト
シン、ACTH、アンギオテンシン、met−および
leu−エンケフアリン、これらの代謝産物ならび
に誘導体が含まれる。

疾病症状に関係する代謝産物にはスペルミン、
ガラクトース、フエニルピルビン酸およびポルフ
イリン１型がある。

次の群の薬物は、ゲンタマイシン、カナマイシ
ン、トブラマイシンおよびアミカシンのようなア
ミノグリコキシドである。

対象となる殺虫剤にはポリハロゲン化ビフエニ
ル、リン酸エステル、チオホスフエート、カルバ
メート、ポリハロゲン化スルフエナミド、これら
の代謝産物および誘導体がある。

受容体型の被分析物に関しては、分子量は一般
に10000ないし２×10^-6、より普通には10000ない
し10⁶の範囲内である。免疫グロブリンIgA、
IgG、IgEおよびIgMについは、分子量は一般に
約160000〜10⁶の範囲内である。酵素の分子量は
一般に約10000〜6000000である。天然受容体は多
岐にわたり、一般に分子量は約25000以上であつ
て、10⁶またはそれ以上に達することもあり、ア
ビジン、チロキシン結合性グロブリン、チロキシ
ン結合性プレアルブミン、トランスコルチンなど
の物質を包含する。

リガンドアナログ リガンドアナログがリガンドと相違する点は、
１個の水素または官能基のいずれかが、活性官能
性を有する別の分子への共有結合を形成するため
の官能性（例、ヒドロキシル、アミノ、アリー
ル、チオ、オレフインなど）を有する結合基また
は結合のいずれかで置換されていることであり、
得られた化合物は、結合体の形成のためにリガン
ドに結合させた分子によりリガンドの水素１個が
置換されている以外にさらにリガンドの置換部位
がある点でリガンドと相違する。結合基は一般に
水素以外に１〜20の原子を含有し、この原子は炭
素、酸素、イオウ、窒素および原子番号17〜35の
ハロゲンである。結合基に含まれる官能性には、
カルボニル（オキソおよび非オキソ型）、活性ハ
ロゲン、ジアゾ、メルカプト、エチレン（特に、
活性化エチレン）、アミノなどがある。ヘテロ原
子の数は一般に約０〜６、より通常には約１〜
６、好ましくは約１〜４の範囲内である。結合基
については米国特許第3817837にも説明されてい
る。

多くの場合、結合基は脂肪族基であるが、ジア
ゾ基、芳香族基も含まれる。一般に結合基は鎖の
中に約１〜10、より普通には約１〜６の原子を有
する２価の鎖である。酸素は一般にオキソまたは
オキソとして存在し、炭素および水素に、好まし
くは炭素だけに結合している。一方、窒素は一般
にアミノ（炭素だけに結合）またはアミドとして
存在し、またイオウは酸素と同様である。

結合基と結合体形成用分子との間で共有結合を
形成する際の普通の官能性はアルキルアミン、ア
ミド、アミジン、チオアミド、尿素、チオ尿素、
グアニジンおよびジアゾである。

特にポリペプチドへの結合で利用される結合基
は、カルボン酸（これはジイミドと併用してもよ
い）または炭酸モノエステルとのもしくは活性カ
ルボン酸エステル、たとえばＮ−ヒドロキシスク
シンイミドまたはｐ−ニトロフエニルとしての混
合無水物を包含するものである。窒素類似化合物
もイミドエステルとして使用できる。アルデヒド
を使用して、還元アミノ化条件下（例、ホウ水素
化物の存在下）でイミンを形成し、アルキルアミ
ンを生成させてもよい。使用できる他の非オキソ
カルボニル基にはイソシアネートとイソチオシア
ネートがある。また活性ハロゲン化物、特にブロ
モアセチル基も使用できる。

多くの場合、リガンドは結合基を結合させるた
めのサイトとして使用できる１または２以上の官
能基を有している。特にヒドロキシ、アミノおよ
びアリール基（特に活性アリール基）は有用であ
る。オキソ官能性と、結合基への結合用サイトと
して使用されるヒドロキシル（例、カルボキシメ
チル）からオキシムを調製してもよい。

結合基の選択は、リガンドおよびこのリガンド
を結合すべき相手方の化合物に存在する官能性、
所望の結合基の性質と長さなどに応じて多岐に変
動する。

信号発生系 信号発生系は、検出可能な信号の発生に関与す
る試薬と生成物を包含する。信号発生系は少なく
とも１種の試薬成分を含み、２種以上の成分を含
むこともある。観測される信号の大きさ（レベ
ル）は、粒子結合体と溶液本体との間での信号ラ
ベルの分配により支配される。すなわち、信号ラ
ベルが粒子の立体束縛の範囲内にあるか、または
溶液本体中に遊離して信号抑制体に接近できるか
どうかである。粒子結合体は、これに結合してい
る信号ラベルから出る信号を信号抑制体が減少さ
せる作用を妨げるような環境を与えなければなら
ない。さらに、信号発生系は単一の特異的結合対
の両成分の間での結合に応答して数種の測定可能
な結果を与える（増幅）のが望ましい。

信号発生系は色原体（クロモゲン）による発光
または吸光を伴なう。検出可能な信号は、色原体
による照射光の吸収後の残留光線（信号ラベルが
色素である場合）、色原体による照射光の吸収後
の発光（信号ラベルがケイ光体またはリン光体で
ある場合）または化学反応後の発光（信号ラベル
が化学ルミネサーである場合）の結果である。上
の例は主要なものであつて、受容体分子へのエネ
ルギー伝達のような他の試薬または組合せも使用
できる。

信号発生系は信号ラベルとして色原体を含有す
ることがあり、これは照射により、或いはこのよ
うな色原体の生成時に吸光または発光する。後者
（生成時の吸光または発光）の場合、信号ラベル
は、化学反応時にその分光特性（たとえば、その
吸光特性、ケイ光特性または化学ルミネセンス特
性）が実質的変化を受ける化合物である。多くの
場合、この変化は不安定な結合の開裂または接触
レドツクス反応（どちらの反応も通常は酵素を使
用）により所望の色原体色素、ケイ光体または化
学ルミネサーを生成させることによつて達成され
る。酵素は化学ルミネサーでも有利に使用でき
る。

第１に興味をひく信号ラベルはケイ光性信号ラ
ベルであり、これをまず説明する。

使用できるケイ光体は一般に350nｍより長波
長、通常は400nｍ、好ましくは450nｍより長波
長の光線を発する。望ましくはケイ光体は高い量
子効率と大きなストークス・シフトを有し、その
結合および使用条件下で化学的に安定である。

対象となるケイ光体は或る種の主要な官能性を
有する多様な類に分類される。このような主要官
能性には１−および２−アミノナフタレン、ｐ，
p′−ジアミノスチルベン、ピレン、第四フエナン
トリジン塩、９−アミノアクリジン、ｐ，p′−ジ
アミノベンゾフエノンイミン、アントラセン、オ
キサカルボシアニン、メロシアニン、３−アミノ
エキレニン、ペリレン、ビス−ベンゾオキサゾー
ル、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，２−
ベンゾフエナジン、レチノール、ビス−３−アミ
ノピリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイ
クリン、ステロフエノール、ベンズイミダゾリル
フエニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、イ
ンドール、キサンテン、７−ヒドロキシクマリ
ン、４，５−ベンズイミダゾール、フエノキサジ
ン、サリチレート、ストロフアンチジン、ポルフ
イリン、トリアリールメタン、フラビン、および
希土類キレートがある。

結合のための官能性を有しているか、このよう
な官能性を組込むように変性できる具体的なケイ
光化合物の例には、塩化ダンシル、３，６−ジヒ
ドロキシ−９−フエニルキサントヒドロールのよ
うなフルオレセイン類、ローダミンイソチオシア
ネート、Ｎ−フエニル−１−アミノ−８−スルホ
ナトナフタレン、Ｎ−フエニル−２−アミノ−６
−スルホナトナフタレン、４−アセトアミド−
4′−イソチオシアナトスチルベン−２，2′−ジス
ルホン酸、ピレン−３−スルホン酸、２−トルイ
ジノナフタレン−６−スルホネート、Ｎ−フエニ
ル、Ｎ−メチル−２−アミノナフタレン−６−ス
ルホネート、臭化エチジウム、アテブリン、オー
ロミン−Ｏ、２−（9′−アントロイル）パルミテ
ート、ダンシル・ホスフアチジルエタノールアミ
ン、Ｎ−〔（ｐ−２−ベンズイミダゾリル）フエニ
ル〕マレインイミド、４−フエニル−スピロ（フ
ラン−２，1′−フタラン）−３，3′−ジオン、ホ
モバニリン酸二量体、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルオ
キサカルボシアニン、Ｎ，N′−ジヘキシルオキ
サカルボシアニン、メロシアニン、４−（3′−ピ
レニル）ブチレート、α−３−アミノデンキシエ
キレニン、12−（9′−アントロイル）ステアレー
ト、２−メチルアントラセン、９−ビニルアント
ラセン、２，2′−ビニレン−ｐ−フエニレンビス
−ベンゾオキサゾール、ｐ−ビス〔２−（４−メ
チル−５−フエニルオキサゾリル）〕ベンゼン、
６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフエナジ
ン、レチノール、ビス（3′−アミノピリジニウ
ム）、１，10−デカンジイル・ジヨージド、ヘレ
ブリゲニンのスルホナフチルヒドラゾン、クロル
テトラサイクリン、Ｎ−（７−ジメチルアミノ−
４−メチル−２−オキソ−３−クロメニル）マレ
インイミド、Ｎ−〔ｐ−（２−ベンゾイミダゾイ
ル）フエニル〕マレインイミド、Ｎ−（４−フル
オルアンチル）マレインイミド、ビス（ホモバニ
リン酸）、レサザリン、４−クロロ−７−ニトロ
−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール、メロシ
アニン540、レゾルフイン、ローズベンガル、２，
４−ジフエニル−３（2H）−フラノン、メチルウ
ンベリフエロン、９，10−ジブロモアントラセ
ン、９，10−ジエチニルアントラセンおよびエオ
シンがある。

結合後の色原体の吸光および発光特性は未結合
の色原体とは異なることがある。したがつて、色
原体の特性と各種波長について言及する場合、任
意の溶媒中で確認した未結合の色原体ではなく、
使用時の条件下の色原体を指示することにする。

検出可能な信号としての別の光線源は化学ルミ
ネセンス源である。化学ルミネセンス源には、化
学反応によつて電子が励起状態になり、次いで検
出可能な信号となる光を発するか、またはケイ光
性受容体にエネルギーを供与するような化合物が
包含される。

多様な種類の化合物が多様な条件下で化学ルミ
ネセンスを示すことが判明している。その１群は
２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン類
である。最も一般的は化合物はルミノールであつ
て、これは５−アミノ誘導体である。この群の別
の化合物には、５−アミノ−６，７，８−トリメ
トキシおよびジメチルアミノ〔ca〕ベンゾ誘導
体がある。これらの化合物は、アルカリ性過酸化
水素または次亜塩素酸カルシウムと塩基とで発光
させることができる。別の群の化合物は２，４，
５−トリフエニルイミダゾール類であつて、これ
は基本生成物に対する共通名称としてロフインが
冠せられて命名される。化学発光性同族体には、
ｐ−ジメチルアミノおよびｐ−メトキシ置換誘導
体がある。

300nｍより長波長、好ましくは350nｍ以上、
特に好ましくは400nｍより長波長の光を吸収す
る各種の染料（色素）も使用できる。染料の選択
においては、これが信号抑制体に結合したときに
そのスペクトルの実質的な変化を受けることが必
要である。

染料の例には、フエノール染料、アゾ化合物、
トリアリールメタン、フタレインなどがある。市
販品の染料に、特異的結合対の１成分への共有結
合に利用できる官能性が存在していない場合に
は、このような基を導入するように染料を変性で
きる。

染料の具体例には、メドラ（medola）ブルー、
メチレンブルー、アリザリン、ニトロフエノー
ル、フクシン、アニリンエロー、パラレツド、イ
ンジゴ、フタロシアニンおよびナフトールASが
ある。

色原体のほかに、化学反応を受けると目的とす
る色原体を生ずる色原体前駆体も使用できる。便
宜上、この反応は触媒（酵素と非酵素の両方）と
化学変換（例、加水分解および酸化還元反応）を
包含する。

加水分解反応においては、一般にフエノール型
色原体を酵素に不安定な結合によつて或る基に結
合（カツプリング）させ、その際に得られた置換
フエノールは非置換フエノールとは実質的に異な
る色素特性（例、非ケイ光性とケイ光性）を有す
るようにする。具体例は、グリコシド分解（例、
β−ガラクトシダーゼによる）により開裂される
グリコシジルフルオレセイン類と、酸またはアル
カリ性ホスフアターゼにより開裂されるウンベリ
フエリルホスフエートである。

或いは、ロイコ形の色原体を使用し、酵素もし
くは非酵素の触媒により、または触媒によらずに
これを活性または有色形態に酸化または還元する
ことも可能である。たとえば、フルオレシンをフ
ルオレセインに酸化、フエナジンメトサルフエー
トをNAD依存性デヒドロゲナーゼにより生成さ
せたNADHで還元、メチレンブルーをヘモフラ
ボタンパク質で酸化、ベンジルビオロゲンをキサ
ンチンオキシダーゼで酸化などが可能である。非
酵素的酸化剤または還元剤も使用できる。

使用できる酵素は大部分はIUB分類（酸化還
元酵素）またはIUB分類（ヒドロラーゼ）に含
まれるものである。

色原体前駆体を使用することにより、信号の測
定に平衡方式ではなくて変化率方式を採用するこ
とができる。信号ラベル結合体を粒子結合体に結
合させると、信号抑制体は溶液本体中にある色原
体が発する信号の発生を抑制するので、観測され
る信号は主に粒子結合体に結合した信号ラベルか
らの信号となる。

粒 子 多様な液体または固体（通常は固体）の粒子を
本発明では使用できる。多くの方法に対して、少
なくとも一方の粒子は多孔性または微細網状
（microreticulated）である。すなわち、溶液本
体に開放されている部分を有し、これが粒子材料
が取り囲む面積の約50％より大である。このよう
な部分は深い細孔、チヤンネル、裂け目、へこみ
などでよい。

使用する粒子の選択は、粒子結合体に結合した
信号ラベルと抑制サイトすなわち信号抑制体の官
能性との相互作用を妨げるように考えて行なう。
不溶性粒子の適当な使用により、粒子表面上の信
号ラベルが信号抑制体へ接近する可能性を制限す
ることができる。多孔性粒子では、粒子の細孔ま
たはチヤンネルを、信号発生系の少なくとも１種
の成分の出入りを許すが、信号抑制体の出入りは
阻止するように選択する。

多孔性の固体粒子は各種の細孔寸法のものが入
手できる。細孔寸法は使用する粒子の特性に応じ
て選択される。拡散速度が重要な因子である場合
には、細孔内に拡散しなければならない分子と、
細孔内への拡散が阻止される分子との間のカツト
オフ（cut−off）サイズを使用する。カツトオ
フ・サイズは数万、たとえば20000、より普通に
は40000から数百万以上、たとえば10000000、よ
り普通には1000000までの分子量の幅があり、各
種範囲のものが市販されている。

固体粒子の粒度は次の点で制限される。まず粒
子は分析の作業時間中、好ましくはより長時間に
わたつて比較的安定に分散されねばならない。分
析媒質中でいつまでも安定であることは必要な
い。粒度は、大多数の粒子が溶液中にあるように
十分小さいことが必要である。すなわち、光路を
通過する１個または数個の粒子が観測された信号
の実質的変化を生ずる場合、信号に大幅の動揺を
見るのは好ましくない。ししがつて、たいていの
場合、粒子は約50nｍないし100μ、より普通には
500nｍないし5μの範囲内の粒径のものである。
細孔寸法は一般に約0.1〜750nｍ、より普通には
約50nｍ以下である。

より大きな粒子を摩砕、音波処理
（sonicaton）、撹拌などの機械的手段によつてよ
り小さな粒子に破砕することにより粒度の変動と
表面積の増大が可能である。

粒子には多様な材料が使用できる。多くの材料
が市販され、またその特性を変更するように市販
材料を変性してもよい。

粒子は天然材料、合成的に変性した天然材料お
よび合成材料から得ることができる。特に重要な
粒子は、多糖類、特に架橋多糖類、たとえばアガ
ロース（Sepharoseとして市販）、デキストラン
（SephadexおよびSephacylとして市販）、セルロ
ース、でんぷんなどである。他の材料には、ポリ
アクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアル
コール、ヒドロキシエチルメタクリレートとメチ
ルメタクリレートとのコポリマー、シリコーン、
ガラス（Bioglasとして市販）、炭（charcoal）
などがある。

粒子は通常は多官能性であるか、または多官能
性化できるものである。多様な官能基が利用また
は加入できる。官能基にはカルボン酸、アルデヒ
ド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキ
シル基、メルカプト基などがある。各種の粒子に
多様な化合物を結合する方法は周知であり、文献
に詳細に説明されている。たとえば
Cuatrecases、J.Biol.Chem.245、3059（1970）を
参照されたい。

結合基の長さは、結合される化合物の性質、ラ
ベルと粒子間の間隔がラベルの特性に及ぼす影
響、ラベルの架橋の可能性などに応じて大幅に変
動する。

信号抑制体としては分離した液体粒子も使用で
きる。このような粒子は表面活性剤により分散さ
せた油滴、リポゾームなどでよいが、粒子には光
線吸収能が付与される。油滴に対しては、親油性
の黒色染料を油の中に加える。リポゾームに対し
ては、消光性分子を膜脂質に結合することができ
る。いずれの場合も、抗色原体がさらに粒子表面
に結合されよう。

粒子結合体 粒子結合体は常に特異的結合対の成分の一方と
結合されている。この結合は直接でも間接的でも
よい。直接結合とは、特異的結合対成分ラベルが
粒子に共有結合していることを意味する。或い
は、特異的結合対成分に受容体を使用することも
できる。特異的結合対成分が多価である場合に
は、相補（complementary）成分の不純品を粒
子に共有結合させてもよい。この未精製の特異的
結合対成分を次に非共有結合させると、夾雑物を
含有しない同族の結合対成分でラベルされた粒子
を生ずる。その後、得られた粒子結合体はその相
補信号ラベル結合体と共に分析に使用できる。

被分析物がヒトIgEのような受容体である場合
には、上記方法の変法も使用できる。まず、IgE
により認識されるアレルゲンを粒子に共有結合さ
せる。信号ラベル結合体としては、羊の抗（ヒト
IgE）を使用する。分析においては、ヒトIgE被
分析物は粒子上のアレルゲンに結合し、信号ラベ
ル結合体（抗ヒトIgE）は粒子に結合しているヒ
トIgEに結合しよう。この場合は、分析中におけ
る被分析物の粒子への結合が粒子結合体として既
に定義したものを生ずるので、上記の一般的情況
とは異なる。また、IgA、IgG、IgM、酵素、な
らびにたとえばエストリオール、ビオチンもしく
は他の薬物に対する特異的受容体などの上記以外
の受容体も同様に使用できる。

要するに、この方法では２種類の特異的結合対
が存在し、同じ化合物が片方の結合対では抗原、
他方では受容体の役割を果し、一方、各特異的結
合対の被分析物に対する相補成分は互いにリガン
ドと受容体の関係を有している必要はない。

粒子の分子量に対する特異的結合対成分の比率
は、粒子の性質、有効表面積、有効結合サイトな
どに応じて大幅に変動する。粒子１個当り平均で
少なくとも約１個の特異的結合対成分を存在さ
せ、一般に１×10⁵の分子量について少なくとも
約１個、より通常には１×10⁷の分子量について
少なくとも約１個の特異的結合対成分を存在させ
る。

信号ラベル結合体 リガンドおよび受容体へのラベルの結合は文
献、特に上に引用した文献に詳細に報告されてい
る。特異的結合対成分に対するラベルのモル比
は、ラベルの性質ならびに特異的結合対成分の性
質に応じて大幅に変動する。

特異的結合対の成分に結合させるラベルの数
は、平均で少なくとも１以上であつて、上限はそ
の成分の分子量を1500で、通常は3000で割つた数
であり、一般に約１〜50、通常は約２〜30の範囲
内である。

場合によつては、特異的結合対の成分の１また
は２以上の分子を１個のラベルに結合させること
もできる。通常は分子量1500につき１未満の分子
である。ラベル１個当りの分子の数は一般に50未
満、通常は30未満、より普通には10未満である。

結合法は安定な共有結合を包含するのが好都合
であり、その場合信号ラベルは１個の結合または
鎖長が約１〜10原子のスペーサー腕によつて該成
分に結合させることができる。

信号抑制体 信号抑制体は、溶液本体にある信号ラベルを粒
子結合体に結合している信号ラベルに比較した差
異によつて分析媒質からの発光に優先的に影響を
及ぼすことのできる粒子である限り、広範囲から
選択できる。信号抑制体として使用できる粒子は
下記の性質の１またはそれ以上を有する：検出可
能な信号として信号発生系が出す光の波長範囲内
での吸収；発光を阻止するように励起分子からの
エネルギーを受容または変衰させることが可能；
励起波長の光の吸収の吸収により発光性分子の励
起の阻止。

信号抑制体粒子の粒度は広範囲にわたるが、一
般には約50nｍないし100μ、通常は500nｍないし
5μである。粒子の粒度の制限は、分析媒質から
の光のうち、信号抑制体に接近している信号ラベ
ルとは無関係の光の入射または放射を不当に妨害
してはならないこと、および電磁放射線の測定装
置の測定帯域内のその移動・通過により信号に実
質的な動揺を生じてはならないことである。

各種の粒子が使用でき、これは共有または非共
有結合により、信号ラベル結合体に対する受容体
（通常は信号ラベルに対する受容体）または信号
ラベル結合体の結合対成分ならびにこれに付随す
る夾雑物に対する受容体と結合させてもよい。

または、信号抑制体粒子は、特定のコンフオメ
ーシヨン、たとえば延長された芳香族共役系、特
に発色団、に結合する本来的に存在する活性中心
サイトのために信号ラベルに対して固有の親和性
を有するものでもよい。また、活性中心サイトは
化学的変性により合成的に導入することもでき、
たとえばスルホヒドリル基を信号ラベルに結合さ
せ、一方信号抑制体粒子にはスルホヒドリル特異
性試薬を結合させる方法が考えられる。多数のそ
の他の組合せのカツプリング基も使用できる。

使用する粒子はタンパク質に対して吸着性また
は非吸着性でよく、粒子は天然物、合成品または
その併用であつて、単一の物質または混合物のい
ずれでもよい。粒子は一般に化学的に不活性であ
つて、使用する波長範囲の光を吸収し、黒色であ
ることが多い。このような材料の例には、活性
炭、ランプブラツク、黒鉛およびコロイド状炭素
のような炭素粒子、コロイド状金属粒子、金属酸
化物粒子、金属カルコゲン化物粒子、光吸収性合
成ポリマー粒子などがある。

粒子は分析媒質中に分散性であることが必要で
あり、比較的安定な分散液を生ずるか、或いは分
散剤の添加により比較的安定な分散液とすること
ができるものがよい。ただし、粒子は測定の時間
中だけ分散状態にあればよい（より長時間の分散
が望ましいが）。

各種の粒子のもつ発光の抑制の方式はさまざま
であるが、次の因子の１または２以上が全体的に
または部分的に関連していよう：エネルギー受
容；シールデイング（しやへい）；粒子表面との
化学的または物理的相互作用によるエネルギー準
位の動揺または吸光。

信号抑制体の固体粒子は、個々の粒子そのまま
でも、或いはこの粒子相互のまたはこの粒子と他
の異なる粒子もしくは巨大分子物質（これらは吸
光性でも非吸光性でもよい）との集合体または凝
集体でもよい。この物質の例には多糖類（例、ア
ガロース、セルロース、Sephadexおよびデキス
トラン）、シリカなどがある。このような集合体
を使用して、信号抑制体粒子集合体の密度および
形状を変えることにより、信号ラベルの吸収に対
する信号抑制体粒子の能力を高め、および／また
は沈降速度を低下させることができる。

補助材料 本発明の分析では各種の補助物質が使用でき
る。一般に、約0.01〜1Mの緩衝剤濃度となる量
で緩衝剤を使用する。緩衝剤のほかに、次のよう
な他の材料も添加しうる：安定剤、たとえば約
1.5重量％までの濃度となる量のタンパク質（例、
アルブミン）；保護化合物、たとえば約１重量％
までの濃度となる量の静菌剤または殺菌剤（例、
アジ化ナトリウム）；ならびに表面活性剤、キレ
ート化剤もしくは酸化防止剤のような特定の作用
のための他の材料。

さらに、信号発生系の要件に関連して他の試薬
も使用される。このような試薬には、エネルギー
供与体または受容体、酵素、酸性もしくは塩基性
試薬などがある。

キツト 便宜上、試薬類はキツトとして供給される。キ
ツトでは、各試薬は対象とする範囲内で分析感度
を実質的に最適化するように所定の比率で提供さ
れる。凍結乾燥品の場合、各試薬の再構成後に、
粒子結合体ならびに信号抑制体は、一般に密度が
粒子と実質的に同一の水性媒質中に分散させて、
粒子の実質的に均一な分散状態或いは分散性を保
持する。高密度添加剤の使用または粒子の密度の
調整により、所望の密度関係が達成できる。

信号抑制体粒子は、一般に少なくとも信号ラベ
ルの実質的に全部（≧90％）にほぼ結合できるだ
けの量で添加される。粒子結合体の量は、被分析
物の対象とする範囲に応じた動的分析範囲を与え
るような量とする。信号ラベル結合体の量は粒子
結合体の量と調和させる。

キツトに用意される試薬類は、粒子結合体、信
号ラベル結合体および信号抑制体である。材料の
種類およびプロトコルに応じて、信号ラベル結合
体と粒子結合体は、安定剤、タンパク質、緩衝剤
などの各種の他の試薬と共に単一の試薬として混
合してもよい。各安定剤の量は、分析に使用する
ために調製した試薬溶液中での濃度を約0.01〜１
重量％の範囲内とする量である。緩衝剤の量は試
薬溶液中での濃度を約１ｍＭないし1Mの範囲内
とする量である。信号抑制体は、溶液本体中の信
号ラベルの全部が迅速に信号発生を阻害されるの
を確実にするために、信号ラベルの約90％に結合
するのに必要な量より比較的大過剰に使用でき
る。

免疫分析の実施面での便宜のために、複数の試
薬を単一の容器内に混合して、各試薬を慎重に関
係させた比率で同時に添加できるようにすること
が望ましい。信号ラベル結合体または信号抑制体
を、信号ラベルが信号抑制体に結合するにして
も、弱くしか結合しないような形態で混合できる
場合には、両者の試薬を単一の薬びんの中で混合
できる。

たとえば、信号ラベルとしての色原体を、色原
体前駆体のようなそのロイコ形態で、その塩では
なくてそのプロトン化形態または還元もしくは酸
化形態の状態で使用する（このような状態が無色
である場合）ことにより、色原体は炭（チヤコー
ル）のような信号抑制体に弱く結合する。信号抑
制体が抗色原体である場合、ロイコ形態は抗色原
体に結合するにしても弱く結合しよう。

信号ラベル結合体と信号抑制体を単一の水薬び
んの中で混合する場合、水溶液が信号ラベルの信
号抑制体への結合を最小限にする適当なPHになる
ように適当な緩衝剤も混入することができる。

信号ラベルと信号抑制体を分析実施用の単一試
薬として混合する場合、粒子結合体および信号ラ
ベルを色原体形態に変換するための別の試薬の添
加に先立つて、被分析物含有試料を上記の混合試
薬に添加しておくのが一般的である。所望によ
り、このような試薬を粒子結合体と混合しておい
て、実験室に必要な試薬を２種類だけにすること
もできる。

実 験 以下の実施例は、制限を目的としたものではな
く、例示のために提示する。

実施例中、温度は特に指定のない限り℃であ
る。部および％は、特に指定のない限り重量によ
るが、ただし液体の混合物に関しては例外で、容
量による。次の略号を用いる：抗HuIgG−ヒト
IgGの抗体；DMF−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド；PBS−リン酸緩衝化食塩水。

実施例 １ 炭への抗フルオレセインの結合 水２mlに活性炭50mgを分散させ、この混合物を
ブランソンセル式粉砕機（Branson Cell
Disruptor）35型、カツプ・ホーン、50％パルス、
５にセツトで２分間音波処理した。合計10mgの抗
フルオレセイン組成物をPBS、PH7.8（NaN₃0.05
％）で３mlに希釈した後、 ¹⁴CヒツジIgG40μ
と緩衝液70μを添加し、110μを採取して放射
能を測定した（10mlアクアゾル、5746cpm／100μ
）。この抗フルオレセイン３mlを音波処理した
活性炭分散液と混合し、混合物を室温で１晩撹拌
した。

この混合物を次いで遠心分離し、上澄みから
0.5mlを取り、ペレツトはPBS、PH7.8（0.05％
NaN₃含有）で５回洗浄し、６回目は５mlで洗浄
し、この洗浄をその後は洗液中にタンパク質がま
だ存在しているかどうかを調べるために１mlずつ
でくり返した。ペレツトはその後PBS（２ml）に
再懸濁させた。活性炭分散液の放射能に基き、活
性炭の存在により生ずるcpmの減少について補正
すると、ほぼ3.9mgの抗フルオレセインが50mgの
炭に結合している。

実施例 ２ 抗HuIgGのフルオレセインラベル化 Ａ 予じめ0.1M炭酸ナトリウムPH9.0に対して透
析処理した0.5mlの抗HuIgG（５mg、Dako10−
mat046）に、50mlのDMFにとかした0.2mgの
フルオレセインイソチオシアネートを添加し、
混合物を室温で３時間撹拌した。この混合物を
セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−25のカラム
でPBS、PH7.0を用いてクロマトグラフ処理し
た。生成物は3.2mg／mlの溶液状で単離され、
フルオレセイン／タンパク質の比は11.2である
ことが判明した。このフルオレセインの約25％
がセフアローズ（Sepharose）4Bに結合させた
HuIgGとの沈殿により抗HuIgGに結合される
ことが見出された。

Ｂ 上の反応を次のようにくり返した。

0.1M炭酸ナトリウムPH9.0に対して透析処理
した0.5mlの抗HuIgG（Dako、10−mat、ロツ
ト046、約10mg／ml）に、DMF100μに0.16mg
のフルオレセインイソチオシアネートをとかし
た溶液の10μだけを添加し、混合物を暗所で
室温下に１時間撹拌した。反応混合物をセフア
デツクスＧ−25のカラムでPBS、PH7.0により
クロマトグラフ処理した。生成物の濃度は4.95
mg／mlで、フルオレセイン／タンパク質の比は
0.47であつた。

実施例 ３ セフアローズCL6BへのHuIgGの結合 予じめ1M炭酸ナトリウムで洗浄した約２mlの
セフアローズCL6Bビーズ（Pharmacia）に、ア
セトニトリル中のCNBrの溶液（濃度２ｇ／ml）
150を添加し、この混合物を2.5分間撹拌した。
ビーズを単離した後、0.1M炭酸ナトリウムPH
9.1、水および0.1M炭酸ナトリウムPH9.1で洗浄し
た。このビーズに次にHuIgG溶液（5.6mg／ml）
2.9mlを添加し、得られた混合物を4゜で１晩撹拌
した。この混合物に0.5mlの1Mアミノプロパノー
ルPH8.0を添加し、混合物を4゜で１時間撹拌した。
得られたビーズに対して、次いで0.1M酢酸ナト
リウム、1M NaClの第１の水溶液（PH4.0）と
0.1Mホウ酸ナトリウム、1.0M NaClの第２の水
溶液（PH8.0）とによる洗浄を３回くり返した。
このビーズをその後ブランソンセル式粉砕機（No.
２にセツト、マイクロチツプ）で0.5時間音波処
理した。放射性ラベルを使用することにより、ビ
ーズ１mlについて5.6mgのHuIgGが存在すること
が見出された。

本発明を実証する第１の分析においては、フル
オレセインの消光のために吸着性物質である炭を
使用した。吸着性活性炭Norit Ａ CX655を1.5
mg／mlの濃度で水と混合し、ブランソンセル式粉
砕機35型（No.２のセツト）での２分間の音波処理
により粒子を分散させた。使用したフルオレセイ
ン−抗HuIgGは、フルオレセイン／タンパク質
比が約14である実施例2Aのものであつた。使用
した緩衝液はPBS、アジ化ナトリウム0.5％、10
ｍＭリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、PH7.8であ
つた。

フルオレセイン−抗HuIgGは約3.2mg／mlの濃
度であつた。HuIgG−セフアローズCL6Bは充填
されたビーズ１ml当りの濃度が5.6mgHuIgGであ
つて、これは上記のブランソンセル式粉砕機で15
分間づつ３回音波処理し、その際に各回の音波処
理後にビーズをスピンダウン（spinning down）
して、緩衝液で洗浄した。活性炭による吸光を補
正係数として520nｍで測定した。第１回の試験
では、15μのフルオレセイン−抗HuIgG（１：
80で希釈；５×10^-9M）をさまざまの量の活性炭
液と混合し、最終的な体積が0.75mlとなるように
緩衝液を加えた。活性炭が存在しないときのケイ
光を100％としたときに、10μの炭液はこの始
めのケイ光の17.5％を生じ、炭液が25μでは1.4
％のケイ光、50μでは0.06％のケイ光を生じた。
これは、抗体に結合されたフルオレセインに対す
る炭の消光効果を実証する。

次の一連の試験では、15μのフルオレセイン
−抗HuIgG（１：20に希釈）、15μのHuIgG−セ
フアローズCL6B（１：３に希釈）および100μ
の緩衝液を混合し、室温で１時間インキユベーシ
ヨンした。混合物をスピンダウンし、ビーズから
得られたペレツトを緩衝液で洗浄した。このビー
スペレツト（フルオレセイン−抗HuIgGに関し
て５×10^-9M；HuIgG−セフアローズCL6Bに関
して2.1×10^-7M）約50μを、650μの緩衝液な
らびに50μの炭もしくは50μの緩衝液と混合
し、混合物を室温で0.5時間インキユベーシヨン
した。フルオレセイン−抗HuIgGとHuIgG−セ
フアローズCL6Bの混合物で得られたケイ光を
100％とし、炭による吸光について補正を行なう
と、炭の存在は最初のケイ光の45.5％のケイ光を
生じた。すなわち、フルオレセインをHuIgGお
よび抗HuIgGの介在によりセフアローズCL6Bに
結合させると約50％の保護を生じた。

次の分析ではHuIgGの存在の効果を示す。使
用したプロトコルは前記と同様である。分析媒質
の調製は、１：329に希釈したフルオレセイン−
抗HuIgG20μを緩衝液0.80mlと混合し（５×
10^-9M抗体）、各種希釈度の10μを0.5時間イン
キユベーシヨンし、10μの（４×10^-8M）
HuIgG−セフアローズCL6B（最終濃度3.8×
10^-7M）または緩衝液を添加し、0.5時間インキ
ユベーシヨンし、抗フルオレセインを被覆した活
性炭20μを添加し、最後に0.5時間インキユベー
シヨンすることにより行なつた。測定値は前記の
ようにして求めた。結果を次の表に示す。

HuIgG濃度 Log₁₀ ケイ光（％）ａ ｂ 7.6、7.1 −10 4.9、4.4 −９ 2.1、2.2 −８ 2.0、1.5 ａ：ケイ光（％）は分析媒質と同一濃度の緩衝液
中のフルオレセイン−HuIgGに対する値を100
％として求めた値である。

ｂ：HuIgGを添加せず；同じ体積の緩衝液のみ
を使用。

上の結果は、ラベルと相互作用して信号を抑制
する粒子状信号抑制体からの、特異的結合対の介
在により粒子に結合しているラベルの保護に依存
した分析法が開発できることを実証している。本
発明の方法は多くの利点を与える。まず、不純物
があつても、これは粒子結合体の調製または機能
の妨げとならないので、特異的結合対の所望の成
分を含有する比較的不純な混合物を使用して粒子
結合体を調製することが可能である。

第二に、特異的結合対の成分以外のものに結合
した信号ラベルから生ずる信号は実質的に抑制さ
れるので、特異的結合対の成分の比較的不純な混
合物を信号ラベルでラベルすることができる。最
後に、粒子結合体に結合していない信号ラベル結
合体からの信号もやはり抑制されるので、非常に
高い感度が得られる。すなわち、分析値の不確実
さを増長するバツクグラウンド値が、外来ラベル
ならびに溶液本体中にとどまつている信号ラベル
結合体の両方に関して著しく減少する。

よつて、本発明は多様な有機化合物もしくは組
成物に対する高感度かつ高精度の分析法を提供
し、また比較的容易に調製でき、長期間安定で、
分析媒質中に混合したときに比較的短時間で結果
を与える試薬も提供する。

以上に、本発明を詳細に説明し、理解を助ける
ために実施例で具体的に説明したが、本発明の範
囲内で多くの変更・修正を実施できることは当然
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ リガンドおよび同族の抗リガンドからなる特
   異的結合対の一員である被分析物の試料中におけ
   る存在を、試薬として、(a)該特異的結合対の一員
   を分散性の不連続粒子に結合してなる粒子結合
   体；(b)それを構成する一員の励起により発光する
   ことができる信号発生系の一員に結合された該特
   異的結合対の一員からなる信号ラベル結合体；お
   よび(c)該信号ラベル結合体に結合したときは信号
   発生能力を変調できるが、該信号ラベル結合体が
   該粒子結合体に結合されたときは該変調が阻害さ
   れる光吸収性の信号抑制体粒子；を使用して測定
   する方法であつて： (i) 水性分析媒質中において、該試料、粒子結合
   体、信号ラベル結合体、信号抑制体および該信
   号発生系のすべての付随的な試薬をあわせ、 ただし、特異的結合対の該一員が該被分析
   物、粒子結合体および信号ラベル結合体のいず
   れに対しても同一である場合には、該同族一員
   を添加し、 (ii) 該信号発生系が出す光を少なくとも１波長値
   で測定することからなる方法。 ２ 該水性分析媒質が約10〜50℃の範囲内の温度
   および約５〜10の範囲内のPHである特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３ 該信号発生系が400nｍより長波長の光を発
   するケイ光体を包含する特許請求の範囲第２項記
   載の方法。 ４ 該信号発生系が化学ルミネセンス性分子を包
   含する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５ 該信号抑制体粒子が炭素を主成分とするもの
   である特許請求の範囲第２項ないし第４項のいず
   れかに記載の方法。 ６ 該炭素系信号抑制体粒子が炭である特許請求
   の範囲第５項記載の方法。 ７ 該信号ラベルの受容体が該信号抑制体粒子に
   結合されている特許請求の範囲第２項ないし第４
   項のいずれかに記載の方法。 ８ 該信号ラベルが信号の発生に先立つて酵素と
   反応し、該酵素が該信号発生系の一員である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ９ 該信号ラベルがケイ光体の前駆体である特許
   請求の範囲第８項記載の方法。 １０ リガンドとその同族抗リガンドからなる特
   異的結合対のうちのリガンドである被分析物の試
   料中における存在を、試薬として、(a)該特異的結
   合対の一員を分散性の不連続固体粒子に結合して
   なる粒子結合体；(b)それを構成する一員の励起に
   より発光することができる信号発生系の一員に結
   合された該特異的結合対の一員からなる信号ラベ
   ル結合体；および(c)該信号ラベル結合体に結合し
   たときは発光を抑制できるが、該信号ラベル結合
   体が該粒子結合体に結合されたときは発光が抑制
   される不透明な信号抑制体粒子；を使用して測定
   する方法であつて、 (i) PHが約6.5〜9.5の範囲内の水性媒質中で、該
   試料、粒子結合体、信号ラベル結合体、信号抑
   制体および該信号発生系のすべての付随的な試
   薬をあわせ、 ただし、特異的結合対の該一員が該被分析
   物、粒子結合体および信号ラベル結合体のいず
   れに対しても同一であるときには、該同族一員
   を添加し、 (ii) 該信号発生系が出す光を少なくとも１波長値
   で測定することからなる特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 １１ 該リガンドがポリアミノ酸である特許請求
   の範囲第１０項記載の方法。 １２ 該信号発生系が、400nｍより長波長の光
   を発する抗リガンドに結合されたケイ光体を包含
   する特許請求の範囲第１０項または第１１項記載
   の方法。 １３ 該ケイ光体がフルオレセインである特許請
   求の範囲第１２項記載の方法。 １４ 該信号抑制体粒子が炭素を主成分とするも
   のである特許請求の範囲第１０項または第１１項
   記載の方法。 １５ 該炭素系信号抑制体粒子が炭である特許請
   求の範囲第１４項記載の方法。 １６ 信号ラベルの受容体が該信号抑制体粒子に
   結合されている特許請求の範囲第１４項記載の方
   法。 １７ 該試料中の不純物に対する受容体が該信号
   抑制体粒子に結合されている特許請求の範囲第１
   ４項記載の方法。 １８ サンプル中の受容体（被分析物）を測定す
   る方法であり、該受容体は該受容体がその同族リ
   ガンドに対する抗リガンドであるという関係にあ
   る第１の結合対と、該受容体がその同族抗受容体
   に対するリガンドであるという関係にある第２の
   結合対という２つの特異的結合対の一員であり、
   したがつて分析法にリガンド、受容体（被分析
   物）および抗受容体が存在する方法であり、試薬
   として、(a)リガンドを分散性の不連続固体粒子に
   結合してなる粒子結合体；(b)それを構成する一員
   の励起により発光することができる信号発生系の
   一員に結合された抗受容体の一員からなる信号ラ
   ベル結合体；および(c)該信号ラベル結合体に結合
   したときは発光を抑制できるが、該信号ラベル結
   合体が該粒子結合体に結合されたときは発光が抑
   制される不透明な信号抑制体粒子；を使用して測
   定する方法であつて、 (i) PHが約５〜10の範囲内で温度が約10〜50℃の
   範囲内である水性分析媒質中で、該試料、粒子
   結合体、信号ラベル結合体、信号抑制体および
   該信号発生系のすべての付随的な試薬をあわ
   せ、 (ii) 該信号発生系が出す光を少なくとも１波長値
   で測定することからなる特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 １９ グロブリンと抗グロブリンからなる特異的
   結合対の一員であるグロブリン（被分析物）の試
   料中における存在を、試薬として、(a)グロブリン
   を分散性の不連続固体粒子に結合してなる粒子結
   合体；(b)抗グロブリンを、約450nｍより長波長
   の光を発するケイ光性分子に結合してなる信号ラ
   ベル結合体；および(c)信号抑制体粒子としての炭
   粒子、を使用して測定する方法であつて、 (i) 水性分析媒質中で該試料、粒子結合体、信号
   ラベル結合体および炭粒子をあわせ、 (ii) 該ケイ光体が吸収する光の照射により該ケイ
   光体が発する光を、少なくとも１波長値で測定
   することからなる特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ２０ 該グロブリンが免疫グロブリンであり、該
   ケイ光体がフルオレセインである特許請求の範囲
   第１９項記載の方法。 ２１ リガンドと同族の抗リガンドとからなる特
   異的結合対の一員である被分析物の試料中におけ
   る存在を、試薬として、(a)該特異的結合対の一員
   を分散性の不連続固体粒子に結合してなる粒子結
   合体；(b)分析媒質から出る光の量を変調させるこ
   とができる信号発生系の一員に結合された該特異
   的結合対の一員からなる信号ラベル結合体；およ
   び(c)該信号ラベル結合体に結合したときは該光の
   変調に影響できるが、該信号ラベル結合体が該粒
   子結合体に結合されたときは該光変調への影響が
   阻害される不透明な信号抑制体粒子；を使用して
   測定する方法であつて： (i) 水性分析媒質中で、試料、粒子結合体、信号
   ラベル結合体、信号抑制体および該信号発生系
   のすべて付随的な試薬をあわせ、 ただし、特異的結合対の該一員が該被分析
   物、粒子結合体および信号ラベル結合体に対し
   て同一であるときには、該同族一員を添加し、 (ii) この分析媒質から出る光を少なくとも１波長
   値で測定することからなる特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ２２ リガンドと抗リガンドからなる特異的結合
   対の一員を測定するためのキツトであつて； 分散性の不連続固体粒子に結合させた該特異的
   結合対の一員から本質的になる粒子結合体；信号
   発生系の一員から本質的になる信号ラベル結合
   体、ここで該信号発生系は該特異的結合対の一員
   に結合したその構成員の１つの励起により発光す
   ることができるものである；および該信号ラベル
   結合体が該粒子に結合しているときには該信号ラ
   ベル結合体の発光を抑制することができる不透明
   粒子；からなるキツト。 ２３ 該信号抑制体粒子が炭である特許請求の範
   囲第２２項記載のキツト。