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Die Erfindung bezieht sich auf das Feld spezifischer
Bindungsassays, insbesondere Immunassays zum Bestimmen von
Substanzen, die von klinischem Interesse sind.
Spezifische Bindungsassays beruhen auf der spezifischen
Wechselwirkung zwischen einem Liganden, d.h., einem bindbaren zu
bestimmenden Analyten, und einem Bindungspartner dafür,
d.h., einem Rezeptor. Wenn entweder der Ligand oder sein
Bindungspartner ein Hapten oder Antigen ist, und der
andere ein korrespondierender Antikörper, ist der Assay als
Immunassay bekannt.
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Viele Eigenschaften natürlicher Zellmembranen können in
einfachen Lipiddoppelschichtsystemen, die als Liposomen
bezeichnet werden, dupliziert werden. Eine dieser
Eigenschaften ist die Lyse. Wenn eine vesikuläre Membran,
beispielsweise ein Liposom, ein extern zugängliches Antigen
enthält, wird es mit seinem korrespondierenden Antikörper
reagieren. Wenn das Antigen-sensibilisierte Liposom mit
dem korrespondierenden Antikörper in Gegenwart von
Komplement reagiert, ist die Membran irreversibel geschädigt
und kann nicht länger als intakte selektive
Permeabilitätsbarriere fungieren. Dies ist die Immunolyse.
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Das Ausmaß der Immunolyse ist unter Verwendung
Antigensensibilisierter Liposomen, die irgendeinen einer
Vielzahl eingeschlossener Markermoleküle enthalten, die nach
Immunolyse freigesetzt werden, verfolgt worden. Siehe
Hixby et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 64: 290-295 (1969);
Kinsky et al., Biochemistry, 8: 4149-4158 (1969); Kinsky
et al., Biochemistry, 9: 1048 (1970). Siehe auch Six et
al., Biochemistry, 13: 4050 (1974); Uemura et al., J.
Biochem., 87: 1221 (1980); und Uemura et al., J. Immunol.
Methods, 53: 221-232 (1982); Kataoka et al., Biochem.
Biophys. Acta, 298: 158-179 (1973); Haga, Biochem.
Biophys. Res. Comm., 95: 187-192 (1980); Solomon et al.,
Biochem. Biophys. Acta., 455: 332-342 (1976); Tokunaga et
al., FEBS Letters, 106: 85-88 (1979) und Magee et al., J.
Cell Biology, 63: 492-504 (1974).
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Es sind spezifische Bindungsassaysysteme vorgeschlagen
worden, die ein Liposom verwenden, das so hergestellt
oder behandelt worden ist, daß ein Ligand oder Analogon
eines Liganden an die Oberfläche gebunden und ein Marker
oder eine Reagenzsubstanz im Vesikel eingeschlossen ist.
Die verbleibenden Reagentien für den Assay umfassen (1)
einen Bindungspartner für den Liganden, z.B. einen
Antikörper, und (2) Komplement, um die Lyse des Vesikels nach
Bindung des Bindungspartners an den oberflächengebundenen
Liganden zu bewirken. Siehe allgemein Gregoriadis et al.,
Liposomes in Biological Systems, John Wiley & Sons, N.Y.
(1980), insbesondere Kapitel 12, betitelt "Liposomes as
Diagnostic Tools".
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Weiterhin sind Immunassaysysteme offenbart worden, in
denen die Verwendung eines Enzyme einschließenden Liposoms
vorgeschlagen wird. Hsia et al., beschreiben im US-Patent
Nr. 4,235,792 ein kompetetives homogenes
Immunassayverfahren, das auf der Immunolyse eines
Antigen-sensibilisierten Liposomes, das einen Marker enthält, beruht.
Unter den offenbarten Markern sind Enzyme (Spalte 6, Zeilen
24-28). Cole offenbart im US-Patent Nr. 4,342,826 einen
spezifischen Bindungsassay unter Verwendung eines
Antigen-sensibilisierten, enzymhaltigen Liposoms. Diese
Liposomen werden immunspezifisch veranlaßt, nach Bindung
eines
korrespondierenden Antikörpers und Fixierung aktiven
Komplements Enzym zu exponieren. Nach Enzymexposition
wird die Gegenwart oder das Fehlen einer enzymatischen
Aktivität nachgewiesen. Cole betont den Vorteil, ein
homogenes System bereitzustellen, in dem die enzymatische
Aktivität nach Lyse wesentlich größer ist, beispielsweise
ein "Signal:Rauschuntergrund"-Verhältnis von mindestens 5
- 10 und bevorzugt über 60.
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Beeinträchtigungen in Immunassays können auf einer
Vielzahl von Wechselwirkungen zwischen der Probe und dem
Marker beruhen. Beispielsweise kann die Beeinträchtigung,
wenn der Marker ein Enzym ist, auf der Gegenwart
endogener Enzyme, nicht spezifischer Bindungsproteine und
Enzyminhibitoren in der Probe beruhen. Diese
Beeinträchtigungen können durch kluge Auswahl eines geeigneten
Markers, den Zusatz von hemmenden Mitteln und/oder Schritte
zur Vorbehandlung der Probe eliminiert werden. Cole
beschreibt die getrennte und unabhängige Vorbehandlung der
Probe vor Durchführung eines Assays. Es ist jedoch nicht
Zweck dieser Erfindung, die bekannten Beeinträchtigungen
und Verfahren zu ihrer Vermeidung anzusprechen.
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Wir haben vielmehr in Liposomen-Immunassays eine neue
Klasse von Beeinträchtigungen beobachtet, die auf
Wechselwirkungen zwischen der Probe und der Membran des
Liposomes, das den Marker einschließt, zu beruhen scheinen.
Bestimmte Bestandteile der Probe scheinen an die Membran
des Liposoms zu binden und führen zu falschen
Ergebnissen, die höher oder niedriger sein können, als einer
Antikörper-abhängigen Immunolyse zugeschrieben werden
kann. Ob ein solches falsches Ergebnis höher oder
niedriger ist, hängt von der Art und Weise ab, in der die
beeinträchtigende Substanz die Liposomenmembran beeinflußt.
Der Stand der Technik stellt keine Mittel zur Verfügung
und schlägt auch keine Mittel vor, diese Typen von
Beeinträchtigung zu eliminieren.
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Im Gegensatz zum Stand der Technik stellt die vorliegende
Erfindung ein neues Verfahren und eine
Reagenzienzusammensetzung zum Durchführen von Liposomen-Immunassays zur
Verfügung, bei dem bzw. der die Effekte der
Proben-Beeinträchtigungen minimiert sind, und das keine
Probenvorbehandlung erfordert, um ein solches Ergebnis zu erhalten.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist insbesondere
geeignet für automatisierte analytische Systeme und für die
Analytbestimmung, die große Probenvolumina erfordert, das
heißt, solche, in denen die Effekte solcher
beeinträchtigenden Substanzen nicht ausverdünnt werden.
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Das erfindungsgemäße Liposomen-Immunassayverfahren zum
Bestimmen eines Analyts in einer Probe mit verringerter
Beeinträchtigung durch eine endogene Spezies umfaßt die
Schritte:
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a) Mischen der Probe zum Herstellen einer
Reaktionsmischung mit
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(i) einem ersten Liposom, enthaltend einen
eingeschlossenen Marker oder einen Bestandteil
eines Markersystems und den Analyten oder ein
Analogon des Analyten, eingebaut in die Membran
des Liposoms, um eine erste Bindungsdomäne
bereitzustellen;
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(ii) einen Bindungspartner, der zur Reaktion mit dem
Analyten und der ersten Bindungsdomäne des
ersten Liposoms fähig ist;
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(iii) Komplement, das die Permeabilität des ersten
Liposoms in Antwort auf das Binden des
Analyten oder des Analogons des Analyten, die in
die Membran des ersten Liposoms eingebaut
sind, und des Bindungspartners verändert;
und
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(iv) einem zweiten Liposom, um mindestens eine
zweite Bindungsdomäne bereitzustellen, die
nicht zur Kreuzreaktion mit der ersten
Bindungsdomäne für den Bindungspartner fähig ist;
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b) Inkubieren der Reaktionsmischung, wobei das Binden
der endogenen Spezies an die mindestens eine zweite
Bindungsdomäne die Menge von beeinträchtigenden
Spezies, die das erste Liposom binden, verringert;
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c) Messen des Markers der ersten Liposomen, die eine
veränderte Permeabilität in Antwort auf das Komplement
zeigen; und
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d) In-Beziehung-setzen der Messung zu der Bestimmung des
Analyten.
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Jede endogene Spezies in der Mischung, die dazu neigt, an
das erste Liposom zu binden oder es direkt zu
beeinträchtigen, bindet kompetitiv an das zweite Liposom eher denn
an das erste Liposom und steigert so die Genauigkeit des
Immunassays.
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Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine
Reagenzzusammensetzung für einen Liposomen-Immunassay zum
Bestimmen der Gegenwart eines Analyten in einer flüssigen
Probe, von der angenommen wird, daß sie beeinträchtigende
endogene Spezies enthält, zur Verfügung, wobei die
Reagenzzusammensetzung umfaßt:
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a) ein erstes Liposom, enthaltend einen eingeschlossenen
Marker oder Bestandteil eines Markersystems und den
Analyten oder ein Analogon des Analyten, eingebaut in
die Membran des Liposoms, um eine erste Bindungsdomäne
bereitzustellen;
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b) einen Bindungspartner, der zur Reaktion mit dem
Analyten und der ersten Bindungsdomäne des ersten
Liposomens fähig ist;
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c) Komplement, das die Permeabilität des ersten Liposomes
in Antwort auf das Binden des Analyten oder des
Analogons des Analyten, die in die Membran des ersten
Liposoms eingebaut sind, und des Bindungspartners
verändert; und
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d) ein zweites Liposom, um mindestens eine zweite
Bindungsdomäne, die nicht zur Kreuzreaktion mit der
ersten Bindungsdomäne für den Bindungspartner fähig
ist, bereitzustellen.
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Die Erfindung wird veranschaulicht durch den Vergleich
der Genauigkeiten spezifischer Bindungsassays, in denen
die Reaktionsmischung eine zweite
Liposomenzusammensetzung entweder enthält oder nicht enthält. Ein solcher
Vergleich zeigt, daß die Einbeziehung eines zweiten
Liposomes
einen Assay von stark verbesserter Genauigkeit auf
der Basis einer Korrelation mit einem
Vergleichs-Radioimmunassay zur Verfügung stellt.
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Noch weitere Verbesserungen der Genauigkeit werden
erreicht, in dem als weiterer Schritt lösliche
Phosphorsäureester in die Reaktionsmischung eingeführt werden, um in
der Lösung Phosphorylestergruppen bereitzustellen.
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Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung
wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen, wobei:
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Fig. 1 eine Korrelation von T&sub4;-Werten (ug/dl) von zwanzig
klinischen Proben, die mit einem Liposom-Immunassay
(LIA)-Protokoll und Radioimmunassay (RIA) bestimmt
wurden, zeigt; sie zeigt eine schlechte Korrelation.
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Fig. 2 zeigt die Auswirkungen auf die Korrelationsdaten
von Fig. 1, wenn ein Liposom, das mindestens eine Domäne
von Phosphorylestergruppen ausprägt, die von denen des
Markerliposoms unterschiedlich sind, um so die
Serumbeeinträchtigungen zu verringern, verwendet wird;
und
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Fig. 3 zeigt die Auswirkungen auf die Korrelationsdaten
von Fig. 2, wenn Phosphorylestergruppen, die in der
Reaktionsmischung löslich sind, zusätzlich in solch
einem Liposom verwendet werden, um die
Serumbeeinträchtigungen weiter zu verringern, wobei das Fehlen einer
Ausreißerprobe auf eine weitgehende Elimination von
Serumbeeinträchtigungen hinweist.
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Spezifische Ausdrücke in der folgenden Beschreibung, die
sich auf eine besondere Ausführungsform beziehen, sind
beispielhaft für alle anderen Ausführungsformen, wenn es
nicht anders angegeben ist.
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Probenflüssigkeiten, mit denen der Immunassay
durchgeführt werden kann, umfassen biologische, physiologische,
industrielle, Umwelt-Proben und andere Typen von
Flüssigkeiten. Von besonderem Interesse sind biologische
Flüssigkeiten, so wie Serum, Plasma, Urin, cerebrospinale
Flüssigkeit, Speichel, Milch, Nährlösungen und andere
Kulturmedien und Überstände sowie Fraktionen irgendeiner
der Flüssigkeiten. Andere Quellen für
Probenflüssigkeiten, die mit herkömmlichen Verfahren getestet werden,
werden als innerhalb der Bedeutung dieses Ausdrucks
liegend, so, wie er hier verwendet wird, angesehen, und
können ebenso nach dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet
werden.
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Die Ausdrücke "Ligand" oder "Analyt" beziehen sich auf
jede Substanz oder Klasse in Beziehung stehender
Substanzen, deren Gegenwart in einer Probenflüssigkeit mittels
eines Immunassays, beispielsweise dem gerade
beschriebenen, qualitativ oder quantitativ bestimmt werden kann.
Der Ausdruck "zur Kreuzreaktion fähiges Ligandenanalogon"
bezeichnet eine Substanz, die nicht mit einem Liganden
identisch ist, aber die gleiche Bindungsspezifität, z.B.,
immunologische Spezifität hat. So ist es beispielsweise
bekannt, daß in einem Assay für Gentamicin mit dem
entsprechenden Antiserum die Reagenzzusammensetzung
Gentamicin selbst oder Sisomycin, das zur Kreuzreaktion fähig
ist, verwendet werden kann. Das vorliegende Verfahren
kann für Assays von Liganden, für die es einen
spezifischen
Bindungspartner gibt, und umgekehrt, für die
Bestimmung der Kapazität eines flüssigen Mediums, einen
Liganden zu binden (gewöhnlich infolge der Gegenwart eines
Bindungspartners für den Liganden in der Probe) verwendet
werden. Der Ligand ist gewöhnlich ein Peptid, Protein,
Kohlenhydrat, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes
organisches Molekül, für das spezifische Bindungspartner
existieren oder durch immunologische oder synthetische
Mittel bereitgestellt werden können. Der Ligand wird,
funktionell ausgedrückt, gewöhnlich aus Antigenen und
dagegen gerichteten Antikörpern, Haptenen und dagegen
gerichteten Antikörpern, und Hormonen, Vitaminen,
Metaboliten und pharmakologischen Mitteln, außerdem ihren
Rezeptoren und Bindungssubstanzen und normalen
Serumbestandteilen und Krankheitsmarkern ausgewählt.
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Der Ausdruck "Bindungspartner" oder "Rezeptor" bezeichnet
jede Substanz oder Klasse von Substanzen, die eine
spezifische Bindungsaffinität für den Liganden in Preferenz
gegenüber anderen Substanzen aufweist. In der Mehrheit
der hier beschriebenen Assays umfaßt das Reagenz
Bestandteile, die mit dem Liganden oder seinen
Bindungseffektoren in der Probe auf immunchemische Weise wechselwirken.
Das bedeutet, daß es eine Antigen-Antikörper- oder
Hapten-Antikörperbeziehung zwischen Reagenz und Liganden
oder seinem Bindungseffektor in der Probe gibt. Im Stand
der Technik ist jedoch bekannt, daß andere
Bindungswechselwirkungen zwischen dem Liganden und seinem
Bindungspartner als Basis für spezifische Bindungsassays dienen,
einschließlich der Bindungswechselwirkung zwischen
Hormonen, Vitaminen, Metaboliten und pharmakologischen Mitteln
und ihren jeweiligen Rezeptoren und Bindungssubstanzen.
Beispielsweise werden Polypeptidhormonrezeptoren als
Bindungsagentien oder Partner in Langan et al., (Eds.).
Liband Assay, Masson Publishing U.S.A. Inc., New York,
Seiten 211 et seq (1981) diskutiert.
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Der Ausdruck "selektiv zugängliche Vesikel" bezeichnet
einfach- oder mehrfach-kompartimentierte Säcke, die ein
inneres Volumen umschließen, eine aus einer oder mehreren
Bestandteilen zusammengesetzte Wand haben und ein oder
mehrere innere geschlossene Kompartimente bilden. Ein
Beispiel eines solchen Vesikels ist ein "Zellgeist"
("cell ghost"), der durch Öffnen einer zellulären
Membran, Entfernen der internen Bestandteile aus der Zelle
und Wiederverschließen der Membran gebildet wird. Ein
weiteres Beispiel ist ein Liposom, welches ein
einfachoder ein mehrfach-kompartimentierter Vesikel sein kann,
der aus Lipiden aufgebaut ist, insbesondere
Lipidmischungen, die mindestens ein Phospholipid umfassen, wobei die
Lipide eine kontinuierliche einfache oder
doppelschichtige geschlossene Lipidmembran bilden. Zusätzliche
gewöhnliche Bestandteile dieser Lipidmischungen sind
Cholesterin und geladene, langkettige Phosphate. Liposomen können
durch irgendeines einer Vielzahl von Verfahren
hergestellt werden. Beispielsweise können multilamellare
Vesikel durch Filmverdampfung und Hydrierung eines
Lipidfilmes und auch durch Umkehrphasenverdampfungsverfahren
hergestellt werden. Für einen allgemeinen Überblick über
Liposomen und ihre Herstellung wird auf Papabadjopoulos et
al., (Eds.), Liposomes, Ann. N.Y. Acad. Sci., Volume 308
(1978); Tom et al., (Eds.), Liposomes and Immunobiology,
Elsevier North Holland Inc., N.Y. (1980); und Gregoriadis
et al., Liposomes in Biological Systems, John Wiley &
Sons. N.Y. (1980), verwiesen.
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In Immunassays verwendete Liposomen werden so
hergestellt, daß in die Oberfläche Liganden oder
Ligandenanaloge Gruppen eingebaut sind. Solche Liposomen werden
unter Verwendung von Liganden-Amphiphil-Konjugaten
gebildet, die gewöhnlich die Form eines
Liganden-Koppler-Amphiphil-Moleküles haben. Amphiphile sind
Substanzen, die sowohl wasserlösliche als auch wasserunlösliche
Bereiche enthalten. Solche Substanzen werden am besten
durch Lipidamphiphile veranschaulicht, beispielsweise
Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylserine,
Phosphatidylinositol, Sphingomyelincerebroside, Phosphatidsäure,
Plasmalogene, Cardiolipine und Fettsäuren. Wenn Liposomen
vorgeformt werden, können an ihrer äußeren Oberfläche
chemische funktionelle Gruppen (functionalities)
existieren, an die die Rezeptoren des Liganden, der getestet
werden soll, kovalent gebunden werden können.
Entsprechende Reaktionen, die verwendet werden können, um eine
solche Bindung zu bewirken, sind in Williams et al.,
Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1,
Academic Press, New York (1967) beschrieben. In einigen Fällen
können die Antigene an der Liposomenoberfläche adsorbiert
werden, wie von Uemura und Kinsky, Biochemistry, 11:
4085-4094 (1972) gezeigt wurde.
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Um den erfindungsgemäßen Liposomen-Immunassay
durchzuführen, ist Komplement anwesend, das die
Vesikelzugänglichkeit in Antwort auf die Bindung eines in die Oberfläche
eingebauten Liganden oder Ligandenanalogons und des
Bindungspartners verändert. Normalerweise sind die
Phosphorylkopfgruppen in der Liposomenmembran wegen der
Ladung nach außen in Richtung zum wäßrigen Medium
orientiert. Beispielsweise gibt es in der Phosphatidylcholin-
Kopfgruppe eine negative Ladung auf der Phosphatgruppe
und eine positive Ladung auf der Cholingruppe. Zusätzlich
ist der oberflächengebundene Ligand oder das Analogon des
Liganden nach außen in Richtung auf das wäßrige Medium
orientiert, so daß ein Antikörper daran binden kann. Die
Bindung von zwei solchen Antikörpern der IgG Klasse in
enger Nachbarschaft auf der äußeren Oberfläche der
Membran führt zur Fixierung von Komplement und
anschließender Lyse. Ein zusätzliches Erfordernis ist, daß die
beiden IgG Antikörper zu einer oder mehreren der
Unterklassen gehören, die zur Komplementfixierung fähig sind. Es
ist jedoch nur ein Antikörper der IgM Klasse
erforderlich, um Komplement zu fixieren und Lyse zu induzieren.
Für einen allgemeinen Überblick über Komplement und seine
Wirkungen siehe Rapp et al., Molecular Basis of
Complement Action, Appleton-Century-Crofts, New York (1970).
Die Rolle von Komplement wird außerdem in vielen der oben
zitierten Referenzen, die andere Liposomen-Immunassays
betreffen, angesprochen.
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Das Verfahren kann eines einer Vielzahl von
Nachweissystemen zum Verfolgen der Immunolyse verwenden,
einschließlich der in den oben zitierten Referenzen
beschriebenen. Ein neues Nachweissystem umfaßt ein stabiles
Nitroxid (engl.: nitroxid)- oder einen Fluoreszenzmarker,
dessen Signalintensität als Folge der Immunolyse
ansteigt. Außerdem können, wie ursprünglich von Kinsky et
al., supra., gezeigt, Enzymsubstrate innerhalb der
Liposomen eingeschlossen werden, die mit einem Enzym unter
Erzeugung eines messbaren Zustandes reagieren, wenn die
Lyse eine Vermischung mit dem entsprechenden Enzym
gestattet. Die umgekehrte Konfiguration, d.h., wo Enzym in
die Liposomen eingeschlossen ist und Substrat in die
Reaktionsmischung eingeführt wird, kann ebenso verwendet
werden. Infolge ihrer hohen Empfindlichkeit und der
Vielzahl von Enzym-Substrat-Kombinationen, die verfügbar
sind, ist die Verwendung von Enzymen wünschenswert.
Solche Enzyme umfassen beispielsweise alkalische
Phosphatase, Galactosidase, Glucoseoxidase, Dehydrogenasen,
Urease und verschiedene Proteasen. In der gleichzeitig
anhängigen EP-A-0140521, die am 24. August 1984
eingereicht worden ist und dem gleichen Rechtsnachfolger
übertragen worden ist, wird eine neue Variante verwendet,
wobei eingeschlossene Peroxidase gegenüber dem
Substratsystem dann aktiver ist, wenn das Liposom intakt ist, als
wenn es lysiert ist. Es wird angenommen, daß bei diesem
Phänomen eine Konversion eines permeablen Substrates
(Wasserstoffperoxid) zu einem reaktiven Intermediat eine
Rolle spielt, das durch die Membran passiert und einen
zweiten Bestandteil des Substratsystemes oxidiert, um ein
chemilumineszierendes Signal zu erzeugen. Die Lyse führt
zur Inhibition des eingeschlossenen Enzyms und einer
Verringerung des Signals. Weiterhin können multiple
Enzymsysteme verwendet werden, wo das eingeschlossene Enzym
nach Lyse ein Produkt erzeugt, das als Substrat für ein
zweites Enzym, das in der Reaktionsmischung vorhanden
ist, dient. Beispielsweise kann das eingeschlossene Enzym
Glucoseoxidase sein, die Wasserstoffperoxid erzeugt, das
als Substrat für peroxidase dient. Multiple Enzymsysteme
haben Vorteile hinsichtlich der Empfindlichkeit und einer
Verringerung des Hintergrundsignals.
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Im folgenden wird auf den Ausdruck "leeres" Liposom Bezug
genommen. Dieser Ausdruck bezeichnet ein Liposom, das, im
Gegensatz zu den oben beschriebenen, keinen Bestandteil
des Nachweissystemes in sich oder einen Liganden auf
seiner Oberfläche enthält. Das von der Membran des leeren
Liposoms eingeschlossene Volumen kann Salze, Puffer und
andere Materialien, beispielsweise Kohlenhydrate,
Phosphatesterverbindungen und Proteine, enthalten.
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Beeinträchtigungen von Liposomen-Immunassays sind im
allgemeinen von dem Typ, bei dem eine unspezifische Lyse
des Liposomes induziert wird oder bei dem die Immunolyse
durch den spezifischen Antikörper und aktives Komplement
inhibiert wird. Solche Beeinträchtigungen werden
teilweise durch die Bindung von Probenbestandteilen an
die Liposomenmembran verursacht und werden durch die
vorliegende Erfindung angesprochen.
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Eine Klasse von Bindungsbestandteilen, die in humanem
Serum existieren kann, sind natürliche Antikörper gegen
Phospholipide und Liposomen, wie beispielsweise in C.
Alving, Biochem. Soc. Trans., Seite 342 (1984)
diskutiert. Es ist gezeigt worden, daß solche natürlichen
Antikörper in ungefähr 10% der anscheinend normalen humanen
Serumproben vorhanden sind und nicht mit irgendeinem
besonderen Erkrankungszustand verbunden sind. Weiterhin
können solche natürliche Antikörper Komplement als eine
Folge der Bindung an Liposomen fixieren, was zu
unspezifischer Lyse führt. Eine Probe, die solche natürliche
Antikörper enthält, wird daher ein mit einer gesteigerten
Lyse verbundenes Signal erzeugen und zur Unterschätzung
der Ligandenkonzentration in der Probe führen.
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Mit bestimmten Autoimmunerkrankungen sind Antikörper
gegen nukleäres Material, beispielsweise DNA, verbunden.
Solche Antikörper können eine Spezifität für Domänen und
Phosphatestergruppen aufweisen, die die Nukleoside der
DNA verbrücken. Sie können daher ebenso mit Bereichen der
Liposomenoberfläche, die exponierte Phosphatestergruppen
aufweisen, kreuzreagieren oder daran binden. Eine solche
Bindung kann entweder zur Aktivierung des Komplements und
daraus folgender Immunolyse oder im Gegenteil zur
Inhibition der Komplementaktivierung durch Blockieren von
Ligandenbindungsstellen auf der exponierten
Membranoberfläche des Liposomes führen.
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Eine weitere Klasse von Bindungsbestandteilen, die in
humanem Serum existieren kann, sind Peptide, Lipoproteine
und von natürlichen Antikörpern verschiedene Proteine.
Ein Beispiel ist das globuläre Protein, C-reaktives
Protein (CRP), das bei Entzündungszuständen endogen erzeugt
wird und zur Komplementfixierung nach Bindung an die
Membran von Liposomen fähig ist. Als eine Folge tritt Lyse
auf und führt zur Unterschätzung der
Testligandkonzentrationen in der Probe.
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Weiterhin kann die Bindung natürlicher Antikörper an die
Liposomenmembran oder andere Probenbestandteile, die zur
Komplementaktivierung unfähig sind, zur Inhibition der
spezifischen Immunolyse führen. Wenn eine solche Bindung
in der Nachbarschaft einer Ligandengruppe auf der
Membranoberfläche geschieht, kann das die Bindung des
Liganden durch den entsprechenden Antikörper verhindern oder
zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit des Auftretens
von Antikörper/Ligandenpaaren, die für die
Komplementaktivierung erforderlich sind, führen. In diesem Fall wird
die Inhibition einer spezifischen Immunolyse eine
fälschlich zu hohe Schätzung der Ligandenkonzentration in der
Probe nach sich ziehen.
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Im allgemeinen gewinnen Beeinträchtigungen der
beschriebenen Typen an Bedeutung, wenn die Konzentration des
Serums in dem Assay steigt, und sie werden daher öfter in
Assay von niedrig konzentrierten Analyten, die eine hohe
Empfindlichkeit erfordern, beispielsweise solche für
therapeutische Wirkstoffe, z.B. Digoxin, gefunden werden, wo
falsche Angaben möglicherweise fatale Folgen haben.
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Das Cardiolipinantigen ist ein Phospholipid, von dem
bekannt ist, daß es für Syphilistests spezifisch ist.
Von Antikörpern gegen Cardiolipin ist gezeigt worden,
daß sie mit DNA und Phospholipiden kreuzreagieren. Es
wird Bezug genommen auf Cuarnier, Biochem. Biophys.
Acta. Vol. 58, Seite 347 (1974) und auf Lipids, Vol. 9,
Seite 692 (1974). Diese Referenzen legen nahe, daß
Antikörper gegen Phospholipide und andere Verbindungen,
die Phosphatestergruppen aufweisen, eine beschränkte
Spezifität haben. Wir haben beobachtet, daß natürliche
Antikörper oder Nichtantikörper-Serumbestandteile auch
eine beschränkte Spezifität für Phospholipide und andere
Verbindungen, die Phosphatestergruppen enthalten,
aufweisen und daher ihre Bindung an "Marker"-Liposomen
durch bestimmte Phospholipid- und
Phosphatesterzusammensetzungen, die in die Reaktionsmischung eingeführt
werden und nicht einen Teil des Nachweissystemes bilden,
blockiert werden könnte.
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Solche Beeinträchtigungen werden beispielsweise
mindestens zum Teil durch die Verwendung von "leeren"
Liposomen eliminiert, die eine Lipidzusammensetzung aufweisen,
die analog der des Liganden-tragenden oder
"Marker"-Liposomes sind. Wenn jedoch in das "leere" Liposom
Cardiolipin oder ein nicht zur Kreuzreaktion fähiges
Ligandenanalogon eingebaut wurde, waren solche Beeinträchtigungen
wesentlich verringert. Es wird angenommen, daß ein
solches
"leeres" Liposom eine Domäne darstellt, die nicht
nur das spezifische Phospholipid zur Eliminierung von
Beeinträchtigungen einschließt, sondern auch eine
gestörte Membranstruktur aufweist, die die Bindung solcher
Beeinträchtigungen beschleunigt. Das bedeutet, daß die
Bindung der beeinträchtigenden Substanz in dem Serum
durch den Einbau eines kreuzreagierenden Zusatz es in die
Doppelschichtmembran oder das "leere" Liposom, das eine
Domäne höherer Reaktivität gegenüber dem
beeinträchtigenden Serumbestandteil zur Verfügung stellt, gesteigert
wird.
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Weiterhin kann eine Kombination von Cardiolipinliposom
und löslichem Phosphatester, beispielsweise
Phosphorylcholin oder cyclischem Uridin-2',3'-Phosphatester,
verwendet werden, um all solche Beeinträchtigungen in dem
Immunassay signifikant zu eliminieren. Von besonderer
Bedeutung ist die Tatsache, daß weder Cardiolipin noch
Uridinphosphat irgendeine strukturelle Ähnlichkeit mit den
Kopfgruppen der Liganden-tragenden Liposomen mit Ausnahme
der Gegenwart von Phosphatestergruppen aufweisen.
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Es ist vorherzusehen, daß andere leere Liposome zur
Elimination solcher Beeinträchtigungen in einem Immunassay
hergestellt werden können, beispielsweise durch
Manipulation der Lipidzusammensetzung der Membran und/oder
Zufügen von membranlöslichen Bestandteilen und Kopfgruppen
der Membran.
BEISPIEL I
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Dies Beispiel zeigt die Korrelation eines T&sub4;-Liposomen-
Immunassays mit einem Radioimmunassay in Abwesenheit von
die Beeinträchtigungen entfernenden Zusätzen, wie z.B.
"leeren" Liposomen und Phosphorylcholin.
Reagenzien
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T&sub4;-sensibilisierte Liposomen, enthaltend
ß-Galactosidaseenzym, wurden in einer Flasche durch
Mischen von 220 ul Eilecithin (Sigma Chemical Co., Palo
Alto, CA), 5,25 mg Dicetylphosphat, 8,70 mg Cholesterin,
0,65 mg DL-α-Tocopherol und 2,19 mg T&sub4;-Konjugat in 100 ml
Chloroform hergestellt. Das T&sub4;-Konjugat wurde wie von
Hsia, supra, beschrieben, hergestellt. Auf der inneren
Oberfläche des Bechers wurde durch Verdampfen der
Mischung bei 40ºC an einem Rotationsverdampfer ein
Lipidfilm gebildet und weiter mit einem Hochvakuumsystem bei
Raumtemperatur 1 h getrocknet. Die Liposomen wurden durch
Hydrierung des Lipidfilmes mit 6 ml kalter Enzymlösung
(18,1 mg ß-Glactosidase, 13 ml 50 mM TRIS-Puffer, pH 7,5)
unter Rotation gebildet. Die ß-Galactosidaseenzym
enthaltenden T&sub4;-Liposomen wurden von extravesikulärem Enzym
durch Zentrifugation getrennt. Die gereinigte
Liposomenpräparation (6 ml) wurde 1:150 in TRIS-Puffer (50 mM, pH
7,5) verdünnt und bei 4ºC im Dunkeln gelagert.
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Das Komplementreagenz wurde hergestellt, indem ein
Röhrchen eines lyophilisierten Meerschweinchenserums (Pel
Freeze, Rogers, AK) mit 3 ml destilliertem Wasser
rekonstituiert wurden.
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Kaninchen anti-Thyroxinantiserum wurde 30 min auf 57ºC
erwärmt und das geerntete Antiserum 1:60 mit 50 mM
Barbitalpuffer (pH 8,5) verdünnt, um eine Stammlösung
herzustellen.
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Die Assaypufferlösung bestand aus 50 mM Barbitalpuffer
(pH 8,5), enthaltend 120 mM NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,15 mM
CaCl&sub2;, 0,5% BSA und 0,05% NaN&sub3;.
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Aus einer Thyroxinstammlösung von 10 mg Thyroxin (freie
Säure; Sigma, supra) in 50 ml 0,2N NaOH wurden
Thyroxin-Humanserumstandards (1,5, 3, 6, 12, 24 ug/dl)
hergestellt. Die entsprechenden Verdünnungen wurden unter
Verwendung kommerziell erhältlichen Humanserums
vorgenommen.
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Eine Substrat- und T&sub4;-freisetzendes Mittel (um gebundenes
T&sub4; freizusetzen) enthaltende Lösung wurde durch Mischen
von 18,5 mg O-Nitrophenyl-ß-Galactosidase ("ANS", Sigma,
supra), die im folgenden als "ANS"-Stammlösung
bezeichnet wird, und 3,0 mg
8-Anilin-naphthalin-1-sulfonsäureammoniumsalz (Eastman Organic Chemicals, Inc., Rochester,
NY) in 10 ml Barbitalpuffer hergestellt.
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Reagenz A wurde durch Verbinden von 235 ul "Substrat" und
"ANS"-Stammlösung mit 30 ul (1:60) Antikörper und 85 ul
Barbitalpuffer hergestellt. Der Ansatz wurde maßstäblich
vergrößert, um eine ausreichende Menge Reagenz für
Mehrfachtests zur Verfügung zu stellen.
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Das Reagenz B wurde durch Verbinden von 50 ul (1:150)
Liposomenpräparation mit 40 ul Komplement hergestellt. Hier
wurde wiederum die Präparation im Maßstab vergrößert, um
ausreichend Reagenz für Mehrfachtests bereitzustellen.
Testverfahren und Ergebnisse
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Ein Volumen von 200 ul von jedem der T&sub4;-Standards und 20
klinische Proben wurden einzeln in Küvetten auf einem
Küvettentablett eines analytischen Systems Technicon
RA-1000 (Technicon Instruments Corporation, Tarrytown,
NY) pipettiert. Reagenz A und Reagenz B wurden auf das
Reagenztablett eines solchen Systemes gestellt. Das
System wurde programmiert, 20 ul jeder Probe und ebenso
des Standards automatisch zu pipettieren und mit je 350
ul des Reagenz A 3 min bei 37ºC zu inkubieren, bevor 90
ul des Reagenz B zugesetzt wurden. Die Lösungen wurden
weiter 5 min bei 37ºC inkubiert, bevor die Rate der
Steigerung der optischen Dichte unter Verwendung eines
optischen Filters mit 405 nm gemessen wurde. Die T&sub4;-Werte der
klinischen Proben wurden dann auf der Grundlage der Rate
der Veränderung der optischen Dichte, die bei
verschiedenen T&sub4;-Spiegeln auftrat, berechnet. Der Vergleich der
T&sub4;-Werte der klinischen Proben, bestimmt durch
Liposom-Immunassay (LIA) und Radioimmunassay (RIA) ist in
Figur 1 gezeigt.
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Figur 1 zeigt, daß unzählige Datenpunkte erhalten wurden,
die nicht mit dem Wert, der bei der Analyse der gleichen
Probe mit der RIA-Technik erhalten wurde, korrelierten.
Weiter korrelierten die Werte in ihrer Gesamtheit mit
den mittels RIA-Technik erhaltenen. (Es wurde ein
Korrelationskoeffizient von nur 0,638 erhalten). Ein solcher
Korrelationsmangel weist auf die Auswirkungen
beeinträchtigender Substanzen in den nicht korrelierenden Proben
hin.
BEISPIEL II
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Zahlreiche Serumproben, die nicht mit dem RIA
korrelierten, zeigten eine antiliposomale Aktivität, wenn sie mit
T&sub4;-Liposomen und Komplement kombiniert wurden.
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Dieses Beispiel zeigt die Effekte "leeren" Liposomen,
"leeren" Cardiolipinliposomen und Trijodthyronin
(T&sub3;)-tragenden "leeren" Lipsomen auf die hohe lytische
Aktivität, die mit solchen Proben (Ausreißerproben)
verbunden ist.
Reagenzien
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Die T&sub4;-ß-Galactosidase-Liposomen, die in diesem
Experiment verwendet wurden, wurden wie in Beispiel I
beschrieben hergestellt.
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"Leere" Liposome wurden hergestellt, wie es in Beispiel I
für die T&sub4;-ß-Galactosidase-Liposome beschrieben ist, mit
der Ausnahme, daß die Lipidmischung und Hydrierungslösung
kein T&sub4;-Konjugat bzw. ß-Galactosidaseenzym enthielt. Die
leere Liposomenpräparation wurde vor der Verwendung 1:30
verdünnt.
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"Leere" Cardiolipinliposome wurden wie in Beispiel I für
T&sub4;-ß-Galactosidase-Liposomen hergestellt, mit der
Ausnahme, daß die Lipidmischung 3,95 mg Cardiolipin anstelle
von 2,19 mg T&sub4;-Konjugat enthielt und die
Hydrierungslösung kein ß-Galactosidaseenzym enthielt. Die Präparation
"leerer" Cardiolipin-Liposomen wurde vor der Verwendung
1:30 verdünnt.
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"Leere" T&sub3;-Liposome wurden hergestellt, wie in Beispiel I
für T&sub4;-ß-Galactosidase-Liposomen beschrieben, mit der
Ausnahme, daß die Lipidmischung 4,1 mg T&sub3;-Konjugat
anstelle von 2,19 mg T&sub4;-Konjugat enthielt und die
Hydrierungslösung kein ß-Galactosidaseenzym enthielt. Die
Präparation "leerer" T&sub3;-Liposomen wurde vor der Verwendung
1:30 verdünnt.
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Das Komplementreagenz war der gleichen Herkunft, wie in
Beispiel I beschrieben. Die Komplementlösung wurde durch
Mischen eines Röhrchens lyophilisierten Materials mit 3
ml destillierten Wassers hergestellt.
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Das Substrat und T&sub4;-freisetzende Mittel im Puffer wurden
wie im Beispiel I beschrieben hergestellt.
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Das Reagenz A wurde durch Kombinieren von 235 ul
"Substrat" und "ANS"-Stammlösung mit 115 ul
Barbitalpuffer hergestellt. Beachte: Reagenz A enthielt keinen
anti-T&sub4;-Antikörper, wie es Reagenz A in Beispiel I
enthielt.
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Reagenz B wurde wie in Beispiel I beschrieben
hergestellt.
Assayverfahren und Ergebnisse
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Zunächst wurde ein Volumen von 25 ul Puffer in einzelne
Küvetten des Küvettentablettes des analytischen Systemes
Technicon RA-1000 (supra), pipettiert. Dann wurde eine
gleiche Menge von 25 ul Volumina verschiedener
Serumproben in andere Küvetten des gleichen Tabletts pipettiert.
Ein Volumen von je 200 ul der Präparationen von "leeren"
Liposomen (1:30), "leeren" Cardiolipinliposomen (1:30),
"leeren" T&sub3;-Liposomen (1:30) oder Puffer wurden in jeden
verschiedenen Probenbecher des Probentablettes gegeben
und jeder unterschiedlicher Probenbecher des
Probentabletts und die Reagenzien A und B wurden in das
Reagenztablett eines solchen Systemes eingesetzt. Das System
wurde programmiert, um automatisch 30 ul jeder
Präparation mit 350 ul von Reagenz A in die entsprechende
Küvette zu pipettieren und 3 min bei 37ºC zu inkubieren, bevor
90 ul Reagenz B zugesetzt werden. Die Lösung wurde
weitere 5 min bei 37ºC inkubiert, bevor die Zunahmeraten der
optischen Dichte unter Verwendung eines optischen Filters
mit 405 nm gemessen wurden. Die Serumkontrolle (ohne
Antikörper) jeder Ausreißerprobe in Gegenwart von "leeren"
Liposomen, "leeren" Cardiolipinliposomen, "leeren"
T&sub3;-Liposom und Puffer wurden aufgezeichnet. Die
Ergebnisse sind in Tabelle I (siehe unten) gezeigt.
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Das oben beschriebene Verfahren wurde mit
ß-Galactosidase-T&sub4;-Liposom und "leeren" Cardiolipinliposomen
wiederholt, die ähnlich hergestellt wurden, mit der Ausnahme,
daß die "leeren" Cardiolipinliposomen und Uridinphosphat
(cyclischer Uridin-2' ,3-Phosphatester) in die
Formulierung des Reagenzes A einbezogen wurden. Die Ergebnisse
dieses Experiments sind in Tabelle II gezeigt.
Tabelle I
Absorptionsgeschwindigkeit (Absorption/Minute)
ß-Galactosidase-T&sub4;-Liposom
Serumprobe
In Puffer
"leeres" Liposom
"leeres" Cardiolipin Liposom
"leeres" T&sub3;-Liposom
Tabelle II
Absorptionsgeschwindigkeit (Absorption/Minute)
ß-Galactosidase-T&sub4;-Liposom
Serumprobe
In Puffer
Uridinphosphat (8mM)
"leeres" Cardiolipin-Liposom
Uridinphosphat und "leeres" Cardiolipin-Liposom
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Unter den Bedingungen dieses Beispiels, das in
Abwesenheit von T&sub4;-Antikörper durchgeführt wurde, war die
signifikante Zunahme der optischen Dichte in Verbindung mit
den Ausreißerproben in Gegenwart von entweder "leeren"
Cardiolipinliposomen oder "leeren" T&sub3;-Liposomen wie in
Tabelle I, oder in Gegenwart einer Kombination "leerer"
Cardiolipinliposomen und Uridinphosphat, wie in Tabelle
II, verringert. Die Gegenwart einer antiliposomalen
Aktivität in diesen Serumproben ist aus den vorgestellten
Daten offensichtlich.
BEISPIEL III
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Dieses Beispiel zeigt die Wirkung der Zugabe von
"leeren" Cardiolipinliposomen zu dem T&sub4;-Liposomen-
Immunassay.
Reagenzien
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In diesem Experiment wurden Galactosidase-enthaltende
T&sub4;-Liposomen, hergestellt wie in Beispiel I, verwendet.
Anti-T&sub4; Antiserum und Komplement stammten aus der
gleichen Quelle wie im Beispiel I beschrieben. Anti-T&sub4;
Reagenz wurde durch Verdünnen von T&sub4;-Antikörpern 1:60
mit Barbitalpuffer hergestellt. Das Komplementreagenz
wurde durch Mischen des lyophilisierten Materials (ein
Röhrchen) mit 3 ml destilliertem Wasser hergestellt.
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T&sub4; Humanserumstandards (1,5, 3, 6, 12, 24 ug/dl),
Barbitalpuffer, "Substrat" und "ANS"-Lösung wurden wie
in Beispiel I beschrieben hergestellt.
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Die "leeren" Cardiolipinliposomen, die in diesem
Experiment verwendet wurden, wurden wie in Beispiel II
beschrieben, hergestellt.
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Reagenz A wurde durch Kombinieren von 235 ul "Substrat"
und "ANS"-Stammlösung mit 40 ul (1:60) Antikörper und 30
ul (1:30) "leeren" Cardiolipinliposomen und 45 ul
Barbitalpuffer hergestellt. Die Zubereitung wurde maßstäblich
vergrößert, um eine ausreichende Menge Reagenz für
mehrfache Tests bereitzustellen.
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Das Reagenz B, das eine Mischung aus T&sub4;-Liposom und
Komplement ist, wurde wie in Beispiel I beschrieben
hergestellt.
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Hier wurde wiederum die Zubereitung maßstäblich
vergrößert, um ausreichende Mengen Reagenz für vielfache Tests
bereitzustellen.
Assayverfahren und Ergebnisse
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Das Assayverfahren entsprach dem in Beispiel I
beschriebenen.
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Figur 2 zeigt die Ergebnisse der Bewertung von 20
klinischen Proben in Gegenwart von "leeren"
Cardiolipinliposomen. Eine Korrelation mit der RIA-Technik führte zu einem
Koeffizienten von 0,8989, das im Vergleich zu dem von
Fig. 1, wie auch durch die verringerte Streuung in Fig. 2
gezeigt wird, signifikant besser ist.
BEISPIEL IV
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Dieses Beispiel zeigt die weitere Verbesserung des
T&sub4;-Liposomen-Immunassays durch Zusatz von "leeren"
Cardiolipinliposomen zusammen mit Phosphorylcholin.
Reagenzien
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In diesem Experiment wurden T&sub4;-ß-Galactosidase-Liposomen,
hergestellt wie in Beispiel I beschrieben, verwendet.
Anti-T&sub4; und Komplement waren aus der gleichen Quelle,
wie in Beispiel I beschrieben. Anti-T&sub4; Reagenz wurde
durch Verdünnen von T&sub4;-Antikörper (1:60) mit
Barbitalpuffer hergestellt. Komplementreagenz wurde durch
Mischen des lyophilisierten Materials (ein Röhrchen) mit
3 ml destilliertem Wasser hergestellt.
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T&sub4;-Humanserumstandards, Barbitalpuffer, "Substrat" und
"ANS" -Lösung wurden wie in Beispiel I beschrieben
hergestellt.
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Die "leeren" Cardiolipinliposomen, wurden wie in Beispiel
II hergestellt.
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Eine Phosphorylcholinlösung wurde hergestellt, in dem 13
mg Phosphorylcholincalciumsalz (Sigma, supra) in 1 ml
Barbitalpuffer als Stammlösung gelöst wurden. In jedem
Immunassay wurden 20 ul der Stamm-Phosphorylcholinlösung
verwendet.
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Das Reagenz A wurde durch Kombinieren von 235 ul "ONPG"
und "ANS"-Stammlösung mit 50 ul (1:60) Antikörper, 30 ul
(1:30) "leeren" Cardiolipinliposomen, 20 ul
Phosphorylcholin-Stammlösung und 15 ul Barbitalpuffer
hergestellt.
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Das Reagenz B, das eine Mischung von ß-Galactosidase
enthaltendem T&sub4;-Liposomen-Komplement ist, wurde wie in
Beispiel I hergestellt.
Assayverfahren und Ergebnisse
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Das Assayverfahren war das in Beispiel I beschriebene.