JPH063447B2 - 化学的触媒の調節剤によるイムノアッセイの信号強化法 - Google Patents
化学的触媒の調節剤によるイムノアッセイの信号強化法Info
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- JPH063447B2 JPH063447B2 JP62115718A JP11571887A JPH063447B2 JP H063447 B2 JPH063447 B2 JP H063447B2 JP 62115718 A JP62115718 A JP 62115718A JP 11571887 A JP11571887 A JP 11571887A JP H063447 B2 JPH063447 B2 JP H063447B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はアナライトのイムノアッセイとそれに使用する
材料に関するものでありさらに詳しくは、表示反応の化
学的触媒作用の調整によって検出される信号の増強が成
し遂げられるイムノアッセイの方法と材料に関するもの
である。
材料に関するものでありさらに詳しくは、表示反応の化
学的触媒作用の調整によって検出される信号の増強が成
し遂げられるイムノアッセイの方法と材料に関するもの
である。
（従来技術） 迅速で高感度の分析方式は流体中の物質の濃度を決定す
るために開発されている。イムノアッセイは特定の抗体
に対する抗原あるいはハプテンの結合に基づくもので、
特に特異性と感度の水準をあげるために有用である。こ
れらの分析は概して標識された形での上記の試薬の１つ
を用いるものであり、そして標識された試薬はしばしば
トレーサーと呼ばれる。イムノアッセイの手順は液体中
か固体支持体上で行なわれ、またそれは異相反応と同相
反応のいずれであってもよい。異相分析は遊離（結合し
ていない）トレーサーと結合トレーサーとの分離を必要
とする。同相分析は分離段階を必要としないし、それに
よって異相分析に勝る迅速性、簡便性およびオートメー
ションの容易さといった重要な利点をもたらす。
るために開発されている。イムノアッセイは特定の抗体
に対する抗原あるいはハプテンの結合に基づくもので、
特に特異性と感度の水準をあげるために有用である。こ
れらの分析は概して標識された形での上記の試薬の１つ
を用いるものであり、そして標識された試薬はしばしば
トレーサーと呼ばれる。イムノアッセイの手順は液体中
か固体支持体上で行なわれ、またそれは異相反応と同相
反応のいずれであってもよい。異相分析は遊離（結合し
ていない）トレーサーと結合トレーサーとの分離を必要
とする。同相分析は分離段階を必要としないし、それに
よって異相分析に勝る迅速性、簡便性およびオートメー
ションの容易さといった重要な利点をもたらす。
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の方法は標識するとき
ラジオアイソトープを使い感度と再現性の水準をあげ
る。そしてそれは多数のサンプルを迅速に処理するオー
トメーションに適する。しかしながら測定される（原子
核崩壊）パラメーターは、分析の条件あるいは成分を変
化させてコントロールすることができないので、すべて
のＲＩＡの手順は分離段階を必要とする。付け加えてア
イソトープは高価であり、比較的短い保存期間を有し、
そして高価で複雑な装置を必要としそれらの取り扱いや
処置の仕方には広範な安全管理が追求されなければなら
ない。
ラジオアイソトープを使い感度と再現性の水準をあげ
る。そしてそれは多数のサンプルを迅速に処理するオー
トメーションに適する。しかしながら測定される（原子
核崩壊）パラメーターは、分析の条件あるいは成分を変
化させてコントロールすることができないので、すべて
のＲＩＡの手順は分離段階を必要とする。付け加えてア
イソトープは高価であり、比較的短い保存期間を有し、
そして高価で複雑な装置を必要としそれらの取り扱いや
処置の仕方には広範な安全管理が追求されなければなら
ない。
螢光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は標識剤としてフッ化ク
ロムを使い、その標識の直接的な検出を可能にするし、
同相分析の方法にたやすく適応できる。しかしながら、
従来知られているフルオレッセンあるいはローダミンの
誘導体のようなフッ化クロムを使った同相分析のＦＩＡ
方法はＲＩＡの高い反応性に及ばない。その理由の大部
分は、分析媒体中に分散している不純物や分析媒体中に
存在する他の螢光体物質からの螢光性放射物のバックグ
ラウンドのためである。
ロムを使い、その標識の直接的な検出を可能にするし、
同相分析の方法にたやすく適応できる。しかしながら、
従来知られているフルオレッセンあるいはローダミンの
誘導体のようなフッ化クロムを使った同相分析のＦＩＡ
方法はＲＩＡの高い反応性に及ばない。その理由の大部
分は、分析媒体中に分散している不純物や分析媒体中に
存在する他の螢光体物質からの螢光性放射物のバックグ
ラウンドのためである。
酵素もまたイムノアッセイの標識として使われている。
典型的な酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）では酵素は特異
的に結合する抗原−抗体の対の１方の成分と共有結合さ
せる。その結果生じる酵素複合物を基質と反応させ、信
号を発生させて、これを検出および測定する。普通の人
間は発色団の存在を１０-5あるいは１０-6モル（Ｍ）程
度の下限までしか検出できないため肉眼により検出され
る信号には限界がある；ところが生物学上の流動体にお
いて検出されるか、あるいは測定されるリガンドはしば
しば１０-9から１０-12モル（Ｍ）の範囲で存在する。
典型的な酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）では酵素は特異
的に結合する抗原−抗体の対の１方の成分と共有結合さ
せる。その結果生じる酵素複合物を基質と反応させ、信
号を発生させて、これを検出および測定する。普通の人
間は発色団の存在を１０-5あるいは１０-6モル（Ｍ）程
度の下限までしか検出できないため肉眼により検出され
る信号には限界がある；ところが生物学上の流動体にお
いて検出されるか、あるいは測定されるリガンドはしば
しば１０-9から１０-12モル（Ｍ）の範囲で存在する。
ＥＩＡの感度は、しばしばスペクトル光度測定の技術に
よって増加しうる。しかしながらそのような方法は費用
のかかる装備を必要とする。他の方法では感度は、多段
増幅によって増強される。この方法では検出可能な（一
般に着色された）分子の数は、２つあるいはそれ以上の
酵素、あるいは酵素の誘導体の使用によって増加し、そ
こでは分析リガンドに結合した第１酵素が第２酵素ある
いは酵素誘導体を活性化して、これが更に第３酵素の発
色反応又は形成を触媒する。典型的なこの技術はハリス
（Harris）の米国特許第４４６３０９０号である。
よって増加しうる。しかしながらそのような方法は費用
のかかる装備を必要とする。他の方法では感度は、多段
増幅によって増強される。この方法では検出可能な（一
般に着色された）分子の数は、２つあるいはそれ以上の
酵素、あるいは酵素の誘導体の使用によって増加し、そ
こでは分析リガンドに結合した第１酵素が第２酵素ある
いは酵素誘導体を活性化して、これが更に第３酵素の発
色反応又は形成を触媒する。典型的なこの技術はハリス
（Harris）の米国特許第４４６３０９０号である。
ウルマン（Ullman）の米国特許第４１６０６４５号は、
２つの酸化還元試薬の間の反応速度を測定することによ
るイムノアッセイを開示している。反応の触媒として、
金属イオン複合体を含んでいても良い非酵素触媒がリガ
ンドに結合されている。リガンドが抗リガンドに結合す
るとき触媒に対する酸化還元試薬の接近は抑制されて反
応速度は調整される。フォルギオン（Forgione）らの米
国特許第４３７５９７２号および日本国特許ＪＰ／２０
１３３号では金属イオンおよびメタロポルフィリンとリ
ガンドの結合物に触媒される価格ルミネッセンス（低温
発光現象）反応を伴なうイムノアッセイが開示されてい
る。
２つの酸化還元試薬の間の反応速度を測定することによ
るイムノアッセイを開示している。反応の触媒として、
金属イオン複合体を含んでいても良い非酵素触媒がリガ
ンドに結合されている。リガンドが抗リガンドに結合す
るとき触媒に対する酸化還元試薬の接近は抑制されて反
応速度は調整される。フォルギオン（Forgione）らの米
国特許第４３７５９７２号および日本国特許ＪＰ／２０
１３３号では金属イオンおよびメタロポルフィリンとリ
ガンドの結合物に触媒される価格ルミネッセンス（低温
発光現象）反応を伴なうイムノアッセイが開示されてい
る。
金属イオンによる化学反応の触媒作用はよくしられてい
るし、微量の金属イオンの分析の手段を提供する。これ
らの手順は発色させるか、あるいは現存する色を退色さ
せるか、どちらかの反応に触媒作用を及ぼす金属イオン
を使用する。そして、概して最初の反応速度と金属イオ
ン濃度とが一次関数的関連となる。
るし、微量の金属イオンの分析の手段を提供する。これ
らの手順は発色させるか、あるいは現存する色を退色さ
せるか、どちらかの反応に触媒作用を及ぼす金属イオン
を使用する。そして、概して最初の反応速度と金属イオ
ン濃度とが一次関数的関連となる。
微量金属の分析は、しばしば単独では触媒活性をもたな
いが、金属イオンの触媒活性に影響を及ぼすことによっ
て反応速度を増加させるか減少させる有機化合物を使用
する。そのような化合物は、従って、金属の触媒反応の
調節剤であり、活性剤または抑制剤のどちらかであり得
る。水中の微量金属分析における調節剤の使用は、ブン
チェブ（Bontchev）によって、タランタ（Talanta）１
９巻、６７５頁（１９７２年）で討論されている。調節
剤自身の測定は、ミラノビック（Mila-novic）により、
Microchem.J.２８巻４３７頁（１９８３年）に検討され
ているし、具体的な例はアントノブ（Antonov）らやド
ルマノバ（Dolmanova）らにより、（Anal.Chem.ＵＳＳ
Ｒ，３１巻、１６８頁’（１９７６年）およびJ.Anal.C
hem.ＵＳＳＲ，３２巻、６３８頁（１９７７））に述べ
られている。
いが、金属イオンの触媒活性に影響を及ぼすことによっ
て反応速度を増加させるか減少させる有機化合物を使用
する。そのような化合物は、従って、金属の触媒反応の
調節剤であり、活性剤または抑制剤のどちらかであり得
る。水中の微量金属分析における調節剤の使用は、ブン
チェブ（Bontchev）によって、タランタ（Talanta）１
９巻、６７５頁（１９７２年）で討論されている。調節
剤自身の測定は、ミラノビック（Mila-novic）により、
Microchem.J.２８巻４３７頁（１９８３年）に検討され
ているし、具体的な例はアントノブ（Antonov）らやド
ルマノバ（Dolmanova）らにより、（Anal.Chem.ＵＳＳ
Ｒ，３１巻、１６８頁’（１９７６年）およびJ.Anal.C
hem.ＵＳＳＲ，３２巻、６３８頁（１９７７））に述べ
られている。
（発明が解決しようとする問題点） 信号検出に高価な器具を必要とせずに、生物学的流体に
きわめて微量で存在するリガンドが検出できる感度の高
い方法が必要とされている。本発明が目的とするのは、
このような要求を満足させることである。
きわめて微量で存在するリガンドが検出できる感度の高
い方法が必要とされている。本発明が目的とするのは、
このような要求を満足させることである。
（問題点を解決する手段） 本発明の１つの面は、流体中のリガンドの検出方法であ
る。信号手段は、リガンドが抗リガンドに結合するとき
検出できる信号を生じさせ、信号の形成は金属イオン触
媒によって接触作用を受ける。触媒という用語は以下、
金属イオン触媒を意味するものとする。触媒活性は酵素
によって活性化される調節剤によって調節される。
る。信号手段は、リガンドが抗リガンドに結合するとき
検出できる信号を生じさせ、信号の形成は金属イオン触
媒によって接触作用を受ける。触媒という用語は以下、
金属イオン触媒を意味するものとする。触媒活性は酵素
によって活性化される調節剤によって調節される。
流体は酵素やリガンドに特異的な抗リガンド、ブロック
された調節剤、基質および酸化還元試薬と混合される。
抗リガンドに対するリガンドの結合によって、酵素は調
節剤を脱ブロックする。それにより、遊離された調節剤
は触媒を調節する。そしてこの触媒は基質と酸化還元試
薬の間の表示反応に触媒活性をもつ。その反応は、流体
中のリガンドの存在を示す検出可能なシグナルをもたら
す。
された調節剤、基質および酸化還元試薬と混合される。
抗リガンドに対するリガンドの結合によって、酵素は調
節剤を脱ブロックする。それにより、遊離された調節剤
は触媒を調節する。そしてこの触媒は基質と酸化還元試
薬の間の表示反応に触媒活性をもつ。その反応は、流体
中のリガンドの存在を示す検出可能なシグナルをもたら
す。
触媒は金属イオン、好ましくは遷移金属イオンあるいは
その複合体であってよいし、天然あるいは合成の生成物
のどちらであってもよい。それは流体に加えられてもよ
いし、あるいは流体中の内因的金属イオンであってもよ
い。以下において、金属イオンという用語は遊離イオン
あるいはその複合体を意味することが理解されよう。
その複合体であってよいし、天然あるいは合成の生成物
のどちらであってもよい。それは流体に加えられてもよ
いし、あるいは流体中の内因的金属イオンであってもよ
い。以下において、金属イオンという用語は遊離イオン
あるいはその複合体を意味することが理解されよう。
触媒の活性は、活性化された酵素によってブロックされ
た調節剤から遊離された遊離調節剤によって調節され
る。遊離調節剤は活性剤あるいは好ましくは抑制剤であ
ってよい。好ましい抑制調節剤は金属結合剤であり、そ
れは触媒と複合体を形づくり、それにより金属イオンの
触媒活性が抑制される。特に好ましい抑制調節剤は８−
ヒドロキシキノリンとベンジルメルカプタンである。
た調節剤から遊離された遊離調節剤によって調節され
る。遊離調節剤は活性剤あるいは好ましくは抑制剤であ
ってよい。好ましい抑制調節剤は金属結合剤であり、そ
れは触媒と複合体を形づくり、それにより金属イオンの
触媒活性が抑制される。特に好ましい抑制調節剤は８−
ヒドロキシキノリンとベンジルメルカプタンである。
ブロックされた調節剤は、好ましくは酵素の作用によっ
てその後にはずすことのできるブロック基と共有結合し
た遊離調節剤である。好ましい酵素はヒドロラーゼであ
り、また好ましいブロック基はヒドロラーゼによって開
裂可能な化学的結合によって調節剤に結合する。もっと
も好ましいブロック基は短いペプチドである。
てその後にはずすことのできるブロック基と共有結合し
た遊離調節剤である。好ましい酵素はヒドロラーゼであ
り、また好ましいブロック基はヒドロラーゼによって開
裂可能な化学的結合によって調節剤に結合する。もっと
も好ましいブロック基は短いペプチドである。
遊離調節剤は基質と酸化還元試薬との間の表示反応の触
媒を調整する。表示反応は検出できる信号を供給する。
好ましい信号は色の出現あるいは消失である。従って好
ましい基質は、酸化剤あるいは還元剤のように酸化還元
試薬により金属イオンの触媒作用を受ける色原体であ
る。
媒を調整する。表示反応は検出できる信号を供給する。
好ましい信号は色の出現あるいは消失である。従って好
ましい基質は、酸化剤あるいは還元剤のように酸化還元
試薬により金属イオンの触媒作用を受ける色原体であ
る。
本発明の好ましい態様においては、酵素は不活性の形で
流体に加えられ、リガンドは（もし流体中に存在するな
らば）抗リガンドに結合し、それによって酵素は活性化
されて、金属結合剤にエステル化されたペプチドのブロ
ック基の開裂を促進する。遊離した金属結合剤は複合体
を形成して、それによって触媒作用即ち表示反応の触媒
活性を減少させ、着色した色原体が無色の生成物に酸化
される反応を抑制する。リガンドの存在は色の消失の妨
害によって示される。
流体に加えられ、リガンドは（もし流体中に存在するな
らば）抗リガンドに結合し、それによって酵素は活性化
されて、金属結合剤にエステル化されたペプチドのブロ
ック基の開裂を促進する。遊離した金属結合剤は複合体
を形成して、それによって触媒作用即ち表示反応の触媒
活性を減少させ、着色した色原体が無色の生成物に酸化
される反応を抑制する。リガンドの存在は色の消失の妨
害によって示される。
もっとも好まれる本発明の態様では、酵素として補体の
第１成分を、遊離調節剤として８−ヒドロキシキノリン
あるいはベンジルメルカプタンを、調節剤のブロック基
としてペンタペプタイドを使用する。
第１成分を、遊離調節剤として８−ヒドロキシキノリン
あるいはベンジルメルカプタンを、調節剤のブロック基
としてペンタペプタイドを使用する。
本発明の方法は、固体相や分離段階を含む異相分析によ
っても良く、分離段階をさける同相分析におって行なわ
れてよい。
っても良く、分離段階をさける同相分析におって行なわ
れてよい。
本発明の他の局面は上述の如き本発明の方法を実行する
ためのキットを含む。
ためのキットを含む。
このように本発明は同相であってよい分析を提供し、流
体中に非常に低濃度で存在するリガンドにとって多方面
の方法を提供する。その方法は、たとえリガンドが１０
-12モル（Ｍ）程度に低い濃度で存在しようとも、分析
の信号の肉眼検出や測定を可能にする。これは１０-6倍
程度の信号の増幅を表わし、また費用のかかる、あるい
は扱いにくい装置なしに検出および決定できるリガンド
の範囲を大いに広げる。本発明に従った分析は、小さな
病院の検査室や医師の診療室でさえ行なうことができ、
費用や場所の明らかな節約が達成される。
体中に非常に低濃度で存在するリガンドにとって多方面
の方法を提供する。その方法は、たとえリガンドが１０
-12モル（Ｍ）程度に低い濃度で存在しようとも、分析
の信号の肉眼検出や測定を可能にする。これは１０-6倍
程度の信号の増幅を表わし、また費用のかかる、あるい
は扱いにくい装置なしに検出および決定できるリガンド
の範囲を大いに広げる。本発明に従った分析は、小さな
病院の検査室や医師の診療室でさえ行なうことができ、
費用や場所の明らかな節約が達成される。
（好ましい態様） 本発明はたくさんの異なる形の態様によって達せられる
が、本発明の好ましい態様を次に詳細に述べる。しか
し、この説明が本発明の原理の一例として考えられるべ
きであり、本発明を限定するものではない。本発明の範
囲は特許請求の範囲およびその均等範囲から決定される
であろう。
が、本発明の好ましい態様を次に詳細に述べる。しか
し、この説明が本発明の原理の一例として考えられるべ
きであり、本発明を限定するものではない。本発明の範
囲は特許請求の範囲およびその均等範囲から決定される
であろう。
本発明の方法に従えば、流体中に存在するある物質（以
下リガンドと呼ぶ）が視覚的に検出される；すなわち、
低濃度で存在するときですら肉眼の観測により検出され
る。その方法は少なくとも２つの増幅段階を含んでい
る。１つの増幅段階において表示反応は触媒によって接
触作用を受ける。２番目の増幅段階では、触媒の触媒反
応の活性は酵素学的に触媒に対する調節剤の脱ブロック
によって調節される。これらの増幅段階は連続的に生じ
て１０-6倍にまでシグナルの増幅を供給する結果、１０
-2モル（Ｍ）のレベルで流体中にあらわれるリガンドを
肉眼で検出することができる。もし付加的な増幅が要求
されるなら、第１酵素には更なるシグナルの増幅をもた
らす多数の酵素反応（どれか１つあるいはすべてが増幅
をもたらす）を供給し、多数の酵素を含んだ連続して起
る反応のカスケード（階段）を生じさせてもよい。
下リガンドと呼ぶ）が視覚的に検出される；すなわち、
低濃度で存在するときですら肉眼の観測により検出され
る。その方法は少なくとも２つの増幅段階を含んでい
る。１つの増幅段階において表示反応は触媒によって接
触作用を受ける。２番目の増幅段階では、触媒の触媒反
応の活性は酵素学的に触媒に対する調節剤の脱ブロック
によって調節される。これらの増幅段階は連続的に生じ
て１０-6倍にまでシグナルの増幅を供給する結果、１０
-2モル（Ｍ）のレベルで流体中にあらわれるリガンドを
肉眼で検出することができる。もし付加的な増幅が要求
されるなら、第１酵素には更なるシグナルの増幅をもた
らす多数の酵素反応（どれか１つあるいはすべてが増幅
をもたらす）を供給し、多数の酵素を含んだ連続して起
る反応のカスケード（階段）を生じさせてもよい。
免疫学反応は流体中のリガンドの検出のため本発明の方
法で使用される。この中で使われる“免疫学反応”とい
う用語は、抗原−抗体、ハプテン−抗体、あるいは抗
原、抗体の適当な類似物、あるいは特異的に結合するハ
プテン、の特異的結合反応を意味する。
法で使用される。この中で使われる“免疫学反応”とい
う用語は、抗原−抗体、ハプテン−抗体、あるいは抗
原、抗体の適当な類似物、あるいは特異的に結合するハ
プテン、の特異的結合反応を意味する。
免疫学反応は適当などんな流体中でも行なうことができ
る。たとえば、流体は、血清、尿、脳脊髄液、胸水ある
いはその他の、リガンドを含んでいると思われる体液で
あってよい。その他、流体は水、生理食塩液、あるいは
適当などんな緩衝液でもよく、あるいは体液混合物でも
よく、他の流体（それにリガンドを含んでいると思われ
る流体が加えられたもの）であってもよい。
る。たとえば、流体は、血清、尿、脳脊髄液、胸水ある
いはその他の、リガンドを含んでいると思われる体液で
あってよい。その他、流体は水、生理食塩液、あるいは
適当などんな緩衝液でもよく、あるいは体液混合物でも
よく、他の流体（それにリガンドを含んでいると思われ
る流体が加えられたもの）であってもよい。
本発明の好ましい方法を下の分析フローシートに関して
説明し、分析成分と相互作用の一般的な理解を先に提供
し、さらに、それぞれの成分についても後に詳しく論述
する。発明のどの態様を使用するかにより、分析成分は
分析手順の最初に加えるか、あるいは手順の間のどこか
の段階で加えられる。さらにそれらは別々に、あるいは
任意の組合せでも加えられる。従って、ここに述べられ
ている成分の順序は、分析方法において成分を組み合せ
る特別の順序を限定するものと解釈されるべきではな
い。
説明し、分析成分と相互作用の一般的な理解を先に提供
し、さらに、それぞれの成分についても後に詳しく論述
する。発明のどの態様を使用するかにより、分析成分は
分析手順の最初に加えるか、あるいは手順の間のどこか
の段階で加えられる。さらにそれらは別々に、あるいは
任意の組合せでも加えられる。従って、ここに述べられ
ている成分の順序は、分析方法において成分を組み合せ
る特別の順序を限定するものと解釈されるべきではな
い。
上記のフローシートにおいては、コロンは免疫学的結合
を示し、ハイフォンは化学結合あるいは吸着のような物
理学的付着を示し、棒線矢印は化学的転換を示し、点線
矢印は反応あるいは分析成分の調節を示す。
を示し、ハイフォンは化学結合あるいは吸着のような物
理学的付着を示し、棒線矢印は化学的転換を示し、点線
矢印は反応あるいは分析成分の調節を示す。
Ｅ−活性酵素 ＡＬ−抗リガンド Ｌ−リガンド Ｍ−触媒の調節剤 Ｂ−調節剤のブロック基 Ｃ−金属イオン触媒 Ｓ−基質 Ｒ−酸化還元試薬 Ｐ−生成物 活性酵素が調節剤からブロック基を取り除き、一方、活
性酵素の濃度は抗リガンドに対するリガンドの結合によ
って調節され、従って流体中のリガンドの濃度に比例す
ることがフローシートからわかる。調節剤の脱ブロック
は活性酵素の出現に依存するから、遊離調節剤のレベル
もまたリガンドの濃度に比例する。遊離調節剤は生成物
を与える基質と酸化還元試薬との間の表示反応における
触媒活性を調節（活性化または抑制）する。生成物のレ
ベルは調節剤従って、リガンドのレベルに対して、正ま
たは逆のどちらかに比例する。正比例または逆比例のど
ちらかになるかは、調節剤がそれぞれ、活性剤か抑制剤
であるかにより定まる。実際に測定される信号は表示反
応に伴なう色の変化であってよい。たとえば、生成物の
色や生成物の発色速度、あるいは基質の色やそれについ
ての消失速度、あるいは、化学ルミネッセンスや螢光と
して測定される発光であってよい。
性酵素の濃度は抗リガンドに対するリガンドの結合によ
って調節され、従って流体中のリガンドの濃度に比例す
ることがフローシートからわかる。調節剤の脱ブロック
は活性酵素の出現に依存するから、遊離調節剤のレベル
もまたリガンドの濃度に比例する。遊離調節剤は生成物
を与える基質と酸化還元試薬との間の表示反応における
触媒活性を調節（活性化または抑制）する。生成物のレ
ベルは調節剤従って、リガンドのレベルに対して、正ま
たは逆のどちらかに比例する。正比例または逆比例のど
ちらかになるかは、調節剤がそれぞれ、活性剤か抑制剤
であるかにより定まる。実際に測定される信号は表示反
応に伴なう色の変化であってよい。たとえば、生成物の
色や生成物の発色速度、あるいは基質の色やそれについ
ての消失速度、あるいは、化学ルミネッセンスや螢光と
して測定される発光であってよい。
分析成分の詳細に言及すれば、リガンドはどんな起源か
らのものでよく、また、抗原や抗体あるいはハプテンで
あってよい。たとえば、リガンドは体液に存在する抗原
であってよいし、体液から分離され、続いて緩衝液のよ
うな異なる流体に導入されてよい。他のケースではリガ
ンドは体液以外の起源のもの、たとえば、微生物の培養
液や微生物の細胞抽出物であってもよい。好ましいリガ
ンドは抗原であり、もっとも好ましくは、単純ヘルペス
ビールス（ＨＳＶ）、アデノビールス、インフルエンザ
Ａビールス、パラインフルエンザ３ビールス、そして呼
吸器シンシチアル（syncyt-ial）ビールスにような体液
中に存在するビールス抗原である。
らのものでよく、また、抗原や抗体あるいはハプテンで
あってよい。たとえば、リガンドは体液に存在する抗原
であってよいし、体液から分離され、続いて緩衝液のよ
うな異なる流体に導入されてよい。他のケースではリガ
ンドは体液以外の起源のもの、たとえば、微生物の培養
液や微生物の細胞抽出物であってもよい。好ましいリガ
ンドは抗原であり、もっとも好ましくは、単純ヘルペス
ビールス（ＨＳＶ）、アデノビールス、インフルエンザ
Ａビールス、パラインフルエンザ３ビールス、そして呼
吸器シンシチアル（syncyt-ial）ビールスにような体液
中に存在するビールス抗原である。
抗リガンドは免疫学的反応を引きおこすために流体中の
リガンドと接触させる。抗リガンドは抗原や抗体（モノ
クロナールまたはポリクロナール）またはリガンドと特
異的に反応する適切な任意の類似物であってもよい。加
えて、抗リガンドは複数の結合した抗体からなる抗体複
合体でありうる。たとえは特異的に第１抗体に結合する
第２抗体であって良い。あるいはリガンドはいくつかの
異なる抗リガンドに結合してよい。たとえばポリクロナ
ール抗体の集合体、あるいはリガンドの異なる表面部分
に同時に結合するいくつかのモノクロナール抗体分子の
混合物であってよい。概して第２抗体は第１抗体に対し
て異なる動物に感作して得られる。複合体中で結合され
た複数の抗体は、だいたい２から１０、あるいはそれよ
りもっと多くの抗体を含んでいてよい。
リガンドと接触させる。抗リガンドは抗原や抗体（モノ
クロナールまたはポリクロナール）またはリガンドと特
異的に反応する適切な任意の類似物であってもよい。加
えて、抗リガンドは複数の結合した抗体からなる抗体複
合体でありうる。たとえは特異的に第１抗体に結合する
第２抗体であって良い。あるいはリガンドはいくつかの
異なる抗リガンドに結合してよい。たとえばポリクロナ
ール抗体の集合体、あるいはリガンドの異なる表面部分
に同時に結合するいくつかのモノクロナール抗体分子の
混合物であってよい。概して第２抗体は第１抗体に対し
て異なる動物に感作して得られる。複合体中で結合され
た複数の抗体は、だいたい２から１０、あるいはそれよ
りもっと多くの抗体を含んでいてよい。
使われる抗リガンドの量は広い範囲にわたって変化され
てよい。すべてのリガンドを結合するには不十分な結合
場所をもつ限られた量の抗リガンドを使用してよい。そ
の場合、流体中の濃度に比例してリガンドが抗リガンド
に結合する。好ましくは実質的にすべてのリガンドを結
合するのに十分な結合場所をもつ過剰な抗リガンドが使
われる。
てよい。すべてのリガンドを結合するには不十分な結合
場所をもつ限られた量の抗リガンドを使用してよい。そ
の場合、流体中の濃度に比例してリガンドが抗リガンド
に結合する。好ましくは実質的にすべてのリガンドを結
合するのに十分な結合場所をもつ過剰な抗リガンドが使
われる。
リガンドと抗リガンドを含む流体は、もし必要なら結合
を導くためにインキュベートする。インキュベートは結
合を促進するのに適当な任意の温度及び任意の時間で行
なわれる。好ましくは２０〜４０℃、１分〜４時間であ
る。結合された抗リガンドとリガンドを以下、結合画分
と呼び、結合しない抗リガンドとリガンドを以下、遊離
画分と呼ぶ。分析は、結合画分と遊離画分の間に平衡状
態が達せられるように行なわれてよい。
を導くためにインキュベートする。インキュベートは結
合を促進するのに適当な任意の温度及び任意の時間で行
なわれる。好ましくは２０〜４０℃、１分〜４時間であ
る。結合された抗リガンドとリガンドを以下、結合画分
と呼び、結合しない抗リガンドとリガンドを以下、遊離
画分と呼ぶ。分析は、結合画分と遊離画分の間に平衡状
態が達せられるように行なわれてよい。
結合画分の存在下で調節剤からブロック基を除去するこ
とができる任意の酵素も使用されうる。たとえば、酵素
を免疫学的反応の前に適当な方法でリガンドまたは抗リ
ガンドに結合し、その反応の後、結合（型）と遊離の相
を分離し、他の分析成分を結合型の相と混合する。リガ
ンドあるいは抗リガンドに対する酵素の結合は一般に行
なわれており、当業者によく知られている。
とができる任意の酵素も使用されうる。たとえば、酵素
を免疫学的反応の前に適当な方法でリガンドまたは抗リ
ガンドに結合し、その反応の後、結合（型）と遊離の相
を分離し、他の分析成分を結合型の相と混合する。リガ
ンドあるいは抗リガンドに対する酵素の結合は一般に行
なわれており、当業者によく知られている。
本発明の他の態様では、酵素は結合画分によって活性化
されるまで非活性である状態で分析媒体に加えられる。
適当な非活性酵素は補体の第１成分であり、以下Ｃ１と
呼ぶ。Ｃ１は適当な形で、たとえば補体の一部あるいは
任意の部分として、もしくは血清中の存在物として添加
してよい。好ましくはＣ１は他の補体蛋白から分離さ
れ、そしてもし望むなら添加前に精製されてよい。補体
を調整する方法とそれからＣ１を分離する方法は当業者
にはよく知られている。典型的方法は、メディカス（Me
dicus）らのJournal of Immun-ology１２５巻、３９０
頁（１９８０年）に記されている。
されるまで非活性である状態で分析媒体に加えられる。
適当な非活性酵素は補体の第１成分であり、以下Ｃ１と
呼ぶ。Ｃ１は適当な形で、たとえば補体の一部あるいは
任意の部分として、もしくは血清中の存在物として添加
してよい。好ましくはＣ１は他の補体蛋白から分離さ
れ、そしてもし望むなら添加前に精製されてよい。補体
を調整する方法とそれからＣ１を分離する方法は当業者
にはよく知られている。典型的方法は、メディカス（Me
dicus）らのJournal of Immun-ology１２５巻、３９０
頁（１９８０年）に記されている。
Ｃ１はＣ１と結合画分の抗体部分のＦｃ部との結合反応
により、Ｃ１と結合画分とからなる複合体が形成される
まで不活性状態である。結合の順序は重要でない。Ｃ１
は結合画分に結合してもよいし、あるいは、免疫学的反
応に先だって抗体に結合してもよい。もし望むなら、分
離インキュベーション段階を行なって、抗体あるいは結
合画分に対するＣ１の結合を促進してもよい。結合の順
序に関係なく、Ｃ１と結合画分との複合体の形成は、活
性型Ｃ１を供給する。
により、Ｃ１と結合画分とからなる複合体が形成される
まで不活性状態である。結合の順序は重要でない。Ｃ１
は結合画分に結合してもよいし、あるいは、免疫学的反
応に先だって抗体に結合してもよい。もし望むなら、分
離インキュベーション段階を行なって、抗体あるいは結
合画分に対するＣ１の結合を促進してもよい。結合の順
序に関係なく、Ｃ１と結合画分との複合体の形成は、活
性型Ｃ１を供給する。
調節剤は触媒の活性を調整したり、活性酵素の作用を受
けるまで不活性の状態に保たれるどんな物質でもよい。
作用するときの調節剤は、触媒の活性剤または抑制剤の
どちらかであり、たぶん１０-13ないし１０-1まで（好
ましくは１０-10ないし１０-3モル（Ｍ）まで）の濃度
範囲で使用される。好ましい調節剤は触媒抑制剤であ
り、それは下記の如く、活性酵素によるブロック基の除
去によってそれが活性化される（すなわち、遊離され
る）までその抑制的作用をブロックする基と結合してい
る。好ましい調節剤は、アミノ酸（そのうちではＬ−シ
スティンが好まれる）、チオウレア、ヒドロキサメイ
ト、サリチル酸のような芳香族ヒドロキシ酸、エチレン
ジアミンのようなポリアミン、エチレンジアミン四酢
酸、そして最も好ましくはベンジルメルカプタンのよう
なチオール、および2,2′−ジピリジル、1,10−フェナ
ントロリン、８−ヒドロキシキノリンのような窒素含有
複素環のような金属結合剤である。
けるまで不活性の状態に保たれるどんな物質でもよい。
作用するときの調節剤は、触媒の活性剤または抑制剤の
どちらかであり、たぶん１０-13ないし１０-1まで（好
ましくは１０-10ないし１０-3モル（Ｍ）まで）の濃度
範囲で使用される。好ましい調節剤は触媒抑制剤であ
り、それは下記の如く、活性酵素によるブロック基の除
去によってそれが活性化される（すなわち、遊離され
る）までその抑制的作用をブロックする基と結合してい
る。好ましい調節剤は、アミノ酸（そのうちではＬ−シ
スティンが好まれる）、チオウレア、ヒドロキサメイ
ト、サリチル酸のような芳香族ヒドロキシ酸、エチレン
ジアミンのようなポリアミン、エチレンジアミン四酢
酸、そして最も好ましくはベンジルメルカプタンのよう
なチオール、および2,2′−ジピリジル、1,10−フェナ
ントロリン、８−ヒドロキシキノリンのような窒素含有
複素環のような金属結合剤である。
上述したように、適当な酵素はＣ１であり、それは結合
した画分によって活性化されるまで活性のないままであ
る。他の適当な酵素は、たとえばプロテアーゼ、エステ
ラーゼ、フォスファターゼあるいはグリコシダーゼのよ
うなヒドロラーゼである。使われる酵素の濃度はその活
性による。そして、それは１０-6から１０-14モル
（Ｍ）まで、好ましくは１０-9から１０-11モル（Ｍ）
までである。
した画分によって活性化されるまで活性のないままであ
る。他の適当な酵素は、たとえばプロテアーゼ、エステ
ラーゼ、フォスファターゼあるいはグリコシダーゼのよ
うなヒドロラーゼである。使われる酵素の濃度はその活
性による。そして、それは１０-6から１０-14モル
（Ｍ）まで、好ましくは１０-9から１０-11モル（Ｍ）
までである。
適当なブロック基は、活性酵素によって開裂することの
できる、アミド、チオアミド、エステル、あるいはチオ
エステル結合のような結合によって調節剤に結合されて
よい。ブロックされる調節剤の濃度は約１０-1から１０
-9モル（Ｍ）まで、好ましくは１０-3から１０-6モル
（Ｍ）までである。このようにブロック基の選択は使わ
れる酵素によることがわかる。もし酵素がＣ１ならば好
ましいブロック基はペプタイドである。もし酵素がプロ
テアーゼならば適当なブロック基は、アミノ酸、カルボ
ン酸、もしくはペプタイドである。もし酵素がエステラ
ーゼならば、適当なブロック基は、アルコール類、チオ
ール類、カルボン酸類である。もし酵素がグリコシダー
ゼあるいはフォスファターゼなら、適当なブロック基は
それぞれ炭水化物基またはオルトリン酸基である。好ま
しいブロック基はペプチドであり、特にアミノ酸残基５
またはそれ以下のペプチドであり、エステルの手によっ
て調節剤に結合する。もっとも好まれるブロックされる
調節剤は、８−ヒドロキシキノリンとベンジルメルカプ
タンであり、そのヒドロキシとスルフヒドリル基がアミ
ノ酸またはアミノ酸残基数５以下のペプタイドのカルボ
キシ基とエステル化される。
できる、アミド、チオアミド、エステル、あるいはチオ
エステル結合のような結合によって調節剤に結合されて
よい。ブロックされる調節剤の濃度は約１０-1から１０
-9モル（Ｍ）まで、好ましくは１０-3から１０-6モル
（Ｍ）までである。このようにブロック基の選択は使わ
れる酵素によることがわかる。もし酵素がＣ１ならば好
ましいブロック基はペプタイドである。もし酵素がプロ
テアーゼならば適当なブロック基は、アミノ酸、カルボ
ン酸、もしくはペプタイドである。もし酵素がエステラ
ーゼならば、適当なブロック基は、アルコール類、チオ
ール類、カルボン酸類である。もし酵素がグリコシダー
ゼあるいはフォスファターゼなら、適当なブロック基は
それぞれ炭水化物基またはオルトリン酸基である。好ま
しいブロック基はペプチドであり、特にアミノ酸残基５
またはそれ以下のペプチドであり、エステルの手によっ
て調節剤に結合する。もっとも好まれるブロックされる
調節剤は、８−ヒドロキシキノリンとベンジルメルカプ
タンであり、そのヒドロキシとスルフヒドリル基がアミ
ノ酸またはアミノ酸残基数５以下のペプタイドのカルボ
キシ基とエステル化される。
調節剤からのブロック基の酵素的除去は非酵素学的にブ
ロック基を除去しない任意のpH（好ましくは６−８）で
行なわれてよい。結果として生ずる遊離の調節剤は表示
反応の触媒活性を調節し、そして、それは適当などんな
pHでも（好ましくは５−９）行なわれる。触媒は、流体
中に最初から存在するものであるか、あるいは好ましく
は１０-12から１０-4（好ましくは１０-9から１０-6）
モル（Ｍ）の濃度で分析混合物に加えられる。好ましい
触媒は、鉄、コバルト、マンガン、銅、バナジウム、水
銀、モリブデン、銀イオンあるいはそのようなイオンの
複合体、のような遷移金属イオンである。イオン複合体
は、自然に生じた複合体、たとえばヘミンのような鉄ポ
ルフィリンあるいはコバラミンのようなコバルトポルフ
ィリンであってよく、その代りに合成の誘導体、たとえ
ばデューテロヘミンのような合成のメタロポルフィリ
ン、あるいは鉄(III)メソテトラアリールポルフインで
あってもよい。
ロック基を除去しない任意のpH（好ましくは６−８）で
行なわれてよい。結果として生ずる遊離の調節剤は表示
反応の触媒活性を調節し、そして、それは適当などんな
pHでも（好ましくは５−９）行なわれる。触媒は、流体
中に最初から存在するものであるか、あるいは好ましく
は１０-12から１０-4（好ましくは１０-9から１０-6）
モル（Ｍ）の濃度で分析混合物に加えられる。好ましい
触媒は、鉄、コバルト、マンガン、銅、バナジウム、水
銀、モリブデン、銀イオンあるいはそのようなイオンの
複合体、のような遷移金属イオンである。イオン複合体
は、自然に生じた複合体、たとえばヘミンのような鉄ポ
ルフィリンあるいはコバラミンのようなコバルトポルフ
ィリンであってよく、その代りに合成の誘導体、たとえ
ばデューテロヘミンのような合成のメタロポルフィリ
ン、あるいは鉄(III)メソテトラアリールポルフインで
あってもよい。
たとえば第二鉄イオンのようにいくつかの触媒は固有の
触媒活性が低いことがあり、触媒活性の促進物の存在で
有利に使用される。役に立つ促進物の体は、2,2′−ジ
ピリジルおよび1,10−フェナントトロリンのような窒素
含有複素環である。促進物は、好ましくは金属イオン触
媒に対してモル過剰の状態で使用される。このように窒
素含有複素環は、使用される触媒に依存して、触媒活性
の促進物であるかまたは抑制的調節剤であるかであるこ
とが上述された通り理解される。
触媒活性が低いことがあり、触媒活性の促進物の存在で
有利に使用される。役に立つ促進物の体は、2,2′−ジ
ピリジルおよび1,10−フェナントトロリンのような窒素
含有複素環である。促進物は、好ましくは金属イオン触
媒に対してモル過剰の状態で使用される。このように窒
素含有複素環は、使用される触媒に依存して、触媒活性
の促進物であるかまたは抑制的調節剤であるかであるこ
とが上述された通り理解される。
表示反応は、触媒存在下で酸化還元試薬と基質が反応す
ることであり、好ましくは色の変化としての信号を発生
する。触媒のない状態では表示反応は殆んど進行しない
か、非常に徐々にしか進行しない。
ることであり、好ましくは色の変化としての信号を発生
する。触媒のない状態では表示反応は殆んど進行しない
か、非常に徐々にしか進行しない。
還元剤あるいは好ましくは酸化剤は酸化還元試薬として
役に立つ。そして、それは１０-8ないし１０-1モル
（Ｍ）、好ましくは１０-6から１０-2モル（Ｍ）の濃度
範囲で使われる。適当な酸化剤の例は、過酸化水素およ
びｍ−クロロ過安息香酸のような過酸化物、臭素酸塩、
塩素酸塩、過ヨウ素酸塩、酸素、過硫酸塩等である。適
当な還元剤の例はチオ硫酸塩とアスコルビン酸である。
基質は検出できる信号を与えるための表示反応で酸化あ
るいは還元されるどんな物質でもよい。好ましい基質は
芳香族アミン、フェノール、トリアリールメタンであ
つ。もっとも好ましい基質は相互変換のできる色原体で
着色形のものおよび無色の形のものである。たとえば、
アリザリンレッドＳは、その紫色の形（フォーム）がコ
バルトイオンのような金属イオンの触媒下で無色の形に
酸化される。他の基質は無色であってｐ−フェネチジン
の第二鉄イオンにより触媒される生成物のように酸化を
受けて着色生成物（単数もしくは複数）を与えてよい。
基質の適当な濃度は、１０-8から１０-1モル（Ｍ）、好
ましくは１０-6から１０-3モル（Ｍ）である。
役に立つ。そして、それは１０-8ないし１０-1モル
（Ｍ）、好ましくは１０-6から１０-2モル（Ｍ）の濃度
範囲で使われる。適当な酸化剤の例は、過酸化水素およ
びｍ−クロロ過安息香酸のような過酸化物、臭素酸塩、
塩素酸塩、過ヨウ素酸塩、酸素、過硫酸塩等である。適
当な還元剤の例はチオ硫酸塩とアスコルビン酸である。
基質は検出できる信号を与えるための表示反応で酸化あ
るいは還元されるどんな物質でもよい。好ましい基質は
芳香族アミン、フェノール、トリアリールメタンであ
つ。もっとも好ましい基質は相互変換のできる色原体で
着色形のものおよび無色の形のものである。たとえば、
アリザリンレッドＳは、その紫色の形（フォーム）がコ
バルトイオンのような金属イオンの触媒下で無色の形に
酸化される。他の基質は無色であってｐ−フェネチジン
の第二鉄イオンにより触媒される生成物のように酸化を
受けて着色生成物（単数もしくは複数）を与えてよい。
基質の適当な濃度は、１０-8から１０-1モル（Ｍ）、好
ましくは１０-6から１０-3モル（Ｍ）である。
検出できる信号は表示反応と関連し、たとえば光の産物
であってよい。光は化学ルミネッセンス、螢光であって
よいし、あるいは螢光物によって吸収や放出の結果検出
される螢光であってよい。好ましくは、検出できる信号
は色の発生又は消失であり、あるいは、ある色から他の
色に変わる変化でもよい。本発明の他の態様において
は、信号はたとえば、基質の色が一定時間の間変化しな
いままでいる系での表示反応速度の変化であってよい。
このように、信号の測定は運動学的条件または熱力学的
条件のどちらでされてもよい。運動学的測定は一定期間
内におこる変化の速度を決めるもので、そして概して分
析試薬を混合したのち、いろいろな時間、連続測定をす
ることにより行なわれる。熱力学的測定は、表示反応の
基質と生成物の間に平衡状態が達した時、おこった変化
の程度を決定する。測定は器機によるか、あるいは、好
ましくは肉眼でされてよい。
であってよい。光は化学ルミネッセンス、螢光であって
よいし、あるいは螢光物によって吸収や放出の結果検出
される螢光であってよい。好ましくは、検出できる信号
は色の発生又は消失であり、あるいは、ある色から他の
色に変わる変化でもよい。本発明の他の態様において
は、信号はたとえば、基質の色が一定時間の間変化しな
いままでいる系での表示反応速度の変化であってよい。
このように、信号の測定は運動学的条件または熱力学的
条件のどちらでされてもよい。運動学的測定は一定期間
内におこる変化の速度を決めるもので、そして概して分
析試薬を混合したのち、いろいろな時間、連続測定をす
ることにより行なわれる。熱力学的測定は、表示反応の
基質と生成物の間に平衡状態が達した時、おこった変化
の程度を決定する。測定は器機によるか、あるいは、好
ましくは肉眼でされてよい。
もし、付加的な信号の増幅が望まれるならば、多段式カ
スケード増幅分析が行なわれてよい、その場合において
は、分析媒体中の複数の試薬は連続的に反応し、結果と
して最終的にブロック剤が取り去られる。本発明のこの
態様を述べると上述された酵素を第１酵素と考え、この
第１酵素が分析媒体中の試薬を酵素学的に第２酵素に変
え、これがさらに調節剤を脱ブロックすると考えるのが
都合が良い。あるいは第１酵素あるいは、次の酵素が付
加的反応剤と反応して、さらに別の酵素を供給し、こう
して、調節剤が除去されるまで酵素反応のカスケードを
続けてよい。分析媒体に加えられる試薬の適切な選択に
よって、任意の回数の増幅段階も行なわれうる。
スケード増幅分析が行なわれてよい、その場合において
は、分析媒体中の複数の試薬は連続的に反応し、結果と
して最終的にブロック剤が取り去られる。本発明のこの
態様を述べると上述された酵素を第１酵素と考え、この
第１酵素が分析媒体中の試薬を酵素学的に第２酵素に変
え、これがさらに調節剤を脱ブロックすると考えるのが
都合が良い。あるいは第１酵素あるいは、次の酵素が付
加的反応剤と反応して、さらに別の酵素を供給し、こう
して、調節剤が除去されるまで酵素反応のカスケードを
続けてよい。分析媒体に加えられる試薬の適切な選択に
よって、任意の回数の増幅段階も行なわれうる。
今まで述べられた本発明のどんな態様でも増幅が起こる
ことは明らかである。というのは、酵素あるいは次に生
じる酵素と金属イオン触媒は本当の触媒として作用し、
単一の分子でさえ実質的に無限の保護された調節剤ある
いは、基質分子に夫々消費されることなく作用するから
である。このように、本発明の方法を行なうのに理論
上、１分子の酵素で十分である。本発明の実施において
は、加えられる酵素および触媒の量や使われる増幅段階
の数の決定は、一般的な熟練技術の範囲である。
ことは明らかである。というのは、酵素あるいは次に生
じる酵素と金属イオン触媒は本当の触媒として作用し、
単一の分子でさえ実質的に無限の保護された調節剤ある
いは、基質分子に夫々消費されることなく作用するから
である。このように、本発明の方法を行なうのに理論
上、１分子の酵素で十分である。本発明の実施において
は、加えられる酵素および触媒の量や使われる増幅段階
の数の決定は、一般的な熟練技術の範囲である。
本発明の他の態様では、分析成分は固体支持体の表面に
付着する。この技術分野で知られるように、固体支持体
は実質的に分析に阻害的でない任意の支持体でもよい。
使われる典型的な固体支持体はガラス、重合体物質（ポ
リエチレン、ポリスチレン、その他）である。そのよう
な支持体は薄板、平板、孔（ウエル）、好ましくは管の
ような適当な形に作ることができる。たとえば分析成分
はチューブ、好ましくは下端を閉じたプラスチックチュ
ーブの壁や底の内側に付着してよい。好ましくはブロッ
クされた調節剤は次のような方法で固体支持体に付着し
てもよい；即ち、ブロック基が活性酵素によって除去さ
れるとき遊離調節剤が活性酵素の濃度に比例し、従って
リガンドの濃度に比例して、固体支持体に付着したまま
残存する。分析媒体の異質の物質すべてを除去するため
に、その次に洗浄段階が行なわれてよい。この洗浄を行
なわないと上記異質分質は分析を阻害し、基質、酸化還
元試薬、触媒が表示反応を生じる妨げとなることがあ
る。
付着する。この技術分野で知られるように、固体支持体
は実質的に分析に阻害的でない任意の支持体でもよい。
使われる典型的な固体支持体はガラス、重合体物質（ポ
リエチレン、ポリスチレン、その他）である。そのよう
な支持体は薄板、平板、孔（ウエル）、好ましくは管の
ような適当な形に作ることができる。たとえば分析成分
はチューブ、好ましくは下端を閉じたプラスチックチュ
ーブの壁や底の内側に付着してよい。好ましくはブロッ
クされた調節剤は次のような方法で固体支持体に付着し
てもよい；即ち、ブロック基が活性酵素によって除去さ
れるとき遊離調節剤が活性酵素の濃度に比例し、従って
リガンドの濃度に比例して、固体支持体に付着したまま
残存する。分析媒体の異質の物質すべてを除去するため
に、その次に洗浄段階が行なわれてよい。この洗浄を行
なわないと上記異質分質は分析を阻害し、基質、酸化還
元試薬、触媒が表示反応を生じる妨げとなることがあ
る。
固体支持体を使う本発明のもう一つの態様では、抗リガ
ンドを固体支持体に付着し、固体支持体にリガンドを結
合するためにリガンドとインキュベートしてもよい。阻
害物質を除去する洗浄段階ののち、残りの分析成分を加
え、分析を上述の如く完了する。もし望むなら、本発明
のこの態様はサンドイッチ方式で行なわれてよい。その
場合、固体相の抗リガンドに結合したリガンドが、リガ
ンドの第２の決定因子を認識する第２抗リガンドに結合
される。たとえば、酵素は第２抗リガンドに結合され、
分析は上述の如く行なわれる。
ンドを固体支持体に付着し、固体支持体にリガンドを結
合するためにリガンドとインキュベートしてもよい。阻
害物質を除去する洗浄段階ののち、残りの分析成分を加
え、分析を上述の如く完了する。もし望むなら、本発明
のこの態様はサンドイッチ方式で行なわれてよい。その
場合、固体相の抗リガンドに結合したリガンドが、リガ
ンドの第２の決定因子を認識する第２抗リガンドに結合
される。たとえば、酵素は第２抗リガンドに結合され、
分析は上述の如く行なわれる。
ほとんど無限の分析形態が本発明の範囲内で適用される
ことは明らかであり、その中には同相分析と異相分析の
両方があり、それらを競合法またはサンドイッチ法によ
って行なうことも含まれることは明らかである。さらに
本発明は、リガンドの検出またはその濃度の決定に適当
な分析形態をもたらす。リガンドの濃度は、未知量のリ
ガンドによるシグナルの強度と、本質的に同一な状態で
分析される既知量のリガンドの一定範囲の分析で生じた
シグナルの強度を比較することによって決定されてよ
い。
ことは明らかであり、その中には同相分析と異相分析の
両方があり、それらを競合法またはサンドイッチ法によ
って行なうことも含まれることは明らかである。さらに
本発明は、リガンドの検出またはその濃度の決定に適当
な分析形態をもたらす。リガンドの濃度は、未知量のリ
ガンドによるシグナルの強度と、本質的に同一な状態で
分析される既知量のリガンドの一定範囲の分析で生じた
シグナルの強度を比較することによって決定されてよ
い。
本発明の他の見地は、本発明の方法に従ったリガンドの
分析を完了させるため材料の試薬キットもしくは包装品
である。キットは抗リガンド、酵素（活性型か非活性型
のどちらかであってよく、所望により抗リガンドに結合
していてよい）、触媒に対するブロックされた調節剤
（この抗リガンドあるいはブロックされた調節剤は所望
により固体支持体に付着していてよい）を含んでいる。
そのキットは触媒、標準のリガンド、たとえば既知の濃
度の１つかそれ以上のリガンドサンプルも含んでよい。
あるいは、キットは他の試薬、酵素基質、あるいは他の
標識されているか、もしくは標識されていない特異的抗
原、抗体又はそれらの複合体を分析を行なうのに役立つ
成分として含んでいてもよい。さらに生理食塩水や緩衝
液のような液体を含みうる。キットの成分は、たとえば
バイヤルびんのような別々の容器で供給されてもよく、
または２つかそれ以上の成分を単一容器中に混合しても
よい。次にあげる実施例により本発明をさらに詳しく述
べるが、本発明は実施例によって限定されるものでなな
い。
分析を完了させるため材料の試薬キットもしくは包装品
である。キットは抗リガンド、酵素（活性型か非活性型
のどちらかであってよく、所望により抗リガンドに結合
していてよい）、触媒に対するブロックされた調節剤
（この抗リガンドあるいはブロックされた調節剤は所望
により固体支持体に付着していてよい）を含んでいる。
そのキットは触媒、標準のリガンド、たとえば既知の濃
度の１つかそれ以上のリガンドサンプルも含んでよい。
あるいは、キットは他の試薬、酵素基質、あるいは他の
標識されているか、もしくは標識されていない特異的抗
原、抗体又はそれらの複合体を分析を行なうのに役立つ
成分として含んでいてもよい。さらに生理食塩水や緩衝
液のような液体を含みうる。キットの成分は、たとえば
バイヤルびんのような別々の容器で供給されてもよく、
または２つかそれ以上の成分を単一容器中に混合しても
よい。次にあげる実施例により本発明をさらに詳しく述
べるが、本発明は実施例によって限定されるものでなな
い。
実施例Ｉ このモデル実験では、活性Ｃ１成分Ｃ１ｓを用いて本発
明の方法を説明する。本発明の実施においては、結合画
分と非活性Ｃ１の相互作用によって活性亜成分（active
subcomponent）Ｃ１ｓが生ずるということが理解され
よう。
明の方法を説明する。本発明の実施においては、結合画
分と非活性Ｃ１の相互作用によって活性亜成分（active
subcomponent）Ｃ１ｓが生ずるということが理解され
よう。
2,8μg/mlタンパク質（およそ３２ｎＭＣ１ｓ）を含有
する精製された活性化補体第１成分（Ｃｌｓ）の脱塩溶
液を、pH７．３５のベロナール緩衡生理食塩水（ＶＢ
Ｓ）により作る。別に新たに、緩衡された２×１０-5の
ベンジルＮ2−カルボベンジルオキシ−Ｌ−アルギニン
チオエステル塩酸塩（ベンジルメルカプタンＮ2−カル
ボベンジルオキシ−Ｌ−アルギニン塩酸塩との縮合によ
って作られたブロックされた調節剤）を用意し、その１
mlを複数のキュベットの各々に入れる。緩衡液のみにつ
いてもコントロールキュベットに入れる。それぞれのキ
ュベットに量を変化させながら補体溶液を加える。但
し、チオエステルを含有する２番目のコントロールキュ
ベットには補体は加えない。キュベットの内容を攪拌
し、室温にて１０分間放置する。そして各キュベットに
新たに用意した0.025％Ｐ−フェネチジン塩酸塩を1.0ml
（基質）、pH5.5、0.5Ｍの酢酸ナトリウム緩衡液を3.0m
l、0.30％2,2′−ジピリジルを1.0ml（促進剤）と水2.5
mlの混合水溶液を1.0mlずつ加える。得られた水溶液を
攪拌して、新たに用意した塩化第２鉄と過沃素酸カリウ
ムの溶液を、最終濃度がＦｅ(III)2.1×１０-7モル
（Ｍ）及び酸化剤が1.7×１０-4モル（Ｍ）となるまで
加える。この溶液を再び攪拌し、１０分間にわたり、一
定時間置きに、５３６ｎｍでの吸光度をベックマンＤＵ
７分光光度計（Beckman Instrument Inc.Irvine,Califo
rnia）によって測定する。
する精製された活性化補体第１成分（Ｃｌｓ）の脱塩溶
液を、pH７．３５のベロナール緩衡生理食塩水（ＶＢ
Ｓ）により作る。別に新たに、緩衡された２×１０-5の
ベンジルＮ2−カルボベンジルオキシ−Ｌ−アルギニン
チオエステル塩酸塩（ベンジルメルカプタンＮ2−カル
ボベンジルオキシ−Ｌ−アルギニン塩酸塩との縮合によ
って作られたブロックされた調節剤）を用意し、その１
mlを複数のキュベットの各々に入れる。緩衡液のみにつ
いてもコントロールキュベットに入れる。それぞれのキ
ュベットに量を変化させながら補体溶液を加える。但
し、チオエステルを含有する２番目のコントロールキュ
ベットには補体は加えない。キュベットの内容を攪拌
し、室温にて１０分間放置する。そして各キュベットに
新たに用意した0.025％Ｐ−フェネチジン塩酸塩を1.0ml
（基質）、pH5.5、0.5Ｍの酢酸ナトリウム緩衡液を3.0m
l、0.30％2,2′−ジピリジルを1.0ml（促進剤）と水2.5
mlの混合水溶液を1.0mlずつ加える。得られた水溶液を
攪拌して、新たに用意した塩化第２鉄と過沃素酸カリウ
ムの溶液を、最終濃度がＦｅ(III)2.1×１０-7モル
（Ｍ）及び酸化剤が1.7×１０-4モル（Ｍ）となるまで
加える。この溶液を再び攪拌し、１０分間にわたり、一
定時間置きに、５３６ｎｍでの吸光度をベックマンＤＵ
７分光光度計（Beckman Instrument Inc.Irvine,Califo
rnia）によって測定する。
結果は表Ｉに明らかなように、紫色の生成物の最終吸光
度及び初期の酸化速度の両者とこの濃度範囲における補
体のレベルには一次関数的相関が見られる。補体の視覚
による測定限界はおよそ２５０ｎｇ（ほぼ1.3ｎＭ）で
あり、器機測定の限界は3.6×１０-10以下である。
度及び初期の酸化速度の両者とこの濃度範囲における補
体のレベルには一次関数的相関が見られる。補体の視覚
による測定限界はおよそ２５０ｎｇ（ほぼ1.3ｎＭ）で
あり、器機測定の限界は3.6×１０-10以下である。
実施例II この実験においてＨＳＶの異相固相分析の典型的手順を
示す。
示す。
マイクロタイタープレートのウエルは、適切な緩衝液内
でウィルス抗原に対する抗体の２００μｌ溶液にて４℃
で少くとも１８時間インキュベートすることにより、Ｈ
ＳＶに対する特異的抗体で表面処理されている。次いで
そのプレートを緩衝液で洗浄する。分析のためには、緩
衝されたサンプル溶液を５０μｌずつ、ウエルに入れ
る。これらには、一定量の抗原を含む陽性スタンドー
ド、抗原を含まない陰性コントロール、必要な予備処理
をすませた種々の希釈液のサンプルなどがあり、また全
くの緩衝液のみ加えられるウエルもある。室温で２時間
インキュベートしたのちこれらのウエルを２００ミリリ
ットル（ml）の緩衝液によって３回洗浄する。そして全
てのウエルにＣ１ｓと結合したＨＳＶ特異抗体の５０マ
イクロリットル（μｌ）溶液を加え、プレートを２時間
インキュベートする。その後ウエルを緩衝液によって５
回洗浄する。
でウィルス抗原に対する抗体の２００μｌ溶液にて４℃
で少くとも１８時間インキュベートすることにより、Ｈ
ＳＶに対する特異的抗体で表面処理されている。次いで
そのプレートを緩衝液で洗浄する。分析のためには、緩
衝されたサンプル溶液を５０μｌずつ、ウエルに入れ
る。これらには、一定量の抗原を含む陽性スタンドー
ド、抗原を含まない陰性コントロール、必要な予備処理
をすませた種々の希釈液のサンプルなどがあり、また全
くの緩衝液のみ加えられるウエルもある。室温で２時間
インキュベートしたのちこれらのウエルを２００ミリリ
ットル（ml）の緩衝液によって３回洗浄する。そして全
てのウエルにＣ１ｓと結合したＨＳＶ特異抗体の５０マ
イクロリットル（μｌ）溶液を加え、プレートを２時間
インキュベートする。その後ウエルを緩衝液によって５
回洗浄する。
更に、それぞれのウエルに緩衝されたベンジルＮ2−カ
ルボベンジルキシ−Ｌ−アルギニンチオエステル塩酸塩
溶液１０マイクロリットル（μｌ）を加える。１０〜６
０分インキュベートした後、新たに用意したpH5.5の詐
酸ナトリウム緩衝液中の2,2−ジピリジルおよびＰ−フ
ェネチジン塩酸塩を実施例Ｉと同様の比率で含む試薬液
をそれぞれのウエルに加える。次に新たに用意した塩化
第２鉄と過ヨウ素酸カリウムとの混合液をウエルに加
え、プレートを振とうする。この溶液を更に１０分間室
温でインキュベートする。陰性コントロールには、反応
抑制剤が放出されないため深い紫色が生じるが、一方抗
原の量が増加すにつれその色調は段階的に薄くなってゆ
く。陽性コントロールとの比較により、抗原のレベルの
準定量的測定がサンプル溶液の色調の視査により行ない
うる。
ルボベンジルキシ−Ｌ−アルギニンチオエステル塩酸塩
溶液１０マイクロリットル（μｌ）を加える。１０〜６
０分インキュベートした後、新たに用意したpH5.5の詐
酸ナトリウム緩衝液中の2,2−ジピリジルおよびＰ−フ
ェネチジン塩酸塩を実施例Ｉと同様の比率で含む試薬液
をそれぞれのウエルに加える。次に新たに用意した塩化
第２鉄と過ヨウ素酸カリウムとの混合液をウエルに加
え、プレートを振とうする。この溶液を更に１０分間室
温でインキュベートする。陰性コントロールには、反応
抑制剤が放出されないため深い紫色が生じるが、一方抗
原の量が増加すにつれその色調は段階的に薄くなってゆ
く。陽性コントロールとの比較により、抗原のレベルの
準定量的測定がサンプル溶液の色調の視査により行ない
うる。
実施例III この実施例では色調表示反応により生じる信号に対する
種々の濃度における金属結合剤の効果を示す。
種々の濃度における金属結合剤の効果を示す。
鉄ポルフィリンデュ−テロヘミン触媒をK.M.スミスの
「ポルフィリンとメタロポルフィリン」ed,Elsevier,１
９７５に記述の通りに用意する。
「ポルフィリンとメタロポルフィリン」ed,Elsevier,１
９７５に記述の通りに用意する。
0.1ＮのＮａＯＨ２ミリリットル（ml）に2.4mgの触媒を
含有する溶液を新たに用意し、pH7.4の0.01Ｍリン酸塩
緩衝液で希釈し、0.2μＭの触媒溶液とする。この金属
触媒溶液１mlをアクリル製キュベット内に入れられる。
0.05ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む。1.0mlのリ
ン酸塩で緩衝されたエタノールベンジルメルカプタンの
様々な希釈液に加え、内容物を攪拌する。その後、基質
溶液として、Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スル
フォプロピル）−ｍ−トルイジン（７８ｍＭ）（シグマ
ケミカル社）と４−アミノアンチピリン（１００ｍＭ）
（アドリッチケミカル社）をそれぞれ５０μｌずつキュ
ベットに加えて攪拌する。そして、１１０ｍＭの過酸化
水素を２５μｌそれぞれのキュベットに加える。再度の
攪拌の後、１０分間まで一定時間毎に５５５ｎｍにおけ
る吸光度を測定する。得られた最終の吸光度は表IIの通
りである。
含有する溶液を新たに用意し、pH7.4の0.01Ｍリン酸塩
緩衝液で希釈し、0.2μＭの触媒溶液とする。この金属
触媒溶液１mlをアクリル製キュベット内に入れられる。
0.05ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む。1.0mlのリ
ン酸塩で緩衝されたエタノールベンジルメルカプタンの
様々な希釈液に加え、内容物を攪拌する。その後、基質
溶液として、Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スル
フォプロピル）−ｍ−トルイジン（７８ｍＭ）（シグマ
ケミカル社）と４−アミノアンチピリン（１００ｍＭ）
（アドリッチケミカル社）をそれぞれ５０μｌずつキュ
ベットに加えて攪拌する。そして、１１０ｍＭの過酸化
水素を２５μｌそれぞれのキュベットに加える。再度の
攪拌の後、１０分間まで一定時間毎に５５５ｎｍにおけ
る吸光度を測定する。得られた最終の吸光度は表IIの通
りである。
これから分る通り、ベンジルメルカプタン濃度の増加に
つれて、発色の度合が減るが、その理由は酸化反応のた
めの鉄ポルフィリンデューテロヘミン触媒が反応混合物
から除去されるためである。この触媒システムは，Ｃ１
あるいはチオエステルによりブロックされた調節剤から
チオール例えばベンジルメルカプタンを放つことができ
る他の酵素の検出の際にただちに採用される。要約すれ
ば、本発明はある流体内に極少レベルで存在するリガン
ドを検出ないしは決定する方法をもたらすものである。
金属イオン触媒の調節剤と共有結合している保護基はあ
る酵素によって分離される。その酵素は結合画分と結合
しているかまたは不活性な状態で分析媒体に加えられた
後、結合画分によって活性化される。この遊離調節剤に
よる触媒への調節作用は信号への表示反応速度に影響す
る。この信号を検出することにより、その流体内のリガ
ンドの有無が立証される。信号の強度を計ることによ
り、リガンドの濃度が測定できる。調節剤と触媒とが２
つの増幅段階をもたらすことにより、信号は１０6倍に
増幅され肉眼での検出を可能にする。
つれて、発色の度合が減るが、その理由は酸化反応のた
めの鉄ポルフィリンデューテロヘミン触媒が反応混合物
から除去されるためである。この触媒システムは，Ｃ１
あるいはチオエステルによりブロックされた調節剤から
チオール例えばベンジルメルカプタンを放つことができ
る他の酵素の検出の際にただちに採用される。要約すれ
ば、本発明はある流体内に極少レベルで存在するリガン
ドを検出ないしは決定する方法をもたらすものである。
金属イオン触媒の調節剤と共有結合している保護基はあ
る酵素によって分離される。その酵素は結合画分と結合
しているかまたは不活性な状態で分析媒体に加えられた
後、結合画分によって活性化される。この遊離調節剤に
よる触媒への調節作用は信号への表示反応速度に影響す
る。この信号を検出することにより、その流体内のリガ
ンドの有無が立証される。信号の強度を計ることによ
り、リガンドの濃度が測定できる。調節剤と触媒とが２
つの増幅段階をもたらすことにより、信号は１０6倍に
増幅され肉眼での検出を可能にする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−501171（ＪＰ，Ａ)
Claims (25)
- 【請求項１】(a)リガンドを含有するとみられる流体； 該リガンドに対して特異的に結合する抗リガンド； 該リガンドと該抗リガンドが結合したときに活性化され
て、下記抑制剤のブロック基を遊離することができる不
活性な酵素； 酸化または還元されることにより検出可能な信号を生じ
る生成物に変換される基質および該基質を酸化または還
元することができる酸化還元剤； 該酸化還元剤と該基質との反応を触媒する金属イオン触
媒；および 該触媒の活性を抑制する抑制剤をブロック基でブロック
したもの を混合し； (b)上記流体内に存在するリガンドを上記抗リガンドと
結合させて上記酵素を活性化する結合物を生ぜしめ、そ
の際上記酵素が上記ブロック基を遊離せしめて遊離の抑
制剤をもたらし、遊離の該抑制剤により基質と酸化還元
剤の間の反応に対する上記触媒の活性を抑制しつつ生成
物を生ぜしめ；そして (c)上記リガンドを上記反応に対応する信号により検出
する； ことよりなる、流体内のリガンドの検出方法。 - 【請求項２】上記不活性な酵素が上記抗リガンドと結合
している特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】上記抗リガンドが固体支持体に付着してい
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】さらに上記流体を上記リガンドに対して特
異的であり且つ上記不活性な酵素に結合している第２の
抗リガンドと混合する特許請求の範囲第３項記載の方
法。 - 【請求項５】上記不活性な酵素が補体の第一成分である
特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】上記不活性な酵素が加水分解酵素である特
許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】上記酸化還元剤が酸化剤と還元剤から成る
群より選択されたものである特許請求の範囲第１項記載
の方法。 - 【請求項８】上記遊離抑制剤が金属結合剤である特許請
求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項９】上記ブロック基がペプチド、アミノ酸、カ
ルボン酸、アルコール、炭水化物及びオルトリン酸塩か
らなる化合物の残基より選択されたものである特許請求
の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１０】上記金属イオンが鉄、コバルト、マンガ
ン、銅、パナジウム、水銀、モリブデンおよび銀からな
るイオンより選択されたものである特許請求の範囲第１
項記載の方法。 - 【請求項１１】上記基質が芳香族アミン、フエノール、
トリアリルメタンからなる基質より選択されたものであ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１２】上記信号が色である特許請求の範囲第１
項記載の方法。 - 【請求項１３】上記信号が上記生成物に伴う蛍光である
特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１４】上記混合物の流体相を上記固体支持体か
ら分離する工程をさらに含む特許請求の範囲第３項記載
の方法。 - 【請求項１５】上記流体を上記触媒活性促進剤と結合さ
せる工程をさらに含む特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項１６】工程(a)において、不活性な酵素；金属
イオン触媒に対する抑制剤；リガンドを含有するとみら
れる流体；上記リガンドに対して特異的な抗リガンド；
および信号手段を混合し、 工程(b)の活性化された抑制剤が上記触媒の触媒活性を
抑制し、そして 工程(c)において、上記信号手段が上記流体内の存在の
指標となる検出可能な信号を生じさせる ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１７】工程(a)における、上記不活性な酵素が
補体の第１成分であり且つ上記ブロック基がペプチドで
あり； 工程(c)において、上記反応に伴う色調の変化を抑制す
ることにより上記リガンドを検出することを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１８】(a)リガンドを含有するとみられる流体
を上記リガンドに対して特異的な抗リガンドと混合する
が、その際上記抗リガンドは加水分解酵素を結合して有
しており； (b)上記流体内に存在するリガンドを、結合相と遊離相
をもたらすように上記抗リガンドと結合させ； (c)上記結合相を上記遊離相より分離し； (d)上記結合相を酸化剤、この酸化剤の基質、金属イオ
ン触媒及び金属イオン結合剤と接触させ、但し、上記金
属イオン結合剤はその結合特性をブロックするブロック
基と結合されており、このようにして上記加水分解酵素
で上記ブロック基を取り去ることにより上記金属イオン
触媒と結合する遊離結合剤を生じさせることにより、上
記基質と上記酸化剤との間の反応に対する上記触媒の触
媒活性を抑制し；そして (e)上記反応に対応する色の変化の抑制具合によって上
記リガンドを検出する； ことよりなる、流体中のリガンドの検出方法。 - 【請求項１９】上記信号の強度を、既知量のリガンドを
含む流体サンプルで(a)〜(c)の工程をくり返した時の信
号の強度と比較する工程をさらに含む特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項２０】リガンドに特異的に結合する抗リガン
ド； 該リガンドと該抗リガンドが結合したときに活性化され
て、下記抑制剤のブロック基を遊離することができる不
活性な酵素； 酸化または還元されることにより検出可能な信号を生じ
る生成物に変換される基質および該基質を酸化または還
元することができる酸化還元剤； 該酸化還元剤と該基質との反応を触媒する金属イオン触
媒；および 該触媒の活性を抑制する抑制剤をブロック基でブロック
したもの により構成される、流体中のリガンド検出用キット。 - 【請求項２１】上記不活性な酵素が上記抗リガンドと結
合している特許請求の範囲第20項記載のキット。 - 【請求項２２】上記ブロックされた抑制剤と上記抗リガ
ンドの少なくとも一方が固体支持体に付着している特許
請求の範囲第20項記載のキット。 - 【請求項２３】さらに既知濃度のリガンドを含有する流
体サンプルを少なくとも１つ有する特許請求の範囲第20
項記載のキット。 - 【請求項２４】さらに抗原、抗体、それらの複合体、緩
衝液および生理食塩水からなる試薬群より選択された試
薬を少なくとも１つ有する特許請求の範囲第20項記載の
キット。 - 【請求項２５】さらに１つもしくはそれ以上の容器を有
する特許請求の範囲第20項記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US861818 | 1986-05-12 | ||
| US06/861,818 US4810631A (en) | 1986-05-12 | 1986-05-12 | Signal enhancement in immunoassay by modulation of chemical catalysis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62274261A JPS62274261A (ja) | 1987-11-28 |
| JPH063447B2 true JPH063447B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=25336850
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62115718A Expired - Lifetime JPH063447B2 (ja) | 1986-05-12 | 1987-05-12 | 化学的触媒の調節剤によるイムノアッセイの信号強化法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4810631A (ja) |
| EP (1) | EP0245981B1 (ja) |
| JP (1) | JPH063447B2 (ja) |
| AU (1) | AU596832B2 (ja) |
| BR (1) | BR8701435A (ja) |
| CA (1) | CA1271419A (ja) |
| DE (1) | DE3772840D1 (ja) |
| DK (1) | DK233987A (ja) |
| ES (1) | ES2025654T3 (ja) |
| MX (1) | MX167488B (ja) |
| NZ (1) | NZ219442A (ja) |
| ZA (1) | ZA871750B (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4962024A (en) * | 1988-08-11 | 1990-10-09 | Becton, Dickinson And Company | Signal enhancement in assay for an enzyme |
| CA2000678A1 (en) * | 1988-11-17 | 1990-05-17 | John E. Reardon | Chromogenic substrate for esterase and immunoassay using same |
| IE900688A1 (en) * | 1989-03-08 | 1991-02-13 | Becton Dickinson Co | Signal enhancement in magnetic immunoassay by inhibition of¹enzymatic catalysis |
| US5196306A (en) * | 1989-03-29 | 1993-03-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the detection or quantitation of an analyte using an analyte dependent enzyme activation system |
| GB8927503D0 (en) * | 1989-12-04 | 1990-02-07 | Kronem Systems Inc | Enzyme-amplified lanthanide chelate luminescence |
| US5972630A (en) * | 1991-08-19 | 1999-10-26 | Dade Behring Marburg Gmbh | Homogeneous immunoassays using enzyme inhibitors |
| US5279937A (en) * | 1992-04-30 | 1994-01-18 | Detechnology Canada | Use of macroglobulins to improve the signal-to-background ratio in affinity binding assays |
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