JPH0755807A - 色原体溶液安定化方法及び安定化された色原体溶液 - Google Patents

色原体溶液安定化方法及び安定化された色原体溶液

Info

Publication number
JPH0755807A
JPH0755807A JP20660393A JP20660393A JPH0755807A JP H0755807 A JPH0755807 A JP H0755807A JP 20660393 A JP20660393 A JP 20660393A JP 20660393 A JP20660393 A JP 20660393A JP H0755807 A JPH0755807 A JP H0755807A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
chromogen
solution
reaction
chromogen solution
stabilizing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP20660393A
Other languages
English (en)
Inventor
Masahiko Yamazaki
誠彦 山崎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Inc filed Critical Konica Minolta Inc
Priority to JP20660393A priority Critical patent/JPH0755807A/ja
Publication of JPH0755807A publication Critical patent/JPH0755807A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 簡易に且つ高感度、高分解能でありしかも迅
速な特定成分の酵素免疫測定方法が得られ、該測定方法
における色原体溶液もしくは色原体希釈液の安定化方法
及び該測定方法に有用である安定な色原体溶液もしくは
色原体希釈液の提供。 【構成】 酵素免疫測定の色素形成反応発色系におい
て、色原体溶液もしくは色原体希釈液に、低級脂肪酸又
はそれらの塩もしくは第4級アンモニューム化合物から
選ばれる少なくとも1種の化合物を存在させることを特
徴とする色原体溶液の安定化方法。また、酵素免疫測定
の色素形成反応発色系において、低級脂肪酸又はそれら
の塩もしくは第4級アンモニューム化合物から選ばれる
少なくとも1種の化合物を含有することを特徴とする色
原体溶液もしくは色原体希釈液。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は酵素又はその擬似酵素の
酸化反応を利用する検出系の色原体溶液もしくは色原体
希釈液の安定化方法及び該検出系に有用である安定な色
原体溶液もしくは色原体希釈液に関する。
【0002】
【従来の技術】臨床検査、診断分野においては、各種生
体内物質の定性、定量を行うに当り、酵素反応を利用す
る測定法が広く用いられている。
【0003】例えば抗原抗体反応を利用する酵素免疫測
定法においては、標識体として酵素を用いる事により、
その活性量又は活性量の変化を指標として試料中の解析
物質の測定が行われる。酵素は一般に色原体から色素を
生成させ、その色素量を測定することにより定量が可能
となる。酵素反応は液相で行われ、反応の場は色原体が
溶解されたバッファー溶液である。即ち、前記色原体の
バッファー溶液に酵素を添加して反応を行う。
【0004】使用される色原体は過酸化酵素による酸化
作用により解析手段(一般的には物質)を与える化合物で
あり、通常呈色色素を生成する芳香族アミン化合物やフ
ェノール系化合物などが知られている。芳香族アミン化
合物、例えばo-フェニレンジアミンは高い感度を得る事
ができ、最も広く用いられる。そして、o-フェニレンジ
アミンを含め、一般に色原体を溶解した溶液あるいはそ
の希釈液は、緩衝剤など多くの化合物が含有され、長期
保存で濁りを生じたり、また、色原体は、溶液状態では
安定性が十分でない場合が多く、光、酸素等により非酵
素的に酸化を受け、検出系において高いバックグランド
濃度を生ずるなど、実際の測定における測定誤差の要因
となっていた。それ故、暗所における取扱いや色原体含
有試薬液に調製後から使用までの時間制限等が課され、
色原体溶液もしくは色原体希釈液の安定化方法が強く要
望されていた。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】前記の情況に照し、本
発明の目的は、酵素免疫測定の色素形成反応発色系にお
ける色原体溶液もしくは色原体希釈液の安定化方法及び
該発色系に有用である安定な色原体溶液もしくは色原体
希釈液の提供にある。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は、酵
素免疫測定の色素形成反応発色系において、色原体溶液
もしくは色原体希釈液に、低級脂肪酸又はそれらの塩も
しくは第4級アンモニューム化合物から選ばれる少なく
とも1種の化合物を存在させることを特徴とする色原体
溶液の安定化方法により達成された。
【0007】また、酵素免疫測定の色素形成反応発色系
において、低級脂肪酸又はそれらの塩もしくは第4級ア
ンモニューム化合物から選ばれる少なくとも1種の化合
物を含有することを特徴とする色原体溶液もしくは色原
体希釈液により上記目的は解決される。
【0008】そして、より好ましくは低級脂肪酸が、デ
ヒドロ酢酸、ソルビン酸またはプロピオン酸、或いは第
4級アンモニューム化合物が塩化ベンザルコニウムであ
る。
【0009】生体成分などの特定成分を検出する各種の
分析法が開発されて来ているが、それらの方法の中最も
精度の高い方法として、該特定成分とこれに対して特異
的に結合しうる物質(以後特異結合物質と称する)、例え
ば抗原と抗体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとア
ビジン、プロテインAとIgG、ホルモンとレセプタ、
酵素と基質等の間の特異的結合反応を用いる方法が知ら
れている。
【0010】一般的には何らかの標識(ラベル)を付した
特異結合物質(以後標識体と称する)を用い特定成分に応
じて変化した該標識のシグナルを検出することにより特
定成分の測定が行われる。
【0011】本発明に於て特定成分は支持体に物理的吸
着、化学的結合等により直接的に担持されてもよく、1
つ以上の特異結合物質を介して間接的に担持されてもよ
い。又、特定成分を支持体上に直接もしくは間接的に担
持せしめた後、前記標識体を反応させ前記複合結合体を
形成させてもよいし、或いは複合結合体を形成せしめた
後に該複合結合体を支持体上に直接もしくは間接的に担
持せしめてもよい。更に標識体は該特定成分と複合結合
体を形成し、支持体に担持されるが、特定成分と標識体
は直接結合してもよく、1つ以上の他の特異結合物質を
介して結合してもよい。
【0012】本発明に於て標識体はパーオキシダーゼ或
いはアルカリフォスファターゼが好ましい。
【0013】本発明において、対象とする特定成分は、
その特定成分に特異的に結合する特異結合物質が得られ
る物質又は物質群である。
【0014】たとえば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、
複合糖質、糖脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗
体等が挙げられる。
【0015】また本発明に使用し得る特異結合物質は、
特定成分又は他の特異結合物質と特異的に結合できる物
質であり、特定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。た
とえば、蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチ
ン、プロテインA、アビジン、ビオチン、レセプター、
補酵素、酵素の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等
が挙げられる。本発明に使用し得る支持体としては、セ
ルロースアセテート、ニトロセルロース等の膜、ポリア
クリルアミド等のゲル状支持体、TLCプレート等のシ
リカゲル担体、プレート状、ビーズ状のプラスチック、
ガラス、金属、繊維等が挙げられる。また組織化学染色
においては、組織そのものも支持体として使用できる。
【0016】支持体に担持された特定成分とパーオキシ
ダーゼ標識体との複合結合体上に色素を生成せしめるに
は発色液中に支持体を浸漬させれば良い。発色液は、適
当なpHの緩衝液中に過酸化水素、色原体を溶解し、調製
される。
【0017】本発明に係る色原体は、酸化されることに
より解析手段を与える。例えば呈色色素、発光物質或い
は蛍光物質を生成する化合物であれば良く、一般に過酸
化酵素、過酸化水素の酵素反応を利用する検出系に用い
られる基質が含まれる。代表的なものとしては芳香族ア
ミン化合物やフェノール系化合物などが挙げられる。
【0018】具体例としては、o-フェニレンジアミン、
m-フェニレンジアミン、p-フェニレンジアミン、ベンジ
ジン、o-ジアニジジン、o-トリジン、3,3′5,5′-テト
ラメチルベンジジン、ジアミノベンジジン、ジカルボキ
シジン、2,2′-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン
-6-スルホン酸)、3-アミノ-9-エチルカルバゾール、4-
クロル-1-ナフトール、ピロガロール、4-アミノ-アンチ
ピリン、4-アミノ-N,N-ジメチルアニリン、4-アミノア
ンチピリンとジメチルアニリン、4-アミノアンチピリン
とジメチルアニリン混合物、4-アミノアンチピリンとジ
メチルアナニリン混合物、4-アミノアンチピリンとフェ
ノールの混合物、ピロガロールと p-フェニレンジアミ
ンの混合物、4-クロル-1-ナフトールとN-エチル-N′-ヒ
ドロキシエチル-3-メチル-4-アミノアニリンの混合物、
5-アミノサリチル酸、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノン
ヒドラゾンとジメチルアニリンの混合物、4-ヒドロキシ
フェニル酢酸、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン
酸、ルミノール等が挙げられ、またこれらの塩も有用で
ある。
【0019】本発明の色原体溶液または希釈液は、脂肪
酸またはその塩或いは第4級アンモニューム塩を含有さ
せることにより長期に亙り安定に使用することが可能に
なる。その結果、測定値の再現性が上昇し、分析も容易
になった。
【0020】本発明の色原体溶液又は希釈液に用いる溶
媒としては一般には水系溶媒が好ましいが酵素的酸化反
応を極端に阻害するものでなければ、有機溶媒又は有機
溶媒と水系溶媒の混合溶媒であってもよい。溶媒は酵素
反応に適当なpH値にあることが望ましく、通常用いら
れる緩衝剤により調製することが好ましい。過酸化酵素
を用いる場合は、pH3〜9が好ましい。
【0021】この場合も、色原体溶液調製時の各成分の
溶媒への添加の順序は特に限定されない。酵素反応によ
り色素が充分生成した後、未反応物質を洗い流し、ある
いは酸を添加するなどして、反応を停止する。
【0022】生成色素についての情報は、目視にて、も
しくは技術的に公知な方法たとえば分光光度計を用いて
読み取る事ができる。
【0023】
【実施例】
実施例1 1)色原体溶液及び発色液の調製 3,3′-5,5′-テトラメチルベンジジン2塩酸塩10mgを10
0mM酢酸緩衝液(pH6.0)10mlに溶解した。さらに、下
記のごとく添加剤を添加し、色原体溶液を調製した。
【0024】 基質溶液の調製 添加剤 添加濃度 本発明−1 デヒドロ酢酸 0.1% 本発明−2 デヒドロ酢酸 0.02% 本発明−3 塩化ベンザルコニウム 0.01% 本発明−4 塩化ベンザルコニウム 0.002% 本発明−5 ソルビン酸ナトリウム 0.2% 本発明−6 ソルビン酸ナトリウム 0.04% 本発明−7 プロピオン酸ナトリウム 0.2% 本発明−8 プロピオン酸ナトリウム 0.04% 比較例 添加せず。
【0025】これらの色原体溶液を、 a)37℃にて10日間静置した後、これに3%過酸化水素
水60μlを加える b)発色反応直前に調製し、これに3%過酸化水素水60
μlを加えるの2通りで発色液を調製した。
【0026】2)免疫反応 特開平3-259093に記載されている癌関連ガラクトシルト
ランスフェラーゼ(以下GATと称す)に対するモノク
ローナル抗体MAb8513を、100mM炭酸緩衝液(pH9.1
5)中に10μg/mlに希釈し、これにポリスチレンビーズ
(積水化学社製)を4℃にて24時間浸漬し抗体の固定化
を行った。ビーズを20mM燐酸緩衝液(150mMのNaCl含
有、pH7.3 以下PBSと称す)にて洗浄した後、牛血
清アルブミン(以下BSAと称す)を1%含有するPB
S中にビーズを移し37℃にて10時間静置し、ブロッキン
グを行った。ついでビーズは凍結乾燥し、4℃にて保存
した。癌患者プール血清(GATと高濃度に含む)50μ
lもしくは馬血清(GATを含まず)にPBS200μlを
添加し、これに上記抗体固定化ビーズを浸漬し、1次反
応(45℃、2時間)を行った。PBSで洗浄した後、1
%BSA/PBSにて1μg/mlに希釈されたペルオキシ
ダーゼ(以下PODと称す)標識抗GAT抗体MAb86
28(特開平3-259093)250μlを加え、2次反応(20℃、
1時間)を行った。その後、ビーズはPBSで洗浄し
た。
【0027】3)発色反応 2)にて免疫反応を施したビーズに、1)で調製した発
色液を300μl加え、室温にて発色反応を行った。30分後
に1N硫酸を1ml添加し反応を停止させ、450nmの吸光
度を測定し、結果を表1に示す。
【0028】
【表1】
【0029】本発明により、保存によるバックグランド
の上昇とシグナルの低下が抑制され、より正確な測定が
可能となった。
【0030】実施例2 1)希釈液及び発色液の調製 100mMクエン酸−燐酸緩衝液(pH5.0)10mlに下記のご
とく添加剤を添加し色原体希釈液を調製した。
【0031】 色原体希釈液の調製 添加剤 添加濃度 本発明−9 デヒドロ酢酸 0.05% 本発明−10 塩化ベンザルコニウム 0.005% 本発明−11 ソルビン酸ナトリウム 0.1% 本発明−12 プロピオン酸ナトリウム 0.1% 比較例 添加せず。
【0032】これらの希釈液を、 c)37℃にて20日間静置した後、これにo-フェニレンジ
アミン30mgと3%過酸化水素水60μlを加える d)発色反応直前に調製し、これにo-フェニレンジアミ
ン30mgと3%過酸化水素水60μlを加える の2通りで発色液を調製した。
【0033】2)免疫反応 実施例1の2)と同様に行った。
【0034】3)発色反応 450nmの代わりに492nmの吸光度を測定する以外は実施例
1の3)と同様に行い、結果を表2に示す。
【0035】
【表2】
【0036】表2から、保存によるバックグランドの上
昇が抑制され、より正確な測定が可能となることが解
る。
【0037】
【発明の効果】簡易に且つ高感度、高分解能でありしか
も迅速な特定成分の酵素免疫測定方法が得られ、該測定
方法における色原体溶液もしくは色原体希釈液の安定化
方法及び該測定方法に有用である安定な色原体溶液もし
くは色原体希釈液が得られた。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 酵素免疫測定の色素形成反応発色系にお
    いて、色原体溶液もしくは色原体希釈液に、低級脂肪酸
    又はそれらの塩もしくは第4級アンモニューム化合物か
    ら選ばれる少なくとも1種の化合物を存在させることを
    特徴とする色原体溶液の安定化方法。
  2. 【請求項2】 酵素免疫測定の色素形成反応発色系にお
    いて、低級脂肪酸又はそれらの塩もしくは第4級アンモ
    ニューム化合物から選ばれる少なくとも1種の化合物を
    含有することを特徴とする色原体溶液もしくは色原体希
    釈液。
  3. 【請求項3】 低級脂肪酸が、デヒドロ酢酸、ソルビン
    酸またはプロピオン酸であることを特徴とする請求項2
    記載の色原体溶液もしくは色原体希釈液。
  4. 【請求項4】 第4級アンモニューム化合物が塩化ベン
    ザルコニウムであることを特徴とする請求項2記載の色
    原体溶液もしくは色原体希釈液。
JP20660393A 1993-08-20 1993-08-20 色原体溶液安定化方法及び安定化された色原体溶液 Pending JPH0755807A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP20660393A JPH0755807A (ja) 1993-08-20 1993-08-20 色原体溶液安定化方法及び安定化された色原体溶液

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP20660393A JPH0755807A (ja) 1993-08-20 1993-08-20 色原体溶液安定化方法及び安定化された色原体溶液

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH0755807A true JPH0755807A (ja) 1995-03-03

Family

ID=16526129

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP20660393A Pending JPH0755807A (ja) 1993-08-20 1993-08-20 色原体溶液安定化方法及び安定化された色原体溶液

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH0755807A (ja)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4503143A (en) Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen
US4828983A (en) Use of phenols and anilines to increase the rate of peroxidase catalyzed oxidation of leuco dyes
US5126276A (en) Method for the determination and measurements of more than one unknown material in a single surface of a multianalytic assay
US4786589A (en) Immunoassay utilizing formazan-prelabeled reactants
US5358852A (en) Use of calcium in immunoassay for measurement of C-reactive protein
EP0171150B2 (en) Method and apparatus for assaying with optional reagent quality control
US4604365A (en) Immunoprecipitation assay
JPS61292060A (ja) 分析素子
JPH0249161A (ja) 免疫クロマトグラフイー分析方法
EP0481020B1 (en) Silver enhanced gold-labelled immuno assay method
JPH06105255B2 (ja) 固相ウレアーゼイムノアッセイのための基質組成物及び方法
JPS62100660A (ja) 高分子のイムノアツセイ法
US5506114A (en) Methods and kits for detecting the presence or concentration of biological analytes
JP4197393B2 (ja) IgA腎症の検査法
JPH10511776A (ja) レセプター:遊離リガンド(リランド)複合体ならびにそれに基づくアッセイおよびキット
US5176999A (en) Buffered wash composition, insolubilizing composition, test kits and method of use
JPH02501500A (ja) 生物学的診断検定システム
JPH0755807A (ja) 色原体溶液安定化方法及び安定化された色原体溶液
JPS6228666A (ja) 生物学的試料中の抗原及び抗体検出法及び検出用支持体
US5552297A (en) Lead detection method and reggents utilizing aminolevulinic acid dehydratase and tertiary phosphines
JPS628055A (ja) 酵素免疫測定方法
JP3194446B2 (ja) 電子伝達体を標識物質とする免疫学的検出方法
WO2000039586A2 (en) Tetramethylbenzidine formulation for horseradish peroxidase enzyme assays
US8318509B2 (en) Two-phase optical assays for analytes of no intrinsic opitcal contrast
JP2521074B2 (ja) 免疫反応の調節法