JPH0812196B2 - グリコシル化ヘモグロビンのアッセイ - Google Patents

グリコシル化ヘモグロビンのアッセイ

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JPH0812196B2
JPH0812196B2 JP2507703A JP50770390A JPH0812196B2 JP H0812196 B2 JPH0812196 B2 JP H0812196B2 JP 2507703 A JP2507703 A JP 2507703A JP 50770390 A JP50770390 A JP 50770390A JP H0812196 B2 JPH0812196 B2 JP H0812196B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グリコシル化ヘモグロビンを特異的に評価
するためのリガンド結合アッセイに関する。
体液中に溶解しているタンパク質は絶えずグリコシル
化過程に付される。グリコースは非酵素的反応によりタ
ンパク質と反応して糖タンパク質を形成し、多くの場
合、糖タンパク質形成レベルは問題の体液中のグリコー
ス濃度に比例する。タンパク質は最初に糖タンパク質と
しては合成されないので、グリコシル化形態で存在する
タンパク質分画は、 生体内のタンパク質の寿命、および タンパク質が暴露されたグリコース濃度の関数であ
る。
サンプリング時のグリコース濃度についての情報のみ
を与える血液、血漿または尿中のグリコース濃度の測定
とは異なり、グリコシル化形態で存在するタンパク質の
量は、より長期間にわたるグリコース濃度の生体制御の
指標を与える。
赤血球（erythrocyte,red blood cell）は約120日の
平均寿命を有し、大量のヘモグロビンを含有している。
したがって、グリコシル化形態の赤血球ヘモグロビン分
画は、真正糖尿病患者の病気を制御する良好な基準であ
り、採血の数週間前の患者の血中グリコース濃度の関数
である。臨床診療において、真正糖尿病患者の血中グリ
コースの長期制御を定量的に評価するために、グリコシ
ル化ヘモグロビン分画を測定するのに多くの異なる方法
が用いられている。臨床上用いられている主な方法は次
の方法である。
1.イオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化
および非グリコシル化ヘモグロビンの分離。これは提案
された最初の方法であり、今でも最も普通に用いられて
いる臨床方法である。この方法の欠点は、コストが高
く、作製方法に時間がかかると共に、分離の実施に時間
がかかることであり、わずかな温度変化によって結果が
影響を受ける。
2.グリコシル化ヘモグロビン分画を特異的に単離する
ためのボロン酸誘導体の使用。ボロン酸部分がシス−ジ
オール基を有する炭水化物部分に結合することは久しい
以前から知られており（Boeseken J.,Advances in carb
ohydrate chemistry 4,189−210,1949.Solms j.およびD
euel H.,Chimica 11,311,1957）、この性質はアフィニ
ティクロマトグラフィー分離のための基礎として用いる
ことができる。したがって例えば、ボロン酸基は、糖タ
ンパク質、炭水化物およびヌクレオチドを分離するため
に、例えば寒天などの固相上に化学的に固定化されてき
た（Hageman,J.およびKuehn,G.,Anal Biochem.80:547,1
977.）。このような材料のカラムは、ヘモグロビンのグ
リコシル化分画の定量にも用いられた（Dean P.D.G.＆a
l,英国特許出願GB−Ａ−2024829号明細書）。このよう
なカラムは作製に時間と費用がかかり、実行するのに時
間がかかる。すなわち、溶血物をカラムに通過させねば
ならず、異なる分画を集めねばならず、そして分画の容
積を補正せねばならない。その後で異なる分画のヘモグ
ロビン含量を測定することができ、グリコシル化形態の
ヘモグロビン分画を計算することができる。
3.電気泳動。ヘモグロビンのグリコシル化はタンパク
質の電荷を変化させる。これはグリコシル化および非グ
リコシル化分画の分離に用いることができ、これに続い
て異なる分画を例えば反射率測定により定量することが
できる。この方法も時間と費用がかかる。
真正糖尿病患者においては、赤血球内ヘモグロビンの
グリコシル化に加えて血清中のタンパク質のグリコシル
化も高い割合で起こる。しかし、種々の血清タンパク質
は生体内で異なる半減期を有し、これら半減期の大部分
はヘモグロビンの半減期よりも短いので、グリコシル化
血清タンパク質の測定は、病気の調節を短期間から中間
的な期間、遡及して鑑視するためにしか用いられない。
グリコシル化血清タンパク質を定量するための種々の測
定方法が、糖尿病制御の指数として広く用いられている
（Johnsen,Metcalf ＆ Baker,Clinical Chimica Acta12
7（1982）87−95）。しかしグリコシル化血清タンパク
質の定量は、臨床的価値を制限してきた。なぜならば大
部分の血清タンパク質の寿命が短いからであり、このこ
とはグリコシル化形態についても同様に真実である。さ
らに技術的観点から、血清タンパク質に結合した炭水化
物の定量は、毛細血管血のマイクロサンプリングによっ
てのみ行うことのできる糖尿病患者の血中グリコース定
量と比較して、実施するのに時間がかかり、やっかいな
血清の回収と調製が必要である（静脈穿刺、２時間の凝
集、遠心分離および傾しゃ）。
グリコシル化ヘモグロビンを定量するためのいずれの
従来方法も、絶対的な標準方法として確立されるに至っ
ていない。第１には、異なる公知方法で単離された分画
は正確には対応しない（“Measurement of Glycosylate
d Hemoglobins using affinity chromatography"B ouri
otis et al,Diabetologia21:579−580,1981）。イオン
交換法において、HbAlcと命名された分画はしばしば
「グリコシル化ヘモグロビン」と呼ばれるが、この分画
は非グリコシル化ヘモグロビンをも含有することがあ
り、幾つかのグリコシル化ヘモグロビンは異なる分画に
溶出される。
固定化ボロン酸基を用いるアフィニティクロマトグラ
フィーによれば、β−鎖のアミノ末端においてグリコシ
ル化されたもっと一般的な分画に加えて、異なる基にお
いてグリコシル化されたヘモグロビン（例えばリジン基
においてグリコシル化されたヘモグロビンを含む）が単
離される。しかし非グリコシル化ヘモグロビンはこの方
法に用いられる固相と非特異的に結合するようになるこ
ともあり、そしてグリコシル部分が分子内に位置し、固
相との結合に利用できないならば、すべてのグリコシル
化ヘモグロビンが結合できるわけではない。したがっ
て、グリコシル化ヘモグロビンの定量に用いられる種々
の方法は、異なる基準範囲値を有する。
もう一つの問題は、幾つかの方法においては高濃度の
グリコースがグリコシル化分画の定量を妨害することで
ある。
ヘモグロビンの前記グリコシル化分画（グルコースが
ヘモグロビンに共有結合している）に加えて、別のグリ
コシル化分画（グルコースがもっとゆるく結合してい
る）がある。これらのグリコシル化ヘモグロビンは、赤
血球の洗浄または炭水化物を含まない溶液中での赤血球
のインキュベーションにより、あるいはグリコシル化ヘ
モグロビンをpH5に曝すことにより、その形態が逆転し
うるので、しばしば「不安定な」グリコヘモグロビンと
呼ばれる（Bisse,Berger ＆ Fluckinger,Diabetes31:63
0−633,1982）。しかしグリコシル化ヘモグロビンとで
形成されたボロン酸エステルの幾何学的構造は、不安定
な予備グリコシル化形態ではなく、非可逆的にグリコシ
ル化された形態で主に得られる。
アッセイの別の態様に関しては、固相上への抗体の固
定化が、タンパク質および細胞のイムノアッセイ技術お
よびイムノ精製に一般に用いられる。抗体はホモジニア
スイムアッセイに用いることもできる。すなわちこの場
合は抗原と抗体の両者が溶液中に存在しており、抗原／
抗体反応を直接に（例えばネフェロメトリック法または
比濁法により）、あるいは間接的に（蛍光または酵素の
活性化もしくは阻害により）測定することができる。グ
リコシル化ヘモグロビンに対して特異的なモノクロナー
ルおよびポリクロナール抗体を用いる多くの試みがなさ
れたが、限られた成功しか得られていない。これは主と
して、グリコシル化ヘモグロビンの炭水化物基の大部分
がモノクロナール抗体との結合に容易に利用できない化
学的形態で存在するという事実のためである。したがっ
て、このような結合を得るために、例えばポリスチレン
表面への吸着（Engbaeck F.＆ al:Clinical Chemistry3
5:93−97,1989）、または化学的変性（Knowles ＆ al:
米国特許第4,658,022号明細書、1987）によるグリコシ
ル化ヘモグロビンの変性がしばしば必要である。
Burnett J.B.＆ al（Biochemical and Biophysical R
esearch Communication,vol.96,p.157−162,1980）は、
蛍光性ボロン酸分子であるＮ−（５−ジメチルアミノ−
１−ナフタリンスルホニル）−３−アミノベンゼンボロ
ン酸を合成し、細胞の蛍光顕微鏡法によって、この化合
物が細胞膜に結合することを示した。
Schleicherはドイツ特許出願DE3720736号明細書、198
9年１月５日公告に、サンプル中に存在する総グリコシ
ル化タンパク質を定量するための、ボロン酸との蛍光性
および着色したジアゾ接合体を記載している。Schleich
er法は、サンプル中に存在する総糖タンパク質を測定す
るための下記の三つの原理の一つに基づいている。
1.存在する糖タンパク質のグリコシル化部分に結合した
ときの、ボロン酸接合体の吸収極大の移動、あるいは 2.蛍光性ボロン酸接合体が、存在する総糖タンパク質の
グリコシル化部分に結合したときの蛍光の極性変化、あ
るいは 3.例えば活性炭を用いて過剰の未結合ボロン酸接合体を
除去した後の、着色したまたは蛍光性ボロン酸接合体量
の測定。
しかし、Schleicher（同上）によって記載されたどの
方法も、他の糖タンパク質の混合物中における特定糖タ
ンパク質の定量に用いることができず、特に患者からの
溶血サンプル中のグリコシル化ヘモグロビンの特異的測
定には用いることができない。さらにSchleicherにより
記載された試薬は比較的低い吸収係数を有し、それらの
吸収極大はヘモグロビンの吸収極大と接近しており、た
とえ純粋な形態で存在していたとしても、グリコシル化
ヘモグロビンの検出を困難または不可能にする。実際、
Schleicherは彼の方法をグリコシル化ヘモグロビンの分
析に使用することについては言及しておらず、その代わ
りにヒト血清から抽出された総グリコシル化タンパク質
およびグリコシル化アルブミンの分析について述べてい
る。 糖タンパク質と反応するレクチンも研究されてき
たが、グリコシル化ヘモグロビンと特異的に反応し、か
つグリコシル化ヘモグロビンの定量に有用であるレクチ
ンは、これまで同定されていない。
ボロン酸誘導体を用いてグリコシル化分画を標識する
こと、および固定化されたヘモグロビン−結合タンパク
質を用いてサンプルからヘモグロビンを分離することに
基づくグリコシル化ヘモグロビンのアッセイは、Wagner
により米国特許US−Ａ−4861728号明細書（本出願の最
先の優先権主張日より後で発行された）に記載されてい
る。フランス特許FR−Ａ−246447号明細書（Amicon）に
は、サンプル中のグリコシル化ヘモグロビンの定量に適
する糖タンパク質アッセイが記載されており、この場合
には、サンプルからグリコシル化分画を分離するのにボ
ロン酸を基礎とする試薬が用いられ、次いでこの分画を
定量する。
したがって、使用するのに特異的で迅速で簡単であ
り、かつ臨床検査室での使用に容易に適合されるグリコ
シル化ヘモグロビンアッセイの改良法に対する要求があ
る。
本発明者らは、サンプルからのグリコシル化および非
グリコシル化ヘモグロビン分画を分離することと、グリ
コシル化分画だけを検出するボロン酸誘導体の特異的な
炭水化物認識特性とを組合わせることにより、有効かつ
特異的なアッセイを達成できることを見出した。
したがって、一つの態様からみて、本発明によれば、 （ａ）所望によりサンプルを溶血して細胞結合ヘモグロ
ビンを遊離させる工程、 （ｂ）該サンプルまたは下記工程（ｃ）による該サンプ
ルから回収されたヘモグロビンを、シグナル形成ラベル
に結合した１個または数個のジヒドロキシボルニル基ま
たはその塩の接合体からなるシグナル形成分子と接触さ
せる工程、 （ｃ）グリコシル化および非グリコシル化ヘモグロビン
およびそれに結合した分子を、サンプルまたは前記工程
（ｂ）の反応混合物から分離する工程、および （ｄ）分離されたヘモグロビンに結合したシグナル形成
分子、および／または非−ヘモグロビン結合シグナル形
成分子を評価する工程 を包含することを特徴とする、サンプル中のグリコシル
化ヘモグロビンの評価方法が提供される。
本発明の方法を実施するに際しては、サンプル中のグ
リコシル化ヘモグロビン濃度を測定するほかに、存在す
るグリコシル化および非グリコシル化ヘモグロビン濃度
の評価を得ること、およびグリコシル化ヘモグロビンと
総ヘモグロビンとの比率を計算することが望ましいこと
もある。
ヘモグロビン分離工程では、サンプル中に存在するヘモ
グロビン（グリコシル化および非グリコシル化）の総量
の分離を必要としない。本方法を適切に較正する限り、
分離すべきグリコシル化および非グリコシル化分画の両
者の割合だけで充分である。このような較正は、臨床検
査室アッセイにおいて日常的である。
本明細書において用いられるように、「評価（assess
ing）」の用語は、サンプル中のグリコシル化ヘモグロ
ビン量または総ヘモグロビン量についての絶対値を得る
意味で、また、例えば総ヘモグロビン濃度に対するグリ
コシル化ヘモグロビン濃度の指数、比率、パーセントま
たは同様の指標を得る意味での両方の定量を含むことを
意図している。
本発明の新規方法では、非グリコシル化ヘモグロビン
分画からのグリコシル化分画の分離が回避され、その代
わりに、サンプルからグリコシル化および非グリコシル
化ヘモグロビンの両者を分離することに基づいているこ
とが認められる。したがって、シグナル形成ボロン酸誘
導体を固定化する必要がない。なぜならばこれらの誘導
体は分離システムの一部として用いられるのではないか
らであり、実際、固定化しないことが好ましい。
本発明の方法は、健康な個体または真正糖尿病患者も
しくは真正糖尿病擬似患者の双方からの血液、血液溶血
物または血液抽出物のサンプル中のグリコシル化ヘモグ
ロビン量を評価するために用いることができる。本方法
は、血液もしくは溶血物、または他のグリコシル化タン
パク質および／または糖タンパク質および／または炭水
化物を含有する他の混合物中のヘモグロビンと、グリコ
シル化ヘモグロビンとを評価するために特に有用であ
る。サンプルは、分析の前は乾燥、液状または凍結の形
態にあってよい。本発明方法により分析するための溶血
物は、例えば種々の試薬を用いて溶血し、グリコシル化
ヘモグロビンの炭水化物部分に結合反応を受けさせるこ
とにより調製することができる。この処理は、本方法の
実施に必要な他の試薬を使用する前またはこの使用と組
合せて行うことができる。所望により、妨害を減少させ
るために、例えばグリコースオキシダーゼまたは６より
低いpHを有する緩衝液を用いてサンプルを処理し、存在
する遊離グリコースおよび／または不安定な糖タンパク
質の量を減少させることができる。
本発明の方法において、シグナル形成分子または接合
体とヘモグロビンとの反応は、ヘモグロビンをサンプル
から分離する前でも後でも行うことができる。選ばれる
順序は、本方法の実施に用いるべき化学的装置または器
具、およびさらに実際的であると認められるものによ
る。
本発明の好ましい一態様においては、シグナル形成分
子の結合およびヘモグロビンの単離は、均質溶液中で同
時に行われ、この溶液からヘモグロビンが沈澱し、遠心
分離またはろ過により単離される。しかし反応および分
離の条件は、グリコシル基一ボロン酸の会合定数の範囲
内で選ぶ必要があり、これは比較的低い（103-105mo
1-1.1）。
該シグナル形成分子から得られるシグナルの強度か
ら、ヘモグロビンに結合したシグナル形成分子またはヘ
モグロビンから分離されたシグナル形成分子の濃度を測
定することができる。先に述べたように、グリコシル化
ヘモグロビンの定量についての「絶対的」基準はまだな
い。しかし所望により、従来技術の方法により測定され
た既知濃度のグリコシル化ヘモグロビンを含有する標準
溶液を用いて、この新規方法を従来技術の方法に対して
較正または補正することができる。
シグナル形成分子または接合体は、有利には、シグナ
ル形成ラベルに直接に結合しているか、アミンまたはア
ミド結合、スペース部分、あるいはこの技術分野で公知
の任意の種類の化学結合により結合しているフェニルボ
ロン酸基を含有し、これらの結合または部分は、ジヒド
ロキシボルニル基をヘモグロビンのグリコシル部分のシ
ス−ジオール基と自由に反応するようにしておくもので
ある。ボロン酸基のどのようなpKa値が望ましいかに応
じて、フェニル環は、例えばニトロ基、ホルミル基、ア
ルコキシ基により、あるいはpKa値に影響を及ぼすがグ
リコシル化ヘモグロビンのシス−ジオール基との結合を
立体的に妨害しない他の置換基によりさらに置換されて
いてもよい。
本発明のシグナル形成分子の合成に用いられるボロン
酸基は、有利には、アミノフェニル基例えばｍ−アミノ
フェニル基とボロン酸基から合成され、該シグナル形成
分子または接合体のラベルまたはシグナル形成部分との
結合は、典型的には、ジアゾニウムイオン形成、シラン
化により、あるいはカップリング剤例えばグルタルジア
ルデヒド類、カルボジイミド類、ハロゲン化シアン、ス
クシンイミド類または一般の化学文献に教示された他の
カップリング剤を用いて得ることができる。シグナル形
成ラベルは、ボロン酸基がグリコシル化ヘモグロビン分
析物のシス−ジオールと自由に反応するようにしておく
方法で結合され、そしてアミンまたはジヒドロキシボル
ニル基上の他の反応性部分、例えばジメチルアミノアゾ
−ベンゼンイソチオシアネートおよびジメチルアミノ−
ナフタリンスルホニルクロリドと反応性にさせるため
に、予め「活性化」することができる。本発明のシグナ
ル形成分子は、水溶性を増大するためにさらに変性され
ていてもよい。
本発明により用いられるシグナル形成ジヒドロキシボ
ルニル試薬は、好ましくは固定化されていない形態で存
在しており、そして化学的または物理的定量の目的に使
用できるシグナルを直接または間接的に形成しうる化学
構造（ラベル）に直接または間接的に結合したボロン酸
基からなる。シグナル形成ラベルは、酵素、好ましくは
炭水化物のシス−ジオール部分を有しないか、またはシ
ス−ジオール基を有する分画を取り除いた酵素からなっ
ていてよい。あるいはシグナル形成ラベルは、一部また
は全体が着色部分または蛍光性部分により構成されてい
てもよい。ラベルとしての使用に好適な広範囲の着色化
合物、蛍光性化合物または色素化合物がこの技術分野で
知られており、使用できる。好適な例には次のものが含
まれる。アントラキノン類、アゾ染料、アジン染料例え
ばオキサジン類およびチアジン類、トリアジン類、天然
に存在する色素例えばポルフィリン類、フィコエリスリ
ン類およびフィコシアニン類を含むフィコビリタンパク
質、クロロフィル類、およびこれらの類似化合物または
誘導体、カロチノイド類、アクリニジン類、フルオレセ
ン類およびローダミン類を含むキサンチン類、インジゴ
染料、チオキサンチン類、クマリン類、ジ−およびトリ
−アリ−ルメチン類を含むポリメチン類、およびこれら
の誘導体、およびフタロシアニン類および金属フタロシ
アニン類。これらの化合物は、所望により、シグナル形
成ラベルとボロン酸基との間に介在するスペース部分に
より結合され、分析すべき糖タンパク質のシス−ジオー
ルと自由に反応するようにしておく。
同様に、本発明に用いられる試薬のシグナル形成ラベ
ル部分としては、広範囲の放射性化合物を使用すること
ができ、中でも特に沃素−125で標識された化合物が挙
げられる。これらの標識化合物は、有利には、フェニル
ボロン酸の炭素環をＩ−125で標識することにより、ま
たはアミノフェニルボロン酸をＩ−125標識用試薬、例
えばよく知られたBolton−Hunter試薬に接合させること
により得ることができる。このような放射性標識技術
は、BoltonによりBiochem.J.133:529−539,1973で概説
されている。本発明の方法を実施するに際しては、比較
的高い試薬濃度が必要であり、したがって本発明の多く
の態様においては、Ｉ−125標識接合体を非放射性ホウ
酸または同一または異なる構造のボロン酸類と混合し、
アッセイ用試薬の適切な放射性レベルを得ることができ
る。
あるいは、公知方法でアッセイできる化学ルミネッセ
ンス性シグナルを生成しうる天然または合成化合物にボ
ロン酸基を接合させることができる（Cormier,M.J.et a
l;Chemiluminescence and Bioluminescence,Plenum Pre
ss,New York1973）。好適な化学ルミネッセンス性化合
物には、蓚酸エステル、1,2−ジオキシエタン、ルミノ
ールまたはこれらの誘導体が含まれるが、これらに限定
されるものではない。もし適当であるならば、過酸化水
素、酵素、例えばルシフェラーゼまたは他の化学物質
を、用いられるシグナル生成分子から化学ルミネッセン
ス性シグナルを生成させるのに使用することができる。
強アニオン性のシグナル形成接合体は、サンプル中に
存在することのあるヒト血清アルブミン（HSA）のよう
な血清タンパク質と結合する傾向を有するので、本発明
方法への使用には好ましくない。使用できる特に好適な
例は、フルオレセンイソチオシアネートとアミノフェニ
ルボロン酸との反応により得られる接合体であり、この
反応の結果、遊離カルボン酸部分を有する接合体が生じ
る。他の好適な接合体には次のものが含まれる。例えば
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミド（EDC）によりフルオレセンに接合された
アミノフェニルボロン酸、ブロックされたカルボキシル
基を有するフルオレセンイソチオシアネート、またはカ
ルボン酸部分が除去されている場合にはアミノフェニル
ボロン酸に接合されたフルオレセンイソチオシアネー
ト。例えばカルボジイミドによりアミノフェニルボロン
酸に接合されたローダミンＢも使用できるが、この接合
体は、本発明方法によるアッセイにとって重要な大部分
の溶液に対して比較的劣った溶解度を有する。特に好ま
しいシグナル形成分子は、Ｎ−（レゾルフィン−４−カ
ルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（以下、resosと略記する）
であり、本発明者はこれをアミノフェニルボロン酸に接
合させ、そしてこれは優れた溶解特性およびタンパク質
との低い非特異的結合を提示することを示した。この低
いタンパク質結合は、アニオン性基の数が、接合体例え
ばFITC−アミノフェニルボロン酸接合体と較べて少ない
ためかもしれない。
ボロン酸基 −Ｂ−(OH)2 は、その電気的中性の形ではしばしばジヒドロキシボル
ニル基と呼ばれ、ヒドロキシルイオンの結合によりアニ
オン −Ｂ−(OH)3− を形成し、それ自体で塩を形成できる。本発明方法に用
いられ、また本発明により提供される試薬は、試薬組成
物のpHおよび電解質含有量に応じて、ボロン酸のこれら
の形態の１種または数種を有することができる。ボロン
酸がグリコシル化ヘモグロビンのシス−ジオール基と結
合するのは、アニオン形である。しかしボロン酸基のア
ニオン強度は充分に低いので、タンパク質例えばHSAと
の結合の際に問題を起こすことがない。
本発明方法においては、ボロン酸との高分子量シグナ
ル形成接合体の使用は、大部分のグリコシル化ヘモグロ
ビンのグリコシル化部分の利用性が制限されるので、避
けることが好ましい。すなわち、血液中のグリコシル化
ヘモグロビンの実質的分画は、ベータ鎖のＮ−末端バリ
ンアミノ酸においてグリコシル化されており、前記の米
国特許第4658022号明細書に記載されているように、水
溶性高分子量分子には容易に利用されない。この特許
は、グリコシル化基に抗体結合反応を受けさせる極めて
重要な変性の使用を教えている。
本発明方法の一態様によれば、ヘモグロビンに対して
特異的な固定化結合タンパク質、例えばフィルター、
膜、ビーズ、ゲル、マイクロタイターストリップ、チュ
ーブまたはプレートのような表面に、疏水性相互作用に
よるか、あるいは直接の化学結合または第二抗体による
化学的結合のいずれかにより結合させた、抗体またはハ
プトグロビンなどを用いてサンプルから総ヘモグロビン
を分離することができる。しかしこれは、ボロン酸と炭
水化物のシス−ジオール基との間の会合定数が、103-10
5mo1-1.1の範囲にあるので（Evans ＆ al:Anal.Biovhe
m,95:383,1979.Zittle C,Advan.Enzym.12:493,1951）、
それゆえ結合タンパク質の有効濃度は固定化されたとき
に比較的低く、ボロン酸とシス−ジオール基との結合も
対応して減少されるので、好ましくない。したがって、
補償のために高結合能が必要であり、これを達成するの
は技術上の観点から困難である。これはまた、結合能の
低い固相、例えばポリスチレン表面の使用を制限する。
しかし固相結合能は、ゲル、マイクロビーズまたは単位
体積当り大きな表面積を有する他のよく知られた固相の
使用により増大させることができるが、このような固相
は日常的な臨床使用にはあまり実際的でない。固定化さ
れたヘモグロビン特異的結合タンパク質をヘモグロビン
の分離に使用する場合には、シグナル形成分子をアルカ
リ性ホスファターゼ酵素ラベル以外のもので標識するこ
とが好ましい。
本発明のさらに好ましい態様において、ヘモグロビン
（およびそれに結合したシグナル形成分子）の分離は、
例えば適切な沈澱剤を所望によりクロマトグラフィー、
遠心分離またはろ過系と組合せて用いることにより、均
質溶液から総ヘモグロビンを選択的に沈澱させることに
より達成される。したがってヘモグロビンの分離は、固
定化されていない特異的ヘモグロビン結合タンパク質、
例えば特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗
体、ヒトヘモグロビンに結合する任意の種からのハプト
グロビン、またはヘモグロビンに結合して沈澱を形成す
るかまたは溶液からヘモグロビンを除去する任意の他の
タンパク質を用いて行うことができる。したがって、異
なるエピトープと反応するモノクローナル抗体またはポ
リクローナル抗体を用いて、ヘモグロビンとの沈澱を形
成することができる。第二抗体を用いて、またはハプト
グロビンと反応する抗体と組合せたハプトグロビンを用
いて、沈澱を行うこともできる。シス−ジオール部分を
有しない抗体、シス−ジオール含有部分に関して枯渇さ
れた抗体、またはそれらの免疫反応性フラグメントを好
ましく用いることができる。
しかしこの方法の欠点は、シグナル形成部分を含有す
るボロン酸とグリコシル化ヘモグロビンのグリコシル化
基との会合定数が、103-105mo1-1.1のオーダーでしかな
いので、比較的高い濃度の反応関与体が必要であり、そ
の結果、試験当りの抗体またはハプトグロビンの消費が
比較的多くなることである。
本発明の好ましい態様において、均質溶液からの特異
的ヘモグロビン沈澱は、金属カチオンまたは有機溶剤を
用いて達成される。これは、極めて高濃度のヘモグロビ
ンを使用でき、例えば遠心分離またはろ過により沈澱を
容易に分離でき、そして試薬が安価で有効であるという
利点を有する。
このような一態様は、ヘモグロビンが極めて水溶性の
タンパク質であるという事実を使用するものであり、本
発明者は、ある種の有機溶剤、例えば下記の溶剤の使用
により、ヘモグロビンを特異的またはほぼ特異的に沈澱
させることができた。この溶剤の例は、アルコール類例
えばエタノールおよび／またはブタノール、ケトン類例
えばアセトン、エーテル類例えばジオキサンおよびテト
ラヒドロフラン等の環状エーテル類、アミド溶剤例えば
ジメチルホルムアミド、スルホキシド溶剤例えばジメチ
ルスルホキシド、炭化水素溶剤例えばクロロホルムであ
る。約6.5mgヘモグロビンおよび1.5mgHSA/mlとなるよう
に希釈した全血液（エタノール中の50％ブタノール（v/
v）の添加によりブタノールの最終濃度を９％（v/v）に
する）を沈澱させたときに、ヘモグロビンの94％が沈澱
したが、HSAは１％しか沈澱しなかった。このような沈
澱は、シス−ジオール基に結合したボロン酸の損失なし
に得られた。
ヘモグロビンの特異的沈澱は、タンパク質に結合して
凝集させる金属カチオンを使用して行うこともできる。
好適なカチオンには、亜鉛、あまり好ましくないがニッ
ケル、コバルトおよびカドミウムが含まれる。銅キレー
トまたは硫酸銅を用いるヘモグロビンの沈澱は、Van Da
m et alによりBiotechnical.Appl.Biochem.,11（５）,4
92−502（1989）に記載されているが、ヘモグロビンア
ッセイへの応用については全く示唆されていない。この
手段で沈澱されたどのヘモグロビンも、可溶化錯生成剤
の添加により容易に再溶解できるという重要な利点を有
する。亜鉛イオンを用いると、全血溶血物からヘモグロ
ビンを実質的に特異的に沈澱させることができる。これ
は予期できなかった観察である。一例として、約6.5mg
ヘモグロビンおよび1.5mgHSA/mlの存在下に2.5−4mMの
亜鉛イオン濃度を用いることにより、特異的またはほぼ
特異的なヘモグロビン沈澱が得られる。しかし4mMより
高い亜鉛イオン濃度は、HSAの実質的な共沈を引き起こ
す。これは下記に示す結果により説明される。
Zn濃度（Mm） 沈澱したHb％ 沈澱したHSA％ 2.6 87 6 3.9 87 15 6.5 91 92 しかしイオン濃度は、用いられるシグナル形成ボロン
酸誘導体を妨害しないように注意深く調整すべきであ
る。望ましい場合には、シグナル形成ボロン酸接合体と
反応させる前に過剰のカチオンを除去するために、沈澱
したヘモグロビンを所望により洗浄またはろ過すること
ができる。この反応順序は、比較的アニオン性のシグナ
ル形成ボロン酸接合体を用いる場合に特に好ましい。な
ぜならば過剰の亜鉛イオンとアニオン性接合体との直接
の結合が望まれない妨害を生じることがあるからであ
る。亜鉛のほかに、沈澱反応に用いられる緩衝液中で他
の金属カチオンがそれ自体で沈澱せず、亜鉛イオンと同
じ特異的ヘモグロビン沈澱能を有するならば、これら他
の金属カチオンを使用することもできる。
金属イオンが加水分解または試験溶液中の他の試薬と
の他の反応に関与する可能性があるため、金属カチオン
が可溶性のままであり、ヘモグロビンの沈澱に利用でき
ることを保証するように沈澱を行う必要がある。
本明細書に記載したシグナル形成接合体の幾つかは、
金属カチオンに電子対を供与でき、それゆえに錯生成剤
として作用する基を含有する。リガンドー金属錯体を形
成するこの能力は、反応を制御するために使用すること
ができ、金属イオンを溶液中に保持し、金属とボロン酸
シグナル形成誘導体との錯体の形成を防ぎ、そして金属
イオンの利用可能性および充分高い濃度を保証し、試験
溶液中のヘモグロビンの望ましい沈澱を与える。
リガンド濃度および種々の金属錯体の安定定数の両者
を考慮する必要があるので、不溶性金属錯体（以下、Me
−錯体という）の形成を防止するために適切な緩衝塩を
用いることができる。
したがって弱い単座配位Me−錯体を形成する緩衝塩が
好ましく、このような緩衝塩の例は、亜鉛と組合せた酢
酸アンモニウムであり、可溶性のZn（Ac）およびZn（NH
4）錯体を形成する。より強い錯生成剤、例えば多座キ
レート化配位子を緩衝液に添加することにより、前記の
全ての反応を試験溶液中に制御することができる。錯生
成剤は、種々の錯体において必要なモル比が得られるよ
うに、そしてすべての反応関与体が最適に働くことを保
証するために他の添加物と調和するように添加される。
さらに、錯生成剤は、使用すべき特別の金属カチオンを
考慮して、もしかして望ましくない全ての副反応、例え
ば金属イオンの強すぎる錯生成を防止することを保証す
るように選択すべきである。
キレート−Me−錯体の安定定数は、試験溶液中のシグ
ナル−ボロン酸接合体などの他の可能性のある錯生成剤
と競争するために充分高くなければならないが、沈澱剤
としての金属カチオンの利用可能性が減少し、あるいは
阻害されるほど強くてはいけない。
多くのキレート化剤を使用することができ、これには
エチレンー、プロピレンーまたはブチレンージアミンま
たはこれらの類似化合物、グリシン、アスパルテート、
ニトリロアセテート、ヒスチジンおよびピコリネートが
含まれる。幾つかの他の天然または合成キレート化剤、
例えば炭水化物、２個以上の配位基を有する有機酸、ア
ミノ酸、ペプチド、フェノール性化合物等も使用できる
が、これらのあるもの、すなわちサリチレート、オギザ
レート、炭水化物例えばソルビトールおよびタルタレー
トは、ボロン酸と錯体を形成することができ、したがっ
てシグナル−ボロン酸接合体との結合に関しグリコシル
化ヘモグロビンと競合するため、好ましくない。
多座キレート化配位子、例えばEDTA（エチレンジアミ
ンテトラ酢酸）、CDTA（トランス−1,2−ジアミノシク
ロヘキサン−N,N,N′,N′−テトラ酢酸）、EGTA（エチ
レングリコール−o,o′−ビス（２−アミノ−エチル）
−N,N,N′,N′−テトラ酢酸）、DTPA（ジエチレントリ
アミン−ペンタ酢酸）等も使用できるが、金属イオンと
の錯生成能が強く、ヘモグロビンの沈澱を著しく減少さ
せるので、事情によってはあまり好ましくない。亜鉛イ
オンおよびグリシンを含有する酢酸アンモニウム緩衝液
は、好ましい組合せの一例である。
本発明の種々の態様においては異なる錯生成剤が好ま
しいことがある。錯生成剤、例えばEDTAおよびDTPAは好
都合に使用できるが、ヘモグロビンの沈澱に用いられる
金属カチオンと組合せる場合には、その濃度を注意深く
調整すべきである。クエン酸および蓚酸は、ボロン酸基
と相互作用するためあまり好ましくない。ヘパリンおよ
びフルオリドイオンは、使用できる他の例である。
有機溶剤または金属カチオンの前記の使用により、均
質溶液から沈澱反応により得られる沈澱は、遠心分離ま
たはろ過あるいはこの技術分野でよく知られた他の技術
により、全体としてまたは部分的に分離することができ
る。
ヘモグロビンを分離するためには、フィルター膜また
はTLC−系も、例えばディップスティック（dipstick）
または多層フィルムホーマットとして、所望によりヘモ
グロビンを結合するためにその上に固定化された抗体も
しくはその免疫反応性フラグメントまたはハプトグロビ
ンとともに用いることができる。
一つの好ましい方法は、遠心分離によるヘモグロビン
を分離し、次いで上澄液から沈澱を分離することであ
る。その代わりに、ろ過を好都合に使用することがで
き、これはフィルターを通してフィルター表面に対し垂
直に、あるいはフィルター内で接線方向にまたは半径方
向に一次元的または二次元的分離法で行うことができ
る。
薄層クロマトグラフィー法も使用できる。この場合に
は例えば次のように操作する。サンプルを好適なクロマ
トグラフィー用媒体、例えばテストストリップまたはゲ
ルに塗布し、そして試薬および洗浄液を例えばサンプル
を塗布したと同じ場所に塗布するかまたは溶離する。
さらに他の態様においては、フィルターまたは他の固
相クロマトグラフィー用媒体の上またはその中で、ヘモ
グロビンを溶液から直接に沈澱させることができ、この
場合、沈澱の形成に続いてまたはこれと同時に、固相の
上またはその中で沈澱が析出しうる。沈澱工程の前、同
時または後に、試薬を多孔性固相媒体に塗布することが
できる。したがって例えば、試薬、例えば沈澱剤、シグ
ナル形成ボロン酸試薬、溶血剤または錯生成剤を、任意
の好ましい組合せにおいて、固相媒体の中または上に、
好ましくは乾燥状態で担持させることができる。このよ
うな試薬を担持した固相クロマトグラフィー用媒体は、
本発明の他の態様を形成する。固相媒体を所望による洗
浄することができ、あるいは沈澱領域を通して溶離液を
溶離させることができる。
全血液サンプル中の赤血球を溶血し、そしてグリコシ
ル化ヘモグロビンとシグナル形成ボロン酸接合体との良
好な化学的接触を保証するために、この技術分野で多く
の試薬および方法が知られており、使用できる。これに
は、低張性溶血、界面活性剤、例えば非イオン性ポリエ
チレングリコールエステルまたはポリオキシエチレンソ
ルビトールエステル誘導体、例えば“Triton"および“T
ween"、コール酢塩（エステル）もしくはドデシル硫酸
ナトリウム、グアニジン、加熱、超音波処理の使用、あ
るいはこれらの任意の組合せが含まれる。
シグナル形成ボロン酸接合体は、溶血処理工程の後で
またはこれと同時に、血液溶血サンプルまたはこのよう
なサンプルから単離されたヘモグロビンと、アッセイ用
緩衝液中で接触または混合することができる。
多くのアッセイ用緩衝液、中でも特に反応混合物のpH
を好適なpHに保持しうるリン酸塩緩衝液および他の緩衝
液を用いることができる。アッセイの好ましいpH範囲は
7.5−10.0であるが、望ましいpHは用いられる添加物、
緩衝塩および用いられるボロン酸誘導体のpKa値に左右
される。アミンを含有する緩衝剤がジヒドロキシボルニ
ル−シスジオール相互作用を強めるか、またはホウ酸塩
の見掛けpKa値を低下させるのに役立ちうるという証拠
がある。この事実による、セリン、グリシン、Hepes
（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エ
タンスルホン酸）、酢酸アンモニウム、モルホリンおよ
びタウリンのような緩衝剤が好ましい。ジヒドロキシボ
ルニル基−シス−ジオール基間の相互作用をさらに促進
するために、２価のカチオン、界面活性剤およびカオト
ロフィク剤のような添加物を用いて、電荷反発作用を減
少させ、標的分子を安定化し、疎水性相互作用を制限
し、そしてグリコシル化ヘモグロビン中のジオールの利
用性を高めることができる。しかしトリスおよびエタノ
ールアミンのようなある種の緩衝剤は、これらの緩衝化
合物がホウ酸塩を錯化させ、ジオールが結合するのを妨
げるという事実があるために避けるべきである。リン酸
塩−亜鉛のようなある種の緩衝剤／添加物の組合せもZn
3(PO4)2のような不溶性化合物を形成する可能性がある
ため好ましくない。
本発明の方法は、４−37℃の温度範囲内で、得られる
結果に有意な変化を生じることなしに実施することがで
きる。
本発明の方法は、該シグナル形成分子を評価または定
量すること（すなはちシグナル読取り工程）、および所
望によりグリコシル化ヘモグロビンおよび非グリコシル
化ヘモグロビンの両形態で存在する総ヘモグロビンをも
評価または定量することを伴う。本発明方法のどの態様
を用いるかに応じて、ヘモグロビン結合シグナル形成分
子または残った非ヘモグロビン結合シグナル形成分子か
らシグナルを読取ることができる。予め単離されたヘモ
グロビンに結合したシグナル形成分子を評価することが
最も実際的である。
ヘモグロビンに結合しているかまたはこれから分離さ
れたシグナル形成分子の評価は、シグナル形成ラベルの
化学的性質に応じて、酵素活性、蛍光、放射線または光
学的濃度（吸光度）を測定するために普通に用いられる
従来の化学装置により達成される。固相表面上の色また
は蛍光は、臨床化学において一般に用いられる反射率測
定法により容易に測定することができる。ディップステ
ィックもしくはフィルターフォーマットまたは他の実用
的な固相フォーマットにおいて、ヘモグロビンおよび／
または蛍光性または着色したシグナル形成接合体をその
表面上で直接に評価することができる。あるいは沈澱ま
たは固定化したヘモグロビンおよび／またはシグナル形
成ボロン酸接合体を再溶解し、溶液中で測定することも
できる。
同様に、酵素活性を有するシグナル形成ボロン酸接合
体は、固定化あるいは溶解または再溶解された形態で、
この技術分野でよく知られた酵素分析技術により評価す
ることができる。したがって、よく知られた放射分析法
を用いて評価できる放射性ボロン酸接合体についても同
様である。
分離されたグリコシル化ヘモグロビンおよび非グリコ
シル化ヘモグロビンの両者の濃度は、分離工程の前また
は後の反応混合物中の関連する波長における吸収により
測定することができ、あるいは分離した分画中のヘモグ
ロビン含量を測定することができる。後者は、ヘモグロ
ビンを再溶解したのち吸光度を測定することにより、あ
るいは分離した分画を必要に応じて固相上で反射率測定
することにより得ることができる。ヘモグロビンの存在
下に蛍光性シグナル形成分子を定量しようとするなら
ば、消光および発光波長はヘモグロビンの吸収波長の外
側にあることが好ましい。同様に、着色シグナル形成分
子を用いる場合には、第１図〔ヘモグロビン（１）およ
びRESOS−アミノフェニルボロン酸接合体とヘモグロビ
ンとの混合物（２）の吸収スペクトルを示す〕に示され
るように、ヘモグロビンの吸収波長の外側の波長が好ま
しい。しかしヘモグロビンからの部分的干渉は容認で
き、２種以上の波長における測定値に基づく計算によっ
て補正できる。
本発明の一つの態様において、ヘモグロビンおよび結
合したシグナル形成ボロン酸接合体は、マイクロビーズ
および／またはフィルターまたは他の固相上で単離さ
れ、次いでヘモグロビンおよびシグナル形成ボロン酸接
合体は、吸光測定または蛍光測定のいずれかによって、
反射率測定定量される。
本発明の他の態様においては、ボロン酸基またはその
塩と反応する他の幾つかの、大部分のまたはすべてのタ
ンパク質を除去した溶血物のサンプルまたはアルコート
が用いられる。例えば、サンプル中のグリコシル化ヘモ
グロビンを分析する前に血漿タンパク質を除去するため
に、溶血前に血赤球を洗浄することができる。あるい
は、全血液の溶血物をイオン交換固相セパレーターに曝
して、ヘモグロビンより低い等電点および／または高い
等電点を有するすべてのタンパク質を除去することもで
きる。この精製は、所望により本発明方法を実施するた
めの装置またはキットの一部であってよい。
本発明の特別の態様におては、競合化合物の存在また
は不在においてヘモグロビンと結合しているシグナル形
成分子または接合体の量が測定される。競合化合物は任
意のシス−ジオール含有分子、例えばソルビトールもし
くはマンニトール、またはシグナル形成活性を有しない
ボロン酸含有分子であってよい。
本発明の他の特別の態様においては、ヘモグロビンを
分離する前および後の反応混合物および／または分離さ
れた分画中に存在するシグナル形成分子の量が測定さ
れ、ヘモグロビンとの結合により除去されたシグナル形
成分子の分画を計算することが可能になる。
本発明は、比較的低い結合力（シス−ジオール部分と
ボロン酸基との間の会合定数103-105mo1.-1.1）に基づ
いているので、グリコシル化ヘモグロビンとシグナル形
成ボロン酸接合体との間の化学量論的結合は起こらな
い。さらに、本発明によれば、ヘモグロビンのすべての
グリコシル部分が、結合反応により容易に評価される方
法が提供され、したがって、従来法により通常得られる
グリコシル化ヘモグロビンの分画：総ヘモグロビンの比
率よりも高い結合したボロン酸接合体：ヘモグロビンの
比率が得られる。
わずかな程度ではあるが、血液中の遊離炭化水素はボ
ロン酸基に対して競合することがある。これらの効果は
過剰のシグナル形成ボロン酸接合体の使用により減少さ
れる。20倍モル過剰が有利であるが、本発明のどの態様
を用いるかに応じて、より高い割合およびより低い割合
も使用できる。もちろん、用いられる分離技術の有効性
に応じてバックグラウンドシグナルがあるだろう。極め
て有効な分離系を用いる場合には、より高い過剰を使用
できる。極めて高い反応関与体濃度を使用できない場合
には、既知濃度のグリコシル化ヘモグロビンを有する標
準を用いて、および／または会合定数について正確な知
識を用いて測定することにより、グリコシル化ヘモグロ
ビン濃度を計算すべきである。このような標準の使用
は、臨床検査室医学においては極めて一般的である。
また、本発明によれば、前記の方法を実施するための
試薬組成物が提供される。この試薬は、グリコシル化ヘ
モグロビンのグリコシル基と自由に反応する１個または
数個のボロン酸基を有し、かつシグナル形成ラベルと結
合した分子を含有し、このラベルは、前記のように酵素
活性を有するか、着色しているか、蛍光性であるか、化
学ルミネッセンス性であるか、または放射性であること
ができる。
本発明の他の態様によれば、 （ａ）シグナル形成ラベルに結合した１個または数個の
ジヒドロキシボルニル基またはその塩の接合体からなる
シグナル形成分子を含有する試薬と、 （ｂ）サンプルからヘモグロビンを分離するための手段
とを、所望により緩衝塩または緩衝液と組合せてなるこ
とを特徴とする分析試験用キットが提供される。
下記実施例および調製例は、本発明を限定することな
く説明するためにのみ提供される。
実施例 調製例 調製例１ 1.アミノフェニルボロン酸とのＮ−（レゾルフィン−４
−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル（RESOS）の接合体 溶液A:2mgのRESOSを、0.5mlのジメチルスルホキシド
に溶解した。
溶液B:m−アミノフェニルボロン酸の半硫酸塩を、pH
8.0の0.1M炭酸Na緩衝液に15mg/ml溶解した。pHを8.0に
調整した。
0.5mlの溶液Ａを、2mlの溶液Ｂに加えた。この混合物
を室温で12時間インキュベートした。精製は、HPLCで行
った。この接合体の構造を第２図に示す。
調製例２ 2.アミノフェニルボロン酸とのフルオレセンイソチオシ
アネート（FITC）の接合体 溶液A:3.9mgのFITCを、1mlのジメチルスルホキシドに
溶解した。
溶解B:m−アミノフェニルボロン酸の半硫酸塩を、pH
9.5の0.2M炭酸塩緩衝液に1.86mg/ml溶解した。
1mlの溶液Ａを、絶えず攪拌しながら10mlの溶液Ｂに
徐々に加えた。この混合物を室温で最低２時間反応さ
せ、FITC−アミノフェニルボロン酸接合体をHPLCで精製
した。この接合体の構造を第３図に示す。
調製例３ 3.沃素ー125で標識されたボロン酸接合体 A:pH7.5の50mMリン酸Na中のアミノフェニルボロン酸（A
PBA）10mg/mlを、DMSO中のBolton−Hunter（BH）試薬1
4.2mg/mlと反応させた。BHをAPBAに同容量部になるまで
徐々に加えた。この溶液を室温で12時間インキュベート
した。
B:反応生成物を、逆層カラム上で、0.1％トリフルオロ
酢酸（TFA）水溶液中のメタノール勾配により分離し
た。
C:単離されたBH−APBA反応生成物を、クロラミン−Ｔ法
により125I-NaIで標識した0.5mlのBH−APBA分画を、pH
7.5の0.25Mリン酸Na0.1mlに加え、pHを7.5に調整した。
新たに調製したpH7.5の0.25Mリン酸Na中のクロラミン−
Ｔ（10mg/ml）0.3mlのほかに、10μ１の125I-NaI（100
μCi）を加え、この混合物を１分間インキュベートし
た。
D:pH7.5の0.25Mリン酸Na中のジ亜硫酸Na（24mg/ml）0.3
mlを加えて反応を停止した。
E:標識されたBH−APBAを、0.1％TFAを含む水溶液中のメ
タノール勾配により逆層クロマトグラフィーにて単離し
た。
調製例４ 4.アルカリ性ホスファターゼとのボロン酸の接合体 フェニルボロン酸が固定化された寒天カラムを通過さ
せることにより、ボロン酸と反応する酵素分子を除去し
たアルカリ性ホスファターゼ10mgを、pH8.5の炭酸塩緩
衝液中の30倍モル過剰のビス−（スルホスクシンイミ
ド）スベレートと混合し、室温で120分間反応させ、次
いで100倍モル過剰のモノエタノールアミンを加えた。
その４時間後、酵素接合体をゲルクロマトグラフィーに
より精製した。
全血液溶血物からのほぼ特異的な ヘモグロビン沈澱を説明する例： 金属カチオン： 溶液A:最終濃度が6.4mgヘモグロビン/mlになるようにpH
8.0の50mM酢酸アンモニウムに希釈した全血液溶血物。
溶液B:10mMCu2+の濃度になるように水に溶解したCu（SO
4）。
溶液C:10mMZn2+の濃度になるように水に溶解したZn（Cl
2）。
調製例５ 40μｌの溶液Ｂを、200μｌの溶液Ａに加えた。この
混合物を室温で５分間インキュベートし、ヘモグロビン
沈澱を遠心分離により分離した。
調製例６ 40μｌの溶液Ｃを、200μｌの溶液Ａに加えた。この
混合物を室温で５分間インキュベートし、ヘモグロビン
沈澱を遠心分離により分離した。
本発明方法の実施例 実施例１ 下記の本方法のすべての実施例において、本方法を、
Jeppson,J.O.＆ al.:（Clinical Chemistory32/10,1867
−1872,1988による古典的なイオン交換クロマトグラフ
ィー（以下、「イオン交換」法と略記する）と比較し
た。
全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液、
すなわち0.05％Triton X−100とともに100mMHepesnを含
むpH9.0の溶液にて、ヘモグロビン約8mg/mlとなるよう
に希釈した。エタノール中の50％ブタノール（v/v）と
前記のFITC−アミノフェニルボロン酸接合体との混合物
を加え、最終ブタノール濃度を９％（v/v）に、接合体
濃度を1.6x10-4Mにした。沈澱が形成され、これを遠心
分離により上澄液から分離した。この沈澱を、５％のジ
メチルスルホキシドを含有する0.05M塩酸に再溶解し、
ヘモグロビン濃度を吸光光度法により測定し、そしてFI
TC−アミノフェニルボロン酸接合体濃度を蛍光測定によ
り検出した。既知濃度のヘモグロビンおよびグリコシル
化ヘモグロビンの標準溶液を用いて得られた較正曲線に
おいて内挿することにより、ヘモグロビンおよびFITC−
アミノフェニルボロン酸接合体の濃度を計算し、そして
総ヘモグロビンに対するグリコシル化ヘモグロビンのパ
ーセントを計算した。
前記の方法を実施することにより得られた結果を下記
に示す。
グリコシル化ヘモグロビン％ モル比 （イオン交換法） 接合体／ヘモグロビン 4.8 0.284 7.8 0.344 11.7 0.431 実施例２ 全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液中
に、ヘモグロビン約8mg/mlになるように希釈し、FITC−
アミノフェニルボロン酸接合体を加えて2x10-4Mの最終
濃度にした。サンプルを30分間インキュベートし、エタ
ノール中の50％ブタノール（v/v）を加え、最終ブタノ
ール濃度を９％（v/v）にした。沈澱が形成され、これ
を遠心分離により上澄液から分離した。この沈澱を、５
％のジメチルスルホキシドを含有する0.05M塩酸に再溶
解し、ヘモグロビンおよび接合体の濃度を実施例１に記
載のようにして測定した。
FITC−アミノフェニルボロン酸接合体の特異性を証明
するために、実施例２に記載のようにして本方法を実施
し、ただし、競合する0.1M濃度のソルビトールを加え
た。これは、接合体のヘモグロビンに対する低くくて非
特異的な結合を生じ、これらの結果は、下記のように、
グリコシル化ヘモグロビン含有量の高いサンプルと低い
サンプルとの間で差異を示さなかった。
ソルビトールを添加せずに得られた結果： グリコシル化ヘモグロビン％ モル比 （イオン交換法） 接合体／ヘモグロビン 4.4 0.259 7.1 0.340 11.4 0.473 ソルビトールを添加して得られた結果： グリコシル化ヘモグロビン％ モル比 （イオン交換法） 接合体／ヘモグロビン 4.4 0.078 7.1 0.066 11.4 0.083 実施例３ 実施例１に記載のようにして本方法を実施し、ただ
し、沈澱を遠心分離により分離する代わりに、沈澱した
サンプルをろ過により分離した。全血液のサンプルを溶
血し溶血アッセイ用緩衝液、すなわち0.05％Triton X−
100と100mM Hepesとを含有するpH9.0の溶液中に、ヘモ
グロビン約8mg/mlになるように希釈した。エタノール中
の50％ブタノール（v/v）とFITC−アミノフェニルボロ
ン酸接合体との混合物を加え、最終ブタノール濃度を９
％（v/v）に、接合体濃度を1.6x10-4Mにした。沈澱が形
成され、これをろ過により単離した後、単離されたヘモ
グロビンおよびFITC−アミノフェニルボロン酸接合体を
定量した。下記の結果が得られた。
グリコシル化ヘモグロビン％ モル比 （イオン交換法） 接合体／ヘモグロビン 5.2 0.160 11.7 0.226 実施例４ 全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液、
すなわち0.05％Triton X−100と100mM Hepesとを含有す
るpH9.0の溶液中に、ヘモグロビン約8mg/mlになるよう
に希釈した。エタノール中の50％ブタノール（v/v）と
前記のRESOS−アミノフェニルボロン酸接合体との混合
物を加え、最終ブタノール濃度を９％（v/v）に、接合
体濃度を1.6x10-4Mにした。沈澱が形成され、これを遠
心分離により上澄液から分離した。この沈澱を、５％の
ジメチルスルホキシドを含有する0.05M塩酸に再溶解
し、ヘモグロビンおよびRESOS−アミノフェニルボロン
酸接合体の濃度を吸収測定法により測定した。既知濃度
のヘモグロビンおよびグリコシル化ヘモグロビンの標準
溶液を用いて得られた較正曲線において内挿することに
より、ヘモグロビンおよびRESOS−アミノフェニルボロ
ン酸接合体の濃度を計算し、そしてグリコシル化ヘモグ
ロビンのパーセントを計算した本方法を前記のように実
施したときに、下記の結果が得られた。
グリコシル化ヘモグロビン％ モル比 （イオン交換法） 接合体／ヘモグロビン 4.9 0.212 11.2 0.294 実施例５ 実施例４に記載のようにして本方法を実施し、ただ
し、沈澱を遠心分離により分離する代わりに、沈澱した
サンプルをろ過により単離した。全血液のサンプルを溶
血し溶血アッセイ用緩衝液、すなわち0.05％Triton X−
100と100mM Hepesとを含有するpH9.0の溶液中に、ヘモ
グロビン約8mg/mlになるように希釈した。エタノール中
の50％ブタノール（v/v）とRESOS−アミノフェニルボロ
ン酸との混合物を加え、最終ブタノール濃度を９％（v/
v）に、接合体濃度を1.6x10-4Mにした。沈澱が形成さ
れ、これをろ過により単離した後、単離されたヘモグロ
ビンおよびRESOS−アミノフェニルボロン酸接合体を定
量した。
下記の結果が得られた。
グリコシル化ヘモグロビン％ モル比 （イオン交換法） 接合体／ヘモグロビン 4.9 0.195 13.0 0.367 実施例６ 全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液、
すなわち0.05％Triton X−100と0.25M酢酸アンモニウム
とを含有するpH9.0の溶液中に、ヘモグロビン約8mg/ml
になるように希釈した。この溶血ヘモグロビン溶液に、
30mMZnCl2および50mMグリシンの溶液中のRESOS−アミノ
フェニルボロン酸接合体1.6x10-4Mを加え、沈澱を形成
させた。この沈澱を遠心分離により上澄液から分離した
後、pH9.0の30mM EDTAを含有する0.25M酢酸アンモニウ
ム緩衝液に再溶解した。ヘモグロビンおよびRESOS−ア
ミノフェニルボロン酸接合体の濃度を、吸収分光光度法
により測定した。
結果は下記のとおりであった。
グリコシル化ヘモグロビン％ モル比 （イオン交換法） 接合体／ヘモグロビン 4.9 0.384 13.0 0.449 実施例７ 実施例６に記載のようにして本方法を実施し、ただ
し、沈澱したヘモグロビンをろ過により分離した後、ヘ
モグロビンおよびRESOS−アミノフェニルボロン酸接合
体を定量した。
実施例８ Hepes緩衝液中で溶血した血液を、沃素ー125で標識さ
れたボロン酸接合体に加えた（上記参照）。ヘモグロビ
ン濃度は8mg/mlであった。
30分間インキュベートした後、22μｌのエタノール：
ブタノール（1:1）を加え、沈澱したヘモグロビンを遠
心分離により分離した。
この沈澱をHCl/DMSO/水の添加により再溶解し、ヘモ
グロビン含有量および放射能を測定した。
放射能／ヘモグロビン比とグリコシル化ヘモグロビン
含有量との間に有意な相関関係があることが認められ
た。
実施例９ 全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液、
すなわち0.05％Triton X−100と100mM Hepesを含有する
pH9.0の溶液中に、ヘモグロビン約8mg/mlになるように
希釈した。RESOS−アミノフェニルボロン酸接合体を加
えて最終濃度を2x10-4Mとなし、CuSO4を加えて最終濃度
を2mMとなし、沈澱を形成させた。この沈澱を遠心分離
により上澄液から分離した。この沈澱を、５％のジメチ
ルスルホキシドを含有する0.05M塩酸に再溶解し、ヘモ
グロビンおよびRESOS−アミノフェニルボロン酸接合体
の濃度を実施例１に記載のようにして測定した。
結果は下記のとおりであった。
グリコシル化ヘモグロビン％ モル比 （イオン交換法） 接合体／ヘモグロビン 4.6 0.524 12.0 0.617 実施例10 全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液、
すなわち0.05％Triton X−100と0.25M酢酸アンモニウム
とを含有する溶液中に希釈した。FITC−アミノフェニル
ボロン酸接合体を加えて最終濃度を2x10-4Mにした。イ
ソプロパノールを加えて最終濃度を33％（v/v）とな
し、沈澱を形成させた。この沈澱を遠心分離により上澄
液から分離した。この沈澱を、５％のジメチルスルホキ
シドを含有する0.05M塩酸に再溶解し、ヘモグロビンお
よびFITC−アミノフェニルボロン酸接合体の濃度を実施
例１に記載のようにして測定した。
結果は下記のとおりであった。
グリコシル化ヘモグロビン％ モル比 （イオン交換法） 接合体／ヘモグロビン 4.8 0.260 12.5 0.398 実施例11 実施例10に記載のようにして本方法を実施し、ただ
し、テトラヒドロフランを添加して最終濃度を50％（v/
v）にすることにより沈澱を形成させた。
結果は下記のとおりであった。
グリコシル化ヘモグロビン％ モル比 （イオン交換法） 接合体／ヘモグロビン 4.8 0.255 12.5 0.429 実施例12 実施例10に記載のようにして本方法を実施し、ただ
し、N,N−ジメチルホルムアミドを添加して最終濃度を1
5％（v/v）にすることにより沈澱を形成させた。
結果は下記のとおりであった。
グリコシル化ヘモグロビン％ モル比 （イオン交換法） 接合体／ヘモグロビン 4.8 0.197 12.5 0.211

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）所望によりサンプルを溶血して細胞
    結合ヘモグロビンを遊離させる工程、 （ｂ）該サンプルまたは下記工程（ｃ）による該サンプ
    ルから回収されたヘモグロビンを、シグナル形成ラベル
    に結合した１個または数個のジヒドロキシボルニル基ま
    たはその塩の接合体からなるシグナル形成分子と接触さ
    せる工程、 （ｃ）グリコシル化および非グリコシル化ヘモグロビン
    およびそれに結合した分子を、サンプルまたは前記工程
    （ｂ）の反応混合物から分離する工程、および （ｄ）分離されたヘモグロビンに結合したシグナル形成
    分子、および／または非−ヘモグロビン結合シグナル形
    成分子を評価する工程 を包含することを特徴とする、サンプル中のグリコシル
    化ヘモグロビンの評価方法。
  2. 【請求項２】上記シグナル形成分子が固定化されていな
    いことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】工程（ｂ）および（ｃ）を同時に行うこと
    を特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】サンプルから分離されたグリコシル化およ
    び非グリコシル化ヘモグロビンの量を評価する工程をさ
    らに包含することを特徴とする特許請求の範囲第１〜３
    項のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】上記グリコシル化および非グリコシル化ヘ
    モグロビンを、均質溶液からの選択的沈澱により分離す
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１〜４項のいずれ
    かに記載の方法。
  6. 【請求項６】形成された沈澱を、クロマトグラフィーま
    たはろ過媒体により分離することを特徴とする特許請求
    の範囲第５項に記載の方法。
  7. 【請求項７】沈澱工程を固相クロマトグラフィーまたは
    ろ過媒体上またはその中で行うことを特徴とする特許請
    求の範囲第５項に記載の方法。
  8. 【請求項８】上記クロマトグラフィーまたはろ過媒体
    が、ヘモグロビン沈澱剤、特許請求の範囲第１項で定義
    したシグナル形成分子、溶血剤および錯生成剤から選ば
    れた１種または数種の試薬を担持していることを特徴と
    する特許請求の範囲第６項または第７項に記載の方法。
  9. 【請求項９】亜鉛イオンおよび／または銅イオンおよび
    ／または他の特異的ヘモグロビン沈澱金属カチオンの添
    加により、ヘモグロビンを沈澱させることを特徴とする
    特許請求の範囲第５〜８項のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】金属−錯生成剤を添加することをさらに
    包含することを特徴とする特許請求の範囲第９項に記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】有機溶剤または有機溶剤混合物を、実質
    的に特異的にヘモグロビンを沈澱させることのできる濃
    度で添加することにより、ヘモグロビンを沈澱させるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】上記溶剤が、水混和性アルコール類、ケ
    トン類、エーテル類、アミド溶剤、スルホキシド溶剤、
    炭化水素溶剤、ハロゲン化溶剤またはこれらの混合物か
    ら選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第11項に記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】ヘモグロビン−特異的結合タンパク質の
    添加により、ヘモグロビンを沈澱させることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】抗−ヘモグロビン抗体またはハプトグロ
    ビンまたはこれらのフラグメントを用い、所望により第
    ２の抗体または抗−ハプトグロビン抗体またはこれらの
    フラグメントの存在下に、ヘモグロビンを沈澱させるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第13項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】固相上に固定化されたヘモグロビン−特
    異的結合タンパク質により、ヘモグロビンを沈澱させる
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１〜４項のいずれか
    に記載の方法。
  16. 【請求項１６】上記シグナル形成分子を、アルカリ性ホ
    スファターゼ酵素ラベル以外のもので標識することを特
    徴とする特許請求の範囲第15項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】ジオール含有化合物またはジヒドロキシ
    ボルニル基含有化合物のような競合剤の存在下に実施す
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１〜16項のいずれ
    かに記載の方法。
  18. 【請求項１８】界面活性剤またはグアニジンの添加によ
    る低張性溶解、加熱、超音波処理またはこれらの任意の
    組合せにより、溶血を行うことを特徴とする特許請求の
    範囲第１〜17項のいずれかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】上記シグナル形成分子が化学ルミネッセ
    ンス性、蛍光性、着色性または放射性であるか、あるい
    は酵素活性を有することを特徴とする特許請求の範囲第
    １〜14項のいずれかに記載の方法。
  20. 【請求項２０】上記シグナル形成分子が、アントラキノ
    ン類、アゾ染料、オキサジン類、チアジン類、トリアジ
    ン類、ポルフィリン類、フィコビリタンパク質類、クロ
    ロフィル類、およびこれらの誘導体および類似化合物、
    カロチノイド類、アクリジン類、キサンチン類、インジ
    ゴ染料、チオキサンチン類、クマリン類、ポリメチン
    類、およびこれらの誘導体、フタロシアニン類および金
    属フタロシアニン類から選ばれたラベルを含有すること
    を特徴とする特許請求の範囲第19項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】上記シグナル形成分子を、Ｎ−（レゾル
    フィン−４−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸
    −Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（RESOS）ま
    たは他のオキサジンで標識することを特徴とする特許請
    求の範囲第20項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】試験すべきサンプル以外の、用いられる
    １種または数種の反応関与体が、ジヒドロキシボルニル
    基と反応する分子を除去されていることを特徴とする特
    許請求の範囲第１〜21項のいずれかに記載の方法。
  23. 【請求項２３】放射性または化学ルミネッセンス性シグ
    ナル形成ラベルに結合している、１個または数個のジヒ
    ドロキシボルニル基またはその塩の接合体からなるシグ
    ナル形成分子を含有する試薬。
  24. 【請求項２４】Ｎ−（レゾルフィン−４−カルボニル）
    ピペリジン−４−カルボン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシン
    イミドエステル（RESOS）または他のオキサジンに結合
    している、１個または数個のジヒドロキシボルニル基ま
    たはその塩の接合体からなるシグナル形成分子を含有す
    る試薬。
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