HU215181B - Eljárás és vizsgálókészlet glükozilált hemoglobin kimutatására - Google Patents

Abstract

A találmány vizsgálati módszerre vőnatkőzik, amellyel egy mintaglükőzilált hemőglőbintartalma határőzható meg, és amely vizsgálatimódszer a következő lépésekből áll: a) a mintát adőtt esetben hemőlizálják az összes sejthez kötötthemőglőbin felszabadítására, b) a mintát vagy az alábbi c) pőnt szerint a mintából kinyert hemőglőbintegy jeladó mőlekűlával érintkeztetik, amely egy vagy több dihidrőxil-bőril-csőpőrtból vagy ennek sójából és ehhez kapcs lódójeladócsőpőrtból álló kőnjűgátűm, c) a mintából vagy az előző b) pőnt szerinti reakciókeverékbőlelválasztják a glükőzilált és nem glükőzilált hemőglőbint és mindenhőzzá kötődő mőlekűlát, és d) meghatárőzzák az elválasztőtt hemőglőbinhőz és/vagy nem hemőglőbinhőzkötődött jeladó mőlekűlák mennyiségét. A találmány őltalmi körébetartőzik a fentiek szerinti vizsgálati módszer kivitelezésére alkalmasanalitikai vizsgálókészlet is. ŕ

Description

A találmány ligandummegkötésen alapuló, glükozilált hemoglobin kimutatására szolgáló vizsgálati eljárásra vonatkozik.

A testfolyadékokban jelen lévő oldatban lévő proteinek folyamatosan glükozílálási lépésnek vannak kitéve. A glükóz a proteinekkel nem enzimatikus reakcióban glükoproteint képez, és sok esetben a glükoprotein képződése arányos a testfolyadékban jelen lévő glükóz koncentrációjával. Olyan proteinek esetében, amelyek eredetileg nem voltak glükozilált formában, a glükoziláltság mértéke függvénye az alábbiaknak:

- a szervezetben lévő protein élettartama, és

- a glükóz koncentrációja, amelyhez a protein kötődik.

Eltérően azoktól a vizsgálatoktól, amelyek a vérben, a plazmában vagy a vizeletben mutatják ki a glükóz koncentrációját, és amely koncentrációk mindig a mintavétel idejére vonatkoznak, addig a glükozilált formában jelen lévő protein mennyiségének meghatározásával egy hosszabb periódusra kaphattunk információt a glükóz mennyiségéről.

Az eritrociták (vörös vérsejtek) átlagos élettartama körülbelül 120 nap, és nagy mennyiségű hemoglobint tartalmaznak. A glükozilált formában jelen lévő eritrocita hemoglobinmennyisége így mértéke lehet a diabetes mellitusnak, és függvénye a beteg vérében lévő glükózkoncentrációnak a vérvételt megelőző hetekben.

A klinikai gyakorlatban számos módszer ismert a glükozilált hemoglobin meghatározására annak érdekében, hogy diabetes mellitusban szenvedő betegek esetében kvantitatíve értékelhető, illetve ellenőrizhető legyen a vér glükóztartalma. Az ismertebb eljárások a következők:

1. A glükozilált és nem glükozilált hemoglobin szétválasztása ioncserés kromatográfiával. Ez volt az első, erre a célra javasolt módszer, és még ma is ezt alkalmazzák legelterjedtebben. E módszer hátránya azonban idő- és költségigénye, valamint az, hogy a kapott eredményt már kis hőmérséklet-eltérések is befolyásolják.

2. Boronsavszármazékok alkalmazása a glükozilált hemoglobin specifikus elválasztására. Régóta ismert, hogy a boronsavcsoport a cisz-diol-csoportot tartalmazó szénhidrátrészhez képes kötődni (Boeseken J., Advances in Carbohydrate chemistry 4,189-210,1949. Solms J. és Deuel H., Chimica 11, 311, 1957), és ezt a tulajdonságot fel lehet használni affmitásos kromatográfiás elválasztáshoz. így például a boronsavrészt kémiailag immobilizálják egy szilárd fázison, így például agarozon, és így elválasztják a glükoproteineket, a szénhidrátoktól és nukleotidoktól (Hageman, J. és Kuehn, G., Anal. Biochem. 80: 547, 1977). Ilyen anyagokat tartalmazó oszlopokat szintén alkalmaznak a glükozilált hemoglobin mennyiségének meghatározására (1. 2024829 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás). Az ilyen oszlopok elkészítése azonban igen időigényes és költséges, és ráadásul még lassú is a művelet, a hemolizátumot át kell nyomatni az oszlopon, a különböző frakciókat össze kell gyűjteni, a térfogatokat korrigálni kell, mielőtt a hemoglobin tartalmat meghatározzák az egyes frakciókban, majd a glükozilált hemoglobin mennyiségét számítani kell.

3. Elektroforetikus elválasztás. A hemoglobin glükoziláltságának mértéke változik a protein töltésével, és ezt a tulajdonságot fel lehet használni a glükozilált és nem glükozilált frakciók elektroforetikus szétválasztására, majd a kapott frakciókat mennyiségileg például reflektometriával határozzák meg. Ez az eljárás is azonban időigényes és költséges.

Az eritrocitákban lévő hemoglobin glükozilálása mellett a szérumban lévő proteinek glükozilálása is fokozottan végbemegy diabetes mellitusban szenvedő betegek esetében. Mivel azonban a különböző szérumproteinek felezési ideje különböző, és ezen felezési idők jelentős mértékben rövidebbek, mint a hemoglobin felezési ideje, a glükozilált szérumproteinek meghatározását csak a betegség szabályozásának visszamenőlegesen rövidtől közepes ideig terjedő kimutatására alkalmazzák. Alkalmaznak különböző kolorimetriás módszereket a glükozilált szérumproteinek mennyiségi kimutatására, mint a diabetes szabályozásának indexe (Johnsen, Metcalf & Baker, Clinical Chimica Acta 127 [1982] 87-95.). Ezen kvantitatív kimutatásnak klinikai értéke azonban korlátozott, mivel a szérumproteinek felezési ideje rövid és ugyancsak rövid a glükozilált formáé is. Továbbá nehézséget jelent még az is, hogy a szérumproteinekhez kötött szénhidrátok mennyiségi meghatározásához szükség van a szérum összegyűjtésére és preparálására (vénás vérvétel, 2 órás koaguláltatás, centrifügálás, dekantálás), ami igen munkaigényes és költséges, összehasonlítva a diabeteszesek vércukormeghatározásával, amelyet kapilláris vérből mikrovizsgálattal el lehet végezni.

A technika állása szerint ismert módszerek egyike sem megfelelő azonban a glükozilált hemoglobin mennyiségi kimutatására standard módszerként. Egyrészt a különböző módszerekkel elválasztott frakciók nem azonosak egymással (Measurement of Glycosylated Hemoglobins using affinity chromatography, Bouriotis és munkatársai, Diabetologia 21: 579—580, 1981). Az ioncserés módszerrel nyert HbAlc frakciót gyakran „glükozilált hemoglobinnak” is nevezik, azonban ez tartalmazhat nem glükozilált hemoglobint is, ugyanakkor sok glükozilált hemoglobint más frakciókkal eluálnak.

Az immobilizált boronsavrészt alkalmazó affinitásos kromatográfiával különböző helyeken glükozilált hemoglobinokat izolálnak, így például olyanokat, amelyek a lizincsoporton vannak glükozilálva, a leggyakoribb frakció a bétalánc aminoterminális részén van glükozilálva. Ugyanakkor nem glükozilált hemoglobinok is kötődhetnek nem specifikusan a szilárd fázishoz, és nem minden glükozilált hemoglobin kötődik, ha a glükozilcsoport a molekula olyan részén helyezkedik el, amely nem hozzáférhető a szilárd fázis kötési helyei számára. Ezért a különböző módszerek esetében a glükozilált hemoglobinokra különböző mennyiségi intervallumokat adnak meg.

További problémát jelent meg, hogy sok módszernél a magas glükózszint akadályozza a glükozilált frakció mennyiségi kiértékelését.

HU 215 181 Β

A hemoglobin olyan glükozilált frakcióinál, ahol a glükóz kovalens kötéssel kötődik, van egy másik glükozilált frakció is, amelynél a glükóz sokkal lazábban kötődik. Ezt a frakciót gyakran „labilis” glükohemoglobinoknak nevezik, mivel a kialakulásuk megfordítható az eritrociták mosásával vagy az eritrociták szénhidrátmentes oldatban való inkubálásával vagy a glükozilált hemoglobin pH=5 értéken való tartásával (Bisse, Berger & Fluckinger, Diabetes 31: 630-633, 1982). A glükozilált hemoglobinnal képzett boronsavészterek geometriai szerkezete azonban túlnyomórészt a nem reverzibilis glükozilált formában és nem a labilis formában képződik.

Ami a vizsgálatok alternatív formáit illeti, az antitestek immobilizálását szilárd fázisokon általánosan alkalmazzák az immunovizsgálatoknál és a sejtek és proteinek immunotisztításánál. Antitesteket homogén immunovizsgálatoknál is alkalmazhatnak, azaz ott, ahol antitest és antigén egyaránt jelen van az oldatban és ott, ahol az antitest/antigén reakciót közvetlenül lehet mérni például nefelometriával vagy turbiditásméréssel vagy közvetve például fluoreszcenciával vagy enzimaktivitás vagy -gátlás meghatározásával. Különböző próbálkozások történtek már a glükozilált hemoglobinra specifikus monoklón és poliklón antitestek alkalmazására, de korlátozott sikerrel. Ez főleg annak tudható be, hogy a glükozilált hemoglobin szénhidrátrésze kémiai formájában nemigen hozzáférhető az antitestek számára. így a glükozilált hemoglobin denaturálása szükséges a kötések létrehozása érdekében, ezt például polisztirol felülethez való adszorpcióval (1. például Engbaeck F. és mtársai, Clinical Chemistry 35: 93-97, 1989) vagy kémiai denaturálással végzik (Knowles 7 U.S. Patent 4658022, 1987).

Bumett és munkatársai (Biochemical and Biophysical Research Communication, 96, 157-162, 1980) fluoreszcensz boronsav-molekulát (N-(5-dimetil-l-naftilszulfonil)-3-amino-benzol-boronsav) szintetizáltak, amelyről kimutatták, hogy a sejtmembránhoz kötődik a sejtek fluoreszcenciás mikroszkópos vizsgálatánál.

A 3 720736 számú német szabadalmi bejelentésben fluoreszkáló és színes boronsav-diazo konjugátumokat ismertetnek a teljesen glükozilált proteinek mennyiségi meghatározására. Ez a módszer a következő három elven alapszik a teljesen glükozilált proteinek mérésével kapcsolatban:

1. A boronsav-konjugátumok abszorpciós maximuma eltolódik, ha a jelen lévő glükoproteinek glükozilált részéhez kötődik, vagy

2. A fluoreszcencia polarizációja megváltozik, ha a fluoreszkáló boronsav-konjugátum a glükozilált proteinrészhez kötődik, vagy

3. A nem kötött boronsav eltávolítása után (például aktívszenes kezeléssel) a színes vagy fluoreszkáló, a teljes glükoproteinhez kötött boronsav-konjugátum meghatározható.

A fentiek szerinti egyik módszer sem alkalmazható azonban speciális glükoproteinek meghatározására más egyéb glükoproteinekkel való keverékben, különösen nem betegektől származó hemolizátummintákban a glükozilált hemoglobin meghatározására. Ráadásul még az említett szabadalmi leírásban megadott reagens abszorpciós koefficiense igen alacsony, így közel esik a hemoglobinéhoz, ami megnehezíti vagy lehetetlenné teszi a glükozilált hemoglobin kimutatását még igen tiszta formában is. A leírás szerint a módszert nem is ajánlják a glükozilált hemoglobinok vizsgálatára, hanem a teljes szérum glükozilált proteinek és a humán szérumból extrahált glükozilált albumin analízisére.

A glükoproteinekkel szemben reakcióképes lecitineket szintén vizsgálták, bár eddig még nem ismert egy lecitin sem, amely specifikusan a glükozilált hemoglobinnal lépne reakcióba, és így alkalmas lenne a glükozilált hemoglobinok mennyiségi meghatározásához.

A fentiek alapján szükséges egy olyan továbbfejlesztett módszer biztosítása, amely alkalmas a glükozilált hemoglobin specifikus, gyors, egyszerű meghatározására és a klinikai gyakorlatban könnyen alkalmazható.

Felismertük, hogy ha kombináljuk a glükozilált és nem glükozilált hemoglobinok elválasztását a boronsavszármazékok specifikus szénhidrát-felismerő tulajdonságával, egy igen hatásos és specifikus módszert nyerünk a glükozilált frakció kimutatására.

Ezek alapján találmányunk tárgya eljárás glükozilált hemoglobin kimutatására, oly módon, hogy

a) adott esetben hemolizáljuk a mintát a sejtben kötött hemoglobin felszabadítására,

b) az így kapott mintát vagy a mintából kinyert hemoglobint egy jelzőmolekulával érintkeztetjük, amely a jelzett részhez kapcsolva egy vagy több dihidroxil-boril-csoport vagy ennek sója konjugátumát tartalmazza,

c) elválasztjuk a glükozilált és nem glükozilált hemoglobint a fenti b) pont szerinti mintából, és

d) mérjük az elválasztott hemoglobinhoz kötött jelzett molekulákat és/vagy bármely, nem hemoglobinhoz kötött jelzett molekulát.

A találmány szerinti módszernél a mintában lévő glükozilált hemoglobin mennyiségének meghatározásán kívül szükség lehet a jelen lévő glükozilált és nem glükozilált hemoglobin mennyiségének, valamint a glükozilált résznek a teljes hemoglobinra vonatkoztatott arányának meghatározására is.

A hemoglobinelválasztási lépésnél nem szükséges a teljes hemoglobinmennyiség (glükozilált és nem glükozilált) elválasztása. Elegendő mindkettőnek csak egy részét elválasztani, ha a rendszer megfelelően van kalibrálva. Az ilyen kalibrálások a klinikai gyakorlatban rutinszerűen ismertek.

A találmány értelmében a „meghatározzuk” kifejezés magában foglalja mind a mennyiségi meghatározást, azaz, hogy abszolút értékben megkapjuk a glükozilált vagy a teljes hemoglobinmennyiséget a mintában, mind azt, hogy egy indexszámot, egy arányt, százalékos értéket vagy más hasonlót nyerünk, amely jelzi a glükozilált hemoglobin mennyiségét például a mintában lévő összhemoglobinhoz viszonyítva.

Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti módszernél elkerülhető a glükozilált és nem glükozilált hemoglo3

HU 215 181 Β bin-frakciók szétválasztása, a módszernél mind a glükozilált, mind a nem glükozilált hemoglobint kinyerjük a mintából. Ily módon nem szükséges a jelzett boronsavszármazékokat immobilizálni, mivel ezek nem részei az elválasztási rendszernek, sőt előnyös is, ha nincsenek immobilizálva.

A találmány szerinti módszer alkalmazható a glükozilált hemoglobin mennyiségének meghatározására vérben, vér hemolizátumokban vagy vér extraktumokban függetlenül attól, hogy a minta egészséges, diabetes mellitusban vagy feltételezett diabetes mellitusban szenvedő egyedektől származik. Különösen előnyösen alkalmazható olyan esetekben, amikor a vér vagy hemolizátum vagy egyéb minta a glükozilált hemoglobin mellett még más glükozilált proteineket és/vagy glükoproteineket és/vagy szénhidrátokat is tartalmaz. A vizsgálat előtt a minták lehetnek száraz, folyékony vagy fagyasztott állapotban. A találmány szerinti analízishez a hemolizátumot előállíthatjuk például különböző reagensek alkalmazásával, amelyek lehetővé teszik, hogy a szénhidrát molekularésze a glükozilált hemoglobinnak részt vegyen a kötési reakcióban. Ezt a kezelést végezhetjük az analízisnél alkalmazott egyéb reagensek adagolása előtt vagy azokkal egyidejűleg. Adott esetben a kölcsönhatások csökkentése érdekében a mintákat kezelhetjük a szabad glükóztartalom és/vagy labilis glükohemoglobinok mennyiségének csökkentése érdekében, például glükóz oxidázokkal vagy olyan pufferoldatokkal, amelyek pH-értéke 6 alatt van.

A találmány szerinti eljárásnál a jelzett molekulák vagy konjugátumok hemoglobinnal való reakcióját végezhetjük a hemoglobinnak a mintából való eltávolítása előtt vagy után egyaránt. A sorrend megválasztása függ a rendelkezésre álló eszközöktől és műszerektől, amelyekkel az eljárást kivitelezzük.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési módjánál a jelzett molekula kötését és a hemoglobin elválasztását szimultán végezzük homogén oldatban, amelyből a hemoglobint kicsapjuk, majd centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk. A reakciók, valamint az elválasztás körülményeit azonban a glükozilcsoport és boronsav közötti egyesülési konstans határértékeinek figyelembevételével kell megválasztani, amely meglehetősen alacsony érték (10³—10⁵ moE^lxl).

A jel erősségéből, amelyet a jelzett molekula révén kapunk, meghatározható a hemoglobinhoz kötött vagy a hemoglobinnal elválasztott mennyisége. Mint azt már az előbbiekben is említettük, pillanatnyilag még nincs abszolút értékű standard a glükozilált hemoglobin mennyiségi meghatározásához. Ha szükséges azonban, a találmány szerinti módszert kalibrálhatjuk, illetve összefüggést állíthatunk fel közötte és a technika állása szerinti ismert módszerek között, ismert koncentrációjú (a technika állása szerint meghatározva) standard hemoglobinoldatok alkalmazásával.

A jelzett molekula vagy konjugátum tartalmazhat fenilboronsav-csoportot is, amely vagy közvetlenül, amin- vagy amidkötés révén kapcsolódik a jelzett részhez vagy bármely ismert kémiai kötés segítségével, amely a dihidroxi-boril-csoportot szabadon hagyja, hogy reagálni tudjon a hemoglobin glükozilcsoportjának cisz-diol-csoportjával. Függően attól, hogy milyen pKa-érték kívánt a boronsavcsoportra, a fenilcsoport még további szubsztituenseket is tartalmazhat, így például nitro-, formil- vagy alkoxicsoportot vagy más, a pKa-értéket befolyásoló csoportot, de amely csoportok sztérikusan nem befolyásolják a glükozilált hemoglobinok cisz-diol-csoportjához való kötődést.

A találmány szerinti jelzett molekulák előállításához alkalmazható boronsavcsoport előállítását például aminofenilből kiindulva végezzük, majd a jelzett molekulához vagy konjugátumhoz való kapcsolást diazonium-ion-képzéssel vagy szilanizálással végezzük, kapcsolószer, így például glutár-dialdehidek, karbodiimidek, cián-halogenidek, szukcinimidek vagy más ismert anyagok jelenlétében. A jelképző rész oly módon kapcsolódik, hogy a boronsavrész nem reagál a glükozilált hemoglobin cisz-indol-részével, és „aktiválható” előzőleg aminnal vagy más reakcióképes vegyülettel, így például dimetil-amino-azobenzo-izotiocianáttal vagy dimetil-amino-naffalinszulfonilkloriddal, hogy a dihidroxiboril-csoporton reakcióképessé tegyük. A találmány szerinti jelzett molekulákat még tovább is módosíthatjuk a vízoldhatóságuk növelésére.

A találmány szerint felhasználásra kerülő dihidroxiboril-csoport előnyösen nem immobilizált formában van jelen, és egy boronsavcsoportot tartalmaz, amely közvetve vagy közvetlenül egy olyan kémiai szerkezethez kapcsolódik, amely közvetve vagy közvetlenül, fizikai vagy kémiai mennyiségi meghatározásokhoz alkalmazható jelzést képes alkotni. A jelzett molekula tartalmazhat például enzimet vagy enzimeket, amelyekben nincs szénhidrát cisz-diol-csoport vagy amelyek nem hasadnak cisz-indol-csoportot tartalmazó frakciókká. Más lehetőség szerint a jelzett molekula lehet részben vagy teljesen színes vagy fluoreszcesz tulajdonságú vegyület is. A szakterületen számos színes, fluoreszkáló vagy pigmentált vegyület ismert, amelyek mindegyike alkalmazható a találmány szerinti jelzett molekulák előállításához. Ilyenek például a következők: antrakinonok, azofestékek, azinfestékek, így például oxazinok, tiazinok, triazinok, természetben előforduló pigmentek, így például porfirinek, fikobiliproteinek, beleértve a fíkoeritrineket és fikocianinokat, klorofillek és ezek analógjai és származékai karotenoidok, akridinek, xantének, beleértve a fluoroszceineket és rodaminokat, indigófestékek, tioxantének, kumarinok, polimetének, beleértve a di- és triaril-meténeket valamint ezek származékait, továbbá ftalocianinok és fém-ftalocianinok, amely molekulák adott esetben egy köztes molekulán keresztül kapcsolódnak a boronsav-molekulákhoz, amelyek nem reagálnak az analizálni kívánt glükoproteinek cisz-diol-részével.

Más megoldás szerint számos radioaktív molekula is alkalmazható jeladó reagensnek, így például a jód125 vegyületek. Az ilyen vegyületeket például úgy nyerhetjük, hogy a fenil-boronsav gyűrűjét jelöljük 1-125 izotóppal vagy az amino-fenil-boronsavat 1-125 jelzett reagenshez, például az ismert BoltonHunter reagenshez kapcsoljuk. Ilyen radioaktív jelzési

HU215 181 Β módszereket ismertetnek például a következő irodalmi helyen: Biochem. J. 133, 529-539, 1973. A találmány szerinti módszer alkalmazásánál a reagenseket meglehetősen nagy koncentrációban kell használni, így több kivitelezési módnál, az 1—125 jelzett konjugátumokat elkeverhetjük nem radioaktív bórsavval vagy boronsavval - amelyek szerkezete azonos vagy különböző -, hogy ily módon nyerjük a vizsgálathoz szükséges, megfelelő radioaktív szintet.

A boronsavcsoportokat olyan természetes vagy szintetikus vegyületekhez is kapcsolhatjuk, amelyek kemilumineszenciás jeleket képesek adni, amelyeket ismert módon mérhetünk (Cormier. M. J. és munkatársai, Chemiluminescence and Bioluminescence, Plenum Press, New York 1973). Alkalmas kemilumineszcenciás vegyületek közé tartozik például a luciferin, a különböző oxálsavészterek, 1,2-dioxetán, luminol vagy ezek származékai. Adott esetben hidrogén-peroxid vagy enzimek, így például luciferáz alkalmazásával nyerjük a jeladó molekulából a kemilumineszcenciás jelet.

Erősen anionos jeladó molekulák alkalmazása nem előnyös, mivel ezek képesek a szérumproteinekhez, így például a mintában jelen lévő humán szérum albuminhoz kötődni. Különösen előnyösen például fluoreszcein izotiocianát és amino-fenil-boronsav reakciójával nyert konjugátumot alkalmazunk, amely konjugátum nem tartalmaz karboxilcsoportot. Egy másik előnyös konjugátum például a fluoreszceinhez l-etil-3-(3-dimetilamino-propil)karbodiimiden keresztül amino-fenilboronsavval létrehozott konjugátum (EDC) vagy a blokkolt karboxilcsoportokat tartalmazó fluoroeszcein izotiocianát vagy olyan amino-fenil-boronsav konjugátumok, amelyekben a karboxilcsoportokat eltávolítottuk. Az amino-fenil-boronsavhoz, például karbodiimiddel kapcsolt Rhodamine B konjugátum szintén alkalmazható, ezen konjugátum oldhatósága azonban a legtöbb, a találmány szerinti vizsgálati eljárásnál felhasználásra kerülő oldószerben gyenge. Az N-(rezorufín)-4-karbonil-piperidin-4-karbonsav-N-hidroxiszukcinimid-észter (a továbbiakban Resos) egy különösen előnyös jelzett molekula, amelyet az amino-fenilboronsavhoz kötünk és amelynek oldhatósági tulajdonságai kiválók és a fehérjékhez való nem specifikus kötődése is alacsony. Ez utóbbi valószínűleg annak tudható be, hogy kevesebb anionos csoportot tartalmaz, mint például az FITC-amino-fenil-boronsav konjugátum.

A -B-(OH)₂ képletnek megfelelő boronsavcsoportot gyakran dihidroxilboril-csoportnak is nevezik elektromosan semleges formában és hidroxilionok jelenlétében -B-(OH)₃ csoportot képez és sókat is alkothat. A találmány szerinti módszernél egy vagy több ilyen csoportot tartalmazó boronsavat reagenst alkalmazunk, függően a reagens pH-jától és elektrolittartalmától. Ez anionos formában van, hogy a boronsav a glükozilált hemoglobin cisz-indol-csoportjához kötődjön. Ugyanakkor a boronsav csoport anionos erőssége elegendően gyenge kell hogy legyen, hogy a proteinekhez, így HSA-hoz való kötődés elkerülhető legyen.

A nagy molekulatömegű jelzett boronsav-konjugátumok alkalmazását a találmány szerinti módszernél előnyösen kerüljük, mivel a legtöbb glükozilált hemoglobin glükozilált része korlátozottan hozzáférhető; a vérben a glükozilált hemoglobin jelentős része a béta-lánc N-terminális valin aminosavnál glükozilezett, ami a nagy molekulatömegű, vízoldható molekulák számára nehezen hozzáférhető, mint azt a 4658 022 számú amerikai szabadalmi leírásban is említik. E szabadalmi leírásban leírják, hogy antitestkötési reakciókban a glükozilált részek jelentős denaturálódásnak vannak kitéve.

A találmány szerinti eljárás egyik megvalósítási módjánál a teljes hemoglobint a mintából a hemoglobinra specifikus immobilizált kötő fehérjékkel, így például antitestekkel vagy haptoglobinnal választjuk el, amelyeket például szűrők, membránok, gyöngyök, gélek, mikrotitráló csíkok, csövek vagy lemezek felületéhez kötöttünk, akár a hidrofób kölcsönhatással, akár közvetlen kémiai vagy egy szekunder antitesttel végzett kötéssel. Ez általában azonban nem előnyös, mivel a boronsav és a cisz-diol közötti egyesülési konstans értéke 10³ és 10⁵ mól¹ közötti érték (lásd Evans és munkatársai, Anal. Biochem., 95:383, 1979, Zittle C., Adván. Enzym. 12:493, 1951), és ily módon a kötőfehérjék koncentrációja az immobilizálásnál meglehetősen alacsony érték, és ez a boronsavnak a cisz-diol-csoportokhoz való kötésének csökkenését eredményezi. Ezért nagy kötési kapacitás lenne szükséges ennek ellensúlyozására, amit viszont technikai szempontokból nehéz kivitelezni. Ez tovább korlátozza az alacsony kötési kapacitású szilárd fázisok, így például polisztirolok alkalmazhatóságát. A szilárd fázisú kötési kapacitás azonban növelhető gélek, mikrogyöngyök vagy más ismert, nagy fajlagos felületű szilárd fázisok alkalmazásával, ezek a szilárd fázisok azonban a klinikai gyakorlatban kevésbé praktikusak. Ha a hemoglobin eltávolítására hemoglobinspecifikus kötőfehérjéket alkalmazunk, előnyös, ha a jelzett molekulákat nem alkalikus foszfatáz enzimmel jelöljük.

A találmány szerinti eljárás egy még előnyösebb kivitelezési módjánál, a hemoglobin (és a hozzá kötött jelzett molekulák) elválasztását a teljes hemoglobinnek a homogén oldatból való szelektív kicsapásával végezzük, amelyhez megfelelő kicsapószert használunk kromatográfiával, centrifúgálással vagy szűréssel kombináltan.

így a hemoglobin elválasztását végezhetjük nem specifikus hemoglobint megkötő proteinek alkalmazásával, így például specifikus monoklonális vagy poliklonális antitestekkel, bármely, a humán hemoglobint megkötni képes fajhoz tartozó haptoglobinokkal vagy más egyéb, hemoglobint megkötni, kicsapni vagy egyéb más módon eltávolítani képes fehéqével. A különböző epitopokkal reakcióképes monoklonális antitestek vagy poliklonális antitestek alkalmazhatók a hemoglobinnal csapadékképzésre. Csapadékot képezhetünk továbbá szekunder antitestekkel, valamint haptoglobinokkal olyan antitestekkel kombináltan, amelyek a haptoglobinnal szemben reakcióképesek. Előnyösen olyan antitesteket alkalmazunk, amelyek nem tartalmaznak cisz-diol-részt vagy hiányzik a cisz-diolt hordozó molekularész, vagy mindezek immunoreaktív fragmenseit is alkalmazhatjuk.

HU 215 181 Β

Ezen módszer hátránya azonban, hogy mivel a jelzett molekulát tartalmazó boronsav és a glükozilált hemoglobinok glükozilált részei közötti egyesülési konstans értéke csupán ΙΟ⁵—10³ moE'xl nagyságrendű, meglehetősen nagy koncentrációban szükséges a reagenseket alkalmazni, és ez minden vizsgálatnál nagy haptoglobin- vagy antitestfogyasztást eredményez.

A találmány szerinti módszer egy előnyös kivitelezési módjánál a homogén oldatból való hemoglobinkicsapást fémkationok vagy szerves oldószerek alkalmazásával végezzük. E módszer előnye, hogy nagy koncentrációjú hemoglobin alkalmazható, a csapadék könnyen elválasztható, például centrifugálással vagy szűréssel, a reagensek olcsók és hatékonyak.

Egy másik kivitelezési formát az tesz lehetővé, hogy a hemoglobin igen jól oldódik vízben és így oldatból bizonyos szerves oldószer alkalmazásával specifikus vagy közel specifikus hemoglobinkicsapás végezhető, erre a célra például a következő oldószerek használhatók: alkoholok, így például etanol vagy metanol, ketonok, így például aceton, éterek, így például ciklusos éterek, például dioxán vagy tetrahidrofurán, amidok, így például dimetil-formamid vagy dietil-formamid, szulfoxidok, így például dimetil-szulfoxid, szénhidrogén oldószerek, így például toluol, halogénezett szénhidrogének, így például kloroform. Ha például egy teljes vérmintát csapunk ki, körülbelül 6,5 mg hemoglobin- és 1,5 mg HSA/ml tartalomra hígítva és 50 tf% etanolos butanolt adagolva 9 tf% végső butanol koncentrációig, a hemoglobin 94%-a kiválik és csupán 1% HSA csapódik ki. Az ilyen kicsapásnál nincs veszteség a cisz-diol-részhez kötött boronsavtartalomban sem.

Specifikus hemoglobinkicsapást érhetünk el fémkationok alkalmazásával is, amely aggregáló proteinhez van kötve. Alkalmas kation például a cink, a réz, kevésbé előnyös a nikkel, a kobalt, a kadmium. E módszer előnye, hogy bármely, ily módon kicsapott hemoglobin szolubilizáló komplexképző adagolásával ismételten oldatba vihető. Cinkionok alkalmazásával jelentősen specifikus hemoglobinkicsapást érhetünk el a teljes vér hemolizátból, ami igen meglepő felismerés. Például 2,5-4 mM cinkion-koncentráció esetén, 6,5 mg hemoglobin és 1,5 mg HSA/ml jelenlétében specifikus vagy közel specifikus hemoglobinkicsapást érhetünk el. Ugyanakkor 4 mM cinkion-koncentráció felett HSA is kicsapódik. Ez látható a következő kísérleti eredményekből:

Zn-koncentráció Kivált Hb,% Kivált HSA,% mM

2,6 87 6

3,9 87 15

6,5 91 92

Az ionkoncentrációt azonban igen gondosan kell megválasztani, hogy ne lépjen kapcsolatba jelzést adó boronsavszármazékkal. Ha szükséges, a kivált hemoglobint át is moshatjuk vagy szűréssel eltávolíthatjuk a felesleges kationt, mielőtt azok a jeladó boronsav-konjugátumokkal reakcióba lépnének. Ez a reakciósor különösen akkor előnyös, ha inkább anionos jeladó boronsavkonjugátumokat alkalmazunk, mivel a felesleges cinkionok és az anionos konjugátumok között különösen nemkívánatos kölcsönhatás alakulhat ki. A cink mellett más egyéb fémkation is alkalmazható, feltéve, hogy sem saját, sem a pufferolt, a kicsapáshoz alkalmazott oldatból nem válik ki, ugyanakkor a specifikus hemoglobin kicsapóképessége azonos a cinkionéval.

Amiatt azonban, hogy a fémionok a hidrolízisben vagy a reagensek más reakcióiban is részt vehetnek, előzetes intézkedéseket kell tenni annak biztosítására, hogy a fémkationok oldatban maradjanak, és a hemoglobinkicsapásban vegyenek részt.

Néhány, a leírásban ismertetett jelzett boronsavkonjugátum tartalmaz olyan csoportokat, amelyek a fémkationoknak elektronpárt képesek adni, és ily módon komplexképzőként szerepelnek. Ez a ligandumfémkomplex-képző képesség felhasználható a reakció szabályozására a fémionokat oldatban tartva, a fémionok és a boronsavjelzett molekulák közötti komplex képződését megakadályozva és biztosítva a szükséges, megfelelően nagy fémion-koncentrációt, amely szükséges a hemoglobin kicsapásához.

Miután mind a különböző fémkomplexek stabilitási konstansait, mind a ligandumkoncentrációkat figyelembe kell venni, megfelelő puffersókat lehet alkalmazni, az oldhatatlan fémkomplexek kialakulásának megelőzésére (a továbbiakban Me-komplexek).

Ezért előnyösek a gyenge monodentát Me-komplexeket képző puffersók, így például az ammónium-acetát, amely cinkkel kombinációban oldható Zn(Ac) és Zn(NH₄) komplexet képez.

Erősebb komplexképző szerek, így például multidentát kellátképző ligandumoknak a pufferhez való adagolásával az összes említett reakciók szabályozhatók a vizsgálandó oldatban. A komplexképző szert megfelelő mólmennyiségben adagoljuk, hogy a megfelelő mólarányokat kapjuk a különböző komplexek esetén és hogy egyensúlyt teremtsünk a többi alkotóval is a reakció kívánt végbemenetele biztosítására. Továbbá, a komplexképző szert az adott, felhasználni kívánt fémkation figyelembevételével kell megválasztani, így biztosítva esetleges nemkívánatos mellékreakciók, így például a fémion túl erős komplexálásának elkerülését.

A kelát-Me-komplex stabilitási konstansának elegendően nagy értékűnek kell lenni, hogy felvehesse a versenyt az esetleges más jelen lévő komplexképző szenei, így például a jelzett boronsav-konjugátummal, de ne legyen túl erős, hogy a kicsapószerként jelen lévő fémionok számára a hozzáférhetőség csökkenjen vagy gátolva legyen.

Kelátképző ligandumként igen sokféle ismert vegyület alkalmazható, így például a következők: etilén-, propilén- vagy butilén-diamin vagy ezek analógjai, glicin, aszpartát, nitrilo-acetát, hisztidin vagy pikolinát, továbbá különböző természetes vagy szintetikus kelátképzők, így például szénhidrátok, szerves savak, amelyek több koordinációs csoportot tartalmaznak, aminosavak, peptidek, fenolok, bár ezek közül több nem elő6

HU215 181 Β nyös, mivel a boronsawal komplexet képesek alkotni, ilyenek például a szalicilátok, oxalátok, szénhidrátok, így például a szorbitol vagy tartarát, és ily módon ezek versenyben vannak a glükozilált hemoglobinnal a jelzett boronsav-konjugátumok megkötésében.

Multidentát kelátképzőként az alábbi vegyületek szintén alkalmazhatók, bár ezek sok esetben kevésbé előnyösek, mivel igen erős a fémionokkal szembeni kelátképző képességük, és így csökken a hemoglobin kicsapása: EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav), CDTA (transz- l,2-diamíno-ciklohexán-N,N, Ν’, N’-tetraecetsav), EGTA (etilénglikol-o-o’-bisz(2-2-amino-etil)Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetraecetsav), DTP A (dimetilén-triaminpentaecetsav). Előnyös a cinkionokat tartalmazó ammónium-acetát puffért és glicint tartalmazó kombináció.

A találmány szerinti eljárás különböző megvalósítási módjainál különböző komplexálószerek előnyösek. Általában EDTA és DTPA komplexálószereket alkalmazunk, de ezek koncentrációját igen gondosan kell beállítani, ha a hemoglobin kicsapásához fémionokat alkalmazunk. A citromsav és oxálsav kevésbé előnyös, mivel kölcsönhatásba lépnek a boronsav-molekulával. A heparin és a fluoridionok szintén előnyösen alkalmazhatók.

A homogén oldatból például a fentiek szerinti módon szerves oldószerrel vagy fémionnal kicsapott csapadékot teljesen vagy részlegesen elválaszthatjuk centrifügálással vagy szűréssel vagy más, ismert módszerrel.

Szűrőmembránok vagy vékonyréteg-kromatográfiás rendszerek vagy ezeken immobilizált, a hemoglobin megkötésére alkalmas haptoglobint tartalmazó rendszerek szintén alkalmazhatók az adott esetben antitestekkel vagy ezek immunoreaktív fragmenseivel kapcsolt hemoglobin elválasztására merülő pálcák vagy többrétegű filmek formájában.

A centrifügálással, majd a kapott felülúszóból a csapadék elválasztásával végzett hemoglobinelválasztás az egyik előnyös módszer. Más eljárásnál szűrést is alkalmazhatunk, amelynél az elválasztást egy- vagy kétdimenziós módszerrel a szűrő felületére vertikálisan, tangenciálisan vagy radiálisán végezzük.

Vékonyréteg-kromatográfiás módszereket szintén alkalmazhatunk, így például felvihetjük a mintát egy alkalmas kromatográfiás médiumra, például szalagra vagy gélre, majd a reagenseket és mosóoldatokat vagy közvetlenül a felvitel helyére adagoljuk, vagy eluálást végzünk.

Egy másik kiviteli módnál az oldatból a hemoglobint közvetlenül is kicsaphatjuk a szűrőre vagy szűrőben vagy más egyéb kromatográfiás médiumra vagy médiumba, amely esetben a kapott csapadék a szilárd fázison vagy fázisban lesz. A reagenseket a porózus médiumra felvihetjük akár a kicsapás előtt, akár azzal egyidejűleg vagy azt követően. így például a reagenseket, mint például a kicsapószereket, a jeladó boronsavreagenseket, hemolizálószereket és egyéb más reagenseket bármilyen kombinációban felvihetjük a szilárd állapotú kromatográfiás anyagra, az így kapott szilárd médiumok szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak. Ezeket a médiumokat adott esetben átmoshatjuk vagy eluálhatjuk.

A teljes vérmintából az eritrociták hemolizálására és a glikozilált hemoglobinok és a jeladó boronsav-konjugátumok közötti jó kémiai kontaktus biztosítására számos reagens és módszer ismert és alkalmazható, ilyenek például a következők: hipotóniás hemolízis, valamely következő detergens alkalmazása: nemionos poli(etilén-glikol)-észter vagy poli-(etilén-oxi)-szorbitolészterszármazékok, így például „Triton” és „Tween”, kólátok, nátrium-dodecil-szulfátok, guanidin, továbbá hőkezelés, ultrahangos kezelés vagy ezek bármilyen kombinációja.

A jeladó boronsav-konjugátumok érintkeztetését a vér hemolizátum mintával vagy az ilyen mintákból izolált hemoglobinnal bármilyen pufferoldatban végezhetjük a hemolízis kezelési lépéssel egyidejűleg vagy azt követően.

Pufferként számos puffer alkalmazható, így például foszfátpufferek vagy mások, amelyek a pH-értékét a reakció alatt a kívánt értéken képesek tartani. A vizsgálat előnyös pH-tartománya 7,5 és 10 közötti érték, a kívánt pH-értéke függ az alkalmazott adalékanyagoktól, puffersóktól valamint az adott boronsav pKa-értékétől. Bizonyos, amincsoportot tartalmazó pufferek erősíthetik a dihidroxi-boril-cisz-diol kölcsönhatást, vagy csökkenthetik a borát látszólagos pKa-értékét. Ennek következtében előnyösek például a következő pufferek: szerin, glicin, Hepes (4-(2-hidroxi-etil)-1-piperazinetánszulfonsav)-ammónium-acetát, morfolin vagy taurin. A dihidroxi-boril és cisz-diol közötti kölcsönhatás további elősegítésére különböző további adalékanyagokat alkalmazhatunk, így például kétértékű kationokat, detergenseket, kaotropikus szereket, a töltések taszításának csökkentésére, a célmolekula oldhatóságának elősegítésére, a hidrofób kölcsönhatás korlátozására, valamint a glükozilált hemoglobinokban a diolok hozzáférhetőségének fokozására. Bizonyos pufferek alkalmazását azonban, így például a trisz és etanol-amin alkalmazását kerülni kell, mivel ezek a pufferek a borátokkal komplexet képeznek, és így blokkolják a diolokat a kötéstől. Bizonyos puffer-adalékanyag kombinációkat előnyösen szintén kerülni kell - ilyen például a foszfát-cink kombináció - oldhatatlan vegyületek, például Zn₃(PO₄)₂ képződése miatt.

A találmány szerinti vizsgálati módszert 4-37 °C közötti hőmérsékleten bármilyen intervallumban végezhetjük, anélkül, hogy a kapott eredményeket a hőmérséklet befolyásolná.

A találmány szerinti módszerrel meghatározhatjuk az említett jeladó molekulák mennyiségét, valamint adott esetben az összhemoglobin-mennyiséget, amely akár glükozilált, akár nem glükozilált formában van jelen. Attól függően, hogy a találmány szerinti módszer melyik kivitelezési formáját alkalmazzuk, a jel vagy a jeladó molekulához kötött hemoglobinról érkezik, azt jelzi, vagy a nem hemoglobinhoz kötött jeladó molekulákról. Különösen előnyösen előzőleg izolált hemoglobinhoz kötött jeladó molekulákat határozunk meg.

HU215 181 Β

A jeladó molekulák meghatározását, amelyek hemoglobinhoz kötöttek, vagy hemoglobinnal együtt választottuk el őket, ismert kémiai berendezésekkel végezzük, amelyeket általában az enzimatikus aktivitás, a fluoresszencia, radioaktív sugárzás, optikai sűrűség (abszorpció) meghatározására alkalmaznak, függően ajeladó kémiai természetétől. A szín- vagy fluoresszenciameghatározást a szilárd fázisú felületen könnyen végezhetjük reflektometriával, amelyet általában a klinikai gyakorlatban is alkalmaznak. Egy merülő mérce vagy szűrő vagy egyéb más, praktikus, szilárd eszköz felhasználásával a hemoglobinokat és/vagy a fluoreszkáló vagy színezett jeladó konjugátumokat közvetlenül a felületen is meghatározhatjuk. Eljárhatunk úgy is, hogy a kicsapott vagy immobilizált hemoglobint és/vagy jeladó boronsav-konjugátumokat ismételten oldjuk, majd oldatban határozzuk meg.

Enzimatikus aktivitású jeladó boronsav-konjugátumokat hasonlóképpen meghatározhatunk immobilizált vagy oldott vagy ismételten oldott formában az ismert enzimometrikus technológia alkalmazásával. Radioaktív boronsav-konjugátumokat az ismert radiometrikus módszerrel határozunk meg.

A glükozilált és nem glükozilált hemoglobin koncentrációját a megfelelő hullámhosszon végzett abszorpció meghatározásával végezhetjük a reakciókeverékben az elválasztási lépés előtt vagy után, vagy meghatározhatjuk a hemoglobintartalmat az elválasztott frakcióban is. Ez utóbbinál úgy járunk el, hogy a hemoglobint ismételten oldjuk, majd abszorpciós vagy reflektometriás vizsgálatot végzünk az izolált frakciókon, ha szükséges, a szilárd fázison. Amennyiben fluoreszkáló jeladó molekulák mennyiségét kell meghatározni hemoglobin jelenlétében, akkor előnyösen olyan hullámhosszt alkalmazunk, amely a hemoglobin emissziós és abszorpciós hullámhossztartományán kívül esik. Hasonlóképpen, ha színezett jeladó molekulát alkalmazunk, a vizsgálati abszorpciós hullámhossz előnyösen kívül esik a hemoglobin abszorpciós tartományán, mint azt az 1. ábrán láthatjuk, ahol a hemoglobin (1) és a RESOS/amino-fenil-boronsav konjugátum és hemoglobin keverékének (2) abszorpcióspektrumát mutatjuk be. Mindazonáltal részleges interferencia várható, de ezt korrigálhatjuk a több hullámhosszon végzett mérések alapján végzett számításokkal.

A találmány egy előnyös kivitelezési módjánál a hemoglobint és a kötött jeladó boronsav-konjugátumokat mikrogyöngyökön és/vagy szűrőn vagy más szilárd fázison izoláljuk, majd reflektometriásan meghatározzuk a hemoglobin és a jeladó boronsav-konjugátum mennyiségét, vagy fényabszorpciós vizsgálattal, fluoreszcencia-vizsgálattal.

A találmány egy másik kivitelezési módjánál olyan mintákat vagy hemolizátum alikvot részeket alkalmazunk, amelyből az egyéb, a boronsavcsoportokkal szemben reakcióképes proteineket eltávolítottuk. így például az eritrocitákat a hemolízis előtt kimoshatjuk annak érdekében, hogy a plazmaproteint eltávolítsuk, mielőtt a mintában a glükozilált hemoglobint meghatározzuk. Más módszer szerint a hemolizátumot vagy teljes vérmintát ioncserés kezelésnek vethetjük alá egy szilárd fázisú elválasztóban, amikor is az összes olyan proteint eltávolítjuk, amelynek izoelektromos pontja a hemoglobiné alatt és/vagy felett van. Ez a tisztítás adott esetben része lehet a találmány szerinti vizsgálati módszer kivitelezésénél alkalmazott berendezésnek vagy készletnek.

A találmány egy különösen előnyös kivitelezési módjával azon jeladó molekula vagy konjugátum mennyiségét határozzuk meg, amely egy kompetitor vegyület jelenlétében kötődik a hemoglobinhoz. Ez a kompetitor vegyület lehet bármilyen cisz-diolt tartalmazó molekula, így például szorbit vagy mannit, vagy olyan boronsavat tartalmazó molekula, amely nem rendelkezik jeladó aktivitással.

A találmány szerinti módszer egy másik előnyös kivitelezési módjánál azon jeladó molekulák mennyiségét határozzuk meg, amelyek vagy a reakciókeverékben és/vagy az elválasztott frakcióban vannak jelen a hemoglobin elválasztását megelőzően és azt követően, és ily módon lehetővé válik kiszámítani azt ajeladó molekulamennyiséget, amelyet a hemoglobinhoz való kötés révén távolítottunk el.

Mivel a találmány egy meglehetősen alacsony kötési erősségen alapul (a cisz-diol-rész és a boronsavcsoport közötti asszociációs konstans értéke 10³ és 10⁵/molxl értékű), közvetlen sztöchiometrikus kötődés glükozilált hemoglobin és a jeladó boronsav-konjugátum között nem megy végbe. Továbbá, a találmány szerinti módszer olyan, hogy a hemoglobin összes glükozilcsoportja könnyen meghatározható a kötési reakció révén, így nagyobb kötött boronsav-konjugátum/hemoglobin arányt kapunk, mint amilyen az általában ismert módszereknél kapott, glükozilált hemoglobin/hemoglobin arány.

Kis mennyiségben a térben lévő szabad szénhidrátok is kötődhetnek a boronsavcsoportokhoz. Ezt a hatást kiküszöbölhetjük, ha a jeladó boronsav-konjugátumokat feleslegben alkalmazzuk. Előnyösen hússzoros moláros felesleget alkalmazunk, de ennél nagyobb és alacsonyabb mennyiségek is használhatók, attól függően, hogy melyik kiviteli formát alkalmazzuk. Természetesen az elválasztási technika hatásosságától függően háttérjel van. Ha nagyon hatásos elválasztást alkalmazunk, nagyobb felesleg is használható. Amennyiben nem használható nagy reagenskoncentráció, a glükozilált hemoglobin koncentrációját a mérések alapján kell számítani standardok alkalmazásával, amelyek ismert mennyiségű glükozilált hemoglobint tartalmaznak, és/vagy amelyeknek pontosan ismert az asszociációs konstansuk. Az ilyen standardok alkalmazása általában ismert a klinikai, laboratóriumi gyakorlatban.

A találmány szerinti eljárás kivitelezésénél tehát egy reagenskompozíciót alkalmazunk, amely kompozíció olyan molekulákból áll, amelyek egy vagy több boronsavcsoportot tartalmaznak, amelyek szabadon képesek reagálni a jeladó anyaghoz kötődött glükozilált hemoglobinok glükozilált csoportjaival, továbbá amelyek enzimatikus aktivitásúak, vagy színesek vagy fluoreszkálok, kemilumineszcenciás vagy radioaktív tulajdonságúak. Különösen előnyösek azok a kompozí8

HU 215 181 Β ciók, amelyek gyengén anionos jeladó csoportokat tartalmaznak.

A találmány vonatkozik továbbá egy analitikai vizsgálati készletre, amely a találmány szerinti módszer kivitelezéséhez használható, és amely a következőket tartalmazza:

a) egy reagens, amely egy jeladó molekulát tartalmaz, amely egy vagy több dihidroxi-boril-csoportból és annak sójából és egy jeladó molekulából álló konjugátumot tartalmaz,

b) egy, a mintából a hemoglobin elválasztására alkalmas eszköz, adott esetben puffersókkal vagy oldatokkal kombinálva.

A következő, nem korlátozó példákkal a találmány szerinti megoldást illusztráljuk közelebbről.

Készítményekre vonatkozó példák

1. készitménypélda

1. N-(Rezorufin)-4-karbonil-piperidin-4-karboxiN-hidroxi-szukcinimid-észter (RESOS) aminofenil-boronsavval képzett konjugátuma

A oldat: mg RESOS 1,5 ml dimetil-szulfoxidban oldva.

B oldat: m-amino-fenil-boronsav hemiszulfátsója 0,1 mólos nátrium-karbonát pufferban (pH=8) oldva, 15mg/ml, pH=8-ra beállítva.

0,5 ml A oldatot elkeverünk 2 ml B oldattal, a kapott keveréket szobahőmérsékleten 12 órán át inkubáljuk, majd HPLC segítségével tisztítjuk. A kapott konjugátum szerkezetét a 2. ábrán mutatjuk be.

2. készítménypélda

2. Fluoreszcein izotiocianát (FITC) aminofenil-boronsavval alkotott konjugátuma

A oldat: 3,9 mg FITC-t 1 ml dimetil-szulfoxidban oldunk.

B oldat: m-amino-fenil-boronsav-hemiszulfátsót

1,2 mólos karbonátpufferban (pH=9,5) oldunk, 1,86 mg/ml.

ml fenti A oldatot lassan 10 ml B oldathoz adagolunk állandó keverés közben, majd a kapott keveréket minimum 2 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a kapott FITC-amino-fenil-boronsav konjugátumot HPLC segítségével tisztítjuk. A kapott konjugátum szerkezetét 3. ábrán mutatjuk be.

3. készítménypélda

3. Jód-250-jelzett boronsav-konjugátum

A: Amino-fenil-boronsavat (APBA) 10 mg/ml 50 mM Na-foszfátban, (pH=7,5) Bolton-Hunter reagenssel (BH) 14,2 mg/ml DMSO-ba reagáltatunk oly módon, hogy a BH-t lassan adagoljuk az APBA-hoz azonos térfogatban. A kapott oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk.

B: A reakcióterméket fordított fázisú oszlopon választjuk el, metanol/víz gradiens alkalmazásával, amely 0,1 % trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmaz.

C: Az elválasztott BH-APBA reakcióterméket ¹²⁵INal-vel jelöljük klóramin-T módszer szerint.

0,5 ml BH-APBA frakciót elkeverünk 0,1 ml 0,25 mólos Na-foszfáttal (pH=7,5), majd a pH értékét 7,5-re beállítjuk. Ezután 10 μί ¹²⁵I-NaI-t adagolunk 100 pCi mennyiségben a frissen készített, 0,3 ml klóramin-T (10 mg/ml) mellett 0,25 mólos Na-foszfátban, pH=7,5, majd a kapott keveréket 1 percig inkubáljuk.

D: A reakciót 0,3 ml Na-biszulfit (24 mg/ml) 0,25 mólos Na-foszfátban (pH=7,5) adagolásával megállítjuk.

E: A jelzett BH-APBA-t fordított fázisú kromatográfiával elválasztjuk metanol/víz gradiens alkalmazásával, amely 0,1% TFA-t tartalmaz.

4. készítménypélda

4. Boronsav alkalikus foszfatázzal képzett konjugátuma mg alkalikus foszfatázt - amelyből a boronsavval reagálni képes enzimmolekulákat agarozzal töltött oszlopon immobilizált fenil-boronsavcsoportok segítségével eltávolítottuk - elkeverünk harmincszoros mólfeleslegben bisz(szulfo-szukcinimidil)-szuberáttal pH=8,5 pH-jú karbonátpufferban, és a keveréket szobahőmérsékleten 120 percen át állni hagyjuk, majd hozzáadunk 100-szoros moláris feleslegben monoetanolamint. 4 óra elteltével a kapott enzimkonjugátumot gélkromatográfiával tisztítjuk.

A hemoglobinnak a teljes vér hemolizátumból való közel specifikus kicsapását bemutató példák Fém-kationok:

A oldat: teljes vér hemolizátumot 50 mM ammónium-acetáttal pH=8-nál 6,4 mg hemoglobin/ml végső koncentrációra hígítunk.

B oldat: Cu(SO₄) sót vízben oldunk 10 mM Cu²⁺ koncentrációban.

C oldat: Zn(Cl)₂ sót vízben oldunk 10 mM Zn²⁺ koncentrációban.

5. készítménypélda μί B oldatot elkeverünk 200 μΐ A oldattal, majd a kapott keveréket szobahőmérsékleten 5 percen át inkubáljuk, és a hemoglobincsapadékot centrifugálással elválasztjuk.

6. készítménypélda μί C oldatot elkeverünk 200 μί A oldattal, a kapott keveréket szobahőmérsékleten 5 percig inkubáljuk, majd a kivált hemoglobincsapadékot centrifugálással elválasztjuk.

A találmány szerinti vizsgálati eljárást bemutató példák

1. példa

Az összes következő példában a találmány szerinti vizsgálati módszert a klasszikus ioncserés HPLC-módszerhez hasonlítottuk (a következőkben ioncserés módszer), amely a következő irodalmi helyen van ismertetve: (Jeppson, J. O. és munkatársai, Clinical Chemistry 32/10, 1867-1872, 1988).

HU 215 181 Β

Teljes vérmintát hemolizálunk, és a hemolizáló vizsgálati pufferral - 100 mM Hepes, 0,05% Triton X-100, (pH=9) - körülbelül 8 mg hemoglobin/ml koncentrációra hígítunk. Ezután 50tf%-os vizes butanol és fentiek szerinti FITC-amino-fenil-boronsav konjugátumot adagolunk olyan mennyiségben, hogy a végső butanolkoncentráció 9 tf% és a konjugátumkoncentráció 1,6* 10~⁴ M legyen. A képződött csapadékot centrifugálással nyert felülúszóból elválasztjuk. A csapadékot 0,05 mólos sósavban, amely még 5% dimetil-szulfoxidot is tartalmaz, feloldjuk, és a hemoglobinkoncentrációt abszorpciós spektroszkópiával, az FITC-amino-fenil-boronsav konjugátum koncentrációt fluoreszcencia-méréssel meghatározzuk. A hemoglobin és az FITC-amino-fenil-boronsav konjugátum koncentrációját kalibrációs görbék segítségével végzett interpolálással számítjuk ki ismert koncentrációjú hemoglobin és glükozilált hemoglobin oldatok alkalmazásával, majd meghatározzuk a glükozilált hemoglobin/összhemoglobin arányt.

A kapott eredmények a következők:
glükozilált hemoglobinmennyiség (%) (ioncserés módszer)	konjugátum/hemoglobin mólarány
4,8	0,284
7,8	0,344
11,7	0,431

2. példa

Teljes vérmintát hemolizálunk, majd hemolizáló vizsgálati puffer segítségével körülbelül 8 mg hemoglobin/ml koncentrációra hígítjuk, majd hozzáadunk FITC-aminofenil-boronsav konjugátumot, olyan mennyiségben, hogy a végső koncentráció 2x10^· M legyen. A kapott mintát 30 percig inkubáljuk, majd 50 tf% butanol/etanol elegyet adagolunk olyan mennyiségben, hogy a butanol végső koncentrációja 9 tf% legyen. A kapott csapadékot centrifugálással elválasztjuk, a csapadékot 0,05 mólos sósavban, amely még 5% dimetil-szulfoxidot is tartalmaz, feloldjuk, majd a hemoglobin és a konjugátum koncentrációját az 1. példában leírtak szerint meghatározzuk.

Az FITC-amino-fenil-boronsav konjugátum specifícitásának bizonyítására a 2. példában leírt vizsgálatot ismételtük meg azzal az eltéréssel, hogy 0,1 M mennyiségű szorbitot adagoltunk kompetitorvegyületként. Ez azt eredményezte, hogy a konjugátum hemoglobinhoz való kötése alacsony és nem specifikus volt, a kapott eredmények nem mutattak differenciát az alacsony és magas glükozilált hemoglobintartalmú minták között, mint az a következő eredményekből látható.

Eredmények szorbit adagolása nélkül: glükozilált hemoglobin- konjugátum/hemoglobin mennyiség (%) mólarány (ioncserés módszer)

4,4	0,259
7,1	0,340
11,4	0,473

A kapott eredmények szorbit adagolásával:

4,4 0,078

7,1 ' 0,066

11,4 0,083

3. példa

Az 1. példában leírtakat ismételjük meg, azzal az eltéréssel, hogy az elválasztást nem centrifugálással, hanem szűréssel végezzük. A teljes vérmintát hemolizáljuk, majd hemolizáló vizsgálati pufferral - 100 mM Hepes, 0,05% Triton X-100 (pH=9) - körülbelül 8 mg hemoglobin/ml koncentrációra hígítjuk. Ezután 50 tf% butanol/etanol elegyet és FITC-amino-fenil-boronsav konjugátumot adagolunk olyan mennyiségben, hogy a végső butanolkoncentráció 9 tf% és az FITC-aminofenil-boronsav konjugátum koncentráció 1,6^10^⁴ legyen. A képződött csapadékot szűréssel elválasztjuk, majd a csapadékban meghatározzuk a hemoglobin, valamint az FITC-amino-fenil-boronsav konjugátum mennyiségét. A kapott eredmények a következők:

glükozilált hemoglobin- konjugátum/hemoglobin mennyiség (%) mólarány (ioncserés módszer)

5,2 0,160

11,7 0,226

4. példa

Teljes vérmintát hemolizálunk, majd hemolizáló vizsgálati pufferral - 100 mM Hepes, 0,05% Triton X-100 (pH=9) - körülbelül 8 mg hemoglobin/ml koncentrációra hígítjuk, majd hozzáadunk 50 tf% butanol/etanol elegyet és fentiek szerinti RESOS-aminofenil-boronsav konjugátumot olyan mennyiségben, hogy a végső butanolkoncentráció 9 tf% és a konjugátumkoncentráció 1,6x1ο-⁴ mól legyen. A kapott csapadékot centrifugálással elválasztjuk, a csapadékot ismételten 0,05 mólos sósavban, amely még 5% dimetil-szulfoxidot is tartalmaz, oldjuk, majd meghatározzuk a hemoglobin és a RESOS-amino-fenil-boronsav konjugátum koncentrációját abszorpciós vizsgálattal. A hemoglobin és a RESOS-amino-fenil-boronsav konjugátum koncentrációját standard, ismert koncentrációjú kalibrációs görbékkel végzett intrapolálással állapítjuk meg és számítjuk a glükozilált hemoglobin %-os mennyiségét.

A kapott eredmények a következők: glükozilált hemoglobin- konjugátum/hemoglobin mennyiség (%) mólarány (ioncserés módszer) ^{* 5}

4,9 0,212

11,2 0,294

5. példa

A 4. példában leírtak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a csapadék elválasztását nem centrifugálással, hanem szűréssel végezzük. A teljes vérmintát hemolizáljuk, hemolizáló vizsgálati pufferral - 100 mM

HU215 181 Β

Hepes, 0,05% Triton X-100 (pH=9) - körülbelül 8 mg hemoglobin/ml koncentrációra hígítjuk, majd hozzáadunk 50 tf% butanol/etanol elegyet és RESOS-aminofenil-boronsavat olyan mennyiségben, hogy a butanol végső koncentrációja 9 tf% és a RESOS-amino-fenilboronsav végső koncentrációja Ι,όχΙΟ*⁴ M legyen. A kapott csapadékot szűréssel elválasztjuk, majd a hemoglobin és a RESOS-amino-fenil-boronsav konjugátum mennyiségét meghatározzuk.

A kapott eredmények a következők: glükozilált hemoglobin- konjugátum/hemoglobin mennyiség (%) mólarány (ioncserés módszer)

4,9 0,195

13,0 0,367

6. példa

Teljes vérmintát hemolizálunk, majd hemolizáló vizsgálati pufferral - 0,25 M ammónium-acetát, 0,05% Triton X-100 (pH=9) - körülbelül 8 mg hemoglobin/ml koncentrációra hígítunk, hozzáadunk Ι,όχΙΟ+Μ mennyiségű RESOS-amino-fenil-boronsav konjugátumot 30 mMZnCl₂-t tartalmazó oldatban, majd még 50 mM glicint. A kapott csapadékot ezután centrifugálással elválasztjuk, majd ismételten 0,25 mólos ammóniumacetát pufferban, amely még 30 mM EDTA-t is tartalmaz (pH=9), feloldjuk, majd meghatározzuk a hemoglobin, valamint a RESOS-amino-fenil-boronsav konjugátum koncentrációját abszorpciós spektroszkópiával.

A kapott eredmények a következők: glükozilált hemoglobin-, konjugátum/hemoglobin mennyiség (%) mólarány (ioncserés módszer)

4,9 0,384

13,0 0,449

7. példa

A 6. példában leírtak szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a csapadék elválasztását szűréssel végezzük, majd az így kapott csapadékban meghatározzuk a hemoglobin, valamint a RESOS-amino-fenil-boronsav konjugátum koncentrációját.

8. példa

Hepes pufferral elkevert hemolizált vérmintát jód125-jelzésű fentiek szerint nyert boronsav-konjugátumhoz adagoljuk, a hemoglobinkoncentráció 8 mg/ml.

perces inkubálás után 22 μί etanol/butanol=l/l elegyet adagolunk, majd a kiváló hemoglobint centrifúgálással elválasztjuk.

A csapadékot HCl/DMSO/víz elegyben feloldjuk, majd meghatározzuk a hemoglobintartalmat és a radioaktivitást.

A radioaktivitás/hemoglobin arány és a glükozilált hemoglobintartalom között szignifikáns korrelációt állapítottunk meg.

9. példa

Teljes vérmintát hemolizálunk, és hemolizáló vizsgálati puffénál -100 Hepes, 0,05% Triton X-100 (pH=9) körülbelül 8 mg hemoglobin/ml koncentrációra hígítjuk. Ezután RESOS-amino-fenil-boronsav konjugátumot adagolunk 2χ 10-⁴ M végső koncentrációban, majd CuSO₄-et adagolunk 2 mM végső koncentrációban. A kapott csapadékot ezután centrifúgálással elválasztjuk, a csapadékot ismételten 0,05 mólos sósavban, amely még 5% dimetilszulfoxidot tartalmaz, feloldjuk, majd meghatározzuk a hemoglobin, valamint a RESOS-amino-fenil-boronsav konjugátum koncentrációját az 1. példában leírtak szerint.

A kapott eredmények a következők: glükozilált hemoglobin- konjugátum/hemoglobin mennyiség (%) mólarány (ioncserés módszer)

4,6 0,524

12,0 0,617

10. példa

Teljes vérmintát hemolizálunk, és hemolizáló vizsgálati pufferral - 0,25 M ammónium-acetát, 0,05% Triton X-100 - körülbelül 8 mg hemoglobin/ml koncentrációra hígítjuk. Ezután hozzáadunk FITC-amino-fenilboronsav konjugátumot 2x10 ⁴ M végső koncentrációban, majd 33 tf%-nak megfelelő végső koncentrációban izopropanolt. A kapott csapadékot ezután centrifugálással elválasztjuk, a csapadékot 0,05 mólos sósavban, amely még 5% dimetil-szulfoxidot tartalmaz, ismételten feloldjuk, majd meghatározzuk a hemoglobin, valamint a FITC-amino-fenil-boronsav konjugátum koncentrációját az 1. példában leírtak szerint.

A kapott eredmények a következők: glükozilált hemoglobin- konjugátum/hemoglobin mennyiség (%) mólarány (ioncserés módszer)

4,8 0,260

12,5 0,398

11. példa

A 10. példában leírtak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a kicsapást 50 tf% végső koncentrációban jelen lévő tetrahidrofuránnal végezzük.

A kapott eredmények a következők: glükozilált hemoglobin- konjugátum/hemoglobin mennyiség (%) mólarány (ioncserés módszer)

4,8 0,255

12,5 0,429

12. példa

A 10. példában leírtak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a kicsapást 15 tf% végső koncentrációban jelen lévő Ν,Ν-dimetil-formamiddal végezzük.

HU215 181 Β

A kapott eredmények a következők:

glükozilált hemoglobin- konjugátum/hemoglobin mennyiség (%) mólarány (ioncserés módszer)

Claims (24)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás egy minta glükozilált hemoglobintartalmának meghatározására, azzal jellemezve, hogy

   a) a mintát adott esetben hemolizáljuk az összes sejthez kötött hemoglobin felszabadítására,

   b) az a) pont szerinti mintát vagy az alábbi c) pont szerint a mintából kinyert hemoglobint egy jeladó molekulával érintkeztetjük, amely egy, egy vagy több dihidroxil-boril-csoportból vagy ennek sójából és ehhez kapcsolódó jeladócsoportból álló konjugátum,

   c) a mintából vagy az előző b) pont szerinti reakciókeverékből elválasztjuk a glükozilált és nem glükozilált hemoglobint és minden hozzá kötődő molekulát, és

   d) meghatározzuk az elválasztott hemoglobinhoz és/vagy nem hemoglobinhoz kötődött jeladó molekulák mennyiségét.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a jeladó molekula nem immobilizált.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy b) és c) pont szerinti lépéseket egyidejűleg visszük végbe.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy további lépésben meghatározzuk a mintából elválasztott és nem glükozilált hemoglobin mennyiségét.
5. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az összhemoglobint az oldatból végzett szelektív kicsapással választjuk el.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiváló csapadékot kromatográfiával vagy szűréssel választjuk el.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kicsapást szilárd kromatográfiás vagy szűrési médiumokban végezzük.
8. 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás vagy szűrési médium egy vagy több valamely következő reagenst tartalmaz: hemoglobinkicsapó szer, 1. igénypont szerinti jeladó molekula, hemolizálószer vagy komplexképző szer.
9. 9. Az 5-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hemoglobin kicsapását cinkionok és/vagy rézionok és/vagy más, a hemoglobin kicsapására alkalmas fémkation adagolásával végezzük.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy még fémkomplexképző szert is adagolunk.
11. 11. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hemoglobin kicsapását a hemoglobin specifikus kicsapásához szükséges mennyiségű szerves oldószerrel vagy szerves oldószerek keverékével végezzük.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamely következő oldószert alkalmazunk: vízzel elkeverhető alkoholok, ketonok, éterek, amid oldószerek, szulfoxid oldószerek, szénhidrogénoldó szerek, halogénezett oldószerek vagy ezek keveréke.
13. 13. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hemoglobint hemoglobinspecifikus kötőprotein adagolásával csapjuk ki.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hemoglobin kicsapását valamely következő anyaggal végezzük: anti-hemoglobin antitestek vagy haptoglobinok vagy ezek fragmensei, adott esetben egy másodlagos antitest vagy anti-haptoglobin antitest vagy ezek fragmensei jelenlétében.
15. 15. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hemoglobin elválasztását szilárd fázison immobilizált hemoglobinspecifíkus kötőproteinnel végezzük.
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a jeladó molekula jelzése eltérő az alkalikus foszfát enzim jelzésétől.
17. 17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hemolízist hipotóniás lízissel, detergensek vagy guanidin adagolásával, hőkezeléssel, ultrahangos kezeléssel vagy ezek bármilyen kombinációjával végezzük.
18. 18. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a jeladó molekula kemilumineszcenciás, fluoreszcenciás tulajdonságú, színezett, radioaktív vagy enzimaktivitású.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a jeladó molekula N-(rezorufm)-4-karbonilpiperidin-4-karbonsav-N-hidroxi-szukcinimid-észterrel (RESOS) vagy más oxazinnal jelzett.
20. 20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több olyan reagenst alkalmazunk, amelyből a dihidroxi-boril-csoportokkal szemben reakcióképes molekulákat eltávolítottuk.
21. 21. Analitikai vizsgálókészlet az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárásnál történő alkalmazásra, azzal jellemezve, hogy a következőket tartalmazza:

    a) egy jeladó molekulát tartalmazó reagens, amely jeladó molekula egy, egy vagy több dihidroxi-borilcsoportból vagy ennek sójából és ehhez kapcsolódó jeladócsoportból álló konjugátum,

    b) egy, a mintából a glükozilált és nem glükozilált hemoglobin elválasztására alkalmas eszköz, adott esetben puffersókkal vagy pufferoldatokkal kombinálva.
22. 22. A 21. igénypont szerinti vizsgálókészlet, azzal jellemezve, hogy a b) pont szerinti hemoglobinelválasztásra alkalmas eszköz valamely következő: cinkionok és/vagy rézionok és/vagy más specifikus hemoglobin kicsapására képes kation, szerves oldószerek vagy szerves oldószerek keveréke, vagy adott esetben szilárd hordozón immobilizált hemoglobinra specifikus kötőprotein vagy annak fragmense.

    HU 215 181 Β

    25. A 21. igénypont szerinti vizsgálókészlet, azzal jellemezve, hogy még egy szilárd fázisú kromatográfiás vagy szűrőmédiumot is tartalmaz a kicsapott hemoglobin elválasztására.

    5 26. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás és a 21-25. igénypontok bármelyike szerinti analitikai vizsgálókészlet, azzal jellemezve, hogy diabetes mellitus in vitro diagnosztizálására vagy kimutatására alkalmazzuk.
23. 23. A 21. igénypont szerinti vizsgálókészlet, azzal jellemezve, hogy cinket vagy más, hemoglobin kicsapására képes fémiont tartalmaz hemoglobinelválasztó reagensként komplexálószerrel együtt.
24. 24. A 21-23. igénypontok bármelyike szerinti vizsgálókészlet, azzal jellemezve, hogy az a) pont szerinti reagenst és/vagy a b) pont szerinti, hemoglobin elválasztására alkalmas eszközt egy szilárd fázisú kromatográfiás vagy szűrőmédiumban tartalmazza.