JPWO2002021142A1 - 総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、試料中の総ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンとを１チャンネルで測定し得る総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの連続測定方法、並びにそれに用いられる測定用キットに関するものであり、「試料をヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理に付した後、吸光度を測定しその結果に基づいて試料中のヘモグロビンの量を求め、次いで試料中の糖化ヘモグロビン量を測定することからなるヘモグロビン類の測定方法」、「ヘモグロビンの構造を変化させるものを含んでなる成分と、糖化ヘモグロビン又はそれから誘導されるものを基質とする過酸化水素生成酵素を含んでなる成分との組合せからなるヘモグロビン類測定用キット」、並びに「ヘモグロビンの構造を変化させるものを含んでなる成分と、抗糖化ヘモグロビン抗体を含んでなる成分との組合せからなるヘモグロビン類測定用キット。」を提供する。
Description
技術分野
本発明は、試料中の総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの連続測定方法、並びに当該方法に用いられる総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの測定用キットに関する。
技術背景
ヘモグロビンは、赤血球中に含まれる色素蛋白で酸素の運搬を担っているものであり、この中の糖化ヘモグロビンは、拡散により赤血球に入り込んだ、血液中の糖（単糖類）の還元末端と、ヘモグロビンのα鎖及びβ鎖の遊離のアミノ基が非酵素的にシッフ塩基により結合して形成された不安定なアルドイミン（不安定型）が、更にアマドリ転移により安定なケトアミン（安定型）へと移行することにより生成されるアマドリ化合物の一種である。総ヘモグロビン中の糖化ヘモグロビンの濃度は過去１〜２ヶ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映すると言われていることから、糖尿病の診断マーカーとして広く利用されている。
糖化ヘモグロビンの測定は、液体クロマトグラフィー法や抗体法等により行われているが、総ヘモグロビンの測定と組み合わせて１チャンネルで測定する方法は、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの測定感度や測定波長の違いから、未だ実現されておらず、その開発が強く望まれている。
本発明は、上記した如き状況に鑑み、試料中の総ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンとを１チャンネルで測定し得る総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの連続測定方法、並びにそれに用いられる測定用キットの提供にある。
発明の開示
本発明は上記課題を解決する目的でなされたものであり、
「試料をヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理に付した後、吸光度を測定しその結果に基づいて試料中のヘモグロビンの量を求め、次いで試料中の糖化ヘモグロビン量を測定することからなるヘモグロビン類の測定方法」、
「ヘモグロビンの構造を変化させる成分を含んでなる試薬と、糖化ヘモグロビン又はそれから誘導されるものを基質とする過酸化水素生成酵素又は抗糖化ヘモグロビン抗体を含んでなる試薬との組合せからなるヘモグロビン類測定用キット。」、
「（１）ヘモグロビンの吸光度を安定化させる試薬を含んでなる第一試薬と、プロテアーゼ試薬を含んでなる第二試薬と、糖化ヘモグロビン由来基質の過酸化水素生成酵素、ペルオキシダーゼ及び被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るキット、（２）ヘモグロビンの吸光度を安定化させる試薬を含んでなる第一試薬と、プロテアーゼ試薬及び糖化ヘモグロビン由来基質の過酸化水素生成酵素を含んでなる第二試薬と、ペルオキシダーゼ及び被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とからなるキット、或いは（３）ヘモグロビンの吸光度を安定化させる試薬を含んでなる第一試薬と、プロテアーゼ試薬及び被酸化呈色試薬を含んでなる第二試薬と、糖化ヘモグロビン由来基質の過酸化水素生成酵素及びペルオキシダーゼを含んでなる第三試薬とから成るキット、（４）ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体試薬を含んでなる第二試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体に対するポリハプテン試薬を含んでなる第三試薬とから成るキットの何れかからなるヘモグロビン類測定用三試薬系キット。」に関する。
本発明者らは、試料中の総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの測定が１チャンネルで測定可能な測定法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、試料をヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理に付した後、吸光度を測定し、その結果に基づいて試料中のヘモグロビンの量を求め、次いで試料中の糖化ヘモグロビン量を測定することで、試料中の総ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンとを１チャンネルで連続して測定し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
発明を実施するための最良の形態
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理としては、ヘモグロビンの構造を変化させる方法が挙げられ、かかる処理としては例えばヘモグロビンのヘム部の構造を変化させる処理及びヘモグロビンのグロビン部の構造を変化させる処理等が挙げられる。
具体的には、前者にあっては、ヘモグロビンを例えば亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等のアルカリ金属亜硝酸塩や、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム等のフェリシアン化化合物等で処理しメトヘモグロビンに変化させた後、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム等のシアン化化合物又はアジ化ナトリウム、アジ化カリウム等のアジ化化合物で処理し、ヘモグロビンをシアンメトヘモグロビン又はアジドメトヘモグロビンに変化させることによりなされ、より具体的には、ヘモグロビンを例えばフェリシアン化カリウム及びシアン化カリウム或いは亜硝酸ナトリウム及びナトリウムアジド等の組み合わせで、例えば国際標準Ｈｂ測定法や特公昭５８−４４９８５に記載の公知の方法に従って処理することによって行われる。
また、後者にあっては、ヘモグロビンをアルカリ、酸、蛋白変性剤、プロテアーゼ、界面活性剤等と接触させることによってなされ、これらの処理によりヘモグロビンのグロビン部の構造が不可逆的に変化するとされている。具体的に構造がどの様に変化したかは必ずしも明らかではないが、かかる処理によって結果的にヘモグロビンの吸光度が安定化されるという目的が達成できる。これらアルカリ、酸、蛋白変性剤、プロテアーゼ、界面活性剤等とヘモグロビン含有試料を接触させる方法としては、例えばこれらの物質とヘモグロビン含有試料とを混合させる方法、ヘモグロビン含有試料にこれら物質或いはそれを含む溶液を添加する方法等が挙げられる。尚、これらの物質は単独で用いてもよく、また２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させるためのアルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化アルカリ、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液等が挙げられるが、中でも水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化アルカリが好ましい。尚、測定時の反応液中のｐＨが、通常１０〜１３．７、好ましくは１２．７〜１３．７になるようにこれらのアルカリの種類、濃度等を選定する。
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させるための酸としては、例えば塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸、例えば酒石酸、クエン酸、酢酸、コハク酸、フマル酸等のカルボン酸等が挙げられるが、中でも塩酸、酒石酸、クエン酸等が好ましい。尚、測定時の反応液中のｐＨが、通常１．０〜４．５、好ましくは１．０〜３．５になるようにこれらの酸の種類、濃度等を選定する。
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させるための蛋白変性剤としては、例えばアセトン、テトラヒドロキシフラン、ｔｅｒｔ−ブタノール、イソプロパノール等の水溶性有機溶媒、二クロム酸カリウム、二クロム酸アンモニウム、二酸化マンガン、二酸化鉛、硫化鉛等の重金属塩、塩酸グアニジン、尿素等が挙げられ、中でも塩酸グアニジン、尿素等が好ましい。尚、測定時の反応液中の濃度としては、通常０．１〜３０％、好ましくは０．５〜１５％である。
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させるためのプロテアーゼとしては、例えばトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、ズブチリシン、カテプシン、プロナーゼ、プロティナーゼＫ、パパイン、ブロメライン、エラスターゼ、サーモリシン、ペプシン、モルシン等が挙げられるが、中でもプロナーゼ、プロティナーゼＫ、エラスターゼ、キモトリプシン等が好ましい。尚、その使用濃度は、測定時の反応液中の濃度として、通常０．１〜１００００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．３〜７０００Ｕ／ｍｌである。
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させるための界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤の何れでもよく、非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられ、陽イオン性界面活性剤としては、例えば脂肪族アミン塩、脂肪族４級アンモニウム塩等が挙げられ、陰イオン性界面活性剤としてはカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩等が挙げられ、両性界面活性剤としては、例えばカルボキシベタイン類、スルホベタイン類、グリシン類、アラニン類、２−アルキルイミダゾリンの誘導体類、アミンオキサイド類等が挙げられる。
さらに、非イオン性界面活性剤である、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等が挙げられ、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレエート等が挙げられ、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等が挙げられ、ソルビタン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート等が挙げられ、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルの具体例としては、例えばテトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール等が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルアミンの具体例としては、例えばポリオキシエチレンラウリルアミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等が挙げられ、グリセリン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等が挙げられ、脂肪酸アルカノールアミドの具体例としては、例えばラウリン酸ジエタノールアミド等が挙げられ、ショ糖脂肪酸エステルの具体例としては、例えばショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル等が挙げられる。
陽イオン性界面活性剤である、脂肪族アミン塩としては、モノラウリルアミン、モノステアリルアミン、ジステアリルアミン、トリステアリルアミン等の高級脂肪族アミン等と、塩酸、硫酸等の無機酸或いは酢酸、乳酸、クエン酸等の低級カルボン酸等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルアミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩等が挙げられ、脂肪族４級アンモニウム塩としては、ラウリルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム等の高級脂肪族アンモニウム等と塩素、臭素等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロライド等が挙げられる。
陰イオン性界面活性剤である、カルボン酸塩としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ、具体的には例えばオレイン酸カリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム等が挙げられ、スルホン酸塩としては、ラウリルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸、ジプロピルナフタレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸等のナフタレンスルホン酸、ジオクチルスルホコハク酸等のスルホコハク酸等と、ナトリウム等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等が挙げられ、硫酸エステル塩としては、ラウリル硫酸エステル等の高級アルコール硫酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸等エステルのポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸等エステルと、ナトリウム、アンモニウム等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等の高級アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩エステル等が挙げられ、リン酸エステル塩としては、モノステアリルリン酸エステル、モノラウリルリン酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ、具体的には例えばモノステアリルリン酸ナトリウム、モノラウリルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸カリウム等が挙げられる。
両性界面活性剤である、カルボキシベタイン類の具体例としては、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられスルホベタイン類の具体例としては、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン等が挙げられ、グリシン類の具体例としては、ラウリルジアミノエチルグリシンナトリウム等が挙げられ、２−アルキルイミダゾリンの誘導体類の具体例としては、２−ラウロイル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等の２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられ、アミンオキサイド類の具体例としては、ラウリルジメチルアミンオキサイド等が挙げられる。
尚、これら界面活性剤の使用濃度は、測定時の反応液中の濃度として、通常０．１〜２０％、好ましくは０．５〜１０％である。
ヘモグロビンの吸光度を安定化させるために用いられる上記した各種試薬の中でも、界面活性剤が特に好ましいものとして挙げられ、更に、界面活性剤にプロナーゼ、プロティナーゼＫ、エラスターゼ、キモトリプシン等のプロテアーゼを併用するものがより好ましい。これら界面活性剤の中でも、短時間でヘモグロビンの吸光度を安定化させることができ、酵素への影響が少ない両性界面活性剤が好ましく、中でもラウリルジメチルアミンオキサイド等のアルキルジメチルアミンオキサイド、Ｎ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が好ましく、その中でも、ラウリルジメチルアミンオキサイド等のアルキルジメチルアミンオキサイドがより好ましい。尚、上記で挙げた界面活性剤は、２種類以上を適宜選択して用いてもよい。
本発明のヘモグロビン類の測定方法は、例えば以下の様に実施される。
即ち、先ず生体由来試料を、ヘモグロビンの吸光度を安定化させるための上記した如き処理に付す。試料とヘモグロビンの吸光度を安定化させるための上記した如き成分との接触時間は、通常２〜１２０分、好ましくは２〜６０分であり、例えば両性界面活性剤であるラウリルジメチルアミンオキサイドを用いる場合、ラウリルジメチルアミンオキサイド水溶液と試料とを混合し、２〜６０分放置する。このような処理を施した後、該試料の吸光度を測定しその値から試料中のヘモグロビン量を求め、次いで該試料中の糖化ヘモグロビンを測定する。
試料中の糖化ヘモグロビンを測定する方法は、酵素的測定法でも免疫学的測定法でも何れでもよいが、例えば酵素的測定法としては、糖化ヘモグロビン又はそれから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を基質とする過酸化水素生成酵素を用いる方法、糖化ヘモグロビンを基質とする脱水素酵素とＮＡＤ（Ｐ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ等の補酵素とを組み合わせて用いる方法等が挙げられ、例えば免疫学的測定法としては、抗糖化ヘモグロビン抗体を用いる方法等が挙げられる。
酵素的測定法のうち、例えば糖化ヘモグロビン又はそれから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を基質とする過酸化水素生成酵素を用いて糖化ヘモグロビンを測定するには、例えば以下の如くして実施すればよい。
即ち、ヘモグロビンの吸光度を安定化させるための処理に付した後の試料（以下、安定化処理試料と略記する）を、糖化ヘモグロビン又はそれから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を基質とする過酸化水素生成酵素と接触させて過酸化水素を生成させる。生成した過酸化水素に例えばペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略記する）と被酸化性呈色試薬（例えばカップラーとデベロッパーとの組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を作用させて色素を生成させ、生成した色素量を吸光度として測定し、得られた吸光度に基づいて生体由来試料中の糖化ヘモグロビン量を算出する。尚、上記のようなＰＯＤを用いた定量法において、ヘモグロビンや赤血球、血漿に含まれる物質等によるＰＯＤ呈色反応の妨害を防止又は回避する方法（例えば特開平３−１０６９６号公報記載の方法）が知られているが、これらの方法を本発明に組み合わせて実施してもよい。また、上記の被酸化性呈色試薬により色素を生成させ生体由来試料中の糖化ヘモグロビン量を算出する代わりに、公知の電極法により、過酸化水素生成酵素により生成した過酸化水素量又は減少した酸素量を測定し、その結果に基づいて生体由来試料中の糖化ヘモグロビン量を算出しても良い。
上記の糖化ヘモグロビンから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を基質とする過酸化水素生成酵素を用いて糖化ヘモグロビンから過酸化水素を生成させるためには、当該糖化ヘモグロビンを適当なプロテアーゼと接触させて糖化ヘモグロビンに由来する糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を生成させる必要がある。
このようなプロテアーゼ処理は例えば以下のようにして行われる。
▲１▼ヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理を行う際にプロテアーゼを添加する方法（尚、ヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理をプロテアーゼを用いて行う場合は、添加しなくてもよい場合がある）。
▲２▼適当なプロテアーゼ或いはこれを含む適当な溶液を、ヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理前の試料と混合する方法。
▲３▼適当なプロテアーゼを上記した如き過酸化水素生成酵素と共に安定化処理試料と接触させる方法。
このような目的で用いられるプロテアーゼとしては、糖化ヘモグロビンから、過酸化水素生成酵素の基質となり得る糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を遊離させるものであれば特に限定されないが、通常この分野で使用されているもの、例えば、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、ズブチリシン、カテプシン、ブロナーゼ、プロティナーゼＫ、パパイン、ブロメライン、エラスターゼ、サーモリシン、ペプシン、モルシン等は全て使用可能であり、中でも、プロナーゼ、プロティナーゼＫ、エラスターゼ、キモトリプシン等が好ましい。また、これらは適宜組み合わせて用いてもよい。また、これらの使用量としては、特に制約はされないが、例えば、反応液中の濃度として、通常０．１〜１００００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．３〜７０００Ｕ／ｍｌである。
また、糖化ヘモグロビンとプロテアーゼとを接触させる場合に、試料中に共存する糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質がプロテアーゼとの反応に関与するのを防止または阻害するために、例えば糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質に対する抗体や水溶性ポリマー等を共存させてもよい。
このような抗体としては、糖化蛋白質の糖鎖部分に結合する抗体でも蛋白質部分に結合する抗体でも、或いは糖鎖と蛋白質との結合部分に結合する抗体の何れでもよいが、中でも抗全血抗体から糖化ヘモグロビンに対する抗体を除いたものが好ましい。また、該抗体は、血清中の含量が比較的多い糖化蛋白質に対する抗体、例えば、抗アルブミン抗体、抗高比重リポ蛋白抗体、抗低比重リポ蛋白抗体、抗トランスフェリン抗体、抗アンチトリプシン抗体等の中から目的に応じて適宜選択して用いることもでき、単独でも、適宜組み合わせて用いてもよい。
その濃度は、糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質がプロテアーゼと反応しなくなる濃度であればよいが、例えば、測定時の反応液中の濃度が、通常０．０１〜１０ｍｇＡｂ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜１ｍｇＡｂ／ｍｌとなるように使用される。
これら抗体は、通常この分野で使用されているものであればポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の区別なく全て使用可能であり、市販品でも、自体公知の調製方法（例えば、エンザイムイムノアッセイ、石川栄治著，１９８９，東京化学同人等に記載の方法）に準じて調製されたもの何れでもよい。また、これらは、必要に応じて、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法により精製したものを用いてもよい。
また、共存する糖化蛋白質の関与を防止または阻害する水溶性ポリマーとしては、例えばポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン，ポリビニルアルコール等の合成高分子化合物、並びに例えばデキストラン，デキストラン硫酸又はその塩，コンドロイチン硫酸又はその塩等の多糖類が挙げられるが、中でもポリエチレングリコール、デキストラン等が好ましい。また、その使用濃度は、測定時の反応液中の濃度として、通常５〜４０％、好ましくは５〜２０％である。また、これらは、自体公知の方法に従い調製したものを用いても、市販品を用いてもよい。
本発明に於いて用いられる過酸化水素生成酵素としては、通常この分野で使用されているものは全て使用可能であるが、例えば、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミンデグリカーゼ等があげられ、具体的にはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（特公平５−３３９９７号公報、特公平６−６５３００号公報）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｓ）属（特願平９−５２０３７１号再公表特許公報）、フサリウム属（特開平７−２８９２５３号公報、特開平１０−２０１４７３号公報）、カンジダ属（特開平６−４６８４６号公報）等の微生物に由来するもの等が挙げられる。また、その濃度は、反応液中の濃度として、通常０．５〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは２〜５０Ｕ／ｍｌである。
本発明に於いて用いられるＰＯＤとしては、例えば、西洋ワサビ、大根等の植物に由来するもの、カビ、酵母等の微生物に由来するもの、動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等が挙げられる。ＰＯＤの使用量としては、例えば試液中の濃度として、通常０．１〜１０００ｕ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜４００ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜２００ｕ／ｍｌであり、また、最終反応液中の濃度として、通常０．１〜２５０ｕ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜１００ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜５０ｕ／ｍｌである。
本発明に於いて用いられる被酸化性呈色試薬としては、ＰＯＤの存在下、過酸化水素と反応して呈色するものであればよいが、例えば４−アミノアンチピリン（以下、４−ＡＡと略記する）等のカップラー及び、該カップラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロッパーとの組合せ、即ち、例えば４−ＡＡとフェノール系化合物、ナフトール系化合物若しくはアニリン系化合物の組合せ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物の組合せ等や、例えば２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンチジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、ｏ−フェニレンジアミン誘導体等のロイコ型発色剤等が挙げられるが、中でも、高感度であるロイコメチレンブルー誘導体が好ましい。
カップラーとデベロッパーとの組合せを用いる場合、カップラーの使用量としては、用いるカップラーの種類や組み合わせるデベロッパーの種類等により異なるが、例えば試液中の濃度として、通常０．０１〜４００ｍＭ、好ましくは０．１〜４０ｍＭであり、最終の反応液中の濃度として、通常０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭの範囲である。まだ、ロイコ型発色剤を用いる場合、その使用量は用いる発色剤の種類などにより異なるが、例えば試液中の濃度として、通常０．０１〜４００ｍＭ、好ましくは０．０１〜４０ｍＭであり、最終の反応液中の濃度として、通常０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭの範囲である。
本発明に於ける糖化ヘモグロビンの免疫学的測定方法に於いて、抗糖化ヘモグロビン抗体を用いた測定法としては、例えば免疫比濁法、ラテックス免疫凝集法、免疫阻害比濁法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定方法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定方法（ＦＩＡ）等が挙げられる。これらのうち、例えば免疫比濁法の場合、具体的には以下の様に実施される。
即ち、安定化処理試料を抗糖化ヘモグロビン抗体と接触させて、糖化ヘモグロビンと抗糖化ヘモグロビン抗体との複合体を生成させる。該複合体の生成による濁度の変化を測定し、測定値より糖化ヘモグロビン量を算出する。尚、ここで用いられる抗糖化ヘモグロビン抗体とは、糖化ヘモグロビン又は／及び糖化ヘモグロビン由来の糖化ペプチドに対して免疫反応を持つ抗体のことである。
また、例えば免疫阻害比濁法を用いる場合、以下の様に実施される。
即ち、安定化処理試料を抗糖化ヘモグロビン抗体と接触させて、糖化ヘモグロビンと抗糖化ヘモグロビン抗体とを反応させる。反応終了後、反応液の吸光度を測定し、更に反応液に抗糖化ヘモグロビン抗体に対するポリハプテンを添加し、未反応の抗糖化ヘモグロビン抗体と反応させ、免疫複合体を形成させる。該免疫複合体の生成による濁度の変化（吸光度変化）を測定し、当該測定値より糖化ヘモグロビン量を算出する。尚、ここで用いられる抗糖化ヘモグロビン抗体とは、糖化ヘモグロビン又は／及び糖化ヘモグロビン由来の糖化ペプチドに対して免疫反応を持つ抗体のことである。
本発明に係る試薬や溶液に於いては、通常緩衝剤が含まれるが、ここで用いることの出来る緩衝剤としては、例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等の通常酵素活性測定法、免疫比濁法、免疫比ろう法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定方法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定方法（ＦＩＡ）等で用いられている緩衝剤であればよく、その濃度は通常１０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは２０ｍＭ〜５００ｍＭで、ｐＨは通常３〜１２好ましくは５〜１０である。本発明に係るキットは、少なくとも二試薬を有するものであり、全血中の総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを測定するために使用されるものであり、例えば糖化ヘモグロビンを酵素的測定法で測定するキットとしては、例えば▲１▼ヘモグロビンの吸光度を安定化させるための処理剤（以下、「ＨＢ安定化剤」と略記する。）、▲２▼プロテアーゼ試薬、▲３▼糖化ヘモグロビン又はそれから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を基質とする過酸化水素生成酵素（以下、「糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素」と略記する）、▲４▼ＰＯＤ、▲５▼被酸化呈色試薬等からなり、酵素的測定法で糖化ヘモグロビンを測定するものであればよい。更にこのうち、二試薬系キットの場合、▲１▼ＨＢ安定化剤を第一試薬に含み、且つ▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬の何れか少なくとも一つが第二試薬に含まれているものであればよく、（ｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ、及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第二試薬とから成るもの、（ｉｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤及び▲２▼プロテアーゼ試薬を含んでなる第一試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ、及び▲５▼被酸化呈色試薬等を含んでなる第二試薬とから成るもの等が挙げられ、三試薬系キットの場合、▲１▼ＨＢ安定化剤を第一試薬に含み、且つ▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬の何れか少なくとも一つが第三試薬に含まれているものであればよく、（ｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬を含んでなる第二試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るもの、（ｉｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬及び▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素を含んでなる第二試薬と、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るもの、（ｉｉｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤及び▲２▼プロテアーゼ試薬を含んでなる第一試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素を含んでなる第二試薬と、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るもの、（ｉｖ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第二試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素及び▲４▼ＰＯＤを含んでなる第三試薬とから成るもの等が挙げられる。
更にまた、例えば免疫学的測定法で糖化ヘモグロビンを測定する場合、第一試薬にＨＢ安定化剤を含み、且つ免疫学的測定法で糖化ヘモグロビンを測定するものであればよく、（ｉ）例えばＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体試薬を含んでなる第二試薬とからなるもの、（ｉｉ）例えばＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体試薬含んでなる第二試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体に対するポリハプテン試薬を含んでなる第三試薬とからなるもの等が挙げられる。
上記本発明に係るキットの中でも、（ｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬を含んでなる第二試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ、及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るもの、（ｉｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬及び▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素を含んでなる第二試薬と、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るもの、（ｉｉｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第二試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素及び▲４▼ＰＯＤを含んでなる第三試薬とから成るもの等の酵素的測定法を用いるキット、（ｉｖ）例えばＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体試薬を含んでなる第二試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体に対するポリハプテン試薬を含んでなる第三試薬とからなるもの等の免疫学的測定法を用いるキット等が好ましい。これらの中でも上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の酵素的測定法を用いるキットがより好ましい。
尚、各キットに於ける各試薬中の各成分の濃度は、これら各キットを所定の標準操作法に従って測定を行う際の反応液中の濃度が上記した如き範囲となるように設定すればよい。
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。尚、実施例及び参考例に於いて使用される略称の正式名称は下記の通りである。
ＳＤＳ；ドデシル硫酸ナトリウム
ソフダゾリンＣＬ；２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン
アンヒトール２０Ｎ（花王株式会社製）；ラウリルジメチルアミンオキサイド
トリトンＸ−１００；ポリオキシエチレングリコールρ−ｔ−オクチルフェニルエーテル
ＨＥＰＥＳ；２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸
ＮＥＭ；Ｎ−エチルマレイミド
ＦＡＯＤ；フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
ＤＡ−６７；１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩
ＴＴＡＢ；テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド
ＭＥＳ；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
実施例
実施例１
日立７１７０形自動分析装置（（株）日立製作所製）を使用して、本発明に係るヘモグロビンの吸光度安定化処理によるヘモグロビン由来の吸光度の変化を測定した。
〔検体〕
ヘモグロビン濃度が１５ｇ／ｄｌのヒト全血（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）を用いた。また、該試料と第一試薬（前処理液）とを１：５で混合したものを、自動分析装置用検体とした。
〔試薬〕
第一試薬（前処理液）：１０％ ＳＤＳ水溶液
第二試薬（Ｒ１） ：２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）
〔測定方法〕
日立７１７０形自動分析装置を用い、以下の測定条件で実験を行った。その結果を図１に示す。尚、図中の縦軸は８００／６６０ｎｍの吸光度、横軸は測光ポイントを表す。
〔測定条件〕
測定方法；１ポイントエンド法〔３４〕−〔０〕
検体量 ； １５μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
測定波長；８００ｎｍ（副波長）／６６０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
〔結果〕
図１の結果から、ＳＤＳを用いることによりヘモグロビン由来の吸光度を５ポイント目（約９０秒間）までで安定化させることが出来るようになることが判る。
実施例２
日立７１７０形自動分析装置（（株）日立製作所製）を使用して、本発明の測定法により全血中の総ヘモグロビン量を測定した。
〔検体〕
ヘモグロビン濃度が既知であるヒト全血（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）を生理食塩水で５段階希釈したものを検体とした。
〔試薬〕
第一試薬（Ｒ１）：１０００Ｕ／ｍｌキモトリプシン及び２％ソフダゾリンＣＬを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）
〔測定方法〕
日立７１７０形自動分析装置を用い、以下の測定条件で実験を行った。得られたヘモグロビン濃度と吸光度の関係を図２に示す。尚、図中の縦軸は８００／６６０ｎｍの吸光度（ヘモグロビンの色）、横軸はヘモグロビンの濃度を表す。 〔測定条件〕
測定方法；１ポイントエンド法〔１６〕−〔０〕
検体量 ；２．５μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
測定波長；８００ｎｍ（副波長）／６６０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
〔結果〕
この結果より、総ヘモグロビン濃度と吸光度が良好な検量関係にあること、言い換えれば本発明に係る総ヘモグロビン測定方法により総ヘモグロビン濃度を精度よく測定し得ることが判る。
実施例３
日立７１７０形自動分析装置（（株）日立製作所製）を使用して、本発明の測定法によりＨｂＡ１ｃコントロール「ロシュ」中のヘモグロビンＡ１ｃ濃度を測定した。
〔検体〕
ＨｂＡ１ｃコントロールＮ「ロシュ」（ＨｂＡ１ｃ：０．６０ｇ／ｄｌ）とＨｂＡ１ｃコントロールＰ「ロシュ」（ＨｂＡ１ｃ：１．３３ｇ／ｄｌ）とを、５：０、４：１、３：２、２：３、１：４、０：５で混合し、さらに、これらを下記の第一試薬（前処理液）と１：５で混合したものを自動分析装置用検体とした。
〔試薬〕
第一試薬（前処理液）：１５％ アンヒトール２０Ｎ水溶液
第二試薬（Ｒ１） ：２００Ｕ／ｍｌ エラスターゼ及び２ｍＭ ＮＥＭを含む
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）
第三試薬（Ｒ２） ：２０Ｕ／ｍｌ ＦＡＯＤ、５０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ及び０．５ｍＭ ＤＡ−６７を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）
〔測定方法〕
日立７１７０形自動分析装置を用い、以下の測定条件で実験を行った。本測定法で得られた吸光度とヘモグロビンＡ１ｃ濃度の関係を図３に示す。図中の縦軸は８００／６６０ｎｍの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸は糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１ｃ）の濃度を表す。
〔測定条件〕
測定方法；２ポイントエンド法〔１６〕−〔３４〕
検体量 ； １５μｌ
Ｒ１ ； １８０μｌ
Ｒ２ ； ６０μｌ
測定波長；８００ｎｍ（副波長）／６６０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
〔結果〕
この結果より、糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１ｃ）濃度と本発明の測定による吸光度が良好な検量関係にあること、言い換えれば本発明に係る糖化ヘモグロビン測定により糖化ヘモグロビン濃度を精度よく測定し得ることが判る。
実施例４
日立７１７０形自動分析装置（（株）日立製作所製）を使用して、本発明の測定法により全血１０検体（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）の総ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度について測定した。
〔検体〕
全血１０検体（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）と第一試薬（前処理液）とを、１：５で混合したものを検体とした。
〔試薬〕
第一試薬（前処理液）：トリトンＸ−１００を７％含む２５０ｍＭ酒石酸−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ１．５）
第二試薬（Ｒ１） ：２０Ｕ／ｍｌ プロティナーゼＫ及び１ｍＭ ＮＥＭを含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）
第三試薬（Ｒ２） ：２０Ｕ／ｍｌ ＦＡＯＤ、５０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ及び０．５ｍＭ ＤＡ−６７を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）
〔測定方法〕
日立７１７０形自動分析装置を用い、以下の測定条件で実験を行い、得られた測定値を、各種濃度の総ヘモグロビン溶液又は各種濃度の糖化ヘモグロビン溶液を検体とした以外は実施例２，３と同様の方法により予め求めた総ヘモグロビン溶液又は糖化ヘモグロビン溶液と吸光度との関係を表す検量線に当てはめ、全血１０検体の総ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）及び糖化ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）を求めた。全血１０検体のうちＮｏ．８のタイムコースを図４に示す。また、総ヘモグロビンの測定結果を表１に、糖化ヘモグロビンの測定結果を表２に夫々示す。尚、図４に於いて、縦軸は縦軸は８００／６６０ｎｍの吸光度、横軸は時間（測光ポイント）を表す。
〔測定条件〕
測定方法；３ポイント法
測定ポイント（ヘモグロビン濃度）； 〔１６〕−〔０〕
測定ポイント（糖化ヘモグロビン濃度）； 〔１６〕−〔３４〕
検体量 ； １５μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
Ｒ２ ； ６０μｌ
測定波長；８００ｎｍ（副波長）／６６０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
参考例１
実施例４と同じ検体について、ロシュ（株）製のリキテックＨｂＡ１ｃＩＩ（免疫阻害比濁２チャンネル法）を使用して、ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度（ｇ／ｄｌ）を求めた。
〔検体〕
検体として、全血１０検体（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）とリキテックＨｂＡ１ｃＩＩの第一試薬（前処理液）とを、１：１００で混合したものを検体とした。
〔測定方法〕
リキテックＨｂＡ１ｃＩＩを用い、以下の測定条件で、全血１０検体のヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）及び糖化ヘモグロビン濃度（ヘモグロビンＡ１ｃ）（ｇ／ｄｌ）を求めた。得られた総ヘモグロビンの測定結果を表１に、得られた糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１ｃ）の測定結果を表２に夫々実施例４の結果と併せて示す。
〔測定条件〕
▲１▼ヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定（チャンネル１）
測定方法；２ポイントエンド法〔１６〕−〔３４〕
検体量 ； ７．２μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
Ｒ２ ； ３６μｌ
測定波長；７００ｎｍ（副波長）／３４０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
▲２▼ヘモグロビン濃度測定（チャンネル２）
測定方法；１ポイントエンド法〔１５〕−〔０〕
検体量 ； １５μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
測定波長；６６０ｎｍ（副波長）／５７０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
〔結果〕
表１及び表２から本発明の測定法により得られた総ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度は、既存の測定法により得られた値と良好な相関性を示すことが判る。
実施例５
日立７１７０形自動分析装置（（株）日立製作所製）を使用して、本発明の測定法により全血１０検体（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）の総ヘモグロビン濃度とヘモグロビンＡ１ｃ濃度について測定し、計算によってヘモグロビンＡ１ｃの割合（％）を求めた。
〔検体〕
検体として、全血１０検体（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）と下記第一試薬（前処理液）とを、１：１００で混合したものを用いた。
〔試薬〕
第一試薬（前処理液）：ＴＴＡＢを０．９％含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
第二試薬（Ｒ１） ：１．５ｍｇ／ｍｌ 抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体を含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．２）
第三試薬（Ｒ２） ：２７．５μｇ／ｍｌ 抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体に対するポリハプテンを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．２）
〔測定方法〕
日立７１７０形自動分析装置を用い、以下の測定条件で実験を行い、得られた測定値を、各種濃度の総ヘモグロビン溶液又は各種濃度の糖化ヘモグロビン溶液を検体とし、実施例２，３に記載の方法に準じて求めた総ヘモグロビン溶液又は糖化ヘモグロビン溶液と吸光度との関係を表す検量線に当てはめ、全血１０検体の総ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）及び糖化ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）を求めた。また、反応しなかった抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体と抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体に対するポリハプテンとの複合体の濁度の測定値からヘモグロビンＡ１ｃ濃度（ｇ／ｄｌ）を求めた。両者の結果より求めたヘモグロビンＡ１ｃ濃度（％）の測定結果を表３に示す。
〔測定条件１〕
測定方法；３ポイント法
測定ポイント（ヘモグロビン濃度）；
〔１４〕−〔０〕，測定波長；６６０ｎｍ（副波長）／５７０ｎｍ（主波長）
測定ポイント（ヘモグロビンＡ１ｃ濃度）；
〔１６〕−〔３４〕，測定波長；７００ｎｍ（副波長）／３４０ｎｍ（主波長）検体量 ；７．２μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
Ｒ２ ； ３６μｌ
測定温度；３７℃
参考例２
実施例５と同じ検体について、ＨＰＬＣ法を用い、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度（％）を測定した。ＨＰＬＣ法によるヘモグロビンＡ１ｃの測定は、自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ（東ソー）を用いて行った。この装置では、オートサンプラーにより試料ラックにのせた検体がセットされた順に、３μｌずつインジェクションバルブのサンプリングループに導入され、定められた送液シークエンスに従って自動的に注入した液体を分離測定する。この装置の溶離液には東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ専用試薬を用いた。得られたヘモグロビンＡ１ｃ濃度（％）の測定結果を表３に実施例５の結果と併せて示す。
〔結果〕
表３から本発明の測定法により得られたヘモグロビンＡ１ｃ濃度（％）は、ＨＰＬＣ法により得られた値と良好な相関性を示すことが判る。
以上の結果から、本発明の測定する方法は、既存の測定方法と良好な相関性を有しつつ、総ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビンを１チャンネルで連続して測定することを可能とする有効な方法であることが判る。
産業上の利用の可能性
以上述べた如く、本発明は、ヘモグロビンを含む生体試料中の総ヘモグロビン量と糖化ヘモグロビン量を１チャンネルで測定し得る測定用試薬及びキット並びにこれを用いた測定方法であり、本発明の実施により、従来別々の系で（２チャンネルで）行われていた、生体試料中の総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの測定を、１チャンネルで連続して測定できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１に於けるヘモグロビンの吸光度安定化処理によるヘモグロビン由来の吸光度変化を示した図である。
図２は、実施例２より得られたヘモグロビン濃度と吸光度の関係示した図である。
図３は、実施例３で得られたヘモグロビンＡ１ｃ濃度と吸光度の関係を示した図である。
図４は、実施例４で得られた、全血を検体として本発明の方法に付した時のタイムコースを図４に示す。
本発明は、試料中の総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの連続測定方法、並びに当該方法に用いられる総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの測定用キットに関する。
技術背景
ヘモグロビンは、赤血球中に含まれる色素蛋白で酸素の運搬を担っているものであり、この中の糖化ヘモグロビンは、拡散により赤血球に入り込んだ、血液中の糖（単糖類）の還元末端と、ヘモグロビンのα鎖及びβ鎖の遊離のアミノ基が非酵素的にシッフ塩基により結合して形成された不安定なアルドイミン（不安定型）が、更にアマドリ転移により安定なケトアミン（安定型）へと移行することにより生成されるアマドリ化合物の一種である。総ヘモグロビン中の糖化ヘモグロビンの濃度は過去１〜２ヶ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映すると言われていることから、糖尿病の診断マーカーとして広く利用されている。
糖化ヘモグロビンの測定は、液体クロマトグラフィー法や抗体法等により行われているが、総ヘモグロビンの測定と組み合わせて１チャンネルで測定する方法は、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの測定感度や測定波長の違いから、未だ実現されておらず、その開発が強く望まれている。
本発明は、上記した如き状況に鑑み、試料中の総ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンとを１チャンネルで測定し得る総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの連続測定方法、並びにそれに用いられる測定用キットの提供にある。
発明の開示
本発明は上記課題を解決する目的でなされたものであり、
「試料をヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理に付した後、吸光度を測定しその結果に基づいて試料中のヘモグロビンの量を求め、次いで試料中の糖化ヘモグロビン量を測定することからなるヘモグロビン類の測定方法」、
「ヘモグロビンの構造を変化させる成分を含んでなる試薬と、糖化ヘモグロビン又はそれから誘導されるものを基質とする過酸化水素生成酵素又は抗糖化ヘモグロビン抗体を含んでなる試薬との組合せからなるヘモグロビン類測定用キット。」、
「（１）ヘモグロビンの吸光度を安定化させる試薬を含んでなる第一試薬と、プロテアーゼ試薬を含んでなる第二試薬と、糖化ヘモグロビン由来基質の過酸化水素生成酵素、ペルオキシダーゼ及び被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るキット、（２）ヘモグロビンの吸光度を安定化させる試薬を含んでなる第一試薬と、プロテアーゼ試薬及び糖化ヘモグロビン由来基質の過酸化水素生成酵素を含んでなる第二試薬と、ペルオキシダーゼ及び被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とからなるキット、或いは（３）ヘモグロビンの吸光度を安定化させる試薬を含んでなる第一試薬と、プロテアーゼ試薬及び被酸化呈色試薬を含んでなる第二試薬と、糖化ヘモグロビン由来基質の過酸化水素生成酵素及びペルオキシダーゼを含んでなる第三試薬とから成るキット、（４）ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体試薬を含んでなる第二試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体に対するポリハプテン試薬を含んでなる第三試薬とから成るキットの何れかからなるヘモグロビン類測定用三試薬系キット。」に関する。
本発明者らは、試料中の総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの測定が１チャンネルで測定可能な測定法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、試料をヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理に付した後、吸光度を測定し、その結果に基づいて試料中のヘモグロビンの量を求め、次いで試料中の糖化ヘモグロビン量を測定することで、試料中の総ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンとを１チャンネルで連続して測定し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
発明を実施するための最良の形態
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理としては、ヘモグロビンの構造を変化させる方法が挙げられ、かかる処理としては例えばヘモグロビンのヘム部の構造を変化させる処理及びヘモグロビンのグロビン部の構造を変化させる処理等が挙げられる。
具体的には、前者にあっては、ヘモグロビンを例えば亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等のアルカリ金属亜硝酸塩や、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム等のフェリシアン化化合物等で処理しメトヘモグロビンに変化させた後、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム等のシアン化化合物又はアジ化ナトリウム、アジ化カリウム等のアジ化化合物で処理し、ヘモグロビンをシアンメトヘモグロビン又はアジドメトヘモグロビンに変化させることによりなされ、より具体的には、ヘモグロビンを例えばフェリシアン化カリウム及びシアン化カリウム或いは亜硝酸ナトリウム及びナトリウムアジド等の組み合わせで、例えば国際標準Ｈｂ測定法や特公昭５８−４４９８５に記載の公知の方法に従って処理することによって行われる。
また、後者にあっては、ヘモグロビンをアルカリ、酸、蛋白変性剤、プロテアーゼ、界面活性剤等と接触させることによってなされ、これらの処理によりヘモグロビンのグロビン部の構造が不可逆的に変化するとされている。具体的に構造がどの様に変化したかは必ずしも明らかではないが、かかる処理によって結果的にヘモグロビンの吸光度が安定化されるという目的が達成できる。これらアルカリ、酸、蛋白変性剤、プロテアーゼ、界面活性剤等とヘモグロビン含有試料を接触させる方法としては、例えばこれらの物質とヘモグロビン含有試料とを混合させる方法、ヘモグロビン含有試料にこれら物質或いはそれを含む溶液を添加する方法等が挙げられる。尚、これらの物質は単独で用いてもよく、また２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させるためのアルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化アルカリ、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液等が挙げられるが、中でも水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化アルカリが好ましい。尚、測定時の反応液中のｐＨが、通常１０〜１３．７、好ましくは１２．７〜１３．７になるようにこれらのアルカリの種類、濃度等を選定する。
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させるための酸としては、例えば塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸、例えば酒石酸、クエン酸、酢酸、コハク酸、フマル酸等のカルボン酸等が挙げられるが、中でも塩酸、酒石酸、クエン酸等が好ましい。尚、測定時の反応液中のｐＨが、通常１．０〜４．５、好ましくは１．０〜３．５になるようにこれらの酸の種類、濃度等を選定する。
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させるための蛋白変性剤としては、例えばアセトン、テトラヒドロキシフラン、ｔｅｒｔ−ブタノール、イソプロパノール等の水溶性有機溶媒、二クロム酸カリウム、二クロム酸アンモニウム、二酸化マンガン、二酸化鉛、硫化鉛等の重金属塩、塩酸グアニジン、尿素等が挙げられ、中でも塩酸グアニジン、尿素等が好ましい。尚、測定時の反応液中の濃度としては、通常０．１〜３０％、好ましくは０．５〜１５％である。
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させるためのプロテアーゼとしては、例えばトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、ズブチリシン、カテプシン、プロナーゼ、プロティナーゼＫ、パパイン、ブロメライン、エラスターゼ、サーモリシン、ペプシン、モルシン等が挙げられるが、中でもプロナーゼ、プロティナーゼＫ、エラスターゼ、キモトリプシン等が好ましい。尚、その使用濃度は、測定時の反応液中の濃度として、通常０．１〜１００００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．３〜７０００Ｕ／ｍｌである。
本発明に係るヘモグロビンの吸光度を安定化させるための界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤の何れでもよく、非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられ、陽イオン性界面活性剤としては、例えば脂肪族アミン塩、脂肪族４級アンモニウム塩等が挙げられ、陰イオン性界面活性剤としてはカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩等が挙げられ、両性界面活性剤としては、例えばカルボキシベタイン類、スルホベタイン類、グリシン類、アラニン類、２−アルキルイミダゾリンの誘導体類、アミンオキサイド類等が挙げられる。
さらに、非イオン性界面活性剤である、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等が挙げられ、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレエート等が挙げられ、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等が挙げられ、ソルビタン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート等が挙げられ、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルの具体例としては、例えばテトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール等が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルアミンの具体例としては、例えばポリオキシエチレンラウリルアミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等が挙げられ、グリセリン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等が挙げられ、脂肪酸アルカノールアミドの具体例としては、例えばラウリン酸ジエタノールアミド等が挙げられ、ショ糖脂肪酸エステルの具体例としては、例えばショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル等が挙げられる。
陽イオン性界面活性剤である、脂肪族アミン塩としては、モノラウリルアミン、モノステアリルアミン、ジステアリルアミン、トリステアリルアミン等の高級脂肪族アミン等と、塩酸、硫酸等の無機酸或いは酢酸、乳酸、クエン酸等の低級カルボン酸等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルアミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩等が挙げられ、脂肪族４級アンモニウム塩としては、ラウリルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム等の高級脂肪族アンモニウム等と塩素、臭素等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロライド等が挙げられる。
陰イオン性界面活性剤である、カルボン酸塩としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ、具体的には例えばオレイン酸カリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム等が挙げられ、スルホン酸塩としては、ラウリルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸、ジプロピルナフタレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸等のナフタレンスルホン酸、ジオクチルスルホコハク酸等のスルホコハク酸等と、ナトリウム等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等が挙げられ、硫酸エステル塩としては、ラウリル硫酸エステル等の高級アルコール硫酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸等エステルのポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸等エステルと、ナトリウム、アンモニウム等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等の高級アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩エステル等が挙げられ、リン酸エステル塩としては、モノステアリルリン酸エステル、モノラウリルリン酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ、具体的には例えばモノステアリルリン酸ナトリウム、モノラウリルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸カリウム等が挙げられる。
両性界面活性剤である、カルボキシベタイン類の具体例としては、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられスルホベタイン類の具体例としては、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン等が挙げられ、グリシン類の具体例としては、ラウリルジアミノエチルグリシンナトリウム等が挙げられ、２−アルキルイミダゾリンの誘導体類の具体例としては、２−ラウロイル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等の２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられ、アミンオキサイド類の具体例としては、ラウリルジメチルアミンオキサイド等が挙げられる。
尚、これら界面活性剤の使用濃度は、測定時の反応液中の濃度として、通常０．１〜２０％、好ましくは０．５〜１０％である。
ヘモグロビンの吸光度を安定化させるために用いられる上記した各種試薬の中でも、界面活性剤が特に好ましいものとして挙げられ、更に、界面活性剤にプロナーゼ、プロティナーゼＫ、エラスターゼ、キモトリプシン等のプロテアーゼを併用するものがより好ましい。これら界面活性剤の中でも、短時間でヘモグロビンの吸光度を安定化させることができ、酵素への影響が少ない両性界面活性剤が好ましく、中でもラウリルジメチルアミンオキサイド等のアルキルジメチルアミンオキサイド、Ｎ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が好ましく、その中でも、ラウリルジメチルアミンオキサイド等のアルキルジメチルアミンオキサイドがより好ましい。尚、上記で挙げた界面活性剤は、２種類以上を適宜選択して用いてもよい。
本発明のヘモグロビン類の測定方法は、例えば以下の様に実施される。
即ち、先ず生体由来試料を、ヘモグロビンの吸光度を安定化させるための上記した如き処理に付す。試料とヘモグロビンの吸光度を安定化させるための上記した如き成分との接触時間は、通常２〜１２０分、好ましくは２〜６０分であり、例えば両性界面活性剤であるラウリルジメチルアミンオキサイドを用いる場合、ラウリルジメチルアミンオキサイド水溶液と試料とを混合し、２〜６０分放置する。このような処理を施した後、該試料の吸光度を測定しその値から試料中のヘモグロビン量を求め、次いで該試料中の糖化ヘモグロビンを測定する。
試料中の糖化ヘモグロビンを測定する方法は、酵素的測定法でも免疫学的測定法でも何れでもよいが、例えば酵素的測定法としては、糖化ヘモグロビン又はそれから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を基質とする過酸化水素生成酵素を用いる方法、糖化ヘモグロビンを基質とする脱水素酵素とＮＡＤ（Ｐ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ等の補酵素とを組み合わせて用いる方法等が挙げられ、例えば免疫学的測定法としては、抗糖化ヘモグロビン抗体を用いる方法等が挙げられる。
酵素的測定法のうち、例えば糖化ヘモグロビン又はそれから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を基質とする過酸化水素生成酵素を用いて糖化ヘモグロビンを測定するには、例えば以下の如くして実施すればよい。
即ち、ヘモグロビンの吸光度を安定化させるための処理に付した後の試料（以下、安定化処理試料と略記する）を、糖化ヘモグロビン又はそれから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を基質とする過酸化水素生成酵素と接触させて過酸化水素を生成させる。生成した過酸化水素に例えばペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略記する）と被酸化性呈色試薬（例えばカップラーとデベロッパーとの組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を作用させて色素を生成させ、生成した色素量を吸光度として測定し、得られた吸光度に基づいて生体由来試料中の糖化ヘモグロビン量を算出する。尚、上記のようなＰＯＤを用いた定量法において、ヘモグロビンや赤血球、血漿に含まれる物質等によるＰＯＤ呈色反応の妨害を防止又は回避する方法（例えば特開平３−１０６９６号公報記載の方法）が知られているが、これらの方法を本発明に組み合わせて実施してもよい。また、上記の被酸化性呈色試薬により色素を生成させ生体由来試料中の糖化ヘモグロビン量を算出する代わりに、公知の電極法により、過酸化水素生成酵素により生成した過酸化水素量又は減少した酸素量を測定し、その結果に基づいて生体由来試料中の糖化ヘモグロビン量を算出しても良い。
上記の糖化ヘモグロビンから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を基質とする過酸化水素生成酵素を用いて糖化ヘモグロビンから過酸化水素を生成させるためには、当該糖化ヘモグロビンを適当なプロテアーゼと接触させて糖化ヘモグロビンに由来する糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を生成させる必要がある。
このようなプロテアーゼ処理は例えば以下のようにして行われる。
▲１▼ヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理を行う際にプロテアーゼを添加する方法（尚、ヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理をプロテアーゼを用いて行う場合は、添加しなくてもよい場合がある）。
▲２▼適当なプロテアーゼ或いはこれを含む適当な溶液を、ヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理前の試料と混合する方法。
▲３▼適当なプロテアーゼを上記した如き過酸化水素生成酵素と共に安定化処理試料と接触させる方法。
このような目的で用いられるプロテアーゼとしては、糖化ヘモグロビンから、過酸化水素生成酵素の基質となり得る糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を遊離させるものであれば特に限定されないが、通常この分野で使用されているもの、例えば、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、ズブチリシン、カテプシン、ブロナーゼ、プロティナーゼＫ、パパイン、ブロメライン、エラスターゼ、サーモリシン、ペプシン、モルシン等は全て使用可能であり、中でも、プロナーゼ、プロティナーゼＫ、エラスターゼ、キモトリプシン等が好ましい。また、これらは適宜組み合わせて用いてもよい。また、これらの使用量としては、特に制約はされないが、例えば、反応液中の濃度として、通常０．１〜１００００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．３〜７０００Ｕ／ｍｌである。
また、糖化ヘモグロビンとプロテアーゼとを接触させる場合に、試料中に共存する糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質がプロテアーゼとの反応に関与するのを防止または阻害するために、例えば糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質に対する抗体や水溶性ポリマー等を共存させてもよい。
このような抗体としては、糖化蛋白質の糖鎖部分に結合する抗体でも蛋白質部分に結合する抗体でも、或いは糖鎖と蛋白質との結合部分に結合する抗体の何れでもよいが、中でも抗全血抗体から糖化ヘモグロビンに対する抗体を除いたものが好ましい。また、該抗体は、血清中の含量が比較的多い糖化蛋白質に対する抗体、例えば、抗アルブミン抗体、抗高比重リポ蛋白抗体、抗低比重リポ蛋白抗体、抗トランスフェリン抗体、抗アンチトリプシン抗体等の中から目的に応じて適宜選択して用いることもでき、単独でも、適宜組み合わせて用いてもよい。
その濃度は、糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質がプロテアーゼと反応しなくなる濃度であればよいが、例えば、測定時の反応液中の濃度が、通常０．０１〜１０ｍｇＡｂ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜１ｍｇＡｂ／ｍｌとなるように使用される。
これら抗体は、通常この分野で使用されているものであればポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の区別なく全て使用可能であり、市販品でも、自体公知の調製方法（例えば、エンザイムイムノアッセイ、石川栄治著，１９８９，東京化学同人等に記載の方法）に準じて調製されたもの何れでもよい。また、これらは、必要に応じて、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法により精製したものを用いてもよい。
また、共存する糖化蛋白質の関与を防止または阻害する水溶性ポリマーとしては、例えばポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン，ポリビニルアルコール等の合成高分子化合物、並びに例えばデキストラン，デキストラン硫酸又はその塩，コンドロイチン硫酸又はその塩等の多糖類が挙げられるが、中でもポリエチレングリコール、デキストラン等が好ましい。また、その使用濃度は、測定時の反応液中の濃度として、通常５〜４０％、好ましくは５〜２０％である。また、これらは、自体公知の方法に従い調製したものを用いても、市販品を用いてもよい。
本発明に於いて用いられる過酸化水素生成酵素としては、通常この分野で使用されているものは全て使用可能であるが、例えば、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミンデグリカーゼ等があげられ、具体的にはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（特公平５−３３９９７号公報、特公平６−６５３００号公報）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｓ）属（特願平９−５２０３７１号再公表特許公報）、フサリウム属（特開平７−２８９２５３号公報、特開平１０−２０１４７３号公報）、カンジダ属（特開平６−４６８４６号公報）等の微生物に由来するもの等が挙げられる。また、その濃度は、反応液中の濃度として、通常０．５〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは２〜５０Ｕ／ｍｌである。
本発明に於いて用いられるＰＯＤとしては、例えば、西洋ワサビ、大根等の植物に由来するもの、カビ、酵母等の微生物に由来するもの、動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等が挙げられる。ＰＯＤの使用量としては、例えば試液中の濃度として、通常０．１〜１０００ｕ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜４００ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜２００ｕ／ｍｌであり、また、最終反応液中の濃度として、通常０．１〜２５０ｕ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜１００ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜５０ｕ／ｍｌである。
本発明に於いて用いられる被酸化性呈色試薬としては、ＰＯＤの存在下、過酸化水素と反応して呈色するものであればよいが、例えば４−アミノアンチピリン（以下、４−ＡＡと略記する）等のカップラー及び、該カップラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロッパーとの組合せ、即ち、例えば４−ＡＡとフェノール系化合物、ナフトール系化合物若しくはアニリン系化合物の組合せ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物の組合せ等や、例えば２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンチジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、ｏ−フェニレンジアミン誘導体等のロイコ型発色剤等が挙げられるが、中でも、高感度であるロイコメチレンブルー誘導体が好ましい。
カップラーとデベロッパーとの組合せを用いる場合、カップラーの使用量としては、用いるカップラーの種類や組み合わせるデベロッパーの種類等により異なるが、例えば試液中の濃度として、通常０．０１〜４００ｍＭ、好ましくは０．１〜４０ｍＭであり、最終の反応液中の濃度として、通常０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭの範囲である。まだ、ロイコ型発色剤を用いる場合、その使用量は用いる発色剤の種類などにより異なるが、例えば試液中の濃度として、通常０．０１〜４００ｍＭ、好ましくは０．０１〜４０ｍＭであり、最終の反応液中の濃度として、通常０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭの範囲である。
本発明に於ける糖化ヘモグロビンの免疫学的測定方法に於いて、抗糖化ヘモグロビン抗体を用いた測定法としては、例えば免疫比濁法、ラテックス免疫凝集法、免疫阻害比濁法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定方法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定方法（ＦＩＡ）等が挙げられる。これらのうち、例えば免疫比濁法の場合、具体的には以下の様に実施される。
即ち、安定化処理試料を抗糖化ヘモグロビン抗体と接触させて、糖化ヘモグロビンと抗糖化ヘモグロビン抗体との複合体を生成させる。該複合体の生成による濁度の変化を測定し、測定値より糖化ヘモグロビン量を算出する。尚、ここで用いられる抗糖化ヘモグロビン抗体とは、糖化ヘモグロビン又は／及び糖化ヘモグロビン由来の糖化ペプチドに対して免疫反応を持つ抗体のことである。
また、例えば免疫阻害比濁法を用いる場合、以下の様に実施される。
即ち、安定化処理試料を抗糖化ヘモグロビン抗体と接触させて、糖化ヘモグロビンと抗糖化ヘモグロビン抗体とを反応させる。反応終了後、反応液の吸光度を測定し、更に反応液に抗糖化ヘモグロビン抗体に対するポリハプテンを添加し、未反応の抗糖化ヘモグロビン抗体と反応させ、免疫複合体を形成させる。該免疫複合体の生成による濁度の変化（吸光度変化）を測定し、当該測定値より糖化ヘモグロビン量を算出する。尚、ここで用いられる抗糖化ヘモグロビン抗体とは、糖化ヘモグロビン又は／及び糖化ヘモグロビン由来の糖化ペプチドに対して免疫反応を持つ抗体のことである。
本発明に係る試薬や溶液に於いては、通常緩衝剤が含まれるが、ここで用いることの出来る緩衝剤としては、例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等の通常酵素活性測定法、免疫比濁法、免疫比ろう法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定方法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定方法（ＦＩＡ）等で用いられている緩衝剤であればよく、その濃度は通常１０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは２０ｍＭ〜５００ｍＭで、ｐＨは通常３〜１２好ましくは５〜１０である。本発明に係るキットは、少なくとも二試薬を有するものであり、全血中の総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを測定するために使用されるものであり、例えば糖化ヘモグロビンを酵素的測定法で測定するキットとしては、例えば▲１▼ヘモグロビンの吸光度を安定化させるための処理剤（以下、「ＨＢ安定化剤」と略記する。）、▲２▼プロテアーゼ試薬、▲３▼糖化ヘモグロビン又はそれから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチド等を基質とする過酸化水素生成酵素（以下、「糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素」と略記する）、▲４▼ＰＯＤ、▲５▼被酸化呈色試薬等からなり、酵素的測定法で糖化ヘモグロビンを測定するものであればよい。更にこのうち、二試薬系キットの場合、▲１▼ＨＢ安定化剤を第一試薬に含み、且つ▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬の何れか少なくとも一つが第二試薬に含まれているものであればよく、（ｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ、及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第二試薬とから成るもの、（ｉｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤及び▲２▼プロテアーゼ試薬を含んでなる第一試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ、及び▲５▼被酸化呈色試薬等を含んでなる第二試薬とから成るもの等が挙げられ、三試薬系キットの場合、▲１▼ＨＢ安定化剤を第一試薬に含み、且つ▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬の何れか少なくとも一つが第三試薬に含まれているものであればよく、（ｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬を含んでなる第二試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るもの、（ｉｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬及び▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素を含んでなる第二試薬と、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るもの、（ｉｉｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤及び▲２▼プロテアーゼ試薬を含んでなる第一試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素を含んでなる第二試薬と、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るもの、（ｉｖ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第二試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素及び▲４▼ＰＯＤを含んでなる第三試薬とから成るもの等が挙げられる。
更にまた、例えば免疫学的測定法で糖化ヘモグロビンを測定する場合、第一試薬にＨＢ安定化剤を含み、且つ免疫学的測定法で糖化ヘモグロビンを測定するものであればよく、（ｉ）例えばＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体試薬を含んでなる第二試薬とからなるもの、（ｉｉ）例えばＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体試薬含んでなる第二試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体に対するポリハプテン試薬を含んでなる第三試薬とからなるもの等が挙げられる。
上記本発明に係るキットの中でも、（ｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬を含んでなる第二試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素、▲４▼ＰＯＤ、及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るもの、（ｉｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬及び▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素を含んでなる第二試薬と、▲４▼ＰＯＤ及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るもの、（ｉｉｉ）例えば▲１▼ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、▲２▼プロテアーゼ試薬及び▲５▼被酸化呈色試薬を含んでなる第二試薬と、▲３▼糖化ヘモグロビン由来基質のＨ２Ｏ２生成酵素及び▲４▼ＰＯＤを含んでなる第三試薬とから成るもの等の酵素的測定法を用いるキット、（ｉｖ）例えばＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体試薬を含んでなる第二試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体に対するポリハプテン試薬を含んでなる第三試薬とからなるもの等の免疫学的測定法を用いるキット等が好ましい。これらの中でも上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の酵素的測定法を用いるキットがより好ましい。
尚、各キットに於ける各試薬中の各成分の濃度は、これら各キットを所定の標準操作法に従って測定を行う際の反応液中の濃度が上記した如き範囲となるように設定すればよい。
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。尚、実施例及び参考例に於いて使用される略称の正式名称は下記の通りである。
ＳＤＳ；ドデシル硫酸ナトリウム
ソフダゾリンＣＬ；２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン
アンヒトール２０Ｎ（花王株式会社製）；ラウリルジメチルアミンオキサイド
トリトンＸ−１００；ポリオキシエチレングリコールρ−ｔ−オクチルフェニルエーテル
ＨＥＰＥＳ；２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸
ＮＥＭ；Ｎ−エチルマレイミド
ＦＡＯＤ；フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
ＤＡ−６７；１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩
ＴＴＡＢ；テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド
ＭＥＳ；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
実施例
実施例１
日立７１７０形自動分析装置（（株）日立製作所製）を使用して、本発明に係るヘモグロビンの吸光度安定化処理によるヘモグロビン由来の吸光度の変化を測定した。
〔検体〕
ヘモグロビン濃度が１５ｇ／ｄｌのヒト全血（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）を用いた。また、該試料と第一試薬（前処理液）とを１：５で混合したものを、自動分析装置用検体とした。
〔試薬〕
第一試薬（前処理液）：１０％ ＳＤＳ水溶液
第二試薬（Ｒ１） ：２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）
〔測定方法〕
日立７１７０形自動分析装置を用い、以下の測定条件で実験を行った。その結果を図１に示す。尚、図中の縦軸は８００／６６０ｎｍの吸光度、横軸は測光ポイントを表す。
〔測定条件〕
測定方法；１ポイントエンド法〔３４〕−〔０〕
検体量 ； １５μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
測定波長；８００ｎｍ（副波長）／６６０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
〔結果〕
図１の結果から、ＳＤＳを用いることによりヘモグロビン由来の吸光度を５ポイント目（約９０秒間）までで安定化させることが出来るようになることが判る。
実施例２
日立７１７０形自動分析装置（（株）日立製作所製）を使用して、本発明の測定法により全血中の総ヘモグロビン量を測定した。
〔検体〕
ヘモグロビン濃度が既知であるヒト全血（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）を生理食塩水で５段階希釈したものを検体とした。
〔試薬〕
第一試薬（Ｒ１）：１０００Ｕ／ｍｌキモトリプシン及び２％ソフダゾリンＣＬを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）
〔測定方法〕
日立７１７０形自動分析装置を用い、以下の測定条件で実験を行った。得られたヘモグロビン濃度と吸光度の関係を図２に示す。尚、図中の縦軸は８００／６６０ｎｍの吸光度（ヘモグロビンの色）、横軸はヘモグロビンの濃度を表す。 〔測定条件〕
測定方法；１ポイントエンド法〔１６〕−〔０〕
検体量 ；２．５μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
測定波長；８００ｎｍ（副波長）／６６０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
〔結果〕
この結果より、総ヘモグロビン濃度と吸光度が良好な検量関係にあること、言い換えれば本発明に係る総ヘモグロビン測定方法により総ヘモグロビン濃度を精度よく測定し得ることが判る。
実施例３
日立７１７０形自動分析装置（（株）日立製作所製）を使用して、本発明の測定法によりＨｂＡ１ｃコントロール「ロシュ」中のヘモグロビンＡ１ｃ濃度を測定した。
〔検体〕
ＨｂＡ１ｃコントロールＮ「ロシュ」（ＨｂＡ１ｃ：０．６０ｇ／ｄｌ）とＨｂＡ１ｃコントロールＰ「ロシュ」（ＨｂＡ１ｃ：１．３３ｇ／ｄｌ）とを、５：０、４：１、３：２、２：３、１：４、０：５で混合し、さらに、これらを下記の第一試薬（前処理液）と１：５で混合したものを自動分析装置用検体とした。
〔試薬〕
第一試薬（前処理液）：１５％ アンヒトール２０Ｎ水溶液
第二試薬（Ｒ１） ：２００Ｕ／ｍｌ エラスターゼ及び２ｍＭ ＮＥＭを含む
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）
第三試薬（Ｒ２） ：２０Ｕ／ｍｌ ＦＡＯＤ、５０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ及び０．５ｍＭ ＤＡ−６７を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）
〔測定方法〕
日立７１７０形自動分析装置を用い、以下の測定条件で実験を行った。本測定法で得られた吸光度とヘモグロビンＡ１ｃ濃度の関係を図３に示す。図中の縦軸は８００／６６０ｎｍの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸は糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１ｃ）の濃度を表す。
〔測定条件〕
測定方法；２ポイントエンド法〔１６〕−〔３４〕
検体量 ； １５μｌ
Ｒ１ ； １８０μｌ
Ｒ２ ； ６０μｌ
測定波長；８００ｎｍ（副波長）／６６０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
〔結果〕
この結果より、糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１ｃ）濃度と本発明の測定による吸光度が良好な検量関係にあること、言い換えれば本発明に係る糖化ヘモグロビン測定により糖化ヘモグロビン濃度を精度よく測定し得ることが判る。
実施例４
日立７１７０形自動分析装置（（株）日立製作所製）を使用して、本発明の測定法により全血１０検体（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）の総ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度について測定した。
〔検体〕
全血１０検体（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）と第一試薬（前処理液）とを、１：５で混合したものを検体とした。
〔試薬〕
第一試薬（前処理液）：トリトンＸ−１００を７％含む２５０ｍＭ酒石酸−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ１．５）
第二試薬（Ｒ１） ：２０Ｕ／ｍｌ プロティナーゼＫ及び１ｍＭ ＮＥＭを含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）
第三試薬（Ｒ２） ：２０Ｕ／ｍｌ ＦＡＯＤ、５０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ及び０．５ｍＭ ＤＡ−６７を含む２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）
〔測定方法〕
日立７１７０形自動分析装置を用い、以下の測定条件で実験を行い、得られた測定値を、各種濃度の総ヘモグロビン溶液又は各種濃度の糖化ヘモグロビン溶液を検体とした以外は実施例２，３と同様の方法により予め求めた総ヘモグロビン溶液又は糖化ヘモグロビン溶液と吸光度との関係を表す検量線に当てはめ、全血１０検体の総ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）及び糖化ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）を求めた。全血１０検体のうちＮｏ．８のタイムコースを図４に示す。また、総ヘモグロビンの測定結果を表１に、糖化ヘモグロビンの測定結果を表２に夫々示す。尚、図４に於いて、縦軸は縦軸は８００／６６０ｎｍの吸光度、横軸は時間（測光ポイント）を表す。
〔測定条件〕
測定方法；３ポイント法
測定ポイント（ヘモグロビン濃度）； 〔１６〕−〔０〕
測定ポイント（糖化ヘモグロビン濃度）； 〔１６〕−〔３４〕
検体量 ； １５μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
Ｒ２ ； ６０μｌ
測定波長；８００ｎｍ（副波長）／６６０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
参考例１
実施例４と同じ検体について、ロシュ（株）製のリキテックＨｂＡ１ｃＩＩ（免疫阻害比濁２チャンネル法）を使用して、ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）及びヘモグロビンＡ１ｃ濃度（ｇ／ｄｌ）を求めた。
〔検体〕
検体として、全血１０検体（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）とリキテックＨｂＡ１ｃＩＩの第一試薬（前処理液）とを、１：１００で混合したものを検体とした。
〔測定方法〕
リキテックＨｂＡ１ｃＩＩを用い、以下の測定条件で、全血１０検体のヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）及び糖化ヘモグロビン濃度（ヘモグロビンＡ１ｃ）（ｇ／ｄｌ）を求めた。得られた総ヘモグロビンの測定結果を表１に、得られた糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１ｃ）の測定結果を表２に夫々実施例４の結果と併せて示す。
〔測定条件〕
▲１▼ヘモグロビンＡ１ｃ濃度測定（チャンネル１）
測定方法；２ポイントエンド法〔１６〕−〔３４〕
検体量 ； ７．２μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
Ｒ２ ； ３６μｌ
測定波長；７００ｎｍ（副波長）／３４０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
▲２▼ヘモグロビン濃度測定（チャンネル２）
測定方法；１ポイントエンド法〔１５〕−〔０〕
検体量 ； １５μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
測定波長；６６０ｎｍ（副波長）／５７０ｎｍ（主波長）
測定温度；３７℃
表１及び表２から本発明の測定法により得られた総ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度は、既存の測定法により得られた値と良好な相関性を示すことが判る。
実施例５
日立７１７０形自動分析装置（（株）日立製作所製）を使用して、本発明の測定法により全血１０検体（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）の総ヘモグロビン濃度とヘモグロビンＡ１ｃ濃度について測定し、計算によってヘモグロビンＡ１ｃの割合（％）を求めた。
〔検体〕
検体として、全血１０検体（ＥＤＴＡ・２Ｎａ採血）と下記第一試薬（前処理液）とを、１：１００で混合したものを用いた。
〔試薬〕
第一試薬（前処理液）：ＴＴＡＢを０．９％含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
第二試薬（Ｒ１） ：１．５ｍｇ／ｍｌ 抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体を含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．２）
第三試薬（Ｒ２） ：２７．５μｇ／ｍｌ 抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体に対するポリハプテンを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．２）
〔測定方法〕
日立７１７０形自動分析装置を用い、以下の測定条件で実験を行い、得られた測定値を、各種濃度の総ヘモグロビン溶液又は各種濃度の糖化ヘモグロビン溶液を検体とし、実施例２，３に記載の方法に準じて求めた総ヘモグロビン溶液又は糖化ヘモグロビン溶液と吸光度との関係を表す検量線に当てはめ、全血１０検体の総ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）及び糖化ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）を求めた。また、反応しなかった抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体と抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体に対するポリハプテンとの複合体の濁度の測定値からヘモグロビンＡ１ｃ濃度（ｇ／ｄｌ）を求めた。両者の結果より求めたヘモグロビンＡ１ｃ濃度（％）の測定結果を表３に示す。
〔測定条件１〕
測定方法；３ポイント法
測定ポイント（ヘモグロビン濃度）；
〔１４〕−〔０〕，測定波長；６６０ｎｍ（副波長）／５７０ｎｍ（主波長）
測定ポイント（ヘモグロビンＡ１ｃ濃度）；
〔１６〕−〔３４〕，測定波長；７００ｎｍ（副波長）／３４０ｎｍ（主波長）検体量 ；７．２μｌ
Ｒ１ ；１８０μｌ
Ｒ２ ； ３６μｌ
測定温度；３７℃
参考例２
実施例５と同じ検体について、ＨＰＬＣ法を用い、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度（％）を測定した。ＨＰＬＣ法によるヘモグロビンＡ１ｃの測定は、自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ（東ソー）を用いて行った。この装置では、オートサンプラーにより試料ラックにのせた検体がセットされた順に、３μｌずつインジェクションバルブのサンプリングループに導入され、定められた送液シークエンスに従って自動的に注入した液体を分離測定する。この装置の溶離液には東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ専用試薬を用いた。得られたヘモグロビンＡ１ｃ濃度（％）の測定結果を表３に実施例５の結果と併せて示す。
表３から本発明の測定法により得られたヘモグロビンＡ１ｃ濃度（％）は、ＨＰＬＣ法により得られた値と良好な相関性を示すことが判る。
以上の結果から、本発明の測定する方法は、既存の測定方法と良好な相関性を有しつつ、総ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビンを１チャンネルで連続して測定することを可能とする有効な方法であることが判る。
産業上の利用の可能性
以上述べた如く、本発明は、ヘモグロビンを含む生体試料中の総ヘモグロビン量と糖化ヘモグロビン量を１チャンネルで測定し得る測定用試薬及びキット並びにこれを用いた測定方法であり、本発明の実施により、従来別々の系で（２チャンネルで）行われていた、生体試料中の総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの測定を、１チャンネルで連続して測定できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１に於けるヘモグロビンの吸光度安定化処理によるヘモグロビン由来の吸光度変化を示した図である。
図２は、実施例２より得られたヘモグロビン濃度と吸光度の関係示した図である。
図３は、実施例３で得られたヘモグロビンＡ１ｃ濃度と吸光度の関係を示した図である。
図４は、実施例４で得られた、全血を検体として本発明の方法に付した時のタイムコースを図４に示す。
【請求項７】ヘモグロビンのグロビン部の構造を変化させる処理が、ヘモグロビンを両性界面活性剤及びプロテアーゼと接触させるものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】糖化ヘモグロビン量を測定する方法が、酵素的測定法である請求項１又は７に記載の測定方法。
【請求項１１】糖化ヘモグロビン量を測定する方法が、免疫学的測定法である請求項７記載の測定方法。
【請求項１４】ヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理が、ヘモグロビンを両性界面活性剤及びプロテアーゼと接触させるものであり、糖化ヘモグロビン量を測定する方法が糖化ヘモグロビン又はそれから誘導されるものを基質とする過酸化水素生成酵素を用いるものである請求項１記載の方法。
【請求項２１】ヘモグロビンのグロビン部の構造を変化させる成分が両性界面活性剤及びプロテアーゼである、請求項２０記載のキット。
Claims (22)
- ヘモグロビン含有試料をヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理に付した後、吸光度を測定しその結果に基づいて試料中のヘモグロビンの量を求め、次いで試料中の糖化ヘモグロビン量を測定することからなるヘモグロビン類の測定方法。
- ヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理が、ヘモグロビンの構造を変化させる処理である請求項１記載の方法。
- ヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理が、ヘモグロビンのヘム部又はグロビン部の構造を変化させる処理である、請求項１記載の方法。
- ヘモグロビンのヘム部の構造を変化させる処理が、ヘモグロビンをメトヘモグロビンに変化させる処理の後、シアン化化合物又はアジ化化合物と接触させるものである、請求項３記載の方法。
- ヘモグロビンをメトヘモグロビンに変化させる処理が、ヘモグロビンをアルカリ金属亜硝酸塩又はフェリシアン化化合物に接触させるものである、請求項４記載の方法。
- ヘモグロビンのグロビン部の構造を変化させる処理が、ヘモグロビンをアルカリ、酸、蛋白変性剤、プロテアーゼ又は界面活性剤と接触させるものである、請求項３記載の方法。
- ヘモグロビンのグロビン部の構造を変化させる処理が、ヘモグロビンを両性界面活性剤と接触させるものである、請求項３記載の方法。
- 糖化ヘモグロビン量を測定する方法が、酵素的測定法である請求項１記載の測定方法。
- 酵素的測定法が、糖化ヘモグロビン又はそれから誘導されるものを基質とする過酸化水素生成酵素を用いるものである請求項８記載の方法。
- 酵素的測定法が、ヘモグロビンの吸光度を安定化させるための処理に付した後の試料を、糖化ヘモグロビン又はそれから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチドを基質とする過酸化水素生成酵素と接触させて過酸化水素を生成させ、更に、生成した過酸化水素にペルオキシダーゼと被酸化性呈色試薬を作用させて色素を生成させ、該色素量を測定し、それに基づいて糖化ヘモグロビン量を算出する方法である、請求項８記載の方法。
- 糖化ヘモグロビン量を測定する方法が、免疫学的測定法である請求項１記載の測定方法。
- 免疫学的測定法が抗糖化ヘモグロビン抗体を用いたものである請求項１１記載の方法。
- 免疫学的測定法が、ヘモグロビンの吸光度を安定化させるための処理に付した後の試料を抗糖化ヘモグロビン抗体と接触させて、糖化ヘモグロビンと抗糖化ヘモグロビン抗体とを反応させた後、その反応液の吸光度を測定し、更に該反応液に抗糖化ヘモグロビン抗体に対するポリハプテンを添加し、未反応の抗糖化ヘモグロビン抗体と反応させて、免疫複合体を形成させた後に吸光度を測定し、先に測定した吸光度と比較して変化した吸光度値を算出し、得られた値より糖化ヘモグロビン量を算出する方法である請求項１１記載の方法。
- ヘモグロビンの吸光度を安定化させる処理が、ヘモグロビンを両性界面活性剤と接触させるものであり、糖化ヘモグロビン量を測定する方法が糖化ヘモグロビン又はそれから誘導されるものを基質とする過酸化水素生成酵素を用いるものである請求項１記載の方法。
- 糖化ヘモグロビン量を測定する方法が、ヘモグロビンの吸光度を安定化させるための処理に付した後の試料を、糖化ヘモグロビン又はそれから誘導される糖化アミノ酸、糖化ペプチドを基質とする過酸化水素生成酵素と接触させて過酸化水素を生成させ、更に、生成した過酸化水素にペルオキシダーゼと被酸化性呈色試薬を作用させて色素を生成させ、該色素量を測定し、それに基づいて糖化ヘモグロビン量を算出する方法である、請求項１４記載の方法。
- ヘモグロビンの構造を変化させる成分を含んでなる試薬と、糖化ヘモグロビン又はそれから誘導されるものを基質とする過酸化水素生成酵素又は抗糖化ヘモグロビン抗体を含んでなる試薬との組合せからなるヘモグロビン類測定用キット。
- ヘモグロビンの構造を変化させる成分が、ヘモグロビンのヘム部又はグロビン部の構造を変化させる成分である、請求項１６記載のキット。
- ヘモグロビンのヘム部の構造を変化させる成分が、ヘモグロビンをメトヘモグロビンに変化させる成分、並びにシアン化化合物又はアジ化化合物を組み合わせたものである、請求項１７記載のキット。
- ヘモグロビンをメトヘモグロビンに変化させる成分が、アルカリ金属亜硝酸塩又はフェリシアン化化合物である請求項１８記載のキット。
- ヘモグロビンのグロビン部の構造を変化させる成分がアルカリ、酸、蛋白変性剤、プロテアーゼ又は界面活性剤である、請求項１７記載のキット。
- ヘモグロビンのグロビン部の構造を変化させる成分が両性界面活性剤である、請求項１７記載のキット。
- （１）ヘモグロビンの吸光度を安定化させる試薬を含んでなる第一試薬と、プロテアーゼ試薬を含んでなる第二試薬と、糖化ヘモグロビン由来基質の過酸化水素生成酵素、ペルオキシダーゼ及び被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とから成るキット、（２）ヘモグロビンの吸光度を安定化させる試薬を含んでなる第一試薬と、プロテアーゼ試薬及び糖化ヘモグロビン由来基質の過酸化水素生成酵素を含んでなる第二試薬と、ペルオキシダーゼ及び被酸化呈色試薬を含んでなる第三試薬とからなるキット、或いは（３）ヘモグロビンの吸光度を安定化させる試薬を含んでなる第一試薬と、プロテアーゼ試薬及び被酸化呈色試薬を含んでなる第二試薬と、糖化ヘモグロビン由来基質の過酸化水素生成酵素及びペルオキシダーゼを含んでなる第三試薬とから成るキット、ＨＢ安定化剤を含んでなる第一試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体試薬を含んでなる第二試薬と、抗糖化ヘモグロビン抗体に対するポリハプテン試薬を含んでなる第三試薬とから成るキットの何れかからなるヘモグロビン類測定用三試薬系キット。
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