JP2010237136A - 気体の遊離方法及び試薬キット - Google Patents

Abstract

【課題】生体から抽出された検体に含まれる気体の放出効率をさらに高めた気体の遊離方法を提供する。
【解決手段】気体の遊離方法は、検体を封入した密閉容器としてのバイアル瓶内に、ヘム蛋白のガス結合を阻害する蛋白変性物質を含む第１の試薬を添加する第１の工程（Ｓ１２）と、第１の工程の終了から所定時間経過後に、密閉容器内にシアンイオンを含む第２の試薬を添加する第２の工程（Ｓ１２）とを含む。
【選択図】図２

Description

本発明は、気体の遊離方法、特に医療現場において患者から採取された検体に含まれる微量の一酸化炭素を遊離させる方法に関するものである。

今まで、医療現場における一酸化炭素濃度測定の用途は、一酸化炭素中毒に関係するものがほとんどであった。しかしながら、近年では生体内の一酸化炭素が抗酸化ストレス作用を発揮したり、血管拡張作用や神経伝達物質として作用することが明らかとなっており、一酸化炭素の薬理効果に注目が集まっている。

ここで、患者から採取した検体（血液、細胞等）に含まれる一酸化炭素濃度を測定する従来の方法としては、例えば、特開２００５−３３７８１３号公報（特許文献１）及び特開昭６３−１２０２５５号公報（特許文献２）に開示されている方法が知られている。

上記の各文献に開示されている測定方法は、気体を放出させるための試薬（以下「気体放出試薬」と表記する）を検体に添加し、放出された気体の濃度を測定装置で測定するというものである。また、気体放出試薬の具体例としては、一酸化窒素及びフェリシアン化カリウムが挙げられている。さらに、スルホサリチル酸も気体放出試薬として使用可能であることが知られている。

特開２００５−３３７８１３号公報 特開昭６３−１２０２５５号公報

しかしながら、上記の各気体放出試薬を単体で使用した場合、検体に含まれる気体を１００％放出させることはできなかった。これは、一酸化炭素中毒患者の生体内に含まれる％オーダーの一酸化炭素測定には利用可能であるが、薬理効果を発揮する一酸化炭素は極微量（ｐｐｍオーダー）であり、上記従来の試薬を用いる方法では感度不足となっている。

そこで、本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、検体に含まれる気体の放出効率をさらに高めた気体の遊離方法、及び当該方法に使用する試薬キットを提供することを目的とする。

本発明に係る気体の遊離方法は、生体から抽出された検体に含まれる気体を遊離させる方法である。具体的には、前記検体を封入した密閉容器内に、ヘム蛋白のガス結合を阻害する蛋白変性物質を含む第１の試薬を添加する第１の工程と、前記第１の工程の終了から所定時間経過後に、前記密閉容器内にシアンイオンを含む第２の試薬を添加する第２の工程とを含む。

上記方法のように、第１及び第２の試薬をこの順序で添加することにより、これらの試薬を単体で使用する場合と比較して、検体からの気体の放出効率が著しく向上する（ほぼ１００％）。

また、前記蛋白変性物質は、スルホサリチル酸であってもよい。さらに、前記第１の試薬に含まれるスルホサリチル酸の濃度は、０．８％〜１．３％であってもよい。上記の添加順序に加えて、蛋白変性物質の一例であるスルホサリチル酸の濃度を１％前後とすることにより、さらに放出効率が向上する。

また、前記第２の試薬は、蒸留水に過剰なフェリシアン化カリウムを混合したフェリシアン化カリウム過飽和溶液であってもよい。フェリシアン化カリウムは、他のシアン化合物と異なり毒性が極めて低いので、第２の試薬を安全に調製することができる。

本発明に係る試薬キットは、上記記載の気体の遊離方法に使用される試薬キットである。具体的には、前記第１の試薬と前記第２の試薬とを備える。第１及び第２の試薬は、検体の量（例えば、５〜１５０μｌ）に拘らず、一定の量（例えば、０．５〜２ｍｌ）でほぼ１００％のガスを放出させることができるので、予め所定量を小分けした試薬キットとして提供することで、現場での作業効率が向上する。

本発明に係る気体の遊離方法によれば、検体に含まれる気体の放出効率が飛躍的に向上する。

本発明の一実施形態に係る気体の遊離方法に使用される器具の模式図である。 本発明の一実施形態に係る気体の遊離方法の手順を説明する図である。 本発明の効果を確認するための実験結果を示す図である。

図１及び図２を参照して、本発明の一実施形態に係る気体の遊離方法を説明する。なお、図１は、気体を遊離させるための器具を説明する図である。図２は、気体を遊離させる手順を説明する図である。

本発明の一実施形態に係る気体（ガス）の遊離方法では、図１に示されるように、バイアル瓶１１０と、ブチルゴム栓１２０と、３本のシリンジ１３０、１４０、１５０とを少なくとも使用する。

バイアル瓶１１０には、生体から抽出された検体の一例としての血液１０が封入される。なお、検体は血液１０に限定されず、細胞であってもよい。また、生体から抽出した細胞は、予めホモジナイズ（均質化）しておくのが望ましい。

ブチルゴム栓１２０は、バイアル瓶１１０の上部開口を封止する。また、後述する第１及び第２の試薬３０、４０をバイアル瓶１１０に添加すると、バイアル瓶１１０の内部圧力が上昇する。この内部圧力の変化によってバイアル瓶１１０とブチルゴム栓１２０との間からガスが漏れるのを防止するために、メラミン製穴あきキャップ（図示省略）を用いて補強するのが望ましい。

シリンジ１３０には、第１の試薬３０が封入されている。シリンジ１４０には、第２の試薬４０が封入されている。シリンジ１５０は、第１及び第２の試薬３０、４０を用いて血液１０から遊離したガス５０を吸引する。

第１の試薬３０は、血液１０に含まれるヘム蛋白のガス結合を阻害する蛋白変性物質を含む。蛋白変性物質は特に限定されないが、典型的にはスルホサリチル酸である。つまり、第１の試薬３０は、蒸留水のスルホサリチル酸を溶解させたスルホサリチル酸溶液である。なお、スルホサリチル酸の至適濃度は、１％（ｗ／ｖ）を含む非常に狭い範囲（例えば０．６〜２．０％、より好ましくは０．８〜１．３％）である。

第２の試薬４０は、ガスに代わってヘム蛋白と結合するシアンイオン（ＣＮ^-）を含む。第２の試薬４０の製造方法は特に限定されないが、例えば、蒸留水に過剰のフェリシアン化カリウムを加えたフェリシアン化カリウム過飽和溶液である。フェリシアン化カリウムは、他のシアン化合物と異なり毒性が低いので、第２の試薬４０を安全に調製することができる点で有効である。なお、「過剰」とは、蒸留水に対するフェリシアン化カリウムの最大溶解量を超える量を指すものとする。

なお、図１中の破線は第１及び第２の試薬３０、４０を添加した後の液面を示し、この液面より上の密閉領域をヘッドスペース部２０と呼ぶ。第１及び第２の試薬３０、４０によって血液１０から遊離したガスは、このヘッドスペース部２０に集まる。そして、シリンジ１５０を用いて、ヘッドスペース部２０からガス５０を吸引する。

次に、図２を参照して、上記の各器具を用いて血液１０に含まれるガスを遊離させる方法を説明する。

まず、生体から抽出した血液１０をバイアル瓶１１０に入れ、当該バイアル瓶１１０の上部開口をブチルゴム栓１２０で封止する（Ｓ１１）。なお、バイアル瓶１１０に入れられる血液１０は、例えば、５〜１５０μｌである。

次に、シリンジ１３０を用いて第１の試薬３０をバイアル瓶１１０に添加し、激しく攪拌する（Ｓ１２）。第１の試薬３０の添加は、シリンジ１３０のニードル１３１をブチルゴム栓１２０に突き刺して、バイアル瓶１１０の密閉状態を維持した状態で行われる。第１の試薬３０の添加量は、例えば、１ｍｌである。攪拌は、例えば、Ｖｏｒｔｅｘ（登録商標）ミキサーを用いればよい。攪拌時間は５〜３０秒、より好ましくは８〜１５秒とする。

次に、シリンジ１４０を用いて第２の試薬４０をバイアル瓶１１０に添加し、激しく攪拌する（Ｓ１３）。第２の試薬４０の添加は、シリンジ１４０のニードル１４１をブチルゴム栓１２０に突き刺して、バイアル瓶１１０の密閉状態を維持した状態で行われる。第２の試薬の添加量は、例えば、１ｍｌである。攪拌は、例えば、Ｖｏｒｔｅｘ（登録商標）ミキサーを用いればよい。攪拌時間は１０〜６０秒、より好ましくは２０〜４０秒とする。

上記の各工程によって、バイアル瓶１１０のヘッドスペース部２０に、血液１０から放出されたガスが集まる。なお、ガスを十分に放出させるには、第１及び第２の試薬３０、４０を添加した後（Ｓ１３の終了後）、バイアル瓶１１０を所定の時間放置する必要がある。放置時間は５分〜６０分、より好ましくは８〜１５分とする。

なお、スルホサリチル酸は、血液１０に含まれる蛋白質（ヘム蛋白）の変性作用を利用して血液１０からガスを放出させる。また、ガスと結合しているヘモグロビンは、フェリシアン化カリウムの作用によって、メトヘモグロビンとなる。その結果、ヘモグロビンに結合していたガスが放出される。つまり、ヘッドスペース部２０に含まれる気体は、ヘム蛋白に結合していた様々なガス（酸素、一酸化炭素、二酸化炭素等）が交じり合った混合気体である。

次に、シリンジ１５０を用いて、バイアル瓶１１０のヘッドスペース部から所定量のガスを吸引する（Ｓ１４）。ガスの吸引は、シリンジ１５０のニードル１５１をブチルゴム栓１２０に突き刺して、バイアル瓶１１０の密閉状態を維持した状態で行われる。そして、シリンジ１５０内のガス５０の成分や濃度等は、測定装置（図示省略）によって測定される。

ガス５０の成分や濃度を測定する測定装置は特に限定されないが、例えば、株式会社タイヨウ製のトライライザー（登録商標）を用いるのが望ましい。トライライザー（登録商標）は、いわゆるガスクロマトグラフィ装置であって、一酸化炭素を他の物質に変換することなく、濃度を直接測定することができる。その結果、光学的にガス濃度を測定するような装置や、一酸化炭素をメタン等に変換してから濃度測定を行う装置と比較して、高精度の濃度測定が可能となる。特に、微量（０．１％以下）のガス濃度測定においては、顕著な効果を奏する。

次に、表１及び図３を参照して、試薬の組み合わせとガスの放出量との関係を説明する。この実験では、血液量（５〜１５０μｌ）と検体から放出された一酸化炭素濃度との関係を試薬毎に測定した。実験結果を表１及び図３に示す。

なお、比較例１（図３中の□）は、第１の試薬３０を単体で使用した場合の結果を示す。比較例２（図３中の◇）は、第２の試薬４０を単体で使用した場合の結果を示す。実施例（図３中の△）は第１の試薬３０と第２の試薬４０とをこの順番で使用した場合の結果を示す。一方、図３中の×は理論値を示す。また、各実験では、血液量の多少に拘らず、１ｍｌの試薬を添加（実施例では１ｍｌずつ）した。

ここで、本明細書中の各実験において「第２の試薬４０を単体で使用する」場合には、実際には、溶血作用を有するフタル酸を添加して所定時間攪拌してから第２の試薬４０を添加している。一方、「第１及び第２の試薬３０、４０を組み合わせて使用する」場合には、特に明示がない限りフタル酸は使用していない。

また、理論値（図３の×で示される値）は、式（１）を用いて算出される。なお、式（１）中のＣ（ｐｐｍ）は、一酸化炭素濃度の理論値を示す。Ｘ（％）は、血液１００μｌ中のＣｏＨｂ（一酸化炭素と結合したヘモグロビン量）をコオキシメータで測定した結果を示す。Ｙ×１０^-3（ｇ）は、血液１００μｌ中のヘモグロビン濃度をコオキシメータで測定した結果を示す。Ｚ（ｍｌ）は、コオキシメータでの測定時におけるバイアル瓶のヘッドスペース容積である。さらに、１ｇのヘモグロビンに結合する一酸化炭素の量は、１．３６８（ｍｌ）として計算している。

表１及び図３によれば、比較例１のＣＯ放出量は理論値の８５％程度、比較例２のＣＯ放出量は理論値の１５％程度であったのに対し、実施例のＣＯ放出量は理論値とほぼ一致した（約１００％）。つまり、両試薬を組み合わせることにより、ＣＯ放出効率が著しく改善したことが確認された。

また、実施例では、血液量（５〜１５０μｌ）の多少に拘らず、第１及び第２の試薬３０、４０を１ｍｌずつ添加した。一方、ＣＯ放出量は、図３を参照すれば明らかなように、血液量に比例して増加することが確認された。つまり、少なくとも血液量が上記の範囲内であれば、血液量に応じて第１及び第２の試薬３０、４０の添加量を調整しなくとも、血液内のガスをほぼ１００％放出させることができると確認された。

そこで、本発明に係る第１及び第２の試薬３０、４０は、それぞれを所定量（例えば、０．５〜２ｍｌ）ずつ容器（サンプル瓶等）に小分けしておくことができる。つまり、第１の試薬３０を所定量封入した第１の容器と、第２の試薬４０を所定量封入した第２の容器とを含む試薬キットとして提供することができる。そして、予め調製された第１の試薬３０を第１の容器からシリンジ１３０で直接吸引し、予め調製された第２の試薬４０を第２の容器からシリンジ１４０で直接吸引するようにすれば、実際の医療現場等で作業の効率化が図れる。

次に、表２を参照して、第１及び第２の試薬３０、４０の添加順序とガスの放出量との関係を説明する。なお、この実験では、第１の試薬３０を添加した後で第２の試薬４０を添加した場合と、第２の試薬４０を添加した後で第１の試薬を添加した場合とで、一酸化炭素の放出量をそれぞれ測定した。

表２によれば、第１の試薬３０を先に添加した場合のＣＯ放出量が、第２の試薬４０を先に添加した場合と比較して約１．７倍となることが確認された。つまり、第１及び第２の試薬３０、４０の添加順序は、血液１０からのＣＯ放出量に極めて重大な影響を与えることが確認された。

また、第１及び第２の試薬３０、４０を予め混合してから血液１０に添加した場合についても確認を行った。その結果、フタル酸と第１及び第２の試薬３０、４０を予め混合してから血液１０に添加した場合のＣＯ放出量は１．３５ｐｐｍ程度であった。一方、フタル酸と第１の試薬３０とを予め混合してから血液１０に添加した場合（つまり、第２の試薬４０を単体で添加した場合）のＣＯ放出量も１．３５ｐｐｍ程度であった。つまり、第１及び第２の試薬３０、４０を同時に添加しても有利な効果を得ることはできないことが確認された。

上記の各実験によれば、第１及び第２の試薬３０、４０を単純に組み合わせて使用するだけでは、従来の方法に対する優位性は認められないことが確認された。つまり、第１及び第２の試薬３０、４０の組み合わせに加えて、添加順序が重大な影響を与えることが確認された。

次に、表３を参照して、第１の試薬３０におけるスルホサリチル酸の濃度とガスの放出量との関係を説明する。なお、この実験では、第１の試薬３０のスルホサリチル酸を０．５〜２０％まで変化させた。また、一酸化炭素の濃度測定は、第１の試薬３０を添加後１０分、６０分、及び６０分経過後に第２の試薬４０を添加したタイミングでそれぞれ行った。さらに、第２の試薬４０を添加した後で第１の試薬３０を添加したタイミングでの一酸化炭素の濃度測定も合わせて行った。

表３によれば、スルホサリチル酸の濃度を１％にしたときのＣＯ放出率が、実験中のいずれの段階においても顕著に高い値を示した。つまり、スルホサリチル酸の至適濃度は、１％を含む非常に狭い範囲（例えば０．６％〜２．０％、より好ましくは０．８％〜１．３％）であることが確認された。

一方、第２の試薬４０の後に第１の試薬３０を添加した場合、スルホサリチル酸の濃度に拘らず、ＣＯ放出率は低い値でほぼ一定した。つまり、ガスの放出量に最も大きな影響を与えるのは、第１及び第２の試薬３０、４０の添加順序であることが確認された。

上記の各実験によって、本発明に係る気体の遊離方法は、検体中のガスをほぼ１００％放出させることができることが確認された。つまり、検体中の極微量（ｐｐｍオーダー）のガスを測定する必要がある分野で、特に有利な効果を奏する。具体的には、医療現場において生体中のガス濃度を測定するような場合に特に有効である。

なお、上記の各実験では、血液１０から放出された気体のうち、一酸化炭素の濃度を測定する例を説明したが、本発明の用途はこれに限定されない。つまり、本発明に係る気体の遊離方法によれば、ガス（一酸化炭素、二酸化炭素、酸素、窒素等）の種類を問わず、血液１０内のヘモグロビンと結合しているガスをほぼ１００％の効率で放出させることができる。従って、測定装置の測定条件等を変更すれば、血液１０中の他の気体の濃度等を測定できることは言うまでもない。

以上、図面を参照してこの発明の実施形態を説明したが、この発明は、図示した実施形態のものに限定されない。図示した実施形態に対して、この発明と同一の範囲内において、あるいは均等の範囲内において、種々の修正や変形を加えることが可能である。

本発明は、生体から抽出された検体に含まれる気体を遊離させる方法、及び当該方法に使用される試薬キットとして有利に利用される。

１０ 血液
２０ ヘッドスペース部
３０ 第１の試薬
４０ 第２の試薬
１１０ バイアル瓶
１２０ ブチルゴム栓
１３０，１４０，１５０ シリンジ
１３１，１４１，１５１ ニードル

Claims (5)

1. 生体から抽出された検体に含まれる気体の遊離方法であって、
   前記検体を封入した密閉容器内に、ヘム蛋白のガス結合を阻害する蛋白変性物質を含む第１の試薬を添加する第１の工程と、
   前記第１の工程の終了から所定時間経過後に、前記密閉容器内にシアンイオンを含む第２の試薬を添加する第２の工程とを含む
   気体の遊離方法。
2. 前記蛋白変性物質は、スルホサリチル酸である
   請求項１に記載の気体の遊離方法。
3. 前記第１の試薬に含まれるスルホサリチル酸の濃度は、０．８％〜１．３％である
   請求項２に記載の気体の遊離方法。
4. 前記第２の試薬は、蒸留水に過剰なフェリシアン化カリウムを混合したフェリシアン化カリウム過飽和溶液である
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の気体の遊離方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の気体の遊離方法に使用される試薬キットであって、
   前記第１の試薬と、前記第２の試薬とを備える
   試薬キット。

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