JP2004529342A

JP2004529342A - 試料中の実効的な副甲状腺ホルモン活性の測定方法

Info

Publication number: JP2004529342A
Application number: JP2002579811A
Authority: JP
Inventors: ポールアルムブルスター，フランツ; ロート，ハインツ−ユルゲン; シュミット−ガイク，ハインリッヒ
Original assignee: ABC ARMBRUSTER BIOCHEMICALS; Schmidt Gayk Heinrich
Current assignee: ABC ARMBRUSTER BIOCHEMICALS; Schmidt Gayk Heinrich
Priority date: 2001-04-03
Filing date: 2002-04-03
Publication date: 2004-09-24
Anticipated expiration: 2022-04-03
Also published as: ATE408842T1; DE50212794D1; EP2006688A2; JP4294961B2; US20060211054A1; EP1425588B1; EP2006688B1; EP1425588A2; EP2006688A3; DK2006688T3; WO2002082092A3; DE10116552A1; US7790398B2; WO2002082092A2; DK1425588T3

Abstract

試料中の活性な副甲状腺ホルモンの含有量を測定する方法であり、アミノ酸１５〜２２を有するＰＴＨ受容体結合構造の近傍で１つまたはそれ以上の部位で酸化された副甲状腺ホルモンのポリペプチド鎖の要素が含有量測定から特定的に排除される。副甲状腺ホルモンの酸化は特に透析患者において発生し、彼らの血液プラスマは透析中に酸化ストレスに曝される。本発明は、酸化され、または還元された副甲状腺ホルモンおよびその断片の特定のコンフォメーションエピトープに結合する抗体の使用に基づく。さらに、試料中の副甲状腺ホルモンとこの活性な断片を定量する試験システムを提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は試料中に含有される副甲状腺ホルモンの実効的な濃度を測定する免疫学的方法に関する。本発明は特に、カルシウム代謝の障害、骨障害、上皮小体機能の亢進症または低下症に対する診断、病因究明および治療のための活性な副甲状腺ホルモンおよびその生物学的に活性な断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）の含有量を測定するための試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は上皮小体（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｇｌａｎｄ；ｇｌａｎｄｕｌａｅｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｅａ）で形成され、血液循環へと分泌される。完全形（ｉｎｔａｃｔｆｏｒｍ）では、それは８４のアミノ酸を有する単一のポリペプチド鎖からなり、約９５００ダルトンの分子量を有する（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ０１２７０，ＰＴＨＹ−ＨＵＭＡＮを参照せよ）。それは、ビタミンＤおよびカルシトニンとともに、カルシウムおよリン酸塩の骨格（ｂｏｎｅｓｋｅｌｅｔｏｎ）からの動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）をもたらし、腸でのカルシウムの摂取と腎臓によるリン酸塩の排出を増加させる。このように、プラスマ（ｐｌａｓｍａ）あるいは血清中の実効的なＰＴＨの活性は、重要な診断パラメータであり、以下のことを決めるのに必要である：１）上皮小体機能の亢進症または低下症の存在および程度、２）骨芽細胞の活性の定量、３）破骨細胞の活性の定量、４）ビタミンＤと活性ビタミンＤ代謝物での治療のモニタ、５）アルミニウムの存在の推定、６）閉経後の透析患者の起こりうるエストロゲン欠乏の推定、６）腎臓移植後の必要なステロイドまたはシクロスポリンの投薬、７）病理学的な骨髄（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ）の変化、尿毒症状態および慢性腎不全の治療と防止の必要性。
【０００３】
従来技術においては、ＰＴＨの測定はＰＴＨポリペプチド鎖上の２つの分離したエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）の検出によりもたらされる。人の血清中の完全な（ｉｎｔａｃｔ）ＰＴＨ鎖を定量する特に高感度なイムノアッセイの導入で、カルシウムのホメオスタシス（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）、骨の変換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および上皮小体などの原因である制御器官の分野の全ての診断上の質問に対して回答されるようである。
【０００４】
しかし、そのように測定された値は、プラスマあるいは血清試料中の実際に存在するＰＴＨ活性にしばしば対応しない。それらはしばしば患者の症状に調和できないＰＴＨ含有量を供するからである。通常の骨の変換を有する尿毒症状態の患者の場合、血清中の完全なＰＴＨのレベルは、大抵は健康な腎臓を有する患者の２．５倍高いところにある（健康な腎臓の患者の病理学的限界：６５μｇＰＴＨ／Ｌ；尿毒症状態の患者に対して：１６５μｇＰＴＨ／Ｌ血清）。さらに、ＰＴＨ値が比較的高い尿毒症の患者は、骨の変換について明らかな差をしばしば表す（ＳｌａｔｏｐｏｌｓｋｙＥら（２０００），ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．，５８，７５３−７６１）。このように、これらの患者は、血清中に８〜１０倍に増加したＰＴＨ濃度を、しかし骨の特定のアルカリフォスファターゼ（ｏｓｔａｓｅ）については低い通常値を、しばしば有する。このように、彼らは過度のＰＴＨ活性の症状がない。可能性のある原因として、測定の系統的な誤り、あるいは、例えばＰＴＨ受容体の遺伝的に減少した発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によることなど、骨芽細胞中のＰＴＨ抵抗が議論されてきた。さらに、循環あるいは肝臓中でホルモンが数分のうちの活性あるいは不活性な断片に破壊されてしまうという点で、血清あるいはプラスマ中の実効的なＰＴＨ含有量の測定はより困難となる。これらの断片のいくつかは、完全なＰＴＨ（以下を参照せよ；ＥＰ−Ａ０３４９５４５；Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｇａｙｋら（１９９９），Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｅｆｏｒｕｍ，５，４８−５８）に匹敵する活性を有し、他方で残りは拮抗するように（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｌｌｙ）機能する。このように、断片ｈＰＴＨ（３−３４）およびｈＰＴＨ（７−３４）はＰＴＨの効果を阻害しうることが知られている（Ｓｕｖａら（１９８７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７，８９３ｆｆ；ＥＰ０４５１８６７）。
【０００５】
さらに、”（１−８４）ではない”大きなＰＴＨ断片は、誤った測定がなされているのではないかと疑われてきた（ＬｅＰａｇｅＲ．ら（１９９８），Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４４，８０５−８０９）。”大きなＰＴＨ断片”との名称は、少なくともアミノ酸３９〜８４と、Ｎ末端アミノ酸１〜３が失われているＮ末端断片ｈＰＴＨ（１−３３）、ｈＰＴＨ（１−３４）、ｈＰＴＨ（１−３７）あるいはｈＰＴＨ（１−３８）のエピトープを有するポリペプチド鎖を含む断片に対して一般的に用いられる。ＷＯ９６／１００４１は、Ｎ末端アミノ酸であるセリンとバリンが失われた後はＰＴＨ断片はもはや活性ではないことを開示している。ｈＰＴＨ（７−８４）のタイプの合成の断片を用いる様々な免疫学的試験の特徴づけは、概してこれらは不活性な大きなＰＴＨ（７−８４）断片も測定していることを示す（ＪｏｈｎＭＲら（１９９９），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８４，４２８７−４２９０；ＧａｏＰら，２０００，ポスターＭ４５５，ＡＳＢＭＲ第２２回年回（ＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ）；ＲｏｔｈＨＪら（２０００），ポスターＰ１２８８；第１１回国際内分泌学会，シドニー）。不活性な大きなＰＴＨ断片の同時測定は、測定されたＰＴＨ濃度と臨床的な所見との間の相違の原因となった。完全なＰＴＨ分子はＰＴＨ受容体上の結合部位に対して大きなＰＴＨ断片と競合し、また、ＣＡＰ（ＣｙｃｌａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇＰＴＨ−生物学的に活性）あるいはＣＩＰ（ＣｙｃｌａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｉｎｇＰＴＨ−生物学的に不活性、受容体ブロック（ｂｌｏｃｋｉｎｇ））の濃度に応じて、異なる細胞活性化が生じるのではと疑われた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、試料中の実効的なＰＴＨ含有量の定量方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は請求項１による方法によって達成される。さらに、この方法の都合のよい実施の形態が従属請求項に示されている。
【０００８】
本発明に係る試料中のＰＴＨ含有量の定量方法は、完全なＰＴＨのポリペプチド鎖とＰＴＨ受容体結合構造（１５〜２２）を有するＮ末端の完全な断片であり、ＰＴＨ受容体結合構造（１５〜２２）の近傍の１つ以上の部位で酸化されたものは、含有量測定から排除されることを特徴とする。換言すると、ＰＴＨ活性あるいは実効的なＰＴＨ含有量の測定から、メチオニン−８あるいは−１８またはその両方位置で酸化された全てのＰＴＨポリペプチド鎖および断片が排除される。これは、少なくとも１つの８位および／または１８位の酸化されたメチオニン基からなるＰＴＨエピトープに結合する抗体、特定的にメチオニン８および／または１８において酸化されたＰＴＨポリペプチド鎖または断片に結合する抗体、または、酸化された、および、”天然の”非酸化の副甲状腺ホルモンの特定のコンフォメーションエピトープを識別できる抗体の使用によりもたらされる。このように、受容体結合構造であるＰＴＨ（１５−２２）を含む、ｈＰＴＨ（７−８４）またはｈＰＴＨ（３−８４）のタイプの不活性の大きなＰＴＨ断片、酸化された完全なｈＰＴＨ（１−８４）、および、ｏｘ−ｈＰＴＨ（１−３４）あるいはｏｘ−ｈＰＴＨ（１−３７）のタイプの酸化されたＮ末端の完全な酸化されたｈＰＴＨ断片が測定から排除されることが保証される。
【０００９】
本発明によれば、抗体は、８位および／または１８位が酸化された副甲状腺ホルモンでの精製あるいは選択を通して得ることができる。抗体は、合成の、あるいは特定的に酸化されたＰＴＨ断片の免疫処置を通して得ることができる（ＬｏｇｕｅＦＣら（１９９１），Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８，１６０−１６６；ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，３９，１５９）。例えば、合成のＰＴＨ（１−３４）は、Ｈ₂Ｏ₂の添加によりメチオニン８および１８で酸化され、免疫処置での使用に供せられうる。特に、明らかに最初に酸化されるメチオニン−８に抗する単クローン抗体が好ましい。
【００１０】
本発明に係る方法の実施形態において、副甲状腺ホルモンと潜在的に活性なその断片は、化学的に後から酸化され、および／または後から還元され、完全な副甲状腺ホルモンとその活性な断片の含有量が二重の測定（前と後）によって測定される。さらなる実施形態では、試料中の酸化された完全な副甲状腺ホルモンとこの断片の含有量が、分離して追加で測定され、ＰＴＨの総計と酸化されていないＰＴＨおよびその生物学的に活性な断片の含有量の同時の測定を通して算出される。
【００１１】
この方法の特に好ましい実施形態において、酸化された副甲状腺ホルモンのマスキングために、８位および／または１８位で酸化された副甲状腺ホルモンに抗する抗体が添加され、全く、酸化されていない、または生物学的に活性な副甲状腺ホルモンとその断片のみが第１および第２の抗体によって結合される。それから、本発明に係る方法は、次に示す、８位および／または１８位において酸化された副甲状腺ホルモンか関係するエピトープ識別する抗体で試料を処理する工程；副甲状腺ホルモンのＮ末端アミノ酸１〜３からなる識別する抗体で試料を処理する工程；人の副甲状腺ホルモンの受容体結合構造（アミノ酸１５〜２２）の領域におけるエピトープを識別し、酸化されたメチオニン８および／または１８の領域で抗体が既に結合しているときには結合できない抗体で試料を処理する工程；および２つの抗体で識別された分子数の測定工程、を含む。好ましくは、２つの抗体の結合は、０．０５〜０．１重量％のＴｗｅｅｎ^TM２０またはＴｒｉｔｏｎ^TMＸ−１００などの穏やかな洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）の存在下でもたらされる。本発明によれば、特に好ましい実施形態において、このように、副甲状腺ホルモンの受容体結合部位において結合する抗体が酸化されたＰＴＨポリペプチド鎖に結合できないように、試料はまず酸化された副甲状腺ホルモンに抗する抗体で処理される。酸化された副甲状腺ホルモンとこの断片のマスキングのための抗体は、サンドイッチ錯体を形成し、あるいは検出する抗体よりも異なるタイプである方が好ましいということを当業者は知っている。捕獲体（ｃａｐｔｏｒ）あるいはトレーサ（ｔｒａｃｅｒ）として用いられる抗体もまた、当業者が知るように、機能的に交換されうる。
【００１２】
さらなる実施形態において、少なくとも１つの抗体が、蛍光性または化学発光性の基、または、検出反応の触媒作用のための酵素から選択されたマーキングを伴う。好ましくは、抗体の１つは、ルテニウム錯体でマークされ、アミノ酸１５〜２２または２６〜３２の領域のエピトープを識別する単クローン抗体である。抗体の１つがビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）されて、ストレプタビディン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を介して固相に結合されていてもよい。本方法では、さらにアミノ酸４〜１４または１５〜３５ｖ３９を有するＰＴＨポリペプチド鎖に結合する抗体を用いることができる。アミノ酸１５〜２２の領域のいエピトープを識別する抗体は、一方でこのエピトープが受容体結合構造の領域に存在し、他方ではそのような抗体はメチオニン１８に起因して酸化されたｈＰＴＨと天然のｈＰＴＨを識別できるので、特に好ましい。
【００１３】
本発明に係る試料中の副甲状腺ホルモンとこの断片の定量のための試験システムは、一実施形態において、副甲状腺ホルモンのＰＴＨ受容体結合構造に、あるいはその近傍に、抗体が結合する相に結合された抗体（捕獲抗体）と、マスキングのために、酸化されたメチオニン８および／または１８を有する副甲状腺ホルモンエピトープに結合する、遊離した（結合していない）抗体を含む。抗体は、例えば酸化された副甲状腺ホルモンのメチオニン８および／または１８へのそれらの結合を通し、親和力クロマトグラフィ（ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって精製されうる。トレーサ抗体として、（還元された構造の）副甲状腺ホルモンのＮ末端アミノ酸１〜３に抗する抗体が用いられる。捕獲およびトレーサ抗体は交換されうる。
【００１４】
さらに本発明は、透析患者の酸化ストレスの診断に関し、それによって本発明に従う副甲状腺ホルモンとその活性な断片の定量のための試験管内試験が用いられる。
【００１５】
ＰＴＨ断片の試験から酸化された副甲状腺ホルモンあるいは酸化された副甲状腺ホルモン断片が生物学的に活性であることがわかっても、この酸化が生理学的に妥当な準位を装い（ａｓｓｕｍｅ）、試料中の真の生理学的なＰＴＨ活性の測定を妨げうることを想像することはできなかった。このように、従来のある試験方法では、試料バッファ中に抗体を安定化するための還元手段が添加され、他の方法では、後に続くＰＴＨ分子の部分的な酸化が許容された。
【００１６】
本発明はまた、実施形態において、上皮小体機能の亢進症および低下症の診断および程度方法、カルシウム代謝の障害の病因究明、骨障害、腎不全および血液中のカルシウムのおよびリン酸塩の含有量の阻害されたホメオスタシスから生じる状態に関する。さらに、本発明に従って、Ｎ末端ＰＴＨ断片の直接的な生成も、これが生じる限り指示される。これは、本発明に従うＰＴＨ診断は、完全な活性副甲状腺ホルモンに加えて、直接生成された生物学的に活性なＰＴＨ断片も検出するということを意味する。
【００１７】
酸素は好気性生物にとって不可欠のものであるが、しかし同時に、たんぱく質、脂質および核酸との反応を通して細胞にダメージを与え、反応性のアミノ酸の酸化を通してたんぱく質の構造を作り変えることができる、遊離した反応性酸素種（ＲＯＳ；ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）の最も重要な先駆体分子である。多くの発表は、慢性的に腎機能の不完全な患者の場合の複雑化した病因への酸化ストレスの効果および”進歩したグリケーション最終生成物（ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃａｔｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）”の影響に関するものである（Ｍａｒｔｉｎ−ＭａｔｅｏＭＣ．ら（１９９９），Ｒｅｎ．Ｆａｉｌ．，２１，１５５−１６７；ＨａｓｓｅｌｗａｎｄｅｒＯ．ら（１９９８），ＦｒｅｅＲａｄｉｃ．Ｒｅｓ．，２９，１−１１；ＺｏｃｃａｌｉＣ．ら（２０００），Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１５，Ｓｕｐｐｌ．２；ＣａｎａｕｄＢら（１９９９），ＢｌｏｏｄＰｕｒｉｆ．，１７，９９−１０６）。酸化ストレスによって非常に強く影響された透析患者が通常の人と比較される。様々な調査グループが、酸化された副甲状腺ホルモンとその生物学的な活性を調査してきた（ＡｌｅｘｉｅｗｉｃｚＬＭら（１９９０），Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１，２３６−２４４；ＺｕｌｌＪＥら（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，５６７１−５６７６；ＰｉｔｔｓＴＯら（１９８８），Ｍｉｎｅｒ．ＥｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅＭｅｔａｂ．，１５，２６７−２７５；ＨｏｒｉｕｃｈｉＮ．（１９８８），Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，３，３５３−３５８；ＦｒｅｌｉｎｇｅｒＡＬら（１９８６），Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２４４，６４１−６４９；ＧａｌｃｅｒａｎＴら（１９８４），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１１５，２３７５−２３７８；ＦｒｅｌｉｎｇｅｒＡＬら（１９８４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，５５０７−５５１３；Ｏ’ＲｉｏｒｄａｎＪＬＨら（１９７４），Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒ．，６３，１１７−１２４；ＬｏｇｕｅＦＣら（１９９１），Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８，１６０−１６６；ＬｏｇｕｅＦＣ（１９９１ｂ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．，３９，１５９）。しかしながら、透析患者の酸化ストレスおよびそのＰＴＨ診断に対する結果は、それほど調査され、認められてはこなかった。
【００１８】
現在、従来の定量方法はどの場合も、試験キットおよび抗体に依存して両方の生物活性の（天然および還元された）完全のＰＴＨを検出し、もし適用できれば、その断片および酸化されたＰＴＨを検出し、そしてまた適用できれば、その断片を検出し、このように副甲状腺ホルモンの実効的なレベルを誤って測定するということが見いだされている。
【００１９】
さらに、仮定された大きなＰＴＨ断片は、それらがただ生じる限りでは、全く生物学的な意義を持たず、むしろ、測定されたＰＴＨ含有量と医学的な決定の間の間の不一致が、少なくとも一部的に透析患者が受けてしまう酸化ストレスから生じる、ということが見いだされている。すなわち、プラスマあるいは血清試料中の実効的なＰＴＨ含有量は酸化ストレスに依存し、酸化ストレスは同時に病理学的状態の原因である。
【００２０】
本発明はさらに、第１の捕獲抗体が固相に結合される方法に関する。第２のトレーサ抗体は、例えば蛍光性または化学発光性の基であるマーカーを伴ってもよく、あるいは、アルカリフォスファターゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素で接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）されてもよい。この方法は、本発明に従って、それ自体知られたイムノアッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡ、ＥＣＬＩＡ、ＩＥＭＡ、ＩＲＭＡ、ＩＬＭＡまたはＬＩＡにおいてもたらされる。Ｎ末端エピトープＰＴＨ（１−３）のＰＴＨ受容体結合構造への組み込み（ｆｏｌｄｉｎｇ）を防止するために、あるいは、Ｎ末端エピトープＰＴＨ（１−３）を抗体に結合可能にしておくために、２つの抗体のＰＴＨへの結合は、好ましくは、０．０５〜０．１重量％のＴｗｅｅｎ^TM２０またはＴｒｉｔｏｎ^TMＸ−１００などの穏やかな洗浄剤の存在下でもたらされる。生物学的活性とＰＴＨの組み込みについて、受容体結合構造とアミノ末端エピトープＰＴＨ（１−３）の両方が必要であるので、恐らくこれらの２つの構造はお互いと相互作用する。穏やかな洗浄剤の存在下でも、ｈＰＴＨ（１−３）に抗する抗体を用いる上述の実施形態では、アッセイの感度と精度は明らかに向上できる。
【００２１】
方法の実施形態において、試料の知られたアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）がさらにアミノ酸４〜１４および／または１５〜３７の間のＰＴＨ配列に結合する抗体で処理される。エピトープＰＴＨ（１−３）およびＰＴＨの受容体結合構造に抗する抗体によって結合された分子の試料中の数と、ＰＴＨ領域４〜１４および１５〜３７に抗する抗体によって結合された分子の数は、お互いに関連を持っており、生物学的に実効的なＰＴＨ活性が測定される。
【００２２】
本発明はさらに、試料中のＰＴＨ発生の測定のための診断システムに関する。そのシステムは、アミノ酸１〜３を有するＮ末端エピトープを特定的に識別する抗体と、ＰＴＨ受容体結合構造の領域に結合する抗体によって特徴付けられる。さらなる実施形態では、診断システムはさらに、アミノ酸４〜１４の間の領域に結合する抗体を有する。第３の実施形態では、システムは副甲状腺ホルモンのアミノ酸２４と３７の間の部分、あるいは、ＰＴＨポリペプチド鎖の中央部（５３〜８６）あるいはＣ末端（５３〜８４）部分に結合する抗体を含む。
【００２３】
以前のイムノアッセイとは著しく異なり、本発明に係る方法は完全ではないＰＴＨ断片のＰＴＨ活性も考慮に入れ、また、副甲状腺ホルモンのアミノ末端の一番端のあるいは端から２つのアミノ酸が欠けているとき、あるいは、Ｎ末端断片の８位と１８位のメチオニンの１つあるいは両方が酸化されているときは、完全なＰＴＨは明らかに生物学的に不活性であることを考慮に入れる。アミノ酸１５〜２２を有する受容体結合構造と完全なＮ末端エピトープＰＴＨ（１−３）のどちらも持たないＰＴＨ断片は、アゴニストの（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）活性あるいは拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ）活性をどちらも持たない。
【００２４】
完全な副甲状腺ホルモンあるいはｈＰＴＨ（１−３７）を定量する従来の免疫学的試験は、生理学的活性が２つのエピトープの存在からのみ結論付けられていれば、誤った活性値を得る。従来の方法は、正しい組み込みあるいはＰＴＨ受容体への結合がアミノ酸セリンおよびバリンを有する完全なアミノ末端依存すること、および、ＰＴＨ受容体結合構造の近傍の８位および１８位のメチオニン基が酸化されてはならないことを考慮に入れない。本発明は、特に透析患者の場合、上述の位置でのＰＴＨの酸化は相当な量であり、診断上重要でありうる、という発見に基づく。活性ＰＴＨとして従来の試験で測定された、ｈＰＴＨ（７−８４）、ｈＰＴＨ（３−８４）あるいはｈＰＴＨ（４−３７）の断片は、それらが存在する限り、拮抗活性を持たないか、または計測不可能な程度である。中央部（５３−６８）あるいはＣ末端部（５３−８４）に抗する抗体に基づく試験システムは、ある患者がｈＰＴＨ（１−３７）、ｈＰＴＨ（１−３２〜３６）あるいはｈＰＴＨ（１−３８）というタイプの生物学的に活性なＰＴＨ断片を直接生成するという事実を見逃す。
【００２５】
ｈＰＴＨ（１−３）、ｈＰＴＨ（１−６）に抗する、あるいはｈＰＴＨ（１−３７）断片から得られるペプチドに抗する抗体に基づく免疫学的方法もまた、生物学的に活性な（還元された）構造単位のみが測定されるのではないので、誤った活性を反映する。アミノ酸１〜５あるいは６を部分的に有するＮ末端ペプチドに抗する多クローンの抗体あるいは抗血清を用いて、拮抗活性な断片でさえ活性ＰＴＨ断片と識別される。
【００２６】
本発明に係る方法は、このように、天然の（還元された）副甲状腺ホルモンとその活性断片の生理学的な効果を示すＰＴＨ活性値を医師に与えるものである。それはまた、血清中の完全なｈＰＴＨ（１−８４）の正常または低下した含有量を有し、血流中にｈＰＴＨ（１−３７）およびｈＰＴＨ（１−３８）などのＰＴＨ断片を直接分泌する患者の上皮小体機能の亢進症を識別する。
【００２７】
本発明に係る試料中のＰＴＨおよびその断片の活性を測定する方法は、手動の試験システムとしては、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、ＬＩＡあるいはＩＣＬＩＡ、ＩＬＭＡ、ＦＩＡまたはＩＦＭＡとして実現可能であり、あるいは好ましくは、自動システムに適合したバージョンに、液相あるいは固相技術に、実現可能である。
【００２８】
さらなる本発明の利点、特徴および実施形態が、以降の実施例とそれに伴う図面を通して提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
（実施例）
実施例１：大きなＰＴＨ断片の生物学的効果
従来技術において仮定されていた、大きなＰＴＨ断片が人の血清中に発生し、ＰＴＨ受容体への拮抗効果を有するか調べた。用いたイムノアッセイは合成したｈＰＴＨ（７−８４）（ＢａｃｈｅｍＡＧ）と交差反応（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔ）をしない抗体を基にしているので、測定値は人の血清中の完全な活性を持つｈＰＴＨの正確な濃度を示すはずである。これらの値を骨の変換のパラメータと比較した。従来技術によると、大きなＰＴＨ断片の生成は、フィードバック機構を介して規制されており、必要性が高くまたは低くなったときは、上皮小体の刺激あるいは抑制が適切な発現へと導く。現在、合成した大きなＰＴＨ断片ｈＰＴＨ（７−８４）とは臨床的に明らかな交差反応性を持たないＰＴＨを定量するための２つの試験システムが知られている。マンハイムのロチェ・ディアグノスティック（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＧｍｂＨ社のエレクシス（Ｅｌｅｃｓｙｓ、商標）２０１０ＰＴＨイムノアッセイと、スキャンチボディ（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）社のＣＡＰ−ＰＴＨ−ＩＲＭＡがある。電気化学発光イムノアッセイ（ロチェ・ディアグノスティックＧｍｂＨ社（マンハイム））は、アミノ酸２６〜３２に対応するＮ末端ＰＴＨエピトープに抗する単クローンの捕獲（ｃａｐｔｏｒ）抗体と、アミノ酸５５〜６４に対応するＣ末端ｈＰＴＨエピトープに抗するルテニウム錯体でマークしたトレーサ抗体を基にしている。用いた合成した大きなｈＰＴＨ（７−８４）断片（ＢａｃｈｅｍＡＧ）は、エレクシス^TM２０１０ＰＴＨイムノアッセイの捕獲抗体によって識別されないので、それは第三（ｔｅｒｔｉａｒｙ）折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）構造を識別しなければならず、いわゆるコンフォメーション抗体である。恐らく、用いられた大きなｈＰＴＨ（７−８４）断片（ＧａｏＰら，２０００，ポスターＭ４５５，ＡＳＢＭＲ
第２２回年会（ＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ）；ＲｏｔｈＨＪら（２０００），ポスターＰ１２８８，第１１回国際内分泌学会、シドニー）は、今回の結果が明らかにするように、合成あるいは保管中に酸化されたものである。エレクシス^TM２０１０ＰＴＨイムノアッセイの捕獲抗体は、恐らく酸化されたｈＰＴＨ（７−８４）だけでなく、還元されたＰＴＨ（７−８４）とも結合する。スキャンチボディ社のＣＡＰ−ＰＴＨ−ＩＲＭＡは、大きなＰＴＨ（７−８４）断片には結合できなかったＮ末端ｈＰＴＨ（１−６）に抗する多クローンの抗体を用いる。
【００３０】
様々なイムノアッセイ（ニコルズ（Ｎｉｃｈｏｌｓ）社ＩＲＭＡ、ロチェ社エレクシス^TM２０１０、ＤＵＯ−ＰＴＨスキャンチボディ社、ＰＴＨ−イムンディアグノスティク社（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ））を用いて完全なＰＴＨの測定に伴って、生成（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）マーカーとしての骨マーカーＢＡＰ（ｏｓｔａｓｅ）と吸収（ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）マーカーであるＴＲＡＰ５ｂも測定した。結果は次の表１に示されている。
【００３１】
（表１）
骨の成長（ｇｒｏｗｔｈ）および還元（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）マーカーと
ＰＴＨ測定値の相関

【００３２】
成長および変形マーカーの値と血清中のＰＴＨ含有量との相関は、ニコルス・インスティチュート社のＩＲＭＡと比較して、より特定の試験に対して明らかにより大きな相関は示さない（大きなＰＴＨ断片に対して交差反応性がない）。個々のＰＴＨアッセイのお互いとの相関は、他の研究でも示されてきたことであるが、非常に良い。これは、知られている試験システムは一つも満足な結果をもたらさないことを示す。
【００３３】
実施例２酸化および還元試験
エレクシス^TM２０１０試験とニコルス社のインタクト（Ｉｎｔａｃｔ）ＰＴＨ試験が、天然のＰＴＨあるいは酸化したＰＴＨのどちらをどのような限界まで識別するか調べた。
【００３４】
ニコルス社のインタクトＰＴＨアッセイ（ニコルス・インスティチュート社，サンジュアンカピストラノ（ＳａｎＪｕａｎＣａｐｉｓｔｒａｎｏ），カリフォルニア州、ＵＳＡ）は、２つの多クローンの山羊（ｇｏａｔ）の抗体で２重に結合させたイムノラジオメトリー（ＩＲＭＡ）である。捕獲抗体は、プラスチックビーズ中に固定され、ｈＰＴＨ（アンチｈＰＴＨ（３９−８９））の中央またはＣ末端部のみに結合する。第２の抗体検出は、¹²⁵Ｉ（ヨウ素）でマークされ、ｈＰＴＨ（アンチｈＰＴＨ（１−３４））のＮ末端部のエピトープを識別する。試料は抗体が塗られたビーズおよび¹²⁵Ｉ（ヨウ素）でマークした検出抗体とともに同時に一晩（１２±２時間）室温で培養される。培養後、ビーズは洗浄され、固相に結合している放射能がガンマカウンタ（ＬＫＢ１２７７パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）のガンママスター）で測定された。試料の限界放射能と濃度の間のドーズ量測定曲線（マルチカルク・ソフトウェア（ＭｕｌｔｉＣａｌｃ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ））が、同時に測定された標準によって、生産者の指示に従って厳密に測定された。アッセイ間の分散は、通常および増加領域において１０％の分散係数（ＣＶ）より小さかった。
【００３５】
ロチェ・エレクシス^TMＰＴＨアッセイは、全自動免疫解析機エレクシス^R２０１０については、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）である。ビオチン化された捕獲抗体で識別されるエピトープは、ＰＴＨアミノ酸２６〜３２を含み、また、単クローンのルテニウム検出抗体は、生産者の情報によると、ＰＴＨアミノ酸５５〜６４の領域のエピトープを識別する。試料と抗体は一緒に３７℃で９分間培養され、ストレプタビディンが塗られた常磁性のビーズが培養混合物中に導入され、最終的に９分間培養された。結合した共役系（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を遊離した共役系から電極の表面上で磁気的に分離した後で、発光が測定され、最終的なＰＴＨの濃度が再較正されたマスター曲線によって決定された。アッセイ間の分散は、低い方および高い方の通常領域で７％の分散係数より小さく、高濃度領域で５％の分散係数であった。
【００３６】
酸化および還元実験の標準と、異なる濃度および酸化状態のｈＰＴＨ（１−３７）断片を有する透析患者からの貯留（ｐｏｏｌ）プラスマが処理された。全ての試料は抗凝固剤としてＥＤＴＡを受け取った。天然の変わらない初期試料（参照パラメータ）と処理された貯留プラスマの測定が同時に実行された。決定は生産者の指示に厳密に従って各ケース毎に実行された。
【００３７】
１．標準実験
４６．８ｐｍｏｌ／ｌの通常の濃度を有するニコルス・インスティチュート社のＰＴＨＩＲＭＡ標準
【００３８】
２．貯留プラスマでの実験
完全なＰＴＨの増加した内容物を有する透析患者から分離された２つのＥＤＴＡプラスマ試料が貯留された。
【００３９】

【００４０】
標準試料およびプラスマ貯留が、各ケースで３つの異なるｈＰＴＨ（１−３７）断片の濃度および５つの異なる酸化および状態の形態で処理され、それから回復したＰＴＨが測定された。
【００４１】
２つの処理されたＰＴＨ（１−３７）断片溶液は、様々な生産者（１：ＩＰＦ＝ＩｎｓｔｉｔｕｔｆｕｒＰｅｐｔｉｄｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，２＝ＩｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋＡＧ，Ｂｅｎｓｈｅｉｍ）からの天然のｈＰＴＨ（１−３７）を受け取った。第３のｈＰＴＨ（１−３７）の断片溶液中でメチオニンが８位で酸化され、第４の溶液中ではメチオニンが１８位で酸化され、第５の溶液中ではメチオニンが８位と１８位の両方で酸化された。
【００４２】
各断片容器から３つの初期濃度（１０００ｎＭ、１００ｎＭおよび１０ｎＭ）が生成された。標準試料および貯留プラスマの断片容液の１：１００でのさらなる希釈が、解析する試料中での１００００ｐＭｏｌ、１０００ｐＭｏｌ、１００ｐＭｏｌの最終濃度を生成した。Ｎ末端ＰＴＨ断片に対する商業的な試験で用いられる捕獲抗体の結合容量（ｂｉｎｄｉｎｇｃａｐａｃｉｔｉｅｓ）が知られていないので、各ケースで３つの断片濃度が用いられた。実験の目的は、サンドイッチ錯体はもはや生成されず、測定信号はそれぞれの検出限界以下となるような、天然または酸化したｈＰＴＨ（１−３７）で捕獲抗体を完全に占めることである。天然のｈＰＴＨ（１−３７）断片あるいは酸化した断片を添加した試料から得られた測定値の比較は捕獲抗体の特性の情報をもたらす。結果は図１〜４に示される図面にまとめられる。
【００４３】
Ｎ末端抗体のブロック（ｂｌｏｃｋａｇｅ）を計算するために、標準および貯留プラスマの測定濃度は天然のＰＴＨ調整で処理され、ＩＰＦから得られたｈＰＴＨ（１−３７）は１００％と決定され、すべてのさらなる値はそれらに関連付けて位置された。
【００４４】
エレクシス^TM２０１０ＰＴＨ試験の結果の議論
図１および２を参照せよ。異なる位置で酸化された全てのＰＴＨ断片の測定値の最小の百分率の偏差を基礎として、ロチェ・エレクシス^TM２０１０試験は、わずかな親近性のみをもって酸化したＰＴＨを検出し、主として天然およびこのように生物学的に活性な副甲状腺ホルモンと反応すると推定することができる。１００００ｐＭの大変高い断片濃度をもっても信号低下がないことは、捕獲抗体の結合容量が極端に高いことを示す。天然の測定された試料は、対応する処理された試料よりも最大の１０％高い絶対の濃度とする。エレクシス^TM２０１０のＰＴＨ試験によっても、トレーサ抗体がＰＴＨのＣ末端部に結合するので、直接生成された活性Ｎ末端ＰＴＨ断片が検出されないという点で不利益なままである。しかしながら、一方で、アミノ酸１〜３のＮ末端エピトープが欠けて、生物学的に不活性なＰＴＨ（４−３７）断片は部分的に検出される。
【００４５】
ニコルス社ＩＲＭＡＰＴＨ試験の結果の議論
図３および４を参照せよ。エレクシス^TM２０１０ＰＴＨ試験と異なり、ＩＲＭＡの完全なＰＴＨの試験でのスパイク実験は、様々な断片の追加に依存する反応性の明らかな違いを生成した。用いた標準もまた、貯留プラスマと異なる反応性を示し、それは、たんぱく質含有量などの異なるマトリックスによるかもしれない。１０００ｐＭのｈＰＴＨ（１−３７）の濃度での可視信号の天然の測定試料に対する５０％までの低下は、Ｎ末端ＰＴＨ断片に抗する捕獲抗体の結合容量の低さを示す。ＩＰＦおよびＩｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ社からの酸化されていないｈＰＴＨ（１−３７）断片は異なる反応性を示し、貯留プラスマのケースでは、それによって相違点が特に明らかである。また、酸化したｈＰＴＨ（１−３７）断片が添加されるとすぐに、測定信号が明らかに低下した。結果をもとに、ニコルス社のテストキットで用いられた多クローンの抗体物質は、天然のＰＴＨとまた酸化したＰＴＨのどちらとも反応する様々な抗体集団を含むと推定することができる。様々な酸化されたｈＰＴＨ（１−３７）断片の異なる結合の反応性は興味深い。（８位、１８位あるいはその両方で）いろいろと酸化された分子が異なる生物学的効果を持つか調べる予定である。
【００４６】
実験により、多クローンの抗体物質（ニコルス社ＩＲＭＡ）では、単クローン抗体（エレクシス^TM２０１０）と対照的に、天然のＰＴＨとともに、酸化された不活性のＰＴＨの形態も検出される、ということが示される。酸化されたＰＴＨは、カルシウムホメオスタシス（腎臓、骨）に対する対象細胞にとって、生物学的に制限されない活性を有する。
【００４７】
実施例３尿毒症（ｕｒａｅｍｉｃ）患者のプラスマ試料の酸化および還元
透析において、透析患者は増加した酸化のストレスに曝されている。その生物学的な活性の結果に対応して、生体中でＰＴＨの酸化が生じるか調べた。さらに、試料中で、ＰＴＨ分子の直接酸化、還元、逆転の還元のいずれがそのような限界まで可能か調べた。
【００４８】
透析患者およびＥＳＲＤ患者（ＥＳＲＤ＝末期腎臓病（ｅｎｄｓｔａｇｅｒｅｎａｌｄｉｓｅａｓｅ））の３０のプラスマ試料がランダムに選択され、過酸化水素（３０％；最終濃度：１．５Ｍｏｌ／Ｌ）で酸化され、あるいは、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ₄，１００ｎＭｏｌ／Ｌの水溶液）で還元された。全ての試料は処理され、あるいは未処理とされ、ロチェ・エレクシス^TM２０１０とニコルス社ＩＲＭＡ試験で同時に測定された。
【００４９】
酸化は３０％の過酸化水素溶液でもたらされた。培養調製における過酸化水素は３０％溶液のうちの１７％であった。全ての試料は３７℃で４５分間培養され、それから−７０℃に冷却され、凍結乾燥され、ＰＴＨの定量測定まで−２０℃で保存された。
【００５０】
２０の試料のうちのそれぞれの１：１比（ｖ／ｖ）でのアリコートが処理され、１００ｎＭｏｌのＮａＢＨ₄溶液で還元された。さらに、１０の酸化された試料のうちの各ケースでアリコートが１００ｎＭｏｌＮａＢＨ₄溶液の１：１の比での追加で逆転の還元がなされた。試料は室温で４５分間培養され、反応はドライアイス上で停止した。凍結乾燥の後、試料は−２０℃で測定まで過度に凍結された。図５〜１１の図面が結果を示す。
【００５１】
図５および図６を参照せよ。天然のＰＴＨに対するロチェ・エレクシス^TM２０１０試験で得られた測定値は、酸化の後も平均で初期値の２９％であった。ここで、個々の試料は大変異なって反応した。測定信号の最大の減少は初期値の１０％であり、測定信号の最小の減少は初期値の５３％であった。結果は、ロチェ・エレクシス^TM２０１０ＰＴＨ試験で用いられた捕獲抗体が主に天然の還元されたＰＴＨの形を識別したことを示している。
【００５２】
図７および図８を参照せよ。ニコルス社のＩＲＭＡにおいて酸化は明らかに測定値に対する影響がより小さい。平均で、濃度は初期値の７６％に、最大の減少で３３％に、最小の減少で９８％に、減少した。
【００５３】
試料のＨ₂Ｏ₂による前処理での結果としてＰＴＨ分子が部分的に破壊されるのを排除するために、酸化された試料はＮａＢＨ₄で再び逆転の還元がなされた。エレクシス^TM２０１０ＰＴＨ試験での逆転の還元がなされた試料の測定において、初期値の約５０％のみが達成された。しかしながら、検出システムは電気科学的な発光反応を基にしているため、反応媒体が恐らく測定を混乱させた。さらなる実験において、エレクシスシステムでの測定信号の混乱が他の抗オキシダント剤によって見いだされた。しかし、恐らく、メチオニンの一部もまたスルホン（ｓｕｌｆｏｎｅ）へと酸化され、それは再び逆転の還元がされることができない。
【００５４】
図９および図１０はニコルス社のＩＲＭＡでの平行の実験の結果を示す。結果は、ペプチドの酸化あるいは還元は免疫学的活性に影響を与えないことを示す。酸化および対応する逆転の還元の後で、天然の初期濃度は大きく到達された。逆転の還元後の回復におけるわずかな差は、恐らくペプチドの異なる（酸化の）初期状態によるものである。
【００５５】
図１１は天然のＰＴＨの還元単独に対する結果を示す。還元単独では、天然の初期値に対してわずかに増加した回復（＋４％）へと導く。ニコルス試験で用いられた多クローンの抗体は、ペプチドの酸化型に対して高い親和性をもち、ペプチドの還元前後における異なるＰＴＨ濃度の検出可能な強調された明示を恐らく妨げる。
【００５６】
データは、様々な試験で測定された完全なＰＴＨの濃度に対する酸化の影響を明らかに示す。天然のＰＴＨおよび酸化されたＰＴＨは、様々な対象器官における生物学的活性に明らかな差を示す。特に、透析患者は明らかに高い酸化のストレスに曝されており、遊離した反応性の酸素種が、その構造におけるメチオニンの酸化を通して、副甲状腺ホルモンを明らかに変化させ、このように明らかに生物学的活性を変化させることの疑いが手の届くところにある。このように、透析患者はしばしば、酸化ストレスおよび混乱したホモシスチン代謝に対する知られた指標である、高ホモシスチン血症（ｈｙｐｅｒｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｅｍｅａ）を患う（ＤｕｒａｎｄＰ．ら，ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００１，８１（５），６４５−６７２）。副甲状腺ホルモンにおいて８位および１８位のメチオニンは全て上記の酸化の影響を受けやすい。８位および１８位のメチオニンのメチオニルスルホキシドへの酸化は、組織中に発生するメチオニルスルホキシド還元酵素により、恐らく生物学的に可逆である（ＶｏｇｔＷ．ら，ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９５，１８（１），９３−１０５）。それは確実に生理学的効果の損失につながる（Ｇａｌｃｅｒａｎら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９８４，１１５（６），２３７５−２３７８；ＨｏｒｉｕｃｈｉＮ．Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒＲｅｓ．，１９８８，３（３），３５３−３５８，ＺｕｌｌＪＥら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２６５（１０），５６７１−５６７６；Ｏ’ＲｉｏｒｄａｎＪＬＨら，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒ．，１９７４，６３，１１７−１２４）。このように、現在可能な試験は、生物学的に活性なＰＴＨを不活性なＰＴＨから識別することができない。
【００５７】
実施例４酸化したＰＴＨに抗する単クローン抗体の追加による酸化したＰＴＨのＮ末端が結合した部位の選択的なブロック
ＬｏｇｕｅＦＣら（Ａｎｎｕ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１，２８，１６０−１６６；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９１，１３７，１５６−１６６）に従って、酸化したＰＴＨに抗する単クローンの抗体を用いた。簡単に言うと、これは合成したｈＰＴＨ（１−３４）が過酸化水素（３０％）の添加により酸化され、それからＤＡラットがこれで免疫化されたことにおいて得られた。８位あるいは１８位にメチオニルスルホキシドを含む合成のＰＴＨ断片（１−３７）でも免疫化がもたらされるかもしれない。ラットの脾臓細胞とマウスの骨髄腫線Ｘ６３Ａｇ８．６５３との混合物に、酸化したＰＴＨを結合し、マスクする特性に対するイムノアッセイにおいて試験された様々な単クローン抗体を導入した。
【００５８】
図１２および図１３は、単クローン抗体ｍＡＫ−ｈＰＴＨ（１−３７）−ｍｅｔｏｘ−８／１８（３Ｂ３）での脱離実験を示し、それはＰＴＨメチオニルスルホキシドを有するエピトープを識別する。比較する目的のために、この抗体は従来の（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）ニコルス・インスティチュート社のＰＴＨＩＲＭＡおよびロチェ社のエレクシス^TM２０１０ＰＴＨに用いられた。
【００５９】
この目的のために、高濃度領域で平均のＰＴＨ値（平均値±ＳＤ：ＮＩＤ４６±１７ｐＭｏｌ／Ｌ；ロチェ４１±１４ｐＭｏｌ／Ｌ）を有する１０のＥＤＴＡプラスマ貯留物が生成され、Ｎ末端結合部位のブロックのために上記記載の酸化したＰＴＨに抗する単クローン抗体で処理された。この目的のために、試料は単クローン抗体の溶液と混合され、単クローン抗体に関する試料中の最終的な濃度は２００ｎｇ／ｍｌまたは２０ｎｇ／ｍｌであった。試料は、酸化したＰＴＨに抗するマスキング抗体とともに室温で１時間予め培養され、その後にロチェ社またはニコルス社のそれぞれの試験キットにより従来の方法で測定された。結果は図１２および図１３に示される。
【００６０】
ここで、ＮＩＤおよびＲはニコルスまたはロチェの試験を示し、”ｎｅａｔ”は未処理試料を示し、２００は２００ｎｇ／ｍｌのｍＡＫ−ｈＰＴＨ（１−３７）−ｍｅｔｏｘ−８／１８（３Ｂ３）マスキング抗体の添加を示し、２０は２０ｎｇ／ｍｌのマスキング抗体の添加を示し、ＲｏｘおよびＮＩＤｏｘは実施例３による過酸化水素で酸化した試料を示し、２００あるいは２０はマスキング抗体の表示されたドーズ量を示す。
【００６１】
結果は、ニコルス・インスティチュート社のＰＴＨアッセイは酸化された不活性のＰＴＨと天然の活性なＰＴＨを識別できないが、酸化されたＰＴＨに抗するマスキング抗体の添加によって、ｈＰＴＨ（１−３４）に抗する多クローンの山羊の抗体と一緒であっても、抗体のＮ末端部位への結合と不正確な測定が最も広い範囲にわたって抑制されることを示す。実験はさらに通常の貯留プラスマでも約１０％の酸化したＰＴＨを含むことを示す。
【００６２】
ロチェ社のＰＴＨ試験は、明らかに酸化したＰＴＨと天然の活性ＰＴＨとを識別できるコンフォメーション検出抗体（ＰＴＨ５５−６４）を含む。しかし、マスキング抗体の添加によって、特に未処理の試料において、間違った過度の測定は明らかに抑制される。
【００６３】
どちらの比較試験も、ｈＰＴＨ（１−３４ｖ３７）の型の活性ＰＴＨ断片を検出せず、内在的に不正確なＰＴＨ含有量をもたらすということに注意しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１はＰＴＨ標準に対するスパイク実験の結果を示す図である（試験システム：ロチェ・ディアグノスティックスＧｍｂＨ社（マンハイム）のエレクシス^TM２０１０）。
【図２】図２は貯留プラスマに対するスパイク実験の結果を示す図である（ロチェ・ディアグノスティックス社のエレクシス^TM２０１０）。
【図３】図３はＰＴＨ標準に対するスパイク実験の結果を示す図である（試験システム：ニコルス・インスティチュート社（米国）のＰＴＨ−ＩＲＭＡ）。
【図４】図４は貯留プラスマに対するスパイク実験の結果を示す図である（ニコルス・インスティチュート社のＰＴＨ−ＩＲＭＡ）。
【図５】Ｈ₂Ｏ₂で酸化した後のプラスマ試料の測定値を示す図である（ロチェ社のエレクシス^TM２０１０）。
【図６】Ｈ₂Ｏ₂で酸化した後のプラスマ試料の百分率測定値を示す図である（ロチェ社のエレクシス^TM２０１０）。
【図７】Ｈ₂Ｏ₂で酸化した後のプラスマ試料の測定値を示す図である（ニコルス・インスティチュート社のＰＴＨ−ＩＲＭＡ）。
【図８】Ｈ₂Ｏ₂で酸化した後のプラスマ試料の百分率測定値を示す図である（ニコルス・インスティチュート社のＰＴＨ−ＩＲＭＡ）。
【図９】試料の酸化および逆転の還元の後の測定値を示す図である（ニコルス・インスティチュート社のＰＴＨ−ＩＲＭＡ）。
【図１０】試料の酸化および逆転の還元の後の百分率測定値を示す図である（ニコルス・インスティチュート社のＰＴＨ−ＩＲＭＡ）。
【図１１】試料の酸化および直接還元の後の百分率測定値を示す図である（ニコルス・インスティチュート社のＰＴＨ−ＩＲＭＡ）。
【図１２】酸化したあるいは酸化せずに、酸化した副甲状腺ホルモンに抗する単クローンの抗体を追加したプラスマ試料の百分率測定値を示す図である（ニコルス・インスティチュート社のＰＴＨ−ＩＲＭＡ）。
【図１３】酸化したあるいは酸化せずに、酸化した副甲状腺ホルモンに抗する単クローンの抗体を追加したプラスマ試料の百分率測定値を示す図である（ロチェ社のエレクシス^TM）。

Claims

アミノ酸１５〜２２を有するＰＴＨ受容体結合構造の近傍の１つもしくはそれ以上の部位において酸化された、完全な（ｉｎｔａｃｔ）副甲状腺ホルモンのポリペプチド鎖およびＮ末端の完全な断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を、含有量測定から特定的に（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）排除したことを特徴とする
体液試料中の実効的な副甲状腺ホルモン含有量の測定方法。
副甲状腺ホルモンのポリペプチド鎖の８位、１８位あるいはその両位置のメチオニンが酸化されている
請求項１に記載の方法。
８位および／または１８位における少なくとも１つの酸化されたメチオニン基からなるＰＴＨエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する抗体が用いられる
請求項１または２に記載の方法。
８位および／または１８位のメチオニンが酸化された特定の副甲状腺ホルモンのポリペプチド鎖あるいは断片と結合する抗体が用いられる
請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
酸化された、天然の、あるいは、還元された副甲状腺ホルモンの特定のコンフォメーションのエピトープに結合する抗体が用いられる
請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
用いられる抗体は、８位および／または１８位で酸化された副甲状腺ホルモンに結合することで精製され、または選択される
請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
完全な副甲状腺ホルモンとこの断片が酸化され、および／または還元され、それから完全な副甲状腺ホルモンとその活性な断片の総計の含有量が測定される
請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
酸化され、および還元された完全な副甲状腺ホルモンおよびその断片の総計の含有量が測定される
請求項７に記載の方法。
酸化された完全な副甲状腺ホルモンとこの断片の含有量が分離して測定される
請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
請求項３または４に記載の抗体が、酸化された副甲状腺ホルモンおよびその断片のマスキングのために用いられて添加され、それにより、還元されて生物学的に活性な副甲状腺ホルモンおよびその断片のみが測定される
請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
副甲状腺ホルモンのＮ末端アミノ酸１〜３の端部からなるエピトープを識別する抗体で前記試料を処理する工程と、
人の副甲状腺ホルモンのアミノ酸１５と２２の間の受容体結合部位の領域におけるエピトープを識別する抗体で前記試料を処理する工程と、
２つの前記抗体で識別される分子の測定工程と
を有する請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
２つの前記抗体の結合は、０．０５〜０．１重量％のＴｗｅｅｎ^TMまたはＴｒｉｔｏｎ^TMＸ−１００などの穏やかな洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）の存在下でもたらされる
請求項１１に記載の方法。
副甲状腺ホルモンの受容体結合部位の領域において結合する抗体が、酸化された副甲状腺ホルモン鎖に結合できないように、請求項３または４に記載の酸化された副甲状腺ホルモンに抗する抗体で前記試料が処理される
請求項１１または１２に記載の方法。
酸化された副甲状腺ホルモンとこの断片のマスキングのための抗体は、サンドイッチ錯体を構成するための抗体とは異なるタイプである
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
少なくとも１つの抗体が、蛍光性または化学発光性の基、または、検出反応の触媒作用のための酵素から選択されたマーキングを伴う
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
前記抗体の１つは、ルテニウム錯体でマークされ、アミノ酸１５〜２２または２６〜３２の領域のエピトープを識別する単クローン抗体である
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
前記抗体の１つがビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）される
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
アミノ酸４〜１４または１５〜３５ｖ３９を有する副甲状腺ホルモンのポリペプチド鎖に結合する抗体が用いられる
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
副甲状腺ホルモンのＰＴＨ受容体結合構造またはこの近傍に結合する抗体と、
８位および／または１８位の酸化されたメチオニンを有する副甲状腺ホルモンのエピトープに結合する抗体と
により特徴付けられる
試料中の副甲状腺ホルモンとこの断片を定量する試験システム。
副甲状腺ホルモンのＮ末端断片１〜３７に抗する多クローン抗体が、酸化された副甲状腺ホルモン断片の８位および／または１８位のメチオニンに結合する抗体の親和力クロマトグラフィ（ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって精製される
請求項１９に記載の試験システム。
還元された構造のアミノ酸１〜３を有する、完全な副甲状腺ホルモンとこのＮ末端断片が測定される
請求項１９または２０に記載の試験システム。
上記のいずれかの請求項に記載の副甲状腺ホルモンとこの活性断片を定量する試験管内の試験が用いられることにより特徴付けられる
透析患者の酸化ストレスの診断。