JP3411623B2 - 心不全に対する検査方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、感受性患者における心不全の進
行を予知するための方法に関する。心不全は、特に初老
期の人々において普通の臨床症候群である。人口調査で
は、この状態が、西側世界の人工全体の約２％を冒して
いることを示している。この症候群は、通常は非特異的
症状、例えば運動性の呼吸困難（dyspnea ）、疲労およ
び末梢性浮腫（peripheral oedemas）等を伴った潜行性
の症状として現れる。一旦心不全が発症すると、心臓が
身体を維持するのに充分に働かない結果、心不全が悪化
するという悪性循環が起こる。その最終的結果は、患者
の全体的な段階的衰弱であり、深刻な心不全の進行は、
しばしば心臓血管性の死亡に至る。

【０００２】心臓疾患は、多くの主要国において、健康
資源上著しい損失を示し、早期診断は、症状の調節およ
び深刻な心不全への急激な回帰の防止に役立つが、実際
に発症する以前に、心不全が起りそうな患者を特定でき
ること、即ち診断と言うよりは予測できることが、明ら
かに好ましい。

【０００３】残念ながら、現在、心不全の可能性を予知
するための完全に満足できる方法はない。このような方
法にしばしばみられる問題は、精度および感度が不充分
なことと、特別に訓練された技術者を要求する高価な装
置が必要である（例えば、エコー心電図検査法）という
不利益があることである。したがって、心不全の発症の
可能性を精度良くかつ感度良く予知する単純な方法に対
する必要性が存在している。

【０００４】心不全は、症候的状態、即ち明らかな疾患
または症候群として定義できる一方、患者は、心不全が
発現する前に、無症候の心臓機能不全の状態、即ち明確
な症候のない潜行性状態をしばしば経過することがあ
る。しかしながら、我々は、心臓機能不全を有する全て
の患者が、深刻な心不全の進行を続けるのではないこ
と、およびこのような人々のある者に対する心不全の危
険性が、他の人々よりずっと大きいことを発見した。心
不全が起こる前に患者を見つけて治療することができる
ように、心不全進行の特別の危険に曝されている人々を
特定できることは、臨床上非常に重要なことである。現
に存在する処置、例えばＡＣＥ阻害剤等は非常に高価で
あって、心不全の発症を防止するために全ての人々に施
されるべき治療としては、費用効果が低い。

【０００５】しかしながら、我々は、患者におけるＮ−
末端プロ−心房ナトリウム排泄増加因子（N-terminal p
ro-Atrial Natriuretic factor；ｐｒｏ−ＡＮＦ；γ−
ＡＮＦ）のレベルが、心不全および心臓血管性死につい
ての驚くべき精度の予知因子であることを発見した。し
たがって、患者のＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦレベルの決定
は、心不全進行の特別な危険にある患者を特定するのに
役立てることができる。

【０００６】特に、我々の研究では、無症候心臓機能不
全（例えば、左心室吐出フラクションの測定によって決
定されるような、無症候左心室機能不全）の患者におい
て、ｐｒｏ−ＡＮＦは、心臓血管性死亡および深刻な心
不全進行の、最も強力な独立した予知因子であることが
示された。

【０００７】一つの観点において、本発明は、患者の体
液をインビトロで、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦまたはその
フラグメントもしくはその延長したポリペプチドの体液
中レベルの決定に付することからなる、患者の心不全を
予知する方法を提供する。

【０００８】他の観点からみて、本発明は、患者の体液
をインビトロで、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦまたはそのフ
ラグメントもしくはその延長したポリペプチドの体液中
レベルの決定に付し、これらのレベルに基づいて患者の
心不全の危険性の評価を行うことからなる、患者の心不
全が進行する危険性があるか、またはそれが無いかをス
クリーニングする方法を提供する。

【０００９】このようなスクリーニングは、陽性、即ち
処置が必要な危険性のある患者の特定でもよいし、また
陰性、即ち著しい危険性のない患者の除外でもよい。Ａ
ＮＦは、有力なナトリウム排泄増大性および血管拡張性
のペプチド、または共通の前駆体から誘導される同属ペ
プチドの混合物であり、哺乳類の心臓の心房から単離さ
れている（１）（２）（３）（４）。ＡＮＦは、細胞外
液の体積および血圧恒常性のホルモン調節に関係してい
る。最近になって、ＡＮＦが心房圧の増加に応じて心房
から分泌されることが示され、心不全に関係があること
が指摘された。ＡＮＦレベルは、心不全、例えばうっ血
性心不全において増加するようである（例えばBurnett
et al. 1986, Science 231: 1145 における実施例参
照）。

【００１０】ＡＮＦは、高分子量前駆体、ｐｒｅ−ｐｒ
ｏＡＮＦとして形成され、１２６アミノ酸ペプチドプロ
ホルモン、ｐｒｏ−ＡＮＦとして、心房中に貯蔵され
る。生物学的に活性な、即ち成熟したホルモン形態のＡ
ＮＦは、心臓細胞からの分泌時にタンパク質開裂によっ
て形成され、このとき、ｐｒｏ−ＡＮＦは、Ｎ−末端ｐ
ｒｏ−ＡＮＦ（ＡＮＦ（１−９８））と名付けられたＮ
−末端部分と、生物学的に活性なホルモンとに分かれる
（５）（６）（７）。

【００１１】分泌の後、ＡＮＦは、おびただしい周縁レ
セプターとの特異的結合によって（９）、および、ある
程度までは酵素分解によって（１０）、迅速に血清中か
ら除去される（半減期２．５分）。より長い半減期によ
って（ラット：ＡＮＦの８倍（６））、Ｎ−末端ｐｒｏ
−ＡＮＦの血漿中濃度は、ＡＮＦの５０倍にまで高い
（５）（６）（７）（１１）。同様に、血漿Ｎ−末端ｐ
ｒｏ−ＡＮＦは、心房ペプチド分泌の亜急性および慢性
のレベルをよりよく反映するであろうが、分泌の急激な
変化に対し、ＡＮＦそのものと同等の感度であるとはい
えないかもしれない。

【００１２】心房ペプチドの分泌に対する公知の主な刺
激は、増加した心房伸長として通常記載される増加した
心房壁負荷である（１４）（１５）。ある研究では、ｐ
ｒｏ−ＡＮＦおよびｐｒｏ−ＡＮＦ誘導ペプチドの増加
したレベルが、明らかな心不全の患者において分泌され
ることが示され、成熟ＡＮＦのレベルと同様に、ｐｒｏ
−ＡＮＦレベルまたはＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦレベルの
決定が心不全の診断指示因子として提案されている（It
oh et al., 1988, Journal of Clinical Endocrinology
and Metabolism, 67(3): 429-437)（また、（１１）
（１６）（１７）〜（２０）も参照せよ）。

【００１３】上述したように、我々は、驚くべきこと
に、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦが心不全の有効な予知因子
であることを証明した。特に予想外なことに、我々は、
Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦが、心不全の予知因子として、
ＡＮＦよりも効果的な因子であることを明らかにした。

【００１４】好ましくは、本発明の方法は、心不全の明
らかな症候がないが、心不全の進行の恐れのある患者、
例えば、一般的に明確な心不全が進行し続ける危険性が
あると考えられる無症候心臓機能不全を有する患者に施
される。医学文献によく記載されているように、多くの
因子が心不全に罹患しやくすし、心不全の危険因子と考
えることができる。これらの因子には、高令、例えば７
０歳以上、高血圧、および心臓疾患のあらゆる形態が含
まれる。このように、１回以上の心筋梗塞、あるいは他
の心臓疾患の発症にすでにおかされてはいるが、心不全
の症候を示していない患者は、「危険性のある」グルー
プの一部と考えられる。

【００１５】健康な患者において、血漿中のＮ−末端ｐ
ｒｏ−ＡＮＦレベルは変化するものの、通常１４００ピ
コモル／リットルより下にある。年令は正常レベルに影
響を与え、略７０才未満の年令では、略１１００ピコモ
ル／リットルのＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦレベルが観察さ
れる。我々は、正常レベルより丁度４００ピコモル／リ
ットル高い場合は、患者が高危険性グループに入ること
を発見した。このような患者にあっては、患者の略５０
％は３．５年以内に心不全に進行することを予知し得
る。このように、一般的に言えば、血漿レベルが、特に
７０歳以下の患者において１５００ピコモル／リットル
より高く、例えば１６００ピコモル／リットルよりも高
ければ、心不全を予知することができる。

【００１６】Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦレベルは、このよ
うな決定を行う分野において普通の任意の方法および技
術を用いて決定できる。有利には、このような方法はイ
ムノアッセイ、例えばＲＩＡまたはＥＬＩＳＡを含む。
Shinogi & Co. Ltd.は、EP-A-0350218において、ｐｒｏ
−ＡＮＰのＮ−末端を認識するモノクローナル抗体と、
このような抗体を用いたｐｒｏ−ＡＮＰのイムノアッセ
イを開示している。その代わりとなるＲＩＡ法は、Sund
sfjord et al. 等によって開示されている（５）。

【００１７】Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦのイムノアッセイ
決定は、モノクローナルあるいはポリクローナル抗体を
使用して行なわれ、これら抗体はこの技術分野で周知の
方法を用いて得られる。例えば、抗体は宿主動物、例え
ばマウスまたはウサギ等にＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦ抗原
を、有利にはＰＰＤ、ツベルクリンのタンパク質誘導
体、鍵穴笠貝（Keyhole Limpet）ヘモシアニン、ＢＳＡ
等の免疫原性タンパク質との結合体として注入し、ポリ
クローナル抗体を含む血清を提供するか、あるいはハイ
ブリドーマまたは永久セルラインを与えるための融合用
の脾臓細胞を提供することによって作成される。ＰＰＤ
に対するハプテンの結合は、Staros et al. により Ana
lyte Biochem 1986; 156; 220-222 に開示されている。
このように、例えば、我々は、１−エチル−３−（３−
ジメチル−アミノプロピルカルボジイミド）でＢＳＡに
カップリングされたＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの結合体に
対して得られたウサギポリクローナル血清に基づくＲＩ
Ａを首尾よく用いることができた。

【００１８】このイムノアッセイは、例えばミクロタイ
タープレート、膜あるいはビーズ等に抗体を固定化した
形態で用い、標的Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＰ化合物を単離
するのに普通に用いられる。サンドイッチアッセイで
は、結合抗原は追加の可溶性抗体を用いて標識できる。
この抗体は、モノクローナルであってもポリクローナル
であってもよく、標識を有していてもよく、さらに有利
には、次いで標識を有する第二抗体と反応させることに
よって、それ自身を標識することもできる。

【００１９】したがって、もし本発明による第一抗体が
マウスまたはウサギで得られたのであれば、標識第二抗
体は抗マウスあるいは抗ウサギ抗体であってよい。好適
な標識としては、自動ハイブリッド法を採用するエリサ
（ＥＬＩＳＡ）システムに用いられるような放射性核
種、ユーロピウム蛍光助剤等（europium based fluorog
ens）の蛍光物質および酵素、または染料、またはコロ
イド金などの着色粒子を挙げることができる。

【００２０】また、競合結合アッセイを用いてもよく、
この方法では、既知量の標識Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＰ、
そのフラグメントあるいは伸長物をアナライト溶液に加
え、限定された量の固定化モノクローナル抗体と接触さ
せる。このようにすれば、固定化された標識抗原の量
は、アナライト中に存在する標的抗原の量に反比例する
こととなる。

【００２１】便利には、イムノアッセイを行なうのに必
要な成分は、キット形態で提供される。このようなキッ
トは、 (a) Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＰに結合可能な抗体および、
任意に、 (b) Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＰ、そのフラグメントまたは
その延長したポリペプチドの標識されたサンプルを含
み； (c) 上記抗体が非固定化形態にあり；そして (d) 上記抗体(c) に特異的な標識第二抗体を含む。

【００２２】本発明の方法において、Ｎ−末端ｐｒｏ−
ＡＮＰレベルの量的決定、あるいは心不全危険性の定量
的評価、指標を得ることができる。決定が行なわれる体
液は、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＰが存在する全ての体液で
あってよいが、便利には、血漿あるいは血清である。あ
る場合では、ペブチドを抽出し、あるいは決定に先立っ
て他の方法でサンプルを処理することが便利である。

【００２３】この方法が行なわれる時期に制限はない
が、心筋梗塞に以前罹患した患者において、我々は、梗
塞後の２０日まで、例えば３〜１６日の期間中に、Ｎ−
末端ｐｒｏ−ＡＮＦ決定を行なえば、信頼性のある予測
が得られることを発見した。

【００２４】さらに驚くべき観察としては、Ｎ−末端ｐ
ｒｏ−ＡＮＰが貯蔵において非常に安定であることがあ
る。これは、内分泌物およびこの種の神経ペプチドは通
常顕著に不安定であるので、予想できなかったことであ
る。さらに、ＡＮＰ自身は、このような有利な安定性特
性を示さない。このＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＰの安定性
は、アッセイおよび測定を容易にするばかりでなく、サ
ンプル採取後に遅れたアッセイを可能にし、たとえばサ
ンプルを分析するために診断研究室に郵送または送付す
ることを可能にし、即ち、分析の直前にサンプルを採取
する必要が回避されるという点でも重要な利点である。
このことは、商業的アッセイ装置のためにも著しい利点
である。

【００２５】このように、本発明のさらなる観点は、生
体サンプル中のＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＰのアッセイの方
法を提供することにある。この方法では、サンプル中の
Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＰレベルを決定する工程を、サン
プル採取後２４時間以上で、例えば４８時間以上で行わ
れる。

【００２６】便利には、決定は上記したようなイムノア
ッセイで行なわれる。Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦは、長い
半減期の利点も有している。このことは、Ｎ−末端ｐｒ
ｏ−ＡＮＰを、心臓機能障害で起こる心房膨張のパラメ
ーターとして特に有利にする。即ち、Ｎ−末端ｐｒｏ−
ＡＮＰの高い基準レベルは、クロマトグラフィーを行な
わずに血漿中での直接測定を可能にし、より大きなモル
変化が膨張の所定の増加において観察され、そして血漿
レベルは規定時間外の膨張の変化を統合する。

【００２７】本発明の方法の主要な利点は、Ｎ−末端ｐ
ｒｏ−ＡＮＦ決定を、高い精度および感度で行うことが
できることであり、これは正確で信頼性の高い心不全の
予知をもたらす。心臓機能不全および心不全の始まりを
予知するための従来の方法（例えばエコー心電図検査法
およびカテーテル法）は、このレベルの精度および感度
には達しない。

【００２８】以下の非限定的実施例を参照して、本発明
をより詳細に説明する。図１は、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮ
Ｆの４分割、Ｉ：３５９〜７６９ピコモル／リットル、
ＩＩ：７６９〜１０８６．２５ピコモル／リットル、Ｉ
ＩＩ：１０８６．２５〜１６６６．５ピコモル／リット
ル、ＩＶ：１６６６．５〜５６６６ピコモル／リットル
に従って分けた患者グループに対する全体死および心臓
血管終端に関するライフテーブル曲線を示す。

【００２９】Ａ 全体死 Ｂ 心臓血管（ＣＶ）死 Ｃ 深刻な（重症の）心不全の進行 Ｄ 深刻な心不全が進行したＣＶ死 図２は、ＡＮＦと比較した、４８時間にわたる試験管内
でのｐｒｏ−ＡＮＦの安定性を示す。実施例 生存および心臓肥大（Survival and Ventricular Enlar
gement: SAVE) の研究（２２）は、高い危険性にある梗
塞予後の患者、即ち左心室機能不全を有するが明らかな
心不全ではない患者において、退院時頃に測定される心
房ペプチドの予測値を検査するための優れた機会を与え
た。また、この研究は、その安定性およびより長い半減
期のために、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦが予知因子として
ＡＮＦ自身よりも優れているどうかを調査することを可
能とした。ＡＮＦおよびＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの両方
の予測値を決定するために、ＳＡＶＥ研究中の２４６人
の患者における無作為化に先立って、これら物質の血漿
レベルを他の神経ホルモンと一緒に測定し、単一変数分
析および次いで多変数分析によって、平均３２か月間の
追跡での次の心臓欠陥の事象と関連付けた。

【００３０】ｐｒｏ−ＡＮＦがＡＮＦよりもより予知に
重要であるかどうかを検査するために、両方の血漿濃
度、ＳＡＶＥ研究中の２４９人の患者においてＭｌから
後３〜１６日後に測定し、予知（予後）と関連付けた。
ＡＮＦレベルとｐｒｏ−ＡＮＦレベルとの相関関係は、
単に０．４２、ｐ＜０．００１であった。年令、性別、
以前のＭｌ、高血圧、糖尿病、血栓融解剤の使用および
ＬＶＥＦを含む多変数モデルを構成し、次の心臓血管死
あるいは深刻な心不全の進行を予測した。ｐｒｏ−ＡＮ
Ｆをこのモデルに加えた場合、ｐｒｏ−ＡＮＦがこれら
の事象の最も強力な独立した予知因子であること（Wald
Chi-Square = 22.3, p< 0.001）が発見された。ＡＮＦ
自体を加えた場合は、あまり有用ではなかった（ウォル
ドχ配列（Wald Chi-Square = 4.1, p< 0.04））。

【００３１】その結果は、図１に示されている。図１
は、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの４区分により分けた患者
グループについての全体死および心臓血管最終点に関す
るライフテーブル曲線を示す。図１（Ｃ）から判るよう
に、１６６６ピコモル／リットル以上のｐｒｏ−ＡＮＦ
レベルを有するグループＩＶの患者は、深刻な（重症
の）心不全の進行の機会が５０％多い。材料および方法 本研究に含まれる２４６人の患者は、ＳＡＶＥ検査から
抽出された。ＳＡＶＥは、予期された無作為的プラシー
ボ制御研究であり、アンギオテンシン転化酵素（ＡＣ
Ｅ）阻害因子キャプトプリル（captopril ）が、心筋梗
塞から３〜１６日後に開始した場合、生存率を延長し、
深刻な心不全の進行を減少させ、かつ心筋梗塞の再発を
減少させることを示した（２２）（２３）。梗塞予後に
左心房機能不全を有する患者だけを、ＳＡＶＥに含め
た。左心室機能不全は、平衡マルチゲート放射性核種心
室造影法によって測定して、ＬＶＥＦ≦４０％として定
義された。明らかな心不全を有する患者は除外された。
３〜１６日のタイムウインドウ以内に処理されなかった
心筋虚血の症候あるいはサインを有する患者も同様に除
外された。他の除外基準としては、キャプトプリルおよ
び併用薬剤問題に対する禁忌、例えば腎不全（クレアチ
ニン＞２．５ｍｇ／ｄｌ）、深刻な弁膜疾患、不治の高
血圧、悪性腫瘍あるいは生存率を制限すると考えられる
他の条件等を挙げることができる（２３）。全ての患者
にインホームドコンセントを与え、このサブグループの
中で同意を得た患者から余分の血液サンプルを採取し
た。

【００３２】患者の平均年令は６０歳（範囲：２９〜７
９歳）であり、４１人の女性と、２０５人の男性がい
た。２６．８％は高血圧の病歴を有しており、１８．７
％は糖尿病の病歴を有していた。３０．９％は前の心筋
梗塞の病歴を有していた。梗塞時のクレアチニンキナー
ゼの最高値は、正常の上限の１２倍であった。患者の６
１％は、急性梗塞時に、キリップ（Killip）のクラス１
であり、３９％はクラス２以上であった。梗塞後の平均
ＬＶＥＦは３１±７％であった。患者の３２％は、血栓
融解剤を投与されていた。神経液性血液血採取時に、患
者の３２．１％は、利尿剤を投与されていたが、ＡＣＥ
インヒビターを投与されていた患者はいなかった。キャ
プトプリル治療のために１２５人の患者を無作為化し、
プラシーボのために１２１人を無作為化した。追跡平均
期間は３２月（範囲：０．０３〜５０．１３月）であっ
た。

【００３３】１０のカナダのセンターと、３のアメリカ
のセンターが、この研究に関係した。Ｎ−末端ｐｒｏ−
ＡＮＦの測定のための採血は、梗塞後、主研究のための
無作為化する直前の３〜１６日（平均１２日）の間で行
われた。サンプルは、１昼夜絶食後の朝、被研者仰臥位
で３０分間休ませた後、静脈カニューレから採取され
た。血漿分離後、サンプルを−７０℃で凍結し、凍結状
態で中央研究所（Hopital du Sacre-Coeur de Montrea
l, Canada）に毎月送付した。他の神経液性ホルモン
（ノルエピネフリン、血漿レニン活性、アルギニンバソ
プレシンおよびＡＮＦ）を測定するために血漿を解凍し
てアスピレーション（２４）した後、サンプルを−７０
℃で再凍結し、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦ分析まで貯蔵し
た。神経液性ホルモンが測定された（２４）５３４人の
ＳＡＶＥ研究患者の内、２４６人において、Ｎ−末端ｐ
ｒｏ−ＡＮＦ測定に充分な血漿が得られた。ラジオイムノアッセイ Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの分析は、ペプチドを抽出する
ことなく、直接血清からラジオイムノアッセイで、免疫
反応性ＡＮＦ（１−９８）（ｉｒＡＮＦ（１−９８））
を測定することによって行われた。用いられた方法は、
Sundsfjord etalの出版物（５）に従った。このアッセ
イの検出限界は、１８５ピコモル／リットルであった。
アッセイ間の変動係数は、７．１％（サンプル平均：３
８９ピコモル／リットル，Ｎ＝１０）、５．１％（サン
プル平均：８８９ピコモル／リットル，Ｎ＝１０）およ
び５．２％（サンプル平均：１８５８ピコモル／リット
ル，Ｎ＝１０）であった。アッセイ内の変動係数は、
５．３％（サンプル平均：３５９ピコモル／リットル，
Ｎ＝１０）、２．４％（サンプル平均：７５４ピコモル
／リットル，Ｎ＝１０）および８．５％（サンプル平
均：８１３７ピコモル／リットル，Ｎ＝１０）であっ
た。

【００３４】本研究で報告された他の神経液性ホルモン
は、先に記載された方法（２５）（２６）で測定され
た。統計学上の分析 予測的に定義される結果の尺度は、全ての原因による死
亡、心臓血管が原因となる死亡、深刻な心不全（ＡＣＥ
阻害剤または入院を必要とするうっ血性心不全）の進
行、および心臓血管死または深刻な心不全の進行の合併
終点であった。全ての分析は、０．０５レベルの両側で
のアルファの有意差レベルを用いて行なわれた。

【００３５】特定された終点の各々とＮ−末端ｐｒｏ−
ＡＮＦとの関係は、Ｃｏｘ比例危険回帰モデル（Cox pr
oportional hazard regression model）を用いた単一変
数分析および多変数分析の両方によって調査された。Ｃ
ｏｘ回帰モデルに対する時間外の一定の回帰比の推定を
テストして評価した。個々の終点に対する無作為化から
の分布時間に対するKaplan-Meierの推定値を、ライフテ
ーブル曲線間の違いの重要性を評価するために用いた。
これらライフテーブル曲線間の同一性を、対数列テスト
によって分析した。

【００３６】個々の終点に対する相対危険率（ＲＲ）
を、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦおよび他の神経ホルモンの
正常コントロールの１．９６標準偏差の変化量に対して
計算した。ノルウェーのオスロからの、１３４人の年令
が釣り合った（６０±１６歳）健康な人を正常コントロ
ールとして用いた。他の神経ホルモンの正常コントロー
ルグループは、様々な関連センターで働く、３８人の年
令が釣り合った（５７±７歳）健康なボランティアであ
った。結果 年令が釣り合ったコントロールと比較して、Ｎ−末端ｐ
ｒｏ−ＡＮＦ平均値およびＡＮＦ平均値が、ＳＡＶＥ患
者において上昇していた（Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦ：１
３３１．５±８２０．１に対して５８７．５±２３０．
９ピコモル／リットル，ｐ＜０．００１； ＡＮＦ：７
８．４±８４．５に対して２１．１±９．５ピコグラム
／ミリリットル，ｐ＜０．００１）。他の神経ホルモ
ン、例えばノルエピネフリン（３０５．８±１９１．８
に対してコントロールは２２１．５±８６．９ｐｇ／ミ
リリットル，ｐ＜０．００１）、血漿レニン活性（２．
９±４．０に対してコントロールは１．２±１．２ｎｇ
／ｍｌ／ｈ，ｐ＜０．００１）およびアルギニンバソプ
レシン（２．２±９．５に対してコントロールは０．７
±０．３ｐｇ／ミリリットル，ｐ＝０．０１）も同様に
増加した。Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦと他の神経ホルモン
との相関関係は一般的に希薄であった。最良の相関関係
は、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦとＡＮＦ自体との間に見出
された（ｒ＝０．４２，Ｐ＜０．００１）。ごく弱い相
関関係が、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦと、ノルエプネフリ
ン（ｒ＝０．２１，ｐ＜０．００１）および血漿レニン
活性（ｒ＝０．１７，ｐ＝０．００７）との間に見出さ
れた。Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦとアルギニンバソプレシ
ンとの間には有意な相関関係はなかった。次の死亡と罹患状態との関係 ４７人の患者が追跡期間中に死亡した。３８人の患者が
心臓血管が原因で死亡し、２５人が最初の１年間に死亡
した。４３人の患者で深刻な心不全（心不全のために開
放−標識（open-labelled ）ＡＣＥ阻害剤または入院が
必要）が進行し、そして６４人が心臓血管が原因の死亡
または深刻な心不全の進行の合併終点に到達した。

【００３７】単一変数分析によれば、Ｎ−末端ｐｒｏ−
ＡＮＦとこれら終点との間には強い関係があった（死
亡：Ｗａｌｄ Ｘ² ＝２４．９２、ＲＲ（９５％のＣＩ
を有する）＝１．３０（１．１７〜１．４４），ｐ＜
０．００１；心臓血管死：Ｗａｌｄ Ｘ² ＝２８．１
１、ＲＲ＋１．３４（１．２０〜１．４９），ｐ＜０．
００１；一年以内の心臓血管死：Ｗａｌｄ Ｘ² ＝１
８．２１、ＲＲ＝１．３１（１．１６〜１．４８），ｐ
＜０．００１；深刻な心不全：Ｗａｌｄ Ｘ² ＝５９．
１７、ＲＲ＝１．４９（１．３５〜１．６６），ｐ＜
０．００１；心臓血管死または深刻な心不全：Ｗａｌｄ
Ｘ² ＝５６．６２、ＲＲ＝１．４０（１．２８〜１．
５３），ｐ＜０．００１）。これは図１に良く説明され
ており、図１では、これら４つの終点のライフテーブル
曲線は、患者をＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの４分割に分け
た後に、構成されている。

【００３８】ある事象を有する患者の全てのグループに
おいて、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦおよびＡＮＦのレベル
が高かった（表１）。Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの予知能
力をＡＮＦのそれと比較するために、Ｃｏｘ比例回帰モ
デルを構成し、このモデルにはＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦ
レベルおよびＡＮＦレベルの両方が含まれていた（表
１）。ＡＮＦのレベルを制御すると、Ｎ−末端ｐｒｏ−
ＡＮＦは終点の各々に有意な関係を有することが見出さ
れた。一方、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの影響を制御した
後は、ＡＮＦレベルは５つの終点の何れにも関係してい
ないことが見出された。明らかに、２つの神経ホルモン
の間で、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦは、研究された５つの
全ての終点に対してより強力な予知因子であった。

【００３９】生存率に影響を及ぼすことが知られている
臨床的および実験室的変数の多変数モデルにＮ−末端ｐ
ｒｏ−ＡＮＦを加えた場合（表２）、Ｎ−末端ｐｒｏ−
ＡＮＦは長期の結果の強力な独立予知因子であることが
見出された。多変数分析によれば、Ｎ−末端ｐｒｏ−Ａ
ＮＦは、死亡、心臓血管死、一年以内の心臓血管死、深
刻な心不全、および心臓血管死または深刻な心不全と、
独立して関係していた（表２）。心臓血管死または深刻
な心不全の合併終点に対しては、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮ
Ｆは最良の臨床的または実験室的予知因子であり、年
令、ＬＶＥＦおよび前の心筋梗塞より優れている。

【００４０】多変数分析において、Ｎ−末端ｐｒｏ−Ａ
ＮＦの予知能力と、他の神経ホルモンのそれとを比較す
るために、これらの変数もモデルに示した（表３）。他
の神経ホルモン（ＡＮＦ，ノルエピネフリン，血清レニ
ン活性およびアルギニンバソプレシン）に対するＮ−末
端ｐｒｏ−ＡＮＦの優れた予測値は、以下のように立証
された。即ち、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦが全ての終点と
のその有意な関係を維持する一方で、ノルエピネフリン
だけが、深刻な心不全および心臓血管死または深刻な心
不全の合併終点のみに有意な関連を示したという点で明
白であった。しかしながら、これら終点に関しては、ウ
ォルド Ｘ² 値から立証されるように、ノルエプネフリ
ンは、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦよりもかなり弱い予知因
子であった。

【００４１】

【表１】

【００４２】

【表２】

【００４３】

【表３】

【００４４】検討 この研究は、退院するころに測定されたＮ−末端ｐｒｏ
−ＡＮＦが、梗塞予後の左心室機能不全の患者における
次の心血管の経過の最良の神経液性予知因子であること
を示している。このことは、重症心不全の進行、および
重症心不全の進行と心血管死とが合併した最終点にとっ
て特に真実である。これらの最終点にとって、Ｎ−末端
ｐｒｏ−ＡＮＦは、最も強力な神経液性予知因子であっ
ただけでなく、分析に含まれる臨床上または実験室上の
全ての変数の抜群に良い予知因子でもあった。

【００４５】この研究は、危険性の高い患者であって、
左心室機能不全を有する患者において、梗塞予後に退院
するころに測定された神経液性活性化の長期予測値を評
価する最初の大規模な研究である。慢性心不全において
認められたように（１８）（１９）（２０）、この研究
では、全ての神経ホルモンは単一変量分析において次の
死と相関していた（データは示さない）。しかしなが
ら、慢性心不全の場合のように、他の重要な臨床上およ
び実験室上の変数を、多変量分析における神経ホルモン
と一緒に考えるとき、神経ホルモンと次の死との相関は
ずっと弱く、多くの場合に有意ではなかった。このこと
は、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦ以外の全ての神経ホルモン
について真実であった。Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦは、依
然として生存および重症心不全の両方に強い相関関係を
有し、後者の場合は年令、ＬＶＥＦまたは前の心筋梗塞
よりもなお一層そうであった。糖尿病、高血圧、前の心
筋梗塞または血栓融解の治療は受けていないが、３０％
のＬＶＥＦレベルを有する梗塞予後の６０才の女性患者
の場合、血漿Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦが平均値１３３
１．５ピコモル／リットルよりも４５２．５ピコモル／
リットル（正常コントロール１．９６ＳＤ）増加したこ
とは、心血管死の危険性が２１％、重症心不全が進行す
る危険性が４９％上昇することを意味していた。

【００４６】なぜＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦが、次の心血
管死および罹病の予知において他の神経ホルモンよりも
優れているのかは明確でない。しかしながら、血漿中の
心房ペプチドレベルと心房圧との密接な相関関係を考慮
すると（１６）（１７）、この結果は、心不全の症状が
存在していなくても、梗塞予後の退院時に悪い予測シグ
ナルとしての上昇した心房圧、またはことによると心房
壁圧を示している。心房圧と予測とのこの関係について
は、少なくとも二つの相互に関連した説明が可能であ
る。第一に、心房圧は収縮および拡張の両方の機能の収
斂の結果であり、またＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの予測値
はＬＶＥＦから独立しているので、梗塞予後の拡張機能
不全そのものは、劣った予測シグナルである。あるいは
その代わりに、上昇する充満圧は異常な心血管肥大に対
する主な刺激であるので（３０）、上昇した心房圧は、
梗塞予後の心血管拡張の危険性のある患者のマーカーで
ありうる。梗塞予後の心血管拡張は、梗塞予後の生存の
主な独立した予知因子であることが知られている（３
１）。

【００４７】Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦは、予測指示因子
としてＡＮＦよりもかなり良好な結果を生じる。両方の
ペプチドが等モル量で分泌されると推測されることを考
えると、このことは予想外の発見である。この相違は、
Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの半減期が長いことによって説
明することができ、心房ペプチドが分泌する時間にわた
るより良好な因子にする。両ペプチド間のもう一つの重
要かつたぶん極めて関連のある相違は、インビトロ安定
性である。ＡＮＦは、おそらく−８０℃で貯蔵したとし
ても、インビトロ分解を受けることが知られているが
（１３）、我々の実験室での実験は、Ｎ−末端ｐｒｏ−
ＡＮＦの免疫反応性が室温で３日まで、および−８０℃
で２年間貯蔵した後もよく保存されることを示している
（未発表データ）。このペプチドは、少なくとも２回の
凍結と解凍サイクルに対して抵抗することも見出した。

【００４８】心筋梗塞後の患者の予測に関与する情報
は、種々の処置養生のために患者を選ぶ際に重要であ
る。ＬＶＥＦは梗塞予後の長期間の成り行きの強力な予
知因子であることが知られており（３１）、危険性の高
い患者、すなわち生存を延長するように指示された調停
からの利益を最も受けそうな患者の同定に用いられてい
る（２２）（３２）（３３）。本発明者らの発見によれ
ば、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの測定は、追加的でありか
つＬＶＥＦから独立している長期間の成り行きについて
の情報を提供する。Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの血漿レベ
ルを、処置決定の際に追加のパラメーターとして一般的
に使用できるかどうかは、将来の研究で論じられる問題
である。しかしながら、この研究から判断すると、患者
のこの危険性の高いサブグループにおいて有用であるこ
とが明らかであろう。この課題は、左心室機能の他のパ
ラメーターが容易に入手できない状況において特に重要
である。このような背景において、Ｎ−末端ｐｒｏ−Ａ
ＮＦは開業医にとって新規で重要な手段であるというこ
とができる。概要 ＡＮＦプロホルモンのＮ−末端（Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮ
Ｆ）は半減期が長くかつ安定であるため、ＡＮＦそれ自
体よりも、心房ペプチド分泌の良い統合物でありうる。
心筋梗塞後に測定されたＮ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦ血漿レ
ベルの予測値を、ＳＡＶＥからの２４６人の患者で試験
した。Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦは、ＡＮＦそれ自体より
もずっと強力な生存の予知因子であった。さらに、心血
管死および心不全の進行において、ＡＮＦおよび他の神
経ホルモンとは対照的に、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦは、
なお強力で独立した予知因子であった。Ｎ−末端ｐｒｏ
−ＡＮＦの測定は、現行の臨床的かつ客観的な評価を補
充し、また、心血管死および心不全の進行に関する予測
の重要な独立した予知因子を提供する。参考文献 １．DeBold AJ, Borenstein HB, Veress AT, Sonnenber
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【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａは、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの４分
割、Ｉ：３５９〜７６９ピコモル／リットル、ＩＩ：７
６９〜１０８６．２５ピコモル／リットル、ＩＩＩ：１
０８６．２５〜１６６６．５ピコモル／リットル、Ｉ
Ｖ：１６６６．５〜５６６６ピコモル／リットルに従っ
て分けた患者グループに対する全体死に関するライフテ
ーブル曲線を示すグラフである。

【図２】 図１Ｂは、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの４分
割、Ｉ〜ＩＶに従って分けた患者グループに対する全体
死および心臓血管死に関するライフテーブル曲線を示す
グラフである。

【図３】 図１Ｃは、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの４分
割、Ｉ〜ＩＶに従って分けた患者グループに対する深刻
な心不全の進行に関するライフテーブル曲線を示すグラ
フである。

【図４】 図１Ｄは、Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの４分
割、Ｉ〜ＩＶに従って分けた患者グループに対するＣＶ
死または深刻な心不全の進行に関するライフテーブル曲
線を示すグラフである。

【図５】 図２は、ＡＮＦと比較した、４８時間にわた
る試験管内でのｐｒｏ−ＡＮＦの安定性を示すグラフで
ある。

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】患者の体液をインビトロで、Ｎ−末端ｐｒ
   ｏ−ＡＮＦまたはそのフラグメントの体液中レベルの決
   定に付することからなる、患者の心不全の危険性を予知
   する方法。
2. 【請求項２】患者の体液をインビトロで、Ｎ−末端ｐｒ
   ｏ−ＡＮＦまたはそのフラグメントの体液中レベルの決
   定に付し、これらのレベルに基づいて患者の心不全の危
   険性の評価を行うことからなる、患者の心不全が進行す
   る危険性があるか、またはそれがないかをスクリーニン
   グする方法。
3. 【請求項３】前記体液のサンプルを、心不全に罹患し易
   いが心不全の明白な症状のないヒトから採取することか
   らなる、請求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】前記ヒトを、７０才以上のヒト、高血圧を
   示しているヒト、およびある形態の心疾患を有している
   かまたは以前に有していたヒトから選ぶことからなる、
   請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】前記体液が血漿を含むことからなる、請求
   項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】１５００ピコモルより高いＮ−末端ｐｒｏ
   −ＡＮＦ／リットル血漿の血漿レベルを、心不全進行の
   危険性の兆候とみなすことからなる、請求項５に記載の
   方法。
7. 【請求項７】Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦの測定を、イムノ
   アッセイを用いて行うことからなる、請求項１〜６のい
   ずれかに記載の方法。
8. 【請求項８】 請求項１〜７の方法において使用される
   キットであって、 （ａ）Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦに結合することのできる
   抗体および、場合により； （ｂ）Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦまたはそのフラグメント
   の標識されたサンプル； （ｃ）非固定化形態にある該抗体が；および （ｄ）該抗体（ｃ）に特異的な標識された第二抗体を含
   む、 Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＦについてイムノアッセイを実施
   するためのキット。