ES2618077T3

ES2618077T3 - Biomarcadores de pronóstico para la progresión de la enfermedad renal crónica primaria

Info

Publication number: ES2618077T3
Application number: ES09744969.8T
Authority: ES
Inventors: Joachim Struck; Benjamin Dieplinger; Thomas Müller; Barbara Kollerits; Florian Kronenberg
Original assignee: BRAHMS GmbH
Current assignee: BRAHMS GmbH
Priority date: 2008-10-22
Filing date: 2009-10-22
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2029-10-22
Also published as: JP5553835B2; WO2010046137A1; EP2796879B1; JP5718981B2; DK2356466T3; CN104374920A; EP2180322A1; US20120003752A1; CN104374920B; EP2796879A1; CN102203621A; JP2013178278A; CN102203621B; US9128107B2; EP2356466A1; ES2587717T3; EP2356466B1; JP2012506546A; HK1202155A1

Abstract

Método in vitro para la predicción de la progresión de la enfermedad renal crónica primaria o para el seguimiento de la terapia de la enfermedad renal crónica en un paciente que padece la enfermedad renal crónica primaria y en el que dicho paciente no está en la fase terminal de una enfermedad renal, que comprende las etapas siguientes: a. proporcionar una muestra de un paciente que padece la enfermedad renal crónica primaria, b. determinar el nivel de MR-proADM, c. comparar el nivel de MR-proADM con un valor predeterminado y correlacionar el nivel de MR-proADM con la predicción de la progresión de la enfermedad renal crónica primaria, en el que un nivel de MR-proADM aumentado en los valores iniciales es un predictor de progresión.

Description

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DESCRIPCION

Biomarcadores de pronostico para la progresion de la enfermedad renal cronica primaria.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de los biomarcadores de pronostico y se refiere a la prediccion del resultado clfnico de los pacientes con enfermedad renal cronica.

Antecedentes de la invencion

La enfermedad renal cronica (ERC) es un problema sanitario importante de creciente incidencia y prevalencia, costes elevados y malos resultados clfnicos. La introduccion de la iniciativa para la calidad de los resultados clfnicos de la enfermedad renal (K/DOQI) y la utilizacion de la tasa de filtracion glomerular estimada (TFGe) para la evaluacion de la funcion renal ha identificado un gran numero de pacientes con ERC previamente no diagnosticada (National Kidney Foundation, Am. J. Kidney Dis. 39(2 supl. 1):S1-266, 2002; Centros para el control y prevencion de enfermedades (CDC, Morb. Mortal Wkly Rep. 56:161-165, 2007). Sin embargo, solo una parte menor de los pacientes de ERC progresan a enfermedad renal de estadio terminal (ERET) (Clase et al., BMJ 329:912-915, 2004). La identificacion de aquellos pacientes con mayor riesgo de progresion de la ERC sigue siendo un reto. Mediante la adopcion de las recomendaciones K/DOQI y las estimaciones de TFG publicadas periodicamente por muchos laboratorios, se ha conseguido un exito sustancial en el cribado de la ERC no diagnosticada. Sin embargo, existe una necesidad urgente de estratificacion adicional del riesgo y de identificacion de factores predictivos adicionales que permitan concentrar las intervenciones en aquellos pacientes con ERC que es mas probable que progresen a ERET.

Se ha demostrado que la proBNP aminoterminal (NT-proBNP), un marcador predictivo bien establecido de enfermedad cardiovascular, predice la progresion de la enfermedad renal en pacientes no diabeticos con ERC primaria (Spanaus et al., Clin. Chem. 53:1264-1272, 2007).

El peptido natriuretico de tipo A (ANP) y la adrenomedulina (ADM) son potentes peptidos hipotensores, diureticos y natriureticos que participan en el mantenimiento de la hemostasis cardiovascular y renal (Vesely et al., Cardiovasc. Res. 51:647-658, 2001; Bunton et al., Pharmacol. Ther. 103:179-201, 2004). Se ha informado de concentraciones plasmaticas incrementadas de ANP y ADM en pacientes con enfermedad cardiovascular y en pacientes con enfermedad renal (Lerman et al., Lancet 341:1105-1109, 1993; Jougasaki et al., Circulation 92:286-289, 1995; Winters et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 150:231-236, 1988; Ishimitsu et al., J. Clin. Invest. 94:2158-2161, 1994). Sin embargo, ANP y ADM nunca han sido considerados marcadores para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal.

El peptido adrenomedulina (ADM) fue descrito por primera vez en 1993 (Kitamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 192:553-560, 1993) como nuevo peptido hipotensor que comprende 52 aminoacidos, que habfa sido aislado a partir de un feocromocitoma humano. En el mismo ano tambien se describio ADNc codificante de un peptido precursor que comprendfa 185 aminoacidos y la secuencia completa de aminoacidos de dicho peptido precursor (Kitamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 194:720-725, 1993). El peptido precursor, que comprende, entre otros, una secuencia de senal de 21 aminoacidos en el extremo N-terminal, se denomina "pre-pro- adrenomedulina" (pre-pro-ADM).

El peptido ADM comprende los aminoacidos 95 a 146 de la pre-pro-ADM, a partir de la que se forma mediante corte proteolftico. Algunos fragmentos peptfdicos de los formados en el corte de la pre-proADM han sido caracterizados en detalle, en particular los peptidos fisiologicamente activos adrenomedulina (ADM) y "PAMP", un peptido que comprende 20 aminoacidos (22-41) que siguen a los 21 aminoacidos del peptido de senal en pre-proADM. Otro fragmento de funcion desconocida y elevada estabilidad ex vivo es la pro-adrenomedulina de region media (MR- proADM, Struck et al., Peptides 25(8):1369-72, 2004), para la que se ha desarrollado un metodo fiable de cuantificacion (Morgenthaler et al., Clin. Chem. 51(10):1823-9, 2005).

El descubrimiento y caracterizacion de ADM en 1993 estimulo una intensa actividad investigadora y un alud de publicaciones, los resultados de las cuales han sido resumidos recientemente en diversos artfculos de revision; en el contexto de la presente memoria se hace referencia en particular a los artfculos en un numero de "Peptides" dedicados a la AdM (Peptides 22, 2001), en particular Takahashi, Peptides 22:1691, 2001, y Eto, Peptides 22:16931711, 2001). La materia se revisa adicionalmente en Hinson et al. (Hinson et al., Endocr. Rev. 21 (2): 138-167, 2000). La ADM puede considerarse un peptido regulador polifuncional. Se libera en la circulacion en una forma inactiva extendida por una glicina C-terminal (Kitamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 244(2):551-555, 1998).

La ADM es un vasodilatador eficaz. El efecto hipotensor se ha asociado en particular a segmentos peptfdicos en la parte C-terminal de la ADM. Por otra parte, las secuencias peptfdicas del extremo N-terminal de la ADM muestran efectos hipertensores (Kitamura et al., Peptides 22:1713-1718, 2001).

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El peptido natriuretico auricular (ANP, tambien conocido como factor natriuretico auricular (ANF)) es una hormona peptfdica que comprende 28 residuos aminoacidos (SEC ID n° 8). El gen ANP comprende 3 exones y 2 intrones y codifica un pre-proANP de 153 aminoacidos (SEC ID n° 6). Tras el corte de un peptido de senal N-terminal (25 aminoacidos) y los dos aminoacidos C-terminales (127/128), se libera la pro-ANP. El ANP comprende los residuos 99 a 126 del extremo C-terminal de la prohormona precursora proANP (SEC ID n° 7). Dicha prohormona es cortada para formar el peptido ANP de 28 aminoacidos maduro, tambien conocido como ANP (1-28) o a-ANP, y el fragmento amino-terminal ANP (1-98) (NT-proANP, SEC ID n° 9). De esta manera, NT-proANP y ANP son producidos en cantidades equimolares. El NT-proANP de 98 aminoacidos puede ser procesado adicionalmente mediante proteolisis. La proANP de region intermedia (MR-proANP) se define como proANP o cualesquiera fragmentos de la misma que comprenden por lo menos los residuos aminoacidos 53 a 90 de la proANP. Los aminoacidos 53 a 90 de la proANP se ilustran en la SEC ID n° 10 (figura 10). Se ha utilizado la medicion de la MR-proANP en el diagnostico diferencial de la insuficiencia cardiaca descompensada aguda (Gegenhuber et al., Clin. Chem. 52:827-831, 2006). Ademas, Vesely (Cardiovascular Research 51 (2001), 647-658, divulga que los peptidos natriureticos auriculares desempenan un rol en varias enfermedades patofisiologicas, por ejemplo en la insuficiencia renal aguda.

En referencia a la ANP y los precursores y fragmentos de la misma, varias publicaciones se refieren a mediciones de dichos analitos en los pacientes con enfermedad renal avanzada, en particular antes y despues de la hemodialisis. En dichas publicaciones, los niveles medidos de analitos se analizan con respecto a su asociacion a otros parametros, los cuales han sido obtenidos de los pacientes en los mismos tiempos que las muestras obtenidas para la medicion. Ninguna de las publicaciones ha seguido el desarrollado de la enfermedad con el tiempo y, de esta manera, no puede ni ha realizado un estudio de si el nivel del analito medido en un punto temporal dado se asocia a un incremento de la gravedad de la enfermedad, es decir, de si un nivel de analito puede resultar adecuado para la prediccion de la progresion de la enfermedad (Nephron. 58(1):17-22, 1991. Change in plasma immunoreactive N- terminus, C- terminus, and 4,000-dalton midportion of atrial natriuretic factor prohormone with hemodialysis. Winters C.J., Vesely D.L. Regul. Pept. Suppl. 4:110-2, 1985. Plasma concentration of atrial natriuretic polypeptide in chronic hemodialysis patients. Yamamoto Y., Higa T., Kitamura K., Tanaka K., Kangawa K., Matsuo H.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo in vitro para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria (ERC) o para el seguimiento de la terapia de la enfermedad renal cronica en un paciente que sufre de enfermedad renal cronica primaria y en el que dicho paciente no presenta enfermedad renal de estadio terminal, que comprende las etapas siguientes:

(a) obtener una muestra de un paciente que sufre de enfermedad renal cronica primaria,

(b) determinar el nivel de MR-proADM,

(c) comparar el nivel de MR-proADM con un valor predeterminado que correlaciona el nivel de MR-proADM con la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria, en la que un nivel incrementado de MR-proADM en los valores iniciales ("baseline") es predictivo de progresion.

Otras formas de realizacion de la presente invencion son objeto de las reivindicaciones adjuntas.

Es divulgado asimismo un metodo in vitro para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria (ERC), que comprende las etapas siguientes:

(a) proporcionar una muestra de un paciente que padece la enfermedad renal cronica primaria,

(b) determinar el nivel de ANP y/o ADM o los fragmentos de los mismos o sus precursores o fragmentos de los mismos,

(c) correlacionar el nivel de ANP y/o ADM o los fragmentos de los mismos o sus precursores o fragmentos de los mismos con la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria.

Es divulgado asimismo un metodo in vitro para el seguimiento de la terapia de la enfermedad renal cronica, que comprende las etapas siguientes:

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La forma de realizacion mas preferida es el metodo in vitro para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal primaria tal como se ha indicado anteriormente. Esta es la forma de realizacion mas valiosa. Dicho metodo in vitro de prediccion puede modificarse con todas las formas de realizacion especfficas indicadas de manera general a continuacion en la presente memoria.

El metodo in vitro permite discriminar los pacientes con enfermedad renal cronica en progresion de los pacientes con enfermedad renal cronica no progresiva. La ERC progresiva en la presente memoria se refiere a ERC que progresa y posiblemente progresa hasta la duplicacion de la creatinina serica y a enfermedad renal de estadio terminal (ERET). De esta manera, en una forma de realizacion preferente del metodo in vitro, el paciente se clasifica como paciente que progresa o paciente que no progresa. De esta manera, un paciente que progresa es un paciente en el que la ERC del mismo finalmente progresara a enfermedad renal de estadio terminal (ERET). Esto significa en una forma de realizacion que un paciente que progresa se define como un paciente que progresa al punto final que es la duplicacion de la creatinina serica, preferentemente sin alcanzar la ERET. La EREt es una enfermedad renal no compensable. Lo anterior implica que el dano renal ya no es reversible y que se requiere dialisis o trasplante.

Esto implica que el subgrupo de pacientes preferente para el metodo in vitro para la prediccion de la progresion de la ERC primaria y/o para el seguimiento de la enfermedad renal comprende exclusivamente los pacientes que no presentan ERET.

En otra forma de realizacion de la invencion, un paciente que progresa se define como un paciente que progresa al punto final de ERET sin requerir la sustitucion renal. De esta manera, se define progresion como un proceso de la enfermedad en el que esta progresa de enfermedad renal leve a moderada hacia uno de los puntos finales anteriormente indicados en los que la creatinina serica se duplica sin alcanzar la ERET o alcanzando una ERET que requiere el reemplazo renal. Los metodos in vitro de la presente invencion son especialmente aplicables a pacientes que presentan enfermedad renal leve a moderada. Los pacientes con enfermedad leve a moderada se definen como pacientes que presentan una funcion renal estable durante por lo menos 3 meses antes de la medicion de analitos. En una forma de realizacion preferida, los pacientes con enfermedad leve a moderada no requieren hemodialisis.

En una forma de realizacion preferida, los metodos in vitro de la presente invencion sirven para predecir la progresion o para el seguimiento de la enfermedad renal cronica pero no predicen el riesgo de mortalidad. De esta manera, segun una forma de realizacion de la presente invencion, la mortalidad no es un punto final que se considera para la clasificacion de los pacientes en pacientes que progresan o pacientes que no progresan. Sin embargo, resulta evidente para el experto en la materia que un paciente que progresa puede presentar un riesgo de mortalidad incrementado en comparacion con un paciente que no progresa.

En una forma de realizacion preferida la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria (ERC) o para el seguimiento de la terapia de la enfermedad renal cronica para pacientes que padecen la enfermedad renal cronica primaria y el que dicho paciente no presenta una enfermedad renal terminal, sino que presenta una enfermedad renal de leve a moderada, que comprende las etapas siguientes:

(a) proporcionar una muestra de un paciente que padece la enfermedad renal cronica primaria con enfermedad renal de leve a moderada,

(b) determinar el nivel de MR-proADM,

(c) comparar el nivel de MR-proADM con un valor predeterminado y correlacionar el nivel de MR-proADM con la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria, en el que un nivel de MR-proADM aumentado en los valores iniciales es un predictor de la progresion.

En una forma de realizacion preferida la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria (ERC) o para el seguimiento de la terapia de la enfermedad renal cronica para pacientes que padecen la enfermedad renal cronica primaria y en el que dicho paciente no presenta una enfermedad renal terminal, pero presenta una enfermedad renal de leve a moderada, que comprende las etapas siguientes:

(a) proporcionar una muestra de un paciente que padece una enfermedad renal cronica primaria con una enfermedad renal de leve a moderada,

(b) determinar el nivel de MR-proADM,

(c) comparar el nivel de MR-proADM con la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria, en el que un nivel de MR-proADM aumentado en los valores iniciales es un predictor de progresion, sin considerar la prediccion de mortalidad.

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Esto significa progresion de la enfermedad renal cronica primaria, en la que progresion se refiere al agravamiento de la funcion renal. Una medida del agravamiento de la funcion renal es un incremento, es decir, por lo menos una duplicacion de la creatinina serica inicial y/o ERET que requiere terapia de reemplazo renal.

En una forma de realizacion preferida de la invencion, se determina el nivel de MR-proADM y se utiliza como marcador unico.

La ANP o los fragmentos de la misma o los precursores o fragmentos de los mismos preferentemente se seleccionan de entre el grupo que comprende NT-proANP, MR-proANP y ANP madura o fragmentos de la misma. Los fragmentos pueden presentar preferentemente una longitud de por lo menos 12 aminoacidos.

La ADM o fragmentos de la misma o los precursores o fragmentos de los mismos preferentemente se seleccionan de entre el grupo que comprende ADM madura, MR-proADM, PAMP y CT-proADM o fragmentos de los mismos. Los fragmentos pueden presentar preferentemente una longitud de por lo menos 12 aminoacidos.

En formas de realizacion particularmente preferidas de la invencion, la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria puede mejorarse mediante la determinacion y utilizacion adicionales del nivel de por lo menos un parametro de laboratorio adicional o un marcador adicional seleccionado de entre el grupo que comprende: creatinina, TFG ("tasa de filtracion glomerular"; la TFG puede determinarse, por ejemplo, mediante la medicion de la eliminacion del iohexol (Bostom et al., J. Am. Soc. Nephrol. 13:2140-2144, 2002), la proteinuria, la albumina, la CRP, la cistatina C, GDF15, ST2, NGAL, la procalcitonina y los fragmentos de la misma, BNP o fragmentos de la misma o precursores o fragmentos de los mismos, en particular proBNP o NT-proBNP, pro-vasopresina y fragmentos de los mismos, incluyendo copeptina, vasopresina y neurofisina II, pro-endotelina-1 y fragmentos de los mismos, incluyendo CT-proET-1, NT-proET-1, endotelina-1 grande ("big") y endotelina-1, la ANP o fragmentos de los mismos o precursores o fragmentos de los mismos.

Tambien resulta preferido que adicionalmente se determine por lo menos un parametro clfnico seleccionado de entre el grupo que comprende: edad, sexo, presion arterial sistolica, presion arterial diastolica, fndice de masa corporal, habitos tabaquicos actuales y tratamiento antihipertensor.

La presente invencion se refiere ademas a un metodo in vitro para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria y para el seguimiento de la terapia de la enfermedad renal cronica tal como se ha indicado anteriormente, en el que el nivel de MR-proADM solo o conjuntamente con otros parametros de laboratorio o clfnicos utiles con fines predictivos se utiliza para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria mediante un metodo que puede seleccionarse de entre las alternativas siguientes:

- comparacion con la mediana del nivel de MR-proADM en un conjunto de muestras predeterminadas en una poblacion de pacientes que presentas enfermedad renal cronica primaria,

- comparacion con un cuantil del nivel de ANP y/o ADM o fragmentos de los mismos o sus precursores o fragmentos de los mismos en un conjunto de muestras predeterminadas en una poblacion de pacientes que presentan enfermedad renal cronica primaria,

- calculo basado en el analisis de riesgos proporcionales de Cox o mediante la utilizacion de calculos de indices de riesgo, tales como el IRN (fndice de reclasificacion neta) o el IDI (fndice de discriminacion integrada).

En una forma de realizacion particular, se mide el nivel de MR-proADM en un metodo in vitro utilizando un ensayo diagnostico que comprende una o mas sondas de capturas dirigidas contra uno o mas epftopos situados en las posiciones aminoacidas 45 a 92 de la pre-proADM.

Particularmente, la ANP y/o la MR-proADM o fragmentos de los mismos o sus precursores o fragmentos de los mismos se utilizan como predictor independiente de TFG y marcador de clasificacion.

Los metodos in vitro de la presente invencion pueden aplicarse en una o mas ocasiones despues del inicio de la terapia y los resultados pueden compararse entre si o al resultado obtenido antes del inicio de la terapia con el fin de evaluar el exito de la misma.

En una forma de realizacion es utilizado un ensayo de MR-proADM que presenta un lfmite de deteccion inferior a 0,3 nmoles/l y/o inferior a la mediana de una poblacion de pacientes que presenta enfermedad renal cronica primaria y una precision interensayo <30% CV en el intervalo normal para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria.

Es divulgado asimismo un ensayo de MR-proADM que presenta un lfmite de deteccion inferior a 20 nmoles/l y/o inferior a la mediana de una poblacion de pacientes que presenta enfermedad renal cronica primaria y una precision

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interensayo <30% CV en el intervalo normal para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria.

En general, los fragmentos de los peptidos y peptidos precursores tal como se definen en la presente memoria se refieren a fragmentos de los mismos de una longitud de por lo menos 12 aminoacidos. Los fragmentos preferentemente son fragmentos inmunologicamente detectables de los peptidos.

Como es utilizado en la presente memoria, el termino "pro-adrenomedulina" (proADM) y la expresion "pro- adrenomedulina o fragmentos de la misma" se refiere a la molecula entera de proADM o a fragmentos de la misma de por lo menos 12 aminoacidos que incluyen, aunque sin limitacion, ADM, PAMP y MR-proADM. Ademas, proADM se refiere a la molecula completa de proADM o a fragmentos de la misma de por lo menos 12 aminoacidos con la excepcion de la ADM madura. Todavfa ademas, la proADM se refiere a la molecula completa de proADM o fragmentos de la misma de por lo menos 12 aminoacidos con la excepcion de la ADM madura o fragmentos de ADM madura. De esta manera, "determinar el nivel de proADM o fragmentos de la misma" se refiere a determinar el nivel de proADM o fragmentos de la misma, en el que no se determina el nivel de la ADM madura y/o de los fragmentos de la ADM madura.

La secuencia de aminoacidos del peptido precursor de la adrenomedulina (pre-pro-adrenomedulina) se proporciona en la figura 1 (SEC ID n° 1). La pro-adrenomedulina se refiere a los residuos aminoacidos 22 a 185 de la secuencia de la pre-pro-adrenomedulina. La secuencia de aminoacidos de la pro-adrenomedulina (pro-ADM) se proporciona en la figura 2 (SEC ID n° 2). El peptido pro-ADM N-terminal 20 (PAMP) se refiere a los residuos aminoacidos 22 a 41 de pre-proADM. La secuencia de aminoacidos de PAMP se proporciona en la figura 3 (SEC ID n° 3). La MR-pro- adrenomedulina (MR-pro-ADM) se refiere a los residuos aminoacidos 45 a 92 de la pre-pro-ADM. La secuencia de aminoacidos de la MR-pro-ADM se proporciona en la figura 4 (SEC ID n° 4). La secuencia de aminoacidos de la adrenomedulina (ADM) madura se proporciona en la figura 5 (SEC ID n° 5).

La secuencia de aminoacidos de la ANP se proporciona en la figura 8 (SEC ID n° 8). La secuencia de la pre-proANP de 153 aminoacidos se muestra en la figura 6 (SEC ID n° 6). Tras el corte de un peptido de senal N-terminal (25 aminoacidos) y los dos aminoacidos C-terminales (127/128), se libera la proANP (figura 7, SEC ID n° 7). La ANP comprende los residuos 99 a 126 del extremo C-terminal de la prohormona precursora pro-ANP. Esta prohormona se corta en el peptido maduro de 28 aminoacidos ANP, tambien conocido como ANP (1-28) o a-ANP y el fragmento aminoterminal aNp (1-98) (NT-proANP, figura 9, SEC ID n° 9). La proANP de region intermedia (MR-proANP) se define como NT-proANP o cualesquiera fragmentos de la misma que comprenden por lo menos los residuos aminoacidos 53 a 90 (SEC ID n° 10 en la figura 10) de la proANP.

Tal como se indica en la presente memoria en el contexto de las protefnas o peptidos, el termino "fragmento" se refiere a protefnas o peptidos de menor tamano derivables a partir de protefnas o peptidos de mayor tamano, que por lo tanto comprenden una secuencia parcial de la protefna o peptido de mayor tamano. Dichos fragmentos son derivables a partir de las protefnas o peptidos de mayor tamano mediante saponificacion de uno o mas de los enlaces peptfdicos de los mismos.

En el contexto de la presente invencion, el termino "nivel" en expresiones tales como "nivel de una proteasa", "nivel de analito" y expresiones similares, se refieren a la cantidad de la entidad molecular indicada en el contexto respectivo, o en el caso de los enzimas tambien puede referirse a la actividad enzimatica.

En una forma de realizacion preferida del metodo in vitro de la invencion, dicho nivel de MR-proADM o fragmentos de la misma se determina y se utiliza como marcador unico.

En formas de realizacion particularmente preferidas de la invencion, la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria puede mejorarse mediante la determinacion y la utilizacion adicionales del nivel de por lo menos un parametro de laboratorio adicional seleccionado de entre el grupo que comprende: creatinina, TFG ("tasa de filtracion glomerular"; la TFG puede determinarse, por ejemplo, mediante la medicion de la eliminacion de iohexol (Bostom et al., J. Am. Soc. Nephrol. 13:2140-2144, 2002), proteinuria, albumina, CRP, cistatina C, GDF15, ST2, NGAL, procalcitonina y fragmentos de los mismos, BNP o fragmentos de los mismos, o los precursores o fragmentos de los mismos, particularmente proBNP o NT-proBNP, pro-vasopresina y fragmentos de los mismos, incluyendo copeptina, vasopresina y neurofisina II, pro-endotelina-1 y fragmentos de los mismos, incluyendo CT-proET-1, NT- proET-1, endotelina-1 grande y endotelina-1, ANP o fragmentos de los mismos o los precursores o fragmentos de los mismos.

La expresion "determinar adicionalmente" no implica, aunque no excluye, que dichas determinaciones se combinen tecnicamente. La expresion "utilizar adicionalmente" se define como cualquier tipo de combinacion matematica de parametros (parametros de laboratorio y/o clfnicos) que proporciona una prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria. Un ejemplo de dicha combinacion matematica es el analisis de riesgos proporcionales de Cox, a partir del que puede obtenerse el riesgo de que un sujeto sufra de enfermedad renal cronica primaria, aunque tambien pueden utilizarse otros metodos.

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La invencion tambien implica comparar el nivel de marcador para el individuo con un valor predeterminado. El valor predeterminado puede presentar una diversidad de formas. Puede ser un unico valor de corte. Este puede ser, por ejemplo, una mediana o media o el percentil 75, 90, 95 o 99 de una poblacion de referencia. Lo anterior tambien puede ser, por ejemplo, un valor de corte "optimo". El valor de corte optimo para un marcador dado es el valor en el que el producto de sensibilidad diagnostica y especificidad es maxima para dicho marcador. La sensibilidad diagnostica es la fraccion relativa de pacientes portadores de la enfermedad o el riesgo de desarrollar la enfermedad (dependiendo de la cuestion diagnostica o pronostica que debe contestarse en cualquier caso particular), que son correctamente identificados como tales con un marcador ("verdaderos positivos") y la especificidad diagnostica es la fraccion relativa de pacientes no portadores de la enfermedad o el riesgo de desarrollar la enfermedad (dependiendo de la cuestion diagnostica o pronostica que debe contestarse en cualquier caso particular), que son identificados como tales con un marcador ("verdaderos negativos"). Esto puede ser un valor de corte optimizado para un valor predictivo negativo maximo o valor predictivo positivo maximo, dependiendo de las necesidades clfnicas o economicas.

De esta manera, puede adoptarse el valor de corte dependiendo de si se considera mas apropiado identificar la mayorfa de los sujetos en riesgo a expensas de identificar tambien "los falsos positivos", o de si se considera mas apropiado identificar principalmente los sujetos de alto riesgo a expensas de omitir varios sujetos con riesgo moderado.

El valor predeterminado puede establecerse basandose en grupos comparativos, tales como en los que el riesgo en un grupo definido es doble del riesgo en otro grupo definido. Puede ser un intervalo, por ejemplo, en el que la poblacion sometida a ensayo se divide equitativamente (o no equitativamente) en grupos, tal como un grupo de riesgo baja, un grupo de riesgo medio y un grupo de alto riesgo, o en cuartiles, siendo el cuartil mas bajo de individuos con el riesgo mas bajo y siendo el cuartil mas alto de individuos con el riesgo mas alto.

El valor predeterminado puede variar entre poblaciones de referencia particulares seleccionadas, dependiendo de sus habitos, etnicidad, genetica, etc. De acuerdo con lo anterior, los valores predeterminados seleccionados pueden considerar la categorfa en la que se encuentra un individuo. Pueden seleccionarse intervalos y categorfas apropiados mediante simplemente experimentacion rutinaria realizada por el experto ordinario en la materia.

La utilidad de los diversos niveles umbral, tal como se ha comentado anteriormente, puede visualizarse, por ejemplo, con graficos de Kaplan-Meier (figuras 11 a 14), en los que se ilustra la incidencia de sucesos, es decir, en el presente caso: progresion de la enfermedad renal, con el tiempo, para subgrupos de la poblacion de pacientes investigada: en la presente memoria, para cuatro analisis de Kaplan-Meier, cada poblacion de pacientes investigada se separo en dos subgrupos. Los subgrupos se definieron de la manera siguiente:

a) la poblacion de pacientes investigada separada en un grupo con valores de MR-proANP superiores al nivel de la mediana (106 pmoles/l) y otro grupo que presenta valores de MR-proANP inferior al nivel de la mediana (figura 11),

b) la poblacion de pacientes investigada se separo en un grupo que presentaba valores de MR-proADM

superiores al nivel de la mediana (0,75 nmoles/l) y otro grupo que presentaba valores de MR-proADM

inferiores al nivel de la mediana (figura 12),

c) la poblacion de pacientes investigada se separo en un grupo que presentaba valores de MR-proADM superiores al nivel umbral optimo (0,865 nmoles/l (sensibilidad de 0,766 y una especificidad de 0,809) y otro grupo que presentaba valores de MR-proADM inferiores al nivel umbral optimo (figura 13),

d) la poblacion de pacientes investigada se separo en un grupo que presentaba valores de MR-proANP

superiores al nivel umbral optimo (84,15 pmoles/l (sensibilidad de 0,891 y una especificidad de 0,582) y otro

grupo que presentaba valores de MR-proANP inferiores al nivel umbral optimo (figura 14).

Los niveles umbral optimos identificados en la presente invencion se basan en la poblacion particular investigada y pueden ser diferentes (+/- 20%) en otras poblaciones comparables debido a los motivos indicados anteriormente.

En el contexto de la presente invencion, las expresiones "umbral", "valor umbral", "corte" y "valor de corte" se utilizan como sinonimos.

Dichos resultados son corroborados por el analisis de regresion de Cox (Tabla 4), demostrando la utilizacion de tanto MR-proANP como MR-proADM para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica (ERC) primaria.

Otras posibilidades matematicas para calcular el riesgo de un individuo mediante la utilizacion del valor de MR- proADM y/o de MR-proANP de un individuo y otros parametros de laboratorio y clfnicos pronosticos son, por ejemplo, el IRN (el fndice de reclasificacion neta) o el IDI (el fndice de discriminacion integrada). Los indices pueden

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calcularse segun Pencina (Pencina M.J. et al., Evaluating the added predictive ability of a new marker: from area under the ROC curve to reclassification and beyond. Stat. Med. 27:157-172, 2008).

En determinadas formas de realizacion, no se utilizan umbrales particulares para uno o mas marcadores en un panel para determinar si un perfil de niveles de marcador obtenido de un sujeto es indicativo de un diagnostico/pronostico particular. Por el contrario, la presente invencion puede utilizar una evaluacion de un "perfil" de panel de marcadores como entidad unitaria. Un patron de cambios particular "huella digital" en dicho panel de marcadores puede actuar, en efecto, como indicador diagnostico o pronostico especffico. Tal como se expone en la presente memoria, dicho patron de cambios puede obtenerse a partir de una unica muestra, o de cambios temporales en uno o mas elementos del panel (o un valor de respuesta de panel). Un panel en la presente memoria se refiere a un conjunto de marcadores.

Puede obtenerse un valor de respuesta de panel mediante diversos metodos. Un ejemplo es el analisis de riesgos proporcionales de Cox. Otro ejemplo es la optimizacion de curvas de COR. Lo anterior puede conseguirse representando curvas de COR para la sensibilidad de un panel particular de marcadores frente a 1-(especificidad) para el panel en diversos valores de corte.

En dichos metodos, se considera un perfil de mediciones de marcador de un sujeto conjuntamente para proporcionar una probabilidad global (expresada como una puntuacion numerica o como un porcentaje de riesgo) de un diagnostico o pronostico. En dichas formas de realizacion, un incremento en un determinado subgrupo de marcadores puede resultar suficiente para indicar un diagnostico/pronostico particular en un paciente, mientras que un incremento en un subgrupo diferente de marcadores puede resultar suficiente para indicar el mismo diagnostico/pronostico o uno diferente en otro paciente. Tambien pueden aplicarse factores de ponderacion a uno o mas marcadores en un panel, por ejemplo en el caso de que un marcadores resulte de utilidad particularmente elevada para identificar un diagnostico/pronostico particular, puede ponderarse de manera que a un nivel dado por si solo resulte suficiente para senalar un resultado positivo. De manera similar, un factor de ponderacion puede proporcionar que ningun nivel dado de un marcador particular resulte suficiente para senalar un resultado positivo sino que unicamente senale un resultado en el caso de que otro marcador tambien contribuya al analisis.

En determinadas formas de realizacion, se seleccionan marcadores y/o paneles de marcadores que muestran una sensibilidad de por lo menos aproximadamente 70%, mas preferentemente una sensibilidad de por lo menos aproximadamente 80%, todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 85%, todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, y todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 95%, en combinacion con una especificidad de por lo menos aproximadamente 70%, mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, y todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 95%. En formas de realizacion particularmente preferidas, tanto la sensibilidad como la especificidad son de por lo menos aproximadamente 75%, mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 80%, todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 85%, todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, y todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 95%. El termino "aproximadamente" en el presente contexto se refiere a +/-% de una medicion dada.

En otras formas de realizacion, se utiliza una proporcion de probabilidades positiva, una proporcion de probabilidades negativa, un cociente de probabilidades ("odds ratio") o un cociente de riesgos instantaneos ("hazard ratio") como medida de la capacidad de un ensayo de predecir el riesgo o de diagnosticar una enfermedad. En el caso de una proporcion de probabilidades positiva, un valor de 1 indica que es igualmente probable un resultado positivo entre sujetos tanto en el grupo "enfermo" como en el grupo "de control"; un valor superior a 1 indica que es mas probable un resultado positivo en el grupo enfermo y un valor inferior a 1 indica que es mas probable un resultado positivo en el grupo de control. En el caso de una proporcion de probabilidades negativa, un valor de 1 indica que es igualmente probable un resultado negativo entre sujetos tanto en el grupo "enfermo" como en el grupo "de control"; un valor superior a 1 indica que es mas pro bable un resultado negativo en el grupo de ensayo, y un valor inferior a 1 indica que es mas probable un resultado negativo en el grupo de control. En determinadas formas de realizacion preferidas, preferentemente se seleccionan marcadores y/o paneles de marcadores para que muestren una proporcion de probabilidades positiva o negativa de por lo menos aproximadamente 1,5 o superior, o de aproximadamente 0,67 o inferior, mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 2 o superior o de aproximadamente 0,5 o inferior, todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 5 o superior o de aproximadamente 0,2 o inferior, todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 10 o superior o de aproximadamente 0,1 o inferior, y todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 20 o superior o de aproximadamente 0,05 o inferior. El termino "aproximadamente" en el presente contexto se refiere a +/- 5% de una medicion dada.

En el caso de un cociente de probabilidades, un valor de 1 indica que es igualmente probable un resultado positivo entre sujetos tanto en el grupo "enfermo" como en el grupo "de control"; un valor superior a 1 indica que es mas probable un resultado positivo en el grupo enfermo; y un valor inferior a 1 indica que es mas probable un resultado positivo en el grupo de control. En determinadas formas de realizacion preferentes, preferentemente se seleccionan marcadores y/o paneles de marcadores para que muestren un cociente de probabilidades de por lo menos aproximadamente 2 o superior o de aproximadamente 0,5 o inferior, mas preferentemente de por lo menos

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aproximadamente 4 o superior o de aproximadamente 0,25 o inferior, todavfa mas preferentemente de por lo menos

aproximadamente 5 o superior o de aproximadamente 0,2 o inferior, y todavfa mas preferentemente de por lo menos

aproximadamente 10 o superior o de aproximadamente 0,1 o inferior. El termino "aproximadamente" en el presente

contexto se refiere a +/- 5% de una medicion dada.

En el caso de un cociente de riesgos instantaneos, un valor de 1 indica que el riesgo relativo de un punto final (por ejemplo la muerte) es igual tanto en el grupo "enfermo" como en el grupo "de control"; un valor superior a 1 indica que el riesgo es superior en el grupo enfermo y un valor inferior a 1 indica que el riesgo es superior en el grupo de control. En determinadas formas de realizacion preferidas, se seleccionan preferentemente marcadores y/o paneles de marcadores que muestran un cociente de riesgos instantaneos de por lo menos aproximadamente 1,1 o de aproximadamente 0,91 o inferior, mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 1,25 o superior de aproximadamente 0,8 o inferior, todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 1,5 o superior o de aproximadamente 0,67 o inferior, todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 2 o superior de aproximadamente 0,5 o inferior, y todavfa mas preferentemente de por lo menos aproximadamente 2,5 o superior o de aproximadamente 0,4 o inferior. El termino "aproximadamente" en el presente contexto se refiere a +/- 5% de una medicion dada.

El experto en la materia apreciara que la asociacion de un indicador diagnostico o pronostico con un diagnostico o con un riesgo predictivo de un resultado clfnico futuro es un analisis estadfstico. Por ejemplo, un nivel de marcador superior a X puede senalar que es mas probable que un paciente sufra de un resultado adverso que los pacientes con un nivel inferior o igual a X, determinado por un nivel de significancia estadfstica. Ademas, un cambio en la concentracion del marcador respecto a niveles de lfnea base puede reflejar el pronostico del paciente y el grado de cambio del nivel del marcador puede estar relacionado con la gravedad de los sucesos adversos. La significancia estadfstica con frecuencia se determina mediante la comparacion entre dos o mas poblaciones y determinando un intervalo de confianza y/o un valor de p. Ver, por ejemplo, Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983. Los intervalos de confianza preferentes de la invencion son 90%, 95%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% y 99,99%, mientras que los valores de p preferentes son 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 y 0,0001.

En todavfa otras formas de realizacion, pueden llevarse a cabo multiples determinaciones de marcadores diagnosticos o pronosticos y puede utilizarse un cambio temporal en el marcador para determinar un diagnostico o pronostico. Por ejemplo, puede determinarse una concentracion de marcador en una muestra del sujeto en un tiempo inicial y nuevamente en un segundo tiempo de una muestra de un segundo sujeto. En dichas formas de realizacion, un incremento en el marcador entre el tiempo inicial y el segundo tiempo puede ser indicativo de un diagnostico particular o de un pronostico particular. De manera similar, una reduccion en un marcador entre un tiempo inicial y el segundo tiempo puede ser indicativa de un diagnostico particular o de un pronostico particular.

El termino "muestra" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una muestra de lfquido corporal obtenida para el proposito de diagnosticar, pronosticar o evaluar un sujeto de interes, tal como un paciente. Entre las muestras de ensayo preferentes se incluyen sangre, suero, plasma, lfquido cerebroespinal, orina, saliva, esputo y efusiones pleurales. Ademas, el experto en la materia sera consciente de que algunas muestras de ensayo se analizarfan mas facilmente despues de un procedimiento de fraccionamiento o purificacion, por ejemplo la separacion de la sangre completa en componentes suero o plasma.

De esta manera, en una forma de realizacion preferida del metodo in vitro segun la invencion, dicha muestra se selecciona de entre el grupo que comprende una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de plasma y una muestra de orina o un extracto de cualquiera de las muestras anteriormente indicadas.

El termino "paciente" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un organismo humano o no humano vivo que esta recibiendo atencion medica o que deberfa recibir atencion medica debido a una enfermedad. Lo anterior incluye personas sin ninguna enfermedad definida que estan siendo investigados por signos de patologfa. De esta manera, los metodos y ensayos indicados en la presente memoria son aplicables a enfermedades tanto humanas como veterinarias.

El termino "correlacionar", tal como se utiliza en la presente memoria en referencia a la utilizacion de marcadores diagnosticos y pronosticos, se refiere a la comparacion de la presencia o la cantidad del marcador o marcadores en un paciente con su presencia o cantidad en personas que es conocido que sufren de, o que es conocido que presentan un riesgo de una condicion dada, o en personas que es conocido que se encuentran libres de una condicion dada. Tal como se ha comentado anteriormente, un nivel de marcador en una muestra del paciente puede compararse con un nivel que es conocido que se asocia a un diagnostico especffico. El nivel del marcador en la muestra se dice que esta correlacionado con un diagnostico; es decir, el experto en la materia puede utilizar el nivel del marcador para determinar si el paciente sufre de un diagnostico de tipo especffico y responde de acuerdo con ello. Alternativamente, el nivel del marcador en la muestra puede compararse con un nivel de marcador que es conocido que esta asociado a un buen resultado (por ejemplo la ausencia de enfermedad, etc.). En formas de

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realizacion preferentes, un perfil de niveles de marcadores se correlaciona con una probabilidad global o un resultado particular.

Un "pronostico" se refiere a la asignacion de una probabilidad de que se produzca un curso o resultado dado. Esto con frecuencia se determina examinando uno o mas "indicadores pronosticos". Estos son marcadores la presencia o cantidad de los cuales en un paciente (o en una muestra obtenida del paciente) senalan una probabilidad de que se produzca un curso o resultado dado. Por ejemplo, en el caso de que uno o mas indicadores pronosticos alcancen un nivel suficientemente elevado en muestras obtenidas de dichos pacientes, el nivel puede senalar que el paciente presente una probabilidad incrementada de progresar finalmente a enfermedad renal de estadio terminal (ERET), es decir, el paciente presenta una probabilidad incrementada de ser un "paciente que ha progresado".

En una forma de realizacion preferida de la invencion se mide el nivel de MR-proADM. MR-proADM comprende los aminoacidos 45 a 92 de la pre-proADM.

Asimismo el nivel de proADM o fragmentos del mismo puede medirse utilizando un ensayo diagnostico utilizando una o mas sondas de captura dirigidas contra uno o mas epftopos situados en las posiciones aminoacidas 45 a 92 de pre-proADM.

Asimismo puede medirse el nivel de MR-proANP. MR-proANP se refiere a cualesquiera fragmentos de proANP que comprenden los aminoacidos 53 a 90 de proANP.

Puede medirse el nivel de proANP o fragmentos de la misma utilizando un ensayo diagnostico utilizando una o mas sondas de captura dirigidas contra uno o mas epftopos situados en las posiciones aminoacidas 53 a 90 de proANP.

Tal como se ha indicado anteriormente, un "ensayo" o "ensayo diagnostico" puede ser cualquier tipo aplicado en el campo de los diagnosticos. Dicho ensayo puede basarse en la union de un analito que debe detectarse a una o mas sondas de captura con una determinada afinidad. En referencia a la interaccion entre las moleculas de captura y las moleculas diana o moleculas de interes, la constante de afinidad preferentemente es superior a 108 M-1.

El nivel de los marcadores anteriormente indicados puede obtenerse mediante cualquier metodo reconocido de la tecnica. Tfpicamente, el nivel se determina mediante la medicion del nivel o actividad del marcador en un lfquido corporal, por ejemplo sangre, linfa, saliva, orina y similares. El nivel puede determinarse mediante inmunoensayos u otras tecnicas convencionales para la determinacion del nivel del marcador. Entre los metodos reconocidos se incluyen enviar las muestras de un lfquido corporal del paciente a un laboratorio comercial para la medicion, aunque tambien realizar la medicion en un punto de atencion.

En el contexto de la presente invencion, las "moleculas de captura" son moleculas que pueden utilizarse para la union a moleculas diana o moleculas de interes, es decir, analitos, de una muestra. De esta manera, las moleculas de captura deben conformarse adecuadamente, tanto especialmente como en terminos de las caracterfsticas superficiales, tales como la carga superficial, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, la presencia o ausencia de donantes y/o aceptores de Lewis, para la union especfficamente a las moleculas diana o moleculas de interes. En la presente memoria, la union puede estar mediada, por ejemplo, por interacciones ionicas, de van der Waals, pi-pi, sigma-pi, hidrofobas o de enlaces de hidrogeno o una combinacion de dos o mas de las interacciones anteriormente indicadas entre las moleculas de captura y las moleculas diana o moleculas de interes. En el contexto de la presente invencion, las moleculas de captura pueden seleccionarse, por ejemplo, de entre el grupo que comprende una molecula de acidos nucleicos, una molecula de carbohidrato, una molecula de PNA, una protefna, un anticuerpo, un peptido o una glucoprotefna. Preferentemente, las moleculas de captura son anticuerpos, incluyendo fragmentos de los mismos con suficiente afinidad para una diana o molecula de interes, e incluyen anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpo recombinantes, asf como derivados modificados qufmica y/o bioqufmicamente de dichos anticuerpos o fragmentos derivados de la cadena variante con una longitud de por lo menos 12 aminoacidos.

Los metodos de deteccion preferidos comprenden inmunoensayos en diversos formatos, tales como, por ejemplo, radioinmunoensayos, inmunoensayos de quimioluminiscencia y fluorescencia, inmunoensayos ligados a enzima (ELISA), matrices de perlas basadas en Luminex, ensayos de micromatrices de protefnas y formatos de ensayo rapido tales como, por ejemplo, ensayos de tira inmunocromatografica.

Los ensayos pueden ser ensayos homogeneos o heterogeneos, ensayos de tipo sandwich competitivos y no competitivos. En una forma de realizacion particularmente preferida, el ensayo se encuentra en forma de un ensayo de tipo sandwich, que es un inmunoensayo no competitivo, en el que la molecula que debe detectarse y/o cuantificarse se une a un primer anticuerpo y a un segundo anticuerpo. El primer anticuerpo puede encontrarse unido a una fase solida, por ejemplo una perla, una superficie de un pocillo u otro recipiente, un chip o una tira, y el segundo anticuerpo es un anticuerpo que se encuentra marcado, por ejemplo con un pigmento, con un isotopo radioactivo o un reactivo o fraccion catalfticamente activa. La cantidad de anticuerpo marcado unido al analito seguidamente se mide mediante un metodo apropiado. La composicion general y procedimientos incluidos en los "ensayos de tipo sandwich" estan bien establecidos y son conocidos por el experto en la materia (The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford, 3a ed. (mayo de 2005), ISBN-13: 978-0080445267; Hultschig C. et

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al., Curr. Opin. Chem. Biol. 10(1 ):4-10, feb. de 2006. PMID: 16376134), incorporadas en la presente memoria como referencia.

En una forma de realizacion particularmente preferida, el ensayo comprende dos moleculas de captura, preferentemente anticuerpos que se encuentran presentes tanto como dispersiones en una mezcla de reaccion lfquida, en la que un primer componente de marcaje se une a la primera molecula de captura, en al que dicho primer componente de marcaje es parte de un sistema de marcaje basado en la desactivacion o amplificacion de la fluorescencia o quimioluminiscencia, y un segundo componente de marcaje de dicho sistema de marcaje se une a la segunda molecula de captura, de manera que tras la union de ambas moleculas de captura al analito, se genera una senal medible que permite la deteccion de los complejos sandwich formados en la solucion que comprende la muestra.

Todavfa mas preferentemente, dicho sistema de marcaje comprende criptatos de tierra rara o quelatos de tierra rara en combinacion con un pigmento fluorescente o un pigmento quimioluminiscente, en particular un pigmento del tipo cianina.

En el contexto de la presente invencion, los ensayos basados en fluorescencia comprenden la utilizacion de pigmentos, los cuales pueden seleccionarse, por ejemplo, de entre el grupo que comprende FAM (5- o 6- carboxifluorescefna), VlC, NED, fluorescefna, fluorescinisotiocianato (FITC), IRD-700/800, pigmentos de cianina, tales como CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, xanteno, 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexafluorescefna (HEX), TET, 6-carboxi- 4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluorescefna (JOE), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X- rodamina (ROX), 5-carboxirrodamina-6G (R6G5), 6-carboxirodamina-6G (R6G), rodamina, verde rodamina, rojo rodamina, rodamina 110, pigmentos BODIPY, tales como BODIPY TMR, verde Oregon, coumarinas tales como umbeliferona, bencimidas, tales como Hoechst 33258, fenantridinas tales como rojo Texas, amarillo Yakima, Alexa fluor, PET, bromuro de etidio, pigmentos de acridinio, pigmentos carbazol, pigmentos de fenoxazina, pigmentos porfirina, pigmentos de polimetina y similares.

En el contexto de la presente invencion, los ensayos basados en quimioluminiscencia comprenden la utilizacion de pigmentos, basados en los principios ffsicos descritos para los materiales quimioluminiscentes en Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 4a ed., editor ejecutivo, J.I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, vol. 15:518-562, 1993, incorporada en la presente memoria como referencia, incluyendo las citas en las paginas 551 a 56 2. Los pigmentos quimioluminiscentes preferentes son los esteres de acridinio.

En una forma de realizacion especialmente preferida, se utiliza un ensayo MR-proADM que presenta un lfmite de deteccion inferior a 0,3 nmoles/l y una precision interensayo <30% CV en el intervalo normal para la prediccion de un primer suceso adverso en un sujeto o la identificacion de un sujeto que presenta un riesgo incrementado de sufrir un primer suceso adverso.

Asimismo es divulgada la utilizacion de una sonda de captura, por ejemplo un anticuerpo dirigido contra proADM o fragmentos de la misma para la prediccion de un primer suceso adverso en un sujeto o para la identificacion de un sujeto que presenta un riesgo incrementado de sufrir un primer suceso adverso.

Resulta especialmente preferida en el contexto de la presente invencion la utilizacion de uno o mas anticuerpos que estan dirigidos contra un epftopo incluido en las posiciones aminoacidas 45 a 92 de pre-proADM.

Ejemplos

Ejemplo 1: estudio de la enfermedad renal leve a moderada (ERLM)

El objetivo del presente estudio es investigar el valor predictivo de ANP y ADM, utilizando nuevos inmunoensayos de tipo sandwich que cubren los epftopos de region intermedia de los fragmentos prohormona mas estables (MR- proANP y MR-proADM) para la progresion de la enfermedad renal en un estudio prospectivo de seguimiento de 7 anos en una cohorte de pacientes con ERC primaria.

Resultados

La Tabla 1 muestra las concentraciones plasmaticas de NT-proBNP, MR-proANP y MR-proADM en TFG estratificadas iniciales en estadios segun las directrices de practica clfnica K/DOQI para la enfermedad renal cronica. Se observo un incremento continuo de las medianas de concentracion plasmatica de NT-proBNP, MR-proANP y MR-proADM en todos los estadios de ERC. Ademas, los analisis no parametricos de correlacion revelaron asociaciones significativas entre TFG y los tres parametros (Tabla 2).

El seguimiento se encontraba disponible para 177 de los 227 pacientes incluidos en el estudio. La mediana de duracion del seguimiento tras completar la investigacion de valores iniciales era de 53 meses (intervalo de 3 a 84 meses). Durante el seguimiento, 65 pacientes progresaron al punto final que era la duplicacion de la creatinina serica sin alcanzar la ERET en 36 pacientes y ERET que requerfa terapia de reemplazo renal en 29 pacientes. La

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Tabla 3 informa de las caracterfsticas de valores iniciales de los pacientes de ERC para los pacientes que habfan progresado y para los que no habfan progresado. Los pacientes que alcanzaron el punto final de progresion eran de mayor edad, presentaban tasas de excrecion de protefnas mas altas, asf como una TFG mas baja. Ademas, las medianas de concentracion plasmatica de NT-proBNP, MR-proANP y MR-proADM eran mas altas en los pacientes que habfan progresado que en los que no habfan progresado (NT-proBNP, 321 vs. 84 ng/ml; MR-proANP, 164 vs. 74 pmoles/l, y MR-proADM, 1,13 vs. 0,55 nmoles/l).

Los analisis de la curva de Kaplan-Meier de los 177 pacientes con ERC que se estratificaron en dos grupos segun la mediana de MR-proANP y MR-proADM en los valores iniciales se muestran en las figuras 11 a 12. Los pacientes que presentaban valores de TFG inferiores a la mediana y las concentraciones plasmaticas inferiores a la mediana de MR-proANP y MR-proADM superiores a la mediana presentaban un pronostico renal peor y un tiempo de progresion significativamente mas corto que los pacientes con valores de TFG superiores a la mediana y concentraciones plasmaticas de MR-proANP y MR-proADM inferiores a la mediana [tiempo medio hasta la progresion en meses de 51,1 (IC al 95%: 45,2 a 57,1) vs. 71,4 (IC al 95%, 64,7 a 78,1), p<0,001 para MR-proANP; y 51,6 (IC al 95%, 45,6 a 57,6) vs. 73,6 (IC al 95%, 68,5 a 78,6), p<0,001 para MRproADM, respectivamente]. Los analisis de regresion univariante de riesgos proporcionales de Cox utilizando el enfoque de estratificar las variables predictivas segun los valores de la mediana revelaron proporciones de riesgos (PR) significativamente reducidas para la TFG sobre la mediana (PR 0,12, IC al 95%, 0,06 a 0,24, p<0,001) y PR significativamente incrementadas para concentraciones sobre la mediana en los valores iniciales para NT-proBNP (PR 3,84, IC al 95%, 2,14 a 6,89, p<0,001), MR-proANP (PR 4,47, IC al 95%, 2,46 a 8,12, p<0,001) y MR-proADM (PR 5,84, IC al 95%, 3,04 a 11,21,

p<0,001).

Los resultados de los analisis de regresion de riesgos proporcionales de Cox utilizando un enfoque incremental para las variables predictivas se proporcionan en la Tabla 4. En el modelo 1 con ajustes para edad y sexo, TFG, proteinuria, NT-proBNP, MR-proANP y MR-proADM revelaron PR significativas para la progresion de la enfermedad renal. Tras los ajustes adicionales para TFG y proteinuria, la PR para MR-proANP y MR-proADM se encontraban ligeramente atenuadas aunque ambas variables continuaron estando fuertemente asociadas con la progresion de la enfermedad, mientras que la PR para NT-proBNP ya no era significativa (modelo 2). Incluso tras el ajuste adicional para NT-proBNP, tanto MR-proANP como MR-proADM siguieron siendo factores predictivos fuertes de progresion de la enfermedad renal (modelo 3). Debido a que varias de las variables investigadas no presentaban una distribucion normal, los presentes inventores llevaron a cabo un analisis de sensibilidad mediante la inclusion en el modelo de las variables transformadas mediante Ln. Estos analisis revelaron resultados muy similares (datos no representados), con la excepcion de NT-proBNP, que se mantuvo significativa tras ajustes para edad, sexo, TFG y proteinuria (PR 1,59, IC al 95%, 1,15 a 2,19, p=0,005). Sin embargo, para una mejor interpretabilidad de las estimaciones, los presentes inventores presentan los datos en la escala original.

Adicionalmente, los presentes inventores investigaron si tanto MR-proANP como MR-proADM independientemente mejoraban la prediccion de la progresion de la ERC mediante la inclusion de ambas variables en el mismo modelo de regresion de Cox y realizando ajustes para edad, sexo, TFG y proteinuria. Las proporciones de riesgos de ambas variables se redujeron (en comparacion con las estimaciones en el modelo 2 de la Tabla 4) pero se mantuvieron significativas (PR 1,60, IC al 95%, 1,11 a 2,30, p=0,011 para MR-proANP y PR 1,96, IC al 95%, 1,31 a 2,94, p<0,001 para MR-proADM).

En un analisis secundario los presentes inventores incluyeron solo los pacientes en estadio 3 y superior segun las directrices de practica clfnica K/DOQI para enfermedad renal cronica (TFG<60 ml/min/1,73 m2). Los presentes inventores observaron estimaciones muy similares, tal como se presenta en los modelos 2 y 3 de la Tabla 4 para el grupo entero (datos no mostrados).

Exposicion

El presente estudio es la primera observacion prospectiva a largo plazo que investiga el valor pronostico de MR- proANP y MR-proADM para la progresion de la enfermedad renal en pacientes caucasicos con ERC primaria. Los datos de los presentes inventores indican que las concentraciones plasmaticas incrementadas de MR-proANP y MR- proADM en los valores iniciales son factores predictivos fuertes de resultados renales que incluso son independientes de la TFG.

Mediante la adopcion de las recomendaciones K/DOQI y estimaciones publicadas periodicamente de TFG de muchos laboratorios, se ha alcanzado un exito sustancial en el cribado de la ERC no diagnosticada (National Kidney Foundation, Am. J. Kidney Dis. 39(2 supl. 1):S1-266, 2002; Centros para el control y prevencion de enfermedades (CDC), Morb. Mortal Wkly Rep. 56:161-165, 2007). Sin embargo, existe una necesidad urgente de una estratificacion adicional segun riesgo y de la identificacion de factores predictivos de riesgo adicionales a fin de dirigir las intervenciones a aquellos pacientes que presentan ERC que es mas probable que progresen a ERET.

Un importante resultado del presente estudio es el hecho de que MR-proANP y MR-proADM estaban fuertemente correlacionadas con TFG medida mediante iohexol, que se ha informado que se aproxima al estandar de oro de medicion de la funcion renal (Bostom et al., J. Am. Soc. Nephrol. 13:2140-2144, 2002). Los presentes inventores

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observaron un incremento continuo de las concentraciones plasmaticas de MR-proANP y MR-proADM en los diferentes estadios de TFG, indicando una asociacion con la gravedad de la enfermedad. Dicha fuerte correlacion con la TFG podrfa atribuirse al hecho probado de que ANP y ADM son producidas en el rinon (Vesely et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285:167-177, 2003) y a que ambas presentan importantes funciones biologicas en el rinon (Vesely et al., Cardiovasc. Res. 51:647-658, 2001; Nishikimi et al., Curr. Med. Chem. 14:1689-1699, 2007). Ademas, se ha informado de las propiedades renoprotectoras de ambos peptidos, sugiriendo una funcion compensadora de las concentraciones incrementadas de aNp y ADM en la ERC (Vesely et al., Cardiovasc. Res. 51:647-658, 2001; Vesely et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285:167-177, 2003; Nishikimi et al., Curr. Med. Chem. 14:1689-1699, 2007).

En el contexto evaluado, los valores pronosticos de MR-proANP y MR-proADM eran comparables con el de la TFG, un marcador pronostico establecido aunque diffcil de determinar para la progresion de la enfermedad renal. En los modelos de regresion de riesgos proporcionales de Cox con ajustes para edad y sexo, el comportamiento de la TFG, MR-proANP y MR-proADM era similar. Sin embargo, resulta importante indicar que aparte de la TFG, tanto MR- proANP como MR-proADM anadieron significativamente a la prediccion de progresion de la enfermedad. Un incremento de cada uno de ambos parametros en una desviacion estandar estaba asociado a un riesgo de progresion de la enfermedad superior al doble incluso tras el ajuste para la TFG de valores iniciales. Aunque los presentes inventores anadiesen ambos parametros simultaneamente al modelo, el resultado era una contribucion significativa e independiente de ambos parametros a la prediccion del riesgo.

La capacidad predictiva de NT-proBNP era mas baja que la de TFG, MR-proANP o MR-proADM.

Resulta importante indicar que la TFG en el presente estudio no se calculo mediante una formula sino que se midio a partir de la eliminacion del iohexol, que se considera un metodo exacto para la medicion de la funcion renal. Sin embargo, este metodo resulta laborioso y es una carga para el paciente debido a la aplicacion de medios de contraste y la recoleccion de varias muestras de sangre. La medicion de MR-proANP o MR-proADM es un metodo alternativo y simple que proporciona una buena aproximacion de la funcion renal y un predictor de buen comportamiento de progresion de la enfermedad renal que funciona igual de bien que la TFG.

En resumen, el trabajo de los presentes inventores demuestra que las concentraciones plasmaticas incrementadas e MR-proANP y MR-proADM en los valores iniciales son potentes factores predictivos de progresion de la enfermedad renal. Por lo tanto, ambos marcadores resultan clfnicamente utiles como factores predictivos en pacientes con ERC primaria.

Metodos breves

Muestra de estudio

En los valores iniciales se incluyeron 227 pacientes caucasicos de edades comprendidas entre 18 y 65 anos con ERC y diversos grados de alteracion renal en el estudio de enfermedad renal leve a moderada (ERLM). Estos pacientes incluidos procedfan de 8 departamentos de nefrologfa, tal como se indica en Kronenberg et al. (J. Am. Soc. Nephrol. 11:105-115, 2000). Dicho estudio habfa sido autorizado por el comite etico de la institucion y todos los participates proporcionaron su consentimiento informado por escrito. Presentaban una funcion renal estable durante como mfnimo los 3 meses anteriores a la entrada en el estudio. Los criterios de exclusion fueron el tratamiento con agentes inmunosupresores, aceite de pescado o eritropoyetina, niveles de creatinina serica superiores a 6 mg/dl, diabetes mellitus de cualquier tipo, neoplasias malignas, enfermedad hepatica, tiroidea o infecciosa, sfndrome nefrotico (definida como proteinuria>3,5 g/1,73 m2/dfa), trasplante de organo, alergia a medios de contraste ionicos y embarazo. Con el fin de evitar las diferencias entre observadores, todos los pacientes fueron incluidos por un medico que visitaba en todos los centros participates. Se registro la historia del paciente, incluyendo los habitos tabaquicos y el tratamiento antihipertensor en los valores iniciales, mediante entrevista y se confirmo mediante comprobacion de la historia clfnica del paciente. Lo anterior se complemento mediante el examen clfnico, que inclufa la evaluacion del fndice de masa corporal y la tension arterial. Se definio la hipertension como una tension arterial superior a 140/90 mm de Hg y/o la utilizacion de medicacion antihipertensiva. Se suspendio la medicacion antihipertensiva el dfa de inclusion en el estudio con el fin de minimizar la interferencia con las mediciones de la TFG. Los farmacos antihipertensivos eran utilizados por 179 pacientes (79%): diureticos (n=83, 37%), inhibidores de la ACE (n=123, 54%), bloqueantes de los canales del calcio (n=78, 34%), bloqueantes de los receptores beta (n=67, 30%) y los bloqueantes de los receptores alfa-1 (n=36, 16%).

La causa primaria de enfermedad renal era la glomerulonefritis en 97 (confirmado mediante biopsia en 90) pacientes, enfermedad renal poliqufstica adulta en 37 pacientes, nefritis intersticial en 24 pacientes, otros tipos de enfermedad renal en 43 pacientes y desconocido en 26 pacientes. La distribucion de los pacientes en los estudios de ERC segun las directrices de practica clfnica K/DOQI para la clasificacion de las enfermedades renales cronicas2 se proporciona en la Tabla 1.

El criterio de evaluacion de la investigacion de seguimiento se definio como la duplicacion de los niveles de valores iniciales de creatinina serica y/o ERET que requiriese terapia de reemplazo renal. De la cohorte primaria de 227

5

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40

45

pacientes, 177 pacientes (78%) fueron seguidos prospectivamente durante un periodo de hasta 84 meses (Boes et al., J. Am. Soc. Nephrol. 17:528-536, 2006). Los pacientes se encontraban bajo control periodico en la unidad de atencion ambulatoria y los resultados de evaluacion fueron informados al centro coordinador del estudio. Los pacientes perdidos durante el seguimiento habfan vuelto a su domicilio o no habfan sido remitidos a los centros de estudio tras la investigacion de valores iniciales. En comparacion con los pacientes con seguimiento, dichos pacientes presentaban una funcion renal significativamente mejor en los valores iniciales pero no diferfan significativamente en sexo y edad.

Analisis bioauimicos

Se extrajeron muestras de sangre tras un ayuno durante noche de por lo menos 12 horas. Las muestras se centrifugaron inmediatamente a 1.500 g y 4°C durante 10 minutos y se almacenaron los sobrenadantes en alfcuotas a -80°C hasta la utilizacion posterior. Se evaluo la TFG en los pacientes utilizando la tecnica de eliminacion del iohexol, tal como se indica en detalle en Bostom et al. (J. Am. Soc. Nephrol. 13:2140-2144, 2002). Los analisis bioqufmicos rutinarios, incluyendo la creatinina serica, la proteinuria, la albumina serica y la protefna C-reactiva de alta sensibilidad, se llevaron a cabo tal como se indica en Kronenberg et al. (J. Am. Soc. Nephrol. 11:105-115, 2000). Se midio la NT-proBNP plasmatica en un sistema Modular Analytics E170 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) (Spanaus et al., Clin. Chem. 53:1264-1272, 2007). Se midieron las concentraciones plasmaticas de MR- proANP y MR-proADM utilizando ensayos inmunoluminometricos disponibles comercialmente (B.R.A.H.M.S. AG, Hennigsdorf, Alemania). La precision de dichos dos metodos ha sido evaluada y descrita anteriormente (Morgenthaler et al., Clin. Chem. 50:234-236, 2004; Morgenthaler et al., Clin. Chem. 51:1823-1829, 2005).

Analisis estadisticos

Se llevaron a cabo los analisis estadisticos utilizando el software SPSS version 13.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) y el paquete MedCalc 9.4.2.0 (software MedCalc, Mariakerke, Belgica). Las comparaciones univariantes de las variables continuas entre los diversos grupos se llevaron a cabo utilizando ANOVA univariante, pruebas t no apareadas o las pruebas no parametricas de Kruskal-Wallis o de suma de rangos de Wilcoxon en el caso de variables distribuidas no normalmente. Se compararon las variables dicotomizadas utilizando pruebas %2 de Pearson. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estandar (DS) y como medianas y percentiles 25 y 75 para las variables con sesgo, en su caso. Se utilizo el coeficiente de Spearman de correlacion de rangos (rs) para evaluar la relacion entre los cuatro parametros de estudio principales (es decir, TFG, NT-proBNP, MR-proANP y MR- proADM). Se generaron las estimaciones de Kaplan-Meier de la distribucion de tiempos entre los valores iniciales y los criterios de evaluacion renal, para los pacientes con TFG, NT-proBNP, MR-proANP y MR-proADM superiores e inferiores al valor de la mediana de la poblacion de estudio entera; se calcularon las pruebas de rangos logaritmicos para comparar las curvas de supervivencia entre grupos. Se llevo a cabo un analisis de regresion univariante de riesgos proporcionales de Cox, con la totalidad de los cuatro parametros dicotomizados segun la mediana de concentracion de la cohorte entera. Ademas, se calcularon las estimaciones de riesgo ajustadas para los criterios de evaluacion de la progresion utilizando un enfoque incremental para incremento de 1 desviacion estandar (DS) de los datos respectivos. Todas las probabilidades eran de dos colas y se consideraron significativos los valores de P <0,05.

Tabla 1: datos clinicos y de laboratorio de valores iniciales de 227 pacientes estratificados segun la tasa de filtracion glomerular (TFG) en los estadios de la National Kidney Foundation

Sexo

(masculino/femenino),

n (%)

Edad (anos)

Indice de masa corporal (kg/m2) Fumadores actuales, n (%)

Tension arterial sistolica (mmHg) Tension arterial diastolica (mmHg) Creatinina serica (mg/dl)

TFG (ml/min/1,73 m2)

Proteinuria (g/24 h/1,73 m2)

Albumina serica (g/dl)

TFG ml/min./1,73 m2

>=90 (n=72): 60-89 (n=49) 30-59 (n=63) <30 (n=43) Valor de p'

50/22: 34/15 44/19 26/17 0,72

(69,4/30,6)
(69,4/30,6): (68,8/30,2) (60,5/39,5)

39,9 ± 13,2: 46,1 ± 11,6 45,9 ± 11,5 54,4 ± 8,5 <0,001

24,0 ± 3,3: 25,6 ± 3,8 25,4 ± 3,4 26,1 ± 4,8 0,02

18 (25): 11 (22) 11 (18) 9 (21) 0,97

134 ± 21: 140 ± 24 139 ± 19 137 ± 19 0,21

84 ± 13: 88 ± 15 88 ± 14 88 ± 13 0,20

1,14 ± 0,22: 1,54 ± 0,45 2,31 ± 0,79 3,63 ± 1,28 <0,001

[0,95; 1,11; 1,30]: [1,25;1,43;1,70] [1,70;2,18;2,80] [2,73;3,50;4,61]

120 ± 28: 74 ± 9 44 ± 7 19 ± 7 <0,001

[97;110;132]: [65;71;81] [38;44;50] [12;18;26]

0,60 ± 0,66: 1,10 ± 1,10 1,08 ± 0,94 1,03 ± 0,81 0,004

[0,13;0,36;0,82]: [0,16;0,57;1,93] [0,27;0,81;1,83] [0,36;0,89;1,52]

4,70 ± 0,38: 4,46 ± 0,50 4,55 ± 0,38 4,53 ± 0,34 0,01

5

10

15

20

25

30

Protefna C reactiva de alta sensibilidad (mg/l) NT-proBNP (ng/l)T

MR-proANP (pmoles/l)T

MR-proADM (nmoles/l)T__________

0,21 ± 0,27 [0,04;0,09;0,23] 64 ± 76 [22;39;76]

56 ± 28 [37;49;68] 0,43 ± 0,12 [0,33;0,42;0,49]

0,32 ± 0,33 [0,13;0,21;0,42] 180 ± 221 [45;91;199] 95 ± 49 [60;78;120] 0,65 ± 0,20 [0,50;0,63;0,78]

0,23 ± 0,21 [0,06;0,14;0,36] 380 ± 616 [78;173;409] 159 ±123 [82;130;193] 0,90 ± 0,30 [0,69;0,89; 1,01]

0,35 ± 0,38 [0,08;0,18;0,53] 769 ± 846 [232;456;1002] 279 ± 161 [168;248;339] 1,34 ± 0,39 [1,15; 1,28; 1,52]

0,01

<0,001

Abreviaturas: TFG, tasa de filtracion glomerular; MR-proADM, pro-adrenomedulina de region intermedia; MR- proANP, peptido natriuretico de tipo proA de region intermedia; NT-proBNP, peptido natriuretico de tipo proB aminoterminal.

*Los valores de P son para la comparacion entre los 4 grupos obtenidos de la prueba de Kruskal-Wallis, ANOVA univariante y prueba de Chi cuadrado, en su caso.

Los datos se presentan como medias ± DS y percentiles 25, 50 (=mediana) y 75 para las variables con sesgo, en su caso.

T Los niveles plasmaticos de NT-proBNP, MR-proANP y MR-proADM se encontraban disponibles en 222, 221 y 220 de los 227 pacientes, respectivamente.

Tabla 2. Coeficientes de correlacion de Spearman (valores de p) entre las variables TFG, concentraciones plasmaticas de NT-proBNP, MR-proANP y MR-proADM en los 227 pacientes incluidos en los valores iniciales.

: NT-proBNP MR-proANP MR-proADM

TFG: -0,609 (<0,001) -0,705 (<0,001) -0,815 (<0,001)

NT-proBNP: 0,888 (<0,001) 0,737 (<0,001)

MR-proANP: 0,845 (<0,001)

Tabla 3: datos clfnicos y de laboratorio de valores iniciales de 177 pacientes con seguimiento completado y estratificacion adicional de aquellos con y sin progresion de la enfermedad renal durante el periodo de seguimiento

: Pacientes que no han progresado (n=112) Pacientes que han progresado (n=65) Valor de p

Sexo (masculino/femenino), n (%): 74/38 (66/34) 44/21 (68/32) 0,83

Edad (anos): 44,8 ± 12,6 49,1 ± 11,1 0,03

Indice de masa corporal (kg/m2): 24,9 ± 3,5 25,7 ± 3,9 0,13

Fumadores actuales, n (%): 18 (16) 16 (25) 0,21

Tension arterial sistolica (mmHg): 136 ± 22 137 ± 17 0,72

Tension arterial diastolica (mmHg): 86 ± 14 88 ± 12 0,34

Creatinina serica (mg/dl): 1,54 ± 0,61 [1,14;1,40; 1,80] 3,21 ± 1,31 [2,21;3,10;3,94] <0,001

Tasa de filtracion glomerular (ml/min/1,73 m2): 79 ± 38 [50;74;99] 38 ± 25 [20;33;46] <0,001

Proteinuria (g/24 h/1,73 m2): 0,87 ± 0,95 [0,14;0,46;1,25] 1,25 ± 0,83 [0,61;1,09;1,78] <0,001

Albumina serica (g/dl): 4,57 ± 0,43 4,53 ± 0,36 0,50

Protefna C reactiva de alta: 0,28 ± 0,32 0,29 ± 0,31 0,59

sensibilidad (mg/l): [0,07;0,17;0,39] [0,08;0,16;0,43]

NT-proBNP (ng/l)*: 182 ± 305 [44;84;176] 579 ± 717 [117;321 ;745] <0,001

proANP (pmoles/l)*: 97 ± 66 [48;74;128] 225 ± 171 [111;164;274] <0,001

proADM (nmoles/l)*: 0,63 ± 0,28 [0,43;0,55;0,79] 1,15 ± 0,42 [0,91;1,13;1,36] <0,001

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40

45

*Los niveles plasmaticos de NT-proBNP, MR-proANP y MR-proADM se encontraban disponibles en 174, 174 y 173 de los 177 pacientes, respectivamente.

Tabla 4: asociacion de las variables de valores iniciales con la progresion de la enfermedad renal durante el periodo de observacion utilizando modelos de regresion multiple de riesgos proporcionales de Cox

: Modelo 1 Modelo 2 Modelo 3

: Ajustado para edad y sexo Ajustado para edad, sexo, TFG y proteinuria Ajustado para edad, sexo, TFG, proteinuria y NT-proBNP

Variable (incremento): PR (IC al 95%) p PR (IC al 95%) p PR (IC al 95%) p

TFG (por cada incremento de 1: 0,21 (0,13-0,34) <0,001

DS)* Proteinuria (por cada incremento de 1 DS)* NT-proBNP (por: 1,27 (1,02-1,58) 0,032 1,15 (0,96- 1,38)# -

cada incremento de 1 DS)* MR-proANP (por: 1,45 (1,24-1,69) <0,001 0,127 2,90 (1,94-4,34)##

2,11 (1,59- 2,80)#

cada incremento de 1 DS)§: 2,88 (2,25-3,68) <0,001 <0,001 <0,001

MR-proADM (por: 2,60 (1,85- 3,64)#

cada incremento de 1 DS)11: 3,41 (2,61-4,45) <0,001 <0,001 2,62 (1,84-3,74)## <0,001

*Para la TFG: un incremento de 1 DS eran 39 ml/min./1,73 m2, *para la proteinuria era de 0,92 g/24 h/1,73 m2, *para la NT-proBNP era de 527 ng/l, §para la MR-proANP era de 131 pmoles/l y ^para MR-proADM era de 0,42 nmoles/l, respectivamente.

*MR-proANP, MR-proADM y NT-proBNP no fueron incluidos simultaneamente sino que se ajustaron para las mismas variables: edad, sexo, TFG y proteinuria.

##MR-proANP y MR-proADM no fueron incluidos simultaneamente sino que se ajustaron para las mismas variables: edad, sexo, TFG, proteinuria y NT-proBNP.

Descripcion de los dibujos

Figura 1: secuencia de aminoacidos del peptido precursor de la adrenomedulina (ADM) (pre-pro-ADM). Los aminoacidos 1 a 21 forman un peptido de senal. Los aminoacidos 22 a 41 forman el peptido N-20 terminal de pro-ADM (proADM N20). Los aminoacidos 45 a 92 forman el peptido MR-proADM. La ADM madura comprende los aminoacidos 95 a 146. Los aminoacidos 148 a 185 forman el fragmento C-terminal de proADM.

Figura 2: secuencia de aminoacidos del peptido pro-adrenomedulina (proADM).

Figura 3: secuencia de aminoacidos del peptido N-terminal 20 de la pro-adrenomedulina (proADM N20; PAMP). El peptido PAMP puede presentar un extremo C-terminal amidado.

Figura 4: secuencia de aminoacidos de la MR pro-adrenomedulina (MR-proADM).

Figura 5: secuencia de aminoacidos del peptido adrenomedulina maduro (ADM). El peptido ADM puede presentar un extremo C-terminal amidado y/o puede estar glucosilado.

Figura 6: secuencia de aminoacidos del precursor del peptido natriuretico auricular (ANP) (pre-pro-ANP). Los aminoacidos 1 a 25 forman un peptido de senal.

Figura 7: secuencia de aminoacidos de proANP.

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15

20

25

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35

40

Figura 8: secuencia de aminoacidos de la ANP madura.

Fiaura 9: secuencia de aminoacidos de NT-proANP.

Figura 10: secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 53 a 90 de proANP.

Fiaura 11: graficos de Kaplan-Meier que muestran la progresion de la enfermedad renal en pacientes con ERC que se estratificaron en dos grupos segun las medianas de MR-proANP (106 pmoles/l) en valores iniciales.

Figura 12: graficos de Kaplan-Meier que muestran la progresion de la enfermedad renal en pacientes con ERC que se estratificaron en dos grupos segun las medianas de MR-proADM (0,75 nmoles/l) en valores iniciales.

Figura 13: curva de Kaplan-Meier con un valor de corte optimo para MR-proADM. Sensibilidad=0,766, especificidad=0,809, rangos logarftmicos: p<0,001.

Figura 14: curva de Kaplan-Meier con valor de corte optimo para MR-proANP. Sensibilidad=0,891, especificidad=0,582, rangos logarftmicos: p<0,001.

Listado de secuencias

<110> B.R.A.H.M.S. AG

<120> Biomarcadores de pronostico para la progresion de la enfermedad renal cronica primaria

<130> B60404PCT

<150> EP 08167312.1 <151 >

<160> 10

<170> Patentln version 3.3

<210> 1 <211 > 185 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Met Lys Leu val ser val Ala Leu Met Tyr Leu Gly ser Leu Ala Phe 15 10 15

Leu Gly Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asp val Ala Ser Glu Phe Arg Lys 20 25 30

Lys Trp Asn Lys Trp Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met 35 40 45

Ser Ser ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp val Lys Ala Gly pro Ala 50 55 60

Gin: Thr Leu lie Arg Pro Gin Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro

65: 70 75 80

Glu: Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg lie Arg Val Lys Arg Tyr Arg




: 85 90 95

Gin: Ser Met Asn Asn Phe Gin Gly Leu Arg ser Phe Gly Cys Arg Phe



: 100 105 110

Gly: Thr Cys Thr val Gin Lys Leu a! a Hi s Gl n lie Tyr Gin Phe Thr

115 120 125

Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys lie Ser Pro Gin 130 135 140

Gly: Tyr Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly pro
Gly

145: 150 155 160

Arg: Thr Leu val Ser ser Lys pro Gin Ala Hi s Gly Ala Pro Ala Pro



: 165 170 175

Pro: ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu



: 180 185

<210>2

5 <211 > 164

<212> PRT <213> Homo sapiens

5

10

<400>2

Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp 15 10 15

Ala lgu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro 20 25 30

Thr Gly Leu Ala Asp val Lys Ala Gly Pro Ala Gin Thr Leu lie Arg 35 40 45

pro Gin Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg ser Pro Glu Asp ser ser Pro 50 55 60

Asp Ala Ala Arg lie Arg val Lys Arg Tyr Arg Gin 5er Met Asn Asn 65 70 75 80

phe Gin Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr val 85 90 95

Gin Lys Leu Ala His Gin lie Tyr Gin Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp 100 105 110

Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys lie Ser Pro Gin Gly Tyr Gly Arg Arg 115 120 125

Arg Arg Arg ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu val Ser 130 135 140

Ser Lys Pro Gin Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala 145 150 155 160

Pro His Phe Leu

<210>3 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>3

Ala Arg Leu Asp val Ala ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp

15 10 15

Ala Leu Ser Arg 20

<210>4 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>4 Glu Leu 1

Ala Gly

Ser Arg

Arg: Met Ser Ser Ser Tyr

: 5

Pro: Ala Gin Thr Leu lie

: 20

Ser: Pro Glu Asp
Ser
Ser

Pro Thr Gly Leu Ala Asp val Lys 10 15

Arg Pro Gin Asp Met Lys Gly Ala 25 30

35

40

<210>5 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>5

Tyr Arg Gin Ser Met Asn Asn Phe Gin Gly Leu Arg ser Phe Gly Cys

10

15

Arg Phe Gly Thr Cys Thr val Gin Lys Leu Ala His Gin lie Tyr Gin 20 25 30

Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys lie Ser 35 40 45

10

15

Pro Gin Gly Tyr 50

<210>6 <211 > 153 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>6

Met 1: ser ser

Phe: Gin Leu

Ser: Asn Ala 35

Glu: Lys 50 Met

Glu 65: Pro Asn

Pro
Pro: Trp

Phe ser Thr Thr Thr val ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala 5 10 15

Leu Gly Gin Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val 20 25 30

Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu 40 45

pro Leu Glu Asp Glu val val Pro Pro Gin val Leu ser 5 5 60

Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val 70 75 80

Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gin Arg Asp Gly Gly Ala

5

Leu

ser

Ser

Gly

145



: 85 90 95

Gly: Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg ser Ala Leu Leu Lys

: 100 105 no

Lys: Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg ser Leu Arg Arg Ser

: 115 120 125

cys: Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg lie Gly Ala Gin Ser Gly Leu

130: 135 140

cys: Asn Ser Phe Arg Tyr Arg Arg

150

<210>7 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>7

Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys

10

15

Asn Leu Leu Asp His Leu Glu Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu val 20 25 30

val Pro Pro Gin val Leu ser Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala 35 40 45

Leu ser Pro Leu Pro Glu val Pro Pro Trp Thr Gly Glu val Ser pro 50 55 60

Ala Gin Arg Asp Gly Gly Ala Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser ser 65 70 75 80

Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala 85 90 95

Pro Arg Ser Leu Arg Arg ser ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg 100 105 110

10

15

lie Gly Ala Gin Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser phe Arg Tyr 115 120 125

<210>8 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>8

Ser Leu Arg Arg Ser ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg lie Gly 15 10 15

Ala Gin Ser Gly Leu Gly cys Asn Ser phe Arg Tyr 20 25

5

20 <210>9

<211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens

5

10

<400>9 Asn 1

Asn

val

Leu

Ala

65

Asp

Pro

Pro: Met Tyr

Leu
Leu: Asp


: 20

pro: Pro Gin

: 35

Ser: Pro Leu

50

Gin: Arg Asp

Arg: Ser Ala

Arg

Asn Ala Val Ser Asn Ala Asp 5 10

His Leu Glu Glu Lys Met Pro 25

Val Leu Ser Glu Pro Asn Glu 40

Pro Glu val Pro Pro Trp Thr

55

Gly Gly Ala Leu Gly Arg Gly 70 75

Leu Leu Lys ser Lys Leu Arg 85 90

Leu: Met Asp phe Lys



: 15

Leu: Glu ASP Glu val


: 30

Glu: Ala Gly Ala Ala

: 45

Gly: Glu val Ser Pro

60

Pro: Trp Asp Ser Ser




: 80

Ala: Leu Leu Thr
Ala

95

<210> 10 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 10 Pro 1

Gly

Leu

Glu: Val Pro

Gly: Ala Leu


: 20

Leu: Lys Ser

: 35

Pro Trp Thr Gly Glu val Ser Pro Ala Gin Arg Asp 5 10 15

Gly Arg Gly Pro Trp Asp ser Ser Asp Arg Ser Ala 25 30

Lys Leu

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Metodo in vitro para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria o para el seguimiento de la terapia de la enfermedad renal cronica en un paciente que padece la enfermedad renal cronica primaria y en el que dicho paciente no esta en la fase terminal de una enfermedad renal, que comprende las etapas siguientes:

a. proporcionar una muestra de un paciente que padece la enfermedad renal cronica primaria,

b. determinar el nivel de MR-proADM,

c. comparar el nivel de MR-proADM con un valor predeterminado y correlacionar el nivel de MR-proADM con la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria, en el que un nivel de MR-proADM aumentado en los valores iniciales es un predictor de progresion.
2. Metodo in vitro segun la reivindicacion 1, en el que dicho paciente se clasifica como que progresa o que no progresa.
3. Metodo in vitro segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el nivel de MR-proADM es determinado y utilizado como marcador unico.
4. Metodo in vitro segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria es mejorada determinando y utilizando adicionalmente el nivel de por lo menos un parametro de laboratorio o marcador adicional seleccionado de entre el grupo que comprende: creatinina, TFG, proteinuria, albumina, CRP, cistatina C, GDF15, ST2, NGAL, procalcitonina y sus fragmentos, BNP o fragmentos del mismo o sus precursores o fragmentos de los mismos, pro-vasopresina y los fragmentos de la misma incluyendo la copeptina, la vasopresina y la neurofisina II, pro-endotelina-1 y los fragmentos de la misma incluyendo CT-proET-1, NT-proET- 1, endotelina-1 grande y endotelina-1 y ANP o fragmentos del mismo o sus precursores o fragmentos de los mismos.
5. Metodo in vitro segun las reivindicaciones 1 a 4, en el que adicionalmente se determina por lo menos un parametro clfnico seleccionado de entre el grupo que comprende: edad, sexo, tension arterial sistolica, tension arterial diastolica, tratamiento antihipertensor, fndice de masa corporal y habitos tabaquicos actuales.
6. Metodo in vitro para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria y para el seguimiento de la terapia de la enfermedad renal cronica segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de MR-proADM solo o conjuntamente con otros parametros de laboratorio o clfnicos utiles de manera predictora se utiliza para la prediccion de la progresion de la enfermedad renal cronica primaria mediante un metodo que puede seleccionarse de entre las alternativas siguientes:

- comparacion con la mediana del nivel de MR-proADM en un conjunto de muestras predeterminadas en una poblacion de pacientes con enfermedad renal cronica primaria,

- comparacion con un cuantil del nivel de ANP y/o ADM o fragmentos de los mismos o sus precursores o fragmentos de los mismos en un conjunto de muestras predeterminadas en una poblacion de pacientes con enfermedad renal cronica primaria,

- calcular sobre la base del analisis de riesgos proporcionales de Cox o utilizando unos calculos de indices de riesgo, tales como el IRN (fndice de reclasificacion neta) o el IDI (fndice de discriminacion integrada).
7. Metodo in vitro segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de MR-proADM es medido utilizando un ensayo diagnostico que comprende una o mas sondas de captura dirigidas contra uno o mas epftopos ubicados en las posiciones de aminoacido 45-92 de pre-proADM.