CN102203621A - 用于初次慢性肾脏疾病的发展的预后生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明的主题是用于预测初次慢性肾脏疾病(CKD)的发展或用于监测慢性肾脏疾病疗法的测定方法和体外方法，所述方法包含测定ANP和/或ADM或其前体或其片段的水平。

Description

用于初次慢性肾脏疾病的发展的预后生物标志物
发明领域
本发明为预后生物标志物领域，并涉及为慢性肾脏疾病患者预测后果。
发明背景
慢性肾脏疾病(CKD)是重要的健康问题，具有不断增加的发病率和流行率，花费高昂并且后果不良。引入肾脏疾病后果等级主动性(Kidney Disease Outcome Quality Initiative)(K/DOQI)分类并使用估算的肾小球滤过率(eGFR)评估肾功能，已鉴定到大量患有以前未诊断的CKD的患者(国家肾脏基金会(National Kidney Foundation)，Am J Kidney Dis 2002；39(2Suppl 1)：S1-266；疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)(CDC)，Morb Mortal Wkly Rep 2007；56：161-165)。然而，仅有少部分CKD患者最终发展到末期肾病(ESRD)(Clase等，BMJ 2004；329：912-915)。鉴定具有CKD发展的最高风险的患者，仍然是一个挑战。由于许多实验室采纳了K/DOQI的推荐方案并日常报告GFR估算值，在未诊断CKD的筛查中获得了显著成功。但是，对于进一步风险分层并鉴定其他风险预测因子以对患有CKD、最可能发展到ESRD的患者进行定向干预，存在着紧迫需求。
氨基端proBNP(NT-proBNP)，一种用于心血管疾病的公认预后标志物，已显示在患有初次CKD的非糖尿病患者中预测肾脏疾病进展(Spanaus等，Clin Chem 2007；53：1264-1272)。
A-型利尿钠肽(ANP)和肾上腺髓质素(ADM)是强有力的降血压剂、利尿剂和利尿钠肽，其参与维持心血管和肾脏体内平衡(Vesely等，Cardiovasc Res 2001；51：647-658；Bunton等，Pharmacol Ther 2004；103：179-201)。已报道在患有心血管疾病的患者和患有肾脏疾病的患者中，ANP和ADM的血浆浓度增加(Lerman等，Lancet 1993；341：1105-1109；Jougasaki等，Circulation 1995；92：286-289；Winters等，Biochem Biophys Res Commun 1988；150：231-236；Ishimitsu等，J Clin Invest 1994；94：2158-2161)。然而，ANP和ADM还从未被当做标志物来预测肾脏疾病的发展。
肾上腺髓质素(ADM)这种肽，作为一种从人类嗜铬细胞瘤分离的包含52个氨基酸的新的降血压肽，在1993年首次被描述(Kitamura等，(1993)，Biochem.Biophys.Res.Commun.192：553-560)。同年，包含185个氨基酸的前体肽的编码cDNA和该前体肽的完整氨基酸序列也被描述(Kitamura等，(1993)，Biochem.Biophys.Res.Commun.194：720-725)。在N端特别包含有21个氨基酸的信号序列的前体肽，被称为“前肾上腺髓质素原”。
ADM肽包含pre-pro-ADM的95到146位氨基酸，其由pre-pro-ADM通过蛋白水解切割而形成。在pre-pro-ADM的切割中形成的某些肽片段已进行详细的性质研究，特别是生理活性肽肾上腺髓质素(ADM)和“PAMP”，后者是包含在pre-pro-ADM中紧随信号肽的21个氨基酸之后的20个氨基酸(22-41位)的肽。另一个未知功能并具有高的离体稳定性的片段是中段肾上腺髓质素原(MR-proADM)(Struck等，(2004)，Peptides 25(8)：1369-72)，对其已开发出一种可靠的定量方法(Morgenthaler等(2005)，Clin.Chem.51(10)：1823-9)。
1993年ADM的发现和定性引发了大量研究活动和无数出版物，它们的结果最近已被总结在各种综述文章中，在本说明书的情况下，具体来说参考在“Peptides”杂志的ADM专刊(Peptides 22(2001))中的文章，特别是(Takahashi(2001)，Peptides 22，1691和Eto(2001)，Peptides 22，1693-1711)。该主题进一步综述在Hinson等的文章中(Hinson等，(2000)，Endocr.Rev.21(2)，138-167)。ADM可以被当作多功能调控肽。它以带有C端甘氨酸的无活性形式释放到循环中(Kitamura等，(1998)，Biochem.Biophys.Res.Commun.244(2)，551-555)。
ADM是有效的血管舒张剂。降血压效应已与ADM的C端部分中的肽区段具体相关联。另一方面，ADM的N端肽序列表现出升血压效应(Kitamura等，(2001)，Peptides 22，1713-1718)。
心房利尿钠肽(ANP，也称为心房利尿钠因子(ANF))是一种包含28个氨基酸残基的肽类激素(SEQ ID NO：8)。ANP基因包含3个外显子和2个内含子，并编码153个氨基酸的pre-proANP(SEQ ID NO：6)。在切开N端信号肽(25个氨基酸)和两个C端氨基酸(127/128)后，释放出proANP。ANP包含来自前体激素原proANP的C端的99-126位氨基酸残基(SEQ ID NO：7)。该激素原被切割成28个氨基酸的ANP成熟肽，也称为ANP(1-28)或α-ANP，以及氨基端片段ANP(1-98)(NT-proANP，SEQ ID NO：9)。因此，NT-proANP和ANP以等摩尔量产生。98个氨基酸的NT-proANP可以进行进一步蛋白水解加工。中段proANP(MR-proANP)被定义为proANP或其包含proANP的至少53-90位氨基酸残基的任何片段。proANP的53至90位氨基酸显示在SEQ ID NO：10中(图10)。MR-proANP的测量已被用于急性代谢失调心力衰竭的鉴别诊断中(Gegenhuber等，Clin Chem 2006；52：827-31)。
关于ANP及其前体和片段，几份出版物涉及在患有晚期肾脏疾病的患者中测量这些被分析物，特别是在血液透析之前和之后。在这些出版物中，分析了测量到的被分析物水平与其他参数的相关性，所述其他参数在获得用于测量的样品的同时从患者获得。还没有出版物跟踪了疾病随时间的发展，因此不能并且也没有研究在给定时间点测量到的被分析物水平是否与疾病严重性的增加相关，即被分析物水平是否适合用于疾病发展的预测。Nephron.1991；58(1)：17-22，“血液透析后血浆中免疫反应性的心房利尿钠因子激素原的N端、C端和4000道尔顿中段的变化”(Change in plasma immunoreactive N-terminus，C-terminus，and 4,000-dalton midportion of atrial natriuretic factor prohormone with hemodialysis)，Winters CJ，Vesely DL。Regul Pept Suppl.1985；4：110-2，“长期血液透析患者中心房利尿钠多肽的血浆浓度”(Plasma concentration of atrial natriuretic polypeptide in chronic hemodialysis patients)，Yamamoto Y，Higa T，Kitamura K，Tanaka K，Kangawa K，Matsuo H。
发明详述
本发明涉及用于预测初次慢性肾脏疾病(CKD)的发展或用于监测慢性肾脏疾病疗法的方法，所述方法包含下列步骤：
(a)提供来自患有初次慢性肾脏疾病的患者的样品，
(b)测定ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平，
(c)将ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平与初次慢性肾脏疾病的发展的预测相关联。
在一个优选实施方案中，本发明涉及用于预测初次慢性肾脏疾病(CKD)的发展的方法，所述方法包含下列步骤：
(a)提供来自患有初次慢性肾脏疾病的患者的样品，
(b)测定ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平，
(c)将ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平与初次慢性肾脏疾病的发展的预测相关联。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及用于监测慢性肾脏疾病疗法的方法，所述方法包含下列步骤：
(a)提供来自患有初次慢性肾脏疾病的患者的样品，
(b)测定ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平，
(c)将ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平与初次慢性肾脏疾病的发展的预测相关联。
最优选实施方案是如上所述用于预测初次肾脏疾病的发展的方法。这是最有价值的实施方案。这种用于预测的方法可以随着本文后面概述的所有具体实施方案而变。方法允许将患有进行性慢性肾脏疾病的患者与患有非进行性慢性肾脏疾病的患者区分开。本文中的进行性CKD是指发展和可能发展到血清肌酸酐加倍和末期肾病(ESRD)的CKD。因此，在方法的优选实施方案中，患者被分类成发展者或非发展者。因此，发展者是其CKD最终将发展成末期肾病(ESRD)的患者。在一个实施方案中，这意味着发展者被定义为发展到血浆肌酸酐加倍而优选不达到ESRD的终点的患者。ESRD是非补偿性肾病。这意味着肾损伤不再可逆转，并且需要透析或移植。
这意味着用于预测初次CKD的发展和/或用于监测慢性肾脏疾病的方法的优选患者亚组只包含不处于ESRD的患者。
在本发明的另一个实施方案中，发展者被定义为发展到需要更换肾脏的终点ESRD的患者。因此，发展被定义为疾病从轻度至中度肾脏疾病朝向上面提到的终点之一的过程，所述终点是血浆肌酸酐加倍而优选不达到ESRD或达到需要更换肾脏的ESRD。本发明的方法特别适用于具有轻度至中度肾脏疾病的患者。具有轻度至中度肾脏疾病的患者被定义为在被分析物测量之前具有至少3个月的稳定肾功能的患者。在优选实施方案中，具有轻度至中度肾脏疾病的患者不需要血液透析。
在优选实施方案中，本发明的方法用于预测慢性肾脏疾病的发展或监测慢性肾脏疾病，但是不预测死亡风险。因此，根据本发明的一个实施方案，死亡不是被用作将患者分类成发展者或非发展者的终点。然而，对于本技术领域的专业人员来说，显然发展者与非发展者相比具有增加的死亡风险。
在一个优选实施方案中，本发明涉及用于为患有轻度至中度肾脏疾病的患者预测初次慢性肾脏疾病(CKD)的发展或监测慢性肾脏疾病疗法的方法，所述方法包含下列步骤：
(a)提供来自患有初次慢性肾脏疾病、具有轻度至中度肾脏疾病的患者的样品，
(b)测定ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平，
(c)将ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平与初次慢性肾脏疾病的发展的预测相关联。
在一个优选实施方案中，本发明涉及用于为患有轻度至中度肾脏疾病的患者预测初次慢性肾脏疾病(CKD)的发展或监测慢性肾脏疾病疗法的方法，所述方法包含下列步骤：
(a)提供来自患有初次慢性肾脏疾病、具有轻度至中度肾脏疾病的患者的样品，
(b)测定ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平，
(c)将ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平与初次慢性肾脏疾病的发展的预测相关联，不将死亡的预测考虑在内。
这意味着初次慢性肾脏疾病的进展，其中进展意味着肾功能恶化。肾功能恶化的度量是基线血清肌酸酐的增加、即至少倍增，和/或需要换肾疗法的ESRD。
在本发明的一个优选实施方案中，测定ANP或其片段或其前体或所述前体的片段的水平，并将其用作单一标志物。在本发明的另一个优选实施方案中，测定ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平，并将其用作单一标志物。
优选情况下，ANP或其片段或其前体或所述前体的片段选自NT-proANP、MR-proANP和成熟ANP或其片段。片段可以具有优选至少12个氨基酸的长度。
优选情况下，ADM或其片段或其前体或所述前体的片段选自成熟ADM、MR-proADM、PAMP和CT-proADM或其片段。片段可以具有优选至少12个氨基酸的长度。
在本发明的特别优选实施方案中，初次慢性肾脏疾病的发展的预测，可以通过附加地测定并使用至少一种其他实验室参数或其他标志物的水平来改进，所述其他实验室参数或其他标志物选自：肌酸酐、GFR(“肾小球滤过率”；GFR可以通过例如测量碘海醇清除率来测定(Bostom等，J Am Soc Nephrol 2002；13：2140-2144))、蛋白尿、白蛋白、CRP、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、GDF15、ST2、NGAL、降钙素原及其片段、BNP或其片段或其前体或所述前体的片段特别是proBNP或NT-proBNP、血管加压素原及其包括和肽素、血管加压素和后叶激素运载蛋白II的片段、内皮素原-1及其包括CT-proET-1、NT-proET-1、大内皮素-1和内皮素-1的片段。
此外，优选情况下，附加地测定选自下列的至少一个临床参数：年龄、性别、收缩压、舒张压、体重指数、当前吸烟嗜好、抗高血压治疗。
本发明还涉及用于预测初次慢性肾脏疾病的发展或用于监测慢性肾脏疾病疗法的方法，其中ANP和/或ADM或其前体或片段的水平单独地或与其他预后有用的实验室或临床参数联合，通过可以选自下列可选方案的方法用于预测初次慢性肾脏疾病的发展：
-与初次慢性肾脏疾病患者群体中全部预定样品中的ANP和/或ADM或其前体或其片段的水平的中位数进行比较，
-与初次慢性肾脏疾病患者群体中全部预定样品中的ANP和/或ADM或其前体或其片段的水平的分位数进行比较，
-根据Cox比例风险分析或使用风险指数计算例如NRJ(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)进行计算。
在具体实施方案中，使用诊断测定方法测量MR-proADM的水平，所述测定方法包含一个或多个针对位于Pre-proADM的第45-92位氨基酸中的一个或多个表位的捕获探针。
另一方面，本发明还涉及使用ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段，用于在患有初次慢性肾脏疾病的患者中预测肾脏终点(renal endpoints)。
此外，本发明涉及使用ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段，用于预测初次慢性肾脏疾病的发展。
在本发明的一个实施方案中，患有初次慢性肾脏疾病的患者未患糖尿病。因此，在本发明的优选实施方案中，慢性肾脏疾病是非糖尿病性慢性肾脏疾病。
在本发明的范围内还包括使用ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段，用于将患有初次慢性肾脏疾病的患者分类成发展者或非发展者。
具体来说，ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段被用作不依赖于GFR的预测物和分类标志物。
本发明还涉及使用本发明的任一种方法，用于在患有初次慢性肾脏疾病的患者中监测慢性肾脏疾病疗法的成功。在这种情形中，本发明的方法可以在疗法开始后实施一次或多次，并且结果可以互相或与疗法开始前的结果进行比较，以便评估疗法的成功。
本发明的范围内还包括使用本发明的任一种方法，用于监测肾功能。
在一个实施方案中，使用具有低于0.3nmol/L和/或低于初次慢性肾脏疾病患者群体的中位数的检测极限，以及在正常范围内＜30％CV的测定间精确度的MR-proADM测定方法，用于预测初次慢性肾脏疾病的发展。
在另一个实施方案中，使用具有低于20pmol/L和/或低于初次慢性肾脏疾病患者群体的中位数的检测极限，以及在正常范围内＜30％CV的测定间精确度的MR-proADM测定方法，用于预测初次慢性肾脏疾病的发展。
本发明还涉及使用针对ANP或其片段或其前体或所述前体的片段和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的捕获探针，用于预测初次慢性肾脏疾病的发展。在ADM的情形中，优选情况下，所述捕获探针针对位于pre-proADM的第45-92位氨基酸中的一个或多个表位。在ANP的情形中，优选情况下，所述捕获探针针对位于proANP的第53-90位氨基酸中的一个或多个表位。
一般来说，本文中所定义的肽和前体肽的片段，涉及其长度为至少12个氨基酸的片段。片段优选为肽的可免疫检测的片段。
在本发明的上下文中，术语“肾上腺髓质素原”(proADM)和术语“肾上腺髓质素原或其片段”是指proADM的完整分子或其包括但不限于ADM、PAMP和MR-proADM的至少12个氨基酸的片段。在优选实施方案中，proADM是指proADM的完整分子或其除了成熟ADM之外的至少12个氨基酸的片段。在其他优选实施方案中，proADM是指proADM的完整分子或其除了成熟ADM或成熟ADM的片段之外的至少12个氨基酸的片段。因此，在本发明的一个具体实施方案中，“测定proADM或其片段的水平”是指测定proADM或其片段的水平，其中成熟ADM和/或成熟ADM的片段的水平不测定。
肾上腺髓质素的前体肽(前肾上腺髓质素原)的氨基酸序列在图1中给出(SEQ ID NO：1)。肾上腺髓质素原是指前肾上腺髓质素原序列的22到185位氨基酸残基。肾上腺髓质素原(pro-ADM)的氨基酸序列在图2中给出(SEQ ID NO：2)。pro-ADM的N端20肽(PAMP)是指pre-proADM的第22-41位氨基酸残基。PAMP的氨基酸序列在图3中给出(SEQ ID NO.3)。MR-肾上腺髓质素原(MR-pro-ADM)涉及pre-pro-ADM的第45-92位氨基酸残基。MR-pro-ADM的氨基酸序列提供在图4中(SEQ ID NO：4)。成熟肾上腺髓质素(ADM)的氨基酸序列在图5中给出(SEQ ID NO：5)。
ANP的氨基酸序列在图8中给出(SEQ ID NO：8)。153个氨基酸的pre-proANP的序列显示在图6中(SEQ ID NO：6)。在切开N-端信号肽(25个氨基酸)和两个C-端氨基酸(127/128)后，释放出proANP(图7，SEQ ID NO：7)。ANP包含来自前体激素原pro-ANP的C-端的99-126位氨基酸残基。该激素原被切割成28个氨基酸的ANP成熟肽，也称为ANP(1-28)或α-ANP，以及氨基端片段ANP(1-98)(NT-proANP，图9，SEQ ID NO：9)。中段proANP(MR-proANP)被定义为NT-proANP或其包含proANP的至少第53-90位氨基酸残基(图10中的SEQ ID NO：10)的任何片段。
在本文中，当在蛋白或肽的上下文中提到时，术语“片段”是指可以从较大蛋白或肽得到的较小蛋白或肽，因此其包含较大蛋白或肽的部分序列。所述片段可以从较大蛋白或肽通过其一个或多个肽键的皂化作用而产生。
在本发明的文本中，在表述例如“蛋白酶水平”、“被分析物水平”和类似的表述中，术语“水平”是指在相应上下文中提到的分子实体的量，或在酶的情况下它也可以是指酶活性。
在本发明的方法的一个优选实施方案中，测定肾上腺髓质素原或其片段和/或proANP或其片段的所述水平，并将其用作单一标志物。
在本发明的特别优选实施方案中，初次慢性肾脏疾病的发展的预测，可以通过附加地测定和使用至少一种其他实验室参数来改进，所述实验室参数选自：肌酸酐、GFR(“肾小球滤过率”；GFR可以通过例如测量碘海醇清除率来测定(Bostom等，J Am Soc Nephrol 2002；13：2140-2144))、蛋白尿、白蛋白、CRP、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、GDF15、ST2、NGAL、降钙素原及其片段、BNP或其片段或其前体或所述前体的片段特别是proBNP或NT-proBNP、血管加压素原及其包括和肽素、血管加压素和后叶激素运载蛋白II、内皮素原-1及其片段包括CT-proET-1、NT-proET-1、大内皮素-1和内皮素-1的片段。
术语“附加地测定”不暗示、尽管也不排除这些测定在技术上组合。术语“附加地使用”被定义为参数——它可以是实验室和/或临床参数——的任何类型的数学组合，其产生了初次慢性肾脏疾病的发展的预测。这种数学组合的一个实例是Cox比例风险分析，从其可以推导出患有初级慢性肾脏疾病的对象的疾病发展的风险，但是也可以使用其他方法。
本发明还包括将个体的标志物水平与预定值进行比较。预定值可以采取各种形式。它可以是单一截止值：这可以是例如参比群体的中位数或平均值或75th、90th、95th或99th百分位数。这也可以是例如“最适”截止值。给定标志物的最适截止值是对于该标志物来说诊断灵敏度和特异性的积最大时的值。诊断灵敏度是患有疾病或发生疾病的风险(在任何具体情况下取决于所回答的诊断或预后问题)并且也被标志物正确识别出的患者(“真阳性”)的相对分数，诊断特异性是不患有疾病或发生疾病的风险(在任何具体情况下取决于所回答的诊断或预后问题)并且也被标志物正确识别出的患者(“真阴性”)的相对分数。取决于临床或经济学需要，这可以通过对截止值进行优化以获得最大阴性预测值或最大阳性预测值。
因此，人们可以根据被认为更加合适的是以也鉴定到“假阳性”为代价而鉴定大多数有风险对象，还是以错过几个具有中等风险的对象为代价而主要鉴定高风险对象，来挑选截止值。
预定值可以根据对比组来建立，例如一个规定组中的风险为另一个规定组中风险的两倍。它可以是范围，例如将测试群体等量(或不等量)地分组，例如低风险组、中风险组和高风险组，或分成四等分，最低的四分之一是具有最低风险的个体，最高的四分之一是是具有最高风险的个体。
在所选的特定参比群体中，预定值可以随着他们的嗜好、种族、遗传等而变化。因此，所选的预定值可以考虑个体所属类别。本技术领域的普通专业人员可以使用不超出常规的实验来选择适合的范围和类别。
如上讨论的各种阈值水平的有效性，可以通过例如Kaplan-Meier分析(图11-14)看出，其中描述了对于所调查患者群体的亚组来说事件、即在本发明的情况下是肾脏疾病的发展、的发生。这里，对于四个Kaplan-Meier分析来说，所调查的患者群体各自被分成两个亚组。亚组定义如下：
a)所调查的患者群体被分成MR-proANP值高于中位数水平(106pmol/L)的一个组和MR-proANP值低于中位数水平的另一个组(图11)，
b)所调查的患者群体被分成MR-proADM值高于中位数水平(0.75nmol/L)的一个组和MR-proADM值低于中位数水平的另一个组(图12)，
c)所调查的患者群体被分成MR-proADM值高于最适阈值水平(0.865nmol/L(灵敏度为0.766，特异性为0.809))的一个组和MR-proADM值低于最适阈值水平的另一个组(图13)，
d)所调查的患者群体被分成MR-proANP值高于最适阈值水平(84.15pmol/L(灵敏度为0.891，特异性为0.582))的一个组和MR-proANP值低于最适阈值水平的另一个组(图14)。
在本发明中鉴定到的最适阈值水平是基于所调查的特定群体，并且由于上面描述的原因，它们在其他可比群体中可能不同(+/-20％)。
在本发明的文本中，术语“阈”、“阈值”、“截止”和“截止值”同义使用。
这些结果得到Cox回归分析(表4)的进一步支持，所述Cox回归分析证实了MR-proANP和MR-proADM两者对于预测初次慢性肾脏疾病(CKD)的发展的效用。
通过使用个体的MR-proADM和/或MR-proANP值和其他预后性实验室和临床参数来计算个体风险的其他数学可能性是例如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)。指数可以按照Pencina的文献来计算(Pencina MJ等：“评估新标志物的增加预测能力：从ROC曲线下面积到重新分类等”(Evaluating the added predictive ability of a new marker：from area under the ROC curve to reclassification and beyond)，Stat Med.2008；27：157-172)。
在某些实施方案中，不能依靠组中的一种或多种标志物的具体阈值来确定从对象获得的标志物水平的分布情况是否指示了特定的诊断/预后。相反，本发明可以利用标志物组“分布情况”作为不可分割的整体进行评估。这种标志物组中变化的特定“指纹”组合形式能够有效用作特定的诊断或预后指示物。正如在本文中讨论的，变化的组合形式可以从单一样品或组的一个或多个成员的时间变化(或组的响应值)获得。这里的组是指一组标志物。
组的响应值可以通过各种方法产生。一个实例是Cox比例风险分析。另一个实例是优化ROC曲线：这可以通过对在各种截止值下特定组的灵敏度对组的1-(特异性)的ROC曲线作图来获得。
在这些方法中，来自对象的标志物测量值的分布情况合在一起，被认为提供了诊断或预后的全局概率(表示成数字分值或风险百分率)。在这样的实施方案中，标志物的某些子集的增加可能足以在一个患者中指示特定诊断/预后，而标志物的不同子集的增加可能足以在另一个患者中指示相同或不同的诊断/预后。也可以向组中的一个或多个标志物施加权重因数，例如，当标志物在鉴定特定诊断/预后中效用特别高时，可以将其权重成使得在给定水平下，它单独即足以传递阳性结果的信号。同样，权重因数也可以提供成使得任何特定标志物的给定水平都不足以传递阳性结果的信号，而只有当另一个标志物也有助于分析时才传递结果的信号。
在某些实施方案中，标志物和/或标志物组被选择成表现出至少约70％的灵敏度、更优选至少约80％的灵敏度、更优选至少约85％的灵敏度、更优选至少约90％的灵敏度以及最优选至少约95％的灵敏度，与至少约70％的特异性、更优选至少约80％的特异性、更优选至少约85％的特异性、更优选至少约90％的特异性以及最优选至少约95％的特异性的组合。在特别优选实施方案中，灵敏度和特异性两者均为至少约75％、更优选至少约80％、更优选至少约85％、更优选至少约90％以及最优选至少约95％。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。
在其他实施方案中，阳性似然比、阴性似然比、机会比或风险比被用作测试的预测风险或诊断疾病的能力的度量。在阳性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阳性结果可能性相等；值大于1表示在患病组中阳性结果可能性更大；值小于1表示在对照组中阳性结果可能性更大。在阴性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阴性结果可能性相等；值大于1表示在测试组中阴性结果可能性更大；值小于1表示在对照组中阴性结果可能性更大。在某些优选实施方案中，标志物和/或标志物组优选被选择成表现出至少约1.5或1.5以上或约0.67或0.67以下、更优选至少约2或2以上或约0.5或0.5以下、更优选至少约5或5以上或约0.2或0.2以下、更优选至少约10或10以上或约0.1或0.1以下，以及最优选至少约20或20以上或约0.05或0.05以下的阳性或阴性似然比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。
在机会比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阳性结果可能性相等；值大于1表示在患病组中阳性结果可能性更大。值小于1表示在对照组中阳性结果可能性更大。在某些优选实施方案中，标志物和/或标志物组优选被选择成表现出至少约2或2以上或约0.5或0.5以下、更优选至少约3或3以上或约0.33或0.33以下、更优选至少约4或4以上或约0.25或0.25以下、更优选至少约5或5以上或约0.2或0.2以下以及最优选至少约10或约10以上或约0.1或约0.1以下的机会比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。
在风险比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者中终点(例如死亡)的相对风险是相等；值大于1表示在患病组中风险更高；值小于1表示在对照组中风险更高。在某些优选实施方案中，标志物和/或标志物组优选被选择成表现出至少约1.1或1.1以上或约0.91或0.91以下、更优选至少约1.25或1.25以上或约0.8或0.8以下、更优选至少约1.5或1.5以上或约0.67或0.67以下、更优选至少约2或2以上或约0.5或0.5以下以及最优选至少约2.5或2.5以上或约0.4或0.4以下的风险比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。
专业技术人员将会理解，将诊断或预后指示物与诊断或与将来临床结果的预后风险相关联，是一种统计学分析。例如，标志物水平大于X可以传递患者与水平低于或等于X的患者相比更可能遭受不利后果的信号，正如通过统计学显著性水平所确定的。此外，标志物浓度从基线水平的改变可以反映患者的预后，并且标志物水平变化的程度可能与不利事件的严重性相关。统计学显著性通常通过比较两个或多个群体并确定置信区间和/或p值来确定。参见例如Dowdy和Wearden，《用于研究的统计学》(Statistics for Research)，John Wiley & Sons，New York，1983。本发明的优选置信区间是90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而优选的p值是0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
在其他实施方案中，可以进行多次诊断或预后标志物的测定，并使用标志物的时间变化确定诊断或预后。例如，可以在初始时间测定对象样品中的标志物浓度，并在第二个时间从第二个对象样品再次测定。在这样的实施方案中，从初始时间到第二个时间标志物的增加可以指示特定的诊断或特定的预后。同样地，从初始时间到第二个时间标志物的减少可以指示特定的诊断或特定的预后。
当在本文中使用时，术语“样品”是指出于对目标对象例如患者进行诊断、预后或评估的目的而获得的体液样品。优选的测试样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰液和胸膜腔积液。此外，本技术领域的专业人员将会认识到，某些测试样品在分级或纯化步骤、例如将全血分离成血清或血浆组分后，可以更容易地分析。
因此，在本发明的优选实施方案中，所述样品选自血液样品、血清样品、血浆样品和尿液样品，或上面提到的任何样品的提取物。
当在本文中使用时，术语“患者”是指由于疾病而正接受医学护理或将接受医学护理的活的人类或非人类生物体。这包括疾病未确定、正在接受病理征兆调查的人。因此，本文描述的方法和测定法可应用于人类和兽医疾病两者。
当在本文中指称诊断和预后标记物的用途时，术语“相关联”是指将患者中标记物的存在或量，与其在已知患有给定病症或已知具有给定病症风险的人、或已知没有给定病症的人中的存在或量进行比较。正如上面讨论的，可以将患者样品中的标志物水平与已知与特定预后相关的水平进行比较。样品的标志物水平被说成已经与诊断相关联；也就是说，专业技术人员可以使用标志物水平确定患者是否进行特定类型的诊断，并做出相应应答。可替选地，样品的标志物水平可以与已知与良好结果(例如不存在疾病等)相关的标志物水平进行比较。在优选实施方案中，标志物水平的分布情况与总体概率或特定结果相关联。
“预后”是指指派给定过程或结果将会发生的概率。这通常通过检查一种或多种“预后指示物”来确定。它们是标记物，其在患者(或从患者获得的样品)中的存在或量传递了给定过程或结果将会发生的概率的信号。例如，当在从这些患者获得的样品中一种或多种预后指示物达到足够高的水平时，所述水平可以传递患者具有最终发展到末期肾病(ESRD)的增加的概率，即患者具有成为“发展者”的增加的概率的信号。
在本发明的优选实施方案中，测量MR-proADM的水平。MR-proADM包含pre-proADM的第45-92位氨基酸。
在本发明的另一个优选实施方案中，使用诊断测定法测量proADM或其片段的水平，所述诊断测定法使用了一种或多种针对位于pre-proADM的第45-92位氨基酸中的一个或多个表位的捕获探针。
在本发明的另一个优选实施方案中，测量MR-proANP水平。MR-proANP是指包含proANP的第53-90位氨基酸的任何proANP片段。
在本发明的另一个优选实施方案中，使用诊断测定法测量proANP或其片段的水平，所述诊断测定法使用了一种或多种针对位于proANP的第53-90位氨基酸中的一个或多个表位的捕获探针。
当在本文中提到时，“测定方法”或“诊断测定方法”可以是在诊断学领域中应用的任何类型的测定方法。这样的测定方法可以基于待检测被分析物与具有一定亲和性的一种或多种捕获探针的结合。对于捕获分子与目标靶分子之间的相互作用来说，亲和常数优选大于108M-1。
上面提到的标志物的水平可以通过本技术领域任何公知的方法来获得。典型情况下，水平通过测量体液例如血液、淋巴、唾液、尿液等中的标志物水平或活性来测定。水平可以通过免疫测定法或用于测定标志物水平的其他常规技术来测定。公认的方法包括将患者的体液样品送往商业化实验室进行测量，但是也可以在护理现场进行测量。
在本发明的文本中，“捕获分子”是可用于结合来自样品的目标靶分子、即被分析物的分子。因此，捕获分子必须在空间上和表面特征例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体是否存在等方面适当塑造，以特异性结合目标靶分子。因此，结合可以由例如捕获分子与目标靶分子之间的离子、范德华、π-π、δ-π、疏水或氢键相互作用或两种以上上面提到的相互作用的组合来介导。在本发明的情形中，捕获分子可以例如选自核酸分子、糖类分子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选情况下，捕获分子是抗体，包括其与目标靶或分子具有足够亲和性的片段，并包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体或其源自于变体链的长度为至少12个氨基酸的片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。
优选的检测方法包括各种格式的免疫测定法，例如放射免疫测定法、化学发光和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列测定法，以及快速检测格式例如免疫层析条样试验。
测定法可以是均相或非均相测定法、竞争和非竞争性夹心测定法。在特别优选的实施方案中，测定法采用夹心测定法形式，其是非竞争性免疫测定法，其中待检测和/或定量分子与第一抗体并与第二抗体结合。第一抗体可以结合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或条上，并且第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性或催化活性组成部分标记的抗体。然后通过适合的方法测量与被分析物结合的标记抗体的量。“夹心测定法”所涉及的通用组合物和步骤是已确立的，并为专业技术人员所公知。(《免疫测定手册》(The Immunoassay Handbook)，David Wild主编，Elsevier LTD，Oxford；第三版(2005年5月)，ISBN-13：978-0080445267；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol.2006Feb；10(1)：4-10.PMID：16376134)，在此引为参考。
在特别优选实施方案中，测定方法包含两种捕获分子，优选为都作为分散相存在于液体反应混合物中的抗体，其中第一种标记组分附着在第一种捕获分子上，其中所述第一种标记组分是基于荧光或化学发光淬灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二种标记组分附着于第二种捕获分子上，使得当两种捕获分子与被分析物结合后产生可测量信号，允许检测在包含样品的溶液中形成的夹心复合物。
在特别优选的实施方案中，测定法包含两种捕获分子，优选为都作为分散体系存在于液体反应混合物中，其中第一标记组分与第一捕获分子结合，其中所述第一标记组分是基于荧光或化学发光-淬灭或扩增的标记系统的一部分，所述标记系统的第二标记组分与第二捕获分子结合，使得当两种捕获分子与被分析物结合后产生可测量信号，允许检测包含样品的溶液中形成的夹心复合物。
在更优选情况下，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花青类型的染料的组合。
在本发明的情形中，基于荧光的测定方法包含使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、占吨、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’，5-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯并亚胺类例如Hoechst 33258；菲啶类例如德克萨斯红、雅吉瓦黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶类染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。
在本发明的情形中，基于化学发光的测定方法包含根据化学发光材料的物理原理使用染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology)第四版，J.I.Kroschwitz执行主编，M.Howe-Grant编辑，John Wiley & Sons，1993，vol.15，p.518-562中，在此引为参考，包括在551-562页中的引用文献。优选的化学发光染料是吖啶酯。
在特别优选实施方案中，使用具有低于0.3nmol/L的检测极限以及在正常范围内＜30％CV的测定间精确度的MR-proADM测定方法，在对象中预测初次不利事件或鉴定具有发生初次不利事件的高风险的对象。
本发明的另一个实施方案是使用捕获探针、例如针对proADM或其片段的抗体，在对象中预测初次不利事件或鉴定具有发生初次不利事件的高风险的对象。
在本发明的情形中，特别优选的是使用针对包含在Pre-proADM的45-92氨基酸位置中的表位和/或针对包含在proANP的53-90氨基酸位置中的表位的一种或多种抗体。
实施例
实施例1：轻度至中度肾脏疾病(MMKD)研究
本研究的目的是在患有初次CKD的患者组群的前瞻性7年随访研究中，使用覆盖更稳定的激素原片段(MR-proANP和MR-proADM)的中段表位的新的夹心免疫测定法，研究ANP和ADM对肾脏疾病进展的预测价值。
结果
表1显示了按照K/DOQI的慢性肾脏疾病临床实践准则使用基线GFR分层的等级中NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM的血浆浓度。跨过CKD等级，存在NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM血浆浓度中位数的连续增加。此外，非参数关联性分析显示出GFR与所有三种参数之间的显著关联性(表2)。
227位登记患者中的177位随访数据可用。在基线研究完成后随访持续时间的中位数为53个月(范围为3至84个月)。在随访期间，65位患者发展到终点，所述终点在36位患者中是血清肌酸酐加倍并且未达到ESRD，在29位患者中是需要换肾治疗的ESRD。表3报告了发展者和非发展者的基线CKD患者特征。达到发展终点的患者年龄较大、具有较高的蛋白质排泄率以及较低的GFR。此外，在发展者中与非发展者中相比，NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM的血浆浓度中位数较高(NT-proBNP，321比84ng/L；MR-proANP，164比74pmol/L；以及MR-proADM，1.13比0.55nmol/L)。
图11到12显示了根据基线时MR-proANP和MR-proADM的中位数分层到两个组中的177位CKD患者的Kaplan-Meier曲线分析。GFR值低于中位数并且MR-proANP和MR-proADM血浆浓度高于中位数的患者，与GFR值高于中位数并且MR-proANP和MR-proADM血浆浓度低于中位数的患者相比，具有更糟的肾脏预后和明显更短的发展时间[以月计的发展平均时间，分别为对于MR-proANP来说51.1(95％CI 45.2-57.1)比71.4(95％CI 64.7-78.1)，p＜0.001；对于MRproADM来说51.6(95％CI45.6-57.6)比73.6(95％CI 68.5-78.6)，p＜0.001]。使用根据中位数值对预测变量进行分层方法的单变量Cox比例风险回归分析，显示出对于高于中位数的GFR来说显著降低的风险比(HR)(HR 0.12；95％CI0.06-0.24；p＜0.001)，以及对于基线时高于中位数的NT-proBNP(HR 3.84；95％CI 2.14-6.89；p＜0.001)、MR-proANP(HR 4.47；95％CI2.46-8.12；p＜0.001)和MR-proADM(HR 5.84；95％CI 3.04-11.21；p＜0.001)浓度来说显著增加的HR。
使用预测变量的增量方法的Cox比例风险回归分析的结果在表4中给出。在对年龄和性别进行调整的模型1中，GFR、蛋白尿、NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM对肾脏疾病的发展显示出明显的HR。在对GRF和蛋白尿进一步调整后，对于MR-proANP和MR-proADM来说HR略微减弱，但是两种变量仍保持与疾病发展的强烈关联，而对于NT-proBNP来说HR不再显著(模型2)。甚至在对NT-proBNP进一步调整后，MR-proANP和MR-proADM仍各自保留为肾脏疾病进展的有力预测物(模型3)。因为几个所调查的变量都是非正态分布的，因此我们通过将对数变换的变量包含在模型中，进行了灵敏度分析。这些分析显示出非常相似的结果(数据未显示)，例外的是NT-proBNP，其在对年龄、性别、GFR和蛋白尿进行调整后仍然显著(HR 1.59；95％CI1.15-2.19；p＝0.005)。然而，为了估算值的更好的可判读性，我们以原始的标度呈现数据。
我们还通过将MR-proANP和MR-proADM两个变量包含在同样的Cox回归模型中并对年龄、性别、DFR和蛋白尿进行调整，研究了MR-proANP和MR-proADM两者是否独立地增加CKD发展的预测。两个变量的风险比都降低(与表4的模型2中的估算相比)，但是仍保持显著(对于MR-proANP来说HR 1.60；95％CI 1.11-2.30，p＝0.011；对于MR-proADM来说HR 1.96；95％CI 1.31-2.94，p＜0.001)。
在二级分析中，我们只包含了根据K/DOQI的慢性肾脏疾病临床实践准则处于3期及以上的患者(GFR＜60ml/min/1.73m2)。我们对于整个组来说观察到与表4的模型2和3所呈现的非常相似的估算值(数据未显示)。
讨论
本研究是调查MR-proANP和MR-proADM对患有初次CKD的白人患者的肾病发展的预后价值的首个远景长期观察。我们的数据表明，基线时增加的MR-proANP和MR-proADM血浆浓度是肾脏终点的强有力的预测物，即使在独立于GFR的情况下。
通过在许多实验室采纳K/DOQI的推荐方案并日常报告GFR估算值，在未诊断CKD的筛查中获得了显著成功(国家肾脏基金会(National Kidney Foundation)，Am J Kidney Dis 2002；39(2Suppl 1)：S1-266；疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)(CDC)，Morb Mortal Wkly Rep 2007；56：161-165)。但是，对于进一步风险分层并鉴定其他风险预测因子以对患有CKD、最可能发展到ESRD的患者进行定向干预，存在着紧迫需求。
我们的研究的重要发现是下述事实，即MR-proANP和MR-proADM与通过碘海醇测量的GFR强烈相关，碘海醇测量已被报道接近于测量肾功能的黄金标准(Bostom等，J Am Soc Nephrol 2002；13：2140-2144)。我们发现，在跨GFR等级间MR-proANP和MR-proADM的血浆浓度连续增加，表明了与疾病严重性的关联。这种与GFR的强烈关联性可能可归因于下述证据，即ANP和ADM都在肾脏中产生(Vesely等，Am J Physiol Renal Physiol 2003；285：167-177)，并且两者在肾脏中都具有重要的生物学功能(Vesely等，Cardiovasc Res 2001；51：647-658；Nishikimi等，Curr Med Chem 2007；14：1689-1699)。此外，已报道两种肽的肾脏保护性质，表明在CKD中ANP和ADM的浓度增加的代偿性作用(Vesely等，Cardiovasc Res 2001；51：647-658；Vesely等，Am J Physiol Renal Physiol 2003；285：167-177；Nishikimi等，Curr Med Chem 2007；14：1689-1699)。
在评估的背景下，MR-proANP和MR-proADM的预后价值，与肾脏疾病进展的已确立的预后性、但难以测定的标志物GFR的价值相当。在对年龄和性别进行调整的Cox比例风险回归模型中，GFR、MR-proANP和MR-proADM的行为类似。但是，重要的是注意到除了GFR之外，MR-proANP和MR-proADM两者都显著增加了疾病发展的预测。两种参数中的每种增加一个标准偏差，伴有疾病发展的风险增加两倍以上，即使是在对基线GFR进行调整之后。尽管如此，我们向模型同时添加两种参数，获得了两种参数对风险预测的显著并且独立的贡献。
NT-proBNP的预后能力与GFR、MR-proANP或MR-proADM相比较低。
重要的是注意到在我们的研究中，GFR不是通过公式计算，而是通过碘海醇清除率来测量，其被认为是测量肾脏功能的精确方法。但是，由于使用造影介质并收集几个血样，这种方法是繁琐的，并且对于患者来说是一种负担。测量MR-proANP或MR-proADM是替代的简单方法，其提供了肾功能的良好近似，并为肾脏疾病的发展提供了性能良好的预测物，其性能与GFR相等。
总的来说，我们的工作证明了基线时MR-proANP和MR-proADM的增加的血浆浓度，是肾脏疾病发展的强有力预测物。因此，两种标志物都可以在临床上用作初次CKD患者中的预测物。
简要方法
研究样品：
在基线时，227位年龄在18至65岁之间、具有CKD和各种程度的肾损伤的白人患者，在轻度至中度肾脏疾病(MMKD)研究中登记。这些患者从8个肾病科召集，如Kronenberg等中所述(J Am Soc Nephrol 2000；11：105-115)。该研究得到学术论理委员会的批准，并且所有对象提供了书面知情同意书。在进入本研究之前，他们至少3个月具有稳定的肾功能。排除标准是用免疫抑制剂、鱼油或红细胞生成素治疗、血清肌酸酐高于6mg/dL、任何类型的糖尿病、恶性肿瘤、肝病、甲状腺病或传染病、肾病综合征(定义为蛋白尿＞3.5g/1.73m2/天)、器官移植、对离子造影介质过敏和妊娠。为了避免观察者之间的差异，所有患者由一位医生召集，他访问了所有参加的中心。基线时的患者病史、包括吸烟嗜好和抗高血压治疗，通过会谈记录并通过检查患者的记录来证实。此外补充了临床检查，包括体重指数和血压的评估。高血压被定义为血压高于140/90mm Hg和/或使用抗高血压药物。在研究登记的当天保持使用抗高血压药物，以便最小化对GFR测量的干扰。179位患者服用抗高血压药物(79％)：利尿药(n＝83；37％)、ACE抑制剂(n＝123；54％)、钙通道阻断剂(n＝78；34％)、β-受体阻断剂(n＝67；30％)以及α-1受体阻断剂(n＝36；16％)。
肾脏疾病的主要病因，在97位(在90位中活检证实)患者中是肾小球肾炎，在37位患者中是成年人多囊肾病，在24位患者中是间质性肾炎，在43位患者中是其他类型的肾脏疾病，在26位患者中未知。患者在根据K/DOQI的慢性肾脏疾病分类临床实践准则2的CKD等级中的分布，提供在表1中。
随访调查的终点被定义为基线血清肌酸酐加倍和/或需要换肾治疗的ESRD。在227位患者的最初组群中，177位患者(78％)被远景性随访了最高84个月的时间(Boes等，J Am Soc Nephrol 2006；17：528-536)。患者在门诊病房的正规控制下，并且向研究协调中心报告终点。在随访过程中丢失的患者，已经搬家或在基线调查后没有访问研究中心。与参加随附的患者相比，这些患者在基线时具有明显更好的肾功能，但是在性别和年龄方面没有显著差异。
生物化学分析
在过夜禁食至少12小时后抽取血样。将样品立即在4℃下以1.500g离心10分钟，并将上清液以等份试样储存在-80℃，直到进一步使用。患者中的GFR使用碘海醇清除率技术，按照Bostom等中的详细描述进行评估(J Am Soc Nephrol 2002；13：2140-2144)。常规的生物化学分析包括血清肌酸酐、蛋白尿、血清白蛋白和高灵敏性C-反应蛋白，按照Kronenberg等中的描述进行(J Am Soc Nephrol 2000；11：105-115)。血浆NT-proBNP在Modular Analytics E170系统(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)上测量(Spanaus等，Clin Chem 2007；53：1264-1272)。MR-proANP和MR-proADM血浆浓度通过可商购的免疫发光测定系统(B.R.A.H.M.S.AG，Hennigsdorf Germany)测量。这两种方法的精确度已在以前评估和描述(Morgenthaler等，Clin Chem 2004；50：234-236；Morgenthaler等，Clin Chem 2005；51：1823-1829)。
统计学分析
统计学分析使用SPSS第13.0版(SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA)和MedCalc 9.4.2.0软件包(MedCalc Software，Mariakerke，Belgium)进行。各个组之间连续变量的单变量比较使用单向ANOVA、不成对t-检验进行，或在非正态分布变量的情况下使用非参数性Kruskal-Wallis或Wilcoxon秩和检验来进行。二分化变量使用Pearson的χ2-检验进行比较。数据被呈现为平均值±标准偏差(SD)以及对于偏斜变量来说在适当时呈现为中位数和25th和75th百分位数。秩相关(rs)的Spearman系数被用于评估四种主要研究参数(即GFR、NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM)之间的关系。对于GFR、NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM高于和低于整个研究群体的中位数值的患者来说，产生了从基线到肾脏终点的时间分布的Kaplan-Meier估算值；计算了对数排序检验以比较组之间的存活曲线。使用按照整个组群的中位数浓度二分的所有四种参数，进行了单变量Cox比例风险回归分析。此外，使用每个增量为相应数据的1个标准偏差(SD)的增量方法，计算了发展终点的调整过的风险评估值。所有概率是双尾的，并且P值＜0.05被当做是显著的。
表1：根据肾小球滤过率(GFR)分层在国家肾脏基金会(National Kidney Foundation)等级中的227位患者的基线临床和实验室数据
Figure BPA00001349823100271
缩写：GFR，肾小球滤过率；MR-proADM，中段肾上腺髓质素原；MR-proANP，中段A型利尿钠肽原；NT-proBNP，氨基端B型利尿钠肽原。
*P-值用于在适合时从Kruskal-Wallis检验、单向ANOVA和卡方检验获得的所有4个组之间进行比较。
数据被呈现为平均值±SD，以及对于偏斜变量来说在适当时呈现为25th、50th(＝中位数)和75th百分位数。
Figure BPA00001349823100281
可以在222、221和220位患者中分别获得NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM的血浆水平。
表2.在227位登记患者中在基线时的变量GFR、NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM血浆浓度之间的Spearman相关系数(p-值)
Figure BPA00001349823100282
缩写：GFR，肾小球滤过率；MR-proADM，中段肾上腺髓质素原；MR-proANP，中段A型利尿钠肽原；NT-proBNP，氨基端B型利尿钠肽原。
表3：完成随访并在随访过程中进一步分层为具有和没有肾脏疾病发展的177位患者的基线临床和实验室数据
Figure BPA00001349823100283
缩写：GFR，肾小球滤过率；MR-proADM，中段肾上腺髓质素原；MR-proANP，中段A型利尿钠肽原；NT-proBNP，氨基端B型利尿钠肽原。
数据被呈现为平均值±SD，以及对于偏斜变量来说在适当时呈现为25th、50th(＝中位数)和75th百分位数。
*可以在177位患者中的174、174和173位中分别获得NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM的血浆水平。
表4：在观察期间使用多个Cox比例风险回归模型获得的基线变量与肾脏疾病发展之间的关联性
Figure BPA00001349823100291
缩写：GFR，肾小球滤过率；MR-proANP，中段A型利尿钠肽原；MR-proADM，中段肾上腺髓质素原；NT-proBNP，氨基端B型利尿钠肽原。
*对于GFR来说1SD增量为39mL/min/1.73m2，
Figure BPA00001349823100292
对于蛋白尿来说它是0.92g/24h/1.73m2，
Figure BPA00001349823100293
对于NT-proBNP来说它是527ng/L，§对于MR-proANP来说它是131pmol/L，
Figure BPA00001349823100301
对于MR-proADM来说它是0.42nmol/L。
#MR-proANP、MR-proADM和NT-proBNP不被同时包含，但是它们对同样的变量进行调整：年龄、性别、GFR、蛋白尿。
##MR-proANP和MR-proADM不被同时包含，但是它们对同样的变量进行调整：年龄、性别、GFR、蛋白尿和NT-proBNP。
附图描述
图1：肾上腺髓质素(ADM)前体肽(pre-pro-ADM)的氨基酸序列。1-21位氨基酸形成信号肽。22-41位氨基酸形成pro-ADM N-端20肽(proADM N20)。45-92位氨基酸形成MR-proADM肽。成熟ADM包含95-146位氨基酸。148-185位氨基酸形成proADM C-端片段。
图2：肾上腺髓质素原肽(proADM)的氨基酸序列。
图3：肾上腺髓质素原N-端20肽(proADM N20；PAMP)的氨基酸序列。PAMP肽可以具有酰胺化的C-端。
图4：MR肾上腺髓质素原(MR-proADM)的氨基酸序列。
图5：成熟肾上腺髓质素肽(ADM)的氨基酸序列。ADM肽可以具有酰胺化的C-端和/或可以被糖基化。
图6：心房利尿钠肽(ANP)前体(pre-pro-ANP)的氨基酸序列。1-25位氨基酸形成信号肽。
图7：proANP的氨基酸序列。
图8：成熟ANP的氨基酸序列。
图9：NT-proANP的氨基酸序列。
图10：proANP的53-90位氨基酸的氨基酸序列。
图11：Kaplan-Meier作图，显示了患有CKD并根据基线时MR-proANP的中位数(106pmol/L)分层到两个组中的患者的肾病发展。
图12：Kaplan-Meier作图，显示了患有CKD并根据基线时MR-proADM的中位数(0.75nmol/L)分层到两个组中的患者的肾病发展。
图13：使用MR-proADM的最适截止值的Kaplan Meier曲线：灵敏度＝0.766，特异性＝0.809，对数排序：p＝＜0.001。
图14：使用MR-proANP的最适截止值的Kaplan Meier曲线：灵敏度(0.891)，特异性＝0.582，对数排序：p＝＜0.001。
Figure IPA00001349822600011
Figure IPA00001349822600021
Figure IPA00001349822600031
Figure IPA00001349822600041
Figure IPA00001349822600071
Figure IPA00001349822600081

Claims (15)

1.一种用于预测初次慢性肾脏疾病的发展或用于监测慢性肾脏疾病疗法的方法，所述方法包含下列步骤：
(a)提供来自患有初次慢性肾脏疾病的患者的样品，
(b)测定ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平，
(c)将ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平与初次慢性肾脏疾病的发展的预测相关联。
2.权利要求1的方法，其中所述患者被分类为发展者或非发展者。
3.权利要求1或2的方法，其中测定ANP或其片段或其前体或所述前体的片段的水平并将其用作单一标记物。
4.权利要求1到3的方法，其中ANP或其片段或其前体或所述前体的片段选自NT-proANP、MR-proANP和成熟ANP。
5.权利要求1到3的方法，其中测定ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平并将其用作单一标记物。
6.权利要求1、2或5的方法，其中ADM或其片段或其前体或所述前体的片段选自成熟ADM、MR-proADM、PAMP和CT-proADM。
7.权利要求1到6的方法，其中初次慢性肾脏疾病的发展的预测，通过附加地测定并使用至少一种实验室参数或其他标志物的水平来改进，所述其他标志物选自：肌酸酐、GFR、蛋白尿、白蛋白、CRP、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、GDF15、ST2、NGAL、降钙素原及其片段、BNP或其片段或其前体或所述前体的片段、血管加压素原及其包括和肽素、血管加压素和后叶激素运载蛋白II的片段、内皮素原-1及其包括CT-proET-1、NT-proET-1、大内皮素-1和内皮素-1的片段。
8.权利要求1到7的方法，其中附加地测定选自下列的至少一种临床参数：年龄、性别、收缩压、舒张压、抗高血压治疗、体重指数、当前吸烟嗜好。
9.前述权利要求任一项的用于预测初次慢性肾脏疾病的发展和用于监测慢性肾脏疾病疗法的方法，其中ANP和/或ADM或其前体或片段的水平单独地或与其他预后有用的实验室或临床参数联合，通过可以选自下列可选方案的方法用于预测初次慢性肾脏疾病的发展：
-与初次慢性肾脏疾病患者群体中全部预定样品中的ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平的中位数进行比较，
-与初次慢性肾脏疾病患者群体中全部预定样品中的ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的水平的分位数进行比较，
-根据Cox比例风险分析或使用风险指数计算例如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)进行计算。
10.前述权利要求任一项的方法，其中使用诊断测定方法测量MR-proADM的水平，所述诊断测定方法包含一个或多个针对位于Pre-proADM的第45-92位氨基酸中的一个或多个表位的捕获探针。
11.ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段在患有初次慢性肾脏疾病的患者中预测肾脏终点的应用。
12.ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段预测初次慢性肾脏疾病的发展的应用。
13.ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段将患有初次慢性肾脏疾病的患者分类成发展者或非发展者的应用。
14.权利要求1到11任一项的方法监测肾功能的应用。
15.针对ANP和/或ADM或其片段或其前体或所述前体的片段的捕获探针预测初次慢性肾脏疾病的发展的应用。
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