CN105116140A - 一种胰高血糖素检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胰高血糖素检测试剂盒，包括：1)包被有胰高血糖素抗体的固相载体；2)辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体；3)酶标抗体稀释液；4)胰高血糖素校准品；5)洗涤液；6)酶底物溶液；所述胰高血糖素抗体为能够特异性地识别人胰高血糖素N末端的单克隆抗体，所述胰高血糖素检测抗体为能够特异性地识别人胰高血糖素C末端的单克隆抗体。本发明还公开了一种胰高血糖素检测试剂盒的检测方法。本发明的试剂盒配方简单、使用方便，可在临床试验中于室温条件下灵敏、快速、准确地测定血液和血浆中的胰高血糖素。

Description

一种胰高血糖素检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于胰高血糖素检测领域，尤其涉及一种胰高血糖素检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

糖尿病是一组以慢性血糖水平增高为特征的代谢异常综合征，胰岛素和胰高血糖素对于维持适当的血糖水平很重要。胰岛素通过增加葡萄糖外周摄取和减少自肝脏输出的葡萄糖以降低血糖水平而作用肝脏和外周组织，与此同时，胰高血糖素通过与肝细胞上的胰高血糖素受体结合，引起肝糖原分解而释放以糖原形式贮藏的葡萄糖，从而帮助维持血液中的葡萄糖水平。随着这些贮藏被耗尽，胰高血糖素刺激肝脏通过糖异生合成额外的葡萄糖。该葡萄糖释放到血流中，阻止低血糖的发生。

胰高血糖素在临床上具有重要作用，研究已证实胰高血糖素能够促进肝细胞内环磷腺苷(c-AMP)的生物合成，评价肝硬化患者的肝脏储备功能；促进糖原分解和糖异生，升高血糖，治疗低血糖；抑制胃肠蠕动，用于胃肠造影及内镜下胰胆管造影；激活腺苷酸环化酶，增强心肌收缩力，治疗难治性心衰；评价糖尿病患者胰岛β细胞功能等临床意义。

近年来，多个制药公司致力于胰高血糖素类似物的研制，有的在进行临床试验，有的已经完成了临床试验进入市场，表明胰高血糖素在不久的将来必定成为糖尿病、心血管等疾病的常用治疗药物之一。

准确地监测胰高血糖素含量变化对于评价胰岛β细胞、血糖控制及相关代谢疾病的治疗是必不可少的前提。但目前，在国内定量检测患者血液中胰高血糖素含量的ELISA试剂盒尚未见报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种胰高血糖素检测试剂盒，该试剂盒配方简单、使用方便，可在临床试验中于室温条件下灵敏、快速、准确地测定血液和血浆中的胰高血糖素。

本发明采用的技术方案为：一种胰高血糖素检测试剂盒，包括：1)包被有胰高血糖素抗体的固相载体；2)辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体；3)酶标抗体稀释液；4)胰高血糖素校准品；5)洗涤液；6)酶底物溶液；

所述胰高血糖素抗体为能够特异性地识别人胰高血糖素N末端的单克隆抗体，所述胰高血糖素检测抗体为能够特异性地识别人胰高血糖素C末端的单克隆抗体。

在上述技术方案中，本发明胰高血糖素检测试剂盒用于检测胰高血糖素的原理为：向试剂盒中的固相载体加入待测样品、辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体以后，待测样品中的胰高血糖素通过其两个结合位点分别与胰高血糖素抗体和辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体结合，加入酶底物后，酶底物被辣根过氧化物酶催化变为有色产物，有色产物的量与待测样品中胰高血糖素的含量成正比，从而可通过酶联仪测定有色产物的光密度，并结合根据胰高血糖素校准品制得的标准曲线，即可得出待测样品中胰高血糖素含量。

在上述技术方案中，本发明的检测试剂盒使用的包被抗体(即胰高血糖素抗体)具有高的亲和力及高特异性，酶标抗体(即辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体)纯度高，能够有效抑制测定血清及EDTA血浆中的胰高血糖素时的非特异性反应，使得本发明的试剂盒能够准确地测定人胰高血糖素。所述酶标抗体稀释液即辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体稀释液。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述包被有胰高血糖素抗体的固相载体的制备方法为：

1)将胰高血糖素抗体溶于柠檬酸磷酸盐中，制得包被液；

2)将包被液加入固相载体的孔中，于37℃下温浴至包被液完全干燥，冲洗固相抗体；

3)向每孔中加入PBS-1％BSA缓冲液封闭，37℃孵育2h，冲洗后于室温下干燥，即得包被有胰高血糖素抗体的固相载体。

在上述技术方案中，所述固相载体采用全封闭方式进行封闭，减少后续步骤中非特异性蛋白的干扰，提高了检测精确度。

作为对上述技术方案的更进一步改进，所述包被有胰高血糖素抗体的固相载体的制备方法为：

(1)称取5mg包被抗体；

(2)溶于2500mL柠檬酸磷酸盐中，即为包被抗体浓度为2μg/mL的包被液；

(3)设置包被机参数，每孔100μl；通过包被机分装包被液至96孔板，

预热恒温箱，温度为37℃；

(4)将分装完毕的96孔板置于恒温箱中温浴过夜(16h)，至包被液完全干燥；

(5)用PBST冲洗5次已干燥的包被板，每次1min；PSBT为0.01mol/LPBS-0.05％吐温20；

(6)每孔加入350μlPBSB缓冲液进行板的封闭，37℃孵育2h，用洗涤液洗涤3次，置于室温下待其自然干燥，用铝箔袋密封保存于4℃条件下；PBSB为PBS-1％BSA。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述胰高血糖素抗体在固相载体中的包被浓度为2μg/mL。选择此包被浓度时，可满足孔里的抗体高于检测样本中的抗原量，同时不造成过多的抗体浪费。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体的制备方法为：

1)向辣根过氧化物酶的水溶液中加入NaIO₄溶液，4℃静置30min，然后加入乙二醇水溶液，静置30min；

2)加入胰高血糖素检测抗体水溶液，混匀装入透析袋，置于碳酸盐缓冲液中透析，4℃过夜；

3)加入NaBH₄溶液，再置4℃，2小时，其后搅拌加入饱和硫酸铵，置4℃，1小时；

4)3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵清洗，最后沉淀物溶于PBS中；

5)将上述溶液装入透析袋中，用PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶标抗体，稀释至规定浓度。

作为对上述技术方案的更进一步改进，所述辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体的制备方法为：

(1)称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml纯水中；

(2)于上液中加入1ml新配的0.08MNaIO4溶液，混匀，4℃静置30min；

(3)加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀，静置30min；

(4)加入含5mg胰高血糖素检测抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，置于0.01MpH9.5碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜；

(5)加0.2ml新配的5mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃，2小时；

(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃，1小时；

(7)3000rpm离心半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中；

(8)将上述溶液装入透析袋中，用0.15MpH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用奈氏试剂检测)，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶标抗体，用pH7.4PBS-1％BSA稀释至规定浓度。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体的浓度为11μg/mL，使用时的稀释倍数为11倍。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述酶标抗体稀释液为PBS-1％BSA。PBS-1％BSA为含1％牛血清白蛋白的0.01mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液，文中涉及的PBS-1％BSA均为此磷酸盐缓冲液。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述固相载体为酶标板；所述酶标板孔底透明度高，空白值低，各板之间、同一板各孔之间性能相近，可提高检测精确度。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述洗涤液为0.01mol/LPBS-0.05％吐温20。0.01mol/LPBS-0.05％吐温20为含0.05％吐温20的0.01mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液，文中涉及的0.01mol/LPBS-0.05％吐温20均为此磷酸盐缓冲液。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述酶底物溶液为TMB。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述胰高血糖素检测试剂盒还包括终止液，终止液为0.5mol/L的硫酸。

本发明的目的之二是提供一种胰高血糖素检测试剂盒的检测方法，该检测方法操作简单、方便，可重复性强，可灵敏、快速、准确地测定血液和血浆中的胰高血糖素。

本发明采用的技术方案为：一种所述胰高血糖素检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

1)取胰高血糖素检测试剂盒，将其在室温下平衡后，取出所需包被有胰高血糖素抗体的固相载体；

2)在固相载体上预设校准孔和待测样品孔，分别向校准孔、待测样品孔中加入校准品、待测样品；

3)分别向校准孔和待测样品孔中加辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体，于转速800～1000rpm、温度25～29℃下孵育0.8～3h，温育后，弃去孔内液体，洗板并干燥；

4)向每孔中加入酶底物溶液，于温度25～29℃下避光10～20min，显色；

5)向每孔中加入终止溶液，8～15min后于450nm波长下检测各孔的OD值，以校准品的浓度为横坐标，校准品对应的OD值为纵坐标，绘出校准曲线，将待测样品的OD值代入校准曲线回归方程式，计算出待测样品对应的胰高血糖素浓度。

对于现有的试剂盒，由于低温下试剂盒更稳定，相关的抗体和酶在低温下变性会变慢，孵育温度通常在2～8℃，考虑到低温条件下反应的不充分，所以孵育的时间必须加长，通常是过夜孵育。而本发明的胰高血糖素检测试剂盒的检测方法中，孵育温度为室温(25～29℃)，孵育时间为0.8～3h，相较于现有的试剂盒，本发明的试剂盒在保证准确度和精确度的同时，对温度要求更低，孵育时间更短，不仅降低了检测成本，还节约了大量孵育时间，提高了检测效率。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤3)中，孵育时间为1h。试验表明，孵育时间为1h时，胰高血糖素的检测准确度更高。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1、本发明的胰高血糖素检测试剂盒，能够有效地降低测定血清及EDTA血浆中的胰高血糖素时的非特异性反应，能够简便且准确地测定人胰高血糖素；

2、本发明的胰高血糖素检测试剂盒精确度高，其检测范围为1.5pmol/L-120pmol/L，检测限为1.3pmol/L；

3、对于本发明的胰高血糖素试剂盒，不论测定者的熟练程度如何，均能够准确地且高效地测定人胰高血糖素，即使在临床现场也无需繁杂操作，能够简便地实施均一的测定；

4、本发明的胰高血糖素检测试剂盒的检测方法中，反应温度为室温，孵育时间为0.8～3h，这大大的缩短了整个检测时间(现有技术中的检测时间一般为16h左右)，并适合用于临床人胰高血糖素的体外检测，此外，降低了实验设备的采购成本。

附图说明

图1本发明胰高血糖素检测试剂盒检测所用标准曲线。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

一种胰高血糖素检测试剂盒，包括：1)包被有胰高血糖素抗体的酶标板；2)辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体；3)酶标抗体稀释液；4)胰高血糖素校准品；5)洗涤液；6)酶底物溶液；

胰高血糖素抗体为能够特异性地识别人胰高血糖素N末端的单克隆抗体，抗体包被浓度为2μg/mL，每孔包被体积为100μl；胰高血糖素检测抗体为能够特异性地识别人胰高血糖素C末端的单克隆抗体；酶标抗体稀释液为PBS-1％BSA，酶底物溶液为TMB，洗涤液为0.01mol/LPBS-0.05％吐温20。胰高血糖素抗体和胰高血糖素检测抗体均购自瑞典Mercodia公司。

所述胰高血糖素检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

1)取胰高血糖素试剂盒，从室温平衡30min后的铝箔袋中取出所需酶标板板数；

2)加样：在酶标板上设空白校准孔(S0)，校准孔(S1-S5)，待测样品孔，分别加校准品、待测样品25μL，注意不要有气泡，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，每孔设置一个复孔；

3)每孔加辣根过氧化物酶(HRP)标记的胰高血糖素检测抗体200μL，转速900rpm下室温孵育1h；

4)温育后，弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板6次，700μL/每孔，甩干；

5)依序每孔加酶底物溶液200μL，室温避光15min，显色；

6)依序每孔加终止溶液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)，终止溶液为0.5mol/L硫酸；

7)用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测；

以校准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出校准曲线(如图1所示，抗原抗体反应标准曲线不是标准的直线，是有波形的，所以我们采用三次多项式来计算)，根据校准曲线回归方程式(三项多项式)计算出样品的OD值对应的浓度。

胰高血糖素检测试剂盒的孵育时间及反应温度的优化

以胰高血糖素检测试剂盒自带校准品及胰高血糖素质控品(高、中、低浓度)为试验对象，按照上述胰高血糖素检测试剂盒的检测方法的具体步骤进行实验，通过对孵育时间及反应温度的改变达到优化。孵化时间设定为1h、2h、3h、18h；反应温度设定为2-8℃、室温。实验结果如下：

1、2-8℃，不同孵化时间

表12-8℃下不同孵育时间的OD值

在上表中，S1～S5为校准品，C1～C3为质控品。

根据不同孵化时间的校准品的OD值绘制校准曲线，并根据校准曲线回归方程式计算质控品的测算值,结果见下表。

表2质控品测算值

由表2结果可知，2-8℃条件下，孵育时间为1h时的质控品的测算值均在靶值范围内，且最接近靶值。

2.室温(25～29℃)，不同孵化时间

表3室温下不同孵化时间的OD值

在上表中，S1～S5为校准品，C1～C3为质控品。

根据不同孵化时间的校准品的OD值绘制校准曲线，并根据校准曲线回归方程式计算质控品的测算值，结果见下表。

表4质控品测算值

由表4结果可知，室温条件下，孵化时间1h、2h及3h时，质控品低值及高值的测算值皆在靶值范围内，其中孵育时间为1h最接近靶值，且中值在靶值范围内。

胰高血糖素检测试剂盒的精密度

在孵化时间1h，反应温度为室温的条件下，3个不同操作对象针对校准品进行试验，通过数据的变异系数考察试剂盒的精密度，实验结果如下：

表5操作者间的变异系数

由实验结果可知，在室温孵育时间1h条件下，变异系数(CV％)小于10％，说明试剂盒的精密度高。

胰高血糖素检测试剂盒的临床应用

一、研究对象

收集T2DM患者血样本12个。采用普通管或促凝管收集血样本，收集血清-20℃冻存，用于血清胰高血糖素的检测。

上述所有血清样本按照胰高血糖素检测试剂盒的使用方法中说明的操作步骤集中进行检验，每个96孔酶标板均设0～129pmol/L标准曲线；与此同时，选择已上市Mercodia胰高血糖素ELISA试剂盒作为比对试剂盒，按照其说明书上规定的操作方法测试。

二、结果

所有临床样本检测结果见表6。分析检测的结果：本试剂盒与已上市同类试剂盒的临床实验数据显示无统计学差异，且各组数据间的变异系数均小于10％。与已上市同类试剂盒比较，本试剂盒孵育时间短(1h)、反应温度要求低(室温)，是一种能够快速、稳定、可靠的对血清中胰高血糖素含量进行测定的试剂盒。

表612例研究对象胰高血糖素检测情况

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种胰高血糖素检测试剂盒，其特征在于：包括：1)包被有胰高血糖素抗体的固相载体；2)辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体；3)酶标抗体稀释液；4)胰高血糖素校准品；5)洗涤液；6)酶底物溶液；

所述胰高血糖素抗体为能够特异性地识别人胰高血糖素N末端的单克隆抗体，所述胰高血糖素检测抗体为能够特异性地识别人胰高血糖素C末端的单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的胰高血糖素检测试剂盒，其特征在于：所述包被有胰高血糖素抗体的固相载体的制备方法为：

1)将胰高血糖素抗体溶于柠檬酸磷酸盐中，制得包被液；

2)将包被液加入固相载体的孔中，于37℃下温浴至包被液完全干燥，冲洗固相抗体；

3)向每孔中加入PBS-1％BSA缓冲液封闭，37℃孵育2h，冲洗后于室温下干燥，即得包被有胰高血糖素抗体的固相载体。

3.如权利要求1所述的胰高血糖素检测试剂盒，其特征在于：所述胰高血糖素抗体在固相载体中的包被浓度为2μg/mL。

4.如权利要求1所述的胰高血糖素检测试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体的浓度为11μg/mL，使用时的稀释倍数为11倍。

5.如权利要求1所述的胰高血糖素检测试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体稀释液为PBS-1％BSA。

6.如权利要求1所述的胰高血糖素检测试剂盒，其特征在于：所述固相载体为酶标板；所述洗涤液为0.01mol/LPBS-0.05％吐温20。

7.如权利要求1所述的胰高血糖素检测试剂盒，其特征在于：所述酶底物溶液为TMB。

8.如权利要求1所述的胰高血糖素检测试剂盒，其特征在于：还包括终止液，终止液为0.5mol/L的硫酸。

9.一种如权利要求1～8中任一权利要求所述的胰高血糖素检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)取胰高血糖素检测试剂盒，将其在室温下平衡后，取出所需包被有胰高血糖素抗体的固相载体；

2)在固相载体上预设校准孔和待测样品孔，分别向校准孔、待测样品孔中加入校准品、待测样品；

3)分别向校准孔和待测样品孔中加辣根过氧化物酶标记的胰高血糖素检测抗体，于转速800～1000rpm、温度25～29℃下孵育0.8～3h，温育后，弃去孔内液体，洗板并干燥；

4)向每孔中加入酶底物溶液，于温度25～29℃下避光10～20min，显色；

5)向每孔中加入终止溶液，8～15min后于450nm波长下检测各孔的OD值，以校准品的浓度为横坐标，校准品对应的OD值为纵坐标，绘出校准曲线，将待测样品的OD值代入校准曲线回归方程式，计算出待测样品对应的胰高血糖素浓度。

10.如权利要求9所述的胰高血糖素检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤3)中，孵育时间为1h。