CN114410590B - 一种分泌胰高血糖素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用 - Google Patents
一种分泌胰高血糖素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种分泌胰高血糖素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用。所述杂交瘤细胞株，包括保藏编号为GDMCC NO：62086的杂交瘤细胞株GLU‑N2‑6、保藏编号为GDMCC NO：61986的杂交瘤细胞株MM02H。本发明通过获得分泌抗胰高血糖素单克隆抗体的杂交瘤细胞株(杂交瘤细胞株GLU‑N2‑6和杂交瘤细胞株MM02H)，获得针对胰高血糖素不同抗原表位的单克隆抗体两种，该单克隆抗体特异性、亲和力、效价均较高，可以通过配对检测血清或血浆中的胰高血糖素含量，应用于检测胰高血糖素含量变化或诊断以胰高血糖素异常表达为表征的疾病的产品中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种分泌抗胰高血糖素单克隆抗体杂交瘤细胞株及检测胰高血糖素的单克隆抗体与应用。
背景技术
胰高血糖素(glucagon)是一种由胰脏胰岛α细胞分泌的激素，由N-末端组氨酸为起点，C末端苏氨酸为终点的29个氨基酸残基组成的一条直链多肽，分子量为3485。
胰高血糖素在临床上具有重要作用，研究已证实胰高血糖素能够促进肝细胞内环磷腺苷(c-AMP)的生物合成，评价肝硬化患者的肝脏储备功能；促进糖原分解和糖异生，升高血糖，治疗低血糖；抑制胃肠蠕动，用于胃肠造影及内镜下胰胆管造影；激活腺苷酸环化酶，增强心肌收缩力，治疗难治性心衰；评价糖尿病患者胰岛细胞生理功能、辅助诊断胰高血糖素瘤等临床意义。
近年来，多个制药公司致力于胰高血糖素类似物的研制，有的在进行临床试验，有的已经完成了临床试验进入市场，表明胰高血糖素在不久的将来必定成为糖尿病、心血管等疾病的常用治疗药物之一。准确地监测胰高血糖素含量变化对于评价胰岛细胞、血糖控制及相关代谢疾病的治疗是必不可少的前提。
但是目前的胰高血糖素类似物很多，且血清或血浆样本中胰高血糖素类似物的浓度远高于胰高血糖素的浓度，因此，亟需一种特异性识别血清或血浆样本中的胰高血糖素的单克隆抗体及分泌抗胰高血糖素单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种分泌抗胰高血糖素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及检测胰高血糖素的单克隆抗体与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种抗胰高血糖素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，包括保藏编号为GDMCC NO：62086的杂交瘤细胞株GLU-N2-6、保藏编号为GDMCC NO：61986的杂交瘤细胞株MM02H。杂交瘤细胞株GLU-N2-6和杂交瘤细胞株MM02H保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间分别为2021年11月29日和2021年10月28日。
第二目的，本发明提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性识别胰高血糖素。
本发明筛选出的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可以特异性识别血清或血浆样本中的胰高血糖素，该单克隆抗体特异性、亲和力均较高，可以通过配对检测血清或血浆中的胰高血糖素含量，具有检测胰高血糖素含量变化或诊断以胰高血糖素异常表达为表征的疾病的产品中的应用。
经过单克隆抗体效价检测的试验，杂交瘤细胞株GLU-N2-6和杂交瘤细胞株MM02H单克隆抗体效价分别为1：512000和1:256000，效价高。
作为本发明所述单克隆抗体的优选实施方式，所述单克隆抗体的抗原表位处于胰高血糖素的N端、C端，处于胰高血糖素的N端的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，处于胰高血糖素的C端的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
采用ELISA法确认单克隆抗体识别抗原表位，杂交瘤细胞株GLU-N2-6可以特异性识别胰高血糖素的N端，杂交瘤细胞株MM02H可以特异性识别胰高血糖素的C端。
经过单克隆抗体配对实验验证知，杂交瘤细胞株GLU-N2-6分泌的单克隆抗体作为捕获抗体与杂交瘤细胞株MM02H分泌的单克隆抗体反应性最好，因此杂交瘤细胞株GLU-N2-6与杂交瘤细胞株MM02H配对效果最佳。
第三目的，本发明提供了一种上述单克隆抗体的制备方法，将所述的杂交瘤细胞株接种至小鼠腹腔，采集腹水后，经纯化获得单克隆抗体。
更优选地，上述杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
1)用胰高血糖素多肽偶联蛋白免疫小鼠，检测小鼠血清效价；
2)检测小鼠血清效价达到1:10000后用胰高血糖素多肽偶联蛋白腹腔加强免疫，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，克隆筛选出单克隆抗体的杂交瘤细胞行扩大再培养和保存。
更优选地，所述小鼠骨髓瘤细胞为SP2/0小鼠骨髓瘤细胞。
更优选地，上述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)向BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，腹腔接种上述杂交瘤细胞株，采集腹水上清备用；
2)将采集的腹水用微孔滤膜过滤溶液，加入硫酸铵，搅拌均匀后，静置，收集沉淀，并用PBS溶液重溶沉淀；将得到的粗纯抗体上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mMPBS，pH7.0)清洗，然后用甘氨酸-盐酸溶液洗脱抗体，得到单克隆抗体。
第四目的，本发明提供了上述单克隆抗体在制备胰高血糖素体外免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
第五目的，本发明提供了一种免疫检测试剂，包括所述的单克隆抗体。
第六目的，本发明提供了一种胰高血糖素检测试剂盒，包括所述的单克隆抗体。
作为本发明所述胰高血糖素检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括标准品、检测抗体和化学发光底物。
第七目的，本发明提供了所述的杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体在检测胰高血糖素中的应用。
第八目的，本发明提供了所述的杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体在检测胰高血糖素含量变化或诊断以胰高血糖素异常表达的试剂中的应用。
第九目的，本发明提供了一种抗原，由抗原表位肽与载体蛋白偶联获得，抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过获得分泌抗胰高血糖素单克隆抗体的杂交瘤细胞株(杂交瘤细胞株GLU-N2-6和杂交瘤细胞株MM02H)，获得针对胰高血糖素不同抗原表位的单克隆抗体两种，该单克隆抗体特异性、亲和力、效价均较高，可以通过配对检测血清或血浆中的胰高血糖素含量，应用于检测胰高血糖素含量变化或诊断以胰高血糖素异常表达为表征的疾病的产品中的应用。
附图说明
图1为杂交瘤细胞株GLU-N2-6、GLU-N2-17、MM02H和MM04H分泌的抗体进行7.5％和13.0％SDS-PAGE的电泳图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、胰高血糖素(Glucagon)单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
1)小鼠免疫：用胰高血糖素多肽偶联蛋白免疫BALB/c小鼠，每只小鼠每次免疫50μg抗原。首次免疫胰高血糖素多肽抗原与弗氏完全佐剂按照质量比为1：1混合，随后胰高血糖素多肽抗原与弗式不完全佐剂按照质量比为1：1混合，每隔两周免疫一次，共免疫3次，第三次免疫十天后断尾采血，检测血清效价。
2)杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:10000后用胰高血糖素多肽偶联蛋白(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合在50mL离心管，然后加入1mL预热PEG作用45s后，立即缓慢滴加37℃预热的无血清DMEM培养基至35mL，42℃水浴15min，1000rpm/min离心10min弃上清，加50mL预热HAT培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μL，置培养箱中培养。采用胰高血糖素多肽鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞4株，分别命名为杂交瘤细胞株GLU-N2-6、GLU-N2-17、MM02H和MM04H。
在本实施例中，杂交瘤细胞株GLU-N2-6的保藏编号为GDMCC NO：62086，杂交瘤细胞株MM02H的保藏编号为GDMCC NO：61986；杂交瘤细胞株GLU-N2-6和杂交瘤细胞株MM02H保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间分别为2021年11月29日和2021年10月28日。
实施例2、胰高血糖素单克隆抗体的制备、纯化及效价检测
1)单抗腹水制备：10-12周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹腔接种上述杂交瘤细胞株(GLU-N2-6、GLU-N2-17、MM02H和MM04H)，1x106/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，收集腹水上清备用。
2)抗体纯化：将收集的腹水用0.45μm的微孔滤膜过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mM PBS溶液重溶沉淀，得粗纯抗体。将粗纯抗体以1mL/min流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mMPBS，pH7.0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M pH 9.0Tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mM PBS溶液透析3次。将透析后的抗体进行7.5％和13.0％SDS-PAGE电泳，结果显示，由杂交瘤细胞株GLU-N2-6、GLU-N2-17、MM02H和MM04H分别分泌的抗体在50kD与25kD处有条带，灰度分析纯度均大于95％，见图1所示。
3)单克隆抗体效价检测：以100μl、1μg/ml的胰高血糖素的碳酸盐缓冲液(pH9.5)4℃过夜包被微孔板。将步骤2)纯化后的抗体浓度调整为1mg/mL，梯度稀释各个抗体(1:4000、1:8000，1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000)，加入羊抗鼠IgG-HRP(1:200000)，确定纯化后单克隆抗体效价(S/N>2.1)，杂交瘤细胞株GLU-N2-6、GLU-N2-17、MM02H和MM04H分泌的单克隆抗体效价分别均为1：512000、1:256000、1:256000、1:256000。
实施例3、单克隆抗体表位鉴定
根据胰高血糖素多肽序列，设计了N、M、C端的序列以及胰高血糖素全长多肽，并合成相应的多肽序列，氨基酸信息如下：
GCG N端片段(1-15)：HSQGTFTSDYSKYLD(如SEQ ID NO:1所示)；
GCG M端片段(10-21)：YSKYLDSRRAQD(如SEQ ID NO:2所示)；
GCG C端片段(18-29)：RAQDFVQWLMNT(如SEQ ID NO:3所示)；
GCG全片段(1-29)：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(如SEQ ID NO:4所示)。
ELISA法确认单克隆抗体识别表位：分别以碳酸盐缓冲液100μl体积包被1μg/ml的GCG N端(1-15)、GCG M端(10-21)、GCG C端(18-29)和GCG全片段(1-29)4℃过夜，将4株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体分别倍比稀释(400ng/mL、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml和0ng/ml)后加入到微孔反应板，然后加入羊抗鼠IgG-HRP(1:20000)，结果如表1所示。
表1单克隆抗体识别抗原表位分析
结果确定杂交瘤细胞株GLU-N2-6分泌的单克隆抗体可以特异性识别GCG N端(1-15)，杂交瘤细胞株MM02H分泌的单克隆抗体可以特异性识别GCG C端(18-29)，杂交瘤细胞株GLU-N2-17分泌的单克隆抗体与GCG N端(1-15)和GCG M端(10-21)均可反应，不与GCG C端(18-29)反应，杂交瘤细胞株MM04H分泌的单克隆抗体与GCG M端(10-21)和GCG C端(18-29)均可反应，因此杂交瘤细胞株GLU-N2-6分泌的单克隆抗体特异性针对GCG N端(1-15)，杂交瘤细胞株MM02H分泌的单克隆抗体特异识别GCG C端(18-29)。
实施例4、抗体配对验证及交叉反应考察
1)单克隆抗体配对验证：根据单克隆抗体识别抗原表位结果可知，杂交瘤细胞株GLU-N2-6和GLU-N2-17分泌的单克隆抗体均不与GCG C端(18-29)结合，杂交瘤细胞株MM02H和MM04H均不与GCG N端(1-15)结合，可考虑将杂交瘤细胞株GLU-N2-6和GLU-N2-17分泌的单克隆抗体分别与杂交瘤细胞株MM02H和MM04H分泌的单克隆抗体进行配对验证。
2)ELISA法配对验证：将1μg/ml获得的4种单克隆抗体分别包被微孔板，加入25μl不同浓度(0-130pmol/L)的胰高血糖素校准品，分别加入200μl浓度为200ng/ml的HRP标记抗体(GLU-N2-6和GLU-N2-17包被板分别加入MM02H和MM04H标记抗体，MM02H和MM04H包被板分别加入GLU-N2-6和GLU-N2-17标记抗体)，37℃孵育60min，洗涤后加入底物200μl，室温避光反应15min，加入终止液后采用酶标仪测定其吸光度。结果如表2所示，可见，杂交瘤细胞株GLU-N2-6分泌的单克隆抗体作为捕获抗体与杂交瘤细胞株MM02H和MM04H分泌的单克隆抗体反应性均较好，杂交瘤细胞株MM02H分泌的单克隆抗体作为捕获抗体时与杂交瘤细胞株GLU-N2-6分泌的单克隆抗体反应性最好，因此杂交瘤细胞株GLU-N2-6分泌的单克隆抗体与杂交瘤细胞株MM02H分泌的单克隆抗体配对效果最佳。
表2：单克隆抗体配对结果
3)化学发光法配对验证：将吖啶衍生物(Acridan)和辣根过氧化物酶(HRP)均对杂交瘤细胞株GLU-N2-6、MM02H及MM04H分泌的单克隆抗体进行标记，形成3株Acridan标记抗体和3株HRP标记抗体，取20μl不同浓度胰高血糖素校准品及交叉反应物质(肠高血糖素300pmol/L、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)500pmol/L)、60μl 2μg/mL Acridan标记抗体、60μl200ng/mL HRP标记抗体，37℃孵育30min，加入含过氧化氢的发光底物同时检测1-3秒内的发光信号下峰面积(AUC)。检测结果如表3所示，Acridan标记GLU-N2-6抗体与HRP标记MM02H抗体配对效果最佳，交叉反应物肠高血糖素和GLP-1在检测的浓度下交叉反应率低于0.5％，交叉反应造成的干扰不会影响检测结果。
表3：单克隆抗体配对及交叉反应
实施例5、胰高血糖素测定试剂盒
本实施例提供一种胰高血糖素测定试剂盒，试剂盒包含两个试剂组分，分别为Acridan标记杂交瘤细胞株GLU-N2-6分泌的单克隆抗体(Acridan标记抗体)，HRP标记杂交瘤细胞株MM02H分泌的单克隆抗体(HRP标记抗体)，校准品为冻干粉，浓度为0-130pmol/L，Acridan标记抗体、待测胰高血糖素以及HRP标记抗体形成双抗体夹心免疫复合物，加入底物后，免疫复合物中HRP催化底物中的过氧化物产生羟自由基，自由基传递到夹心复合物上的Acirdan，Acridan经加成反应和氧化反应后产生光信号，通过光信号与待测物浓度呈正相关。该试剂盒可以检测胰高血糖素含量变化或诊断以胰高血糖素异常表达的情况。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市进德生物科技有限公司
<120> 一种分泌胰高血糖素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用
<130> 2022-01-21
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工合成
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20 25
Claims (8)
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为保藏编号为GDMCC NO：62086的杂交瘤细胞株GLU-N2-6或保藏编号为GDMCC NO：61986的杂交瘤细胞株MM02H。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由如权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生，所述单克隆抗体特异性识别胰高血糖素。
3.一种如权利要求2所述的单克隆抗体的制备方法，将如权利要求1所述的杂交瘤细胞株接种至小鼠腹腔，采集腹水后，经纯化获得单克隆抗体。
4.如权利要求2所述的单克隆抗体在制备胰高血糖素体外免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
5.一种免疫检测试剂，其特征在于，包括如权利要求2所述的单克隆抗体。
6.一种胰高血糖素检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2所述的单克隆抗体。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品、检测抗体和化学发光底物。
8.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株或如权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测胰高血糖素含量变化或诊断胰高血糖素异常表达的试剂中的应用。
Priority Applications (1)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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