CN107001461A - 抗胰高血糖素抗体及其使用方法 - Google Patents

抗胰高血糖素抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了与胰高血糖素结合的抗体及其使用方法。根据某些实施方式，本发明的抗体以较高的亲和性与人GCG结合。本发明的抗体可以是全人源抗体。本发明的抗体用于治疗以高血糖水平为特征的各种疾病或病症，以及其他GCG相关病症。

Description

抗胰高血糖素抗体及其使用方法
发明领域
本发明涉及与胰高血糖素特异性结合的抗体及其抗原结合片段，包含这些抗体的组合物及其使用方法，例如用于治疗对调节胰高血糖素的水平产生应答的病症，如糖尿病和其他胰高血糖素相关的代谢病症等。
背景技术
胰高血糖素是一种29个残基的多肽激素，其与胰岛素协作，介导血液中葡萄糖量的稳态调节。胰高血糖素的主要作用是当血糖水平下降时通过刺激某些细胞(例如肝细胞)释放葡萄糖。胰高血糖素的作用与胰岛素的作用相反，胰岛素在血糖水平升高时刺激细胞摄取和储存葡萄糖。胰高血糖素在胰腺的α细胞中产生，而胰岛素从相邻的β细胞分泌。
胰高血糖素和胰岛素的失衡可能在诸如糖尿病和糖尿病性酮症酸中毒等几种疾病中起重要作用。特别是，研究表明，较高的基础胰高血糖素水平和缺乏餐后胰高血糖素分泌的抑制促进人体内的糖尿病状况(Muller等，N Eng J Med 283:109-115(1970))。
据信胰高血糖素对血糖水平升高的作用部分由在胰高血糖素(GCG)与其受体(称为GCGR)结合后某些细胞通路的活化所介导。GCGR是G蛋白偶联受体的分泌素亚家族(家族B)成员并且主要在肝脏中表达。胰高血糖素与其受体的结合触发G蛋白信号转导级联，活化细胞内环AMP并通过从头合成(糖异生)和糖原分解(糖原分解)导致葡萄糖输出增加(Wakelam等，Nature,(1986)323:68-71；Unson等，Peptides,(1989),10:1171-1177；以及Pittner和Fain,Biochem.J.(1991),277:371-378)。
胰高血糖素的作用可以通过提供拮抗剂来抑制，如胰高血糖素抗体，如本文所述的那些。可以证明此类抗体在糖尿病或其他状况(如应激性高血糖)中降低的血糖水平是有用的。而且，通过降低血糖水平，也许能预防或改善某些与糖尿病患者的葡萄糖水平升高相关的长期并发症。
例如在美国专利号4,206,199；4,221,777；4,423,034；4,272,433；4,407,965；5,712,105；WO2007/124463和WO2013/081993中提到了抗胰高血糖素抗体。尽管如此，在本领域中对新型胰高血糖素拮抗剂(如本申请所述的抗胰高血糖素抗体)存在需求，用于在患有糖尿病或与胰高血糖素水平升高相关的其他病症的患者中降低血糖水平。
发明内容
本发明提供了与胰高血糖素(GCG)特异性结合并中和其活性的抗体及其抗原结合片段。
在第一个方面，本发明提供了与胰高血糖素结合并抑制或阻断其活性(例如阻止胰高血糖素与其受体结合)的分离的单克隆抗体(mAb)及其抗原结合片段，从而阻止血糖水平升高。该抗体或其抗原结合片段可以用于降低患有部分以血糖水平增加为特征的疾病或状况(如糖尿病或应激性高血糖)的对象的血糖水平。该抗体还可以用于治疗大量状况和病症，其需要阻止胰高血糖素与胰高血糖素受体的相互作用，从而具有有益效果。该抗体最终可以用于预防糖尿病患者中的血糖水平升高相关的长期并发症，或改善与糖尿病患者中的血糖水平升高相关的至少一种症状。
在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合至并且中和GCG活性，其中所述抗体或其片段显示出一个或多个下述特征：
(a)是全人源单克隆抗体；
(b)根据表面等离子体共振测定在25℃时以小于约1nM的KD和在37℃时以小于约5nM的KD与人GCG结合；
(c)当作为单一剂量，或作为小于约40mg/kg的多剂量向哺乳动物施用时，血糖水平降低至少约10％；
(d)以小于约1nM的IC50抑制GCG介导的表达人胰高血糖素受体(GCGR)的细胞的活化；
(e)包含重链可变区(HCVR)，所述重链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：2、18、34、50、66、82、98、114、130和146；或者
(f)包含轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：10、26、42、58、74、90、106、122、138和154。
在一个实施方式中，根据表面等离子体共振测定所述抗体或其抗原结合片段在25℃时以范围从约50pM至约750pM的KD和在37℃时以范围从约300pM至约5nM的KD与人GCG结合。
在一个实施方式中，当作为单一剂量，或作为范围从约3mg/kg至约30mg/kg的多剂量向哺乳动物施用时，所述抗体或其抗原结合片段使血糖水平降低约10％至约35％。
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以范围从约7pM至约950pM的IC50抑制GCG介导的表达人胰高血糖素受体(GCGR)的细胞的活化。
在一个实施方式中，当每1、2、3、4或5天以约30mg/kg的剂量施用时，所述抗体或其抗原结合片段降低哺乳动物的血糖水平。
在一个实施方式中，当每5天以约30mg/kg的剂量施用时，所述抗体或其抗原结合片段降低哺乳动物的血糖水平。
在一个实施方式中，当皮下、静脉内或肌内施用时，所述抗体或其抗原结合片段降低哺乳动物的血糖水平。
本发明的抗体可以是全长的(例如IgG1或IgG4抗体)或者可以仅包含抗原结合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，以及可以对其进行修饰以影响功能，例如以消除残余的效应物功能(Reddy等，2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
本发明的示例性抗胰高血糖素(抗-GCG)抗体列于本文的表1和表2中。表1列出了示例性抗-GCG抗体的重链可变区(HCVR)、轻链可变区(LCVR)、重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识。表2列出了示例性抗-GCG抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列标识。
本发明提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR或基本上与其相似的序列，所述HCVR含有选自表1中所列的任意HCVR氨基酸序列的氨基酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含LCVR或基本上与其相似的序列，所述LCVR含有选自表1中所列的任意LCVR氨基酸序列的氨基酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，所述氨基酸序列对含有与表1中所列的任意LCVR氨基酸序列配对的表1中所列的任意HCVR氨基酸序列。根据某些实施方式，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段含有包含在表1中所列的任意示例性抗-GCG抗体中的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至GCG并且中和与GCG相关的至少一种活性，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链互补性决定区包含在选自下组的重链可变区(HCVR)氨基酸序列中：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130和146；以及(b)三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述轻链CDR包含在选自下组的轻链可变区(LCVR)氨基酸序列中：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138和154。
在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至GCG并且中和与GCG相关的至少一种活性，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：2、18、34、50、66、82、98、114、130和146；以及所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138和154。
在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至GCG并且中和与GCG相关的至少一种活性，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：2/10；18/26；34/42；50/58；66/74；82/90；98/106；114/122；130/138和146/154。
在某些实施方式中，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对包含SEQ ID NO：18/26。
在某些实施方式中，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对包含SEQ ID NO：34/42。
在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至GCG并且中和与GCG相关的至少一种活性，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132和148；
(b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134和150；
(c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136和152；
(d)LCDR1结构域，所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140和156；
(e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142和158；以及
(f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144和160。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，所述抗体特异性地结合至GCG并且中和与GCG相关的至少一种活性，其中所述抗体包含：
(a)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；
(b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；
(c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；
(d)LCDR1结构域，所述LCDR1结构域包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列；
(e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；以及
(f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，所述抗体特异性地结合至GCG并且中和与GCG相关的至少一种活性，其中所述抗体包含：
(a)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列；
(b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；
(c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列；
(d)LCDR1结构域，所述LCDR1结构域包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；
(e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；以及
(f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列。
本发明还提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1(HCDR1)或基本上与其相似的序列，所述HCDR1含有选自表1中所列的任意HCDR1氨基酸序列的氨基酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2(HCDR2)或基本上与其相似的序列，所述HCDR2含有选自表1中所列的任意HCDR2氨基酸序列的氨基酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3(HCDR3)或基本上与其相似的序列，所述HCDR3含有选自表1中所列的任意HCDR3氨基酸序列的氨基酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1(LCDR1)或基本上与其相似的序列，所述LCDR1含有选自表1中所列的任意LCDR1氨基酸序列的氨基酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2(LCDR2)或基本上与其相似的序列，所述LCDR2含有选自表1中所列的任意LCDR2氨基酸序列的氨基酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3(LCDR3)或基本上与其相似的序列，所述LCDR3含有选自表1中所列的任意LCDR3氨基酸序列的氨基酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，所述氨基酸序列对包含与表1中所列的任意LCDR3氨基酸序列配对的表1中所列的任意HCDR3氨基酸序列。根据某些实施方式，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段含有包含在表1中所列的任意示例性抗-GCG抗体中的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施方式中，所述HCDR3/LCDR3氨基酸序列对包含SEQ ID NO：24/32。
本发明还提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段含有包含在表1中所列的任意示例性抗-GCG抗体中的一组6个CDR(即
HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些实施方式中，所述
HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组包含SEQ ID NO：20-22-24-28-30-32。在某些实施方式中，所述
HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组包含SEQ ID NO：36-38-40-44-46-48。
在相关的实施方式中，本发明提供了与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段含有包含在表1中列出的任意示例性抗-GCG抗体所定义的
HCVR/LCVR氨基酸序列对中的一组6个CDR(即
HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。例如，本发明包括与GCG特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段含有包含在选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对中的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组：18/26；34/42；50/58；66/74；82/90；98/106；114/122；130/138和146/154。用于标识HCVR和LCVR氨基酸序列中的CDR的方法和技术是本领域公知的，并且其能够用于标识本申请中公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列中的CDR。能够用于标识CDR边界的示例性的常规方法包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义基于序列的变异性，Chothia定义基于结构环区域的位置，而Abm定义是介于Kabat和Chothia方法之间的折中方法。参见例如Kabat,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)和Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。也可以利用公共数据库来鉴定抗体中的CDR序列。
在一个实施方式中，本发明提供了中和GCG活性的全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段显示出一个或多个下述特征：(i)包含HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130和146；(ii)包含LCVR，所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138和154；(iii)包含HCDR3结构域或基本上与其相似的序列，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136和152，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性；以及LCDR3结构域或基本上与其相似的序列，所述LCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：16、32、48、64、80、96、112、128、144和160，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性；(iv)包含HCDR1结构域或基本上与其相似的序列，所述HCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132和148，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性；HCDR2结构域或基本上与其相似的序列，所述HCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134和150，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性；LCDR1结构域或基本上与其相似的序列，所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140和156，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性；以及LCDR2结构域或基本上与其相似的序列，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142和158，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性；(v)根据表面等离子体共振测定显示出在25℃时小于约1nM的KD和在37℃时小于约5nM的KD；(vi)当作为单一剂量，或作为小于约40mg/kg的多剂量向哺乳动物施用时，血糖水平降低至少约10％；(vi)以小于约1nM的IC50抑制表达人胰高血糖素受体的细胞的GCG活化。
在第二个方面，本发明还提供了编码抗-GCG抗体或其部分的核酸分子。例如，本发明提供了编码表1中列出的任意HCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列或基本上与其相似的序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCVR核酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了编码表1中列出的任意LCVR氨基酸序列的核酸分子。在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列或基本上与其相似的序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCVR核酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了编码表1中列出的任意HCDR1氨基酸序列的核酸分子。在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列或基本上与其相似的序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCDR1核酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了编码表1中列出的任意HCDR2氨基酸序列的核酸分子。在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列或基本上与其相似的序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCDR2核酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了编码表1中列出的任意HCDR3氨基酸序列的核酸分子。在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列或基本上与其相似的序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCDR3核酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了编码表1中列出的任意LCDR1氨基酸序列的核酸分子。在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列或基本上与其相似的序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCDR1核酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了编码表1中列出的任意LCDR2氨基酸序列的核酸分子。在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列或基本上与其相似的序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCDR2核酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了编码表1中列出的任意LCDR3氨基酸序列的核酸分子。在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列或基本上与其相似的序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCDR3核酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。
本发明还提供了编码HCVR的核酸分子，所述HCVR包含一组3个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中所述HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组由表1中列出的任意示例性抗-GCG抗体所定义。
本发明还提供了编码LCVR的核酸分子，所述LCVR包含一组3个CDR(即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中所述LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组由表1中列出的任意示例性抗-GCG抗体所定义。
本发明还提供了编码HCVR和LCVR两者的核酸分子，其中所述HCVR包含表1中列出的任意HCVR氨基酸序列的氨基酸序列，以及其中所述LCVR包含表1中列出的任意LCVR氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列或基本上与其相似的序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCVR核酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性，以及所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCVR核酸序列，所述基本上与其相似的序列与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。在根据本发明这一方面的某些实施方式中，所述核酸分子编码HCVR和LCVR，其中所述HCVR和LCVR两者均来源于表1中列出的相同抗-GCG抗体。
本发明还提供了重组表达载体，所述重组表达载体能够表达包含抗-GCG抗体的重链或轻链可变区的多肽。例如，本发明包括重组表达载体，所述重组表达载体包含上文所述的任意核酸分子，即编码如表1中所示的任意HCVR、LCVR和/或CDR序列的核酸分子。引入了此类载体的宿主细胞，以及通过在允许所述抗体或抗体片段生产的条件下培养所述宿主细胞以生产所述抗体或其部分并且回收所生产的抗体和抗体片段的方法也包括在本发明的范围内。
本发明包括具有经修饰的糖基化模式的抗-GCG抗体。在一些实施方式中，通过修饰除去不需要的糖基化位点可能是有用的，或者例如抗体在寡糖链上缺乏岩藻糖部分以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等，(2002)JBC 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化修饰以改善补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在第三个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含与GCG特异性结合的重组人源化抗体或其片段和药学上可接受的运载体。在相关的方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物是抗-GCG抗体与第二治疗剂的组合。在一个实施方式中，所述第二治疗剂是与抗-GCG抗体组合有利的任意药剂。
在一个实施方式中，所述第二治疗剂可以是能够在患有特征为高血糖水平的疾病或状况(如糖尿病)的患者中降低血糖或减轻至少一种症状的任意药剂。
在某些实施方式中，所述第二治疗剂可以是有助于抵消或减轻与本发明的抗体或抗体的抗原结合片段相关的任何可能的副作用的药剂，如果发生这种副作用的话。例如，在任意抗-GCG抗体增加脂质或胆固醇水平的情况下，施用有效降低脂质或胆固醇水平的第二药剂可能是有益的。
所述第二治疗剂可以是小分子药物、蛋白/多肽、抗体、核酸分子，如反义分子或siRNA。所述第二治疗剂可以是合成的或天然来源的。
在一个实施方式中，所述第二治疗剂可以是胰高血糖素受体拮抗剂或第二胰高血糖素拮抗剂，如另一种胰高血糖素的抗体，如本申请所述的那些，或不同于本申请所述抗体的抗体。还应理解的是，可以在联合疗法中使用本发明的抗体和药学上可接受的组合物，也就是说所述抗体和药学上可接受的组合物可以与一种或多种其他所需的治疗剂或医疗程序同时、在其之前、或在其之后施用。在联用方案中使用的特定疗法(治疗剂或程序)的组合将会考虑所需治疗剂和/或程序的相容性以及所希望获得的治疗效果。还应意识到，所使用的疗法针对相同病症可以达到希望的效果(例如，可以将抗体与用于治疗相同病症的另一种药剂同时施用)，或者其可以达到不同的效果(例如，控制任意不良反应)。如在本申请中所使用的，通常给予以治疗或预防特定疾病或状况的其他治疗剂适用于治疗的所述疾病或状况。
在一个实施方式中，本发明的抗-GCG抗体可以与一种或多种下述目前可用的糖尿病治疗联用。这些包括双胍类(二甲双胍)、磺酰脲类(如格列本脲、格列吡嗪)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ激动剂(例如吡格列酮、罗格列酮)、α葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖、伏格列波糖)。其他治疗包括注射治疗，如胰高血糖素样肽1(GLP-1)激动剂或类似物(例如、(艾塞那肽)、(利拉鲁肽)、TANZEUMTM(阿必鲁肽)、TRULICITYTM(杜拉格肽)或(利西拉来))或者使用胰岛淀粉样多肽的类似物，如(普兰林肽)。
在某些实施方式中，所述治疗剂可以包括选自下组的第二药剂：非磺酰脲类促分泌剂、胰岛素、胰岛素类似物，包括速效(例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素)和长效(例如地特胰岛素、德谷胰岛素或甘精胰岛素)、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)多肽、β3肾上腺素受体激动剂、PPAR激动剂，二肽基肽酶IV(DPP-4)抑制剂(例如沙格列汀 西格列汀和维格列汀)、钠-葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)抑制剂(例如INVOKANATM(卡格列净)、(达格列净)、恩格列净、伊格列净、托格列净)、他汀类和含他汀类的组合、胆固醇摄取和/或胆汁酸再吸收抑制剂、LDL-胆固醇拮抗剂、胆固醇酯转运蛋白拮抗剂、内皮素受体拮抗剂、生长激素拮抗剂、胰岛素增敏剂、胰岛淀粉样多肽模拟物或激动剂、大麻素受体拮抗剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、黑皮质素、黑色素浓缩激素受体激动剂、SNRI、成纤维细胞生长因子21(FGF21)模拟物(参见例如US20110002845和US20080261236)、成纤维细胞生长因子受体1c(FGFR1c)激动剂(参见例如US20110150901)、高级糖基化终产物形成抑制剂，例如但不限于氨基胍以及蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂。
在某些实施方式中，所述组合物可以包括第二药剂以辅助降低脂质或胆固醇水平以及可以包括药剂如3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，例如他汀类如阿伐他汀氟伐他汀洛伐他汀匹伐他汀 普伐他汀瑞舒伐他汀和辛伐他汀等。或者，本发明的抗体可以与药剂如联用，是他汀类和另一种药剂的制剂(如依替米贝/辛伐他汀)。
在某些实施方式中，将本发明的抗体与下述中的任意一种或多种联合施用可能是有益的：(1)烟酸，其增加脂蛋白的分解代谢；(2)贝特类或两性羧酸，其降低低密度脂蛋白(LDL)水平、改善高密度脂蛋白(HDL)和甘油三酯(TG)水平以及减少非致命性心脏病发作次数；以及(3)在胆固醇消除中起作用的LXR转录因子激活剂如22-羟基胆固醇，或固定组合如(依替米贝加辛伐他汀)；他汀类与胆汁树脂(例如消胆胺、考来替泊、考来维仑)；烟酸与他汀类的固定组合(例如烟酸与洛伐他汀)；或者与其他脂质降低剂如ω-3-脂肪酸乙酯(例如omacor)。而且，所述第二治疗剂可以是一种或多种胰高血糖素或胰高血糖素受体的其他抑制剂，以及其他分子的抑制剂，如血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)、血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)、血管生成素样蛋白5(ANGPTL5)、血管生成素样蛋白6(ANGPTL6)、血管生成素样蛋白8(ANGPTL8)，其参与脂质代谢，特别是胆固醇和/或甘油三酯的体内平衡。这些分子的抑制剂包括小分子和与这些分子特异性结合并阻断其活性的抗体。
在某些实施方式中，将本发明的抗-GCG抗体与抑制hPCSK9活性的核酸(如反义分子、双链RNA或siRNA分子)联合施用可能是有益的。在US2011/0065644、US2011/0039914、US2008/0015162(现为US9045754)和US2007/0173473中描述了抑制PCSK9活性的示例性核酸分子。
在某些实施方式中，将本发明的抗-GCG抗体与同hPCSK9特异性结合并抑制其活性的抗体联合施用可能是有益的，其中此类抗体用于降低脂质或胆固醇水平。在US2010/0166768(现为US8062640)中描述了示例性的抗-hPCSK9抗体。可以以范围从约0.01mg/kg至约30mg/kg的剂量施用特异性结合至人PCSK9的分离的抗体或其抗原结合片段。可以以单一剂量或以多剂量施用。抗hPCSK9抗体可以与抗-GCG抗体同时施用，或者其可以在抗-GCG抗体之前或之后施用。
在第四个方面，本发明涉及一种人类抗-hGCGR抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR由来源于VH、DH和JH种系序列的核苷酸序列区段编码，所述LCVR由来源于VK和JK种系序列的核苷酸序列区段编码，其组合如表3中所示。
在第五个方面，本发明涉及一种使用本发明的抗-GCG抗体或抗体的抗原结合部分抑制GCG活性的方法，其中所述治疗方法包括施用治疗有效量的包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明的抗体可以用于治疗通过除去、抑制或降低GCG活性而改善、减轻、抑制或预防的任何状况或病症。
在一个实施方式中，所述抗体可以用于预防其特征部分为血糖水平升高的疾病或病症发作，或者用于防止发展成此类疾病或病症的可能性，或者用于减轻所述疾病或病症的严重程度或与所述疾病或病症相关的至少一种症状。可以设想，本发明的抗体可以单独使用，或者作为公知的用于治疗患有其特征部分为血糖或酮水平升高的疾病或状况(例如但不限于糖尿病)的患者标准护理的其他药剂或方法的辅助疗法。此类标准疗法可以包括流体的施用，或者用于降低血糖、酮或脂质或者用于减轻体重的任意其他药剂的施用。
本发明的抗-GCG抗体可以用于阻断胰高血糖素与其受体之间的相互作用，从而抑制胰高血糖素升高葡萄糖的作用。使用胰高血糖素拮抗剂(如本申请所述的抗体)可能是获得正常水平的葡萄糖，从而改善或预防与例如糖尿病相关的一种或多种症状或者长期并发症的有效手段。使用胰高血糖素拮抗剂(如本申请所述的抗体)还可能是在非糖尿病患者中获得正常水平的葡萄糖的有效手段，所述患者由于与糖尿病无关的状况或病症而导致高血糖症，如围手术期高血糖症(在临手术前或手术后的患者中观察到的高血糖症)。在某些实施方式中，预期使用本发明的抗体是在糖尿病性酮症酸中毒中降低血糖水平或酮水平的方法。在某些实施方式中，还预期使用本发明的抗体是对患者进行治疗以实现减轻体重或者预防体重增加或保持正常体重的方法。
本发明的抗体可以用于改善状况(如葡萄糖耐量受损、肥胖)，或用于预防体重增加，或用于治疗糖尿病状况，或用于预防或减轻与糖尿病相关的任意一种或多种长期并发症(如肾病、神经病、视网膜病变、白内障、中风、动脉粥样硬化、伤口愈合受损或本领域技术人员公知的与糖尿病相关的其他并发症)的严重程度。
在一个实施方式中，本发明的抗体可以用于治疗应激性高血糖，或者用于预防患者应激性高血糖发病的可能性(也称为“应激诱导的高血糖”)，所述方法包括向患者施用治疗有效量的包含本发明胰高血糖素抗体的组合物，其中所述患者表现出由一种或多种应激诱导的刺激或一种或多种葡萄糖升高的刺激引起的或加剧的血糖水平升高。在一个实施方式中，根据具有高于约140mg/dL的血糖水平对患者进行鉴定。
在一个实施方式中，所述应激诱导的刺激或葡萄糖升高的刺激选自下组：已经存在的1型或2型糖尿病；高渗性脱水；儿茶酚胺加压剂的输注；糖皮质激素疗法；肥胖；老龄化；施用过量右旋糖；肠外营养、肠内营养、胰腺炎；败血症；中风；创伤性头部损伤；低体温症；低血氧症；尿毒症；肝硬化；麻醉；术前或术后住院(围手术期高血糖症)；进入急诊室、创伤中心或重症监护室；延长住院时间；外科手术；感染；或慢性病。
可以通过本发明的治疗方法治疗的其他状况或病症包括：糖尿病性酮症酸中毒、围手术期高血糖症、重症监护室患者的高血糖症、高渗性高血糖综合征、烧伤患者的高血糖症、患有心脏病的患者的高血糖症、高胰岛素血症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合征、空腹血糖受损或者与高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高脂血症和总血脂异常相关的高血糖症。
根据本发明这一方面的治疗方法包括向需要其的对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体或抗体的抗原结合片段。所治疗的病症是通过靶向GCG改善、减轻、抑制或预防的任意疾病或状况。
所述抗体可以用于治疗患有无法手术的胰高血糖素瘤(具有或不具有坏死性迁移性红斑和高血糖症的胰脏内分泌肿瘤)的患者。
本发明的抗体可以用作急性期的短期疗法，或其可以预期作为慢性疗法长期使用。
通过对下文中详细的描述的回顾，其他实施方式将是显而易见的。
发明详述
在对本发明进行描述前，应理解本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解本申请中所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求限制。
除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。如在本申请中所使用的，术语“约”当用于指特定列举的数值时，意味着该值可以从所列举的值变化不超过1％。例如，如在本申请中所使用的，表达“约100”包括99和101以及其间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管与本申请中所描述的那些类似或等效的任意方法和材料均能够用于实施或测试本发明，但是现在描述的是优选的方法和材料。在本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用整体并入本申请。
定义
“胰高血糖素”或“GCG”等，如在本申请中所使用的，指人胰高血糖素(除非特别说明是来自另一物种的胰高血糖素)，其包含如SEQ ID NO:161所示的氨基酸序列。亦参见登记号NP_002045.1的氨基酸残基53-81。
除非明确地指出是来自非人物种，否则本申请中所有提及的蛋白、多肽和蛋白片段旨在指各蛋白、多肽或蛋白片段的人源版本。因此，除非指出是来自非人物种，例如“小鼠GCG”、“猴GCG”等，否则表达“GCG”指人GCG。
术语“人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9”或“hPCSK9”，如在本申请中所使用的，指由SEQ ID NO:162中所示的核酸序列编码的hPCSK9并且具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列或其生物活性的片段。
在特定的实施方式中，本发明的抗体或抗体的片段可以与治疗部分缀合(“免疫缀合物”)，如第二GCG拮抗剂，或者双胍类(二甲双胍)、磺酰脲类(如格列本脲或格列吡嗪)、PPARγ激动剂(例如吡格列酮或罗格列酮)、α葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖或伏格列波糖)、(胰高血糖素样肽1)、(普兰林肽)或用于由于不需要的胰高血糖素活性导致的疾病或状况的任意其他治疗部分。
如在本申请中所使用的，表述“抗-GCG抗体”包括具有单特异性的单价抗体，以及双特异性抗体，所述双特异性抗体包含结合GCG的第一臂和结合第二(靶)抗原的第二臂，其中所述抗-GCG臂包含本申请的表1中所示的任意HCVR/LCVR或CDR序列。
在本申请中使用的术语“抗体”指包含特异性结合至或与特定抗原(例如GCG)相互作用的至少一个互补性决定区(CDR)的任意抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子含有四条多肽链，互相之间通过二硫键连接的两条重链(H)和两条轻链(L)，以及其多聚体(例如IgM)。各条重链包含重链可变区(本申请中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。各条轻链包含轻链可变区(本申请中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。可以将VH和VL区进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其散布在更为保守的称为框架区(FR)的区域中。各个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明不同的实施方式中，抗-GCG抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人源种系序列是相同的，或者可以是天然的或人工修饰的。可以基于对两个或多个CDR的并行分析(side-by-side analysis)定义氨基酸的共有序列。
在本申请中使用的术语“抗体”还包括全抗体分子的抗原结合片段。在本申请中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合部分”等包括任意天然存在的、酶促可获得的、合成的或基因工程改造的多肽或糖蛋白，所述多肽或糖蛋白特异性地与抗原结合以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以来源于例如全抗体分子，其使用任意适宜的标准技术如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变和任选地恒定结构域的DNA的操纵和表达的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得的，或者能够被合成的。可以化学地或使用分子生物学技术对DNA进行测序和调控，例如将一个或多个可变和/或恒定结构域排布成适宜的构型，或者引入密码子、形成半胱氨酸残基、修饰、加入或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体高变区(例如分离的互补决定区(CDR)如CDR3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单元或受限制的FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双体、三体、四体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也包括在如本申请所使用的表述“抗原结合片段”中。
抗体的抗原结合片段将通常包括至少一个可变结构域。可变结构域可以是任意尺寸或氨基酸组成并且将通常包括至少一个CDR，其邻近或在一个或多个框架序列的框架中。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原结合片段中，所述VH和VL结构域可以位于相对于彼此适宜的任意排布下。例如，所述可变区可以是二聚的并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，所述抗体的抗原结合片段可以含有单体的VH或VL结构域。
在某些实施方式中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以见于本发明抗体的抗原结合片段中的非限制性的、示例性的可变和恒定结构域构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在包括上文所述的任意示例性构型的可变和恒定结构域的任意构型中，所述可变和恒定结构域可以直接彼此间连接或者通过全长或部分铰链或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，其在单一多肽分子中相邻的可变和/或恒定结构域之间形成柔性或半柔性的连接。而且，本发明抗体的抗原结合片段可以包括上述列出的任意可变和恒定结构域构型在彼此之间非共价结合和/或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价结合(例如通过二硫键)的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。
与全抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包括至少两个不同的可变结构域，其中各可变结构域能够特异性与单独的抗原或同一抗原上不同的表位结合。使用本领域常规技术可以获得的任意多特异性抗体形式(包括本申请公开的示例性双特异性抗体形式)可以适用于本发明抗体的抗原结合片段的语境中。
在本申请中使用的术语“人源抗体”旨在包括非天然存在的人源抗体。该术语包括在非人哺乳动物或在非人哺乳动物的细胞中重组生产的抗体。该术语并非旨在包括从人源对象中分离或产生的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗体可以是重组的人源抗体。在本申请中使用的术语“重组人源抗体”旨在包括利用重组方法制备、表达、形成或分离的所有人源抗体，如使用转染进入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(在下文中进一步描述)，从重组的、组合人源抗体库分离的抗体(在下文中进一步描述)，从针对人源免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或者由涉及将人源免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任意其他方法制备、表达、形成或分离的抗体。在某些实施方式中，对此类重组的人源抗体进行体外诱变(或者当使用针对人Ig序列的转基因动物时进行体内体细胞诱变)，这样重组抗体VH和VL区的氨基酸序列尽管是与人源种系VH和VL序列相关的序列，但是其可能不是体内人源抗体种系库中天然存在的。
人源抗体可以以两种形式存在，这与铰链的异质性有关。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定的四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接并且形成由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成的约75-80kDa的分子。即使在进行亲和纯化后，这些形式也非常难以分离。
第二种形式在不同完整IgG同种型中的出现频率与同抗体的铰链区同种型相关的结构差异有关，但不仅限于此。在人IgG4铰链的铰链区中的单一氨基酸取代能够将第二种形式(Angal等，(1993)Molecular Immunology 30:105)的出现显著降至使用人IgG1铰链通常观察到的水平。本发明包含在铰链、CH2或CH3区具有一个或多个突变的抗体，其在例如生产中可能是所需要的以提高所需抗体形式的收率。
术语“特异性结合”或类似术语指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性的结合可以以平衡解离常数至少约1x10-6M或更低(例如KD越小表明结合越紧密)来表征。确定是否两个分子特异性结合的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括例如平衡透析法、表面等离子体共振等。如本申请所述的，已通过表面等离子体共振(例如BIACORETM)对抗体进行了鉴定，其特异性结合至GCG。而且，如在本申请中所使用的，将与GCG蛋白以及一种或多种其他抗原结合的多特异性抗体或者与GCG的两个不同区域结合的双特异性抗体也认为是“特异性结合”的抗体。
本发明的抗体可以是分离的抗体。在本申请中使用的术语“分离的抗体”指已从其天然环境的至少一个组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，从生物体的至少一个组分或者从抗体天然存在或天然产生的组织或细胞中分离或除去的抗体是用于本发明目的的“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞中的原位抗体。分离的抗体是已进行了至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方式，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
本申请公开的抗-GCG抗体可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸的取代、插入和/或缺失。通过将本申请所公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库中获得的序列进行比较能够容易地确定此类突变。一旦获得，能够针对一个或多个所需的性质容易地对含有一个或多个突变的抗体和抗原结合片段进行检测，如改善的结合特异性、增加的结合亲和性、改善的或增加的拮抗或激动的生物学性质(可视情况而定)、降低的免疫原性等。采用这种一般方法获得的抗体和抗原结合片段包含在本发明中。
本发明还包括抗-GCG抗体，所述抗-GCG抗体包含本申请所公开的任意HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有一个或多个保守的取代的变体。例如，本发明包括抗-GCG抗体，所述抗-GCG抗体相对于本申请表1中所示的任意HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有带有例如10个或更少的、8个或更少的、6个或更少的、4个或更少的等等保守的氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列。
在本申请中使用的“阻断抗体”或“中和抗体”(或“中和GCG活性的抗体”)旨在指与胰高血糖素结合防止或阻断其与胰高血糖素受体结合结果导致GCG的至少一种生物活性抑制的抗体。例如，本发明的抗体有助于阻止与胰高血糖素水平升高相关的血糖水平增加。或者，本发明的抗体可以显示出阻断响应于胰高血糖素的cAMP产生的能力。这种GCG生物活性的抑制可以通过使用本领域公知的多种标准的体外或体内检测中的一种或多种测定一个或多个GCG生物活性的指示指标进行评估。
在本申请中使用的术语“表面等离子体共振”指通过检测在生物传感基质中的蛋白浓度变化能够进行实时的生物分子相互作用分析的光学现象，例如使用BIACORETM系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。
在本申请中使用的术语“KD”旨在指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”指与在被称为互补位的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。一个抗原可以具有一个以上的表位。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物效应。表位可以是具有构象的或线形的。具有构象的表位是由线形多肽链的不同区段在空间上靠近的氨基酸产生的。线形表位是由多肽链中相邻的氨基酸残基产生的。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖类部分、磷酰基或磺酰基。
术语“基本上的一致性”或“基本上一致的”当涉及核酸或其片段时表示当将适当的核苷酸插入或缺失与其他核酸(或其互补链)进行最佳比对时，根据如下文所讨论的任意本领域熟知的序列一致性算法如FASTA、BLAST或Gap的测定结果，核苷酸序列的一致性至少约95％，更优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基。在某些例子中，与对照核酸分子具有基本上的一致性的核酸分子可以编码与由所述对照核酸分子编码的所述多肽具有相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
在用于多肽时，术语“基本上的相似性”或“基本上相似的”指两条多肽序列当进行最佳比对如通过使用缺省缺口权重的程序GAP或BESTFIT时具有至少95％的序列一致性，甚至更优选地至少98％或99％的序列一致性。优选地，不相同的残基位置的差别为保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被带有具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸取代。在通常情况下，保守性氨基酸取代将不会实质性改变蛋白的功能性性质。在两个或多个氨基酸序列彼此之间的差别为保守性取代的案例中，可以对序列一致性百分比或相似性程度进行上调以校正所述取代的保守性性质。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307-331，其通过引用并入本申请。含有具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的示例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)羟基脂肪族侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性取代是在Gonnet等((1992)Science 256:1443 45)所公开的PAM250对数-似然性矩阵中具有正值的任意改变。“适度的保守性”取代是在PAM250对数似然性矩阵中具有非负值的任意改变。
多肽的序列相似性(也将其称为序列一致性)通常使用序列分析软件测定。使用与相似序列匹配的蛋白分析软件测定针对不同取代、缺失和其他修饰包括保守性氨基酸取代的相似性。例如，含有程序如Gap和Bestfit的GCG软件可以使用缺省参数用于确定密切相关的多肽之间的序列同源性或序列一致性，如不同物种生物体或者野生型蛋白与其突变蛋白之间的同源性多肽。参见例如GCG 6.1版。也可以使用采用缺省或推荐参数的在GCG 6.1版中的程序FASTA对多肽序列进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询和检索序列之间最佳重叠区域的比对和序列一致性百分率(Pearson(2000)，如上所述)。当将本发明的序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是计算机程序BLAST，特别是使用缺省参数的BLASTP或TBLASTN。参见例如Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403 410和Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389 402，其均通过引用并入本申请。
短语“治疗有效量”指产生所需效应的施用量。精确的量将取决于治疗目的并且将由本领域技术人员使用公知的技术确定(参见例如Lloyd(1999)The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding)。
术语“血糖水平”或“血糖的水平”应指血糖浓度。在某些实施方式中，血糖水平是血浆葡萄糖水平。可以根据Etgen等(Metabolism 2000；49(5):684-688)确定血糖或者根据D'Orazio等(Clin.Chem.Lab.Med.2006；44(12):1486-1490)由全血糖浓度的转化计算血糖。
“正常血糖水平”指在人体内的平均血糖值空腹水平小于约100mg/dL，以及餐后2小时水平小于110-120mg/dL或随机葡萄糖小于125mg/dL。可以根据Etgen等(Metabolism2000；49(5):684-688)确定血糖或者根据D'Orazio等(Clin.Chem.Lab.Med.2006；44(12):1486-1490)由全血糖浓度的转化计算血糖。在本发明的某些实施方式中，抗-GCG抗体可以用于将血糖水平降至正常范围内。
术语“升高的血糖水平”或“血糖水平升高”应指如在显示出临床上不适宜的基础高血糖和餐后高血糖的对象中发现的或如在口服糖耐量测试(oGTT)中具有当在空腹条件下检测时大于约100mg/dL以及当在1小时时检测时大于约200mg/dL的“升高的血糖水平”的对象中发现的升高的血糖水平。
术语“应激性高血糖”可以与“应激诱导的高血糖”互换使用，指患者遭受与急性损伤或疾病的应激暂时相关的血糖瞬时升高(>140mg/dL)的状况。应激性高血糖能够发生在具有或不具有糖尿病史的患者中。认为其原因与潜在的医学疾病、麻醉、手术或创伤的应激直接相关。
应激性高血糖是由一种或多种下述风险因素、状况或疗法引起或者可能由其加剧：已经存在的1型或2型糖尿病；高渗性脱水；儿茶酚胺加压剂的输注；糖皮质激素疗法；肥胖；老龄化；施用过量右旋糖；肠外营养、肠内营养、胰腺炎；败血症；中风；创伤性头部损伤；低体温症；低血氧症；尿毒症；肝硬化；麻醉；术前或术后住院(围手术期高血糖症)；进入急诊室、创伤中心或重症监护室；延长住院时间；外科手术；感染；或慢性病恶化。
在本申请中使用的术语“危重症”通常指患有需要在医院的危症监护室或重症监护室治疗或监测的疾病、病症、损伤、外科手术或其他状况的患者。在其最宽泛的含义上，在本申请中使用的术语“危重症”患者指持续存在严重威胁生命的单一或多器官系统衰竭或处于其风险中的患者。危重症患者可以是“糖尿病患者”，例如已使用本领域公知的标准检测确诊患有糖尿病的患者；或者“非糖尿病患者”，例如已使用本领域公知的标准方法确诊未患有糖尿病的患者。
术语“不是危重症”或“非危重症”指患有不需要在医院的危症监护室或重症监护室中治疗或监测的疾病、病症或状况的住院患者。在其最宽泛的含义上，在本申请中使用的术语“不是危重症”患者指持续存在由疾病、损伤、外科手术或其他状况导致的严重威胁生命的单一或多器官系统衰竭或处于其风险中的患者以外的患者。
在本申请中使用的术语“重症监护室”(在本申请中称为ICU)指危重患者在此处进行治疗的医院的一部分。在不同国家之间，甚至是在不同医院之间其可能是不同的，并且医院的这一部分可以不必须正式地将其称为“重症监护室”或者其译文或派生词。术语“重症监护室”还包括对患有需要使用设备和药物进行持续、密切的监测和支持以维持正常身体功能的危及生命的疾病状况的患者进行治疗的任何医疗单元。
在本申请中使用的术语“治疗”(“treating”或“treatment”)指获得益处或所需临床结果的方法。对于本发明的目的而言，益处或所需临床结果包括但不限于下述中的一种或多种：将血糖改善至约80-180mg/dL以内或改善至约80-140mg/dL以内，或者在患者中改善与血糖水平升高相关或由其引起的任意一种或多种状况、疾病或症状，其包括但不限于：对感染的易感性、器官衰竭、中风后残疾、多发性神经病、心律失常或死亡。此外，使用本发明的胰高血糖素拮抗剂/抗体“治疗”可能产生益处或所需治疗结果，所述益处或所需治疗结果可以包括：将血糖水平改善至约80-180mg/dL以内或改善至约80-140mg/dL以内，改善由暴露于选自下组的任意一种或多种应激诱导的刺激或葡萄糖升高的刺激导致的任意状况或疾病：已经存在的1型或2型糖尿病；儿茶酚胺加压剂的输注；肠外营养；肠内营养；糖皮质激素疗法；肥胖；老龄化；施用过量右旋糖；胰腺炎；败血症；中风；创伤性头部损伤；低体温症；低血氧症；尿毒症；肝硬化；麻醉；术前或术后住院(围手术期高血糖症)；进入急诊室、创伤中心或重症监护室；延长住院时间；外科手术；感染；或慢性病。使用本发明的胰高血糖素拮抗剂/抗体“治疗”还可以导致预防应激性高血糖发病，或预防应激性高血糖发病的可能性。
“应激诱导的刺激”与“葡萄糖升高的刺激”互换使用，指促进血糖升高至正常水平以上的事件。“应激诱导的刺激”或“葡萄糖升高的刺激”的实例包括下述中的任意一个或多个：已经存在的1型或2型糖尿病；高渗性脱水；儿茶酚胺加压剂的输注；肠外营养；肠内营养；糖皮质激素疗法；肥胖；老龄化；施用过量右旋糖；胰腺炎；败血症；中风；创伤性头部损伤；低体温症；低血氧症；尿毒症；肝硬化；麻醉；术前或术后住院(围手术期高血糖症)；进入急诊室、创伤中心或重症监护室；延长住院时间；外科手术；感染；或慢性病。
在本申请中使用的术语“胰岛素”指来自任意物种的胰岛素(如人胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素)及其盐(如锌盐)。
pH-依赖性结合
本发明包括具有pH依赖性结合特性的抗-GCG抗体。例如，本发明的抗-GCG抗体在酸性pH下与在中性pH下相比可以显示出与GCG减少的结合。或者，本发明的抗-GCG抗体在酸性pH下与在中性pH下相比可以显示出与GCG增加的结合。表述“酸性pH”包括小于约6.2的pH值，例如约6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更低。在本申请中使用的表达“中性pH”指约7.0至约7.4的pH。表述“中性pH”包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4的pH值。
在某些情况下，“在酸性pH下与在中性pH下相比与GCG的结合减少”以在酸性pH下抗体与GCG结合的KD值与在中性pH下抗体与GCG结合的KD值的比值表示(或者反之亦然)。例如，如果抗体或其抗原结合片段显示出的酸性/中性KD的比值为约3.0或更高，则可以认为抗体或其抗原结合片段显示出针对本发明目的的“在酸性pH下与在中性pH下相比与GCG的结合减少”。在某些示例性的实施方式中，针对本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性KD的比值可以是约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更高。
可以例如通过筛选在酸性pH下与在中性pH下相比与特定抗原的结合减少(或增加)的一群抗体获得具有pH依赖性结合特性的抗体。此外，在氨基酸水平上对抗原结合结构域的修饰可以产生具有pH依赖性特性的抗体。例如，通过使用组氨酸残基取代抗原结合结构域(例如在CDR中)的一个或多个氨基酸，可以获得在酸性pH下与在中性pH下相比抗原结合减少的抗体。
包含Fc变体的抗-GCG抗体
根据本发明的某些实施方式，提供了包含Fc结构域的抗-GCG抗体，所述Fc结构域含有例如在酸性pH下与在中性pH下相比增加或减少抗体与FcRn受体结合的一个或多个突变。例如，本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变的抗-GCG抗体，其中所述突变在酸性环境中增加Fc结构域与FcRn的亲和性(例如，在pH范围从约5.5至约6.0的核内体中)。当向动物施用时，此类突变可以导致抗体血清半衰期的增加。此类Fc修饰的非限制性示例包括例如在位置250(例如E或Q)；250和248(例如L和F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或者在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])的修饰；或者在位置250和/或428的修饰；或者在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)的修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)的修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)的修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)的修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。在又一个实施方式中，所述修饰包括265A(例如D265A)和/或297A(例如N297A)的修饰。
例如，本发明包括包含Fc结构域的抗-GCG抗体，所述Fc结构域含有一对或多对或者一组或多组选自下组的突变：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；257I和311I(例如P257I和Q311I)；257I和434H(例如P257I和N434H)；376V和434H(例如D376V和N434H)；307A、380A和434A(例如T307A、E380A和N434A)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。前述Fc结构域突变的所有可能的组合以及本申请所公开的抗体可变结构域中的其他突变均包含在本发明的范围内。
本发明还包括包含嵌合的重链恒定(CH)区的抗-GCG抗体，其中所述嵌合的CH区包含来源于一个以上免疫球蛋白同种型的CH区的区段。例如，本发明的抗体可以包含嵌合的CH区，所述嵌合的CH区包含来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的部分或全部的CH2结构域，其与来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的部分或全部的CH3结构域组合。根据某些实施方式，本发明的抗体包含具有嵌合的铰链区的嵌合的CH区。例如，嵌合的铰链可以包含来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上部铰链”氨基酸序列(来自根据EU编号的位置216至227的氨基酸残基)，其与来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下部铰链”序列(来自根据EU编号的位置228至236的氨基酸残基)组合。根据某些实施方式，所述嵌合的铰链区包含来源于人IgG1或人IgG4上部铰链的氨基酸残基和来源于人IgG2下部铰链的氨基酸残基。在某些实施方式中，如本申请所述的包含嵌合的CH区的抗体显示出改善的Fc效应物功能且对抗体的治疗或药代动力学性质未产生不利影响。(参见例如2013年2月1日提交的美国临时申请号61/759,578，其公开的全部内容通过引用并入本申请)。
抗体的生物学特性
本发明包括以高亲和性结合GCG的抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括以在25℃或37℃下根据表面等离子体共振(例如使用如本申请实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定)测定的小于约5.0nM的KD结合GCG的抗-GCG抗体。根据某些实施方式，提供了根据表面等离子体共振(例如使用如本申请实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定)测定的在37℃下以小于约5nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约900pM、小于约800pM、小于约700pM、小于约600pM、小于约500pM、小于约400pM或小于约300pM的KD结合GCG的抗-GCG抗体。
本发明还包括以在25℃或37℃下根据表面等离子体共振(例如使用如本申请实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定)测定的大于约0.5分钟的解离半衰期(t1/2)结合GCG的抗体及其抗原结合片段。根据某些实施方式，提供了根据表面等离子体共振(例如使用如本申请实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定)测定的在37℃下以大于或等于约0.5分钟、大于约6分钟、大于约8分钟、大于约10分钟、大于约12分钟、大于约14分钟、大于约16分钟、大于约18分钟、大于约20分钟、大于约30分钟、大于约40分钟或更长时间的t1/2结合GCG的抗-GCG抗体。
本发明还包括结合GCG的抗体及其抗原结合片段，所述GCG与表达胰高血糖素受体(GCGR)的细胞结合并活化该细胞。例如，本发明包括以使用本申请的实施例4中定义的GCG生物测定形式或基本上相似的测定法测定的小于约60pM的EC50阻断胰高血糖素与表达胰高血糖素受体的细胞结合的抗-GCG抗体。根据某些实施方式，提供了以使用本申请的实施例4中定义的GCG生物测定形式或基本上相似的测定法测定的小于约50nM、小于约5.0nM、小于约1.0nM、小于约900pM、小于约800pM、小于约600pM、小于约400pM、小于约200pM、小于约100pM、小于约80pM、小于约60pM、小于约40pM、小于约20pM的EC50阻断表达GCGR的细胞活化的抗-GCG抗体。
本发明的抗体可以具有一个或多个上述的生物学特征或其任意组合。本发明抗体生物学特征的上述列表并不是穷举的。在阅读了包括本申请工作实施例在内的本公开后，本发明抗体的其他生物学特征对本领域技术人员而言将是显而易见的。
表位展示和相关技术
本发明的抗体结合的表位可以由GCG蛋白的3个或多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单一连续的序列组成。或者，表位可以由GCG的多个非连续的氨基酸(或氨基酸序列)组成。
可以采用本领域的普通技术人员公知的多种技术确定抗体是否与多肽或蛋白中的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性的技术包括例如可以采用常规的交叉阻断检测如Antibodies,Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中所描述的、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)和肽裂解分析。此外，可以使用方法如抗原的表位删除、表位提取和化学修饰(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。另一种能够用于鉴定与抗体相互作用的多肽中的氨基酸的方法是通过质谱检测的氢/氘交换。一般而言，所述氢/氘交换的方法涉及用氘标记目标蛋白、随后将所述抗体与氘标记的蛋白结合。接下来，将该蛋白/抗体复合物转移至水中以使得在除了受抗体保护的残基(其仍为氘标记)以外的所有残基发生氢-氘交换。在抗体解离后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，从而揭示对应于同抗体相互作用的特定氨基酸的氘标记残基。参见例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
本发明还包括与本申请所述的任意特异性的示例性抗体(例如包含本申请的表1中所示的任意氨基酸序列的抗体)结合相同表位的抗-GCG抗体。同样地，本发明还包括与本申请所述的任意特异性的示例性抗体(例如包含本申请的表1中所示的任意氨基酸序列的抗体)竞争性地与GCG结合的抗-GCG抗体。
通过使用本领域公知的常规方法和本申请中的示例能够容易地确定是否抗体与对照抗-GCG抗体结合至相同表位或竞争结合。例如，为确定是否待测抗体与本发明的对照抗-GCG抗体结合至相同表位，将对照抗体与GCG蛋白结合。接下来，评估待测抗体与GCG分子结合的能力。在使用对照抗-GCG抗体饱和结合后，如果待测抗体能够与GCG结合，则能够得出结论待测抗体与对照抗-GCG抗体结合至不同的表位。另一方面，在使用对照抗-GCG抗体饱和结合后，如果待测抗体不能与GCG分子结合，则待测抗体可能结合至与本发明的对照抗-GCG抗体结合的表位相同的表位。然后可以进行附加的常规实验(例如肽突变和结合分析)以确证是否所观察到的待测抗体缺乏结合的事实上是由于与对照抗体结合相同的表位导致的或者是否是空间位阻(或另外的现象)导致了所观察到的结合缺乏。可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域中任意其他定量或定性的抗体结合检测进行这种类型的实验。根据本发明的某些实施方式，如果例如根据竞争性结合测定的结果(参见例如Junghans等，Cancer Res.1990:50:1495-1502)1、5、10、20或100倍过量的一种抗体对另一种抗体结合的抑制为至少50％但优选地75％、90％或甚至99％，则两个抗体结合至相同的(或重叠的)表位。或者，如果抗原中降低或消除一种抗体结合的基本上所有氨基酸的突变降低或消除另一种的结合，则认为两个抗体结合相同的表位。如果降低或消除一种抗体结合的一组氨基酸的突变降低或消除另一种的结合，则认为两种抗体具有“重叠的表位”。
为确定是否抗体与对照抗-GCG抗体竞争性地结合(或交叉竞争性地结合)，在两个方向上进行上文所述的结合方法：在第一个方向上，在饱和条件下将对照抗体与GCG蛋白结合，随后评估待测抗体与GCG分子的结合。在第二个方向上，在饱和条件下将待测抗体与GCG分子结合，随后评估对照抗体与GCG分子的结合。如果在这两个方向上仅第一(饱和的)抗体能够与GCG分子结合，则得出结论待测抗体和对照抗体与GCG竞争性地结合。根据本领域普通技术人员的理解，与对照抗体竞争结合的抗体并不一定与对照抗体结合至相同表位，但可能通过与重叠或邻近表位的结合在空间上阻断对照抗体的结合。
人源抗体的制备
本发明的抗-GCG抗体可以是全人源(非天然存在的)抗体。用于产生单克隆抗体包括全人源单克隆抗体的方法是本领域公知的。可以将任意此类公知的方法用于本发明的背景下以制备特异性与人GCG结合的人源抗体。
使用技术(参见例如US 6,596,541，瑞恩泽制药公司，)或任意其他公知的用于生成单克隆抗体的方法，首先分离具有人源可变区和小鼠恒定区的对抗原具有高亲和性的嵌合抗体。技术涉及转基因小鼠的产生，所述小鼠具有含有与内源性小鼠恒定区基因座可操作地连接的人源重链和轻链可变区的基因组，以使得所述小鼠针对抗原的刺激产生包含人源可变区和小鼠恒定区的抗体。编码所述抗体的重链和轻链可变区的DNA被分离并且与编码人源重链和轻链恒定区的DNA可操作地连接。然后在能够表达全人源抗体的细胞中表达所述DNA。
在通常情况下，使用目标抗原攻击小鼠，并且从表达抗体的小鼠中收集淋巴细胞(如B细胞)。可以将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以制备永生化的杂交瘤细胞系，并且对此类杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴定产生对目标抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。可以分离编码所述重链和轻链可变区的DNA并且与所述重链和轻链的所需的同种型恒定区连接。可以在细胞如CHO细胞中生产此类抗体蛋白。或者，可以直接从抗原特异性淋巴细胞中分离编码所述抗原特异性嵌合抗体或所述轻链和重链可变结构域的DNA。
如在下面的实验章节中所述的，对具有人源可变区和小鼠恒定区的分离的高亲和性嵌合抗体进行表征并对所需的特征进行选择，包括亲和性、选择性、表位等。然后，使用所需的人源恒定区取代所述小鼠的恒定区以生成本发明的全人源抗体，例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。尽管可以根据特定用途改变所选择的恒定区，高亲和性抗原结合和靶点特异性特征均保留在可变区中。
在通常情况下，当对与固定在固相上或在溶液相中的抗原的结合进行检测时，本发明的抗体具有非常高的亲和性，通常具有的KD从约10-12至约10-9M。
生物等价物
本发明的抗-GCG抗体和抗体片段包含具有不同于本申请所述抗体的那些的氨基酸序列，但是仍保持了结合人源GCG的能力。此类变体抗体和抗体片段当与母体序列进行比较时包含一个或多个氨基酸插入、缺失或取代，但是显示出基本上与所述抗体等价的生物活性。同样地，本发明的编码抗-GCG抗体的DNA序列与所公开的序列相比包含一个或多个核苷酸插入、缺失或取代，但是其编码的抗-GCG抗体或抗体片段基本上是本发明的抗-GCG抗体或抗体片段的生物等价物。此类变体氨基酸和DNA序列的示例如上文所讨论的。
如果例如两种抗原结合蛋白或抗体是药学等价物或药学替代物，即在类似的实验条件下单剂量或多剂量给予相同摩尔剂量时其吸收速率和程度未显示出显著差异，则认为这两者是生物等价物。如果一些抗体在其吸收程度上而不是吸收速率上是等价的仍可以将其认为是等价物或药学替代物并且仍可以认为其是生物等价物，因为这种在吸收速率上的差异是有意的并且已经反映在标签中，其对例如长期使用时达到有效的机体药物浓度不是必要的，并且针对所研究的特定药品认为其在医学上是无足轻重的。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和效能方面不存在具有临床意义的差异，则认为其是生物等价物。
在一个实施方式中，如果患者能够在对照产品和生物产品之间进行一次或多次的转换而在不良反应的风险方面无预期的增加，则认为这两种抗原结合蛋白是生物等价物，所述不良反应包括与无这种转换的连续疗法相比免疫原性出现具有临床意义的改变或有效性降低。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白针对使用的状况通过共同的作用机制发挥作用并且此类作用机制在公知的范围内，则认为其是生物等价物。
生物等效性可以通过体内和体外方法证明。生物等效性的测定包括，例如(a)在人或其他哺乳动物中的体内检测，测定在血液、血浆、血清或其他生物液体中的抗体或其代谢产物的浓度对时间的函数；(b)进行具有相关性的体外检测并合理的预测在人体内的生物利用度数据；(c)在人或其他哺乳动物中进行体内检测，测定适当的抗体(或其靶点)的急性药理学作用作为时间的函数；和(d)在对照良好的临床试验中确定抗体的安全性、有效性或者生物利用度或生物等效性。
可以通过例如对残基或序列进行各种取代或者缺失生物活性不需要的末端或中间的残基构建本发明的抗-GCG抗体的生物等价物变体。例如，半胱氨酸残基不是生物活性所必须的，可以将其缺失或使用其他氨基酸取代以防止在复性过程中形成不必要的或不正确的分子内二硫键桥。在其他情况下，生物等价物抗体可以包括包含氨基酸改变的抗-GCG抗体变体，其改变了所述抗体的糖基化特征，例如消除或除去糖基化的突变。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性)。多特异性抗体可以对一个靶向多肽的不同表位是特异性的或者可以含有对一个以上的靶向多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如Tutt等，1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等，2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本发明的抗-GCG抗体可以连接至或与另一种功能性分子例如另一种肽或蛋白共表达。例如，抗体或其片段可以功能性地连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)至一个或多个其他的分子实体，如另一个抗体或抗体片段，以产生具有第二个结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂与人GCG结合，并且免疫球蛋白的另一个臂对第二抗原具有特异性。与GCG结合的臂可以包含本申请的表1中所示的任意HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。
能够用于本发明背景下的示例性双特异性抗体形式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中所述第一和第二Ig CH3结构域彼此间存在至少一个氨基酸的差异，并且与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比其中至少一个氨基酸的差异降低了双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方式中，所述第一Ig CH3结构域结合蛋白A并且所述第二Ig CH3结构域含有使与蛋白A的结合减少或消除的突变如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。所述第二CH3还可以包括Y96F修饰(根据IMGT；根据EU为Y436F)。可以存在于第二CH3中的进一步的修饰包括：在IgG1抗体的情况下D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU为N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上文所述的双特异性抗体形式的变体包括在本发明的范围内。
能够用于本发明背景下的其他示例性的双特异性形式包括，但不限于，例如基于scFv的或双体双特异性形式、IgG-scFv融合、双可变结构域(DVD)-Ig、四价体杂交瘤、凸起-进入-孔洞(knob-into-hole)、共有轻链(例如具有凸起-进入-孔洞等的共有轻链)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性形式(参见例如Klein等，2012,mAbs 4:6,1-11，并且作为本申请中引用的参考文献，其对前述的形式进行了综述)。也可以使用肽/核酸缀合构建双特异性抗体，例如其中将具有正交化学反应性的非天然氨基酸用于生成位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，然后将其自组装成具有所定义的组分、价态和几何形状的多聚体复合物(参见例如Kazane等，J.Am.Chem.Soc.[Epub:Dec.4,2012])。
治疗性制剂和施用
本发明提供了包含本发明的抗-GCG抗体或其抗原结合片段的药物组合物。使用提供改善的转移、递送、耐受等的适宜的运载体、赋形剂和其他试剂对本发明的药物组合物制剂。多种适宜的制剂能够在所有药物化学家公知的处方集Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Easton,PA中找到。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LIPOFECTINTM，LifeTechnologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有半固体混合物的碳蜡。亦参见Powell等，"Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm SciTechnol 52:238-311。
可以根据患者的年龄和身材、靶疾病、状况、施用途径等改变向患者施用的抗体的剂量。通常根据体重或体表面积计算优选剂量。在成人患者中，通常以约0.01至约20mg/kg体重、更优选地约0.02至约7、约0.03至约5或者约0.05至约3mg/kg体重的单一剂量静脉内施用本发明的抗体是有利的。可以根据所述状况的严重程度调整治疗的频率和持续时间。可以根据经验确定施用抗-GCG抗体的有效剂量和方案；例如可以通过周期性评估监测患者的进展并相应地对剂量进行调整。而且，可以使用本领域公知的方法确定物种间的剂量比例(例如Mordenti等，1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
各种递送系统是公知的并且可以用于施用本发明的药物组合物，例如包封在脂质体中、微粒、微囊、能够表达突变型病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu等，1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述组合物可以通过任意常规的途径施用，例如通过输注或推注、通过经上皮或粘膜层(例如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜等)的吸收和可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。
可以使用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。此外，对于皮下递送，笔递送装置能够容易地用于递送本发明的药物组合物。此类笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常使用含有药物组合物的可替换的药筒。一旦药筒中的所有药物组合物已经施用并且所述药筒是空的时，所述空的药筒能够容易地被弃去并且被含有所述药物组合物的新药筒替换。然后可以重复使用所述药物递送装置。在一次性的笔递送装置中，无可替换的药筒。相反地，所述一次性笔递送装置在所述装置中的储液槽中预充了所述药物组合物。一旦所述药物组合物的储液槽变空，则将整个装置弃去。
多种可重复使用的笔和自动注射器递送装置已应用于本发明药物组合物的皮下递送。例如包括但不一定限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)仅列举了其中的几个。应用于本发明的药物组合物皮下递送的一次性笔递送装置的例子包括但不一定限于SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs,AbbottPark IL)仅列举了其中的几个。
在某些情况下，所述药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施方式中，可以使用泵(参见Langer，如上所述；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方式中，可以使用多聚体材料，参见Medical Applications of ControlledRelease,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又一个实施方式中，可以将控释系统置于所述组合物的靶点附近，以使得仅需要递送全身剂量的一部分。(参见例如Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138)。在Langer，1990,Science 249:1527-1533的综述中对其他控释系统进行了讨论。
可注射的制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射，点滴输注等的剂型。可以采用公知的方法制备这些可注射剂型。例如，可以通过例如将上文所述的抗体或其盐溶解、混悬或乳化于常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中制备可注射制剂。作为用于注射的水性介质，例如有生理盐水、含有葡萄糖和其他辅助剂等的等渗溶液，可以将其与适宜的增溶剂如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等联用。作为油性介质，使用例如芝麻油、豆油等，其可以与助溶剂如苯甲酸苄酯、苄醇等联用。因此，优选将所制备的注射剂填充入适宜的安瓿中。
有利地，将上文所述的用于口服或胃肠外的药物组合物制成适于适宜的活性成分剂量的单位剂量剂型。单位剂量的这种剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含的上述抗体的量通常为约5至约500mg每单位剂量剂型；特别是在注射剂形式，所含的上述抗体优选地为约5至约100mg并且对于其他剂型为约10至约250mg。
免疫缀合物
本发明包括与治疗部分缀合的人源抗-GCG单克隆抗体(“免疫缀合物”)，如能够降低血糖水平的药剂，或放射性同位素，或化学治疗剂。可以与抗-GCG抗体缀合的治疗部分的类型的选择需要考虑所治疗的状况和将达到的希望的治疗效果。例如，对于治疗糖尿病，或者降低血糖和/或维持正常的血糖水平是所希望的任意其他状况而言，可以将药剂如双胍类(二甲双胍)、磺酰脲类(如格列本脲或格列吡嗪)、PPARγ激动剂(例如吡格列酮、罗格列酮)、α葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖、伏格列波糖)、高级糖基化终产物形成抑制剂(例如氨基胍)或第二GCG抑制剂与所述GCG抗体缀合。或者，如果所需的治疗作用是治疗与糖尿病相关的后遗症或症状，或由较高或无法控制的血糖水平导致的任意其他状况，则与适于治疗状况的后遗症或症状的药剂缀合可能是有利的。用于形成免疫缀合物的适宜药剂的实例是本领域公知的，参见例如WO 05/103081。
抗体的治疗用途
由于其与胰高血糖素相互作用，因而本抗体用于降低血糖水平以及还用于治疗得益于阻断胰高血糖素与其受体之间的相互作用的多种状况和病症。这些病症和状况可以选自任意与胰高血糖素相关的代谢病症，所述代谢病症涉及导致所述病症的病理生理学的胰高血糖素受体信号，或涉及对所述病症的稳态应答。因此，抗体可以用于例如预防、治疗或缓解内分泌系统、中枢神经系统、外周神经系统、心血管系统、肺系统和胃肠道系统的疾病或状况或者相关症状或后遗症，同时减轻或消除一种或多种与当前治疗相关的有害的副作用。胰高血糖素相关的代谢病症包括但不限于：1型和2型糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高渗性综合征、围手术期高血糖症、重症监护室患者的高血糖症、高胰岛素血症、餐后高血糖症、与烧伤或心肌梗死或其他心脏问题/状况相关的高血糖症、空腹血糖受损(IFG)、代谢综合征、高/低钾血症、较差的LDL/HDL比例、饮食失调、体重增加、糖尿病引起的肥胖、儿童糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病晚期并发症、微量/大量白蛋白尿、肾病、视网膜病变、神经病、糖尿病足溃疡、伤口愈合、糖耐量受损(IGT)、胰岛素抵抗综合征、X综合征、胰高血糖素瘤、胃肠道病症、肥胖、由肥胖引起的糖尿病等。本发明还提供了：一种在哺乳动物中治疗由过量胰高血糖素导致的状况的方法；一种在哺乳动物中抑制胰高血糖素的升高葡萄糖作用的方法；一种在哺乳动物中抑制胰高血糖素介导的细胞应答的方法；或者一种在哺乳动物中降低血糖水平的方法，所述方法包括向需要此类治疗的哺乳动物施用抑制胰高血糖素的量的抗-GCG抗体或其生物活性片段。
在一个实施方式中，本发明的抗体可以用于在患者中预防高血糖症发病(例如应激诱导的高血糖)或降低高血糖症发病的可能性，或者可以用于降低部分由于升高的血糖水平导致的疾病或状况的严重程度。在这种情况下，可以预期，本发明的抗体可以在急性期单独使用或与第二治疗剂(例如胰岛素)联用。在一个实施方式中，当单独使用或与第二治疗剂(如胰岛素)合用时，可以将抗-GCG抗体作为慢性疗法以降低血糖或维持正常的血糖水平。
本抗体有效降低空腹期和餐后期的血糖。在本发明的某些实施方式中，本抗体用于制备用于治疗2型糖尿病的药物组合物。在本发明的又一个实施方式中，本抗体用于制备用于延迟或阻止由糖耐量受损向2型糖尿病进展的药物组合物。在发明的又一个实施方式中，本抗体用于制备延迟或阻止由不需要胰岛素的糖尿病向需要胰岛素的糖尿病进展的药物组合物。在发明的又一个实施方式中，本抗体用于制备用于治疗1型糖尿病的药物组合物。
在另一个实施方式中，本发明的抗体用于治疗由患者暴露于一种或多种选自下组的应激物，或应激诱导的刺激，或葡萄糖升高的刺激导致的应激性高血糖：已经存在的1型或2型糖尿病、高渗性脱水、儿茶酚胺加压剂的输注、肠外营养、肠内营养、糖皮质激素疗法、肥胖、老龄化、施用过量右旋糖、胰腺炎、败血症、中风、心肌梗死或其他心脏状况、烧伤、创伤性头部损伤、低体温症、低血氧症、尿毒症、肝硬化、麻醉、术前或术后住院(围手术期高血糖症)、进入急诊室，创伤中心或重症监护室、延长住院时间、外科手术、感染和慢性病。
可以预期，本发明的抗体可以在急性期使用(短期使用)或者长期(慢性)使用。此类治疗可以伴随胰岛素疗法或其他降血糖疗法。
联用疗法
联用疗法可以包括本发明的抗-GCG抗体和任意附加治疗剂，所述任意附加治疗剂与本发明的抗体或与本发明抗体的生物活性片段联用可能是有利的。
例如，可以使用第二治疗剂以便在患有其特征为高血糖水平的疾病或状况(如糖尿病)的患者中辅助进一步降低血糖或者减轻至少一种症状。此类第二药剂可以选自例如胰高血糖素受体拮抗剂(如在例如US8545847中描述的)，或另一种GCG拮抗剂(例如另一种不同的抗胰高血糖素抗体或抗-GCGR抗体或者胰高血糖素或GCGR的小分子抑制剂)，或者可以包括用于治疗糖尿病或者与血糖水平升高或葡萄糖代谢受损相关的或由其导致的其他疾病或状况的其他治疗部分，或者用于治疗与血糖水平升高和/或失控相关的任何长期并发症的药剂。这些药剂包括双胍类，其减少肝脏中的葡萄糖产生和增加对胰岛素的敏感性(例如二甲双胍)，或磺酰脲类，其刺激胰岛素产生(例如格列本脲、格列吡嗪)。针对维持葡萄糖体内平衡的附加治疗包括PPARγ激动剂，如噻唑烷二酮类，其作为胰岛素增敏剂(例如吡格列酮、罗格列酮)；以及α葡糖苷酶抑制剂，其减少淀粉吸收和葡萄糖产生(例如阿卡波糖、伏格列波糖)。其他治疗包括可注射的治疗如胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物或激动剂，例如(艾塞那肽)或(利拉鲁肽)。另一种治疗可以使用(普兰林肽)，其是胰岛淀粉样多肽的类似物，胰岛淀粉样多肽是一种在餐后由胰腺的β细胞与胰岛素一起释放进入血液的小分子肽激素。通过增加内源性胰岛淀粉样多肽，普兰林肽通过减慢胃排空、经由下丘脑受体(不同于GLP-1的受体)促进饱腹感，以及抑制胰高血糖素不适宜的分泌辅助葡萄糖的吸收。可以用于与本发明的抗体联用的其他化合物包括二肽基肽酶IV抑制剂(DPP-4抑制剂)，其降低胰高血糖素和血糖水平。DPP-4抑制剂的作用机制是增加肠降血糖素(GLP-1和GIP)水平，其抑制胰高血糖素释放，从而反过来增加胰岛素分泌、减慢胃排空和降低血糖水平。DPP-4抑制剂的实例包括沙格列汀西格列汀和维格列汀可以用于与本发明的抗体联用的其他化合物包括钠-葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)抑制剂，其阻止葡萄糖在肾脏中的再吸收，增加葡萄糖排泄和降低血糖水平。SGLT2抑制剂的实例包括INVOKANATM(卡格列净)、(达格列净)、恩格列净、伊格列净和托格列净。
在某些其他实施方式中，组合物可以包括选自下组的第二药剂：非磺酰脲类促分泌剂、胰岛素、胰岛素类似物、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)多肽、β3肾上腺素受体激动剂、他汀类和含他汀类的组合、胆固醇摄取和/或胆汁酸再吸收抑制剂、LDL-胆固醇拮抗剂、胆固醇酯转运蛋白拮抗剂、内皮素受体拮抗剂、生长激素拮抗剂、胰岛素增敏剂、胰岛淀粉样多肽模拟物或激动剂、大麻素受体拮抗剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、黑皮质素、黑色素浓缩激素受体激动剂、SNRI以及蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂。
在某些其他实施方式中，联用疗法可以包括施用第二药剂以抵消由施用本发明的抗体导致的任何潜在的副作用，如果此类副作用发生的话。例如，在任意抗-GCG抗体增加脂质或胆固醇水平的情况下，施用第二药剂以降低脂质或胆固醇水平可能是有益的，所使用药剂如HMG-CoA还原酶抑制剂(例如他汀类如阿伐他汀氟伐他汀 洛伐他汀匹伐他汀普伐他汀瑞舒伐他汀和辛伐他汀)。或者，本发明的抗体可以与药剂如联用，是他汀类和另一种药剂的制剂-如依替米贝/辛伐他汀。
在某些实施方式中，将本发明的抗体与下述中的任意一种或多种联合施用可能是有益的：(1)烟酸，其增加脂蛋白的分解代谢；(2)贝特类或两性羧酸，其降低低密度脂蛋白(LDL)水平、改善高密度脂蛋白(HDL)和TG水平以及减少非致命性心脏病发作次数；以及(3)在胆固醇消除中起作用的LXR转录因子激活剂如22-羟基胆固醇，他汀类与胆汁树脂(例如考来烯胺、考来替泊、考来维仑)，烟酸与他汀类的固定组合(例如烟酸与洛伐他汀)或与其他脂质降低剂如ω-3-脂肪酸乙酯(例如omacor)。
而且，第二治疗剂可以是一种或多种胰高血糖素其他抑制剂/拮抗剂，或胰高血糖素受体(GCGR)的抑制剂/拮抗剂，以及其他分子的抑制剂，如血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)、血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)、血管生成素样蛋白5(ANGPTL5)、血管生成素样蛋白6(ANGPTL6)、血管生成素样蛋白8(ANGPTL8)，其参与脂质代谢，特别是胆固醇和/或甘油三酯的体内平衡。这些分子的抑制剂包括小分子和与这些分子特异性结合并阻断其活性的抗体。
在某些实施方式中，将本发明的抗体与用于降低脂质或胆固醇水平的抗体联合施用可能是有益的，所述用于降低脂质或胆固醇水平的抗体例如但不限于例如任意抗-PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9)的抗体，如在US2010/0166768(现为US8062640)所描述的那些。在US2010/0040611、US2010/0041102、US2010/0040610、US2010/0113575、US2009/0232795、US2009/0246192、US2010/0233177、US2009/0142352、US2009/0326202、US2010/0068199、US2011/0033465、US2011/0027287、US2010/0150937、US2010/0136028和WO2009/055783中描述了其他抗-PCSK9抗体。
在某些实施方式中，将本发明的抗-GCG抗体与抑制PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9)活性的核酸(如反义分子、双链RNA或siRNA分子)联合施用可能是有益的。在US2011/0065644、US2011/0039914、US2008/0015162和US2007/0173473中描述了抑制PCSK9活性的示例性核酸分子。
可以在本发明的抗-GCG抗体施用前、同时或施用后施用附加治疗性活性成分。对于本公开的目的而言，将此类施用方案认为是抗-GCG抗体与第二种治疗性活性成分的“联用”
施用方案
根据本发明的某些实施方式，可以在一个规定的时间范围内向对象施用多剂量的抗-GCG抗体(或包含抗-GCG抗体与本申请提及的任意附加治疗性活性剂的组合的药物组合物)。根据本发明这一方面的方法包括顺序地向对象施用多剂量的本发明的抗-GCG抗体。如本申请所使用的，“顺序地施用”指在不同的时间点向对象施用各剂量的抗-GCG抗体，例如在由预定的间隔(例如小时、天、周或月)分隔的不同天。本发明包括包含顺序地向患者施用单一初始剂量的抗-GCG抗体，随后一个或多个第二剂量的抗-GCG抗体，以及任选地随后一个或多个第三剂量的抗-GCG抗体的方法。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”指施用抗-GCG抗体的时间顺序。因此，所述“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；所述“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；以及所述“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。所述初始、第二和第三剂量可以均含量相同量的抗-GCG抗体，但是通常在施用频率方面其彼此之间可以是不同的。然而，在某些实施方式中，在治疗过程中，在初始、第二和/或第三剂量中所含的抗-GCG抗体的量彼此之间是可以改变的(例如适当地上调或下调)。在某些实施方式中，在治疗方案开始时施用两个或多个(例如2、3、4或5)剂量作为“负荷剂量”，随后在降低频率的基础上施用后续剂量(例如“维持剂量”)。
在本发明的某些示例性实施方式中，在紧随前剂量后1至26(例如1、1 1/2、2、2 1/2、3、3 1/2、4、4 1/2、5、5 1/2、6、6 1/2、7、7 1/2、8、8 1/2、9、9 1/2、10、10 1/2、11、11 1/2、12、12 1/2、13、13 1/2、14、14 1/2、15、15 1/2、16、16 1/2、17、17 1/2、18、18 1/2、19、19 1/2、20、201/2、21、21 1/2、22、22 1/2、23、23 1/2、24、24 1/2、25、25 1/2、26、26 1/2或更多)周施用各第二和/或第三剂量。如本申请所使用的，短语“紧随前剂量”指在多次施用的顺序中在下一个剂量施用前向患者施用的抗-GCG抗体的剂量，在所述顺序中无介入剂量。
根据本发明这一方面的方法可以包括向患者施用任意数量的第二和/或第三剂量的抗-GCG抗体。例如，在某些实施方式中，仅向患者施用单一的第二剂量。在其他实施方式中，向患者施用两个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第二剂量。同样地，在某些实施方式中，仅向患者施用单一的第三剂量。在其他实施方式中，向患者施用两个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第三剂量。施用方案可以在特定对象生存期间无限制地使用，或者直至此类治疗不再有治疗性的需求或益处。
在涉及多个第二剂量的实施方式中，可以以与其他第二剂量相同的频率施用各第二剂量。例如，在紧随前剂量后1-2周或者1-2个月可以向患者施用各第二剂量。类似地，在涉及多个第三剂量的实施方式中，可以以与其他第三剂量相同的频率施用各第三剂量。例如，在紧随前剂量后2-12周可以向患者施用各第三剂量。在本发明的某些实施方式中，在治疗方案的过程中向患者施用的第二和/或第三剂量的频率可以改变。在治疗过程中还可以由医师根据临床检查后各患者的需要调整施用频率。
抗体的诊断用途
本发明的抗-GCG抗体还可以用于检测和/或测定样品中的GCG，例如用于诊断目的。例如，抗-GCG抗体或其片段可以用于诊断特征为GCG的异常表达(例如过表达、低表达、缺乏表达等)的状况或疾病。针对GCG的示例性诊断检测可以包括例如将来自患者的样品与本发明的抗-GCG抗体接触，其中所述抗-GCG抗体使用可检测的标签或报告分子标记，或用作捕获配体以从患者样品中选择性分离GCG蛋白。或者，在诊断应用中可以将未标记的抗-GCG抗体与其自身具有可检测标签的第二种抗体联用。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分如荧光素异硫氰酸酯或罗丹明；或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。能够用于检测或测定样品中的GCG的示例性检测包括酶联免疫吸附检测(ELISA)、放射性免疫检测(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
能够用于根据本发明的GCG诊断检测的样品包括来自患者的任意组织或液体样品，在正常或病理状况下其含有可检测量的GCG蛋白或其片段。在通常情况下，将测定来自健康患者(例如未患有与异常的GCG水平或活性相关的疾病或状况的患者)的特定样品中的GCG的水平以建立初始的基线或标准GCG水平。然后将GCG的该基线水平与在来自疑似患有GCG相关疾病或状况，或者与这种疾病或状况相关的症状的个体的样品中测得的GCG的水平进行比较。
实施例
在对本发明进行描述前，应理解本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解本申请中所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求限制。已作出努力以确保关于所使用数字的准确性(例如数量、温度等)，但是应对一些实验误差和偏差予以考虑。除非另外指出，份数以重量份计、分子量是平均分子量、温度是摄氏度和压力是处于或接近大气压。
除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。如在本申请中所使用的，术语“约”当用于指特定列举的数值时，意味着该值可以从所列举的值变化不超过1％。例如，如在本申请中所使用的，表达“约100”包括99和101以及其间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管与本申请中所描述的那些类似或等效的任意方法和材料均能够用于实施或测试本发明，但是现在描述的是优选的方法和材料。在本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用整体并入本申请。
实施例1：抗-GCG抗体的产生
通过使用包含人GCG的免疫原免疫小鼠(即包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的经基因工程改造的小鼠)以获得抗-GCG抗体。通过GCG特异性免疫测定监测抗体的免疫应答。当产生了所需要的免疫应答时，由如US 2007/0280945A1中所描述的抗原阳性B细胞产生若干全人源抗-GCG抗体，其全部内容通过引用并入。
在下述的实施例中详细描述了根据该实施例的方法产生的示例性抗-GCG抗体的某些生物学性质。
实施例2：重链和轻链可变区的氨基酸和核酸序列
表1中列出了所选定的本发明的抗-GCG抗体的重链和轻链可变区以及CDR的氨基酸序列标识。相应的核酸序列标识如表2中所示。
表1：氨基酸序列标识
表2：核酸序列标识
在本申请中的抗体通常根据下述命名法：Fc前缀(例如“H1H”、“H1M”、“H2M”等)，随后为数字标识(例如“10223”、“10231”、“10232”等)，随后为“P”或“N”后缀，如表1和表2中所示。因此，根据这种命名法，可以将本申请中的抗体称为例如“H4H10270P”等。在本申请中使用的抗体命名中的H4H前缀表示抗体的特定Fc区同种型。例如，“H4H”抗体具有人源IgG4Fc，“H1M”抗体具有小鼠IgG1Fc和“H2M”抗体具有小鼠IgG2Fc(由抗体名称中的第一个“H”表示所有可变区是全人源的)。本领域的普通技术人员将理解，可以将具有特定Fc同种型的抗体转换为具有不同Fc同种型的抗体(例如可以将具有小鼠IgG1Fc的抗体转换为具有人源IgG4的抗体等等)，但是如论如何，以表1和2中显示的数字标识表示的可变结构域(包括CDR)将是保持不变的，并且无论Fc结构域的性质如何，预计其结合性质将是相同的或基本上相似的。
实施例2：可变基因使用分析
为了分析所产生的抗体的结构，对编码抗体可变区的核酸进行克隆和测序。根据抗体的核酸序列和预测的氨基酸序列，鉴定各重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的基因使用频率。所选定的根据本发明的抗体的基因使用频率如表3中所示。
表3
实施例3：来源于表面等离子体共振的人单克隆抗-GCG抗体的结合亲和性和动力学常数
在Biacore 4000仪器上使用实时表面等离子体共振生物传感器测定确定纯化的抗-GCG抗体结合至人GCG的平衡解离常数(KD)值。使用单克隆的小鼠抗人Fc抗体(GEHealthcare,#BR-1008-39)将Biacore传感器的表面衍生化以捕获各抗-GCG单克隆抗体。以30μL/min的流速将不同浓度的人GCG(Phoenix Pharmaceuticals,#028-02)注入捕获了抗-GCG单克隆抗体的表面。在HBST运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05％v/v表面活性剂P20)中监测4分钟GCG与所捕获的单克隆抗体的结合，同时监测10分钟解离。实验在25℃和37℃下进行。
通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件处理数据和拟合为1:1结合模型确定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。根据动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：
KD(M)＝kd/ka,和
在25℃和37℃下不同抗-GCG单克隆抗体结合至人GCG试剂的结合动力学参数分别如表4和5中所示。
表4：在25℃下抗-GCG抗体结合至人GCG的结合动力学
表5：在37℃下抗-GCG抗体结合至人GCG的结合动力学
如表4中所示，在25℃下所有抗-GCG抗体以范围从57.8pM至约715pM的KD值结合人GCG。如表5中所示，在37℃下所有抗-GCG抗体以范围从314pM至约4.78nM的KD值结合人GCG。
实施例4：使用HEK293/CRE-荧光素酶/hGCGR细胞的GCG测试
GCGR是一种G蛋白偶联受体并且其配体胰高血糖素(GCG)通过G刺激腺苷酸环化酶活性和通过Gq刺激磷酸肌醇代谢回转(Jiang和Zhang,(2003),Amer.J.Physiol.-Endocrinol.And Metabolism,1April,Vol.284,No.E671-E678)。建立一种生物测定以检测通过G的活化、随后cAMP水平的升高以及转录活化。产生稳定表达全长人GCGR(hGCGR；登记号NP000151.1的氨基酸1-477)以及荧光素酶报告子[cAMP应答元件(CRE，4X)-荧光素酶-IRES-GFP]的HEK293细胞系。分离稳定的细胞系(HEK293/CRE-luc/hGCGR细胞)并将其维持在含10％FBS、NEAA和青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的DMEM中。
对于生物测定而言，以10,000个细胞/孔的密度将HEK293/CRE-luc/hGCGR细胞接种至96孔测定板的低血清培养基(含0.1％FBS的OPTIMEM)中，并且在37℃下于5％CO2中孵育过夜。次日，按照1:3将人GCG(Phoenix Pharmaceuticals,#028-02)从10nM连续稀释至0.0002nM并加至细胞。将含有稀释缓冲液但无GCG的对照也加入一个细胞样品中。为了检测抑制情况，按照1:3将抗-GCG抗体从100nM连续稀释至0.002nM并加至含有对照样品的细胞，该对照样品不含抗体，但还有40pM恒定浓度的GCG。在37℃下于5％CO2中孵育5.5小时后，使用Victor X酶标仪(Perkin Elmer)检测荧光素酶活性。使用Prism 6软件(GraphPad)的非线性回归(4-参数logistics回归)对结果进行分析。
如表6中所示，所测试的全部10个抗-GCG抗体均抑制40pM GCG对HEK293/CRE-luc/hGCGR细胞的活化，IC50的范围从7.3pM至910pM。同种型对照抗体未显示出任何可检测的阻断并且GCG以53pM的EC50值活化HEK293/CRE-luc/hGCGR细胞系。
表6：抗-GCG抗体对HEK293/CRE-luc/hGCGR细胞GCG活化的抑制
实施例5：在2型糖尿病的体内模型饮食诱导的肥胖小鼠中单剂量H4H10223P的作用
在2型糖尿病的饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠模型中确定了单剂量的本发明的特定抗-GCG抗体H4H10223P对血糖水平的作用。DIO模型是通过从5-6周龄开始给予小鼠高脂(60％kcal)饮食(HFD)发展成的。在HFD约6周后，小鼠发展成代谢异常，包括胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受和肥胖。23只3月龄雄性C57BL/6小鼠(Taconic farms,Inc.,B6-M)从5周龄开始给予HFD并且在随后的4个月保持该饮食。在7月龄时，将小鼠分成4组，每组2至4只动物。每组单次皮下注射给予3mg/kg(n＝5)、10mg/kg(n＝3)或30mg/kg(n＝2)的H4H10223P或者30mg/kg(n＝5)不结合至任何已知的小鼠蛋白的同种型对照抗体。在抗体给药后的第2、4、7和9天时，从小鼠尾部取血。使用ACCU-Compact Plus(Roche,075177294001)确定尾部血样的血糖水平。计算各只动物在各时间点相对于对照组平均血糖水平的血糖降低百分率。计算各治疗组的平均血糖降低百分率。表7汇总了各治疗组的平均血糖水平。以血糖降低百分率(平均值±SEM)表示的结果如表8中所示。
如表7和8中所示，与注射同种型对照抗体的小鼠相比，单剂量给予小鼠30mg/kgH4H10223P在所检测的全部时间点均显示出对血糖水平的显著降低。与注射同种型对照抗体的小鼠相比，单剂量给予小鼠3mg/kg H4H10223P在第2天显示出对血糖水平的显著降低，但是在所检测的其他时间点未观察到该剂量对血糖水平的显著降低。与注射同种型对照抗体的小鼠相比，单剂量给予小鼠10mg/kg H4H10223P在第2天显示出对血糖水平的显著降低，并且在所检测的其他时间点观察到该剂量对血糖水平的降低趋势。
表7：各治疗组的血糖水平(mg/dL)
表8：与同种型对照治疗相比，各治疗组的血糖水平降低百分率
实施例6：在2型糖尿病的体内饮食诱导的肥胖小鼠模型中多剂量(慢性施用)抗-GCG抗体H4H10223P和H4H10231P的作用
在2型糖尿病的饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠模型中确定了本发明的特定抗-GCG抗体H4H10223P和H4H10231P对血糖水平的慢性作用。如上文所示，DIO模型是通过从约5-6周龄开始给予小鼠高脂(60％kcal)饮食(HFD)发展成的。
在一项实验(研究1)中，13只雄性C57BL/6小鼠(Taconic farms,Inc.,B6-M)从5周龄开始给予HFD并且在随后的21周保持该饮食。在26周龄时，将小鼠分成2组，每组5或8只动物。每5天一次，皮下注射给予各组H4H10223P(n＝5；30mg/kg)或不结合至任何已知的小鼠蛋白的同种型对照抗体(n＝8；30mg/kg)。在初始抗体给药后2、6、9、13、16和20天，从小鼠尾部取血。使用ACCU-Compact Plus(Roche,075177294001)确定尾部血样的血糖水平。计算各只动物在各时间点相对于对照组平均血糖水平的血糖降低百分率。计算各时间点H4H10223P组的平均血糖降低百分率。
表9汇总了各治疗组的平均血糖水平和H4H10223P组的平均血糖降低百分率。
在另一项实验(研究2)中，31只雄性C57BL/6小鼠从5周龄开始给予HFD并且在随后的11周保持该饮食。在16周龄时，将小鼠分成4组，每组7或8只动物。每5天一次，皮下注射给予各组H4H10223P(30mg/kg；n＝8)、H4H10231P(5或30mg/kg；n＝8)或同种型对照抗体(30mg/kg；n＝7)。在初始抗体给药后1、4、7、11、15和20天，从小鼠尾部取血。
表10汇总了各治疗组的平均血糖水平。
表11汇总了各治疗组相对于对照组平均血糖水平的平均血糖水平降低百分率。
表9：(研究1)各治疗组的血糖水平和与对照组相比H4H10223P组的血糖水平降低百分率
表10：(研究2)各治疗组的血糖水平(mg/dL)
表11：(研究2)与对照组相比各治疗组的血糖水平降低百分率
结果
如表9和10中所示，H4H10223P和H4H10231P显著降低血糖水平。在研究1中H4H10223P组的最高血糖降低百分率为31％，在研究2中H4H10223P组的最高血糖降低百分率为22％以及在研究2中H4H10231P组的最高血糖降低百分率为27％(表9和11)。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
H·冈本
J·科洛马达
<120> 抗胰高血糖素抗体及其使用方法
<130> A0010WO01
<150> 62/050,889
<151> 2014-09-16
<160> 163
<170> 用于Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgccttcagt aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggaatg ggtgacattt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaagtga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagaagca 300
gtattagctg ccctctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ala Val Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
ggattcgcct tcagtaacta tggc 24
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
atatcatatg atggaagtaa taaa 24
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
gcgaaagaag cagtattagc tgccctcttt gactac 36
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Ala Lys Glu Ala Val Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaatcagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcaacagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300
cctacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Gln Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
cagagtgttt tatacagctc caacaatcag aactac 36
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Gln Asn Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
tgggcatct 9
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Trp Ala Ser
1
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
cagcaatatt atagtactcc tacg 24
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Thr
1 5
<210> 17
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacgttcaat acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagtcaagg ggctggagtg ggtggcattt atatcaaatg ataagagtaa tacattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240
ctggaaatga acagcctgac agctgaggac acggctgttt attactgtgc gaaagagtcc 300
attttagcag ccctctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcctca 357
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Val Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Asn Asp Lys Ser Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
ggattcacgt tcaataccta tggc 24
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Gly
1 5
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
atatcaaatg ataagagtaa taca 24
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Ile Ser Asn Asp Lys Ser Asn Thr
1 5
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
gcgaaagagt ccattttagc agccctcttt gactac 36
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ttacttagct 120
tggtaccaac agaaaccaag acagcctctt aaactactca tttactgggc atctattcgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatt ttatagtgtt 300
cccacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln
35 40 45
Pro Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Ser Val Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
cagagtgttt tatacagctc caacaataag aattac 36
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
tgggcatct 9
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Trp Ala Ser
1
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
cagcaatttt atagtgttcc cact 24
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Gln Gln Phe Tyr Ser Val Pro Thr
1 5
<210> 33
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacgtttagt acctttggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagtcaagg ggctggagtg ggtggctttt atatcaaatg ataagaataa taaattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaggga cacgctatat 240
ctgcaaatga acagcctgac acctgaggac acggctgttt attactgtgc gaaagagtcc 300
attttagcag ccctctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Val Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Asn Asp Lys Asn Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
ggattcacgt ttagtacctt tggc 24
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe Gly
1 5
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
atatcaaatg ataagaataa taaa 24
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Ile Ser Asn Asp Lys Asn Asn Lys
1 5
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
gcgaaagagt ccattttagc agccctcttt gactac 36
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataaaaa ttacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctctt aaacttctca tttactgggc atctattcgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatt ttatactgtt 300
cccacttttg gcctggggac caagctggag atcaaa 336
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Thr Val Pro Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 43
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
cagagtgttt tatacagctc caacaataaa aattac 36
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
tgggcatct 9
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Trp Ala Ser
1
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
cagcaatttt atactgttcc cact 24
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Gln Gln Phe Tyr Thr Val Pro Thr
1 5
<210> 49
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggatt caccttcagg aactatgaca tgcactgggt ccgccaggct 120
cctggcaagg ggctggaatg ggtggcagtt acatcatctg atggacttaa taaattctat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtct 240
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<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Ser Ser Asp Gly Leu Asn Lys Phe Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
ggattcacct tcaggaacta tgac 24
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Asp
1 5
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
acatcatctg atggacttaa taaa 24
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
Thr Ser Ser Asp Gly Leu Asn Lys
1 5
<210> 55
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
gcgaaagagt ccattttagc agccctcttt gactac 36
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttggct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctct tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaaca ttatactact 300
cccacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336
<210> 58
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
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100 105 110
<210> 59
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
cagagtgttt tatacagctc caacaataag aactac 36
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 61
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
tgggcatct 9
<210> 62
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 62
Trp Ala Ser
1
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 63
cagcaacatt atactactcc cact 24
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 64
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Thr
1 5
<210> 65
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 65
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccagact 120
ccgggcaagg ggctggagtg ggtggcattt atatcatatg atggaaataa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagagtcc 300
attttagcag ccctctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 66
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 67
ggattcacct tcagtagcta tggc 24
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 69
atatcatatg atggaaataa taaa 24
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys
1 5
<210> 71
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
gcgaaagagt ccattttagc agccctcttt gactac 36
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 73
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaacctgg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca ctttattact gtcaacaata ttataatact 300
cccacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336
<210> 74
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 75
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
cagagtgttt tatacagctc caacaataag aactac 36
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 77
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
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<211> 3
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
Trp Ala Ser
1
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
caacaatatt ataatactcc cact 24
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Thr
1 5
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<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagtcaagg ggctggagtg ggtggcattt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctccaaatga acagcctgac agctgaggac acggctgttt attactgtgc gaaagagtcc 300
attttagcag ccctctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Val Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
atatcatatg atggaagtaa taaa 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 88
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 89
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagttcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccaag acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctattcgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cattctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatt ttatagtatt 300
cccacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 90
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Ser Ile Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 91
cagagtgttt tatacagttc caacaataag aactac 36
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 92
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
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<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 93
tgggcatct 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 94
Trp Ala Ser
1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 95
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<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 96
Gln Gln Phe Tyr Ser Ile Pro Thr
1 5
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<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagtcaagg ggctggagtg ggtggcattt atatcaaatg ataaaagtaa taaatattat 180
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Val Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Asn Asp Lys Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 99
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 100
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 101
atatcaaatg ataaaagtaa taaa 24
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 102
Ile Ser Asn Asp Lys Ser Asn Lys
1 5
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 103
gcgaaagagt ccattttagc agccctcttt gactat 36
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 105
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 105
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccaag acagcctcct aagctactca tttactgggc atctattcgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaacaatt ttatagtgtt 300
cccacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336
<210> 106
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 106
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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100 105 110
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 107
cagagtgttt tatacagctc caacaataag aactac 36
<210> 108
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 108
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
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<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 109
tgggcatct 9
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 110
Trp Ala Ser
1
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 111
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<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 112
Gln Gln Phe Tyr Ser Val Pro Thr
1 5
<210> 113
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 113
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 114
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Val Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 115
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 115
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 116
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 117
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 118
Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 119
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 119
gcgaaagagt ccattttagc agccctcttt gactac 36
<210> 120
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 120
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 121
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 121
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccaag acagcctcct aacctgctca tttactgggc atctattcgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca ttttattact gtcagcaatt ttatagtatt 300
cccacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 122
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln
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Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val
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Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Ser Ile Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 123
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 123
cagagtgttt tatacagctc caacaataag aactac 36
<210> 124
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 124
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 125
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 125
tgggcatct 9
<210> 126
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 126
Trp Ala Ser
1
<210> 127
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 127
cagcaatttt atagtattcc cact 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 128
Gln Gln Phe Tyr Ser Ile Pro Thr
1 5
<210> 129
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 129
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagg acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagtcaagg ggctggagtg ggtggcattt atatcaaagg atggaagtga taaatactat 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240
ctgcaaatga acagcctgac agctgaggac acggctgttt attattgtgc gaaagagtcc 300
attttagcag ccctctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcctca 357
<210> 130
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Val Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Lys Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 131
ggattcacct ttaggaccta tggc 24
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 132
Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Gly
1 5
<210> 133
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 133
atatcaaagg atggaagtga taaa 24
<210> 134
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 134
Ile Ser Lys Asp Gly Ser Asp Lys
1 5
<210> 135
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 135
gcgaaagagt ccattttagc agccctcttt gactac 36
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 136
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 137
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 137
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccaag acagcctcct aaactcctca tttactgggc atctaatcgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatt ttatagtgtt 300
cccacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336
<210> 138
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 138
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Ser Val Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 139
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 139
cagagtgttt tatacagctc caacaataag aactac 36
<210> 140
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 140
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 141
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 141
tgggcatct 9
<210> 142
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 142
Trp Ala Ser
1
<210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 143
cagcaatttt atagtgttcc cact 24
<210> 144
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 144
Gln Gln Phe Tyr Ser Val Pro Thr
1 5
<210> 145
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 145
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagtcaagg ggctggagtg ggtggcattt atatcaaatg ataaaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgac agctgaggac acggctgttt attactgtgc gaaagagtcc 300
attttagcag ccctctttga ctcctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 146
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 146
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Val Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Asn Asp Lys Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 147
ggattcacct ttagtagcta tggc 24
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 148
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 149
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 149
atatcaaatg ataaaagtaa taaa 24
<210> 150
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 150
Ile Ser Asn Asp Lys Ser Asn Lys
1 5
<210> 151
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 151
gcgaaagagt ccattttagc agccctcttt gactcc 36
<210> 152
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 152
Ala Lys Glu Ser Ile Leu Ala Ala Leu Phe Asp Ser
1 5 10
<210> 153
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 153
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccaag acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctattcgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg gggcagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctgc agatgtggca gtttattact gtcagcaatt ttatagtgtt 300
cccacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336
<210> 154
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 154
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Ala Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Ser Val Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 155
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 155
cagagtgttt tatacagctc caacaataag aactac 36
<210> 156
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 156
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 157
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 157
tgggcatct 9
<210> 158
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 158
Trp Ala Ser
1
<210> 159
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 159
cagcaatttt atagtgttcc cact 24
<210> 160
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 160
Gln Gln Phe Tyr Ser Val Pro Thr
1 5
<210> 161
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCG 成熟肽: NP_002045.1的氨基酸53-81
<400> 161
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 162
<211> 2076
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCSK9 DNA
<400> 162
datgggcacc gtcagctcca ggcggtcctg gtggccgctg ccactgctgc tgctgctgct 60
gctgctcctg ggtcccgcgg gcgcccgtgc gcaggaggac gaggacggcg actacgagga 120
gctggtgcta gccttgcgtt ccgaggagga cggcctggcc gaagcacccg agcacggaac 180
cacagccacc ttccaccgct gcgccaagga tccgtggagg ttgcctggca cctacgtggt 240
ggtgctgaag gaggagaccc acctctcgca gtcagagcgc actgcccgcc gcctgcaggc 300
ccaggctgcc cgccggggat acctcaccaa gatcctgcat gtcttccatg gccttcttcc 360
tggcttcctg gtgaagatga gtggcgacct gctggagctg gccttgaagt tgccccatgt 420
cgactacatc gaggaggact cctctgtctt tgcccagagc atcccgtgga acctggagcg 480
gattacccct ccacggtacc gggcggatga ataccagccc cccgacggag gcagcctggt 540
ggaggtgtat ctcctagaca ccagcataca gagtgaccac cgggaaatcg agggcagggt 600
catggtcacc gacttcgaga atgtgcccga ggaggacggg acccgcttcc acagacaggc 660
cagcaagtgt gacagtcatg gcacccacct ggcaggggtg gtcagcggcc gggatgccgg 720
cgtggccaag ggtgccagca tgcgcagcct gcgcgtgctc aactgccaag ggaagggcac 780
ggttagcggc accctcatag gcctggagtt tattcggaaa agccagctgg tccagcctgt 840
ggggccactg gtggtgctgc tgcccctggc gggtgggtac agccgcgtcc caacgccgcc 900
tgccagcgcc tggcgagggc tggggtcgtg ctggtcaccg ctgccggcaa cttccgggac 960
gatgcctgcc tctactcccc agcctcagct cccgaggtca tcacagttgg ggccaccaat 1020
gcccaggacc agccggtgac cctggggact ttggggacca actttggccg ctgtgtggac 1080
ctctttgccc caggggagga catcattggt gcctccagcg actgcagcac ctgctttgtg 1140
tcacagagtg ggacatcaca ggctgctgcc cacgtggctg gcattgcagc catgatgctg 1200
tctgccgagc cggagctcac cctggccgag ttgaggcaga gactgatcca cttctctgcc 1260
aaagatgtca tcaatgaggc ctggttccct gaggaccagc gggtactgac ccccaacctg 1320
gtggccgccc tgccccccag cacccatggg gcaggttggc agctgttttg caggactgtg 1380
tggtcagcac actcggggcc tacacggatg gccacagcca tcgcccgctg cgccccagat 1440
gaggagctgc tgagctgctc cagtttctcc aggagtggga agcggcgggg cgagcgcatg 1500
gaggcccaag ggggcaagct ggtctgccgg gcccacaacg cttttggggg tgagggtgtc 1560
tacgccattg ccaggtgctg cctgctaccc caggccaact gcagcgtcca cacagctcca 1620
ccagctgagg ccagcatggg gacccgtgtc cactgccacc aacagggcca cgtcctcaca 1680
ggctgcagct cccactggga ggtggaggac cttggcaccc acaagccgcc tgtgctgagg 1740
ccacgaggtc agcccaacca gtgcgtgggc cacagggagg ccagcatcca cgcttcctgc 1800
tgccatgccc caggtctgga atgcaaagtc aaggagcatg gaatcccggc ccctcaggag 1860
caggtgaccg tggcctgcga ggagggctgg accctgactg gctgcagtgc cctccctggg 1920
acctcccacg tcctgggggc ctacgccgta gacaacacgt gtgtagtcag gagccgggac 1980
gtcagcacta caggcagcac cagcgaagag gccgtgacag ccgttgccat ctgctgccgg 2040
agccggcacc tggcgcaggc ctcccaggag ctccag 2076
<210> 163
<211> 693
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PCSK9 aa
<400> 163
Pro Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln
20 25 30
Glu Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser
35 40 45
Glu Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr
50 55 60
Phe His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val
65 70 75 80
Val Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala
85 90 95
Arg Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile
100 105 110
Leu His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser
115 120 125
Gly Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile
130 135 140
Glu Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu
145 150 155 160
Arg Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp
165 170 175
Gly Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser
180 185 190
Asp His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn
195 200 205
Val Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys
210 215 220
Asp Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala
225 230 235 240
Gly Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys
245 250 255
Gln Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile
260 265 270
Arg Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu
275 280 285
Pro Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg
290 295 300
Leu Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg
305 310 315 320
Asp Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr
325 330 335
Val Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu
340 345 350
Gly Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp
355 360 365
Ile Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser
370 375 380
Gly Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met
385 390 395 400
Leu Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu
405 410 415
Ile His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu
420 425 430
Asp Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser
435 440 445
Thr His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala
450 455 460
His Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Ile Ala Arg Cys Ala Pro
465 470 475 480
Asp Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg
485 490 495
Arg Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala
500 505 510
His Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys
515 520 525
Leu Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu
530 535 540
Ala Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu
545 550 555 560
Thr Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys
565 570 575
Pro Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His
580 585 590
Arg Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu
595 600 605
Cys Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr
610 615 620
Val Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro
625 630 635 640
Gly Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val
645 650 655
Val Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Glu Ala
660 665 670
Val Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala
675 680 685
Ser Gln Glu Leu Gln
690

Claims (25)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合至并且中和GCG活性，其中所述抗体或其片段显示出一个或多个下述特征：
(a)是全人源单克隆抗体；
(b)根据表面等离子体共振测定在25℃时以小于约1nM的KD和在37℃时以小于约5nM的KD与人GCG结合；
(c)当作为单一剂量，或作为小于约40mg/kg的多剂量向哺乳动物施用时，血糖水平降低至少约10％；
(d)以小于约1nM的IC50抑制GCG介导的表达人胰高血糖素受体(GCGR)的细胞的活化；
(e)包含重链可变区(HCVR)，所述重链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130和146；或者
(f)包含轻链可变区(LCVR)，所述轻链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138和154。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中根据表面等离子体共振测定所述抗体在25℃时以范围从约50pM至约750pM的KD和在37℃时以范围从约300pM至约5nM的KD与人GCG结合。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中当作为单一剂量，或作为范围从约3mg/kg至约30mg/kg的多剂量向哺乳动物施用时，所述抗体使血糖水平降低约10％至约35％。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以范围从约7pM至约950pM的IC50抑制GCG介导的表达人胰高血糖素受体(GCGR)的细胞的活化。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中当皮下、静脉内或肌内施用时，所述抗体或其抗原结合片段降低哺乳动物的血糖水平。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段降低哺乳动物的血糖水平，所述哺乳动物患有与高血糖水平相关或其特征部分为高血糖水平的状况或疾病。
7.根据权利要求6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述与高血糖水平相关或其特征部分为高血糖水平的状况或疾病选自下组：糖尿病、葡萄糖耐量受损、肥胖、高血糖症、高血糖高渗性综合征、围手术期高血糖症、重症监护室患者的高血糖症、高胰岛素血症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合征和空腹血糖受损。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链互补性决定区包含在选自下组的重链可变区(HCVR)氨基酸序列中：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130和146；以及(b)三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述轻链CDR包含在选自下组的轻链可变区(LCVR)氨基酸序列中：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138和154。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130和146；以及所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：10、26、42、58、74、90、106、122、138和154。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：2/10；18/26；34/42；50/58；66/74；82/90；98/106；114/122；130/138和146/154。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132和148；
(b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134和150；
(c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136和152；
(d)LCDR1结构域，所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140和156；
(e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142和158；以及
(f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144和160。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；
(b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列；
(c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；
(d)LCDR1结构域，所述LCDR1结构域包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列；
(e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列；以及
(f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-11中任意一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列；
(b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；
(c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列；
(d)LCDR1结构域，所述LCDR1结构域包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；
(e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；以及
(f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列。
14.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段与包含选自下组的重链和轻链序列对的抗体或抗原结合片段竞争与GCG的特异性结合：SEQ ID NO：2/10；18/26；34/42；50/58；66/74；82/90；98/106；114/122；130/138和146/154。
15.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段与包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参照抗体结合至GCG上的相同表位：SEQ ID NO：2/10；18/26；34/42；50/58；66/74；82/90；98/106；114/122；130/138和146/154。
16.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求1-13中任意一项所述的与人GCG特异性结合的单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含(a)重链可变区(HCVR)的互补性决定区(CDR)，所述重链可变区(HCVR)具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130和146；以及(b)轻链可变区(LCVR)的CDR，所述轻链可变区具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138和154。
17.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求1-13中任意一项所述的人抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含HCVR和LCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130和146；以及所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138和154。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-15中任意一项所述的与GCG结合的分离的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂。
19.一种用于降低血糖水平，或者用于治疗与高血糖水平相关或其特征部分为高血糖水平的状况或疾病，或与所述状况或疾病相关的至少一种症状或并发症的方法，所述方法包括向需要其的患者施用如权利要求18所述的药物组合物，以降低血糖水平或调节所述状况或疾病，或减轻或降低与所述状况或疾病相关的至少一种症状或并发症的严重程度。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述状况或疾病选自下组：糖尿病、葡萄糖耐量受损、肥胖、肾病、神经病、视网膜病、白内障、中风、动脉粥样硬化、伤口愈合受损、糖尿病性酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高渗性综合征、围手术期高血糖症、重症监护室患者的高血糖症、烧伤患者或者患有心肌梗死或其他心脏病的患者的高血糖症、高胰岛素血症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合征和空腹血糖受损。
21.根据权利要求19所述的方法，其中向所述患者施用的所述药物组合物与第二治疗剂联用。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二治疗剂选自下组：胰岛素、双胍类(二甲双胍)、磺酰脲类(例如格列本脲、格列吡嗪)、PPARγ激动剂(例如吡格列酮、罗格列酮)、α葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖、伏格列波糖)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)激动剂或类似物(例如艾塞那肽、利拉鲁肽、阿必鲁肽、杜拉格肽、利西拉来)、二肽基肽酶IV(DPP-4)抑制剂(例如沙格列汀、西格列汀、维格列汀)、钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)(例如卡格列净、达格列净、恩格列净、吡格列净、托格列净)、普兰林肽、胰高血糖素受体拮抗剂以及第二GCG拮抗剂。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二治疗剂是3-羟基-3-甲基-戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)抑制剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中HMG-CoA还原酶抑制剂是他汀类，所述他汀类选自下组：阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二治疗剂选自下组：与血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)、血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)、血管生成素样蛋白5(ANGPTL5)、血管生成素样蛋白6(ANGPTL6)、血管生成素样蛋白8(ANGPTL8)和人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段。
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