CN102482350A - 作用于胰高血糖素受体的抗体及其应用 - Google Patents

作用于胰高血糖素受体的抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了免疫组合物，以及使用作用于胰高血糖素受体的抗体降低胰高血糖素信号转导活性的方法。

Description

作用于胰高血糖素受体的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及与作用于胰高血糖素受体的抗体及这些抗体的衍生物相关的组合物和方法。本发明进一步涉及用于这种方法中的药物组合物及衍生物。更具体地，本发明涉及可特异结合胰高血糖素受体的单克隆抗体和多克隆抗体及其片段的生产、诊断应用和治疗应用。
背景技术
控制不佳的II型糖尿病患者的空腹高血糖(fastinghyperglycemia)与葡萄糖生成速率的增加密切相关，反过来又可归因于糖原异生速率的增加。多项研究已经证明，升高的胰高血糖素水平部分是由II型糖尿病患者体内增加的肝葡萄糖生成(hepatic glucoseproduction)造成的。
胰高血糖素为胰腺α细胞中含29个氨基酸的激素，其对胰岛素作用具有重要的反向调节功能。禁食期间，胰高血糖素分泌增加以响应循环中的低葡萄糖水平。增加的胰高血糖素分泌通过促进肝糖原异生和糖原分解刺激了葡萄糖的生成。此外，胰高血糖素降低了肝脏中糖原的合成。临床上，对具有显著低血糖症发病风险的患者施用胰高血糖素。相反，胰高血糖素通路的抑制可能为治疗II型糖尿病提供方案。
胰高血糖素的生物学效应是通过其结合到细胞表面上的特定受体--胰高血糖素受体，并随后激活信号转导通路而介导的。胰高血糖素受体属于G-蛋白偶联受体(GPCR)的B家族。它主要表达于肝脏和肾脏中，这反映了其在这些组织中作为葡萄糖排出和糖原异生调节剂的主要作用。肝脏中胰高血糖素受体的激活刺激了腺苷酸环化酶的活性和磷酸肌醇的周转(turnover)，导致几种关键的糖原异生酶的表达增加。
考虑到胰高血糖素在控制高血糖中的关键作用，抑制胰高血糖素激活途径的方案可提供治疗II型糖尿病的方法。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供作用于胰高血糖素受体的抗体。
本发明的另一个目的是提供重组载体、宿主细胞、分离的细胞系和用于生产该抗体的杂交瘤细胞。
本发明的再一个目的是提供含有所述抗体的药物组合物。
本发明的又一个目的是提供利用这些抗体治疗II型糖尿病及相关疾病的方法。
技术方案
本发明的一个方面涉及能够特异性结合胰高血糖素受体的分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物。
在一个实施方案中，本发明提供分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物，包括：
(a)第一组CDR，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含重链CDR的氨基酸序列，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示的氨基酸序列；
(b)第二组CDR，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含轻链CDR的氨基酸序列，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No.18、20、22、24、26、28和30中任一所示的氨基酸序列；或，
(c)(a)中所述的第一组CDR和(b)中所述的第二组CDR的组合。
在一个优选实施方案中，所述抗体包括重链或轻链，或两者，其中所述重链包括选自下组的重链可变区：HC1(SEQ ID No.2)、HC2(SEQ ID No.4)、HC3(SEQ ID No.6)、HC4(SEQ ID No.8)、HC5(SEQID No.10)、HC6(SEQ ID No.12)、HC7(SEQ ID No.14)、HC8(SEQ IDNo.16)及其抗原结合片段；且所述轻链包括选自下组的轻链可变区：LC1(SEQ ID No.18)、LC2(SEQ ID No.20)、LC3(SEQ ID No.22)、LC4(SEQ ID No.24)、LC5(SEQ ID No.26)、LC6(SEQ ID No.28)、LC7(SEQ ID No.30)及其抗原结合片段。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体选自下组：
(a)包括如SEQ ID No.2和SEQ ID No.18中所示氨基酸序列的抗体(Ab1)；
(b)包括如SEQ ID No.4和SEQ ID No.20中所示氨基酸序列的抗体(Ab2)；
(c)包括如SEQ ID No.6和SEQ ID No.22中所示氨基酸序列的抗体(Ab3)；
(d)包括如SEQ ID No.8和SEQ ID No.24中所示氨基酸序列的抗体(Ab4)；
(e)包括如SEQ ID No.6和SEQ ID No.26中所示氨基酸序列的抗体(Ab5)；
(f)包括如SEQ ID No.10和SEQ ID No.26中所示氨基酸序列的抗体(Ab6)；
(g)包括如SEQ ID No.12和SEQ ID No.28中所示氨基酸序列的抗体(Ab7)；
(h)包括如SEQ ID No.14和SEQ ID No.30中所示氨基酸序列的抗体(Ab8)；
(i)包括如SEQ ID No.16和SEQ ID No.26中所示氨基酸序列的抗体(Ab9)；以及，
(j)包括如SEQ ID No.10和SEQ ID No.22中所示氨基酸序列的抗体(Ab10)。
在另一个方面，本发明涉及竞争结合胰高血糖素受体的分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物。
在一个实施方案中，分离的抗原结合剂以与参考抗体基本上相同的Kd结合到人胰高血糖素受体上，或者以与参考抗体基本上相同的IC50抑制受体的胰高血糖素刺激作用，或与参考抗体竞争结合受体。
在另一个方面，本发明涉及分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物，包括：
(a)第一组CDR，CDR1、CDR2和CDR3依次一起与重链CDR的氨基酸序列具有至少85％的一致性，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示的氨基酸序列；
(b)第二组CDR，CDR1、CDR2和CDR3依次一起与轻链CDR的氨基酸序列具有至少85％的一致性，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No.18、20、22、24、26、28和30中任一所示的氨基酸序列；或，
(c)(a)中所述的第一组CDR和(b)中所述的第二组CDR的组合，
其中所述抗体或抗原结合部位或衍生物与胰高血糖素竞争结合胰高血糖素受体。
所述抗体可包括含有可变区的重链，该可变区含有的氨基酸序列与选自SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％和最优选99％的一致性。此外，所述抗体可包括含有可变区的轻链，该可变区含有的氨基酸序列与选自SEQ ID No.18、20、22、24、26、28或30的氨基酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％和最优选99％的一致性。
在另一个方面，本发明提供分离的抗体或抗原结合部位，包括选自下组的氨基酸序列：
(a)通过氨基酸的添加、缺失和/或非保守替换，与选自SEQ IDNo.2、4、6、8、10、12、14和16的CDR3序列差异总共不超过3个氨基酸的重链CDR3序列；
(b)通过氨基酸的添加、缺失和/或非保守替换，与选自SEQ IDNo.18、20、22、24、26、28和30的CDR3序列差异总共不超过3个氨基酸的轻链CDR3序列；
(c)(a)中所述的重链CDR3序列和(b)中所述的轻链CDR3序列的组合，
其中所述抗体或抗原结合部位与胰高血糖素受体结合。
本发明的另一个方面涉及含有抗体或其功能片段以及药用载体的药物组合物。本发明的组合物包括重链和/或轻链，其可变域，或其抗原结合部位，或编码所述抗体、抗体链或其可变域的核酸分子，以及与一种或多种药用载体或融合伴侣形成的混合物。本发明的组合物可进一步包括其它组分，如治疗剂或诊断剂。
本发明又一个方面涉及含有编码所述抗体的轻链可变域、重链可变域或两者的多核苷酸序列的分离的核酸。所述核酸可包括一种或多种如SEQ ID No.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27和29所示的核苷酸序列。
本发明的另一个方面涉及重组表达载体，其含有参考序列的核酸。
本发明的另一个方面涉及宿主细胞，其通过用所述载体转化得到。
本发明的另一个方面涉及分离细胞系，其生产所述抗体、或其重链或轻链或抗原结合部位。
本发明的另一个方面涉及杂交瘤细胞，其生产所述抗体、或其重链或轻链或抗原结合部位。
本发明的另一个方面涉及用于降低血糖、改善糖耐量或用于治疗、预防或抑制患病个体中II型糖尿病、血脂异常或相关疾病的方法，其包括向个体施用所述抗体或抗原结合部位或其衍生物，或所述药物组合物的步骤。所述胰高血糖素受体抗体可以单独施用，或与其它抗体或其它药物联合施用。
有益效果
本发明提供基于干扰胰高血糖素受体激活的组合物和方法，包括但不限于通过结合胰高血糖素受体的胞外部分。本发明所述的拮抗剂提供用于靶向与糖尿病及相关疾病有关的生理状况的重要治疗剂和诊断剂。因此，本发明提供与调节胰高血糖素受体通路相关的方法、组合物、试剂盒及生产的制品。
附图说明
图1表明选定抗体与表达于细胞表面的胰高血糖素受体结合的能力。将不同量的抗体添加到表达全长人胰高血糖素受体的CHO细胞中。洗涤后，用HRP标记的抗人抗体检测仍保留于细胞上的抗体，随后通过添加底物来显示HRP活性。
图2表明对于胰高血糖素刺激，作用于胰高血糖素受体的抗体抑制了cAMP的产生。将表达全长人胰高血糖素受体的稳定的细胞系与不同量的抗体孵育。15分钟后，向细胞中添加100pM胰高血糖素，并使用cAMP HTRF试剂盒(CIS Bio)测定cAMP的水平。重复样本的平均值和标准偏差如图所示。
图3-图5显示了分离的抗胰高血糖素受体抗体的轻链和重链可变域的预测氨基酸序列。下划线序列从左至右表示CDR1、CDR2和CDR3。
图6显示了以1mg/kg和7mg/kg注射选定抗体(Ab7)的高脂肪诱导肥胖小鼠的血糖水平。单次注射抗体或缓冲液对照后，在第0、1、2、3和10天测定血糖。数值为根据每组9-10只小鼠计算的平均值和标准偏差。
图7显示了高脂肪诱导的肥胖小鼠的空腹血糖水平和基础肝葡萄糖生成(HGP)率。采用放射性同位素稀释法测定基础HGP(Choi C.S.等，Proc Natl Acad Sci U-S-A，2007，104：16480-85)。与赋形剂注射组相比，以7mg/kg注射Ab7的小鼠空腹血糖和基础HGP率显著下降，而两组的基础葡萄糖清除率无差异。数据表示为每组10只小鼠的平均值+/-SEM。
具体实施方式
定义
本文中使用的术语“抗体”是指由一种或多种基本上由公认的免疫球蛋白基因的全部或部分编码的多肽组成的蛋白。公认的免疫球蛋白基因，例如在人体内，包括由κ、λ和重链遗传座位，其共同包含无数个可变区基因和恒定区基因。其中，“抗体”可以指“特定抗原结合剂”。本领域技术人员会易于知晓，所述抗体可用作治疗剂或诊断剂，因此，也可将“抗体”称为“治疗剂”或“诊断剂”。
本文中使用的“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合胰高血糖素受体的分离抗体基本上不含特异性结合除了胰高血糖素受体以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合胰高血糖素受体的分离抗体，对其它抗原如来自其它物种的胰高血糖素受体具有交叉反应。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。此外，分离的抗体，例如分离的人类抗体，可为嵌合抗体，其中，例如，可变区、CDR域或不同人源的同种抗体被移植到该亲本人类抗体上。
术语用于胰高血糖素受体的“中和抗体”是指根据检测，可抑制胰高血糖素受体的胰高血糖素依赖性刺激至少约10～120％，优选至少30％、50％、70％、80％、90％、100％或以上的抗体。优选通过至少一种如本文中所述的和/或本领域已知的以细胞为基础的合适检测来评估胰高血糖素受体抗体抑制胰高血糖素信号转导的能力。一个实例为，使用试剂盒，如cAMP HTRF试剂盒(CisBio)来测定由于胰高血糖素刺激而产生的cAMP。
本文中使用的术语“保守氨基酸替换”是指将氨基酸残基替换成具有类似的或更佳的(为了预期目的)功能和/或化学特性的氨基酸残基，这是本领域普通技术人员应知晓的。保守氨基酸替换往往是氨基酸残基被替换成带有类似侧链的氨基酸残基。带有类似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有定义。例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸为碱性侧链，天门冬氨酸和谷氨酸为酸性侧链，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸为不带电荷的极性侧链，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸为非极性侧链，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸为芳香族侧链。用通常相似理化性质的氨基酸进行的替换使得该替换不会本质上改变肽、多肽或蛋白的特性或活性。
两条氨基酸序列之间的一致性百分率是两条序列共有的氨基酸位置数量的函数(即相同氨基酸位置数量除以位置总数乘以100)，考虑到空位数量以及每个空位的长度，需引入它们用于两条序列的最佳比对。本发明的抗体还包括那些VH和/或VL中的框架残基被修饰以改善抗体的一种或多种属性的抗体。通常，这种框架的修饰用于降低免疫原性或改善抗体的稳定性。
除了在框架区或CDR区内进行修饰，对本发明的抗体的改造也可包括在Fc区的修饰，通常是改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。抗体片段或衍生剂是抗体的一部分，或是不同形式的含有抗原结合部位，及任选地可使抗原结合蛋白的抗原结合部位结合抗原的骨架或框架部位的抗体一部分。例如，可进行框架或CDR中的变化，如氨基酸替换、缺失或添加，然而仍保持其抗原结合的能力。或者，本发明的抗原结合部位可以进行衍生或与另一个分子(例如其它肽、蛋白、聚合物或化学物质)相连。
抗体的抗原结合部位可被修饰成单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段(带有VL、CL、VH和CH1的单价片段)、F(ab′)2片段(由二硫桥连接的两个Fab片段)、Fd(VH和CH1域)、scFv(VL和VH通过接头连接)、域抗体、双特异性抗体、微型抗体、scab(含有VH和VL以及CL或CH1的抗体片段)、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、Ig3抗体、IgG4抗体或抗体恒定域的任意衍生物和基于蛋白骨架的人工抗体，包括但不限于，纤维连接蛋白型、高亲和性多聚体(avimers)或细胞色素B。
发明详述
本发明提供作用于胰高血糖素受体的分离的重组体和/或合成的抗体，以及组合物和含有编码至少一种抗胰高血糖素受体抗体的至少一种多核苷酸的核酸分子。本发明提供基于但不限于通过与胰高血糖素受体的胞外部分结合而干扰胰高血糖素受体信号转导的组合物和方法。本发明所述的拮抗剂提供用于靶向与糖尿病及相关疾病有关的生理状况的重要治疗剂和诊断剂。因此，本发明提供与调节胰高血糖素受体通路相关的方法、组合物、试剂盒及生产的制品。
在一个方面，本发明提供适合治疗使用的且能够不同程度破坏胰高血糖素受体信号转导通路的抗胰高血糖素受体治疗剂。例如，本发明提供作用于胰高血糖素受体的人类抗体及其衍生物和片段，其含有编码能够结合胰高血糖素受体的全部或部分多肽的多核苷酸序列，如编码全部或部分抗胰高血糖素受体抗体、抗体片段或抗体衍生物的核酸。
在一个实施方案中，本发明的抗体为抑制人胰高血糖素和胰高血糖素受体结合的人类抗体。例如，本发明的抗体以低于1μM，优选低于100nM，更优选10nM，最优选1nM的IC50值抑制胰高血糖素结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体为依赖胰高血糖素来抑制cAMP信号转导的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的胰高血糖素受体特异性抗体分子，其包括含有与公开的抗体相应氨基酸序列同源的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区，其中所述抗体分子通过胰高血糖素受体抑制胰高血糖素介导的信号转导。例如，重链可变域可包括与选自SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14和16的重链可变域序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％一致性的氨基酸序列。此外，轻链可变域可包括与选自SEQ ID No.18、20、22、24、26、28和30的轻链可变域序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％一致性的氨基酸序列。具体的实施方案为包括分别与公开的重链和/或轻链可变区至少85％，优选90％，更优选95％，最优选99％同源的重链和/或轻链可变区的拮抗剂。
在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包括选自由SEQ IDNos.中所示的重链和轻链构成的组合中的轻链可变域和重链可变域的组合。在一个具体实施方案中，本发明提供分离的抗体分子，其含有如SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30所示的重链和/或轻链可变域序列的变体(variant)及其保守改造。在另一个实施方案中，本发明包括通过由来自如SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30所示的各轻链和重链序列的可变域任意组合形成的抗体，以及在任一个或多个CDR序列中发生一个或多个保守氨基酸替换的其等价物，具体的实施方案为抑制胰高血糖素受体信号转导通路的胰高血糖素依赖性激活的抗体。
本发明还提供包括与另一种异源多肽或聚合物连接或融合的胰高血糖素受体拮抗剂的嵌合分子。例如，已知用于从目标抗体中衍生出不同亚类或同种抗体的技术，即亚类转换(subclass switching)。这些抗体包括人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合的抗体片段，如F(ab′)2、Fab、Fv、Fab′、Fc和Fd片段，且它们可被整合至单域抗体中，如单链抗体、大抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、细胞内抗体(intrabodies)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、vNAR和双scFv(bisscFv)(Hollinger，P.and Hudson，P.J.，2005，Nat Biotech，23：112636)。
在其它实施方案中，本发明的抗体、片段和衍生物可与其它多肽或化学物质融合。融合伴侣可以为肽、蛋白或抗体衍生物，其具有与其它蛋白特异结合活性，以产生双特异性或多特异性分子或改善分子的理化性质。此外，可对抗体进行以下修饰：糖基化、聚乙二醇化、交联或与其它蛋白或化学物质结合。抗体的氨基酸可被非天然氨基酸取代。
胰高血糖素受体抗体可携带或与毒素、放射性同位素、放射性核素、脂质体、靶向基团、生物传感器、阳离子尾链(cationic tail)或酶结合。这类拮抗剂组合物构成本发明的另一个方面。
在某些情况下，得到不干预配体(如胰高血糖素)与受体结合的胰高血糖素受体拮抗剂抗体可能是有利的。因此，在一个实施方案中，本发明提供不结合胰高血糖素受体上胰高血糖素结合位点的抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗体不明显地抑制胰高血糖素与胰高血糖素受体的结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体不明显地与胰高血糖素竞争结合胰高血糖素受体。
在另一个方面，本发明提供本发明的胰高血糖素受体拮抗剂抗体在制备治疗和/或预防性治疗疾病如糖尿病的药剂中的应用。
在另一个方面，本发明提供本发明的表达载体在制备治疗和/或预防性治疗疾病如糖尿病的药剂中的应用。
在另一个方面，本发明提供本发明的宿主细胞在制备治疗和/或预防性治疗疾病如糖尿病的药剂中的应用。
在进一步的方面，本发明提供本发明生产的制品在制备治疗和/或预防性治疗疾病如糖尿病的药剂中的应用。
本发明还提供含有本发明的抗体或其抗原结合部位及药用载体的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物进一步包括至少一种用于治疗疾病的其它治疗剂，在所述疾病中胰高血糖素受体激活是不利的。
本发明的抗体和抗原结合部位可被掺入到适于对个体施用的药物组合物中。通常，所述药物组合物包括本发明的抗体或抗原结合部位及药用载体。本文中使用的“药用载体”包括生理相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。药用载体的实例包括水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、右旋糖(dextrose)、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。在许多情况下，组合物中优选地包括等渗剂，例如，糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。药用载体可进一步包括少量的能够提高保质期或者抗体或抗原结合部位有效性的辅助物质，如润湿剂或乳化剂，防腐剂或缓冲液。
本发明的组合物可以为各种形式。这些形式包括，例如，液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射的及可输注的溶液(infusible solutions))、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于给药和治疗应用的目标模式。通常优选的组合物为可注射或输注的溶液，如类似于那些用其它抗体被动免疫人类的组合物。
尽管对于许多治疗应用而言，优选的给药途径/模式为皮下注射、静脉注射或输注，但是本发明的抗体和抗原结合部位可通过本领域已知的各种方法施用。本领域技术人员应知晓，给药途径/模式可根据所要达到的结果而有所不同。
辅助活性化合物也可掺入到所述组合物中。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合部位与一种或多种用于治疗疾病的其它治疗剂共同配制和/或共同给药，在所述疾病中胰高血糖素受体激活是不利的。例如，本发明的抗胰高血糖素受体抗体或抗原结合部位可与一种或多种能够结合其它靶分子的其它抗体共同配制和/或共同给药。此外，本发明的一种或多种抗体可与两种或两种以上的治疗剂组合使用。这种组合疗法可有利地利用低剂量施用的治疗剂，从而避免了与各种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。
本发明的药物组合可包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体或抗原结合部位。“治疗有效量”是指有效且对于必要时期而言，能达到理想治疗结果的剂量。抗体或抗原结合部位的治疗有效量可根据不同因素，如疾病状态、年龄、性别和个体体重，以及所述抗体或抗原结合部位引发个体所需响应的能力而有所不同。治疗有效量也是指抗体或抗原结合部位的治疗有益效果大于任何毒性或不利影响的剂量。“预防有效量”是指有效且对于必要时期而言，能达到理想的预防结果的剂量。通常，由于预防剂量是应用于疾病前或疾病早期阶段的个体，因此预防有效量将少于治疗有效量。
本发明抗体或抗原结合部位的示例性的、非限制性的治疗或预防有效量的范围为0.01-100mg/kg，更优选0.1-30mg/kg。应当注意的是，剂量值可随着待缓解的病症类型和严重程度而有所不同。应当进一步理解的是，对于任何特定个体而言，特定剂量方案应根据个人需要以及给药和监管组合物施用的人的专业判断，随着时间的推移来调整，本文中列出的剂量范围仅为示例性的，不用来限制所要求保护的组合物的范围或实践。
以下，将参考下面的实施例来具体解释本发明，提供的实施例只为更好地理解本发明，但不应理解为以任何方式对本发明范围的限制。
实施例1：筛选结合胰高血糖素受体的抗体
产生表达C-末端融合有GFP的全长人胰高血糖素受体的HEK293和CHO细胞。通过FACS分选出稳定的库，并分选出高荧光细胞，从而富集高水平表达胰高血糖素受体的细胞。
为了产生编码人胰高血糖素受体胞外第一域(1st extracellulardomain)的蛋白，将组成人胰高血糖素受体胞外第一域的哺乳动物表达载体与人IgG1的Fc部分在C-末端融合(NTD-Fc)。将该构建体瞬时转染到HEK293细胞中，并收获条件培养基。采用亲和纯化，使用蛋白A琼脂糖珠(Pierce)通过亲和纯化对NTD-Fc融合蛋白进行纯化。
使用NTD-Fc和表达胰高血糖素受体的细胞对展示人类抗体scFv的噬菌体文库进行淘选(pan)。scFv由源于健康人体的人类cDNA制备得到，并使用pIII融合展示于M13噬菌体上。为了进行淘选(panning)，将纯化的NTD-Fc固定在G蛋白磁珠(Invitrogen)上，第一轮用三乙胺洗脱结合的噬菌体。表达融合有GFP的胰高血糖素受体的HEK293细胞和CHO细胞用于随后的几轮淘选。经过3轮淘选，根据ELISA法中其结合NTD-Fc的能力检验单独的噬菌体克隆。然后通过细胞ELISA法(cell based ELISA)检测阳性噬菌体在表达融合了GFP的胰高血糖素受体的CHO或HEK293细胞中的结合。
实施例2：抗体转化和活性测试
对选定的噬菌体克隆进行测序，并通过瞬时表达，将特定的克隆转化至人类IgG2中，从而产生完整的人类抗体。收获条件培养基，使用蛋白A琼脂糖珠(Pierce)纯化抗体。然后制备用于细胞ELISA法的不同量的抗体，以测定其与人胰高血糖素受体的结合能力。
然后使用cAMP HTRF试剂盒(CisBio)测定纯化的抗体在cAMP检测中的中和活性。在将胰高血糖素加入细胞之前，向表达胰高血糖素受体的细胞中加入不同量的抗体并孵育15分钟。根据cAMP的生成量测定胰高血糖素受体的刺激。根据100pM胰高血糖素刺激对cAMP生成的抑制百分数来测定抗体效价。
实施例3：高脂肪诱导的肥胖模型中抗体的体内疗效测试
为了测试抗体在体内的疗效，瞬时表达Ab7并进行纯化。经过蛋白A纯化后，对抗体进行定量并通过cAMP检测证实其活性。
对于高脂饮食诱导的肥胖模型，驯化C57BL/6雄性小鼠并饲喂高脂饮食(60％脂肪卡路里，研究饮食(Research Diet))6周。施用当天，采集小鼠血液，进行基线血糖测定，随后立即进行体重测量。将将体重和血糖具有相似分布的小鼠分为3组(每组n＝9～10)。然后以7mg/kg和1mg/kg给小鼠单次腹膜内注射(IP)赋形剂或抗体。单次注射后在第1、2、3和10天测定血糖。
实施例4：根据放射性同位素稀释法检验抗体效果的分子机制
为进一步理解所述抗体的葡萄糖降低效果的机制，通过放射性同位素标记的葡萄糖输注来评估肝脏和外周胰岛素的敏感性(Choi C.S.等，Proc Natl Acad Sci U-S-A，2007，104：16480-85)。驯化C57BL/6雄性小鼠并饲喂高脂肪饮食(60％脂肪卡路里；研究饮食(ResearchDiet))6周。进行研究前7天，将留置导管置于颈静脉内。然后在实验前48h，给小鼠单次腹膜内注射(IP)赋形剂或抗体7mg/kg。
空腹过夜后，静脉输注[3-3H]葡萄糖(Perkin Elmer)2小时，以评估基础葡萄糖出现率(基础肝葡萄糖生成，basal hepatic glucoseproduction)。在基础期结束时，采集血液样本(20μl)，测定空腹血糖浓度及[3-3H]-葡萄糖活性。根据基础期结束时[3-3H]-葡萄糖输注率(每分钟分解量[dpm])与血糖具体活性(dpm/mg)的比值来确定基础全身葡萄糖出现率。
序列表自由文本
SEQ ID No.1表示重链可变区HC1的核苷酸序列；
SEQ ID No.2表示重链可变区HC1的氨基酸序列；
SEQ ID No.3表示重链可变区HC2的核苷酸序列；
SEQ ID No.4表示重链可变区HC2的氨基酸序列；
SEQ ID No.5表示重链可变区HC3的核苷酸序列；
SEQ ID No.6表示重链可变区HC3的氨基酸序列；
SEQ ID No.7表示重链可变区HC4的核苷酸序列；
SEQ ID No.8表示重链可变区HC4的氨基酸序列；
SEQ ID No.9表示重链可变区HC5的核苷酸序列；
SEQ ID No.10表示重链可变区HC5的氨基酸序列；
SEQ ID No.11表示重链可变区HC6的核苷酸序列；
SEQ ID No.12表示重链可变区HC6的氨基酸序列；
SEQ ID No.13表示重链可变区HC7的核苷酸序列；
SEQ ID No.14表示重链可变区HC7的氨基酸序列；
SEQ ID No.15表示重链可变区HC8的核苷酸序列；
SEQ ID No.16表示重链可变区HC8的氨基酸序列；
SEQ ID No.17表示轻链可变区LC1的核苷酸序列；
SEQ ID No.18表示轻链可变区LC1的氨基酸序列；
SEQ ID No.19表示轻链可变区LC2的核苷酸序列；
SEQ ID No.20表示轻链可变区LC2的氨基酸序列；
SEQ ID No.21表示轻链可变区LC3的核苷酸序列；
SEQ ID No.22表示轻链可变区LC3的氨基酸序列；
SEQ ID No.23表示轻链可变区LC4的核苷酸序列；
SEQ ID No.24表示轻链可变区LC4的氨基酸序列；
SEQ ID No.25表示轻链可变区LC5的核苷酸序列；
SEQ ID No.26表示轻链可变区LC5的氨基酸序列；
SEQ ID No.27表示轻链可变区LC6的核苷酸序列；
SEQ ID No.28表示轻链可变区LC6的氨基酸序列；
SEQ ID No.29表示轻链可变区LC7的核苷酸序列；以及
SEQ ID No.30表示轻链可变区LC7的氨基酸序列。
Figure IDA0000141800670000011
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Claims (17)

1.一种分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物，其包括：
(a)第一组CDR，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含重链CDR的氨基酸序列，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示的氨基酸序列；
(b)第二组CDR，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含轻链CDR的氨基酸序列，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No.18、20、22、24、26、28和30中任一所示的氨基酸序列；或，
(c)(a)中所述的第一组CDR和(b)中所述的第二组CDR的组合。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物，其包括重链或轻链，或两者，其中所述重链包括具有如SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示的氨基酸序列的重链可变区，或其抗原结合片段；以及所述轻链包括具有如SEQ ID No.18、20、22、24、26、28和30中任一所示的氨基酸序列的轻链可变区，或其抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物，其选自下组：
(a)包括如SEQ ID No.2和SEQ ID No.18中所示氨基酸序列的抗体；
(b)包括如SEQ ID No.4和SEQ ID No.20中所示氨基酸序列的抗体；
(c)包括如SEQ ID No.6和SEQ ID No.22中所示氨基酸序列的抗体；
(d)包括如SEQ ID No.8和SEQ ID No.24中所示氨基酸序列的抗体；
(e)包括如SEQ ID No.6和SEQ ID No.26中所示氨基酸序列的抗体；
(f)包括如SEQ ID No.10和SEQ ID No.26中所示氨基酸序列的抗体；
(g)包括如SEQ ID No.12和SEQ ID No.28中所示氨基酸序列的抗体；
(h)包括如SEQ ID No.14和SEQ ID No.30中所示氨基酸序列的抗体；
(i)包括如SEQ ID No.16和SEQ ID No.26中所示氨基酸序列的抗体；以及，
(j)包括如SEQ ID No.10和SEQ ID No.22中所示氨基酸序列的抗体。
4.一种分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物，其与包括如SEQID No.2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示的氨基酸序列和如SEQID No.18、20、22、24、26、28和30中任一所示的氨基酸序列组合的抗体竞争结合胰高血糖素受体。
5.一种分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物，其包括：
(a)第一组CDR，CDR1、CDR2和CDR3依次一起与重链CDR的氨基酸序列具有至少85％的一致性，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示的氨基酸序列；
(b)第二组CDR，CDR1、CDR2和CDR3依次一起与轻链CDR的氨基酸序列具有至少85％的一致性，CDR1、CDR2和CDR3依次一起包含于如SEQ ID No.18、20、22、24、26、28和30中任一所示的氨基酸序列；或，
(c)(a)中所述的第一组CDR和(b)中所述的第二组CDR的组合，
其中所述抗体或抗原结合部位或衍生物与胰高血糖素受体结合。
6.一种分离的抗体或抗原结合部位，其包括选自下组的氨基酸序列：
(a)通过氨基酸的添加、缺失和/或非保守替换，与选自SEQ IDNo.2、4、6、8、10、12、14和16的CDR3序列差异总共不超过3个氨基酸的重链CDR3序列；
(b)通过氨基酸的添加、缺失和/或非保守替换，与选自SEQ IDNo.18、20、22、24、26、28和30的CDR3序列差异总共不超过3个氨基酸的轻链CDR3序列；
(c)(a)中所述的重链CDR3序列和(b)中所述的轻链CDR3序列的组合，
其中所述抗体或抗原结合部位与胰高血糖素受体结合。
7.根据权利要求1-6任一项所述的分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物，其为单克隆抗体。
8.根据权利要求1-7任一项所述的分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物，其中所述抗体或抗原结合部位或其衍生物选自下组：人类抗体、人源化抗体、结合抗原的抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fd、scFv、域抗体、双特异性抗体、微型抗体、scab、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、Ig3抗体、IgG4抗体、抗体恒定域的任意衍生物和基于蛋白骨架的人工抗体。
9.根据权利要求1-8任一项所述的分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物，其中所述抗体或抗原结合部位或其衍生物与其它多肽融合或与其它化学物质连接。
10.药物组合物，其含有权利要求1-9任一项所述的分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物以及一种或多种药用载体。
11.分离的核酸，其含有编码权利要求1-9任一项所述的抗体的轻链可变区、重链可变区或两者的多核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的分离的核酸，其包括一种或多种如SEQ ID No.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27和29所示的核苷酸序列。
13.重组表达载体，其含有权利要求11或12所述的核酸。
14.宿主细胞，其通过用权利要求13所述的载体转化得到。
15.分离细胞系，其生产权利要求1-9任一项所述抗体、或其重链或轻链或抗原结合部位。
16.杂交瘤细胞，其生产权利要求1-9任一项所述抗体、或其重链或轻链或抗原结合部位。
17.用于降低血糖、改善糖耐量或用于治疗、预防或抑制患病个体中II型糖尿病、血脂异常或相关疾病的方法，其包括向个体施用权利要求1-9任一项所述的分离的抗体或抗原结合部位或其衍生物，或者权利要求10所述的药物组合物的步骤。
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