KR20140148294A

KR20140148294A - 항 ｉｇｆ-1ｒ 단일클론항체와 il2를 포함하는 융합 단일클론항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20140148294A
Application number: KR20140048090A
Authority: KR
Inventors: 김주희; 문경덕; 박경진; 박준모; 정선기; 손용규; 장현숙
Original assignee: 한화케미칼 주식회사
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2014-12-31

Abstract

본 발명은 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 항 IGF-1R 단일클론항체와 면역세포의 활성을 증가시키는 IL2가 결합된 융합 단일클론항체, 상기 융합 단일클론항체의 제조방법 및 상기 융합 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융한 단일클론항체는 IL2에 의해 암세포 주변의 면역세포가 강하게 활성화 되어 대조 항암항체 또는 보고된 항 IGF-1R 항체보다 증가된 항체의존성 세포독성을 나타낼 수 있으므로, 보다 효과적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

항 ＩＧＦ-1Ｒ 단일클론항체와 IL2를 포함하는 융합 단일클론항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물 {A fusion monoclonal antibody comprising IGF-1R antibody and IL2, and pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 항 IGF-1R 단일클론항체와 IL2를 포함하는 융합 단일클론항체 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 항 IGF-1R 단일클론항체와 면역세포의 활성을 증가시키는 IL2가 결합된 융합 단일클론항체, 상기 융합 단일클론항체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합 단일클론항체를 제조하는 방법 및 상기 융합 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

인슐린 유사 성장인자(Insulin like growth factor) 1 및 2("IGF-1" 및 "IGF-2")는 혈장내에 존재하는 약 7.5kDa 크기의 폴리펩티드로서, 대부분의 조직에서 검출되고, 매우 다양한 포유동물 세포의 분화 및 증식을 촉진한다고 알려져 있다. 상기 IGF-1 및 IGF-2는 모두 세포표면에 위치한 IGF-1 수용체(IGF-1R, Insulin-like growth factor 1 receptor)에 결합하여 세포의 작용을 조절할 뿐만 아니라 초기 분화에서 중요한 역할을 수행하지만, 정상 성체에서는 특별히 중요한 역할을 수행하지는 않는 것으로 알려져 있다.

IGF-1R은 알파 서브유닛과 베타 서브유닛으로 구성되는데, 알파 서브유닛은 세포막 외부에 존재하여 IGF-1 및 IGF-2와 직접적으로 결합하는 약 130-135kDa의 크기를 가지는 폴리펩티드이고, 베타 서브유닛은 막투과 영역과 티로신 키나제 활성을 가지는 세포질 영역으로 구성되는 약 95kDa의 크기를 가지는 폴리펩티드이다. 기능적으로 볼 때, 상기 IGF-1R은 티로신 키나아제 성장인자 수용체 군에 속하고, 인슐린 수용체와 구조적으로 유사하다고 알려져 있다. 상기 IGF-IR은 처음에는 단일쇄 (single chain) 프로수용체 (proreceptor) 폴리펩타이드로서 합성된 다음 글라이코실화, 단백질 분해에 의해 가공되며 공유결합되어 2개의 알파 서브유닛과 2개의 베타 서브유닛을 포함하는 성숙한 460kDa 헤테로테트라머 (heterotetramer)를 형성한다.

한편, 성체에서 IGF-1, IGF-2, IGF-1R 등이 비정상적으로 활성화되는 경우에는 암의 발생과 관련성이 있는 것으로 보고되었다. 특히, IGF-1R은 유방암, 폐암, 대장암, 전립선암, 자궁암 등 다양한 암 환자의 조직에서 과발현되는 것으로 보고되고 있다. 특히, 최근에 발표된 논문에 의하면 조사 대상 181명의 유방암 환자 중 절반 이상인 109명에서 IGF-1R를 과발현하고 있다고 보고하고 있어, IGF-1R가 훌륭한 유방암 바이오마커 (biomarker)로 사용될 수 있을 가능성을 강하게 제시하고 있어, 항암제의 표적 (target)으로 최근에 관심이 집중되고 있다. 예를 들어, WO 2002/53596, WO 2005/016967 및 WO 2006/01347에는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체 또는 인간의 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물이 개시되어 있다. WO 2006/138729에는 환자에게 IGF-1R 길항제 및/또는 PDGFRα 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 골암을 치료하는 방법이 개시되어 있다. WO 2010/066868에는 사람 IGF-1에 결합하고 IGF-2와 교차반응하여 IGF-1 수용체에 대한 IGF-1 및 IGF-2의 결합을 방해하고 IGF-1 수용체를 통한 신호전달을 억제하는 인간 항체 및 상기 인간 항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물이 개시되어 있다. 상기 IGF-1R을 표적으로 하는 다양한 항암제는 현재 유방암, 간암, 폐암, 전립선암, 대장암, 췌장암 등을 대상으로 임상 진행 중에 있으나, 아직 상업화되지 못하여 더욱 효과가 좋은 IGF-1R을 표적으로 하는 항암제가 요구되고 있다.

한편, IL2 (interleukin 2)는 체내에 항원이 침입했을 때 분비되어 T 세포를 매개로 한 면역 반응을 촉진시키는 면역 촉진 사이토카인의 하나로, T 세포의 증식 및 분화, B 세포의 항체생산, NK 세포의 활성화를 촉진시켜 외부 침입물질로부터 우리 몸을 방어하는 역할을 한다. 이러한 면역촉진의 기능을 이용하여 Chiron Corporation에서 재조합 IL2를 개발하여 악성흑색종 (malignant melanoma)과 신장세포암(renal cell cancer) 치료제로 판매하고 있다. 그러나, 과량 (수 백 mg/kg)으로 사용할 경우 혈관 손상, 간독성을 유발하는 치명적인 부작용이 보고되고 있다. 이러한 부작용을 방지하고, 암치료에 보다 효율적인 치료제를 개발하고자 IL2의 효능을 암 발생 부위에 집중시키기 위한 방법들이 개발되고 있다.

예를 들어, US 7,462,350에는 항체, 항체의 일부, 알부민 등의 비-IL2 부분과 혈청 내 반감기가 증가하도록 변이된 돌연변이 IL2 부분이 융합된 융합 단백질이 개시되어 있다. 또한, US 7,851,599에는 암마커로 알려진 EDb-피브로넥틴 도메인에 특이적인 항체의 일부가 IL2와 융합된 융합단백질과 암 치료제인 젬시타빈의 조합물을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 돌연변이 IL2 부분을 포함하는 융합단백질의 효과는 돌연변이된 IL2 부분을 포함할 경우에만 나타날 수 있을 뿐, 정상적인 IL2 부분을 포함할 경우에는 적용될 수 없다는 문제점이 있다. 아울러, ED-B-피브로넥틴 도메인에 대한 항체를 포함하는 융합단백질은 IL2의 효능을 암발생부위에 집중시키는 효과를 나타낼 수는 있으나, 항체 자체는 별다른 항암효과를 나타내지 못한다는 단점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 IGF-1R을 저해하여 항암효과를 나타내는 인간 단일클론항체 치료제를 개발하기 위해, 인간 항체 라이브러리로부터 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래인 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체를 새롭게 제작하였고, 그 다음, 이의 카르복실 말단에 IL2를 융합시켜 융합 단일클론항체를 제조하였다. 이렇게 제조한 융합 단일클론항체는 단일클론항체 자체에 비하여 현저히 증가된 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 상업적으로 판매중인 IGF-1R 단일클론항체에 IL2를 융합시킨, 융합 단일클론항체에 비해서도 항암 효과가 우수함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 암세포 표면 항원인 IGF-1R (Insulin like growth factor-1 receptor)와 특이적으로 결합하는 항체 및 IL2 (interleukin 2)가 연결된 융합 단일클론항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 융합 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 암세포 표면 항원인 IGF-1R (Insulin like growth factor-1 receptor)에 대하여 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 IL2 (interleukin 2)가 연결된 융합 단일클론항체를 제공한다. 구체적으로는, 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체 및 IL2가 연결된 융합 단일클론항체를 제공한다.

본 발명의 용어, "융합 단일클론항체"란 단일클론항체와 다른 펩타이드의 전체 또는 일부가 연결되어 형성된 형태를 가지고, 자연적으로는 존재하지 않으며, 유전공학 또는 기타 임의의 방법으로 인위적으로 제조된 단일클론 항체를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 융합 단일클론항체는 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체와 IL-2가 직접적으로 또는 링커를 통하여 간접적으로 연결된 형태의 융합 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "IGF-1R (Insulin like growth factor-1 receptor)에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체"는 IGF-1R에 결합하여 IGF-1R의 생물학적 활성의 억제를 가져올 수 있는 항체를 의미한다. 본 발명에서 상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 항 IGF-1R 항체와 혼용하여 사용될 수 있다. 상기 단일클론항체의 형태는 전체 항체 및 항체 단편 형태를 모두 포함한다.

바람직하게는, 상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체일 수 있다. 그 예로 서열번호 7의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 7의 중쇄 및 서열번호 8의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 인간 단일클론항체를 MKJP2로 명명하였다. MKJP2의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열에 대해서는 도 4에 나타내었고, 해당 CDR 서열에 대해서는 도 4에 빨간 밑줄로 표시하였다.

본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체 (whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체 (예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이중결합항체 (예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 또한, 상기 용어는 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 이가 및 양특이성 분자는 예를 들면, Kostelny 등 (1992, J. Immunol., 148:1547), Pack 및 Pluckthun (1992, Biochemistry, 31:1579), Hollinger 등 (1993, Supra), Gruber 등 (1994, J. Immunol., 5368), Zhu 등 (1997, Protein Sci., 6:781 등), Hu 등 (1996, Cancer Res., 56:3055), Adams 등 (1993, Cancer Res., 53:4026) 및 McCartney 등 (1995, Protein Eng., 8:301)에 기술되어 있다.

상기 항체 단편은 항원결합 능력을 가지는 단편을 의미하며, Fab', F(ab')₂, Fab, Fv, scFv 및 rIgG를 포함하는, 항체의 항원 결합 형태를 포함한다. 본 발명에서 항체 단편은 전장항체가 아닌, 항원과의 결합능을 결정하는 상보성 결정영역을 포함하는 폴리펩타이드를 폭넓게 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄 Fv (dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv (scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명의 용어, "단일클론항체"란 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미하는데, 상기 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명의 목적상 상기 단일클론항체는 암세포 표면항원인 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체로, 암세포 표면항원인 IGF-1R에 결합할 수 있는 본 발명의 항체는 IGF-1R과 결합하여 항암활성을 가질 수 있다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역 (상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역 (complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프 (epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

상기 단일클론항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgT, IgY, 단일쇄 항체 등의 천연형 항체; 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키거나, 인간화 항체와 같이 체내에서 항체에 대한 거부반응을 감소시키거나 또는 항체의 안정성을 증대시키기 위하여 천연형 항체의 일부를 변이시킨 형태의 변이항체; 상기 천연형 항체의 일부를 포함하도록 구성된 재조합 항체 등이 될 수 있다. 보다 바람직하게는 IgG 등의 천연항체, 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키도록 변이된 변이항체, 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정영역을 포함하는 재조합 항체 등이 될 수 있다. 상기 IgG는 다양한 isotype을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 IgG1 형태일 수 있다.

본 발명에서 용어, "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, 이는 3가지 이상의 잠재적인 장점을 가질 수 있다. 먼저, 이는 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다. 둘째로, 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는 이점이 있다. 셋째로, 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 이점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 인간 단일클론항체들은 IGF-1R에 대해서 강한 친화력을 나타내며, IGF-1R를 발현하고 있는 세포 (예: 암세포)에 IGF-1이 결합하는 것을 효과적으로 저해할 뿐 아니라, 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로, 암과 같은 질병의 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 인간 단일클론항체가 불변 영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합 (combination) 또는 이들의 혼성 (hybrid)에 의한 불변 영역을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "조합 (combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그 예로, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 불변 영역으로부터 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다.

본 발명에서 용어, "하이브리드 (hybrid)"란 단쇄 면역 글로불린 중쇄 불변 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하며, 그 예로 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다.

한편, IgG의 아형인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중쇄 불변영역의 조합 또는 혼성화도 가능하다. 상기 조합 및 혼성화에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 본 발명의 상기 IGF-1R에 특이적인 인간 단일클론항체는 경쇄 불변영역이 람다 (λ) 또는 카파 (κ) 경쇄 유래일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "인슐린 유사 성장인자 1 수용체 (insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)"는 인슐린 유사 성장인자와 결합하는 세포막 수용체 부류의 하나로서, 바람직하게는 인슐린 유사 성장인자 1 및 2 (IGF-1 및 IGF-2)에 결합하여 IGF-1 및 IGF-2 호르몬의 신호 전달을 세포 내로 매개하는 수용체 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 IGF-1R은 포유류의 IGF-1R라면 제한 없이 포함될 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간 또는 마우스의 IGF-1R를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 IGF-1R는 암세포 세포막에 과다하게 발현되어 IGF-1 또는 IGF-2에 결합함으로써 암의 성장을 유도할 수 있는 수용체 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 IGF-1R은 유방암 (breast cancer)을 비롯한 다양한 암 세포에서 과발현되어 있으며, 암의 성장을 촉진시키거나 항암제 내성을 일으키는 신호전달에 작용하는 것이 알려져 있다 (HE, Jones et al, Endocr . Relat . Cancer 2004;11 (4): 793-814). 또한, 본 발명에서 상기 IGF-1R는 천연형 또는 변이체 IGF-1R 단백질을 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 천연형 IGF-1R 단백질이란 천연형 IGF-1R 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 일반적으로 지칭하며, 상기 천연형 IGF-1R 단백질의 아미노산 서열이란 천연 발생 IGF-1R에서 발견되는 아미노산 서열을 일반적으로 지칭한다. 상기 IGF-1R에 대한 정보는 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 NM_000875인 IGF-1R일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "인슐린 유사 성장인자 (insulin-like growth factor)"는 인슐린과 높은 서열 유사성을 갖는 단백질로, 이들의 수용체인 IGF-1R 및 IGF-2R 단백질과 관련된 여러 기작에 관여한다. 특히, 본 발명에서는 IGF-1 또는 IGF-2 호르몬일 수 있다.

본 발명에서 용어, "인슐린 유사 성장인자 1 (IGF-1)"은 소마토메딘 C (somatomedin C)라고도 지칭되는 유년기 성장 및 성인의 동화작용 (anabolic effect)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 상기 IGF-1 또는 IGF-2는 바람직하게는 인간 또는 마우스의 IGF-1R에 결합하는 단백질을 의미할 수 있다. 상기 IGF-1 또는 IGF-2는 천연형 또는 변이체 IGF-1 또는 IGF-2 단백질을 모두 포함한다. 천연형 IGF-1 또는 IGF-2란 천연형 IGF-1 또는 IGF-2 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하며, 상기 천연형 IGF-1 또는 IGF-2 단백질의 아미노산 서열이란 천연형 발생 IGF-1 또는 IGF-2에서 발견되는 아미노산을 일반적으로 지칭할 수 있다.

본 발명에서 용어, "IGF-1 또는 IGF-2와 IGF-1R 간의 상호작용을 저해"는 본 발명의 IGF-1R에 특이적인 단일클론항체가 IGF-1R에 결합하여 IGF-1R와 그의 리간드에 해당하는 IGF-1 또는 IGF-2 간의 상호작용을 저해시키는 것을 의미한다. 본 발명의 IGF-1R에 특이적인 단일클론항체에 의한 IGF-1과 IGF-1R 간의 상호작용 저해를 통하여 IGF-1R의 IGF-1 결합에 의한 IGF-1R 단백질의 인산화를 저해하여, 이의 하위 신호전달기작인 AKT 및 MAPK 신호 전달의 활성화를 억제할 수 있다. 특히, 암에서 IGF-1과 IGF-1R 단백질이 결합하게 되면, 세포 생존 및 증식 관련 기작인 AKT 및 MAPK 신호전달이 활성화되어 암세포의 생존 및 증식을 향상시켜 암의 증식과 항암제에 대한 내성에 관여하는 것으로 알려져 있다 (HE, Jones et al, Endocr . Relat . Cancer 2004;11 (4): 793-814). 따라서, 암에서 IGF-1에 의한 신호전달을 차단하게 되면 암의 성장 및 항암제에 대한 내성 생성을 억제할 수 있게 된다. 따라서, IGF-1 또는 IGF-2와 IGF-1R 간의 상호작용을 효과적으로 억제하는 본 발명의 IGF-1R에 특이적인 인간 단일클론항체는 암의 치료에 있어서 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기의 IGF-1R에 특이적인 인간 단일클론항체에 면역세포의 활성을 증가시키는 IL2를 융합시켜 제조한 융합 단일클론항체의 경우, IGF-1R에 특이적인 인간 단일클론항체 단독에 비하여 우수한 항암 효과를 가져올 수 있으며, 상기 융합 단일클론항체는 면역세포를 자극함과 동시에 암세포 표면 항원인 IGF-1R에 결합할 수 있는 특성을 나타낸다.

본 발명의 용어, "인터루킨 2 (Interleukin 2, IL2)"란, 면역시스템에 관여하는 사이토카인 신호전달 분자의 한 종류이다. 구체적으로, 상기 IL2는 Th1 세포에서 발현되고, CD25/IL2RA, CD122/IL2RB 또는 CD132/IL2RG를 수용체로 할 수 있다. 상기 IL2는 면역반응을 촉진시키고, 면역시스템에 관여하는 T 세포, B 세포, 단핵구 세포 등의 다양한 세포를 활성화시킬 수 있으며, 상기 T 세포의 성장인자로 작용할 수 있는 효과를 나타내며, 15.5kDa 크기를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 IL2는 상기 IGF-1R과 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체와 함께 본 발명의 융합 단일클론항체를 구성하기 위한 융합파트너로서 사용되며, 이때 사용되는 IL2는 IL2의 활성을 나타내는 한 전체, 단편, 뮤테인 (mutein) 등 일 수 있으나, 바람직하게는 IL2 전체가 될 수 있고, 그 예로 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 IL2 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현된 IL2가 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "면역세포(immunocyte)"란, 항원과 반응하여 항체를 생산하거나 세포 매개성 면역 반응에 참여할 수 있는 세포를 의미한다. 통상적으로, B 세포, 자연 살상 세포 (Natural killer cell, NK cell) 또는 T 세포 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 면역세포는 항체의존성 세포독성 메커니즘에 작용하는 자연 살상 세포 또는 T 세포를 의미할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 융합 단일클론항체에 포함된 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체와 IL2는 직접적으로 결합할 수도 있고, 링커를 통하여 결합할 수도 있다.

상기 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체와 IL2를 직접적으로 결합하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 펩티드 결합, 이황화 결합, 비펩타이드성 또는 펩타이드성 링커를 이용한 결합 등의 방법으로 상기 두 개의 단백질을 결합시킬 수 있다.

본 발명의 용어, "링커(linker)"란 기본적으로는 두 개의 서로 다른 융합 파트너 (예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 수소 결합, 정전기적 상호작용, 반데르 바알스력, 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미하는데, 펩타이드 링커 또는 비펩타이드 링커일 수 있다. 바람직하게는 생리학적 조건 또는 다른 표준 펩타이드 조건 (예를 들면, 펩타이드 정제 조건, 펩타이드 저장 조건)하에서 적어도 하나의 이황화 결합에 참여할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 가질 수 있다. 또한, 단순히 각각의 융합 파트너를 연결하는 역할 이외에도, 융합파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나 또는 융합체에 유연성 또는 강직성을 제공하는 힌지의 역할을 수행할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 링커는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체와 IL2를 연결할 수 있는 폴리펩티드 또는 상기 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 유전자와 IL2를 코딩하는 유전자를 연결할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩된 폴리펩티드가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체의 Fc 영역의 C-말단과 IL2의 N-말단 또는 C-말단을 연결할 수 있는 펩타이드 링커가 될 수 있다. 보다 바람직하게는 GGGGS 모티프가 반복된 형태의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 링커가 될 수 있고, 상기 GGGGS 모티프는 1~10번 반복될 수 있다. 그 예로 하기의 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩된 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

링커 펩타이드: GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 11)

링커 뉴클레오티드: 5'-GGTGGAGGTGGCAGCGGTGGTGGCGGCAGTCCCGGTGGCGGCTCC-3' (서열번호 12)

이때, IL2가 직접적으로 또는 링커를 통하여 간접적으로 연결되는 부위는 상기 단일클론항체의 모든 부위가 될 수 있고, 특정부위에 제한되지 않으나, 그 예로 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체의 Fc 영역의 C-말단 또는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체의 C-말단에 연결된 것일 수 있다.

또한, 상기 융합 단일클론항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 전체 또는 일부와 IL2의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 융합 단일클론항체; 또는 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 전체 또는 일부와 IL2의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론항체가 될 수 있다.

바람직하게는 상기 융합 단일클론항체는, IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄의 전체 또는 일부와, IL2의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 융합 단일클론항체; IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 경쇄의 전체 또는 일부와, IL2의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 융합 단일클론항체; IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄의 전체 또는 일부와, IL2의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론항체; IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 경쇄의 전체 또는 일부와, IL2의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론항체; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.

바람직하게는 상기 융합 단일클론항체는, IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL2의 전체 또는 일부의 N-말단이 연결된 형태의 융합 단일클론항체 (예를 들어, 서열번호 13); IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 경쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL2의 전체 또는 일부의 N-말단이 연결된 형태의 융합 단일클론항체; IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL2의 전체 또는 일부의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론항체; IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 경쇄의 전체 또는 일부의 C-말단과, IL2의 전체 또는 일부의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결된 형태의 융합 단일클론항체; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.

가장 바람직하게는 상기 융합 단일클론항체는, IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄 전체 또는 일부의 C-말단과, IL2의 전체 또는 일부의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결된 형태 (예를 들어, 서열번호 14)의 중쇄를 갖는 융합 단일클론항체가 될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 융합 단일클론항체는 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 (항 IGF-1R 항체의 중쇄 영역, 펩타이드 링커 및 IL2 포함) 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 (항 IGF-1R 항체의 경쇄 영역)를 포함하는 것인 융합 단일클론항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이때, 본 발명에서 제공하는 융합 단일클론항체의 암세포 표면 IGF-1R 항원에 대한 해리 상수값 (K_D 값)은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 100nM 이하임이 바람직하며, 특히 1nM 이하임이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 IgG-IL2 형태로 항 IGF-1R_IL2 (MKJP2-IL2)의 융합 단일클론항체를 제작하였으며 (실시예 1 내지 4), MKJP2에 IL2를 융합한 MKJP2-IL2 항체가 MKJP2 항체와 동일 수준의 IGF-1R에 대한 결합력을 나타내는 것을 확인하였다 (실시예 5). 또한, 상기 융합 단일클론항체에 결합된 IL2는 rhIL2와 동일 수준에서 면역세포인 CTLL-2 세포의 증식을 나타내는 결과를 보여, 융합 단일클론항체의 형태에서도 IL2 본래의 기능을 가짐을 확인하였다 (실시예 6). 또한, IGF-1R이 과발현된 인간 유방암 세포인 MCF-7에 IGF-1과 함께 본 발명의 MKJP2-IL2 항체를 동시에 처리하였을 때, MKJP2와 동등한 수준으로 IGF-1에 의한 성장 증식을 억제하는 결과를 나타내어, IL2의 융합에도 항 IGF-1R의 암 치료 효과를 가지는 것을 확인하였다 (실시예 7). 상기 MKJP2-IL2 항체의 IGF-1R에 대한 친화도를 비아코어 기기로 분석하였을 때, MKJP2 항체 단독과 유사한 수준을 나타내었고, 3.5 X 10^-10M로 높은 친화도를 나타내었다 (실시예 8). 본 발명의 MKJP2-IL2 융합 항체의 사멸 유도 효과 역시 확인하였고, 그 결과, 상기 융합 항체의 IL2에 의해 CTLL-2 세포가 활성화되고 그에 따라 MCF-7 세포의 사멸을 효과적으로 유도할 수 있음을 나타내었다 (실시예 9). 상기와 같은 in vitro 실험 결과에 더하여, 인간 유방암 세포주 MDA-MB231 세포를 이종이식한 누드 마우스를 대상으로 MKJP2-IL2 항체의 효과를 분석한 결과, 동일 항원을 인지하는 A12 항체에 IL2가 융합된 항체에 비해서도 2배 가량 우수한 종양 성장 억제 효과를 나타내었다. 또한, MKJP2 단독 항체와 비교하여서도 1/10배의 투여용량에서 동일한 종양 성장 억제 효과를 나타냄을 확인하여, 본 발명의 융합 단일클론항체가 암의 치료에 있어서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다 (실시예 10).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입되어 상기 융합 단일클론항체를 발현할 수 있는 형질전환체를 제공한다.

상기 융합 단일클론항체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 제공하는 상기 융합 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL2를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 또는 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL2를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는, IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL2를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL2를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부가 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL2를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부와 IL2를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부가 펩타이드 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.

보다 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는, IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 3'-말단과 IL2를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 3'-말단과 IL2를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 3'-말단과 IL2를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 펩타이드 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 3'-말단과 IL2를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 펩타이드 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드; 또는 이들의 조합이 될 수 있다.

가장 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는, IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 3'-말단과 IL2를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부의 5'-말단이 펩타이드 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 연결된 형태의 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 융합 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포 (예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포 (예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스, 레트로바이러스 벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 항체의 중쇄 및 경쇄 각각에 대한 2개의 발현벡터, 또는 상기 중쇄 및 경쇄에 대한 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 바이시스트로닉 벡터일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 E. coli, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 융합 단일클론항체를 제조하는 방법은 본 발명의 융합 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물로부터 융합 단일클론항체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 융합 단일클론항체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

구체적으로, 본 발명의 융합 단일클론항체를 제조하는 방법은 (i) 상기 융합 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; (ii) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 발현벡터를 수득하는 단계; (iii) 상기 수득한 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및 (iv) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 융합 단일클론항체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 IL2가 융합된 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상기 중쇄 또는 경쇄와 함께 항체를 형성할 수 있는 중쇄 또는 경쇄 중 다른 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조합일 수 있다.

상기 융합 단일클론항체를 제조하는 다른 실시양태에 의하면, 본 발명의 융합 단일클론항체를 제조하는 방법은 (i) 암세포 표면항원 IGF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 포함하는 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 수득하는 단계; (ii) 인간의 IL2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; (iii) 상기 수득한 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단과, 상기 수득한 인간의 IL2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단을 링커 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 연결함으로써, 융합 폴리펩티드를 코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; (iv) 상기 수득한 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 융합 폴리뉴클레오티드를 각각 클로닝하여 각각의 발현벡터를 수득하는 단계; (v) 상기 수득한 각각의 발현벡터를 하나의 숙주세포에 동시에 도입하여 형질전환체를 수득하는 단계; 및 (vi) 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 융합 단일클론항체를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 IGF-1R 항원에 결합하는 항체 (MKJP2)의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와, 인간의 IL2를 코딩하는 유전자를 각각 수득하고, 상기 수득한 중쇄를 코딩하는 유전자의 3'-말단과 인간 IL2를 코딩하는 유전자의 5'-말단을 링커 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 연결하여 융합 폴리뉴클레오티드를 수득하였다. 이어, 상기 경쇄를 코딩하는 유전자 및 상기 융합 폴리뉴클레오티드를 각각 클로닝하여 각각의 발현벡터를 수득하고, 상기 수득한 각 발현벡터를 하나의 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 수득하였다. 끝으로, 상기 형질전환체를 배양하여 목적하는 융합 단일클론항체를 생산하고, 이를 배양액으로부터 정제하여 융합 단일클론항체 (MKJP2-IL2)를 제조하였다 (실시예 1 내지 4).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "암"이란, 본 발명의 융합 단일클론항체에 의하여 치료될 수 있는 암이라면 그 종류에 제한없이 포함하나, 그 예로 유방암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종, 또는 혈액암 등이 될 수 있고, 바람직하게는 세포의 표면에 IGF-1R이 비정상적으로 과발현되는 유방암, 폐암, 대장암, 전립선암, 또는 자궁암 등이 될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적인 암 종으로 유방암을 대상으로 하여 본 발명의 융합 단일클론항체가 IGF-1R을 발현하는 암에 대하여 치료 효과를 가지는 것을 확인하였다. 이로부터, 본 발명의 융합 단일클론항체는 IGF-1R을 발현하는 암에 대하여 치료 효과를 가짐을 알 수 있다.

본 발명의 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

아울러, 본 발명의 암 치료용 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 융합 단일클론항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 적소두 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 융합 단일클론항체는 항 IGF-1R 항체에 의한 IGF-1 또는 2와 IGF-1R 간의 상호작용을 저해하는 것 외에도 IL2에 의한 면역세포 활성화를 가져와, 단일클론항체 단독에 비하여 우수한 항암 활성을 나타내므로, IGF-1R을 발현하는 암의 치료에 있어 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 항 IGF-1R 단일클론항체를 스크리닝한 파아지 풀 (phage pool)을 이용한 ELISA 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 항 IGF-1R 단일클론항체를 선별하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 항 IGF-1R 단일클론항체를 선별하기 위한 FACS 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 선별된 항 IGF-1R 단일클론항체인 MKJP2의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열과 CDR 분석결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 MKJP2-IL2 융합 단일클론항체인 단일클론항체를 임시발현 및 분리정제 후, 환원 또는 비환원 상태에서 전기영동으로 분리하여, 은 염색 (silver staining)한 결과를 보여주는 도면이다. A12-IL2는 상업적으로 판매 중인 IGF-1R 항체 IMC-A12에 IL2를 융합한 단백질이다.
도 6은 본 발명의 MKJP2-IL2 융합 단일클론항체의 IGF-1R에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 MKJP2-IL2 융합 단일클론항체의 IL2 활성을, IL2에 의하여 증식이 촉진되는 CTLL-2 세포주의 증식을 통하여 서로 비교하여 확인한 도면이다. A12-IL2는 상업적으로 판매 중인 IGF-1R 항체 IMC-A12에 IL2를 융합한 단백질이며, rhIL2는 재조합 인간 IL2 단백질을 말한다.
도 8은 MCF-7 유방암 세포주를 이용하여 본 발명의 MKJP-IL2 융합 단일클론항체의 항-증식 활성을 확인한 도면이다.
도 9는 IGF-1R 항원에 대한 MKJP2-IL2 융합 단일클론항체의 결합친화도를 BIAcore로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은, MKJP2 단일클론항체, MKJP2-IL2 융합 단일클론항체, 비교군인 A12 항체, A12-IL2 항체 및 rhIL2를, MCF-7 세포가 부착되고 CTLL-2 세포가 분주된 웰에 각각 첨가한 다음, CTLL-2 세포에 의하여 MCF-7 세포의 사멸 효과가 유도될 수 있는지를 확인한 도이다. 여기서, 약어 "E"는 Effector cell을, "T"는 target cell을 의미한다.
도 11은, MDAMB-231 세포를 이종이식한 누드 마우스에 A12-IL2 (2.0 mg/kg 또는 4.0 mg/kg); MKJP-IL2 (1.0 mg/kg, 2.0mg/kg, 또는 4.0mg/kg)을 투여한 다음, 종양 크기를 관찰하여 상기 항체들의 항암 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 라이브러리 파아지의 제조

항-인슐린 유사 성장인자-1 수용체 (Insulin-like Growth Factor-1 receptor, IGF-1R) 항체를 제조하기 위하여, 인간 유래 scFv (single-chain variable fragment) 라이브러리 파아지를 이용하여 스크리닝을 수행하였다. 이때, IGF-1R 항원으로는 리간드인 IGF-1이 결합하는 부위라고 알려진 세포표면으로 노출된 도메인 (extracellular domain, ECD)인 α체인과 β체인의 일부분에 해당하는 아미노산 서열 (Met1-Asn932) (R&D system)을 사용하여 2번의 패닝을 한 후, IGF-1R이 과발현 되었다고 알려진 MCF-7 세포를 이용한 세포 패닝 (Cell panning) 방법을 통하여 3차 패닝을 실시하였다. 본 실시예에서는 IGF-1R 단백질과 MCF-7을 이용한 세포 패닝의 방법과 결과를 기재하였다.

1-1. 인슐린 유사 성장인자-1 수용체 단백질을 이용한 패닝

면역튜브(Immunotube, Maxsorp, Cat No. 4-442-2)에 재조합 인슐린 유사 성장인자-1 수용체(IGF-1R, R&D system, 391-GR)와 Negative Selection 목적으로 사용될 BSA (Gibco, 30063-572)를 각각 10㎍씩 4℃에서 하룻밤 동안 (O/N, Overnight) 코팅하였다. 상등액을 제거한 후, 4% 탈지 우유 포함된 PBST (Tween 20 0.1%)를 3ml 넣어 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 파아지와 4% 탈지 우유가 포함된 PBS용액을 1:1로 섞어 BSA가 코팅된 면역튜브에 넣고, 37℃에서 30분간 반응시킨 후 BSA가 결합하지 않은 파아지를 포함한 상등액을 IGF-1R이 코팅된 면역튜브에 옮겨 상온에서 2시간 반응시켰다.

PBST로 5회 세척한 후, IGF-1R에 특이적으로 결합한 scFv-phage를 얻기위해 100mM TEA (Sigma, T-0886) 1 ml로 용출한 후, 1M Tris (pH7.4) 0.5 ml을 넣고 상온에서 5분동안 반응시킨 후 대장균 ER2738 (OD₆₀₀=0.4~0.6)에 감염 (infection)시켰다. 37℃에서 30분간 배양한 후, SOBAG (2xYT, 1% glucose, 10 mM MgCl₂, carbenicilin) 플레이트에 도말하였다. 2차 패닝은 위와 같은 방법으로 파아지와 반응시키되, PBST의 세척한 횟수를 하기 표 1과 같이 하여 진행하였다.

1-2. 세포 기반 패닝( Cell based panning )

세포 패닝의 경우, IGF-1R을 과발현하는 유방암 세포주 (breast cancer cell line)인 MCF-7을 사용하였다. MCF-7 세포를 1 X 10⁶개을 튜브에 넣고 PBS로 2회 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다. PBS로 2회 세척한 후, 5% FBS가 함유된 PBS로 상온에서 1시간 블로킹하였다. 파아지를 5% FBS가 함유된 PBS에 1:1로 섞어 위의 MCF-7과 상온에서 2시간 반응시켰다. 5% FBS가 함유된 PBST로 10회 세척하고, PBS로 2회 추가 세척하였다. MCF-7 세포는 ER2738 (OD₆₀₀=0.4~0.6)에 감염시켰다. 37℃에서 30분간 배양한 후, SOBAG (2xYT, 1% glucose, 10 mM MgCl₂, carbenicilin) 플레이트에 도말하였다.

1-3. 패닝 이후의 파아지 회수 파아지 적정

플레이트 상의 콜로니 (colony)를 2xYT media (2% glucose, carbenicillin)에 접종 후, OD₆₀₀=0.5가 될 때까지 37℃에서 shaking 하며, O/N 배양하였다. 8000 rpm에서 30분간 원심분리 후 상등액에 4% PEG (Polyethylene glycol 8000, Sigma, 25322-68-3), 3% NaCl을 넣고, 얼음 위에서 1시간 정치시킨 뒤, 8000 rpm, 30분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 응집체 (pellet)를 PBS로 현탁하였다. 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 각 패닝 이후의 파아지를 적정하였다. 상기 패닝 조건에 따른 파아지 적정 결과는 하기 표 1과 같다.

패닝 조건 및 적정 결과

표적항원	패닝 차수	세척(Wash) 조건	초기 파아지 수	결합 파아지 수
재조합 IGF-1R	1st	PBST : 5회 PBS : 2회	7.0 x 10¹²	4.9 x 10¹²
재조합 IGF-1R	2nd	PBST : 10회 PBS : 2회	6.0 x 10¹²	3.3 x 10¹²
MCF-7	3rd	PBST : 10회 PBS : 2회	5.0 x 10¹²	1.2 x 10¹²

1-4. 패닝 후의 타겟 항원 IGF -1R에 대한 phage pool ELISA

상기 패닝을 진행한 후, 생성된 파아지 풀 (phage pool)의 타겟 항원 IGF-1R에 결합하는 정도가 증가되었는지 확인하기 위해, Phage pool ELISA를 진행하였다. 면역 배양접시 (Nunc-Immuno plate, Nunc, 44-2404-21)에 재조합 IGF-1R 100ng을 포함한 PBS 100μL을 넣고, 4℃에서 O/N 코팅하였다. 3% 탈지 우유가 포함된 PBST를 각 웰당 200μL씩 넣어 상온에서 1시간 배양하여 블로킹하였다. 파아지를 희석하여 각 웰에 로딩 후, 상온에서 2시간 반응시켰다. PBST 300μL로 4회 세척한 후, 항-M13-HRP 결합항체를 넣고 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 4회 세척하였다. TMB (Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100μL를 넣어 발색한 후, 1N H₂SO₄ 50μL를 넣어 반응을 정지한 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 1에서 보듯이, 패닝차수가 올라감에 따라 타겟항원 IGF-1R에 결합하는 정도가 증가함을 확인하였다.

1-5. IGF -1R에 결합하는 단일클론항체 선별

상기 실기예 1-4 및 도 1에서 확인한 바대로, 항원에 특이적으로 친화력을 갖는 상기 생성된 파아지 풀 (phage pool)로부터 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 선별하기 위해, 96 deep 웰 플레이트 (Bioneer, 90063)에 400μL의 2xYT (carbenicillin) 배지를 넣고, 각 콜로니를 접종하여 37℃에서 shaking 하면서 O/N 배양하였다. 배양액 20μL를 새로운 500μL의 2xYT (carbenicillin) 배지에 접종하여 37℃에서 2시간 배양한 후, 1mM IPTG (Duchefa, 367-93-1)를 첨가하여, 37℃에서 O/N 배양하였다. 4℃에서 3,000 rpm 20분 간 원심분리 후, 세포 응집체 (cell pellet)를 1 X TES (50mM Tris, 1mM EDTA, 20% sucrose, pH 8.0) 150μL에 현탁한 후, 0.2 X TES 225μL를 넣고, 얼음 상에서 30분간 반응하였다. 4℃에서 3000 rpm에서 20분간 원심분리 후 상등액 (periplasm extract)을 취하여 ELISA에 사용하였다. 면역 배양접시에 재조합 IGF-1R을 웰당 100ng 넣고, 4℃에서 O/N 코팅하였다. 3% 탈지 우유가 포함된 PBST를 각 웰당 200μL씩 넣어 상온에서 1시간 배양하여 블로킹하였다. 상등액을 각 웰당 100μL씩 로딩한 후, 상온에서 2시간 반응시켰다. PBST 300μL로 4회 세척한 후, 항-HA-HRP 결합 항체를 넣고 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 4회 세척 하였다. TMB (Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100μL를 넣어 발색한 후, 1N H₂SO₄ 50μL를 넣어 반응을 정지한 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 2에서 보듯이, IGF-1R에 대해 발색 신호를 보이는 단일클론항체가 존재함을 확인하였다.

1-6. FACS 를 이용한 타겟항원 IGF -1R에 결합확인

상기 실시예 1-5의 ELISA에서 항원에 결합한 상등액을 이용하여 타겟항원 IGF-1R이 과발현되어있는 MCF-7에 결합시켜, 야생형 IGF-1R에 결합하는지 분석하였다. MCF-7을 시료당 1 X 10⁵개를 준비한 후, PBS를 이용하여 1회 세척한 후, 상등액을 30μL 넣고, 4℃에서 30분간 반응시켜 반응시킨 후, 1% BSA (Gibco, 30063-572)가 포함되어 있는 PBS 용액 200μL로 2회 세척한 후, 항-HA-FITC를 1:700으로 희석하여 100μL를 로딩하여 4℃에서 30분간 반응시켰다.

반응 산물을 다시 한번 1% BSA가 포함되어 있는 PBS 용액으로 2회 세척한 후, 200μL의 PBS로 재현탁하여 유세포 분석기 (FACS)를 사용하여 10,000개 세포를 분석하였다.

그 결과 도 3에서 보듯이, 다양한 클론이 MCF-7의 표면상에 결합함을 확인할 수 있었다. 시퀀스 분석 결과 1229 클론이 지속적으로 반복됨을 확인하였고, 이를 MKJP2라고 명명하였다.

실시예 2 : Full IgG 형태로의 클로닝

CHO-S 포유동물 세포주에서 항 IGF-1R 항체와 IL2를 결합시킨 융합 단일클론항체를 생산하기 위한 목적으로, hIGF-1R에 대한 단일클론 파아지 항체인 MKJP2와 IL2가 연결된 MKJP2-IL2를 발현 벡터로 전환하기 위해 중쇄와 경쇄를 각각 유전자 합성하였다 (제노텍) (아미노산 서열: 서열번호 7 및 8, 뉴클레오티드 서열: 서열번호 15 및 16). 상기 중쇄에는 G4S 링커 (서열번호 11)와 IL2 (아미노산 서열: 서열번호 9; 뉴클레오티드 서열: 서열번호 10)가 MKJP2의 C-말단에 연결되도록 합성하였으며, IL2 유전자는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 공개된 유전자 서열 (서열번호 9)을 사용하였다.

먼저, 링커로서 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 11)를 코딩하는 유전자 (서열번호 12)를 사용하여 항 IGF-1R 항체의 중쇄영역을 코딩하는 유전자의 3'-말단과 인간 IL2를 코딩하는 유전자의 5'-말단을 연결하여, 항 IGF-1R 항체의 중쇄영역을 코딩하는 부위와 IL2를 코딩하는 부위가 링커 유전자를 통하여 연결된 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 (서열번호 17)를 수득하고 이를 발현벡터에 클로닝하였다.

상기 합성된 유전자는 NheI과 NotI을 사용하여 pTOP V2 벡터에서 절단하였으며, 절단에 의해 획득한 중쇄 가변영역 유전자를 각각 DNA-겔 추출 키트 (Qiagen)로 정제한 후, 이를 EH-ID 벡터에 각각 라이게이션 (ligation)을 수행하였다. 벡터 1μL (10ng), 중쇄 가변영역 (50~100ng) 15μL, 10X 완충액 2μL, 라이게이즈 (1U/μL) 1μL, 및 증류수를 혼합하여 실온에서 1-2시간 방치하여 상기 벡터와 연결하였다. 상기 벡터를 형질전환용 세포 (Top10)와 함께 얼음에 30분간 방치한 후, 42℃에서 90초간 열충격을 주어 형질도입하였다. 다시 얼음에 5분간 방치한 후, LB 배지 1ml을 주입하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. LB Kan 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 LB Kan 액체배지 3ml에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA prep 키트 (Qiagen)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 또한, 경쇄는 pEL-ID 벡터를 사용하여 상기와 같은 방법으로 DNA를 추출하였다.

상기 수득한 DNA의 E1a_F 프라이머 (서열번호 18), IR2_R 프라이머 (서열번호 19), BstEII 프라이머 (서열번호 20)를 이용한 염기서열분석을 의뢰하였다 (마크로젠).

그 결과, 전체 IgG로 전환한 다양한 IGF1R에 대한 각각 클론의 중쇄와 경쇄의 서열이 MKJP2-IL2 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다. 도 4에 중쇄 (heavy chain), 경쇄 (Light chain)의 아미노산 서열 (서열번호 7 및 8)과 CDR (Complementarity determining regions)을 표기하였다 (표 2).

MKJP2-IL의 중쇄 및 경쇄의 CDR 아미노산 서열

	CDR1	CDR2	CDR3
MKJP2 중쇄	GYAMS (서열번호 1)	AISSDGGST (서열번호 2)	RDPWFSRWTAFDY (서열번호 3)
MKJP2 경쇄	SGSSSNIGNNAVN (서열번호 4)	SNSK (서열번호 5)	GTWDYSLSG (서열번호 6)

실시예 3: 항체의 일시적 발현 ( transient gene expression )

상기 실시예 2에서 클로닝된 전체 IgG 중쇄 DNA와 경쇄 DNA로부터 항체 유전자의 일시적 발현을 수행하였다. CHO-S 세포를 CD-CHO (Gibco, 10743) 배지에 1.5Ｘ10⁶ cells/ml로 농도를 맞춘 후, 8% CO₂, 37℃에서 1일 동안 배양하였다. DNA 형질주입 당일 2.5~3Ｘ10⁶ cells/ml로 자란 세포를 1% DMSO가 포함되어 있는 CD-CHO 배지를 이용하여 2.1Ｘ10⁶ cells/ml의 농도로 준비한 후, 8% CO₂, 37℃에서 3시간 배양하였다. 3000 rpm에서 15분간 원심분리 후, 상등액을 제거한 후, 2.5% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에 재현탁하였다. 중쇄와 경쇄를 발현하는 DNA를 각각 배지 ml당 1μg씩 Opti-MEM 배지에 희석하고, PEI (Polysciences, 23966, stock 농도: 1mg/ml)는 배양 배지 ml당 8μg 희석하였다. DNA 및 PEI 혼합물을 섞어 상온에서 10분 동안 정치한 후 세포가 포함된 플라스크에 넣은 후, 5% CO₂, 37℃, 100rpm으로 4시간 배양한 후, 배양 부피와 동일한 부피의 CD-CHO 배지를 넣어준 후, 8% CO₂, 37℃, 110 rpm에서 4일 동안 배양하였다.

상기 배양이 종료된 후, 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하고, 이를 0.22μm 진공 필터 장치 (Millipore, U.S.A.)로 여과하여, 목적하는 MKJP-IL2 항체를 포함하는 배양액을 수득하였다.

실시예 4 : 항체의 분리 정제

MKJP-IL2 이중 항체를 분리하기 위하여, 평형화 완충액 (50mM Tris-HCl, pH7.4, 100mM NaCl)을 재조합 단백질-A 세파로즈 컬럼 (Histrap rProteinA FF, 5 ml, GE healthcare)에 통과시켜 평형시킨 이후, 실시예 3의 준비된 상등액을 컬럼에 통과하여 발현된 항체가 컬럼에 결합하도록 하였다. 이 후, 0.1M Na-citrate (pH 3.0), 100mM NaCl 용액으로 용출시킨 후, 1M Tris-HCl (pH 9.0)을 이용하여 중화시켜 최종 pH가 7.2가 되게 하였다. 완충액을 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 교환하기 위해 투석하였다.

정제된 항체를 Bis-Tris 4-12% 농도구배 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (NuPAGE gel, Invitrogen)상에서 환원 (Reduced) 및 비환원 (Non-Reduced)상태에서 전기영동하여 순도 및 크기를 확인 한 결과 비환원 상태에서 150 kDa, 환원 상태에서 65 kDa의 중쇄와 25 kDa의 경쇄를 확인하였다 (도 5).

실시예 5: 항체의 항원 특이성 분석

MKJP2의 Fc 부분에 IL2를 융합한 형태가 MKJP2와 동일한 항원 친화도를 보이는지 여부를 확인하기 위해 ELISA를 실시하였다. 면역 배양접시 (Nunc-Immuno plate, Nunc, 44-2404-21)에 IGF-1R (Sino biological Inc. 10164H08H) 단백질 웰당 50ng 넣고, 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 4% BSA가 포함된 PBST를 각 웰당 200μL씩 넣어 상온에서 1시간 배양하여 블로킹하였다. MKJP2-IL2 및 대조군으로써 MKJP2를 최대 20nM에서 최소 0.00033nM로 희석하여 100μL씩 각 웰에 로딩하여 상온에서 1시간 동안 정치하였다. PBST 300μL로 4회 각 웰을 세척한 후, 항-인간-Fc HRP 결합 항체 (Pierce. 31423)를 1:50000으로 4% BSA가 포함된 PBST에 희석한 후, 100μL씩 로딩하여 상온에서 1시간 동안 정치하였다. PBST 300μL로 4회 세척 후, TMB 용액 (sigma, T-0440)을 각 웰에 100μL씩 넣고 반응시킨 후, 1N 황산용액 (sulfuric acid solution, SAMCHUN 7664-93-9)를 50μL씩 넣어 반응을 종료시켜 분석하였다.

그 결과, 도 6과 같이 MKJP2-IL2는 EC₅₀가 0.123nM로 대조군인 MKJP2의 EC₅₀ 0.148nM와 비교하여 동일수준임을 증명하였다.

실시예 6: 항체의 IL2 활성 확인

MKJP2-IL2 항체에 융합되어 있는 IL2의 활성을 확인하기 위하여, rhIL2에 의해서 증식이 활성화되는 CTLL-2 세포를 이용하여, 증식 정도를 통한 IL2 활성을 확인하는 실험을 수행하였다. CTLL-2 세포를 RPMI 1640 (Gibco, 22400-089) 배지에 5X10⁵ cell/ml로 세포 밀도를 맞춘 후, 96-웰 세포 배양접시에 100μL씩 분주하였다. CTLL-2 세포가 분주된 96 웰 배양접시에 MKJP2 항체, MKJP2-IL2 항체, A12 (IMC-A12, ImClone Systems 사), A12-IL2 항체 (A12 항체에 IL2를 융합한 항체)와 rhIL2 (R&D systems, 202-IL)를 각각 2nM, 0.4nM, 0.08nM의 농도로 희석하여 100μL씩 첨가하고 5% CO₂, 37℃에서 2일간 배양한 후, Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, CK04)을 사용해 CTLL-2 세포의 증식 정도를 확인하였다.

그 결과 IL2가 융합되어 있는 항체와 rhIL2 (R&D systems, 202-IL)를 넣어준 웰에서 동일한 수준의 CTLL-2의 증식이 이루어지는 것을 확인하였다 (도 7). 이와 같은 결과는, IL2에 결합된 항체에 의해 IL2 본래의 기능이 저해되지 않음을 뒷받침하는 것으로, 본 발명의 융합 단일클론항체가 암세포로 집중하고, 집중된 암세포에서 IL2 활성을 나타내어 암 치료에 효과가 있음을 뒷받침한다.

실시예 7: 항체의 항-증식 활성 확인

IGF-1R이 과발현되어 있는 인간 유방암 세포인 MCF-7에 IGF-1과 본 발명의 항체인 MKJP2-IL2를 동시에 처리함으로써, IGF-1에 의한 MCF-7의 증식이 억제되는지 여부를 분석하였다.

10% FBS가 포함되어있는 DMEM 배지 내에서 증식시킨 MCF-7을 같은 배지를 이용하여 48 웰에 웰당 2Ｘ10⁴개의 세포가 포함되도록 넣어준 후 300μL의 DMEM 배지를 각 웰에 넣어, 5% CO₂, 37℃에 24시간 배양하여 안정화시켰다. 이후, 상등액을 제거하고 혈청이 포함되지 않은 DMEM (무혈청 배지)을 300μL씩 분주하여 24시간 배양하여 굶주림 (starvation) 상태를 유도하였다. 무혈청 배지에서 IGF-1의 경우 최종 농도가 10nM (1번 시료), MKJP2-IL2의 경우 최고농도 300nM에서 최저농도 0.0034nM가 되도록 희석한 후 (2번 시료), 최종 부피가 300μL가 되도록 하였다. 5% CO₂, 37℃에 4일간 배양한 후, WST-8 (Dojindo, CK04)을 웰당 30μL씩 로딩하여 4시간 동안 배양한 후 O.D 450 nm에서 분석하였다.

그 결과, 도 8에서 보듯이, MKJP2-IL2는 MKJP2와 동등한 수준으로 IGF1에 의한 성장 증식을 억제하는 것으로 분석되었다. 이와 같은 결과는 IL2 융합에도 불구하고 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 암 치료 효과를 유지하는 것을 뒷받침하는 것이다.

실시예 8: 항체의 항원 친화도 분석

MKJP2-IL2 항체의 IGF-1R에 대한 친화도 (Affinity)를 분석하기 위하여 SPR (Surface Plasmon Resonance) 기술을 활용한 비아코아 기기 (BiaCore T200)를 사용하였다. 분석에는 센서칩 (Sensor chip CM5, BIACORE, BR-1005-30)에 항-인간 IgG Fc 항체를 고정화시킨 후 MKJP2 항체를 포획하여 분석하는 포획 (capture) 방법을 적용하였다.

우선, CM5 칩을 항-인간 IgG Fc 항체로 고정화시킨 후, MKJP2-IL2 항체를 고정화된 항-인간 IgG Fc 항체에 결합시켰다. 이후, IGF-1R을 최고 농도 25nM에서 최저 농도 0.78nM까지 총 6개 농도로 희석하고, 희석된 IGF-1R 단백질을 duplicate로 주입하여 분석을 진행하였다. 비아코아 기기를 이용하여 항원-항체간의 결합 및 해리 반응을 유도함으로써 MKJP2-IL2 항체와 IGF-1R간의 kinetics를 분석하였고, 이를 통해 평형 해리 상수값 (dissociation constant, K_D) 값을 확인하였다. 이에 대한, 결과를 도 9에 나타내었다.

친화도 분석은 1) 센서칩에 항-인간 IgG Fc 항체를 고정하는 고정화 단계, 2) 고정화된 센서칩에 MKJP2-IL2 항체를 포획시키는 포획 단계, 3) 포획된 MKJP2-IL2 항체에 서로 다른 농도의 IGF-1R를 흘려주어 친화도를 분석하는 단계로 크게 구분하여 볼 수 있다. 각 시험단계에 대한 구체적인 시험 조건은 다음과 같았다.

1) 센서칩 고정화 단계

MKJP2-IL2 항체의 친화도는 일반적인 항체에 적용되는 포획 방식 중 하나인 항-인간 IgG Fc 항체 포획 방식을 적용하여 분석하였다. 이를 위해, 인간 항체 포획 키트 (Human antibody capture kit, GE, BR-1008-39)를 사용하였다. 우선, 포획 키트 내에 포함되어 있는 항-인간 IgG Fc 항체 스톡 (stock)을 10mM 아세트산나트륨 (pH5.0)으로 1:20으로 희석하여 센서칩 고정화에 사용하였다. 센서칩으로는 CM5 칩 (BR-1005-30)을 사용하였으며, CM5 칩에 항-인간 IgG Fc 항체를 고정화하기 위하여 아민 커플링 키트 (amine coupling kit, BR-1000-50)를 사용하였다. Target RU는 11,000RU로 진행되었다.

2) MKJP2-IL2 항체 포획 단계

다음 단계는 항-인간 IgG Fc 항체가 고정화되어 있는 센서칩에 MKJP2-IL2 항체를 흘려주어 포획시키는 단계로, 정제된 MKJP2-IL2 항체를 분석용 완충액인 HBS-EP 완충액 (BR-1001-88)으로 희석 후 유속 3μL/분으로 200초간 흘려주어 포획시켰다. 포획된 MKJP2-IL2 항체의 경우 센서칩에 직접 고정화한 MKJP2-IL2 항체 대비 일정한 방향성을 가지고 있다는 장점을 지니고 있다.

3) IGF-1R과 MKJP2-IL2 항체를 결합 친화도를 측정하는 단계

IGF-1R과 MKJP2-IL2 항체간 친화 상수 (affinity constant)를 확인하기 위하여 IGF-1R을 서로 다른 5개의 농도로 희석하여 분석에 사용하였다. 본 분석에 사용된 IGF-1R (R&D systems, 391-GR-050) 단백질은 HBS-EP 완충액으로 희석하여 0.78nM, 1.56nM, 3.13nM, 6.25nM 및 12.5nM, 총 5개 농도로 준비하였으며, duplicate로 주입하여 분석을 진행하였다. 분석 시 유속은 3μL/분을 유지하였으며, 결합반응 (association) 1,500초, 해리반응 (dissociation) 3,000초의 조건으로 분석이 진행되었다.

도 9에서 확인할 수 있듯이, MKJP2-IL2 항체 분석 결과 항체의 전형적인 affinity sensogram을 얻었다. 얻어진 sensogram은 BiaCore T200 Evaluation software (Version 1.0)를 사용하여 분석하였고, 측정된 친화 상수는 하기 표 3과 같다.

항체	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	K_D(M)	Rmax	Chi²
MKJP-IL2	8.28E+04	2.91E-05	3.52E-10	39.83	0.929

상기 표3에서 확인할 수 있듯이, 분석 결과 MKJP2-IL2 항체의 IGF-1R에 대한 친화 상수는 3.5 x 10^-10M로 단독 항체 수준과 유사한 것으로 확인되었다.

실시예 9: MKJP2 - IL2 항체의 세포 사멸 유도 효과와 분석

MKJP2-IL2 항체의 IL2에 의해 활성화된 CTLL-2 세포가 MCF-7 유방암 세포의 사멸을 유도하는지 확인하기 위해 사멸 효과 분석 실험 (killing effect assay)을 수행하였다.

구체적으로, MCF-7 세포를 RPMI 1640 (Gibco, 22400-089) 배지에 1X10⁵ cell/ml로 세포 밀도를 맞춘 후, 96 웰 세포 배양접시에 100μL씩 분주 후 6시간 이상 부착시켰다. 부착된 MCF-7 세포내의 배양액을 제거하고 RPMI 1640 (Gibco, 22400-089) 배지에 2 X 10⁵ cell/ml로 세포 밀도를 맞춘 CTLL-2 세포를 100μL씩 분주하였다. MCF-7 세포와 CTLL-2 세포가 분주된 96 웰 배양접시에 MKJP2, MKJP2-IL2, A12, A12-IL2 항체와 rhIL2 (R&D systems, 202-IL)를 각각 2nM, 0.2nM 및 0.02nM의 농도로 희석하여 100μL씩 첨가하고 5% CO₂, 37℃에서 2일간 배양하였다. 2일간 배양한 세포의 배양액을 제거하고, CTLL-2 세포를 제거하기 위해 150μL의 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 2회 세척하였다. 세척한 96 웰 내의 세포에 200μL의 배지를 넣어 주고 WST-8 (Dojindo, CK04)을 웰당 20μL씩 로딩하여 4시간 배양한 후 O.D 450 nm에서 분석하였다.

그 결과, 도 10에서 보듯이 IL2가 융합되어 있는 항체와 rhIL2 (R&D systems, 202-IL)를 넣어준 웰에서 동등한 수준의 CTLL-2 세포에 의한 MCF-7 세포 사멸 효과가 유도되는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는, 항체에 결합된 IL2에 의해 활성화된 CTLL-2 세포가 MCF-7 세포의 사멸을 유도함을 뒷받침하는 것으로, 본 발명의 융합 단일클론항체가 암세포 주위의 면역세포의 활성을 유도함으로써 암치료에 효과가 있음을 뒷받침한다.

실시예 10: 인간 종양 성장에 대한 MKJP2 - IL2 항체의 효과와 분석

7주령 암컷 누드마우스 (찰스리버 저팬 생산)를 대상으로 인간 유방암 세포주 MDA-MB231 세포를 매트리젤 (BD Bioscience, 356237)을 1:1 (v/v)으로 혼합하고, 상기 혼합세포를 1.0x10⁷세포/200μL/마우스의 농도로 상기 누드 마우스의 등부위에 피하 이식하였다. 이식한 종양의 크기가 275.5±7.4mm³ (평균±표준오차)이 되는 시점 (종양 이식 후 9일)에 대조군 (Vehicle), 항암 융합항체인 A12-IL2 (2.0mg/kg), A12-IL2 (4.0mg/kg), MKJP2-IL2 (1.0 mg/kg), MKJP2-IL2 (2.0mg/kg) 및 MKJP2-IL2 (4.0mg/kg)를 각각 실험동물의 정맥에 투여하였고, 각각 4일 1회 간격으로 총 8회 투여하였다. 종양의 크기는 주 2회 측정하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11은 대조군, A12-IL2 및 MKJP2-IL2가 각각 투여된 누드마우스에서 발생된 종양크기 변화를 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다.

도 11에서 보듯이, 측정 최종일의 비히클 (vehicle) 투여군 종양크기 (688.9±91.7mm³)와 대비하였을 때, MKJP-IL2 융합 항체 투여군의 종양 크기는 각각 332.6±127.9mm³ (1.0mg/kg 투여군), 351.5±80.1mm³ (2.0mg/kg 투여군) 및 62.9mm³ (4.0mg/kg 투여군)이었다. 또한, A12-IL2 투여군의 측정 최종일의 종양 크기는 각각 381.1±55.3mm³ (2.0mg/kg 투여군) 및 305.6mm³ (4.0mg/kg 투여군)이었다.

투여개시 시 측정된 종양크기 대비 최종 종양크기를 비율로 나타내면, 종양 성장율은 본 발명의 IL2 융합 항체 투여군이 최대 34.7%이고, 비히클 투여군이 154%로서, 비히클 투여군 대비 본 발명의 융합 항체투여군의 종양성장율이 매우 낮았다. 이는 투여 개시 직후 종양성장 속도가 매우 느려지는 것을 의미하는 것이다.

또한, 상기 결과에서 동일한 항원을 인지하는 A12에 IL2를 융합한 A12-IL2 항체와 본 발명의 MKJP2-IL2 융합 단일클론항체를 각각 4.0mg/kg으로 동량 투여한 결과를 비교하였을 때, 본 발명의 MKJP2-IL2 융합 단일클론항체 투여군 (4.0mg/kg)의 경우, A12-IL2 융합 단일클론항체에 비하여 종양 억제 효과가 2배 가량 우수한 효과를 나타내었다. 이로서, 본 발명의 MKJP2-IL2 항체는 동일항원을 인지하는 기존 항체의 IL2 융합 단일클론항체에 비해서도 항암 효과가 우수함을 알 수 있었다.

또한, IL2를 융합하지 않은 MKJP2 단일클론항체를 대상으로 상기와 동일한 방법으로 in vivo 실험을 수행하였을 때, 10mg/kg 투여군에서, 최종일 기준 325.1±69.4mm³의 종양크기를 나타내었다 (투여 개시시 종양크기: 276.0±11.3mm³; 대조군의 최종일 기준 종양크기: 688.9±91.7mm³).

상기 10mg/kg 투여군의 항암 효과가 본 발명의 IL2 융합 항체 투여군에서는 1.0mg/kg 투여용량, 즉 약 1/10 배 투여용량 (1.0mg/kg MKJP2-IL2)에서 발생하였다. 이로서, 항체에 IL2를 융합할 경우 높은 종양성장억제가 유발되고 그에 기인한 항암효과가 높게 유발됨을 나타내었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> A fusion monoclonal antibody comprising IGF-1R antibody and IL2, and pharmaceutical composition comprising the same <130> KPA130348KR-P1 <150> KR 10-2013-0070628 <151> 2013-06-19 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MKJP2 VH CDR1 <400> 1 Gly Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MKJP2 VH CDR2 <400> 2 Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MKJP2 VH CDR3 <400> 3 Arg Asp Pro Trp Phe Ser Arg Trp Thr Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MKJP2 VL CDR1 <400> 4 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MKJP2 VL CDR2 <400> 5 Ser Asn Ser Lys 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MKJP2 VL CDR3 <400> 6 Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser 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Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln 450 455 460 Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn 465 470 475 480 Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr 485 490 495 Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu 500 505 510 Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn 515 520 525 Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val 530 535 540 Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp 545 550 555 560 Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys 565 570 575 Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ala 580 585 <210> 14 <211> 600 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MKJP2 VH-linker-IL2 <400> 14 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu 465 470 475 480 Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn 485 490 495 Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met 500 505 510 Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu 515 520 525 Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe 530 535 540 His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu 545 550 555 560 Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu 565 570 575 Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln 580 585 590 Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ala 595 600 <210> 15 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MKJP2 heavy chain nucleotide sequence <400> 15 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggcacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttctg atggtggtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcct 300 tggttttcgc ggtggacggc gttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgtcc 360 tccgcctcca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc cctcctccaa gtccacctcc 420 ggcggcaccg ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480 tcctggaact ccggcgccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagtcc 540 tccggcctgt actccctgtc ctccgtcgtg accgtgccct cctcctccct gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgc cctccctgcc ccgcccccga gctgctgggc 720 ggcccctccg tgttcctgtt ccctcctaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 780 cccgaggtga cttgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accccgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agccccggga ggagcagtac 900 aactccacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcccg cccccatcga gaagaccatc 1020 tccaaggcca agggccagcc ccgggagccc caggtgtaca ccctgccccc ctcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta cccctccgac 1140 atcgccgtgg agtgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtcccgg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgtccct gtcccccggc aagtaa 1356 <210> 16 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MKJP2 light chain nucleotide sequence <400> 16 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc aataatgctg tcaactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tctaatagta agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt acttgggatt atagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta ggacagccca aggccgcccc ctccgtgacc 360 ctgttccccc cctcctccga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420 tccgacttct accccggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ctgactcctc ccccgtgaag 480 gccggcgtgg agaccaccac cccctccaag cagtccaaca acaagtacgc cgcctcctcc 540 tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctactcctg ccaggtgacc 600 cacgagggct ccaccgtgga gaagaccgtg gcccccgccg agtgctcctg a 651 <210> 17 <211> 1859 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MKJP2-linker-IL2 heavy chain nucleotide <400> 17 atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcgt gcactccgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gcacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcggt tatgctatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcagcgatc tcttctgatg gtggtagtac atattacgct 240 gattctgtaa aaggtcggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatccttgg 360 ttttcgcggt ggacggcgtt cgactactgg ggccagggta cactggtcac cgtgtcctcc 420 gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc cacctccggc 480 ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 540 tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagtcctcc 600 ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc gtgccctcct cctccctggg cacccagacc 660 tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 720 aagtcctgcg acaagaccca cacctgccct ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 780 ccctccgtgt tcctgttccc tcctaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 840 gaggtgactt gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgggagga gcagtacaac 960 tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatctcc 1080 aaggccaagg gccagccccg ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc ccgggaggag 1140 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc ctccgacatc 1200 gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 1260 ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1320 cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1380 cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag ggtggaggtg gatccggtgg tggaggaagt 1440 ggcggtggcg gcagcgcccc cacctcctcc tccaccaaga agacccagct gcagctggag 1500 cacctgctgc tggacctgca gatgatcctg aacggcatca acaactacaa gaaccccaag 1560 ctgacccgga tgctgacctt caagttctac atgcccaaga aggccaccga gctgaagcac 1620 ctgcagtgcc tggaggagga gctgaagccc ctggaggagg tgctgaacct ggcccagtcc 1680 aagaacttcc acctgcggcc ccgggacctg atctccaaca tcaacgtgat cgtgctggag 1740 ctgaagggct ccgagaccac cttcatgtgc gagtacgccg acgagaccgc caccatcgtg 1800 gagttcctga accggtggat caccttctgc cagtccatca tctccaccct gaccgcggc 1859 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E1a-F primer sequence <400> 18 caggtgtcgt gagagctctc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IR2-R primer sequence <400> 19 agacccctag gaatgctcgt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BstEII primer sequence <400> 20 ctggtcaccg tgtcctccgc 20

Claims

서열번호 1로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 4로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 IGF-1R(Insulin like growth factor-1 receptor)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에, IL2(Interleukin-2)가 연결된, 융합 단일클론항체.
제1항에 있어서,
상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 IgG 형태인 것인 융합 단일클론항체.
제1항에 있어서,
상기 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 Fab', F(ab')₂, Fab, Fv, scFv (Single-chain variable fragment) 및 rIgG로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편의 형태인 것인, 융합 단일클론항체.
제2항에 있어서,
상기 IL2는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 Fc 영역의 C-말단에 연결된 것인, 융합 단일클론항체.
제1항에 있어서,
상기 IGF-1R에 대하여 특이적으로 결합하는 단일클론항체와 IL2는 링커로 연결된 것인, 융합 단일클론항체.
제5항에 있어서,
상기 링커는 펩타이드 링커인 것인, 융합 단일클론항체.
제6항에 있어서,
상기 펩타이드 링커는 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 융합 단일클론항체.
제1항에 있어서,
상기 IL2는 서열번호 9의 아미노산 서열로 정의되는 것인, 융합 단일클론항체.
제1항에 있어서,
상기 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 서열번호 7의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 8의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합 단일클론항체.
제1항에 있어서,
상기 융합 단일클론항체는 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드를 포함하는 것인, 융합 단일클론항체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제12항의 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체.
(i) 제13항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(ii) 상기 배양된 형질전환체의 배양물로부터 융합 단일클론항체를 회수하는 단계를 포함하는, 융합 단일클론항체의 제조방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단일클론항체를 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
제15항에 있어서,
상기 암은 유방암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종 및 혈액암으로 구성되는 군에서 선택된 것인 암 치료용 약학적 조성물.