CN111886024A - 抗tip-1抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明描述了抗TIP‑1抗体及其抗原结合片段。本发明还描述了编码所述抗体的核酸、包含所述抗体的组合物、制备所述抗体的方法，以及使用所述抗体治疗或预防疾病，例如癌症的方法。

Description

抗TIP-1抗体及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年3月8日提交的美国临时申请62/640,123的优先权。通过引用将其公开内容整体并入本文。

发明领域

本发明涉及单克隆抗TIP-1抗体、编码该抗体的核酸和表达载体、包含该载体的重组细胞，以及包含该抗体的组合物。本发明还提供了制备抗体的方法，以及使用该抗体治疗包括癌症在内的疾病的方法。

电子提交的序列表的引用

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发明背景

Tax互作蛋白1(TIP-1，也称为Tax1bp3或谷氨酰胺酶互作蛋白，GIP)是一种包含PDZ(PSD-95/Discs large/ZO-1同源)结构域的胞内蛋白(人类和老鼠中有124个氨基酸)。包含124个氨基酸蛋白中残基13-112的单个PDZ结构域(Olalla等，FEBS Lett 2001；488：116-122)，是TIP-1能够识别的唯一功能和结构单元。这表明TIP-1在含PDZ的蛋白中有独特作用，并且可以仅通过蛋白-蛋白互作发挥其功能。

TIP-1通过PDZ结构域与许多胞内蛋白互作，包括谷氨酰胺酶L、β-连环蛋白(β-Catenin)、FAS、HTLV Tax、HPV E6、Rhotekin和Kir 2.3(Zoetewey等，生物化学2011；50：3528-3539)。但是，TIP-1的确切生物功能仍不清楚。在人类浸润性乳腺癌细胞中检测到TIP-1表达提高，并显示与肿瘤细胞粘附、迁移和肺转移有关(Han等，生物化学和生物物理研究通讯2012；422：139-145)。

最近，发现TIP-1在辐射诱导后可易位至癌细胞表面(Yan等，癌症靶标2016；7：43352-43362)，表明TIP-1可能是基于诱导的癌症新抗原。因此，抗TIP-1单克隆抗体(mAb)可用于选择性靶标癌细胞并用作潜在的治疗药物。

发明概述

在一个总体方面，本发明涉及结合TIP-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，分别具有以下多肽序列：

a.分别为SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8；

其中抗体或其抗原结合片段特异性结合TIP-1，优选人TIP-1。

在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其多肽序列与SEQ ID NO：1至少有95％同一性，或包含轻链可变区，其多肽序列与SEQ ID NO：2至少有95％同一性。

在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括：

a.具有SEQ ID NO：1所示多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：2所示多肽序列的轻链可变区。

在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，能够通过结合细胞表面上TIP-1来介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)，从而诱导效应子介导的肿瘤细胞裂解，和/或介导偶联药物的募集，和/或与具有抗癌效应的另一种单克隆抗体或其抗原结合片段形成双特异性抗体。

在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是嵌合的。

在某些实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人的或人源化的。

本发明还提供了分离的核酸，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的。

本发明还提供了载体，其包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。

本发明还提供了宿主细胞，其含有包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸的载体。

在某些实施方式中，提供了药物组合物，其包含本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的运载体。

本发明还提供了治疗有此需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。所述癌症可以是任何液体或实体癌，例如，可以选自但不限于肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤、以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓细胞性白血病(AML)和其他液体肿瘤。

本发明还提供了产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法包括在产生所述单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，以及从所述细胞或培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。

本发明还提供了制备包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，所述方法包括将所述单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的运载体组合以获得药物组合物。

本发明还提供了确定受试者中TIP-1水平的方法。所述方法包括(a)从受试者获得样品；(b)使样品与本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；(c)确定受试者中TIP-1的水平。所述样品可以是，例如组织样品或血液样品。所述组织样品可以是，例如癌组织样品。

附图的简要说明

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的前述概述以及以下本申请的优选实施例的详细描述。然而，应当理解，本申请不限于附图中所示的明确实施例。

图1显示了在ELISA测定中纯化的小鼠抗TIP-1mAb T2与TIP1-Myc-DDK的结合情况。所使用的T2 mAb浓度为(图中从左到右)：分别为500ng/ml,20ng/ml,5ng/ml,和1ng/ml；仅二抗，该组未接受一抗处理，但用HRP偶联的抗小鼠IgG二抗处理；无抗体，既没有添加一抗也未添加二抗。

图2显示了在ELISA测定中抗TIP-1嵌合mAb(小鼠的VH和VL分别融合于人IgG1和κ链恒定区)T2的结合力；所使用的T2嵌合mAb浓度为(图中从左到右)：分别为18ng/ml,4ng/ml和1ng/ml；仅二抗，未用一抗处理但用HRP结合抗小鼠IgG二抗处理；无抗体，既未添加一抗也未添加二抗。

发明详述

背景技术和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献各自通过引用整体并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、物品等的讨论是为了提供本发明的背景。对于所公开或要求保护的任何发明内容，这种讨论并非承认所有这些或任何这些事项构成现有技术的一部分。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。否则，本文中使用的某些术语具有说明书中阐述的含义。

必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”，“一种”和“该”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。

除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，在任何情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样的，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所使用的，数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围，该范围内的所有单个数值，包括该范围内的整数和分数，除非上下文另外明确指出。

除非另有说明，否则一系列元件之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元件。仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方式的许多等同形式。本发明旨在涵盖这样的等同方案。

如本文所用，术语“包含”、“包含有”、“包括”、“包括有”、“具有”、“有”、“含有”或“含有的”或其任何其他变型将被理解为隐含地包括陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且是非排他性的或开放式的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、步骤、方法、物品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括此组合物、混合物、步骤、方法、物品或设备中未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确指出相反的意思，否则“或”是指包含性的“或”而不是排他性的“或”。例如，以下任一条件都满足条件A或B：A为真(或存在)并且B为假(或不存在)、A为假(或不存在)并且B为真(或存在)，以及A和B均为真(或存在)。

如本文所用，多个述及的元素之间的连接术语“和/或”应理解为包括单独的和组合的选择。例如，在两个元素由“和/或”连接的情况下，第一个选项是指适用第一个元素而没有第二个元素。第二个选项是指适用第二个元素而没有第一个元素。第三个选项是指第一和第二元素一起适用。这些选项中的任何一个都应理解为落入该含义内，并因此满足本文所用术语“和/或”的要求。不止一个选项的并行适用也应理解为在其含义之内，因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用的术语“由……组成”或诸如“由……构成”或“由……所组成”等变体表示包括任何所述整数或整数组，但是指定的方法、结构或组合物中不能增加其他的整数或整数组。

如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由……组成”或诸如“基本上由……构成”或“基本上由……所组成”等变体表示包括任何所述的整数或整数组，并且可选地包含不会实质上改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖性质的任何所述整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。

如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选为哺乳动物，最优选为人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，但更优选人。

还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，如本文所用的术语“大约”、“约”、“通常”、“基本上”以及类似术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除其在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的那样。至少，包括数字参数的此类引用将包括使用本领域公认的数学和工业原理(例如，四舍五入、测量或其他系统误差、制造公差等)不会改变最小有效位数的变化。

在两个或多个核酸或多肽序列(例如，抗TIP-1抗体和编码它们的多核苷酸，TIP-1多肽和编码它们的TIP-1多核苷酸)的上下文中，术语“同一的”或“同一性”百分比是指，当使用以下序列比较算法之一或通过目视检查进行比较和比对以获得最大对应性时，两个或多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同。

为了进行序列比较，通常将一个序列用作参比序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数，计算测试序列相对于参比序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可以例如通过如下算法进行，例如通过Smith和Waterman，高等应用数学，2：482(1981)的局部同源算法进行，通过Needleman和Wunsch，分子生物学杂志，48：443(1970)的同源性比对算法进行，通过Pearson和Lipman，美国国家科学院学报，85：2444(1988)的相似性搜索方法进行，通过这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，位于威斯康星州的575科学Madison博士的遗传学计算机组的遗传学软件包中)，或通过目视检查实现(通常参见，分子生物学实验室指南，F.M.Ausubel等编辑，实验室指南，格林出版联合公司(Greene Publishing Associates,Inc.)和约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)的合资企业(1995年副刊)(Ausubel))。

适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，这些算法在Altschul等(1990)，分子生物学杂志，215：403-410和Altschul等(1997)，核酸研究，25：3389-3402中分别进行了描述。可通过国家生物技术信息中心的公开途径获得进行BLAST分析的软件。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短序列来识别高分序列对(HSP)，这些短序列在与数据库序列中相同长度的序列对齐时匹配或满足某个正值阈值T。T被称为邻近序列分数阈值(Altschul等，同上)。这些最初的邻近序列的命中充当启动搜索以查找包含它们的较长HSP的种子。然后沿着两个方向将序列的命中在每个序列延伸至累积比对得分不再增加。

对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的加分；始终>0)和N(错配残基的罚分；始终<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，将停止序列的命中在每个方向上的延伸：累积比对得分比其最大获得值降低数值X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4，以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)为3、期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff和Henikoff，美国国家科学院学报，89：10915(1989))。

除了计算序列同一性百分比外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul，美国国家科学院学报，90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，它提供了偶然发生两个核苷酸或氨基酸序列匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参比核酸的比较中，最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，最优选地小于约0.001，则认为该核酸与参比序列相似。

如下所述，若由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽在免疫学上交叉反应，则进一步指示两个核酸序列或多肽基本上相同。因此，例如，当两条多肽中仅通过保守取代而不同，则通常认为其中一条多肽与第二多肽基本相同。两个核酸序列基本相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。

抗体

本发明总体上涉及分离的抗TIP-1抗体，编码所述抗体的核酸和表达载体，包含所述载体的重组细胞，以及包含所述抗体的组合物。本发明还提供了制备所述抗体的方法，以及使用所述抗体治疗疾病的方法，所述疾病包括癌症。本发明的抗体具有一种或多种所需的功能特性，包括但不限于与TIP-1的高亲和力结合，对TIP-1的高特异性，以及在动物模型中单独或与其他抗癌疗法组合给药时抑制肿瘤生长的能力。

在总体方面，本发明涉及特异性结合TIP-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。

如本文所用，术语“抗体”以广义使用，并且包括免疫球蛋白或抗体分子，所述抗体分子包括单克隆或多克隆的人、人源化、复合和嵌合抗体以及抗体片段。通常，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白或肽链。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五个主要类别(即，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可以是五个主要类别或相应的亚类别中的任何一个。优选地，本发明的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。脊椎动物物种的抗体轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被指定为两种明显不同的类型之一，即κ和λ。因此，本发明的抗体可以包含κ或λ轻链恒定结构域。根据特定的实施方式，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除重链和轻链恒定结构域外，抗体还包含由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，两者均包含三个结构域(即互补决定区1-3；(CDR1、CDR2和CDR3))。所述轻链可变区结构域可替代地称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述重链可变区结构域可替代地称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。

如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合TIP-1的分离的抗体基本上不含不与TIP-1结合的抗体)。另外，分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能少量存在的天然的突变以外，包含种群的单个抗体是同一的。本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或重组DNA方法来制备。例如，所述单克隆抗体可以由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括获自具有人源重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(如转基因小鼠或大鼠)的B细胞。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单域抗体(sdab)、scFv二聚体(双价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼源单域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体，或任何其他与抗原结合但不包含完整的抗体结构的抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段结合的相同抗原结合。根据特定的实施方式，所述抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和重链的Fd区段。根据其他特定的实施方式，所述抗原结合片段包含Fab和F(ab')。

如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域中常规的单链抗体，其包含通过约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域中常规的单域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区，或仅包含重链可变区。

如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或使用本领域已知的任何技术制备的具有与由人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体、其片段，和/或包含至少一种人重链和/或轻链多肽的抗体。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指进行修饰以增加与人抗体的序列同源性，从而保留了抗体的抗原结合特性，但降低了其在人体中的抗原性的非人抗体。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个或更多个物种的抗体。轻链和重链的可变区通常对应于衍生自一种哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有期望的特异性、亲和力和性能的抗体的可变区，而恒定区对应于衍生自另一种哺乳动物(例如人)的抗体的序列，以避免引起该物种的免疫应答。

如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方式中，所述第一和第二表位在同一抗原上，例如，在同一蛋白(或多聚蛋白的亚基)上。在一个实施方式中，所述第一和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方式中，所述第一和第二表位不重叠或基本不重叠。在一个实施方式中，所述第一和第二表位在不同抗原上，例如，在不同的蛋白(或多聚体蛋白的不同亚基)上。在一个实施方式中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方式中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体，或四特异性抗体分子。

如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两个抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方式中，所述第一和第二表位在同一抗原上，例如，在同一蛋白(或多聚蛋白的亚基)上。在一个实施方式中，所述第一和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方式中，所述第一和第二表位在不同抗原上，例如，在不同的蛋白(或多聚体蛋白的不同亚基)上。在一个实施方式中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结合域序列和轻链可变结构域序列，和对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方式中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方式中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，和对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。在一个实施方式中，所述第一表位位于TIP-1上，所述第二表位位于PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、EGFR、HER-2、CD19、CD20、CD33、CD47、CD73、爱帕琳肽(apelin)、DLL3、连接蛋白(claudin)18.2(CLDN18.2)、FRα(叶酸受体α)、CD3和/或其他与肿瘤相关的免疫抑制剂或表面抗原上。

如本文所用，术语“TIP-1”是指tax互作蛋白1(TIP-1，也称为Tax1bp3或谷氨酰胺酶互作蛋白，GIP)，是一种包含PDZ(PSD-95/Discs large/ZO-1同源)结构域的胞内蛋白(人类和老鼠中有124个氨基酸)(Besser等，Dev Growth Differ 49：205-214(2007))。PDZ结构域为小(80-100个残基)蛋白-蛋白互作基序，通常与其伴侣蛋白质的C端(Lee和Zheng，CellCommun Signal 8：8(2010))结合。单个PDZ结构域，包含124氨基酸蛋白的残基13-112(Olalla等，FEBS Lett 488：116-122(2001))，是TIP-1能够识别的唯一功能和结构单元。TIP-1在人体组织中普遍表达(Alewine等，分子生物细胞17：4200-4211(2006))。TIP-1通过PDZ结构域与许多胞内蛋白相互作用，包括谷氨酰胺酶L、β-连环蛋白(β-Catenin)、FAS、HTLV Tax、HPV E6、Rhotekin和Kir 2.3(Zoetewey等，生物化学，50：3528-3539(2011))，并可能发挥多种生物学功能。例如，通过与基底外侧膜mLin-7/CASK复合物竞争与钾通道Kir2.3的相互作用，TIP-1抑制了Kir 2.3的靶标从而极化质膜(Alewine等，分子生物细胞17：4200-4211(2006))。在人类浸润性乳腺癌细胞中检测到TIP-1表达提高，并显示与肿瘤细胞粘附、迁移和肺转移有关(Han等，生物化学和生物物理研究通讯422：139-145(2012))。TIP-1在通过辐射诱导后易位至癌细胞表面(Yan等，癌症靶标，7：43352-43362(2016))，表明TIP-1可能是诱导后的癌症新抗原。人TIP-1的示例性氨基酸序列在GenBank登录号O14907.2(SEQ ID NO：9)中显示。

如本文所用，“特异性结合TIP-1”的抗体是指与TIP-1，优选人TIP-1结合的抗体，其KD值1×10^-7M或更低，优选1×10^-8M或更低，更优选5×10^-9M或更低、1×10^-9M或更低、5×10^-10M或更低、1×10^-10M或更低。术语“KD”是指解离常数，其是从Kd与Ka之比(即，Kd/Ka)获得的，并被表示为摩尔浓度(M)。鉴于本公开，可以使用本领域的方法测定抗体的KD值。例如，抗体的KD可以通过使用表面等离子体共振来确定，例如通过使用生物传感器系统，例如

系统，或者通过使用生物层干涉技术，例如Octet RED96系统。

抗体的KD值越小，所述抗体与靶抗原结合的亲和力越高。

根据一个特定方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3,分别具有以下多肽序列：

a.SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8；

其中抗体或其抗原结合片段特异性结合TIP-1，优选人TIP-1。

根据另一个特定方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO：1具有至少85％、优选90％、更优选95％或更高，例如95％、96％、97％，98％或99％的同一性的多肽序列的重链可变区，或含有与SEQ ID NO：2具有至少85％、优选90％、更优选95％或更高，例如95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽序列的轻链可变区。根据一个优选的实施方式，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段分别包含含有与SEQ ID NO：1具有至少85％、优选的90％、更优选的95％或更高，例如95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽序列的重链可变区，和含有与SEQ ID NO：2具有至少为85％、优选的为90％、更优选的为95％或更高，例如95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽序列的轻链可变区。

根据另一个特定方面，本发明涉及本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括：

a.具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：2的多肽序列的轻链可变区；

在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别具有SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8的多肽序列。在另一个实施方式中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：1至少85％、优选的90％、更优选的95％或更高，例如95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列的重链可变区，和包含具有与SEQ ID NO：2至少为85％、优选的为90％、更优选的为95％或更高，例如95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列的轻链可变区。优选地，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区；和具有SEQ ID NO：2的多肽序列的轻链可变区。

根据另一个特定方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的。

根据另一个特定方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人或人源化的。

在另一个总体方面，本发明涉及一分离的核酸，编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员熟知，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下改变(例如，替换、缺失、插入等)蛋白质的编码序列。因此，本领域技术人员能够理解，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下，改变编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸序列。

在另一个总体方面，本发明涉及一种载体，其包含编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何载体，例如质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方式中，所述载体是重组表达载体，如质粒。所述载体可以包括用于构建表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或抑制型启动子。本领域已知，许多表达载体能够将核酸递送至细胞，其可以在本发明中使用，用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施方式，可以利用常规克隆技术或人工基因合成生产重组表达载体。

在另一个总体方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开内容，本领域技术人员已知的任何宿主细胞可用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体)、CHO-DG44或CHO-K1细胞或HEK293细胞(用于表达例如全长IgG抗体)。根据具体的实施方式，通过常规方法例如化学转染、热休克或电穿孔将重组表达载体转化到宿主细胞中，其被稳定整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸得到有效表达。

在另一个总体方面，本发明涉及制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，并从细胞或细胞培养物(如从上清液中)中回收抗体或其抗原结合片段。可以从细胞中收获表达的抗体或其抗原结合片段，并根据本领域已知的和本文所述的常规技术进行纯化。

药物组合物

在另一个总体方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含分离的本发明单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的运载体。如本文所用，术语“药物组合物”是指包含本发明的抗体和药学上可接受的运载体的产品。本发明的抗体和包含它们的组合物也可用于制备药物，所述药物用于本发明提及的治疗性应用。

如本文所用，术语“运载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含脂质的囊泡、微球体、脂质包封体、或本领域已知的用于药物制剂的其他物质。应当理解，运载体、赋形剂或稀释剂的特性取决于具体应用的给药途径。如本文所用，术语“药学上可接受的运载体”是指不干扰本发明所述组合物的有效性或本发明所述组合物的生物活性的无毒物质。根据具体实施方式，鉴于本公开内容，适用于抗体药物组合物的任何药学上可接受的运载体均可用于本发明。

用药学上可接受的运载体进行药学活性成分的配制是本领域已知的，例如《雷明顿：药学的科学与实践》(例如，第21版(2005年)以及任何更高版本)。其他成分的非限制性实例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张度调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的运载体可以用于配制本发明的药物组合物。

在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物是液体制剂。液体制剂的优选实例是水性制剂，即包含水的制剂。液体制剂可以包含溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等。水性制剂通常包含至少50％w/w的水，或至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％w/w的水。

在一种实施方式中，所述药物组合物可以配制成可以，例如通过注射装置(例如，注射器或输液泵)注射的注射剂。例如，可以皮下、肌肉内、腹膜内、玻璃体内或静脉内递送注射剂。

在另一种实施方式中，所述药物组合物是固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可以原样使用，或在使用前由医师或患者向其添加溶剂和/或稀释剂。固体剂型可包括片剂，例如压制片剂和/或包衣片剂，以及胶囊剂(例如，硬或软明胶胶囊)。所述药物组合物也可以是例如小包装、糖衣丸、粉末、颗粒、锭剂或用于重构的粉末的形式。

剂型可以是立即释放的，在这种情况下，它们可以包含水溶性或分散性载体，或者可以是延迟释放，持续释放或调节释放，在这种情况下，它们可以包含调节剂型在胃肠道或皮肤下的溶解速率的水不溶性聚合物。

在其他实施方式中，所述药物组合物可以通过鼻内、颊内或舌下递送。

水性制剂中的pH可以在pH 3至pH 10之间。在本发明的一种实施方式中，制剂的pH为约7.0至约9.5。在本发明的另一种实施方式中，制剂的pH为约3.0至约7.0。

在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的非限制性实例包括：精氨酸、天冬氨酸、二甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、富马酸、甘氨酸、双甘氨肽、组氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸、酒石酸、三甲基甘氨酸和三(羟甲基)-氨基甲烷及其混合物。缓冲剂可以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度单独存在或组合存在。包含这些特定缓冲剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。

在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含防腐剂。防腐剂的非限制性实例包括：苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、溴硝醇、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己定、氯苯甘醚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、咪唑烷脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯基乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫柳汞及其混合物。防腐剂可以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度单独存在或组合存在。包含这些特定防腐剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。

在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含等渗剂。该实施方式的非限制性实例包括盐(例如氯化钠)、氨基酸(例如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、糖醇(例如丙三醇、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)及其混合物。等渗剂的另一个实例包括糖。糖的非限制性实例可以是单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β-HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一个实例是糖醇，其中术语“糖醇”定义为具有至少一个-OH基团的C(4-8)烃。糖醇的非限制性实例包括甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。等渗剂可以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度单独存在或组合存在。包含这些特定等渗剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。

在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含螯合剂。螯合剂的非限制性实例包括柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)盐及其混合物。螯合剂可以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度单独存在或组合存在。包含这些特定螯合剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。

在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性实例包括一种或多种聚集抑制剂，一种或多种氧化抑制剂，一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。

在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含稳定剂，其中所述稳定剂是羧基-/羟基纤维素及其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、2-甲硫基乙醇、聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、盐(例如氯化钠)、含硫物质(例如硫代甘油)或巯基乙酸。稳定剂可以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度单独存在或组合存在。包含这些特定稳定剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。

在本发明的其他实施方式中，所述药物组合物包含一种或多种表面活性剂，优选一种表面活性剂、至少一种表面活性剂、或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指由水溶性(亲水)部分和脂溶性(亲脂)部分组成的任何分子或离子。表面活性剂可以例如选自下组：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂可以约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度单独存在或组合存在。包含这些特定表面活性剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。

在本发明的另一种实施方式中，所述药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，例如EDTA和/或盐酸(HCl)苯甲脒。蛋白酶抑制剂可以约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度单独存在或组合存在。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的每一种的药物组合物构成本发明的替代实施方式。

在另一个总体方面，本发明涉及制备包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的运载体组合以获得所述药物组合物。

使用方法

在另一个总体方面，本发明涉及靶向位于受试者癌细胞表面TIP-1的方法，该方法包括向受试者施用与TIP-1特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明药物组合物。TIP-1单克隆抗体或其抗原结合片段能够结合受试者的癌细胞表面上的TIP-1。抗TIP-1单克隆抗体或其抗原结合片段与细胞表面上易位的TIP-1的结合可募集免疫系统的效应细胞、补体系统和/或偶联药物以介导该受试者中的癌症杀伤活动。抗TIP-1单克隆抗体可以，例如与另一种单克隆抗体或其抗原结合片段形成双特异性抗体，从而介导受试者中的癌症杀伤活性。

结合TIP-1的抗体及其抗原结合片段的功能活性可以通过本领域已知的和本发明所述的方法表征。表征结合TIP-1的抗体及其抗原结合片段的方法包括但不限于亲和力和特异性测定法，包括Biacore、ELISA和OctetRed分析；基于FACS的结合实验，以检测抗体与癌细胞上TIP-1的结合力。根据特定的实施方式，表征与TIP-1结合的抗体及其抗原结合片段的方法包括以下所描述的。

在另一个总体方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用分离的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物，该单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合TIP-1。例如，癌症可以选自但不限于肺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓性白血病(AML)和其他液体肿瘤。

根据本发明的实施方式，所述药物组合物包含治疗有效量的抗TIP-1抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物或药物反应的活性成分或组分的量。根据所述目的，可以以经验和常规方式确定治疗有效量。

如本文所用，关于抗TIP-1抗体或其抗原结合片段，治疗有效量是指在需要的受试者中调节免疫应答的抗TIP-1抗体或其抗原结合片段的量。

根据特定的实施方式，治疗有效量是指足以实现以下一、二、三、四或更多种以下效果的治疗量：(i)降低或改善要治疗的疾病，病症或病状或与之相关的症状的严重程度；(ii)减少待治疗的疾病，病症或病状或与之相关的症状的持续时间；(iii)预防待治疗的疾病，病症或病状的发展，或与之相关的症状；(iv)使待治疗的疾病，病症或病状或与之相关的症状消退；(v)预防待治疗的疾病，病症或病状或与之相关的症状的发展或发作；(vi)防止待治疗的疾病，病症或病状或与其相关的症状的复发；(vii)减少患有具有待治疗的疾病，病症或病状或与之相关的症状的受试者的住院；(viii)减少患有要治疗的疾病，病症或病状或与之相关的症状的受试者的住院时间；(ix)增加患有要治疗的疾病，病症或病状或与之相关的症状的受试者的存活率；(xi)在受试者中抑制或减轻要治疗的疾病，病症或病状或与之相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗作用。

治疗有效量或剂量可根据各种因素而变化，例如待治疗的疾病、病症或症状、给药方式、靶位点、受试者的生理状态(包括，例如年龄、体重、健康状况)、受试者是人还是动物、施用的其他药物、以及该处理是预防还是治疗。优化滴定的治疗剂量，以优化安全性和有效性。

根据具体的实施方式，配制本文所述的组合物，以使其适合向受试者施用的预期途径。例如，本文所述的组合物可以配制成适合于静脉内、皮下或肌肉内施用的形式。

如本文所用，术语“治疗”、“治疗的”和“疗法”均旨在指改善或逆转与癌症有关的至少一种可测的生理参数，其在受试者中不必须可辨别，但在受试者中可辨别。术语“治疗”、“治疗的”和“疗法”还可指使得疾病、病症或症状消退、阻碍其进展、或至少减缓其进展。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指减轻，预防与疾病、病症或症状(例如肿瘤，更优选地为癌症)相关的一种或多种症状的发展或发作，或减少其持续时间。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指预防疾病、病症或症状的复发。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指增加患有疾病、病症或症状的受试者的存活率。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指治愈受试者的疾病、病症或症状。

根据特定的实施方式，提供了用于治疗癌症的组合物。对于癌症疗法，该组合物可以与另一种疗法结合使用，包括但不限于：化学疗法、抗CD20 mAb、抗TIM-3mAb、抗LAG-3mAb、抗CD73 mAb、抗CD47 mAb、抗爱帕琳肽(apelin)mAb、抗连接蛋白(claudin)18.2mAb、抗DLL3 mAb、抗FRmAb mAb、抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、PD-1/PD-L1治疗、其他免疫肿瘤药物、抗血管生成剂、放射治疗、抗体-药物偶联物(ADC)、靶向治疗或其他抗癌药物。抗TIP-1抗体可与针对以下靶点的伴侣mAb共同构建双特异性抗体以治疗表达CLDN18.2和特定肿瘤相关抗原的癌症/肿瘤：PD-1、PD-L1、LAG3、TIM-3、CTLA-4、EGFR、HER-2、CD19、CD20、CD33、CD73、CD47、CD3、爱帕琳肽(apelin)、DLL-3、CLDN18.2、叶酸受体α(FOLR1)，和/或其他肿瘤表面抗原。

如本文所用，向受试者施用两种或更多种疗法的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种的疗法。使用的术语“联合”不限制向受试者施用的治疗的顺序。例如，向受试者施用第一种疗法(例如，本文所述的组合物)可以在施用第二种疗法之前(例如，提前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)，同时，或之后(例如，延后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)。

在另一个总体方面，本发明涉及一种确定受试者中TIP-1水平的方法。所述方法包括(a)从受试者获得样品；(b)使所述样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；(c)确定受试者中TIP-1的水平。

如本文所用，“样品”是指从受试者分离的生物样品，可以包括但不限于全血、血清、血浆、血细胞、内皮细胞、活检组织(例如，癌组织、肝组织等)、淋巴液、腹水、组织液、骨髓、脑脊液、唾液、粘液、痰、汗液、尿液或任何其他分泌物、排泄物或其他体液。“血液样品”是指全血或其任何部分，包括血细胞、血清和血浆。

在某些实施方式中，可以使用选自但不限于下组的方法测定受试者中TIP-1的水平：蛋白质印迹(Western blot)分析、ELISA测定，和/或免疫组织化学(IHC)来确定。相对蛋白水平可以通过蛋白质印迹分析和免疫组织化学(IHC)来确定，绝对蛋白水平可以通过ELISA分析来确定。当确定TIP-1的相对水平时，可以在至少两个样品之间测定TIP-1水平，例如，在不同时间点来自同一受试者的样品之间、来自同一受试者的不同组织的样品之间，和/或来自两个受试者的样品之间TIP-1的水平。或者，当测定TIP-1的绝对水平时，例如通过ELISA测定法时，可以通过在测试样品之前为ELISA分析建立标准来确定样品中TIP-1的绝对水平。本领域技术人员将理解，利用本发明的抗体或其抗原结合片段，可使用哪种分析技术确定来自受试者的样品中的TIP-1水平。

利用确定受试者样品中TIP-1水平的方法，可诊断疾病中TIP-1水平的异常(升高、降低或不足)并做出适当的治疗决策。此类疾病可能包括，如癌症的疾病。此外，通过监测受试者的TIP-1水平，可以基于对特定疾病和/或在特定疾病的进展过程中TIP-1水平的了解来确定发生上述疾病的风险。

实施例

本发明提供以下非限制性实施方式。

实施方式1是分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，分别具有以下所示多肽序列：

b.SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8；

其中抗体或其抗原结合片段特异性结合TIP-1，优选人TIP-1。

实施方式2是实施方式1所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO：1至少95％相同的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NO：2至少95％相同的多肽序列的轻链可变区。

实施方式3是实施方式1或2的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

a.具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：2的多肽序列的轻链可变区；

实施方式4是实施方式1-3中任一项所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体或其抗原结合片段能够诱导效应子介导的肿瘤细胞裂解。

实施方式5是实施方式1-4中任一项所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的。

实施方式6是实施方式1-5中任一项所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人的或人源化的。

实施方式7是分离的核酸，其编码实施方式1-6中任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段。

实施方式8是包含实施方式7所述分离的核酸的载体。

实施方式9是包含实施方式8所述载体的宿主细胞。

实施方式10是药物组合物，其包含实施方式1-6中任一项所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的运载体。

实施方式11是在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括向受试者施用实施方式10所述药物组合物。

实施方式12是将TIP-1靶向有需要的受试者的癌细胞表面的方法，该方法包括向受试者施用实施方式10所述药物组合物。

实施方式13是产生实施方式1-6中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在产生该单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码该单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，并从细胞或培养物中回收抗体或其抗原结合片段。

实施方式14是生产包含实施方式1-6中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，其包括将该单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的运载体组合以获得该药物组合物。

实施例15是确定受试者中TIP-1水平的方法，该方法包括：

a.从受试者获得样品；

b.使样品与权利要求1-6中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；和

c.确定受试者中TIP-1的水平。

实施方式16是实施方式15的方法，其中所述样品是组织样品。

实施方式17是实施方式16的方法，其中所述组织样品是癌组织样品。

实施方式18是权利要求15的方法，其中所述样品是血液样品。

实施例

实施例1：抗TIP-1单克隆抗体的鉴定

用含有谷胱甘肽S-转移酶(GST)和TIP-1(GST-TIP-1)的融合蛋白免疫小鼠，并用含有HIS标签、白喉毒素A片段(DTA)和TIP-1(HisDTA-TIP-1)的另一种融合蛋白加强免疫。血浆滴度通过ELISA确定。小鼠安乐死后，收集淋巴结产生杂交瘤。杂交瘤在96孔组织培养板中生长，使用GST-TIP-1通过ELISA筛选各孔的上清液中的阳性信号，GST用于反向筛选。阳性结果通过Myc-DDK标签的TIP-1(TIP1-Myc-DDK)ELISA证实。分离顶层阳性克隆并测序。

表1和表2提供了抗TIP-1单克隆抗体T2的重链和轻链可变区的序列，表3和表4提供了抗TIP-1单克隆抗体T2的CDR区。

表1：抗TIP-1mAb的重链可变区序列

VH：重链可变区

表2：抗TIP-1mAb的轻链可变区序列

VL：轻链可变区

表3：抗TIP-1mAb的重链CDR区1-3

HC：重链；CDR：互补决定区

使用IMGT方法确定了抗TIP-1mAb的HC CDR(Lefranc，M.-P.等，Nucleic AcidsRes.1999；27:209-212).

表4：抗TIP-1mAb的轻链CDR区1-3

LC：轻链；CDR：互补决定区

使用IMGT方法确定了抗TIP-1mAb的LC CDR(Lefranc，M.-P.等，Nucleic AcidsRes.1999；27:209-212).

实施例2：从杂交瘤上清液和转染的293E细胞培养基中生产和纯化mAb T2

使用A蛋白亲和色谱法从杂交瘤培养基/上清液中纯化小鼠抗TIP-1mAb T2。为了获得重组的抗TIP-1嵌合mAb，将含有分别与人IgG1重链和κ轻链恒定区融合的小鼠VH和VL的表达载体瞬时转染到293E细胞中。使用A蛋白亲和色谱法纯化在293E细胞悬液中产生的重组抗体。

实施例3：纯化抗体的ELISA结合分析

将碳酸盐包被缓冲液中的TIP1-Myc-DDK在室温下涂覆在ELISA板上1小时(50L/孔，1μg/mL)。洗涤后，将ELISA板在5％BSA的PBS溶液中封闭1小时，然后再次洗涤。加入抗TIP-1mAb，混合并在室温下孵育60分钟。洗涤板，并通过以下方式检测抗TIP-1mAb与固定的TIP1-Myc-DDK的结合情况：添加PBS配制的二抗，即与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG(ThermoFisher Scientific，#A16084)或与辣根过氧化物酶偶联的抗人IgG(hIgG-HRP)(ThermoFisher Scientific，#31410)，孵育1小时，然后洗涤。ELISA使用一步检测溶液(ThermoFisher Scientific，Cat#：34028)显影，并以450nm处的吸光度测量。小鼠抗TIP-1mAb T2的结合结果如图1所示；使用的T2 mAb浓度分别为(从图表的左到右)：500ng/ml、20ng/ml、5ng/ml和1ng/ml；仅二抗，该组未接受一抗处理，但接受了HRP偶联的抗小鼠IgG二抗处理；无抗体，既没有添加一抗也未添加二抗)。嵌合形式的抗TIP-1mAb T2的结合结果如图2所示；所使用的T2 mAb浓度分别为(从图表的左到右)：18ng/ml、4ng/ml和1ng/ml；仅二抗，未用一抗处理但用HRP偶联的抗小鼠IgG二抗处理；无抗体，既未添加一抗也未添加二抗。

本领域技术人员将认识到，可以在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下对上述实施例进行改变。因此，应理解，本发明不限于所公开的特定实施例，而是旨在涵盖在本说明书所限定的本发明的精神和范围内的修改。

序列表

<110> 东莞凡恩世生物医药有限公司

<120> 抗TIP-1抗体及其用途

<130> 689204-8WO

<150> US62/640,123

<151> 2018-03-08

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Arg Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Pro Thr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Thr Leu Thr Leu Ser Val Ser Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Asn Thr Lys Thr Arg Lys Pro

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Pro Thr Gly Leu Asp Tyr

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Leu Val Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr

1 5

<210> 9

<211> 124

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Met Ser Tyr Ile Pro Gly Gln Pro Val Thr Ala Val Val Gln Arg Val

1 5 10 15

Glu Ile His Lys Leu Arg Gln Gly Glu Asn Leu Ile Leu Gly Phe Ser

20 25 30

Ile Gly Gly Gly Ile Asp Gln Asp Pro Ser Gln Asn Pro Phe Ser Glu

35 40 45

Asp Lys Thr Asp Lys Gly Ile Tyr Val Thr Arg Val Ser Glu Gly Gly

50 55 60

Pro Ala Glu Ile Ala Gly Leu Gln Ile Gly Asp Lys Ile Met Gln Val

65 70 75 80

Asn Gly Trp Asp Met Thr Met Val Thr His Asp Gln Ala Arg Lys Arg

85 90 95

Leu Thr Lys Arg Ser Glu Glu Val Val Arg Leu Leu Val Thr Arg Gln

100 105 110

Ser Leu Gln Lys Ala Val Gln Gln Ser Met Leu Ser

115 120

Claims (18)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，分别具有以下多肽序列：

a.SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8；

其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合TIP-1，优选人TIP-1。

2.如权利要求1所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含含有与SEQ ID NO：1具有至少95％的同一性的多肽序列的重链可变区，或含有与SEQ ID NO：2具有至少95％的同一性的多肽序列的轻链可变区。

3.如权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含：

a.具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：2的多肽序列的轻链可变区。

4.如权利要求1至3任一项所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够诱导效应子介导的肿瘤细胞裂解。

5.如权利要求1至4任一项所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的。

6.如权利要求1至5任一项所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是人的或人源化的。

7.一种编码如权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。

8.一种载体，包含如权利要求7所述的分离的核酸。

9.一种宿主细胞，包含如权利要求8所述的载体。

10.一种药物组合物，包含如权利要求1至6中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体。

11.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者施用如权利要求10所述的药物组合物。

12.一种靶向有需要的受试者中癌细胞表面的TIP-1的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求10所述的药物组合物。

13.一种产生如权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，并从细胞或培养物中回收所述的抗体或抗原结合片段。

14.一种制备包含如权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的运载体组合，以获得所述药物组合物。

15.一种确定受试者中TIP-1水平的方法，所述方法包括：

a.从受试者获得样品；

b.使样品与如权利要求1至6中任一项所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；和

c.确定受试者中TIP-1的水平。

16.如权利要求15所述的方法，所述样品是组织样品。

17.如权利要求16所述的方法，所述组织样品是癌组织样品。

18.如权利要求15所述的方法，所述样品是血液样品。

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