CN114656549A

CN114656549A - 基于tip-1-多肽相互作用的新型分子胶水

Info

Publication number: CN114656549A
Application number: CN202210502251.4A
Authority: CN
Inventors: 沈月全; 杨雪; 龙加福; 陈晓哲
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2022-05-10
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2022-06-24

Abstract

本发明公开一种基于TIP‑1‑多肽相互作用的新型分子胶水及其在蛋白非共价偶联中的应用，分子胶水包括能够特异性结合的TIP‑1蛋白和β‑catenin蛋白的C末端多肽，经测试可知，二者的亲和力达到了0.41μM，TIP‑1蛋白能够以异常高的亲和力专一性地结合β‑catenin蛋白的C末端多肽；将分子胶水的两个组分分别连接在两个待连接的蛋白上，则能够实现这两个蛋白的非共价偶联，尤其用于疏水特性显著的膜蛋白时，也能够实现高效特异性的非共价偶联，从而介导膜蛋白复合物中不同组分之间的相互作用。

Description

基于TIP-1-多肽相互作用的新型分子胶水

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种基于TIP-1-多肽相互作用的新型分子胶水。

背景技术

膜蛋白与普通的水溶性蛋白之间性质相差比较大。膜蛋白需要在溶液中存在一定浓度的去污剂才能稳定。去污剂在溶液中形成胶束，包围住膜蛋白的疏水性表明区域，形成膜蛋白-去污剂胶束复合物，这样膜蛋白才能在离开膜的天然环境稳定存在在溶液中。由于去污剂具有一定的疏水性，很大程度上减弱了两个膜蛋白之间的相互作用力。因此，体外重组膜蛋白复合物的时候，经常需要用到分子胶水帮助复合物的各个组分提高相互间的亲和力。这些工具需要满足以下条件：1，高稳定性。在多种不同条件下能够保持构象的完整性；2，结合力高。在去污剂条件下，也能有很高的亲和力；3，不干扰生物学功能。工具本身没有生物学活性，不会诱导其他蛋白的构象变化；4，非共价耦联。在需要的时候，可以借助条件变化来打开两个蛋白之间的耦联。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于TIP-1-多肽相互作用的新型分子胶水。

本发明采用的技术方案是：基于TIP-1-多肽相互作用的新型分子胶水，包括能够特异性结合的TIP-1蛋白和β-catenin蛋白的C末端多肽。

优选地，TIP-1蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，β-catenin蛋白的C末端多肽序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1：

MSYIPGQPVTAVVQRVEIHKLRQGENLILGFSIGGGIDQDPSQNPFSEDKTDKGIYVTRVSEGGPAEIAGLQIGDKIMQVNGWDMTMVTHDQARKRLTKRSEEVVRLLVTRQSLQKAVQQSMLS

SEQ ID NO.2：QLAWFDTDL

新型分子胶水在蛋白非共价偶联中的应用。

优选地，用于膜蛋白间的非共价偶联。

优选地，TIP-1蛋白连接在第一蛋白的N端或C端；β-catenin蛋白的C末端多肽连接第二蛋白的C端，第一蛋白与第二蛋白非共价偶联。

本发明具有的优点和积极效果是：TIP-1能够以异常高的亲和力专一性地结合β-catenin蛋白的C末端，TIP-1和多肽的相互作用可以用来作为分子胶水来介导膜蛋白复合物中不同组分之间的相互作用。

附图说明

图1是实施例1中TIP-1重组蛋白的考马斯亮蓝G250染色图；

图2是实施例1中示意图ITC滴定结果图；

图3是实施例2中分子胶水质粒构建示意图；

图4是实施例2中膜蛋白复合物亲和纯化考马斯亮蓝G250染色图；M为标准分子量，L为细胞裂解液，FT为上亲和柱后没有柱子的流穿溶液，E1和E2为洗脱液；B为亲和柱子残留；

图5是实施例2中分子胶水耦联的膜蛋白复合物亲和纯化考马斯亮蓝G250染色图；M为标准分子量，L为细胞裂解液，FT为上亲和柱后没有柱子的流穿溶液，E1-4为洗脱液；B为亲和柱子残留。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例做出说明。

本发明公开一种基于TIP-1-多肽相互作用的新型分子胶水，包括能够特异性结合的TIP-1蛋白和β-catenin蛋白的C末端多肽。TIP-1(Tax-interacting protein-1)是一种含有单个PDZ结构域的非典型小蛋白，这一类PDZ结构域识别肽的C末端序列(S/T)-X-Φ(X代表任何氨基酸，Φ代表疏水氨基酸残基)，肽的0和2位置(0位置代表C末端残基)的残基对于与TIP-1的结合的特异性和亲和程度有着重要的作用；这一类PDZ结构域通常包含6个β折叠(β1-β6)和2个α螺旋(α1、α2)，能够以异常高的亲和力专一性地结合β-catenin蛋白的C末端。

本发明某些实施例中，TIP-1蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，β-catenin蛋白的C末端多肽序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1：

SEQ ID NO.2：QLAWFDTDL

TIP-1蛋白和β-catenin蛋白的C末端多肽的相互作用可以用来作为分子胶水来介导蛋白复合物中不同组分之间的相互作用，即便是疏水特性显著的膜蛋白，也能够实现高效特异性的非共价偶联，基于这一特性，可将此类分子胶水应用于蛋白非共价偶联中。通过基因重组技术，将β-catenin蛋白的C末端氨基酸序列基因导入到重组膜蛋白复合物其中一个成员的蛋白质多肽C末端对应的DNA碱基对之后；将TIP-1蛋白的氨基酸序列基因导入到重组膜蛋白复合物的另外一个成员的蛋白质多肽的N端对应的DNA碱基对之前(起始甲硫氨酸之后)或者C末端对应的DNA碱基对之后，从而将TIP-1蛋白连接在第一蛋白的N端或C端；β-catenin蛋白的C末端多肽连接第二蛋白的C端，表达后则可得到分别连接有TIP-1蛋白和β-catenin蛋白的C末端多肽的蛋白，在TIP-1蛋白和β-catenin蛋白的C末端多肽的特异性结合作用下，实现第一蛋白和第二蛋白间的非共价偶联。第一蛋白和第二蛋白可以为任一类型的蛋白，即便为难以相互结合的膜蛋白，也可以实现高效的连接。

下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。

实施例1：TIP-1蛋白和 β-catenin蛋白的C末端多肽亲和力验证

1.1TIP-1蛋白的重组表达

使用小鼠脑cDNA文库作为模板，通过PCR扩增编码小鼠全长TIP-1(1-124)的DNA片段，单独克隆到带6×His标签的pET32a载体，并通过DNA测序确认。TIP-1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

将测序正确的TIP-1转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，涂布平板，37℃培养12-14小时。挑取单菌落于5mL含氨苄抗性的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养12-14小时，将菌液以1：200的比例接种到1L含氨苄抗性的LB培养基中，37℃培养2小时后将培养物转移到16℃继续培养，直到OD₆₀₀达到0.8，加入终浓度为200mM IPTG进行诱导，继续培养过夜，5000rpm常温离心15分钟后收菌。

1.2TIP-1蛋白的体外纯化

每1L菌体加入40mL Ni-NTA binding buffer，吹打均匀后加入终浓度0.1mg/mL的溶菌酶和1mM的PMSF，混匀后于冰浴中超声，每个超声循环工作1秒，停止3秒，总工作时间为4分钟，超声总能量约4000J，超声后继续置冰上裂解30分钟，18000rpm，4℃离心45分钟，取上清。

用binding buffer平衡镍离子亲和层析柱。将收集的上清上样于镍柱，结合半小时左右，收集留出液Flow Through，用wash buffer洗3个柱体积，收集Wash Through，最后用elute buffer洗脱蛋白，收集Elute。将Flow Through，Wash Through和Elute进行SDS-PAGE分析蛋白量和纯度。将镍柱收集的蛋白用Amicon压力超滤浓缩装置通过3kD超滤膜截留浓缩至10mL左右，再通过3kD超滤管4℃，3500rpm浓缩至1mL以下，将样品通过Gel-filtration Buffer平衡过的Superdex200分子筛进行分离，根据A₂₈₀紫外吸收曲线取样，通过SDS-PAGE确定目的蛋白的管数。将蛋白样品收集后用Amicon压力超滤浓缩装置通过3kD超滤膜截留浓缩至10mL左右，加入PreScission蛋白酶(1:1000v/v)在4℃酶切过夜。将酶切后的样品经超滤管4℃，3500rpm浓缩至1mL以下，通过Gel-filtration Buffer平衡过的Superdex 200分子筛进行分离，根据A₂₈₀紫外吸收曲线取样，通过SDS-PAGE确定目的蛋白的管数，结果如图1所示，TIP-1蛋白分子筛后的考马斯亮蓝G250染色图显示其分子量约为15kd，蛋白的纯度超过了95％。最后通过Amicon压力超滤浓缩装置和超滤管将蛋白浓缩至30mg/mL以上，留存备用。

1.3等温滴定微量(Isothermal titration calorimetry，ITC)实验

β-catenin蛋白的C末端多肽按照氨基酸序列送公司合成，序列如SEQ ID NO.2所示所示；

SEQ ID NO.2：QLAWFDTDL

在进行ITC实验之前，保证每个样品的buffer均为TIP-1蛋白的Gel-filtrationbuffer。将400μL蛋白溶液注入滴定池，将80μL滴定多肽配体吸入上样针，在20℃恒温环境、250rpm转速条件下，每隔180秒进行一次滴定，收集热量变化数据，总共收集36次后，绘制能量变化曲线，用Origin软件进行数据收集，计算解离常数。结果如图2所示，TIP-1纯化的蛋白和 β-catenin蛋白的C末端多肽的亲和力达到了0.41 μM，异常高的亲和力表明了两者能够用作分子胶水。

实施例2：分子胶水在膜蛋白连接中的应用

STIM1蛋白是位于细胞内质网膜上的单次跨膜蛋白；Orai1蛋白是位于细胞外膜含四次跨膜螺旋的钙离子通道。这两个膜蛋白的非共价偶联对于细胞内钙离子的信号传导起着非常重要的作用，尤其是免疫细胞T细胞和B细胞的激活。但是这种偶联在体外很难实现，因为膜蛋白的提取涉及到去污剂的应用，很容易破坏两者的非共价偶联。现以STIM1蛋白和Orai1蛋白作为靶标蛋白，通过TIP-1蛋白和 β-catenin蛋白的C末端多肽形成的分子胶水将二者进行非共价偶联。

2.1靶标蛋白基因克隆

按照图3示意分别构建含有靶标蛋白基因和分子胶水的重组质粒，一个质粒中将β-catenin蛋白的C末端氨基酸序列基因和FLAG标签导入到Orai1蛋白C末端对应的DNA碱基对之后；一个质粒中将TIP-1蛋白的氨基酸序列基因和GFP标签导入到STIM1蛋白C末端对应的DNA碱基对之后。

2.2.膜蛋白表达

2.2.1HEK293F细胞的转染

培养HEK293F细胞，当密度达到1.0-2.0×10⁶cells/mL时，将两种质粒等量混合，并对细胞进行转染。1.0×10⁶个cells对应1μg混合重组质粒和3μg PEI(1mg/mL)；以200mL密度达到1.0×10⁶cells/mL的细胞为例：需要200μg的混合重组质粒，600μg的PEI(1mg/mL)，再分别用9mL Freestyle 293培养基稀释，再把稀释好的质粒和PEI混合均匀，静置20分钟，最后加入到细胞中，37℃摇床培养48小时后收集细胞。

2.2.2HEK293F细胞的收集

将表达重组膜蛋白的细胞转移到50mL的离心管中，在4℃,1000×g离心10分钟。弃掉上清，再用预冷的1×TBS清洗细胞，1000×g离心10分钟，弃掉上清，留下的细胞沉淀可进行下一步的实验或冻存于-80℃冰箱中。

2.2.3膜蛋白的亲和纯化

提前预冷实验需要用到的缓冲液。Buffer A：20mM Tris-HCl，pH 8.0，200mMNaCl；Buffer B：20mM Tris-HCl，pH 8.0，200mM NaCl，0.025％DDM。取30mL Buffer A重悬细胞，上下吹打混匀，再补加终浓度为1％DDM以及1×cocktail protease inhibitor，放于垂直混匀仪上4℃裂解细胞1小时。将细胞裂解液转移到30mL离心管中，120000×g离心40分钟。分别取离心后的上清以及一小块沉淀于新的EP管中，沉淀中加入100μL 10％SDS，99℃加热，并时不时混匀，直至沉淀溶解，取20μL留做鉴定的样品，剩余的上清与适量的亲和吸附柱结合，以FLAG标签为例(蛋白带有FLAG标签)，FLAG beads提前使用Buffer B平衡，上清与beads放于垂直混匀仪上4℃旋转孵育2小时。孵育结束后，300g，4℃离心2min，收集beads。用Buffer B冲洗beads不少于10个柱体积，取每次冲洗beads离心后的上清20μL留做鉴定。最后用Buffer B+1mM FLAG多肽进行洗脱，洗脱2-3次。每次也都留样20μL留做鉴定。向beads中加入18μL Buffer B和6μL 4×SDS Loading Buffer，同样地，取之前每一步留的样品18μL，加入6μL4×SDS Loading Buffer，混匀后放于加热模块99℃加热5分钟。此时，将所有的样品进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。通过分析胶来查看结合情况。

如图5所示，其中，GFP标签代表Stim1膜蛋白，FLAG标签代表Orai1膜蛋白；可以清晰看到，任意一个亲和柱洗脱液都包含两个膜蛋白组分，比例约为1:1；表明两个膜蛋白之间实现了高效非共价偶联。STIM1蛋白在融合TIP-1蛋白后，可以与融合多肽的Orai1蛋白非共价偶联。用Strep标签纯化的STIM1可以检测到Orai1蛋白，反过来，用Flag标签纯化的Orai1蛋白可以检测到STIM1蛋白，显示这两个膜蛋白紧紧粘合在一起。

对比例：

分别构建含有靶标蛋白基因和标签的重组质粒，与实施例2的区别在于不包含分子胶水的结构。并按照实施例2的过程对HEK293F细胞进行转染，收集并裂解细胞后，对未连接分子胶水的Stim1膜蛋白和Orai1膜蛋白制成混合物进行相同的纯化步骤。

SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图4所示，其中，GFP标签纯化的是Stim1膜蛋白，FLAG标签纯化的是Orai1膜蛋白；标识框内应为亲和柱洗脱的膜蛋白，可以清晰看到，任意一个亲和柱洗脱液中均只有一个膜蛋白结合，表明两个膜蛋白之间无法非共价偶联。说明了未连接分子胶水的STIM1蛋白和Orai1蛋白不能相互重组成复合物。

通过蛋白重组的方式将分子胶水的两个组分分别连接到不同蛋白上，这样的方式不仅适用于实施例中所提到的蛋白，同样适合其他蛋白，因此这种新型的分子胶水可以用于两个膜蛋白的非共价偶联，同样也适合于任意两个蛋白的非共价偶联。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

序列表

<110> 南开大学

<120> 基于TIP-1-多肽相互作用的新型分子胶水

<141> 2022-05-10

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Tyr Ile Pro Gly Gln Pro Val Thr Ala Val Val Gln Arg Val

1 5 10 15

Glu Ile His Lys Leu Arg Gln Gly Glu Asn Leu Ile Leu Gly Phe Ser

20 25 30

Ile Gly Gly Gly Ile Asp Gln Asp Pro Ser Gln Asn Pro Phe Ser Glu

35 40 45

Asp Lys Thr Asp Lys Gly Ile Tyr Val Thr Arg Val Ser Glu Gly Gly

50 55 60

Pro Ala Glu Ile Ala Gly Leu Gln Ile Gly Asp Lys Ile Met Gln Val

65 70 75 80

Asn Gly Trp Asp Met Thr Met Val Thr His Asp Gln Ala Arg Lys Arg

85 90 95

Leu Thr Lys Arg Ser Glu Glu Val Val Arg Leu Leu Val Thr Arg Gln

100 105 110

Ser Leu Gln Lys Ala Val Gln Gln Ser Met Leu Ser

115 120

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Leu Ala Trp Phe Asp Thr Asp Leu

1 5

Claims

1.基于TIP-1-多肽相互作用的新型分子胶水，其特征在于：包括能够特异性结合的TIP-1蛋白和β-catenin蛋白的C末端多肽。

2.根据权利要求1所述的基于TIP1-多肽相互作用的新型分子胶水，其特征在于：TIP-1蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，β-catenin蛋白的C末端多肽序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1或2所述的新型分子胶水在蛋白非共价偶联中的应用。

4.根据权利要求3所述的新型分子胶水在蛋白非共价偶联中的应用，其特征在于：用于膜蛋白间的非共价偶联。

5.根据权力要求3或4中任一所述的新型分子胶水在蛋白非共价偶联中的应用，其特征在于：TIP-1蛋白连接在第一蛋白的N端或C端；β-catenin蛋白的C末端多肽连接第二蛋白的C端，第一蛋白与第二蛋白非共价偶联。