CN108368177A - 激活瘦素受体的抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与瘦素受体(LEPR)结合的抗体和抗体的抗原结合片段，以及使用其的方法。根据某些实施方式，本发明包括结合LEPR并激活LEPR信号传导的抗体和抗体的抗原结合片段。在其他实施方式中，本发明包括结合LEPR并增强LEPR对抗原的敏化的抗体和抗体的抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明包括在存在和不存在瘦素的情况下结合LEPR的抗体和抗体的抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明包括在表达LEPR突变体的细胞中诱导信号传导的抗体和抗体的抗原结合片段，在其他情况下所述LEPR突变体在存在瘦素的情况下表现出缺陷或受损的信号传导。本发明所述的抗体和抗原结合片段可用于治疗与瘦素缺乏或瘦素抵抗相关或者由其引起的脂肪代谢障碍以及其他疾病和病况。

Description

激活瘦素受体的抗原结合蛋白
发明领域
本发明涉及与人瘦素受体(LEPR)结合的抗体和抗体的抗原结合片段，以及使用这些抗体的治疗和诊断方法。
序列表
序列表的正式副本通过EFS-Web，作为ASCII格式的序列表以电子形式与说明书同时提交，文件名为2016_10_11_10178WO01_Sequence_Listing_as_Filed_ST25.TXT，创建日期为2016年10月11日，大小约为99.6千字节。包含在该ASCII格式文档中的序列表是说明书的一部分，并且其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
瘦素是一种主要由脂肪组织表达的多肽激素，参与代谢调节、能量平衡和食物摄入。瘦素活性是通过与瘦素受体相互作用，以及瘦素受体的信号传导来介导的。瘦素受体(也被称为“LEPR”、“WSX”、“OB受体”、“OB-R”和“CD295”)是I类细胞因子受体家族的单次跨膜受体，具有大的(818个氨基酸)胞外域。瘦素缺乏、瘦素抵抗和某些LEPR信号传导缺陷型/信号传导受损型突变，与肥胖、2型糖尿病、血脂异常、脂肪代谢障碍、肝脂肪变性、非酒精性和酒精性脂肪肝疾病、严重胰岛素抵抗、Leprechaunism/Donohue综合征、Rabson-Mendenhall综合征及相关并发症相关。解决瘦素抗性、瘦素缺乏和低瘦素血症(例如脂肪代谢障碍)的治疗方法主要集中于向受影响个体递送补充的瘦素或瘦素类似物。然而，这些方法通常表现出有限的效力，特别是在瘦素抗性的个体中，并且经常与不良副作用相关。因此，本领域需要用于治疗瘦素抵抗以及与瘦素缺乏或低瘦素血症相关的其他病况的替代方法。
发明简述
本发明提供了与人瘦素受体(LEPR)结合的抗体及其抗原结合片段。本发明所述的抗体是激动剂抗体；即特别地，本发明所述的抗LEPR抗体与LEPR的结合引起细胞中瘦素受体信号传导的激活。在某些实施方案中，本发明所述的抗体不与瘦素竞争结合LEPR。本发明所述的抗体可用于例如模拟，替代或补充受试者中瘦素的正常生物学活性。因此，本发明所述的抗体和抗原结合片段可用于治疗性治疗与瘦素抵抗和瘦素缺乏相关的疾病和病况。
本发明所述的抗体可以是全长的(例如IgG1或IgG4抗体)或可以仅包含抗原结合部分(例如Fab，F(ab’)2或scFv片段)，并且可以被修饰以影响功能性，例如消除残留的效应子功能(Reddy等，2000，J.Immunol.164:1925-1933)。
本发明所述的示例性抗LEPR抗体列于本文表1和2中。表1列出了示例性抗LEPR抗体的重链可变区(HCVR)、轻链可变区(LCVR)、重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识符。表2列出了示例性抗LEPR抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列标识符。
本发明提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR，所述HCVR包含选自表1中列出的任何HCVR氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含LCVR，所述LCVR包含选自表1中列出的任何LCVR氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，所述HCVR/LCVR包含成对的表1中列出的任何HCVR氨基酸序列与表1中列出的任何LCVR氨基酸序列。根据某些实施方案，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包含表1中列出的任何示例性抗LEPR抗体中包含的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在某些实施方案中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO:2/10、18/10、26/10、34/10、42/10、50/10、58/66、74/66和82/66。
本发明还提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1包含选自表1中列出的任何HCDR1氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2包含选自表1中列出的任何HCDR2氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3包含选自表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR1(LCDR1)，所述LCDR1包含选自表1中列出的任何LCDR1氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR2(LCDR2)，所述LCDR2包含选自表1中列出的任何LCDR2氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR3(LCDR3)，所述LCDR3包含选自表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，所述HCDR3/LCDR3包含成对的表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列与表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列。根据某些实施方案，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包含表1中列出的任何示例性抗LEPR抗体中包含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施方案中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO:8/16、24/16、32/16、40/16、48/16、56/16、64/72、80/72和88/72。
本发明还提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含表1中列出的任何示例性抗LEPR抗体中包含的一组六个CDR(即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1，LCDR2和LCDR3)。在某些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列组选自下组：SEQ ID NO:4、6、8、12、14、16；20、22、24、12、14、16；28、30、32、12、14、16；36、38、40、12、14、16；44、46、48、12、14、16；52、54、56、12、14、16；60、62、64、68、70、72；76、78、80、68、70、72；和84、86、88、68、70、72。
在一个相关的实施方案中，本发明提供了与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含在由表1中列出的任何示例性抗LEPR抗体所限定的HCVR/LCVR氨基酸序列对中包含的一组六个CDR(即HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)。例如，本发明包括与LEPR特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含在选自SEQ ID NO:2/10、18/10、26/10、34/10、42/10、50/10、58/66、74/66和82/66的HCVR/LCVR氨基酸序列对中包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列组。用于识别HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术在本领域中是公知的，并且可以用于识别本文公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于识别CDR边界的示例性常规方法包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义基于序列变异性，Chothia定义基于结构环区的位置，AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折衷。参见例如Kabat，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991)；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；和Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)。公共数据库也可用于识别抗体内的CDR序列。
本发明还提供了编码抗LEPR抗体或其部分的核酸分子。例如，本发明提供编码表1中列出的任何HCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，其选自表2中列出的任何HCVR核酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的任何LCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，其选自表2中列出的任何LCVR核酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的任何HCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，其选自表2中列出的任何HCDR1核酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的任何HCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，其选自表2中列出的任何HCDR2核酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，其选自表2中列出的任何HCDR3核酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的任何LCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，其选自表2中列出的任何LCDR1核酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的任何LCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，其选自表2中列出的任何LCDR2核酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，其选自表2中列出的任何LCDR3核酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码HCVR的核酸分子，其中所述HCVR包含一组三个CDR(即HCDR1，HCDR2，HCDR3)，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列组如表1中列出的任何示例性抗LEPR抗体所限定的。
本发明还提供了编码LCVR的核酸分子，其中所述LCVR包含一组三个CDR(即LCDR1，LCDR2，LCDR3)，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列组如表1中列出的任何示例性抗LEPR抗体所限定的。
本发明还提供了编码HCVR和LCVR两者的核酸分子，其中所述HCVR包含表1中列出的任何HCVR氨基酸序列的氨基酸序列，并且其中所述LCVR包含表1中列出的任何LCVR氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的任何HCVR核酸序列或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列中的多核苷酸序列，和选自表2中列出的任何LCVR核酸序列或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列中的多核苷酸序列。在根据本发明这一方面的某些实施方案中，所述核酸分子编码HCVR和LCVR，其中所述HCVR和LCVR均来源于表1中列出的相同抗LEPR抗体。
本发明还提供了重组表达载体，其能够表达包含抗LEPR抗体的重链或轻链可变区的多肽。例如，本发明包括重组表达载体，其包含任意上述核酸分子，即编码表1中列出的任何HCVR、LCVR和/或CDR序列的核酸分子。本发明的范围内还包括导入了这种载体的宿主细胞，以及在允许抗体或抗体片段产生的条件下培养宿主细胞，从而制备抗体或其部分，以及回收如此产生的抗体和抗体片段的方法。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含与LEPR特异性结合的重组人抗体或其片段，以及药学上可接受的运载体。在相关方面，本发明记述了一种组合物的特征，所述组合物为抗LEPR抗体和第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，所述第二治疗剂是与抗LEPR抗体有利地组合的任何药剂。
又一方面，本发明提供了使用本发明所述的抗LEPR抗体或抗体的抗原结合部分来增强或刺激LEPR信号传导的治疗方法。根据本发明这一方面的治疗方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，其包含本发明所述的抗体或抗体的抗原结合片段。所治疗的病症是通过刺激或激活LEPR信号传导或以其他方式在体外或体内模拟瘦素的天然活性而改善、减轻、抑制或预防的任何疾病或病况。
其他实施方式将从对随后的详细描述的评述中变得显而易见。
附图说明
图1描述了通过ELISA测得的，在受试抗LEPR抗体或对照分子浓度增加的情况下，二聚体人LEPR与人瘦素的结合(450nm处的吸光度)。
图2A-2C显示了在表达野生型LEPR(圆圈)、信号传导缺陷型LEPR突变体(A409E，正方形)或信号传导受损型LEPR突变体(P316T，三角形)的HEK293细胞中，LEPR信号传导的程度。LEPR信号传导表示为pSTAT3-Y705/STAT3之比，其通过来自Western印迹的密度测量测得，以上细胞分别由用浓度增加的瘦素(图2A)、H4H16650(图2B)或H4H16679(图2C)处理的细胞制备。
图3显示给予3mg/kg的同种型对照抗体，或3mg/kg的选自H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2或H4H17321P2的LEPR抗体的瘦素缺乏小鼠的平均每日食物摄入量。
图4显示给予3mg/kg的同种型对照抗体，或3mg/kg的选自H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2或H4H17321P2的LEPR抗体的小鼠的平均体重变化百分比。
图5显示各抗体治疗组中的动物在抗体治疗前1天(无阴影的柱)和抗体处理6天后(阴影柱)的通过μCT定量的平均脂肪量，其表示为平均值±SEM。
图6显示喂以30mg/kg的选自H4H18482P2、H4H18487P2、H4H18492P2或同种型对照的抗体的小鼠的体重变化百分比。
图7A-7B。图7A显示给予抗LEPR抗体H4H18482P2、H4H18487P2或H4H18492P2之前，小鼠的脂肪量。图7B显示用30mg/kg的H4H18482P2、H4H18487P2或H4H18492P2处理的小鼠的脂肪量。
图8。图8显示受试抗LEPR抗体在IMR-32/STAT3-luc/Mf LEPR细胞系中激活猴(Mf)LEPR。
发明详述
在描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为方法和条件可以变化。还应理解本文中使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而并非旨在进行限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。
除非另外定义，否则本文中使用的全部技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。用于提及特定的记载的数值时，本文中使用的术语“约/大约”意指该值与记载的值相比可相差不大于1％。例如，本文中使用的表述“约100”包括99和101以及其间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管在对本发明的实施或测试中可使用与本文所描述的那些相似或等同的任意方法和材料，然而现在描述一些优选的方法和材料。
定义
本文中使用的“瘦素受体”、“LEPR”等表述是指包含如SEQ ID NO:113中所示的氨基酸序列的人瘦素受体(还参见UniProtKB/Swiss-Prot登录号P48357)。科学文献中使用的LEPR的替代名称包括“OB受体”、“OB-R”和“CD295”。LEPR也被称为“WSX”(参见例如美国专利号7,524,937)。“LEPR”的表述包括单体和多聚体(例如二聚体)LEPR分子。本文中使用的“单体人LEPR”的表述意指不含有或具有任何多聚化结构域，并且在正常条件下作为单个LEPR分子存在，而不与另一种LEPR分子直接物理连接的LEPR蛋白或其部分。示例性单体LEPR分子是在本文中称为“hLEPR.mmh”的分子，其包含如SEQ ID NO:114所示的氨基酸序列(参见例如本文中的实施例3)。本文中使用的用语“二聚体人LEPR”意指包含两个LEPR分子的构建体，所述两个LEPR分子通过连接子、共价键、非共价键或通过多聚化结构域(如抗体Fc结构域)彼此连接。示例性的二聚体LEPR分子是在本文中称为“hLEPR.mFc”的分子，其包含如SEQID NO:115所示的氨基酸序列(参见例如本文中的实施例3)，或者在本文中称为“hLEPR.hFc”的分子，其包含如SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列。除非另外特别指明，否则本文中使用的，如“抗LEPR抗体”、“与LEPR特异性结合的抗体”、“LEPR特异性结合蛋白”等表述，是指与全长人LEPR、单体人LEPR、二聚体人LEPR，或其他包含LEPR胞外域或由LEPR胞外域组成的构建体结合的分子。
除非明确指定来自非人类物种，否则本文提及的蛋白、多肽和蛋白片段均旨在指相应蛋白、多肽或蛋白片段的人类形式。因此，“LEPR”的表述意指人类LEPR，除非指定来自非人类物种，例如“小鼠LEPR”、“猴LEPR”等。
本文中使用的“细胞表面表达的LEPR”的表述意指如下的一种或多种LEPR蛋白或其胞外域，其在细胞表面上体外或体内表达，使得至少一部分LEPR蛋白暴露于细胞膜的胞外侧，并且易于与抗体的抗原结合部分接近。“细胞表面表达的LEPR”可以包含在细胞的表面上表达的LEPR蛋白或由其组成，所述细胞通常(例如，在天然或野生型状态下)表达LEPR蛋白。或者，“细胞表面表达的LEPR”可以包含在细胞的表面上表达的LEPR蛋白或由其组成，所述细胞通常不在其表面上表达人LEPR，但已被人工工程化为在其表面上表达LEPR。
本文中使用的，如“抗LEPR抗体”或“结合人瘦素受体的抗体”的表述既包括具有单一特异性的单价抗体，也包括包含结合LEPR的第一臂和结合第二(靶)抗原的第二臂的双特异性抗体，其中所述抗LEPR臂包含本文表1中列出的任何HCVR/LCVR或CDR序列。
本文中使用的术语“抗体”意指与特定抗原(例如，LEPR)特异性结合或相互作用的抗原结合分子或分子复合物，其包含至少一个互补决定区(CDR)。术语“抗体”包括含有四条多肽链(通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可再进一步分为称为互补决定区(CDR)的超变区，其被称为框架区(FR)的较保守区间隔开。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，其从氨基末端向羧基末端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明不同的实施方式中，抗LEPR抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系序列相同，或者可以是经天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可基于两个或更多个CDR的并排分析确定。
本文中使用的术语“抗体”还包括全抗体分子的抗原结合片段。本文中使用的术语，抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括与抗原特异性结合以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以使用任何合适的标准技术，如蛋白水解消化，或涉及DNA的操控和表达的重组基因工程技术(所述DNA编码抗体可变域，任选地，编码恒定域)，来源于例如全抗体分子。这样的DNA是已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得或者可以被合成。可对DNA测序并以化学方式或通过使用分子生物学技术操控，从而例如将一个或多个可变和/或恒定域排列成合适的构型，或者引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体超变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)，或限制性FR3-CDR3-FR4肽。本文中使用的“抗原结合片段”的表述还包括其他工程化分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(smallmodular immunopharmaceutical，SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域。
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变域。所述可变域可具有任意大小或氨基酸组成，并且一般将包含至少一个CDR，所述CDR与一个或多个框架序列邻近或者与框架序列同框。在VH域与VL域缔合的抗原结合片段中，VH域和VL域相对于彼此的位置可以以任意合适的排列。例如，可变区可以是二聚的并且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以包含单体VH域或VL域。
在某些实施方式中，抗体的抗原结合片段可包含与至少一个恒定域共价连接的至少一个可变域。可见于本发明所述抗体的抗原结合片段中的可变域和恒定域的非限制性示例构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变域和恒定域的任意构型(包括上文列出的任意示例性构型)中，可变域和恒定域可以彼此直接连接，或者可通过完全或部分铰链区或接头区连接。铰链区可由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，其在单个多肽分子中邻近的可变域和/或恒定域之间产生柔性或半柔性连接。另外，本发明所述抗体的抗原结合片段可包含上文列出的任体可变域和恒定域构型的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)，所述可变域和恒定域构型非价地(例如通过二硫键)彼此缔合和/或与一个或多个单体VH域或VL域缔合。
如同全抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变域，其中每个可变域能够各自与不同的抗原或同一抗原上的不同表位特异性结合。可使用本领域中已有的常规技术，将任何多特异性抗体形式(包括本文公开的示例性双特异性抗体形式)改造成在本发明所述抗体的抗原结合片段的背景下使用。
在本发明的某些实施方式中，本发明所述的抗LEPR抗体是人抗体。本文中使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明所述的人抗体可在例如CDR，特别是CDR3中，包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文中使用的术语“人抗体”不旨在包括来源于其他哺乳动物物种种系(例如小鼠)的CDR序列移植至人框架序列上的抗体。
在一些实施方式中，本发明所述的抗体可以是重组人抗体。本文中使用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体来表达的抗体(在下文进一步描述)、分离自重组的组合人抗体文库的抗体(在下文进一步描述)、分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)的抗体(参见例如，Taylor等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)，或者通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任意其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方式中，这样的重组人抗体经体外诱变(或者，使用人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，由此重组抗体VH区和VL区的氨基酸序列尽管来源于人种系VH和VL序列并且与其相关，但可能不天然存在于体内人抗体种系库内。
本发明包括在铰链区、CH2区或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，所述突变可以是理想的的，例如，所述突变在生产中对于提高期望抗体形式的产量是理想的。
本发明所述的抗体可以是分离的抗体。本文中使用的“分离的抗体”意指经识别并且已从其自然环境的至少一种组分中分离和/或回收的抗体。例如，出于本发明的目的，已从生物体的至少一种组分中，或者从组织或细胞中分离出或取出的抗体(所述抗体天然存在或天然产生于所述组织或细胞)是“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞中的原位抗体。分离的抗体是已进行至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方式，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
本发明包括本文公开的抗LEPR抗体的变体，与抗体所来源的对应种系序列相比，所述变体在重链和轻链可变区的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可获取自例如公开抗体序列数据库的种系序列相比，可以容易地确定这样的突变。本发明包括来源于本文中公开的任意氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架区和/或CDR区中的一个或多个氨基酸突变成抗体来源于的种系序列的对应残基，或者突变成另一人种系序列的对应残基，或者突变成对应种系残基的保守氨基酸取代(这样的序列改变在本文中统称为“种系突变”)。从本文中公开的重链和轻链可变区序列出发，本领域普通技术人员可以容易地产生很多包含一个或多个单一种系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方式中，VH域和/或VL域中的全部框架和/或CDR残基回复突变为存在于抗体来源于的原始种系序列中的残基。在另一些实施方式中，只有某些残基回复突变至原始种系序列，例如，只有存在于FR1前8个氨基酸或FR4后8个氨基酸中的突变残基，或者只有存在于CDR1、CDR2或CDR3中的突变残基。在另一些实施方式中，一个或多个框架和/或CDR残基突变成另一种系序列(例如，不同于抗体最初来源于的种系序列的种系序列)的对应残基。另外，本发明的抗体可在框架和/或CDR区中包含两种或更多种种系突变的任意组合，例如，其中某些单个残基被突变成特定种系序列的对应残基，而保持不同于原始种系序列的某些其他残基，或者将其突变成另一种系序列的对应残基。一旦得到包含一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段，可容易地测试其一种或多种期望性质，例如提高的结合特异性、提高的结合亲和力、提高或增强的拮抗或激动生物学特性(视具体情况而定)、降低的免疫原性等。以这种常规方式得到的抗体和抗原结合片段包括于本发明内。
本发明包括抗LEPR抗体及其抗原结合片段，其包含与存在于本文中公开的任何示例性抗LEPR抗体中的一个或多个可变域或CDR氨基酸序列基本上相似或基本上相同的氨基酸序列。
当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本相似”意指当例如通过程序GAP或BESTFIT，使用默认缺口(gap)权重进行最佳比对时，两条肽序列有至少95％的序列同一性，甚至更优选地，有至少98％或99％的序列同一性。优选地，相异的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是这样的取代：其中氨基酸残基被含有具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基)的另一氨基酸残基取代。一般来说，保守氨基酸取代将基本不改变蛋白的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守替换而彼此不同的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可向上调节以校正取代的保守性质。用于进行这种调节的方法是本领域技术人员公知的。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。含有具有类似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是在Gonnet等，(1992)Science 256:1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250 log-likelihood matrix)中具有正值的任意变化。“适度保守”取代是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任意变化。
多肽的序列相似性(也称为序列同一性)通常使用序列分析软件来测量。蛋白分析软件使用分配给多种取代、缺失及其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性的量度来匹配相似序列。例如，GCG软件包含如Gap和Bestfit的程序，其可与默认参数一起使用来确定密切相关的多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)之间或者野生型蛋白和其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6.1版。也可利用使用默认或推荐参数的FASTA(GCG 6.1版中的一个程序)比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列与检索序列之间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)，出处同上)。当将本发明的序列与包含大量来自不同生物体的序列的数据库进行比较时，另一优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见例如Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
包含Fc变体的抗LEPR抗体
根据本发明的某些实施方式，提供了包含含有一个或多个突变的Fc结构域的抗LEPR抗体，与中性pH相比，所述突变在例如酸性pH下增强或减弱抗体与FcRn受体的结合。例如，本发明包括在Fc结构域的CH2区或CH3区中包含突变的抗LEPR抗体，其中在酸性环境中(例如，在pH为约5.5至约6.0的内涵体中)，所述突变提高Fc结构域对FcRn的亲和力。当施用于动物时，这样的突变可导致抗体的血清半衰期延长。这样的Fc修饰的非限制性实例包括，例如，在第250位(例如E或Q)；250和428位(例如L或F)；252位(例如L/Y/F/W或T)、254位(例如S或T)和256位(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或者在第428和/或433位(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434位(例如H/F或Y)的修饰；或者在第250和/或428位的修饰；或者在第307或308位(例如308F、V308F)和434位的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。
例如，本发明包括含有Fc结构域的抗LEPR抗体，所述Fc结构域包含选自下组的一个或多个突变对或突变组：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。前述Fc结构域突变以及本文所公开的抗体可变域内的其他突变的所有可能组合均在本发明范围的考量之内。
本发明所述的抗LEPR抗体可以包含具有降低的效应子功能的修饰的Fc结构域。本文中使用的“具有降低的效应子功能的修饰的Fc结构域”是指任何这样的免疫球蛋白的Fc部分，其相对于野生型天然存在的Fc结构域已经被修饰、突变、截短等，使得相对于包含野生型天然存在形式的Fc部分的比较分子，包含修饰的Fc的分子表现出选自细胞杀伤(例如ADCC和/或CDC)、补体激活、吞噬作用和调理作用的至少一种作用在严重性或程度上的降低。在某些实施方式中，“具有降低的效应子功能的修饰的Fc结构域”是与Fc受体(例如FcγR)的结合降低或减弱的Fc结构域。
在本发明的某些实施方式中，修饰的Fc结构域是包含铰链区中的取代的变体IgG1Fc或变体IgG4Fc。例如，用于本发明背景下的修饰的Fc可包含变体IgG1Fc，其中IgG1Fc铰链区的至少一个氨基酸被来自IgG2Fc铰链区的对应氨基酸替换。或者，用于本发明背景下的修饰的Fc可包含变体IgG4Fc，其中IgG4Fc铰链区的至少一个氨基酸被来自IgG2Fc铰链区的对应氨基酸替换。可以用于本发明背景下的非限制性示例性的修饰的Fc区如美国专利申请公开号2014/0243504中所示。
可以用于本发明背景下的其他修饰的Fc结构域和Fc修饰包括如US2014/0171623；US 8,697,396；US 2014/0134162；WO 2014/043361中所示的任何修饰。构建包含如本文所述的修饰的Fc结构域的抗体或其他抗原结合融合蛋白的方法是本领域已知的。
抗体的生物学特征
本发明包括结合人LEPR并激活LEPR信号传导的抗体及其抗原结合片段。这样的抗体在本文中可以被称为“激动剂抗体”。在本发明的背景下，“LEPR信号传导的激活”意指刺激通常由表达LEPR的细胞中瘦素与LEPR的相互作用引起的细胞内效应。在某些实施方式中，“LEPR信号传导的激活”意指STAT3的转录激活，其可使用可直接或间接地测量或识别STAT3活性的任何方法，例如使用在报告细胞系中表达的STAT3的标记形式进行检测。例如，本发明包括抗体及其抗原结合片段，其在基于细胞的报告基因测定法(例如使用本文实施例7中限定的基于细胞的测定形式，或基本上类似的测定法)中激活LEPR信号传导。检测到LEPR激活的基于细胞的报告基因测定法，例如本文实施例7中所示的测定法，可以产生就EC50值(即产生半数最大信号传导所需的抗体浓度)和/或在存在瘦素的情况下观察到的最大信号传导的百分比而言，可以表达的可检测信号。在本发明的某些示例性实施方式中，提供了抗LEPR抗体，其在基于细胞的报告基因测定法(例如使用本文实施例7中限定的测定形式或基本上类似的测定法)中，以小于约12.0nM的EC50值激活LEPR信号传导。在本发明的某些示例性实施方式中，提供了抗LEPR抗体，其在基于细胞的报告基因测定法(例如使用本文实施例7中限定的测定形式或基本上类似的测定法)中，以大于瘦素信号传导约65％的的最大激活百分比激活LEPR信号传导。
本发明包括以高亲和力与单体人LEPR结合的抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括抗LEPR抗体，其在25℃或37℃下以小于约150nM的KD与单体人LEPR(例如hLEPR.mmh，SEQ ID NO:114)结合，所述KD值通过表面等离子体共振测得，例如使用本文实施例3中限定的测定形式或基本上类似的测定法。根据某些实施方式，提供抗LEPR抗体，其在25℃下以小于约150nM、小于约140nM、小于约130nM、小于约120nM、小于约110、小于约100nM、小于约90nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM、小于约50nM、小于约40nM、小于约30nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约9nM、小于约8nM、小于约7nM、小于约6nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约900pM、小于约800pM、小于约700pM、小于约600pM、小于约500pM、小于约400pM或小于约300pM的KD与单体人LEPR结合，所述KD值通过表面等离子体共振测得，例如使用本文实施例3中限定的测定形式或基本上类似的测定法。
本发明还包括抗体及其抗原结合片段，其在25℃或37℃下以大于约50分钟的解离半衰期(t1/2)与单体人LEPR(例如，hLEPR.mmh，SEQ ID NO:114)结合，所述t1/2通过表面等离子体共振测得，例如使用本文实施例3中限定的测定形式或基本上类似的测定法下。根据某些实施方式，提供抗-LEPR抗体，其在25℃下以大于约50分钟、大于约55分钟、大于约60分钟、大于约65分钟或更长的t1/2与单体人LEPR结合，所述t1/2通过表面等离子体共振测得，例如使用本文实施例3中限定的测定形式或基本上类似的测定法。
本发明还包括以高亲和力与二聚体人LEPR(例如，hLEPR.mFc，SEQ ID NO:115)结合的抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括抗LEPR抗体，其在25℃或37℃下以小于约1.5nM的KD与二聚体人LEPR结合，所述KD值通过表面等离子体共振测定，例如使用本文实施例3中限定的测定形式或基本上类似的测定法。根据某些实施方式，提供抗-LEPR抗体，其在25℃下以小于约150nM、小于约130nM、小于约110nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM、小于约50nM、小于约40nM、小于约30nM、小于约20nM或小于约10nM的KD与二聚体人LEPR结合，所述KD值通过表面等离子体共振测得，例如使用本文实施例3中限定的测定形式或基本上类似的测定法。
本发明还包括抗体及其抗原结合片段，其在25℃或37℃下以大于约10分钟的解离半衰期(t1/2)与二聚体人LEPR(例如，hLEPR.mFc，SEQ ID NO:115)结合，所述t1/2通过表面等离子体共振测得，例如使用本文实施例3中限定的测定形式或基本上类似的测定法。根据某些实施方式，提供抗LEPR抗体，其在25℃下以大于约10、大于约15分钟、大于约20分钟、大于约25分钟、大于约30分钟、大于约40分钟、大于约50分钟、大于约60分钟、大于约70分钟或更长的t1/2与二聚体人LEPR结合，所述t1/2通过表面等离子体共振测得，例如使用本文实施例3中限定的测定形式或基本上类似的测定法。
本发明还包括与LEPR与人瘦素的复合物结合的抗体及其抗原结合片段(“LEPR与人瘦素的复合物”也可以由“瘦素:LEPR”的表述表示)。例如，本发明包括能够与包含hLEPR和人瘦素的预形成的复合物结合的抗体及其抗原结合片段。也就是说，根据某些实施方式，瘦素与LEPR的复合物的存在不抑制抗LEPR抗体和LEPR之间的相互作用；同样，根据本发明的这个方面，抗LEPR抗体的存在不抑制瘦素与LEPR之间的相互作用。用于确定抗体或其抗原结合片段是否与LEPR与人瘦素的复合物结合的示例性测定形式示于本文的实施例4中。
类似地，本发明还包括与LEPR结合并且不阻断LEPR:瘦素相互作用的抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括能够与LEPR结合，从而产生抗体:LEPR复合物的抗体及其抗原结合片段，其中所得到的抗体:LEPR复合物能够与瘦素相互作用以产生包含抗体、LEPR和瘦素的三元复合物。用于确定抗体或其抗原结合片段是否能够以不阻断或干扰LEPR与瘦素之间的相互作用的方式结合LEPR的示例性测定形式示于本文的实施例5中。
本发明还包括在存在和/或不存在人瘦素的情况下与细胞表面表达的LEPR结合的抗体及其抗原结合片段。细胞表面表达的LEPR意指这样的LEPR或其部分(例如，LEPR的细胞外部分)，其天然在细胞表面上表达，或在工程化的细胞系中的细胞表面上表达，使得抗体或其抗原结合片段能够与LEPR分子结合。在某些实施方式中，细胞表面表达的LEPR包括重组复合物，其包含经由标签或锚定物(例如，如本文实施例6中所述的GPI锚定物)与细胞连接的LEPR的胞外域。根据本发明的这一方面，提供了抗体，其能够在不存在瘦素的情况下与细胞表面表达的LEPR结合，并且还能够在存在瘦素的情况下(即，在瘦素能够与细胞表面表达的瘦素结合的情况下)与细胞表面表达的LEPR结合。也就是说，根据某些实施方式，瘦素与细胞表面表达的LEPR的复合物的存在不抑制抗LEPR抗体与细胞表面表达的LEPR之间的相互作用。根据本发明这一方面的抗体能够在细胞表面上形成包含抗体、细胞表面表达的LEPR和瘦素的三元复合物。用于确定抗体或其抗原结合片段是否能够在存在和不存在人瘦素的情况下与细胞表面表达的LEPR结合的示例性测定形式示于本文的实施例6中。
本发明的抗体可具有一种或多种前述生物学特征或其任何组合。以上对本发明所述抗体的生物学特性列举并不旨在是穷举性的。通过综述包括本文实施例的本公开内容，本发明抗体的其他生物学特征对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
表位定位及相关技术
本发明还包括抗LEPR抗体，其包含本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的具有一个或多个保守取代的变体。例如，本发明包括抗LEPR抗体，相对于本文表1中列出的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，所述抗LEPR抗体的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。在某些实施方式中，本发明提供抗LEPR抗体，其包含相对于本文表1中列出的序列的变体HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列(例如，包含保守氨基酸取代)，其中这种变体抗体仍然表现出本文公开的示例性抗LEPR抗体的一种或多种功能和/或性质。
人LEPR的胞外域包含N-末端细胞因子受体同源结构域(CRH-1)、免疫球蛋白样(Ig)结构域和称为瘦素结合结构域(LBD)的第二CRH结构域(CRH-2)。(Carpenter等(2012)Structure 20:487-97)。此外，LEPR与粒细胞集落刺激因子(GCSF)和糖蛋白130(gp13)具有最大的同源性和相似的胞外域大小和组织。(Haniu等(1998)J Biol Chem 273(44):28691-699)。
术语“表位”指与抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点(称为互补位)相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有多于一个表位。因此，不同的抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物学作用。表位可以是构象性的或线性的。构象性表位由在空间上并列的来自线性多肽链不同区段的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中相邻的氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可包含抗原上的糖、磷酰基或磺酰基部分。
本发明包括与存在于人LEPR的氨基酸M1-D839(SEQ ID NO:113)内的一个或多个表位相互作用的抗LEPR抗体。如实施例11所述，与抗体H4H16650P2结合时，来自人LEPR的201个肽具有显著减少的氘化摄取。与H4H16650P2结合时，对应于氨基酸162-169(人LEPR的氨基酸LYVLPEVL，SEQ ID NO:113)和170-191(人LEPR的氨基酸EDSPLVPQKGSF，SEQ ID NO:113)的肽具有较慢的氘化速率，表明该抗体与至少两个具有序列LYVLPEVL或EDSPLVPQKGSF(分别为SEQ ID NO:113的氨基酸162-169或170-191)的人LEPR表位结合。
本发明所述抗体结合的表位可以由LEPR蛋白的3个或更多个(例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)氨基酸的单个连续序列组成。或者，表位可以由LEPR的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。在一些实施方式中，表位位于LEPR的瘦素结合结构域上或附近。在其他实施方式中，表位位于不同于LEPR的瘦素结合结构域的区域，例如在LEPR表面上这样的位置：抗体在该位置上与该表位结合时，不干扰瘦素与LEPR的结合。
可使用本领域普通技术人员已知的多种技术来识别被特定抗体识别的表位内的氨基酸。示例性的技术包括例如，丙氨酸扫描突变分析；肽印迹分析；以及肽切割分析。另外，可采用例如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰的方法(Tomer，2000,ProteinScience9:487-496)。可用于识别多肽内与抗体相互作用的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般来说，氢/氘交换方法涉及对目的蛋白进行氘标记，之后使抗体与被氘标记的蛋白结合。接着，将蛋白/抗体复合物转移至水，以允许在除受抗体保护的残基(其仍被氘标记)之外的所有残基处发生氢氘交换。在将抗体解离之后，对靶蛋白进行蛋白酶切和质谱分析，从而揭示被氘标记的残基，其对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。抗体与其抗原的复合物的X射线晶体学分析也可用于识别多肽内与抗体相互作用的氨基酸。
本发明还包括与本文所述的任何具体的示例性抗体(例如包含本文表1中列出的任何氨基酸序列的抗体)结合至相同表位的抗LEPR抗体。同样地，本发明还包括与本文所述的任何具体的示例性抗体(例如包含本文表1中列出的任何氨基酸序列的抗体)竞争结合LEPR的抗LEPR抗体。
可通过使用本领域中已知并且在本文中例示的常规方法，确定抗体是否与参照抗LEPR抗体结合至相同表位或者与参照抗LEPR抗体竞争结合。例如，为了确定受试抗体是否与本发明的参照抗LEPR抗体结合至相同表位，允许该参照抗体与LEPR蛋白结合。接下来，评估受试抗体与LEPR分子结合的能力。如果在LEPR与参照抗LEPR抗体结合饱和之后，受试抗体能够与LEPR结合，则可推断该受试抗体与参照抗LEPR抗体结合不同的表位。另一方面，如果在LEPR分子与参照抗LEPR抗体结合饱和之后，受试抗体不能够与LEPR结合，则该受试抗体可能结合本发明的参照抗LEPR抗体所结合的相同表位。然后可进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)以确认观察到的受试抗体的结合缺乏是否确实是由于与参照抗体结合至相同表位，或者观察到的结合的缺乏是否是空间阻断(或其他现象)造成的。这样的实验可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域中可利用的任何其他定量或定性抗体结合测定来进行。根据本发明的某些实施方式，如果例如，如果通过在竞争性结合测定中所测得，1、5、10、20或100倍过量的一种抗体抑制另一种抗体至少50％，但优选75％、90％或甚至99％的结合，则这两种抗体结合至相同(或重叠)的表位(参见，例如Junghans等，Cancer Res.1990:50:1495-1502)。或者，如果抗原中基本上所有降低或消除一种抗体的结合的氨基酸突变，均降低或消除另一种抗体的结合，则认为这两种抗体与相同表位结合。如果降低或消除一种抗体的结合的氨基酸突变仅有一部分降低或消除另一种抗体的结合，则认为这两种抗体具有“重叠表位”。
为了确定抗体是否与参照抗LEPR抗体竞争结合(或交叉竞争结合)，在两个方向上进行上述结合方法：在第一个方向上，在饱和条件下使参照抗体与LEPR蛋白结合，之后评估受试抗体与LEPR分子的结合。在第二个方向上，在饱和条件下使受试抗体与LEPR分子结合，之后评估参照抗体与LEPR分子的结合。如果，在两个方向上仅第一(饱和)抗体能够与LEPR分子结合，则推断受试抗体和参照抗体竞争结合LEPR。本领域普通技术人员将认识到，与参照抗体竞争结合的抗体可能未必与参照抗体结合至相同表位，但可能通过结合重叠表位或邻近表位而在空间上阻断参照抗体的结合。
人抗体的制备
本发明的抗LEPR抗体可以是全人抗体。用于产生单克隆抗体(包括全人单克隆抗体)的方法在本领域中是已知的。任何这样的已知方法均可用于在本发明的背景下制备与人LEPR特异性结合的人抗体。
使用例如VELOCIMMUNETM技术或用于产生全人单克隆抗体的任何其他类似的已知方法，首先分离具有人可变区和小鼠恒定区的针对LEPR的高亲和力嵌合抗体。如下文的实验部分中，对所述抗体进行表征并选择期望的特征，包括亲和力、配体阻断活性、选择性、表位等。如有必要，将小鼠恒定区替换成期望的人恒定区(例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4)以产生全人抗LEPR抗体。尽管所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶标特异性特征仍保留在可变区中。在某些情况下，全人抗LEPR抗体直接从抗原阳性B细胞中分离。
生物等效物
本发明的抗LEPR抗体和抗体片段包括具有不同于上述抗体，但保留与人LEPR结合的能力的氨基酸序列的蛋白。与亲本序列相比，这样的变体抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代，但表现出与所述抗体的生物学活性基本等效的生物学活性。同样地，本发明的抗LEPR抗体编码DNA序列包括这样的序列：与公开的序列相比，其包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代，但其编码与本发明所述的抗LEPR抗体或抗体片段基本生物等效的抗LEPR抗体或抗体片段。上文讨论了这样的变体氨基酸和DNA序列的实例。
如果两种抗原结合蛋白或抗体是例如这样的药物等效物或药物替代物，则认为它们是生物等效的：在相似实验条件下以相同摩尔剂量(无论是单剂量还是多剂量)施用时，其吸收速率和程度未表现出显著差异。一些在其吸收程度方面等效，但在其吸收速率方面不等效的抗体，被认为是等效物或药物替代物，并且仍可以被认为是生物等效的，因为这种吸收速率方面的差异是有意的且反映在标签中，不是例如长期使用时为达到有效的体内药物浓度所必需的，并且被认为对所研究的特定药物产品不具有医学显著性。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白在其安全性、纯度和效力方面不存在临床上有意义的差异，则认为它们是生物等效的。
在一个实施方式中，如果患者可在参照产品和生物产品之间转换一次或多次，而与没有这样的转换的持续治疗相比，不良作用(包括免疫原性发生临床上显著的改变或有效性降低)的风险并未预期提高，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白在使用条件方面均通过共同的作用机制作用，则它们在所述机制已知的程度上是生物等效的。
生物等效性可通过体内和体外方法证明。生物等效性测量包括，例如(a)人或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量血液、血浆、血清或其他生物体液中抗体或其代谢物的浓度作时间函数；(b)已与人体内生物利用度数据相关联并且对其具有合理预测性的体外测试；(c)人或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量抗体(或其靶标)合适的急性药理学作用，作时间函数；以及(d)在建立抗体的安全性、效力或生物利用度或生物等效性的良好控制的临床试验中进行的。
通过例如对生物活性不需要的残基或序列进行多种取代，或者缺失生物活性不需要的末端或内部残基或序列，可以构建本发明所述的抗LEPR抗体的生物等效变体。例如，可缺失或者用其他氨基酸替换对生物活性非必需的半胱氨酸残基，以防止在复性后形成不必要或不正确的分子内二硫桥。在另一些情况下，生物等效抗体可包括含有改变该抗体的糖基化特征的氨基酸改变(例如消除或去除糖基化的突变)的抗LEPR抗体变体。
物种选择性和物种交叉反应性
根据某些实施方式，本发明提供了与人LEPR结合但不与来自其他物种的LEPR结合的抗LEPR抗体。本发明还包括与人LEPR结合并且与来自一种或多种非人物种的LEPR结合的抗LEPR抗体。例如，本发明所述的抗LEPR抗体可与人LEPR结合，并且可与小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩LEPR结合或不结合(视具体情况而定)。根据本发明的某些示例性实施方式，提供了与人LEPR和弥猴(例如食蟹猴(Macaca fascicularis))LEPR特异性结合的抗LEPR抗体。本发明的其他抗LEPR抗体与人LEPR结合但与弥猴LEPR不结合或仅弱结合。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性的)。多特异性抗体可对一种靶多肽的不同表位具有特异性，或者可包含对一种以上靶多肽具有特异性的抗原结合域。参见例如Tutt等，1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等，2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。本发明所述的抗LEPR抗体可与另一功能分子(例如另一肽或蛋白)连接或共表达。例如，抗体或其片段可与一个或多个其他分子实体(例如其他抗体或抗体片段)功能性连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂与人LEPR结合，并且免疫球蛋白的另一个臂对第二抗原具有特异性。LEPR结合臂可以包含本文表1中列出的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。
可用于本发明背景下的一个示例性的双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域和第二Ig CH3域，其中第一和第二Ig CH3域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异降低了双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方式中，第一Ig CH3结构域与蛋白A结合，并且第二Ig CH3结构域包含降低或消除与蛋白A的结合的突变，例如H95R修饰(IMGT外显子编号；EU编号H435R)。第二CH3还可包含Y96F修饰(IMGT编号；EU编号Y436F)。可见于第二CH3中的另一些修饰包括：对于IgG1抗体，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT编号；EU编号D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；对于IgG2抗体，N44S、K52N和V82I(IMGT编号；EU编号N384S、K392N和V422I，)；以及对于IgG4抗体，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT编号；EU编号Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述双特异性抗体形式的变化均在本发明范围的考量之内。
可用于本发明背景下的其他示例性的双特异性形式包括但不限于，例如基于scFv的或双功能抗体的双特异性形式、IgG-scFv融合物、双可变域(DVD)-Ig、四源杂交瘤(Quadroma)、knob-into-hole、共同轻链(例如，具有knob-into-hole的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG，以及Mab2双特异性形式(上述形式的综述参见例如Klein等，2012,mAbs 4:6,1-11，以及文中引用的参考文献)。还可使用肽/核酸缀合物来构建双特异性抗体，例如其中使用具有正交化学反应性的非天然氨基酸产生位点特异性的抗体-寡核苷酸缀合物，所述缀合物随后自组装成具有限定组成、价和几何形态的多聚复合物。(参见例如Kazane等，J.Am.Chem.Soc.[Epub：2012年12月4日])。
治疗制剂和施用
本发明提供了包含本发明所述的抗LEPR抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明所述的药物组合物可用合适的运载体、赋形剂以及提供改善的转移、递送、耐受性等的其他药剂配制。大量合适的制剂可见于所有药物化学家知晓的处方集中：Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company，宾夕法尼亚州伊斯顿。这些制剂包括，例如分散剂、糊剂、软膏剂、胶冻剂(jelly)、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子脂质)的囊泡(例如LIPOFECTINTM，Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油型和油包水型乳剂、乳剂碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶，以及包含碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等，“Compendium of excipients forparenteral formulations”PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
施用于患者的抗体的剂量可依据患者的年龄和身板、目标疾病、状况、施用途径等的变化而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积计算。在成年患者中，通常可以有利地以约0.01至约20mg/kg体重，更优选地约0.02至约7、约0.03至约5或者约0.05至约3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本发明所述的抗体。根据病况的严重程度，可调整治疗的频率和持续时间。用于施用抗LEPR抗体的有效剂量和时间表可凭经验确定；例如可通过周期性评估来监测患者的进展并相应地调整剂量。另外，可使用本领域中公知的方法进行剂量的物种间缩放(例如Mordenti等，1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
多种递送系统是已知的并且可用于施用本发明所述的药物组合物，例如包封在脂质体、微颗粒、微胶囊中，能够表达突变病毒的重组细胞，受体介导的内吞作用(参见例如，Wu等，1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入方法包括但不限于：皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述组合物可通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注注射(bolus injection)、通过经上皮或皮肤粘膜内衬(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。
本发明所述的药物组合物可用标准针和注射器皮下或静脉内递送。另外，对于皮下递送，笔式递送装置(pen delivery device)可容易地应用于递送本发明所述的药物组合物。这样的笔式递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置通常利用含有药物组合物的可替换笔芯(cartridge)。一旦笔芯中的药物组合物已全部被施用并且笔芯变空，可容易地将空笔芯丢弃并替换成含有药物组合物的新笔芯。然后，可重新使用所述笔式递送装置。在一次性笔式递送装置中，没有可替换的笔芯。相反，一次性笔式递送装置预填充有药物组合物，其容纳于该装置内的贮液器中。一旦容器内药物组合物用尽，则将整个装置丢弃。
多种可重复使用的笔式和自动注射器式递送装置可应用于皮下递送本发明所述的药物组合物。实例包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford，Inc.，英国伍德斯托克)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems，瑞士Bergdorf)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lillyand Co.，印第安纳州印第安纳波利斯)、NOVOPENTMI、II和III(Novo Nordisk，丹麦哥本哈根)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk，丹麦哥本哈根)、BDTM笔(Becton Dickinson，新泽西富兰克林湖)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM，以及OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis，德国法兰克福)等等。可应用于皮下递送本发明所述的药物组合物的一次性笔式递送装置的实例包括但不限于SOLO START M笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)，以及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen，加利福尼亚州千橡树市)、PENLETTM(Haselmeier，德国斯图加特)、EPIPEN(Dey，L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs，伊利诺伊州Abbott Park)等。
在某些情况下，可以在受控释放系统中递送所述药物组合物。在一个实施方式中，可使用泵(参见Langer，出处同上；Sefton，1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方式中，可使用聚合物材料；参见Medical Applications of ControlledRelease，Langer和Wise(编)，1974,CRC Pres.，佛罗里达州Boca Raton。在又一个实施方式中，可接近组合物的靶标放置受控释放系统，从而仅需要全身性剂量的一部分(参见例如Goodson，1984，在Medical Applications of Controlled Release，出处同上，vol.2,pp.115-138)。其他受控释放系统在Langer，1990,Science 249:1527-1533的综述中进行了讨论。
可注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可通过公知的方法制备。例如，可如下制备可注射制剂：例如将上述抗体或其盐在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、混悬或乳化。对于注射用水性介质，例如生理盐水，含葡萄糖及其他辅助剂的等渗溶液等，可与合适的增溶剂，如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。对于油性介质，可采用例如芝麻油、大豆油等，其可与增溶剂(如苯甲酸苄酯、苄醇等)组合使用。将如此制备的注射剂优选填充于合适的安瓿中。
有利地，将上述用于口服或胃肠外使用的药物组合物制备成适于匹配活性成分剂量的单位剂量剂型。这样的单位剂量剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。所包含的前述抗体的量一般为每单位剂量剂型约5至约500mg；特别地，在注射剂的形式下，优选地含有约5至约100mg的前述抗体，而其他剂型含有约10至约250mg的前述抗体。
抗体的治疗用途
本发明包括这样的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含抗LEPR抗体(例如包含本文表1中列出的任何HCVR/LCVR或CDR序列的抗LEPR抗体)的治疗组合物。所述治疗组合物可以包含本文公开的任何抗LEPR抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的运载体或稀释剂。
本发明的抗体可特别用于治疗、预防和/或改善任何与瘦素缺乏、瘦素抵抗、低瘦素血症相关或由其介导的疾病或病症，或以其他方式可通过刺激或激活LEPR信号传导或在体外或体内模拟瘦素的天然活性而治疗的疾病或病症。例如，本发明所述的抗体及其抗原结合片段可用于治疗脂肪代谢障碍症。可通过本发明所述的抗体和抗原结合片段治疗的示例性的脂肪代谢障碍症包括例如先天性全身性脂肪代谢障碍，获得性全身性脂肪代谢障碍，家族性部分性脂肪代谢障碍，获得性部分脂肪代谢障碍，离心性腹部脂肪代谢障碍，环状脂肪萎缩，局部脂肪代谢障碍和HIV相关性脂肪代谢障碍。
本发明还包括抗LEPR抗体及其抗原结合片段，其用于针对表达与肥胖相关的一种或多种LEPR突变的细胞、组织和器官，恢复瘦素信号传导。例如，已识别出在瘦素存在的情况下不显示信号传导或显示降低的信号传导，且与肥胖症和相关病症有关的某些LEPR突变体。在本文中使用的，在瘦素存在的情况下不显示信号传导的LEPR突变体被称为“信号传导缺陷型LEPR突变体”。示例性的信号传导缺陷型LEPR突变为LEPR-A409E(Farooqi等，2007,NEngl J Med 356(3):237-247)。在本文中使用的，在瘦素存在的情况下显示降低的信号传导的LEPR突变体(相比于野生型LEPR)被称为“信号传导受损型LEPR突变体”。示例性的信号传导受损型LEPR突变体为LEPR-P316T(Mazen等，2011,Mol Genet Metab 102:461-464)。因此，本发明包括抗LEPR抗体及其抗原结合片段，其可用于治疗、预防和/或改善由一种或多种信号传导缺陷型(例如A409E)和/或信号传导受损型(例如P316T)LEPR突变体引起或与其相关的疾病或病症。
本发明所述的抗LEPR抗体及其抗原结合片段也可用于治疗或预防选自下组的一种或多种疾病或病症：肥胖症、代谢综合征、饮食诱导的食物渴求、功能性下丘脑闭经、1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抵抗，严重的胰岛素抵抗(包括胰岛素受体突变引起的严重胰岛素抵抗、非胰岛素受体突变引起的严重胰岛素抵抗、下游信号传导通路中的突变或其他原因引起的严重胰岛素抵抗，或非酒精性和酒精性脂肪肝疾病、阿尔茨海默氏病、瘦素缺乏、瘦素抵抗，脂肪代谢障碍、Leprechaunism/Donohue综合征、Rabson-Mendenhall综合征。
在本文所述的治疗方法的背景下，抗LEPR抗体可作为单一疗法(即作为唯一治疗剂)施用或与一种或多种另外的治疗剂组合施用(其实例描述于本文其他地方)。
联合治疗和制剂
本发明包括包含本文所述的任何抗LEPR抗体与一种或多种另外的治疗活性组分的组合物和治疗制剂，以及包括向有需要的受试者施用所述组合物的治疗方法。
本发明的抗LEPR抗体可以与一种或多种另外的治疗活性组分共同配制和/或组合施用，所述另外的治疗活性组分例如用于治疗肥胖症、高胆固醇血症、高脂血症、2型糖尿病、1型糖尿病、食欲控制、不育症等的处方药物产品。这种另外的治疗活性组分的实例包括例如重组人瘦素(例如美曲普汀[MYALEPT]、PCSK9抑制剂(例如抗PCSK9抗体[alirocumab、evolocumab、bococizumab、lodecizumab、ralpancizumab等])、他汀类药物(阿托伐他汀、罗苏伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀等)、依泽替米贝、胰岛素、胰岛素变体、胰岛素促分泌素、二甲双胍、磺酰脲类、葡萄糖钠协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂(例如达格列净、卡格列净、依帕列净等)、GLP-1激动剂/类似物(例如extendin-4、艾塞那肽、利拉鲁肽、利西拉肽、阿比鲁肽、杜拉鲁肽等)、胰高血糖素(GCG)抑制剂(例如抗GCG抗体)、胰高血糖素受体(GCGR)抑制剂(例如抗GCGR抗体、小分子GCGR拮抗剂、GCGR特异性反义寡核苷酸、抗GCGR适体[例如Spiegelmers]等)、血管生成素样蛋白(ANGPTL)抑制剂(例如抗ANGPTL3抗体、抗ANGPTL4抗体、抗ANGPTL8抗体等)、苯丁胺、奥利司他、托吡酯、安非他酮、托吡酯/苯丁胺、安非他酮/纳曲酮、安非他酮/唑尼沙胺、普兰林肽/美曲普汀、氯卡色林、塞利司他、特索芬辛、韦利贝特等。
可以在施用本发明所述的抗LEPR抗体之前不久、与其同时或在其之后不久，施用另外的治疗活性组分，例如上文列出的任何药物或其衍生物；(为了本公开内容的目的，这样的施用方案被认为是将抗LEPR抗体与另外的治疗活性组分“组合”施用)。本发明包括药物组合物，其中本发明所述的抗LEPR抗体与本文其他地方所述的一种或多种另外的治疗活性组分共同配制。
施用方案
根据本发明的某些实施方式，可在限定的时间进程内向对象施用多个剂量的抗LEPR抗体(或药物组合物，其包含抗LEPR抗体与本文中所述的任何另外的治疗活性剂的组合)。根据本发明这一方面的方法包括向受试者依次施用多个剂量的本发明所述抗LEPR抗体。本文中使用的“依次施用”意指在相隔预定间隔(例如，数小时、数天、数周或数月)的不同时间点(例如在不同天)，向受试者施用抗LEPR抗体的各剂量。本发明包括方法，所述方法包括向患者依次施用单独初始剂量的抗LEPR抗体，之后是一个或多个第二剂量的抗LEPR抗体，任选地接着是一个或多个第三剂量的抗LEPR抗体。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指施用本发明所述抗LEPR抗体的时间顺序。因此，“初始剂量”为在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”、“负载剂量”、“起始剂量”等)；“第二剂量”为在初始剂量之后施用的剂量；而“第三剂量”为在第二剂量之后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量可以均包含相同量的抗LEPR抗体，但一般可能在施用频率方面彼此有所不同。然而，在某些实施方式中，初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中包含的抗LEPR抗体的量在治疗过程期间彼此不同(例如，适当向上或向下调整)。在某些实施方式中，在治疗方案开始时作为“负荷剂量”施用两个或更多个(例如2、3、4或5个)剂量，之后以较低的频率施用后续剂量，(例如“维持剂量”)。
抗体的诊断和分析用途
例如出于诊断目的，本发明的抗LEPR抗体还可用于在样品中检测和/或测量LEPR或表达LEPR的细胞。例如，抗LEPR抗体或其片段可用于诊断以LEPR的异常表达(例如过表达、表达不足、表达缺乏等)为特征的病况或疾病。示例性的用于LEPR的诊断测定可包括：例如使获取自患者的样品与本发明所述的抗LEPR抗体接触，其中所述抗LEPR抗体标记有可检测标记物或报告分子。或者，未经标记的抗LEPR抗体可以与自身经可检测标记的二抗联合用于诊断应用。可检测标记物或报告分子可以是放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，例如荧光素异硫氰酸盐/酯或罗丹明；或者酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可用于在样品中检测或测量LEPR的具体的示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选(FACS)和正电子发射断层(PET)扫描。
可用于根据本发明所述的LEPR诊断测定的样品包括可获取自患者的任何组织或体液样品，其在正常条件或病理条件下包含可检测量的LEPR蛋白或其片段。一般来说，将测量获取自健康患者(例如未患有与异常LEPR水平或活性相关的疾病或病况的患者)的特定样品中LEPR的水平，以首先建立LEPR的基线或标准水平。然后，可将LEPR的这一基线水平与获取自疑似患有LEPR相关疾病或病况的个体的样品中测得的LEPR水平进行比较。
实施例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本发明所述的方法和组合物，而且并非旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已经尽力确保所使用数值(例如量、温度等)的准确性，但是应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份是重量份，分子量是平均分子量，温度以摄氏度为单位，压力是大气压或接近大气压。
实施例1.特异性结合瘦素受体(LEPR)的抗原结合蛋白的产生
用包含LEPR胞外域的免疫原免疫小鼠(即包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的工程化小鼠)，从而获得抗LEPR抗体。通过LEPR特异性免疫测定监测抗体免疫应答。使用先前描述的技术，分离并纯化全人抗LEPR抗体。
根据本实施例的方法产生的示例性抗LEPR抗体的某些生物学特性在下文所示的实施例中详细描述。
实施例2.重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表1列出了本发明所选抗LEPR抗体的重链和轻链可变区和CDR的氨基酸序列标识符。表2列出了对应的核酸序列标识符。
表1:氨基酸序列标识符
表2:核酸序列标识符
本文中通常根据以下命名法命名抗体：Fc前缀(例如“H4H”、“H1M”、“H2M”等)，后面为数字标识符(例如“16650”、“16679”等)，后面为“P”或“N”后缀。因此，根据该命名法，抗体在本文中可以被称为例如“H4H16650P2”、“H4H16679P2”等。本文中使用的抗体名称(H4H、H1M和H2M)上的Fc前缀指示抗体的特定Fc区同种型。例如，“H4H”抗体具有人IgG 4Fc，而“H1M”抗体具有小鼠IgG1Fc(所有可变区都是全人的，如抗体名称中的第一个“H”所示)。如本领域普通技术人员将理解的，具有特定Fc同种型的抗体可以被转化成具有不同Fc同种型的抗体(例如，具有小鼠IgG1Fc的抗体可以被转化为具有人IgG4等的抗体)，但无论如何，表1和2中显示的数字标识符所指示的可变域(包括CDR)将保持不变，并且无论Fc结构域的性质如何，结合性质预期是相同的或基本上相似的。
如本文实施例中使用的“比较mAb”是指Fazeli等(2006)J Immunol Methods 312:190-200和Carpenter等(2012)Structure 20(3):487-97中所述的Fab9F8。
实施例3.表面等离子体共振得到的人单克隆抗LEPR抗体的结合亲和力和动力学常数
使用Biacore 4000仪器，使用实时表面等离子体共振生物传感器测定LEPR与纯化的抗LEPR单克隆抗体结合的平衡解离常数(KD值)。所有结合研究均在10mM HEPES，150mMNaCl，3mM EDTA和0.05％v/v表面活性剂Tween-20，pH7.4(HBS-ET)运行缓冲液中，在25℃和37℃下进行。首先通过与单克隆小鼠抗人Fc抗体(GE，#BR-1008-39)进行胺偶联，将Biacore传感器表面衍生化，以捕获抗LEPR单克隆抗体。针对以下LEPR试剂进行结合研究：表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的人LEPR胞外域(hLEPR.mmh；SEQ ID NO:114)、表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的食蟹猴LEPR胞外域(mfLEPR.mmh；SEQ ID NO:117)、表达有C末端小鼠IgG2aFc标签的人LEPR胞外域(hLEPR.mFc；SEQ ID NO:115)、表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的小鼠LEPR胞外域(mLEPR.mmh；SEQ ID NO:118)和表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的大鼠LEPR胞外域(rLEPR.mmh；SEQ ID NO:119)。首先在HBS-ET运行缓冲液(100nM-3.7nM；3倍连续稀释)中制备不同浓度的LEPR试剂，并将其注射在抗人Fc捕获的抗LEPR单克隆抗体表面上(以30μL/分钟的流速注射4分钟)，而结合单克隆抗体的LEPR试剂的解离在HBS-ET运行缓冲液中监测10分钟。通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件，将实时结合传感图拟合至具有质量传输限制的1:1结合模型，来确定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。以如下公式，由动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2))：
和
在表3至8中显示了hLEPR.mmh、mfLEPR.MMH或hLEPR.mFc在25℃和37℃下与本发明所述的不同抗LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数。
表3:hLEPR-MMH在25℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数
*NB表示在当前实验条件下未观察到结合。
表4:hLEPR-MMH在37℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数
*NB表示在当前实验条件下未观察到结合。
表5:mfLEPR.MMH在25℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数
*NB表示在当前实验条件下未观察到结合。
*IC表示观察到的结合是兼取的并且在当前实验条件下不能拟合实时结合数据。
表6:mfLEPR.MMH在37℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数
*NB表示在当前实验条件下未观察到结合。
*IC表示观察到的结合是兼取的并且在当前实验条件下不能拟合实时结合数据。
表7:hLEPR.mFc在25℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数
*NB表示在当前实验条件下未观察到结合。
表8:hLEPR.mFc在37℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数
*NB表示在当前实验条件下未观察到结合。
在25℃下，抗LEPR单克隆抗体以从7.93nM至148nM的KD值与hLEPR-MMH结合，如表5所示。在37℃下，抗-LEPR单克隆抗体以从14.8nM至326nM的KD值与hLEPR-MMH结合，如表4所示。
本发明的12个抗LEPR单克隆抗体中有10个与mfLEPR.MMH结合。在25℃下，抗LEPR单克隆抗体以从2.27nM至139nM的KD值与mfLEPR.MMH结合，如表7所示。在37℃下，抗LEPR单克隆抗体以从5.18nM到264nM的KD值与mfLEPR.MMH结合，如表8所示。
在25℃下，抗LEPR单克隆抗体以从613pM至5.7nM的KD值与hLEPR-mFc结合，如表7所示。在37℃下，抗LEPR单克隆抗体以从1.16nM至12.8nM的KD值与hLEPR-mFc结合，如表8所示。
本发明的抗LEPR单克隆抗体没有一种在25℃或37℃下与mLEPR.MMH或rLEPR.MMH结合(数据未显示)。
实施例4.本发明的抗LEPR抗体在存在瘦素:LEPR结合的情况下结合LEPR
在Biacore T200仪器上使用实时表面等离子体共振生物传感器，评估人瘦素对抗LEPR抗体与LEPR的结合的阻断。整个研究在10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA和0.05％v/v表面活性剂Tween-20(HBS-ET运行缓冲液)中，在25℃下进行。首先使用标准EDC/NHS表面化学，通过与人瘦素(R&D Systems，#398-LP)胺偶联，将Biacore CM5传感器表面衍生化。将20nM的表达有C端myc-myc-六聚组氨酸标签的人LEPR胞外域(hLEPR-MMH；SEQ IDNO:xx)注射到人瘦素固定化的Biacore传感器表面上(以10μL/分钟或25μL/分钟的流速注射4分钟)以实现约200RU的结合响应，从而形成人LEPR和人瘦素的复合物。为了评估抗体与hLEPR-MMH的结合是否被人瘦素阻断，将200nM的抗-LEPR单克隆抗体注射到预形成的hLEPR-MMH:人瘦素复合物上(以50μL/分钟或25μL/分钟的流速注射4至5分钟)。本发明的所有抗LEPR抗体以大致相似的信号强度与hLEPR-MMH和人瘦素的复合物(“瘦素:LEPR”)结合，并且9中报道了以RU表示的观察到的结合。该结果表明人瘦素不阻断hLEPR-MMH与受试抗LEPR抗体的结合。
表9:抗LEPR单克隆抗体与hLEPR-MMH和人瘦素的预复合物的结合。
实施例5.人瘦素受体阻断ELISA
人瘦素(hLeptin；R&D Systems，#398-LP-01M)在96孔微量滴定板上以5μg/mL的浓度(溶于PBS中)在4℃下包被过夜，以用于ELISA。随后使用BSA 0.5％(w/v)的PBS溶液封闭非特异性结合位点。用在8.5pM至500nM的范围内连续稀释的抗LEPR抗体、hLeptin蛋白或同种型对照抗体，滴定10nM恒定量的表达有C末端人Fc标签的LEPR蛋白(hLEPR.hFc；SEQ IDNO:116)的胞外域部分。然后将这些抗体-蛋白或蛋白-蛋白复合物在室温(RT)下孵育1.5小时。随后将复合物转移至包被有hLeptin的微量滴定板，并且在室温下孵育2小时，洗涤孔，用与辣根过氧化物酶偶联的抗人IgG多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch Inc，#109-035-098)检测板结合的hLEPR.hFc。样品用TMB溶液(BD Biosciences，#555214；底物A和B按照制造商说明书以1：1比率混合)显色以产生比色反应，然后用1M硫酸中和，然后在VictorX5读板仪上测量450nm处的吸光度。
在PrismTM软件(GraphPad)内使用S型剂量-反应模型进行数据分析。计算受试抗体最大浓度时的阻断百分比，作为抗体阻断10nM hLEPR.hFc与板上的人瘦素结合的能力的指标。在计算中，10nM hLEPR.hFc在抗体不存在的情况下的结合信号称为100％结合或0％阻断；并且hLEPR.hFc不存在的情况下，仅缓冲液的基线信号称为0％结合或100％阻断。在500nM抗体浓度下的阻断数据总结于表10中。
如表10所示，本发明的抗LEPR抗体都没有表现出对hLEPR.hFc与hLeptin包被表面的结合>28％的阻断。然而，作为阳性对照的比较抗体和hLeptin能够阻断99％的hLEPR.hFc与hLeptin包被表面的结合。在高达500nM的浓度下，同种型对照抗体未显示可测得的阻断。
表10:抗LEPR抗体对hLEPR.hFc与hLeptin的结合阻断的ELISA
实施例6.通过用HEK293/Mycx2-hLepR(ecto)-GPI锚定的细胞进行FACS分析测得的细胞结合
瘦素受体LEPR是I类细胞因子受体家族的单次跨膜受体(Tartaglia等(1997)JBiol Chem 7:272(10):6093-6)。LEPR可与瘦素结合，瘦素是主要由参与食物摄取和代谢调节的脂肪组织表达的蛋白(Friedman等(2014)J Endocrinol 223(1):T1-8)。
为了评估抗LEPR抗体的细胞结合，生成HEK293稳定细胞系。下文中称为HEK293/hLEPR-GPI的细胞系稳定地表达人LEPR的胞外域(登录号#P48357(SEQ ID NO:113)的氨基酸22-839，同种型B)，所述胞外结构域具有N-末端myc-myc标签和来自人羧肽酶M的C-末端肽序列，所述人羧肽酶M引导添加GPI(糖基磷脂酰肌醇)(Deddish等(1990)J.BiologicalChemistry 265:25:15083-89)以使得蛋白可以被GPI-锚定至膜。产生另一HEK293细胞系，以稳定地表达全长人LEPR(登录号#P48357(SEQ ID NO:113)的氨基酸1-1165，同种型B)以及萤光素酶报告基因(Stat3-萤光素酶，Stat3-luc，SA Bioscience，#CLS-6028L)，该细胞系在下文中称为HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL。还产生了仅具有Stat3-萤光素酶报告基因的HEK293细胞(HEK293/Stat3-luc)作为对照细胞系。
解离HEK293亲本细胞和HEK293/hLEPR-GPI细胞，并且在含2％FBS的PBS(FACS缓冲液)中，以5×105个细胞/孔铺板于v底96孔板上，以用于FACS分析。为了测试瘦素的存在是否影响抗hLEPR抗体与细胞结合的能力，将含有或不含有1μM人瘦素(R&D Systems，#398-LP)的FACS缓冲液与细胞一起在4℃下孵育30分钟，然后在FACS缓冲液中加入10nM的抗LEPR抗体或对照抗体。随后将细胞在4℃孵育30分钟，然后洗涤，然后与16μg/mL的-647偶联的二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，#109-547-003)一起在4℃下孵育30分钟。随后使用BD CytoFix TM(Becton Dickinson，#554655)固定细胞，过滤并在HyperCyt流式细胞仪(Beckman Coulter)上分析。还针对所有细胞系测试了未染色和仅二抗的对照。使用ForeCyt(IntelliCyt)和FlowJo版本10软件分析结果，以确定活细胞的荧光几何平均值。然后将各样品的荧光几何平均值归一化至未染色细胞，得到各条件下的相对结合(称为“结合比”)，并记录各受试抗体的这些结合比。
如表11所示，9种在10nM下测试的本发明抗LEPR抗体在瘦素不存在的情况下显示与HEK293/hLEPR-GPI细胞结合，结合比为824至3374倍。抗LEPR抗体也在1μM瘦素存在的情况下结合，结合比为398和4184倍。如表11所示，在10nM下测试的比较抗体在瘦素不存在的情况下显示与HEK293/hLEPR-GPI细胞结合，结合比为2349倍，但是在1μM瘦素存在的情况下显示明显更低的与细胞的结合，结合比为112。抗LEPR抗体没有表现出与HEK293亲本细胞的任何显著结合，在1μM瘦素存在和不存在的情况下，结合比为1至9倍。在瘦素存在或不存在的情况下，同种型对照抗体和仅二抗的样品也没有表现出与任何细胞系的显著结合，结合比为1至6倍。
如表12所示，四种在瘦素不存在的情况下以70nM测试的本发明抗体显示与HEK293/hLEPR-GPI细胞的结合，结合比为707至1131倍，以及与HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL细胞的结合，结合比为42至51。抗LEPR抗体没有表现出与HEK293/Stat3-luc细胞的任何显著结合，结合比为1至8倍。同种型对照抗体和仅二抗的样品也未显示出与任何受试细胞系的显著结合，结合比为1至2倍。
表11:在1μM人瘦素存在或不存在的情况下，10nM抗LEPR抗体与HEK293/hLEPR-GPI和HEK293亲本细胞的结合
表11:在1μM人瘦素存在或不存在的情况下，10nM抗LEPR抗体与HEK293/hLEPR-GPI和HEK293亲本细胞的结合
*部分基于本文实施例7和8中观察到的结果，将抗体划分为“激动剂”或“增效剂”。表12:70nM抗LEPR抗体与HEK293/hLEPR-GPI、HEK293/Stat3-hLEPR-FL和HEK293/Stat3-luc亲本细胞的结合
实施例7.本发明的抗LEPR抗体在瘦素存在或不存在的情况下激活LEPR信号传导
开发了一种生物测定法，以使用稳定表达全长人LEPR(hLEPR；登录号NP_002294.2的氨基酸1至1165)以及萤光素酶报告基因(STAT3-Luc；Qiagen，#CLS-6028L)的报告细胞系，经由LEPR激活来检测STAT3在一种人神经母细胞瘤细胞系，IMR-32细胞系中的转录激活。将得到的稳定细胞系(称为IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR)分离在补充了10％FBS、NEAA、1ug/mL嘌呤霉素、100ug/mL潮霉素B和青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的MEM-Earl培养基(完全培养基)中维持。
由此产生的生物测定法用于测定本发明抗LEPR抗体在瘦素存在或不存在的情况下对LEPR信号传导的影响。将IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞在完整培养基中以20,000个细胞/100ul/孔的密度铺板于96孔板，第二天将完整培养基替换为适当体积的补充了1％BSA和0.1％FBS的Opti-MEM培养基(测定缓冲液)，持续30分钟，以用于上述生物测定法。为了测定在瘦素不存在的情况下本发明抗体的作用，将抗-LEPR抗体或同种型对照抗体和人瘦素(hLeptin；R&D Systems，#398-LP)在测定缓冲液中半对数连续稀释到100nM至300fM的终浓度，加至细胞，随后在37℃下，在5％CO2中孵育过夜。
为了测定在瘦素存在的情况下本发明抗体的作用，将试验缓冲液中200pM固定浓度的人瘦素加至细胞，随后立即加入半对数连续稀释至100nM至300fM终浓度的抗-LEPR抗体或同种型对照抗体。然后将样品在37℃下，在5％CO2中孵育过夜。然后将OneGlo试剂(Promega，#E6051)加至样品，并在发光模式下在Envision多标记读板仪(Perkin Elmer)上测量萤光素酶活性。得到相对光单位(RLU)值，并且用GraphPad Prism软件(GraphPad)，使用非线性回归分析结果。从hLeptin剂量响应中得到的最大RLU值在IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR测定中被定义为100％激活。
如表13所示，在研究1中，在hLeptin不存在的情况下，所有受试抗LEPR抗体均显示对IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞的弱刺激，其EC50值为134pM至11.9nM，且最大激活为相对于从hLeptin剂量响应中得到的最大激活的5％至13％。在研究2中，在hLeptin不存在的情况下，4种受试抗LEPR抗体显示对IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞的刺激，其EC50值为61.9pM至206.9pM，且最大激活为相对于从hLeptin剂量响应中得到的最大激活的65％至68％。在研究1中，在200μM的hLeptin存在的情况下，，所有受试抗LEPR抗体均显示对IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞的刺激，其EC50值为20.2pM至523pM，且最大激活为相对于从hLeptin剂量响应中得到的最大激活的66％至107％。因为这些抗体增强了瘦素诱导的LEPR信号传导，所以这些抗体被分类为如本文所定义的“增效剂”。在研究2中，在200pM hLeptin存在的情况下，4种受试抗LEPR抗体显示对IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞的刺激，其EC50值为51.9pM至257.3pM，且最大激活为相对于从hleptin剂量响应得到的最大激活的76％至88％。在瘦素存在的情况下，这些抗体没有明显增强LEPR信号传导。在任何测定中，同种型对照抗体均未显示对IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞的任何可测得的刺激。
表13:抗LEPR抗体对hLEPR的激活
实施例8.本发明的抗LEPR抗体在表达信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变体的细胞中激活信号传导
已识别出表现出缺陷型或受损型瘦素介导的信号传导，并且与早发性肥胖相关的LEPR突变体。例如，LEPR-A409E是一种不将瘦素信号传导至STAT3的信号传导缺陷型突变LEPR蛋白；该A409E突变体最初被确定为早发性肥胖的单基因原因。(Farooqi等，2007，NEngl J Med 356(3)：237-247)。LEPR-P316T是一种也被证明与早发性肥胖有关的信号传导受损型突变LEPR蛋白。Mazen等，2011，Mol Genet Metab 102:461-464)。
在该实施例中，评估了本发明的抗LEPR抗体在表达信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变体的细胞系中刺激LEPR信号传导的能力。特别是，构建了表达野生型LEPR、LEPR-A409E(信号传导缺陷型)或LEPR-P316T(信号传导受损型)的报告细胞系(HEK293)。仅用媒介、或用重组人瘦素、对照IgG或本发明的激动剂抗LEPR抗体(H4H16650或H4H16679)处理细胞，并且确定LEPR信号传导的程度(通过Western印迹检测相对于STAT3表达的pSTAT3-Y705表达而测得)。
在这些实验中，显示了本发明的激动剂抗LEPR抗体(H4H16650和H4H16679)在表达LEPR-A409E突变体或LEPR-P316T突变体(通过STAT3表达测得)的细胞中以剂量依赖性方式刺激LEPR信号传导(图2，板块B和C)。相比之下，瘦素处理在表达LEPR-P316T突变体的细胞中仅诱导适度的信号传导，而在表达LEPR-A409E突变体的细胞中不诱导信号传导。(图2，板块A)。此外，在用媒介或IgG对照抗体处理的任何细胞系中均未检测到LEPR信号传导(数据未显示)。其他信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变体在该试验中进行了测试，但未被抗LEPR突变体激活(数据未显示)，表明这种挽救效果可能是突变体依赖性的。
本实施例的结果表明，本发明的激动剂抗LEPR抗体可用于治疗由某些信号传导缺陷型或某些信号传导受损型LEPR突变体(例如LEPR-P316T或LEPR-A409E)引起或与其相关的疾病和病症(例如，早发性肥胖症)。
实施例9：不同抗LEPR单克隆抗体之间的Octet交叉竞争。
在Octet HTX生物传感器平台(Pall ForteBio Corp.)上，使用实时无标记生物层干涉测定法确定一组不同抗LEPR单克隆抗体之间的结合竞争。整个实验在含有10mMHEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％v/v表面活性剂Tween-20、1mg/mL BSA、pH7.4(HBS-EBT)的缓冲液中，在25℃下以1000rpm的速率摇板进行。为了评估两种抗体是否能够彼此竞争结合其各自在表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的重组人LEPR(hLEPR.mmh；SEQ IDNO:114)上的表位，首先通过将生物传感器尖端在含有20μg/mL hLEPR-MMH的孔中浸没5分钟，从而将约0.25nm或0.34nm的hLEPR-MMH捕获到抗penta-His抗体包被的Octet生物传感器尖端(Fortebio Inc，#18-5122)上。然后通过浸入含有50μg/mL第一抗LEPR单克隆抗体(后称为mAb-1)溶液的孔中210秒，使捕获了抗原的生物传感器尖端被mAb-1饱和。随后将生物传感器尖端浸入含有50μg/mL第二抗LEPR单克隆抗体(随后称为mAb-2)的溶液的孔中150秒。在实验的每个步骤之间，在HBS-EBT缓冲液中洗涤生物传感器尖端。在整个实验过程中监测实时结合反应，并记录每个步骤结束时的结合反应。比较了mAb-2与预复合了mAb-1的hLEPR-MMH结合的反应进行比较，并且确定了不同抗LEPR单克隆抗体的竞争/非竞争行为，如表14和表15所示。
表14:抗LEPR单克隆抗体之间的交叉竞争
表15:抗LEPR单克隆抗体之间的交叉竞争
实施例10：LEPR激动剂抗体H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2和H4H17321P2在可诱导的瘦素缺乏陷小鼠模型中的体内功效。
在基因工程化的LEPRHu/Hu小鼠的可诱导的瘦素缺乏模型中，测定本发明的四种具体的激动剂抗LEPR抗体H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2和H4H17321P2对食物摄入量、体重和肥胖症的影响，所述LEPRHu/Hu小鼠表达由人LEPR胞外域序列而非鼠LEPR胞外域序列组成的瘦素受体。瘦素缺乏模型由编码hFc标记的小鼠LEPR胞外域(本文称为mLEPR.hFc或“瘦素陷阱”；SEQ ID NO:120)的质粒的流体动力学DNA递送(HDD)诱导。瘦素陷阱在表达时分泌并结合循环瘦素。在50μg编码瘦素陷阱的DNA构建物的HDD后，小鼠表现出增加的食物摄取以及增加的肥胖和体重。
在施用瘦素陷阱前7天和4天之间测量基线每日食物摄入量(第-7天和第-4天)。在第0天，35只13至17周龄的雄性LEPRHu/Hu小鼠成功进行瘦素陷阱的HDD。在HDD后的第6天和第13天，收集眶后出血，并且通过μCT定量包括体脂肪率的身体组成。在HDD后第7天，基于从第0天以来的体重变化百分比将小鼠随机分为5组，每组7只小鼠。每组经由皮下注射接受单剂量3mg/kg的同种型对照抗体、3mg/kg的H4H16650P2、3mg/kg的H4H16679P2、3mg/kg的H4H17319P2或3mg/kg的H4H17321。同种型对照抗体不与任何已知的小鼠蛋白结合。在研究期间测量每只动物的食物摄入量和体重。图3总结了每个治疗组的平均每日食物摄入量。在图3中，虚线表示HDD注射前的平均基线食物摄入量。在每个时间点计算每只动物从第0天以来的体重变化百分比。图4总结了每个抗体治疗组中动物的平均体重变化百分比。图5总结了每个抗体治疗组中动物的平均脂肪量，其在抗体治疗前1天和抗体治疗6天后通过μCT定量。所有结果均表示为平均值±SEM。
如图3和4所示，在瘦素陷阱HDD后，各组小鼠组之中在抗体处理之前观察到相似的食物摄入量增加和体重变化百分比。如图3中所示，与用同种型对照抗体注射的小鼠相比，用3mg/kg的抗体H4H16650P2或H4H16679P2处理的小鼠从抗体治疗一天后(HDD后第8天)开始，以及在随后测量的时间点，显示出食物摄入量的显著降低。与用同种型对照抗体注射的小鼠相比，用3mg/kg的抗体H4H17319P2或H4H17321P2处理的小鼠在抗体治疗两天后(HDD后第9天)和在其他随后测量的时间点，显示出食物摄入量的显著降低。如图4所示，与用同种型对照抗体注射的小鼠相比，用3mg/kg的抗体H4H16650P2处理的小鼠在抗体治疗一天后(HDD后第8天)和在其他随后测量的时间点，显示出体重变化百分比的显著降低。在抗体处理一天后，在第8天，用同种型对照处理的小鼠显示从第0天以来21.16±1.27％的体重增加，而用H4H16650P2处理的小鼠具有从第0天以来15.57±0.9％的体重增加。与用同种型对照抗体注射的小鼠相比，用3mg/kg的抗体H4H16679P2、H4H17319P2或H4H17321P2处理的小鼠在抗体治疗两天后(HDD后第9天)和在其他随后测量的时间点，显示体重变化百分比的显著降低。在第9天，对于用同种型对照、H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2或H4H17321P2处理的小鼠，从第0天以来体重变化的百分比分别为23.18±1.22、13.17±1.05、12.95±1.26、15.98±1.78和15.83±2.01。如图5所示，与抗体治疗前1天(HDD后第6天)相比，用3mg/kg的同种型对照抗体处理的小鼠在用抗体处理6天后(HDD后第13天)显示脂肪量的显著增加。与抗体处理前相比，用3mg/kg的抗体H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2或H4H17321P2处理的小鼠在抗体处理后没有获得脂肪量。治疗6天后(HDD后第13天)，与用3mg/kg的同种型对照抗体处理的小鼠相比，用3mg/kg的抗体H4H16650P2、H4H16679P2或H4H17319P2处理的小鼠表现出脂肪量的显著降低。
实施例11：通过氢氘交换对H4H16650P2与人瘦素受体(hLEPR.mmh)的结合表位作图。
进行实验以确定与H4H16650P2相互作用的hLEPR.mmh(SEQ ID NO:114的氨基酸M1-D839)的氨基酸残基。为此目的，用质谱进行H/D交换表位作图。对H/D交换方法的一般性描述示于例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；和Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
实验程序。HDX-MS实验在集成式Waters HDX/MS平台上进行，该平台由以下组成：用于氘标记的Leaptec HDX PAL系统，用于样品消化和上样的Waters Acquity M-Class(辅助溶剂管理器)，用于分析柱梯度的Waters Acquity M-Class(μBinary溶剂管理器)和用于消化肽质量测定的Synapt G2-Si质谱仪。
在pD 7.0(相当于pH 6.6)的10mM PBS的D2O缓冲液中制备标记溶液。为了进行氘标记，将3.8μL的以2:1摩尔比与抗体预混合的hLEPR.mmh(8pmol/μL)或hLEPR.mmh与56.2μL的D2O标记溶液孵育，持续不同的时间点(例如，未氘化的对照＝0秒，标记1分钟和20分钟)。通过将50μL样品转移至50μL预先冷却的淬灭缓冲液(0.2M TCEP、6M氯化胍溶于100mM磷酸盐缓冲液，pH2.5)中，并将混合的样品在1.0℃下孵育2分钟来淬灭氘化。然后将淬灭的样品注射到Waters HDX管理器中，进行在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化。消化的肽在0℃下被捕集到ACQUITY UPLC BEH C18 1.7-μm，2.1×5mm的VanGuard预柱上，并洗脱至分析柱ACQUITY UPLC BEH C18 1.7-μm，1.0×50mm，进行9分钟5％-40％B的梯度分离(流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液)。质谱仪设置为锥电压37V，扫描时间0.5秒，质荷比范围50-1700Th。
为了识别来自人LEPR的肽，经由Waters ProteinLynx Global Server(PLGS)软件，对来自未氘化样品的LC-MSE数据进行处理，并且在包括人LEPR、胃蛋白酶及其随机化序列的数据库中搜索所述数据。将鉴定的肽输入到DynamX软件，并通过以下两个标准进行过滤：1)每个氨基酸的最小产物：0.2，和2)复制文件阈值：3。随后DynamX软件基于多个时间点的驻留时间和高质量准确度(<10ppm)自动确定每种肽的氘摄入量，每次重复3次。
结果。使用与MSE数据采集联网的在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII柱，在不存在或存在抗体的情况下，可重复地识别了总共201个来自人LEPR的肽，代表70％序列覆盖率。如表16中所示，与H4H16650P2结合时，五种肽具有显著降低的氘化摄取(质心δ值>0.4道尔顿，p值<0.05)。记录的肽质量对应于来自三次重复的质心MH+质量的平均值。这些对应于氨基酸162-169(人LEPR的氨基酸LYVLPEVL；SEQ ID NO:113)和氨基酸170-181(人LEPR的氨基酸EDSPLVPQKGSF；SEQ ID NO:113)的肽在与H4H16650P2结合时具有较慢的氘化速率。这些识别的残基也对应于如由Uniprot登录号P48357限定的人LEPR(SEQ ID NO.113；人瘦素受体)的残基酸162-169和170-181。
表16:在与抗体H4H16650P2结合时有显著保护的人瘦素受体肽
实施例12：LEPR增效剂抗体在人源化LEPR小鼠中的体内效力测试。
在单独饲养的基因工程的LEPRHu/Hu小鼠中，测定本发明的三种具体的增效剂抗LEPR抗体H4H18482P2、H4H18487P2和H4H18492P2对体重和肥胖症的影响，所述LEPRHu/Hu小鼠表达由人LEPR胞外域序列而非鼠LEPR胞外域序列组成的瘦素受体(mLEPR.hFc，SEQ ID NO:120)。
在第-19天通过μCT对包括体脂肪率的身体组成进行定量。在第0天，基于体重将48只14至16周龄的雌性LEPRHu/Hu小鼠随机分为4组，每组12只小鼠。在第0天和第11天，每组的小鼠经由皮下注射接受单剂量30mg/kg的同种型对照抗体、30mg/kg的H4H18482P2、30mg/kg的H4H18487P2或30mg/kg的H4H18492P2。同种型对照抗体不与任何已知的小鼠蛋白结合。在研究期间测量每只动物的体重。在每个时间点计算每只动物从第0天以来的体重变化百分比。图6总结了每个治疗组中动物的平均体重百分比变化。图6总结了每个抗体治疗组中动物的平均脂肪量，其在抗体治疗前19天和抗体治疗11天后通过μCT定量。所有结果均表示为平均值±SEM。
如图6所示，在用LEPR增效剂抗体而不是同种型对照抗体给药后，观察到体重变化百分比的降低。如图6中所示，与用同种型对照抗体注射的小鼠相比，用30mg/kg的H4H18482P2处理的小鼠从治疗两天后(第2天)以来，以及在其他时间点，显示出体重变化百分比的显著降低。与用同种型对照抗体注射的小鼠相比，用30mg/kg的H4H18487P2处理的小鼠从第2天以来，以及在其他时间点，显示出体重变化百分比的显著降低。与用同种型对照抗体注射的小鼠相比，用30mg/kg的H4H18492P2处理的小鼠在第4、14和17天而非其他时间点显示出体重变化百分比的显著降低。与用同种型对照抗体注射的小鼠相比，用30mg/kg的H4H18482P2处理的小鼠从第6天以及，以及随后几天，但非第7、14和17天，显示出体重变化百分比的显著降低。与用H4H18492P2注射的小鼠相比，用30mg/kg的H4H18487P2处理的小鼠从第3天以来，以及在其他时间点，但非第4和5天，显示体重变化百分比的显著降低。
如图7A所示，治疗前(第-19天)各组之间的脂肪量没有差异。如图7中所示，与同种型对照抗体相比，用30mg/kg的抗体H4H18482和H4H18487，而非H4H18492处理的小鼠在治疗17天后(第12天)显示脂肪量统计学上的显著降低。
本发明的范围不受本文中所述的具体实施方式的限制。实际上，根据前述描述以及附图，除本所描述的之外，对本发明的多种修改对于本领域技术人员而言将变得明显。这样的修改旨在落入所附权利要求书的范围内。
实施例13：本发明的抗LEPR抗体对猴LEPR信号传导的影响
为了评估猴瘦素受体的转录激活，开发了稳定的细胞系。生成IMR-32细胞(人神经母细胞瘤ATCC)以稳定地表达与人LEPR(hLEPR；登录号为NP_002294.2的氨基酸840至1165)的跨膜和胞质域融合的食蟹猕猴LEPR(MfLEPR；登录号为XP_005543194.1的氨基酸22至837，其中827位的苏氨酸变为丙氨酸)的胞外结构域，以及萤光素酶报告基因(STAT3-Luc；SABiosciences，#CLS-6028L)。将所得的细胞系(下文中称为IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR)分离并在补充了10％FBS、NEAA、1ug/mL嘌呤霉素、100ug/mL潮霉素B和青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的MEM-Earl培养基中维持。
进行生物测定，以测量本发明的抗LEPR抗体在不存在瘦素的情况下对猴LEPR信号传导的影响。将IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR细胞在具有青霉素/链霉素(测定缓冲液)的0.1％FBS Optimem中，以10,000细胞/孔铺板于96孔板中，并在37℃下，在5％CO2中孵育过夜，以用于生物测定。第二天，在测定缓冲液中，将人瘦素(hLeptin)、抗LEPR抗体或同种型对照抗体从50nM连续稀释至0.8pM，(再加上一个仅含缓冲而不含受试分子的癌)加至细胞。在37℃下，5％CO2中5.5小时后，用OneGloTM试剂(Promega，#E6031)和VictorTMX多标记读板仪(Perkin Elmer)测量萤光素酶活性。用PrismTM6软件(GraphPad)，使用非线性回归(4-参数算法)分析结果以得到EC50值。抗体的激活百分比计算为抗体实现的最大RLU范围相对于由hLeptin实现的最大RLU范围。
如表17中所示，在不存在瘦素的情况下，所有受试抗LEPR抗体以范围为266pM至368pM的EC50值，在IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR细胞中显示对猴LEPR信号传导的激活，且最大激活范围为76％到82％，其中hLeptin获得100％激活。hleptin以333pM的EC50值被激活。同种型对照抗体未显示对IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR细胞的任何可测得的刺激。
表17:抗LEPR抗体对食蟹猴LEPR的激活
瘦素或抗体 EC50(M) ％激活
人瘦素 3.33E-11 100
H4H16650P2 2.66E-10 82
H4H16679P2 2.49E-10 80
表17:抗LEPR抗体对食蟹猴LEPR的激活
瘦素或抗体 EC50(M) ％激活
H4H17319P2 3.65E-10 76
H4H17321P2 3.68E-10 78
同种型抗体 无激活 无激活
实施例14：使用Luminex MFI信号确定人LEPR的全长胞外结构域的结合表位
为了确定本发明的抗LEPR抗体结合的人LEPR的表位，使用基于Luminex FLEXMAP(FM3DD，LuminexCorp)流式细胞术的分析来表征抗LEPR抗体与重组人LEPR蛋白结构域的相互作用。将约3百万个羧化MicroplexR微球体(Luminex，目录号LC1000A)洗涤、涡旋并在0.1M NaPO4，pH 6.2(活化缓冲液)中超声处理，然后离心以除去上清液，以用于该测定。将微球重悬于120μL活化缓冲液中，通过在25℃下加入15μL的50mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，Thermo Scientific，目录号24500)，然后加入15μL的50mg/mL1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺(EDC，ThermoScientific，目录号22980)，来活化羧酸酯基团(-COOH)。10分钟后，加入600μL的50mM MES，pH 5(偶联缓冲液)将反应的pH降至5.0，将微球涡旋并且离心，除去上清液。立即将活化的微珠与500μL20μg/mL的小鼠IgG或人IgG的单克隆抗myc抗体在偶联缓冲液中混合，并在25℃下孵育2小时。通过加入50μL的1M Tris-HCl，pH 8.0，来淬灭偶联反应，并将微球快速涡旋、离心并用1mL DPBS洗涤四次以除去未偶联的蛋白和其他反应组分。
将瞬时表达的LEPR蛋白，包括表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的人LEPR胞外域(人LEPR-MMH，SEQ ID NO:113)、表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的人LEPR CRH1(D1)(人LEPR CRH1(D1)-MMH，SEQ ID NO:113的氨基酸1-208，具有myc-myc-六聚组氨酸标签，氨基酸209-236)、表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的人LEPR CRH1(D1,D2)结构域(人LEPR CRH1(D1,D2)-MMH，SEQ ID NO:113的氨基酸1-318，具有myc-myc-六聚组氨酸标签，氨基酸319-346)、表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的人LEPR CRH1-Ig(D1,D2,D3)结构域(人LEPR CRH1(D1,D2,D3)-MMH，SEQ ID NO:113的氨基酸1-278，具有myc-myc-六聚组氨酸标签，氨基酸279-306)、表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的人LEPR CRH1-Ig(D2,D3)结构域(人LEPR CRH1-Ig
(D2,D3)-MMH，SEQ ID NO:113的氨基酸1-198，具有myc-myc-六聚组氨酸标签，氨基酸199-226)、表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的人LEPR Ig(D3)结构域(人LEPR Ig(D3)-MMH，SEQ iD NO:113的氨基酸1-88，具有myc-myc-六聚组氨酸标签，氨基酸89-116)、表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的人LEPR CRH2结构域(人LEPR CRH2-MMH，SEQ IDNO:113的氨基酸，具有myc-myc-六聚组氨酸标签，氨基酸208-235)、表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的人LEPR FNIII结构域(人LEPR FNIII-MMH，SEQ ID NO:113的氨基酸1-204，具有myc-myc-六聚组氨酸标签，氨基酸205-232)和表达有C末端myc-myc-六聚组氨酸标签的人LEPR Ig-CRH2-FNIII结构域(人LEPR Ig-CRH2-FNIII-MMH，SEQ ID NO:113的氨基酸1-510，具有myc-myc-六聚组氨酸标签，氨基酸511-538)，悬浮于无血清CHO-S-SFM II培养基(Thermo Fisher，目录号31033020)中，然后通过离心澄清。将如上述制备的固定有抗myc单克隆抗体的微球的等分试样分别加至1mL以上各蛋白的上清液。将微球轻轻混合，在25℃下孵育2小时，用1mL DBPS洗涤两次，离心除去上清液，最后重悬于1mL的DPBS缓冲液中。从与全长人LEPR和与各种人LEPR结构域蛋白的各反应中，取出48μL偶联了抗myc IgG的微球，并在3.6mL PBS+20mg/mL BSA+0.05％叠氮化钠(阻断缓冲液)中一起混合。
来自以上混合池的微球以75μL每孔铺板于96孔滤板(Millipore，目录号：MSBVN1250)上，并与25μL单个抗人LEPR单克隆抗体(0.5或5μg/mL)混合，在25℃下孵育2小时，然后用200μL含0.05％Tween 20的DPBS(洗涤缓冲液)洗涤两次。为了检测和定量与单个微球结合的抗LEPR抗体量的水平，添加100μL在阻断缓冲液中2.5μg/mL的R-藻红蛋白偶联的山羊F(ab')2抗人κ(Southern Biotech，目录号2063-09)，或者100μL在阻断缓冲液中1.25μg/mL的F(ab')2片段特异性的R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG(Jackson Immunoresearch，目录号：115-116-072)，并且在25℃下孵育30分钟。30分钟后，样品用200μL洗涤缓冲液洗涤两次并重悬于150μL洗涤缓冲液中。在Luminex分析仪中测量微球的中值荧光强度(MFI)。
表18:抗LEPR抗体与myc标签捕获的人LEPR全长胞外结构域及分离的人LEPR结构域结合的Luminex MFI信号
基于Luminex分析的结果列于表18中。Luminex MFI信号强度表明本发明的十二种抗LEPR抗体与完整的人LEPR胞外域结合。抗LEPR抗体H4H18417P2、H4H18438P2和H4H18492P2与人LEPR的CRH1D2结构域内的表位结合。抗LEPR抗体H4H18449P2、H4H16650P和H4H16679P与人LEPR的CRH1(D1-2)结构域内的表位结合。抗LEPR抗体比较mAB与人LEPR的CRH2结构域内的表位结合。抗LEPR抗体H4H18445P2与人LEPR的FNIII结构域内的表位结合。抗LEPR抗体H4H18446P2、H4H18482P2和H4H18487P2与人LEPR的Ig-CRH2-FNIII结构域内的表位结合。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
<120> 激活瘦素受体的抗原结合蛋白
<130> 10178WO01
<150> 62/240,021
<151> 2015-10-12
<150> 62/359,757
<151> 2016-07-08
<150> 62/375,495
<151> 2016-08-16
<150> 62/393,143
<151> 2016-09-12
<160> 120
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaagtc cctgagactc 60
tcctgtgtag cgtctggatt caccttcagt tccgatgcca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggaatg ggtggcagtt atttattatg atggaaatta tcaatactat 180
gaagactccg ttaagggtcg attcaccatc tccagagaca attcccagaa cacgctggat 240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgacgac acggctgtat atttctgtgc gcgtctcaac 300
tgggattact ggtatctcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asp
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Tyr Tyr Asp Gly Asn Tyr Gln Tyr Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asn Trp Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
ggattcacct tcagttccga tgcc 24
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asp Ala
1 5
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
atttattatg atggaaatta tcaa 24
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Ile Tyr Tyr Asp Gly Asn Tyr Gln
1 5
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
gcgcgtctca actgggatta ctggtatctc gatctc 36
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Ala Arg Leu Asn Trp Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 9
<211> 324
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
cagagcatta gcagctat 18
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
gctgcatcc 9
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Ala Ala Ser
1
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
caggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cgtctggatt caccttcagt agttatgcca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcagtt atatactatg atggaagtta taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatgg acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgc gagttataac 300
tggaactact ggtacttcga tttctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Tyr Asn Trp Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
ggattcacct tcagtagtta tgcc 24
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
atatactatg atggaagtta taaa 24
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys
1 5
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
gcgagttata actggaacta ctggtacttc gatttc 36
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Ala Ser Tyr Asn Trp Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 25
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaagc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt acatatgcca tgtactgggt ccgccagact 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggctgtt ttatactctg atggaagtaa taaatactat 180
atagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca cttccacgaa cactctgtat 240
ctgcaaatga gcagcctgcg agccgacgac tcggctctat attactgtgc gcgtctcaac 300
tgggattact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357
<210> 26
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ile Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asn Trp Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
ggattcacct tcagtacata tgcc 24
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
ttatactctg atggaagtaa taaa 24
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
gcgcgtctca actgggatta ctggtacttc gatctc 36
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Ala Arg Leu Asn Trp Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 33
<211> 357
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgaag cgtctggatt cagcagcagt gacaatgcca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcagtt atatatcatg atggaagtta taaatactat 180
gaagactccg tgaagggccg attcaccatc gccagagaca attccaagaa cacgctttat 240
ttgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtgc gaggtataac 300
tggaaccact ggtacttcga tgtctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Asp Asn
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr His Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asn Trp Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
ggattcagca gcagtgacaa tgcc 24
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Gly Phe Ser Ser Ser Asp Asn Ala
1 5
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
atatatcatg atggaagtta taaa 24
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Ile Tyr His Asp Gly Ser Tyr Lys
1 5
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
gcgaggtata actggaacca ctggtacttc gatgtc 36
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Ala Arg Tyr Asn Trp Asn His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 41
<211> 366
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcagtt atatcatatg acgaaagtaa taagtactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatt tctagagaca attccaagaa cgcgctgtat 240
ttacaaatga acagcctgag aaatgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcgg 300
ccttttggat tggttaccgg atggttcgac ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 42
<211> 122
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Tyr Asp Glu Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
ggattcacct tcagtaccta tggc 24
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly
1 5
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
atatcatatg acgaaagtaa taag 24
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Ile Ser Tyr Asp Glu Ser Asn Lys
1 5
<210> 47
<211> 45
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
gcgagagatc ggccttttgg attggttacc ggatggttcg acccc 45
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Ala Arg Asp Arg Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 49
<211> 360
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt cagtttcaat acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgacaatt atatggtatg atggaagtat taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attattgtgc gagaggtgga 300
tatagtggct acctctactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 50
<211> 120
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
ggattcagtt tcaataccta tggc 24
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Gly Phe Ser Phe Asn Thr Tyr Gly
1 5
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
atatggtatg atggaagtat taaa 24
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ile Lys
1 5
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
gcgagaggtg gatatagtgg ctacctctac tttgactac 39
<210> 56
<211> 13
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
Ala Arg Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 372
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agcggtggtg actactggag ctggatccgc 120
cagctcccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcgcctac 180
tataatccgt ccctcaagag tcgaggtacc atatcaatag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgacctctgt gactgccgcg gacacggccg tatatttctg tgtgaaatta 300
cgatttttgg agtggttctt ggggggctgg ttcggcccct ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 58
<211> 124
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Gly Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Val Lys Leu Arg Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gly Gly Trp Phe Gly
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
ggtggctcca tcagcagcgg tggtgactac 30
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
atctattaca gtgggagcgc c 21
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 62
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala
1 5
<210> 63
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 63
gtgaaattac gatttttgga gtggttcttg gggggctggt tcggcccc 48
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 64
Val Lys Leu Arg Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gly Gly Trp Phe Gly Pro
1 5 10 15
<210> 65
<211> 351
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 65
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aactatggca tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct attactggtg gtggtggtag cacatactac 180
tcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240
ctgcgaatga acagtgtgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatataag 300
tggaacttcg tggacgactg gggccaggga accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 66
<211> 117
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Ser Val Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Lys Trp Asn Phe Val Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 67
ggattcacct ttagcaacta tggc 24
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 69
attactggtg gtggtggtag caca 24
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
gcgaaatata agtggaactt cgtggacgac 30
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Ala Lys Tyr Lys Trp Asn Phe Val Asp Asp
1 5 10
<210> 73
<211> 360
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgttg cctctggatt caccttcaat aaatacgaca tgcactgggt ccgccaaact 120
actggaaaag gtctagagtg ggtctcaggt attgatactg atggtgacac atactatcca 180
ggctccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccgagaactc cctgtatctt 240
caaatgaacg gcctgagagt cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag atggccttgg 300
agtggtttct atggtgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360
<210> 74
<211> 120
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Thr Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Thr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Gly Leu Arg Val Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Pro Trp Ser Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
ggattcacct tcaataaata cgac 24
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Asp
1 5
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
attgatactg atggtgacac a 21
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
Ile Asp Thr Asp Gly Asp Thr
1 5
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
gcaagatggc cttggagtgg tttctatggt gcttttgata tc 42
<210> 80
<211> 14
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Ala Arg Trp Pro Trp Ser Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 81
<211> 366
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtaatt actactggaa ctggatccgc 120
caacagccag gagagggcct ggagtggatt gcttacatct atcacaatgg ggtcaccaac 180
ttcaatccgt ccctcaagag tcgacttact atatcagtag acacgtctaa gactcagttc 240
tccctgaagt tgaggtctgt gactgccgcg gacacggccg tttattactg tgcgagatca 300
ggcagctggt tcgagaactg gtacttcgat ctctggggcc gtggcaccct ggtcactgtc 360
tcctca 366
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Gln Pro Gly Glu Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala Tyr Ile Tyr His Asn Gly Val Thr Asn Phe Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Ser Trp Phe Glu Asn Trp Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
ggtggctcca tcagcagtgg taattactac 30
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asn Tyr Tyr
1 5 10
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
atctatcaca atggggtcac c 21
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
Ile Tyr His Asn Gly Val Thr
1 5
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
gcgagatcag gcagctggtt cgagaactgg tacttcgatc tc 42
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 88
Ala Arg Ser Gly Ser Trp Phe Glu Asn Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 89
<211> 324
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 89
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 90
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 90
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 91
cagagtgtta gcagcagcta c 21
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 92
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
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<211> 9
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 93
ggtgcatcc 9
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 94
Gly Ala Ser
1
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 95
cagcagtatg gtagctcacc ttggacg 27
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 96
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
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<211> 360
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt aattcctact ggagctggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattggatat gtctattccc gtgggaacac caagtacaac 180
ccctccctca cgagtcgagt caccatgtca tttgacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aaactgaggt ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagcagcagc 300
tggtacgagg actggtactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac tgtctcctca 360
<210> 98
<211> 120
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val Tyr Ser Arg Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Thr
50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Phe Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Ser Ser Trp Tyr Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 99
ggtggctcca tcagtaattc ctac 24
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 100
Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser Tyr
1 5
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 101
gtctattccc gtgggaacac c 21
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 102
Val Tyr Ser Arg Gly Asn Thr
1 5
<210> 103
<211> 42
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 103
gcgagaagca gcagctggta cgaggactgg tacttcgatc tc 42
<210> 104
<211> 14
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
Ala Arg Ser Ser Ser Trp Tyr Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 105
<211> 354
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 105
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcaggg ctgtttaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgatg tctatggtgg gtccttcaga ggttattatt ggagttggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcagttata gtggtttcac caattacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt catcatatca atagatacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagatgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtttatt actgtgcgag agttacctat 300
ggttatggga cctttgatta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 106
<211> 118
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 106
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Phe Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Asp Val Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Ser Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ile Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Thr Tyr Gly Tyr Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 107
ggtgggtcct tcagaggtta ttat 24
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 108
Gly Gly Ser Phe Arg Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 109
atcagttata gtggtttcac c 21
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 110
Ile Ser Tyr Ser Gly Phe Thr
1 5
<210> 111
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 111
gcgagagtta cctatggtta tgggaccttt gattat 36
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成的
<400> 112
Ala Arg Val Thr Tyr Gly Tyr Gly Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 113
<211> 1165
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hLEPR 登录号 P48357
<400> 113
Met Ile Cys Gln Lys Phe Cys Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Ile
1 5 10 15
Tyr Val Ile Thr Ala Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg
20 25 30
Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr Asp Tyr Phe Leu
35 40 45
Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser Asn Gly His Tyr
50 55 60
Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly Thr His Phe Ser
65 70 75 80
Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe His Cys Cys Phe Arg Ser Glu Gln Asp
85 90 95
Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly Lys Thr Phe Val
100 105 110
Ser Thr Val Asn Ser Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp Ala Asn Trp Asn
115 120 125
Ile Gln Cys Trp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe Ile Cys Tyr Val
130 135 140
Glu Ser Leu Phe Lys Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn Tyr Lys Val His
145 150 155 160
Leu Leu Tyr Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser Pro Leu Val Pro
165 170 175
Gln Lys Gly Ser Phe Gln Met Val His Cys Asn Cys Ser Val His Glu
180 185 190
Cys Cys Glu Cys Leu Val Pro Val Pro Thr Ala Lys Leu Asn Asp Thr
195 200 205
Leu Leu Met Cys Leu Lys Ile Thr Ser Gly Gly Val Ile Phe Gln Ser
210 215 220
Pro Leu Met Ser Val Gln Pro Ile Asn Met Val Lys Pro Asp Pro Pro
225 230 235 240
Leu Gly Leu His Met Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser
245 250 255
Trp Ser Ser Pro Pro Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys
260 265 270
Tyr Ser Glu Asn Ser Thr Thr Val Ile Arg Glu Ala Asp Lys Ile Val
275 280 285
Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Ile Leu Pro Gly Ser Ser Tyr
290 295 300
Glu Val Gln Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro Gly Ile Trp Ser
305 310 315 320
Asp Trp Ser Thr Pro Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Ile Tyr Phe
325 330 335
Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Val Ser Phe His Cys
340 345 350
Ile Tyr Lys Lys Glu Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys Glu Ile Val Trp
355 360 365
Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln Tyr Asp Val Val
370 375 380
Ser Asp His Val Ser Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu Asn Glu Thr Lys
385 390 395 400
Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu His
405 410 415
Glu Cys His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile
420 425 430
Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg
435 440 445
Trp Ser Thr Ser Thr Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser Thr Leu Gln Leu
450 455 460
Arg Tyr His Arg Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile Pro Ser Ile His
465 470 475 480
Pro Ile Ser Glu Pro Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser Asp Gly Phe Tyr
485 490 495
Glu Cys Ile Phe Gln Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp
500 505 510
Ile Arg Ile Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys
515 520 525
Val Leu Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Ser Val Lys
530 535 540
Ala Glu Ile Thr Ile Asn Ile Gly Leu Leu Lys Ile Ser Trp Glu Lys
545 550 555 560
Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu
565 570 575
Ser Gly Lys Glu Val Gln Trp Lys Met Tyr Glu Val Tyr Asp Ala Lys
580 585 590
Ser Lys Ser Val Ser Leu Pro Val Pro Asp Leu Cys Ala Val Tyr Ala
595 600 605
Val Gln Val Arg Cys Lys Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn
610 615 620
Trp Ser Asn Pro Ala Tyr Thr Val Val Met Asp Ile Lys Val Pro Met
625 630 635 640
Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg Ile Ile Asn Gly Asp Thr Met Lys Lys
645 650 655
Glu Lys Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser
660 665 670
Leu Cys Ser Val Gln Arg Tyr Val Ile Asn His His Thr Ser Cys Asn
675 680 685
Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn His Thr Lys Phe Thr Phe Leu
690 695 700
Trp Thr Glu Gln Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile
705 710 715 720
Gly Ala Ser Val Ala Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser
725 730 735
Lys Val Asn Ile Val Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Asn Ser Ser
740 745 750
Cys Val Ile Val Ser Trp Ile Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Lys Leu Met
755 760 765
Tyr Phe Ile Ile Glu Trp Lys Asn Leu Asn Glu Asp Gly Glu Ile Lys
770 775 780
Trp Leu Arg Ile Ser Ser Ser Val Lys Lys Tyr Tyr Ile His Asp His
785 790 795 800
Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Ile Phe Met
805 810 815
Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys Ile Ile Asn Ser Phe Thr Gln Asp Asp
820 825 830
Ile Glu Lys His Gln Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Val Ile Val Pro Val
835 840 845
Ile Ile Ser Ser Ser Ile Leu Leu Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser His
850 855 860
Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu Asp Val Pro Asn Pro Lys Asn
865 870 875 880
Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Pro Glu Thr Phe Glu
885 890 895
His Leu Phe Ile Lys His Thr Ala Ser Val Thr Cys Gly Pro Leu Leu
900 905 910
Leu Glu Pro Glu Thr Ile Ser Glu Asp Ile Ser Val Asp Thr Ser Trp
915 920 925
Lys Asn Lys Asp Glu Met Met Pro Thr Thr Val Val Ser Leu Leu Ser
930 935 940
Thr Thr Asp Leu Glu Lys Gly Ser Val Cys Ile Ser Asp Gln Phe Asn
945 950 955 960
Ser Val Asn Phe Ser Glu Ala Glu Gly Thr Glu Val Thr Tyr Glu Asp
965 970 975
Glu Ser Gln Arg Gln Pro Phe Val Lys Tyr Ala Thr Leu Ile Ser Asn
980 985 990
Ser Lys Pro Ser Glu Thr Gly Glu Glu Gln Gly Leu Ile Asn Ser Ser
995 1000 1005
Val Thr Lys Cys Phe Ser Ser Lys Asn Ser Pro Leu Lys Asp Ser Phe
1010 1015 1020
Ser Asn Ser Ser Trp Glu Ile Glu Ala Gln Ala Phe Phe Ile Leu Ser
1025 1030 1035 1040
Asp Gln His Pro Asn Ile Ile Ser Pro His Leu Thr Phe Ser Glu Gly
1045 1050 1055
Leu Asp Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Asn Phe Pro Glu Glu Asn Asn
1060 1065 1070
Asp Lys Lys Ser Ile Tyr Tyr Leu Gly Val Thr Ser Ile Lys Lys Arg
1075 1080 1085
Glu Ser Gly Val Leu Leu Thr Asp Lys Ser Arg Val Ser Cys Pro Phe
1090 1095 1100
Pro Ala Pro Cys Leu Phe Thr Asp Ile Arg Val Leu Gln Asp Ser Cys
1105 1110 1115 1120
Ser His Phe Val Glu Asn Asn Ile Asn Leu Gly Thr Ser Ser Lys Lys
1125 1130 1135
Thr Phe Ala Ser Tyr Met Pro Gln Phe Gln Thr Cys Ser Thr Gln Thr
1140 1145 1150
His Lys Ile Met Glu Asn Lys Met Cys Asp Leu Thr Val
1155 1160 1165
<210> 114
<211> 846
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hLEPR.mmh
aa 1-818：P48357的F22-D839
aa 819-846：myc-myc-组氨酸标签
<400> 114
Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg Phe Lys Leu Ser Cys
1 5 10 15
Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr Asp Tyr Phe Leu Leu Pro Ala Gly Leu
20 25 30
Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser Asn Gly His Tyr Glu Thr Ala Val Glu
35 40 45
Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly Thr His Phe Ser Asn Leu Ser Lys Thr
50 55 60
Thr Phe His Cys Cys Phe Arg Ser Glu Gln Asp Arg Asn Cys Ser Leu
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35 40 45
Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Val Pro Glu Leu Ser Lys Thr
50 55 60
Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly Gln Asn Cys Ser Ala
65 70 75 80
Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Val Val Lys Ala
85 90 95
Ser Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp Ile Glu Cys Trp Met
100 105 110
Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe Ile Cys His Met Glu Pro Leu Pro Lys
115 120 125
Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His Leu Leu Tyr Asp Leu
130 135 140
Pro Glu Val Ile Asp Asp Ser Pro Leu Pro Pro Leu Lys Asp Ser Phe
145 150 155 160
Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Leu Arg Gly Cys Glu Cys His Val
165 170 175
Pro Val Pro Arg Ala Lys Leu Asn Tyr Ala Leu Leu Met Tyr Leu Glu
180 185 190
Ile Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Leu Gln
195 200 205
Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met Glu
210 215 220
Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Asp Ser Gln Thr Met
225 230 235 240
Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Leu Glu Asn Ser Thr
245 250 255
Ile Val Arg Glu Ala Ala Glu Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val
260 265 270
Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Ser Lys
275 280 285
Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp Ser Ser Pro Gln Val
290 295 300
Phe Thr Thr Gln Asp Val Val Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser
305 310 315 320
Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Asn Glu Asn Gln
325 330 335
Ile Ile Ser Ser Lys Gln Ile Val Trp Trp Arg Asn Leu Ala Glu Lys
340 345 350
Ile Pro Glu Ile Gln Tyr Ser Ile Val Ser Asp Arg Val Ser Lys Val
355 360 365
Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr
370 375 380
Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys His His Arg Tyr Ala
385 390 395 400
Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp
405 410 415
Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Pro Ser Thr Ile Gln
420 425 430
Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr His Arg Arg Ser Leu
435 440 445
Tyr Cys Pro Asp Ser Pro Ser Ile His Pro Thr Ser Glu Pro Lys Asn
450 455 460
Cys Val Leu Gln Arg Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Val Phe Gln Pro Ile
465 470 475 480
Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His Ser Leu
485 490 495
Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val
500 505 510
Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu Ile Thr Val Asn Thr
515 520 525
Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn
530 535 540
Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Ile Gln Trp
545 550 555 560
Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys Ser Ala Ser Leu Leu
565 570 575
Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln Val Arg Cys Arg Arg
580 585 590
Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Ser Pro Ala Tyr Thr
595 600 605
Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg
610 615 620
Lys Met Asp Gly Asp Val Thr Lys Lys Glu Arg Asn Val Thr Leu Leu
625 630 635 640
Trp Lys Pro Leu Thr Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Arg Arg Tyr
645 650 655
Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val
660 665 670
Gly Asn Arg Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Thr Glu Pro Ala His Thr
675 680 685
Val Thr Val Leu Ala Val Asn Ser Leu Gly Ala Ser Leu Val Asn Phe
690 695 700
Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Ser Ala Val Glu Ser
705 710 715 720
Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val Ile Leu Ser Trp Thr
725 730 735
Leu Ser Pro Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu Val Ile Glu Trp Lys
740 745 750
Ile Leu Asn Glu Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu Arg Ile Pro Ser Asn
755 760 765
Val Lys Lys Phe Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr
770 775 780
Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys
785 790 795 800
Ile Ile Asn Gly Phe Thr Lys Asp Ala Ile Asp Lys Gln Gln Asn Asp
805 810 815
Ala Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln
820 825 830
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His
835 840 845
<210> 119
<211> 846
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> rLEPR.mmh
aa 1-818：大鼠LEPR（NP_036728.1的L22-G839）
aa 819-846: myc-myc-组氨酸标签
<400> 119
Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Thr Ser Pro Trp Arg Phe Lys Leu Phe Cys
1 5 10 15
Ala Pro Pro Ser Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu Ser Pro Ala Gly Val
20 25 30
Pro Asn Asn Thr Ser Ser Leu Lys Gly Ala Ser Glu Ala Leu Val Glu
35 40 45
Ala Lys Phe Asn Ser Thr Gly Ile Tyr Val Ser Glu Leu Ser Lys Thr
50 55 60
Ile Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly Gln Asn Cys Ser Ala
65 70 75 80
Leu Thr Gly Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Val Val Lys Pro
85 90 95
Leu Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp Ile Glu Cys Trp Met
100 105 110
Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe Ile Cys His Met Glu Pro Leu Leu Lys
115 120 125
Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His Leu Leu Tyr Asp Leu
130 135 140
Pro Glu Val Ile Asp Asp Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Asp Ser Phe
145 150 155 160
Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Val Arg Glu Cys Glu Cys His Val
165 170 175
Pro Val Pro Arg Ala Lys Val Asn Tyr Ala Leu Leu Met Tyr Leu Glu
180 185 190
Ile Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Leu Gln
195 200 205
Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu Arg Met Glu
210 215 220
Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Asp Ser Gln Thr Lys
225 230 235 240
Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Leu Glu Asn Ser Thr
245 250 255
Ile Val Arg Glu Ala Ala Glu Ile Val Ser Asp Thr Ser Leu Leu Val
260 265 270
Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Ser Lys
275 280 285
Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp Ser Leu Pro Gln Leu
290 295 300
Phe Thr Thr Gln Asp Val Met Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser
305 310 315 320
Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe Cys Cys Ile Tyr Lys Asn Glu Asn Gln
325 330 335
Thr Ile Ser Ser Lys Gln Ile Val Trp Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys
340 345 350
Ile Pro Glu Thr Gln Tyr Asn Thr Val Ser Asp His Ile Ser Lys Val
355 360 365
Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr
370 375 380
Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys His His Arg Tyr Ala
385 390 395 400
Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp
405 410 415
Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Pro Ser Thr Ile Gln
420 425 430
Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr His Arg Arg Ser Leu
435 440 445
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450 455 460
Cys Val Leu Gln Thr Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Val Phe Gln Pro Ile
465 470 475 480
Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His Ser Leu
485 490 495
Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val
500 505 510
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515 520 525
Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn
530 535 540
Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Asn Gly Lys Glu Ile Gln Trp
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Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys Ser Ala Ser Leu Pro
565 570 575
Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln Val Arg Cys Arg Arg
580 585 590
Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Ser Pro Ala Tyr Thr
595 600 605
Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg
610 615 620
Ile Met Asp Gly Asp Ile Thr Lys Lys Glu Arg Asn Val Thr Leu Leu
625 630 635 640
Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Arg Arg Tyr
645 650 655
Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val
660 665 670
Gly Asn Gln Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Ala Glu Ser Ala His Thr
675 680 685
Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile Gly Ala Ser Leu Val Asn Phe
690 695 700
Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Asn Ala Val Gln Ser
705 710 715 720
Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val Ile Leu Ser Trp Thr
725 730 735
Leu Ser Pro Asn Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu Val Ile Glu Trp Lys
740 745 750
Asn Leu Asn Asp Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu Arg Ile Pro Ser Asn
755 760 765
Val Asn Lys Tyr Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr
770 775 780
Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys
785 790 795 800
Ile Ile Asn Gly Phe Thr Lys Asp Asp Ile Ala Lys Gln Gln Asn Asp
805 810 815
Ala Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln
820 825 830
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His
835 840 845
<210> 120
<211> 1045
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> mLEPR.hFc
aa 1-818：小鼠LEPR（NP_666258.2的L22-G839）
aa 819-1045：人IgG1标签（P01857的D104-K330）
<400> 120
Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Trp Lys Phe Lys Leu Phe Cys
1 5 10 15
Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu Ser Pro Ala Gly Ala
20 25 30
Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser Glu Ala Ile Val Glu
35 40 45
Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Val Pro Glu Leu Ser Lys Thr
50 55 60
Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly Gln Asn Cys Ser Ala
65 70 75 80
Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Val Val Lys Ala
85 90 95
Ser Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp Ile Glu Cys Trp Met
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Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe Ile Cys His Met Glu Pro Leu Pro Lys
115 120 125
Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His Leu Leu Tyr Asp Leu
130 135 140
Pro Glu Val Ile Asp Asp Ser Pro Leu Pro Pro Leu Lys Asp Ser Phe
145 150 155 160
Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Leu Arg Gly Cys Glu Cys His Val
165 170 175
Pro Val Pro Arg Ala Lys Leu Asn Tyr Ala Leu Leu Met Tyr Leu Glu
180 185 190
Ile Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Leu Gln
195 200 205
Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met Glu
210 215 220
Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Asp Ser Gln Thr Met
225 230 235 240
Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Leu Glu Asn Ser Thr
245 250 255
Ile Val Arg Glu Ala Ala Glu Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val
260 265 270
Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Ser Lys
275 280 285
Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp Ser Ser Pro Gln Val
290 295 300
Phe Thr Thr Gln Asp Val Val Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser
305 310 315 320
Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Asn Glu Asn Gln
325 330 335
Ile Ile Ser Ser Lys Gln Ile Val Trp Trp Arg Asn Leu Ala Glu Lys
340 345 350
Ile Pro Glu Ile Gln Tyr Ser Ile Val Ser Asp Arg Val Ser Lys Val
355 360 365
Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr
370 375 380
Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys His His Arg Tyr Ala
385 390 395 400
Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp
405 410 415
Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Pro Ser Thr Ile Gln
420 425 430
Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr His Arg Arg Ser Leu
435 440 445
Tyr Cys Pro Asp Ser Pro Ser Ile His Pro Thr Ser Glu Pro Lys Asn
450 455 460
Cys Val Leu Gln Arg Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Val Phe Gln Pro Ile
465 470 475 480
Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His Ser Leu
485 490 495
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500 505 510
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Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Ile Gln Trp
545 550 555 560
Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys Ser Ala Ser Leu Leu
565 570 575
Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln Val Arg Cys Arg Arg
580 585 590
Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Ser Pro Ala Tyr Thr
595 600 605
Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg
610 615 620
Lys Met Asp Gly Asp Val Thr Lys Lys Glu Arg Asn Val Thr Leu Leu
625 630 635 640
Trp Lys Pro Leu Thr Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Arg Arg Tyr
645 650 655
Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val
660 665 670
Gly Asn Arg Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Thr Glu Pro Ala His Thr
675 680 685
Val Thr Val Leu Ala Val Asn Ser Leu Gly Ala Ser Leu Val Asn Phe
690 695 700
Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Ser Ala Val Glu Ser
705 710 715 720
Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val Ile Leu Ser Trp Thr
725 730 735
Leu Ser Pro Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu Val Ile Glu Trp Lys
740 745 750
Ile Leu Asn Glu Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu Arg Ile Pro Ser Asn
755 760 765
Val Lys Lys Phe Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr
770 775 780
Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys
785 790 795 800
Ile Ile Asn Gly Phe Thr Lys Asp Ala Ile Asp Lys Gln Gln Asn Asp
805 810 815
Ala Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
820 825 830
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
835 840 845
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
850 855 860
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
865 870 875 880
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
885 890 895
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900 905 910
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
915 920 925
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
930 935 940
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
945 950 955 960
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
965 970 975
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
980 985 990
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
995 1000 1005
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
1010 1015 1020
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
1025 1030 1035 1040
Leu Ser Pro Gly Lys
1045

Claims (24)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人瘦素受体(LEPR)并激活LEPR信号传导。
2.权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段显示出选自下组的一种或多种性质：
(i)在25℃下以小于约150nM的KD结合单体人LEPR，所述KD通过表面等离子体共振测得；
(ii)在25℃下以大于约1分钟的t1/2结合单体人LEPR，所述t1/2通过表面等离子体共振测得；
(iii)在25℃下以小于约5nM的KD结合二聚人LEPR，所述KD通过表面等离子体共振测得；
(iv)在25℃下以大于约15分钟的t1/2结合二聚人LEPR，所述t1/2通过表面等离子体共振测得；
(v)结合与人瘦素复合的人LEPR；
(vi)不阻断LEPR：瘦素相互作用；
(vii)在存在和不存在人瘦素的情况下结合细胞表面表达的LEPR；和
(viii)在基于细胞的报告基因测定中以小于约90pM的EC50激活LEPR信号传导。
3.权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在基于细胞的报告基因测定中与瘦素至少50％同等有效地激活LEPR信号传导。
4.权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在基于细胞的报告基因测定中与瘦素至少70％同等有效地激活LEPR信号传导。
5.一种结合人瘦素受体(LEPR)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)，其包含SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:74或SEQ ID NO:82的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(LCVR)的CDR，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
6.权利要求5所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链CDR，所述重链和轻链CDR具有选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ IDNO:2/10、18/10、26/10、34/10、42/10、50/10、58/66、74/66和82/66。
7.权利要求5或6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10、18/10、26/10、34/10、42/10、50/10、58/66、74/66和82/66。
8.权利要求7所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段激活LEPR信号传导。
9.权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参照抗体竞争结合LEPR，所述参照抗体包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10、18/10、26/10、34/10、42/10、50/10、58/66、74/66和82/66。
10.权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参照抗体结合至LEPR上的相同表位，所述参照抗体包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10、18/10、26/10、34/10、42/10、50/10、58/66、74/66和82/66。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的运载体或稀释剂。
12.一种用于治疗与瘦素缺乏或瘦素抵抗相关或者由其引起的疾病或病况的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求11所述的药物组合物。
13.权利要求12所述的方法，其中所述与瘦素缺乏或瘦素抵抗相关或者由其引起的疾病或病况选自下组：脂肪代谢障碍、肥胖症、代谢综合征、饮食诱导的食物渴求、功能性下丘脑闭经、1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抵抗、胰岛素受体突变引起的严重胰岛素抵抗、阿尔茨海默氏病、瘦素缺乏、瘦素抵抗、Leprechaunism/Donohue综合征和Rabson-Mendenhall综合征。
14.一种用于治疗患者中的脂肪代谢障碍病况的方法，所述方法包括向有需要的患者施用权利要求11所述的药物组合物，其中所述脂肪代谢障碍病况选自下组：先天性全身性脂肪代谢障碍，获得性全身性脂肪代谢障碍，家族性部分性脂肪代谢障碍，获得性部分脂肪代谢障碍，离心性腹部脂肪代谢障碍，环状脂肪萎缩，局部脂肪代谢障碍和HIV相关性脂肪代谢障碍。
15.一种用于治疗与信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变相关或者由其引起的疾病或病况的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求11所述的药物组合物。
16.权利要求15所述的方法，其中所述信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变是LEPR-A409E或LEPR-P316T。
17.权利要求15或16所述的方法，其中所述与信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变相关或者由其引起的疾病或病况是早发性肥胖症。
18.权利要求12至17中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用第二治疗剂，其中所述第二治疗剂选自下组：重组人瘦素、PCSK9抑制剂、他汀、依泽替米贝、胰岛素、胰岛素变体、胰岛素促分泌素、二甲双胍、磺酰脲、钠葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂、GLP-1激动剂/类似物、胰高血糖素(GCG)抑制剂、胰高血糖素受体(GCGR)抑制剂、促血管生成素样蛋白(ANGPTL)抑制剂、苯丁胺、奥利司他、托吡酯、安非他酮、托吡酯/苯丁胺、安非他酮/纳曲酮、安非他酮/唑尼沙胺、普兰林肽/美曲普汀、氯卡色林、西替利司他、特索芬辛和韦利贝特。
19.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人瘦素受体(LEPR)并使LEPR对抗原敏感。
20.权利要求19所述的结合人瘦素受体(LEPR)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)，所述HCVR包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:82的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(LCVR)的CDR，所述LCVR包含SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
21.权利要求20所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链CDR，所述重链和轻链CDR具有选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ IDNO:26/10、34/10、42/10、50/10、58/66、74/66和82/66。
22.一种与人LEPR特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与SEQ ID NO:113的氨基酸162-169以及SEQ ID NO:113的氨基酸170-181相互作用，如通过氢/氘交换所测定。
23.权利要求22所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段分别包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR2结构域，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR2结构域分别选自下组：SEQ ID NO:4、6和8以及SEQ ID NO:12、14和16。
24.权利要求22所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含由SEQ ID NO:2/10组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
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