ES2908574T3 - Proteínas de unión a antígeno que activan al receptor de leptina - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor de leptina (LEPR) humano y activa la señalización por el LEPR con un valor de CE50 de menos de 12,0 nM en un ensayo indicador basado en células que detecta la activación transcripcional de STAT3, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 4, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 6, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 8; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16; (ii) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 20, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 22, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 24; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16; (iii) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 28, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 30, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 32; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16; (iv) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 36, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 38, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 40; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16; (v) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 44, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 46, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 48; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16; (vi) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 52, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 54, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 56; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16; (vii) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 60, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 62, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 64; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16; (viii) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 68, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 70, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 72; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16; (ix) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 76, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 78, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 80; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16; (x) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 84, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 86, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 88; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 92, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 94, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 96; (xi) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 100, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 102, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 104; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 92, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 94, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 96; o (xii) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 108, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 110, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 112; y una región variable de cadena ligera que comprende: una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 92, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 94, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 96.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de unión a antígeno que activan al receptor de leptina
Campo técnico
La presente invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen al receptor de leptina humano (LEPR, forma siglada de leptin receptor), y a tales anticuerpos para su uso en métodos terapéuticos.
Antecedentes
La leptina es una hormona polipeptídica que se expresa predominantemente en el tejido adiposo y está implicada en la regulación del metabolismo, el balance energético y la ingesta de alimentos. La actividad de la leptina está mediada por la interacción con, y la señalización a través de, el receptor de leptina. El receptor de leptina, (también conocido como "LEPR", "WSX", "receptor de OB", "OB-R", y "CD295") es un receptor transmembrana de un solo cruce de la familia de receptores de citocinas de clase I con un dominio extracelular grande (818 aminoácidos). La deficiencia de leptina, la resistencia a la leptina y determinadas mutaciones de señalización alterada/señalización defectuosa de LEPR, están asociados con obesidad, diabetes de tipo 2, dislipidemia, lipodistrofias, esteatosis hepática, enfermedades del hígado graso alcohólico y no alcohólico, resistencia grave a la insulina, leprechaunismo/síndrome de Donohue, síndrome de Rabson-Mendenhall y complicaciones relacionadas. Los enfoques terapéuticos para abordar la resistencia a la leptina, la deficiencia de leptina y la hipoleptinemia (por ejemplo, la lipodistrofia) se han centrado principalmente en el suministro de leptina o de análogos de leptina complementarios a las personas afectadas. Dichos enfoques, sin embargo, generalmente han mostrado una eficacia limitada, particularmente en individuos resistentes a la leptina, y con frecuencia se asocian con efectos secundarios adversos. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de enfoques alternativos para tratar la resistencia a la leptina y otras afecciones asociadas con la deficiencia de leptina o la hipoleptinemia.
El documento US 6.977.240 divulga la identificación y caracterización de nucleótidos que codifican el receptor de OB. El documento US 6.977.240 también divulga nucleótidos del OB-R, sistemas de expresión en células hospedadoras, proteínas OB-R, proteínas de fusión, polipéptidos y péptidos, anticuerpos contra el receptor, animales transgénicos que expresan un transgén del OB-R o animales genosuprimidos recombinantes que no expresan el OB-R, antagonistas y agonistas del receptor, y otros compuestos que modulan la expresión del gen del OB-R o la actividad del OB-R que pueden utilizarse para el diagnóstico, el cribado de fármacos, el control de ensayos clínicos y/o el tratamiento de trastornos del peso corporal.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se define en las reivindicaciones que se unen al receptor de leptina humano (LEPR). Las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertas por las reivindicaciones adjuntas no se consideran parte de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos agonistas; es decir, la unión al LEPR de los anticuerpos anti-LEPR de la invención provoca, entre otros, activación de la señalización del receptor de leptina en las células. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención no compiten con la leptina por unirse al LEPR. Los anticuerpos de la presente invención son útiles, por ejemplo, para imitar, sustituir o complementar la actividad biológica normal de la leptina en un sujeto. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención son, por lo tanto, útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades y trastornos asociados con la resistencia a la leptina y la deficiencia de leptina.
Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv) y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).
Los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos de la presente invención se enumeran en las Tablas 1 y 2 en el presente documento. La Tabla 1 expone los identificadores de secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (las HCVR), las regiones variables de cadena ligera (las LCVR), las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos. La Tabla 2 expone los identificadores de secuencia de ácido nucleico de las HCVR, las LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos.
La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden una pareja de secuencias de aminoácidos de HCDR y LCDR (HCDR/LCDR) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR enumeradas en la Tabla 1 emparejada con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR enumeradas en la Tabla 1. De acuerdo con determinadas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una pareja de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR contenidas dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos enumerados en la Tabla 1. En determinadas realizaciones, la pareja de secuencias de aminoácidos de HCVR/ LCVR se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/10, 74/10 y 82/90.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden una pareja de secuencias de aminoácidos de una HCDR3 y una LCDR3 (HCDR3/LCDR3) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 emparejada con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1. De acuerdo con determinados aspectos, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una pareja de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 contenidas dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos enumerados en la Tabla 1. En determinados aspectos, la pareja de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8/16, 24/16, 32/16, 40/16, 48/16, 56/16, 64/72, 80/72 y 88/72.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos enumerados en la Tabla 1. En determinados aspectos, el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 12, 14, 16; 20, 22, 24, 12, 14, 16; 28, 30, 32, 12, 14, 16; 36, 38, 40, 12, 14, 16; 44, 46, 48, 12, 14, 16; 52, 54, 56, 12, 14, 16; 60, 62, 64, 68, 70, 72; 76, 78, 80, 68, 70, 72; y 84, 86, 88, 68, 70, 72.
En un aspecto relacionado, la presente divulgación proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de una pareja de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como se define por cualquiera de anticuerpos anti-LEPR ilustrativos enumerados en la Tabla 1. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al LEPR, que comprenden el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 contenidas dentro de una pareja de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/66, 74/66 y 82/66. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la técnica y pueden utilizarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas que se divulgan en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden utilizarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un término medio entre los enfoques de Kabat y de Chothia. Véanse, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Además, están disponibles bases de datos públicas para identificar las secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-LEPR o porciones de los mismos de la invención. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR1 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR2 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR3 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR1 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR2 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1; en determinados aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR3 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una HCVR, en donde la HCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, HCDR1, HCDR2, HCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2, HCDR3 es el como se define por cualquiera de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos enumerados en la Tabla 1.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una LCVR, en donde la LCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, LCDR1, LCDR2, LCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2, LCDR3 es el como se define por cualquiera de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos enumerados en la Tabla 1.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una HCVR como una LCVR, en donde la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1, y en donde la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1. En determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCVR enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma, y una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma. En la invención, la molécula de ácido nucleico codifica una HCVR y una LCVR, en donde la HCVR y la LCVR proceden ambas del mismo anticuerpo anti-LEPR enumerado en la Tabla 1.
La presente divulgación también proporciona vectores de expresión recombinante capaces de expresar un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-LEPR. Por ejemplo, la presente divulgación incluye vectores de expresión recombinante que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, es decir, moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de HCVR, LCVR y/o CDR como se expone en la Tabla 1. La presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido de la invención. La presente invención también proporciona células hospedadoras en las que se han introducido tales vectores. La divulgación proporciona métodos de producción de los anticuerpos o porciones de los mismos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permitan la producción de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, y la recuperación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos así producidos.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo de la invención que se une específicamente al LEPR y un transportador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención presenta una composición que es una combinación de un anticuerpo anti-LEPR de la invención y un segundo agente terapéutico. En una realización, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combina ventajosamente con un anticuerpo anti-LEPR.
En otro aspecto más, la descripción proporciona métodos terapéuticos para potenciar o estimular la señalización por el LEPR utilizando un anticuerpo anti-LEPR o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención. Los métodos terapéuticos de acuerdo con este aspecto comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención a un sujeto que lo necesite. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se mejora, alivia, inhibe o previene estimulando o activando la señalización por el LEPR, o imitando de otro modo la actividad natural de la leptina in vitro o en vivo. Las referencias a los métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de la presente memoria descriptiva deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa la unión del LEPR humano dimérico a leptina humana en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpos anti-LEPR de prueba o moléculas de control, medida por ELISA (absorbancia a 450 nm). Las Figuras 2A-2C ilustran el alcance de la señalización por el LEPR en células HEK293 que expresan LEPR de tipo silvestre (círculos), en un mutante de LEPR con señalización defectuosa (A409E, cuadrados) o en un mutante de LEPR con señalización alterada (P316T, triángulos). La señalización por el LEPR se expresa como la relación de pSTAT3-Y705 / STAT3, medida por densitometría a partir de transferencias de Western preparadas a partir de células tratadas con concentraciones crecientes de leptina (Figura 2A), H4H16650 (Figura 2B) o H4H16679 (Figura 2C).
La Figura 3 muestra la ingesta diaria promedio de alimentos de ratones con deficiencia de leptina a los que se les administró una dosis de un anticuerpo de control de isotipo a 3 mg/kg o un anticuerpo para LEPR seleccionado de H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 o H4H 17321 P2 a 3 mg/kg.
La Figura 4 muestra el cambio porcentual promedio del peso corporal de los ratones a los que se les administró una dosis de un anticuerpo de control de isotipo a 3 mg/kg o un anticuerpo para LEPr seleccionado de H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 o H4H17321 P2 a 3 mg/kg.
La Figura 5 muestra la masa grasa promedio para los animales en cada grupo de tratamiento con anticuerpo cuantificada mediante |jTC 1 día antes (barras no sombreadas) y 6 días después del tratamiento con anticuerpos (barras sombreadas) expresada como media ± ETM.
La Figura 6 muestra el cambio porcentual del peso corporal de ratones alimentados con 30 mg/kg de un anticuerpo seleccionado de H4H18482P2, H4H18487P2, H4H18492P2 o un control de isotipo.
Figuras 7A-7B. La Figura 7A muestra la masa grasa de los ratones antes de administrarles dosis de anticuerpos anti-LEPR H4H18482P2, H4H18487P2 o H4H18492P2. La Figura 7B muestra la masa grasa de los ratones tratados con 30 mg/kg de H4H18482P2, H4H18487P2 o H4H18492P2.
Figura 8. La Figura 8 muestra que los anticuerpos anti-LEPR probados activaron al LEPR de mono (Mf) en una línea celular IMR-32/STAT3-luc/MfLEPR.
Descripción detallada de la invención
Antes de describir la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales particulares descritos, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. Además, debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se utiliza en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
Aunque pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen los métodos y materiales preferidos.
Definiciones
La expresión "receptor de leptina", "LEPR", y similares, como se usa en el presente documento, se refieren al receptor de leptina humano, que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 113 (véase también UniProtKB/Swiss-Prot N.° de referencia P48357). Los nombres alternativos para el LEPR utilizados en la bibliografía científica incluyen "receptor de OB", "OB-R", y "CD295". El LEPR también se denomina "WSX" (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.524.937). La expresión "LEPR" incluye moléculas de LEPR tanto monoméricas como multiméricas (por ejemplo, diméricas). Como se usa en el presente documento, la expresión "LEPR humano monomérico" significa una proteína LEPR o una porción de la misma que no contiene ni posee dominios multimerizantes y que existe en condiciones normales como una sola molécula de LEPR sin una conexión física directa con otra molécula de LEPR. Una molécula de LEPR monomérica ilustrativas es la molécula denominada en el presente documento "hLEPR.mmh" que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 114 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 en el presente documento). Como se usa en el presente documento, la expresión "LEPR humano dimérico" significa una construcción que comprende dos moléculas de LEPR conectadas entre sí a través de un enlazador, un enlace covalente, un enlace no covalente, o a través de un dominio multimerizante tal como un dominio Fc de anticuerpo. Una molécula de LEPR dimérica ilustrativas es la molécula denominada en el presente documento "hLEPR.mFc" que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 115 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 en el presente documento), o la molécula denominada en el presente documento "hLEPR.hFc" que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 116. Como se usa en el presente documento, expresiones tales como "anticuerpo anti-LEPR", "anticuerpo que se une específicamente al LEPR", "proteína de unión específica al LEPR", y similares, a menos que se indique específicamente otra cosa, se refieren a moléculas que se unen al LEPR humano de longitud completa, al LEPR humano monomérico, al LEPR humano dimérico, u otras construcciones que comprenden o consisten en el dominio extracelular del LEPR.
Todas las referencias a proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteína en el presente documento pretenden referirse a la versión de la respectiva proteína, polipéptido o fragmento de proteína, a menos que se especifique explícitamente que procede de una especie no humana. Por tanto, la expresión "LEPR" significa "LEPR" humano a menos que se especifique que procede de una especie no humana, por ejemplo, "LEPR de ratón", "LEPR de mono", etc.
Como se usa en el presente documento, la expresión "LEPR expresado en superficie celular" significa una o más proteínas LEPR, o el dominio extracelular de las mismas, que se expresa/expresan en la superficie de una célula in vitro o en vivo, de modo que al menos una porción de una proteína LEPR se expone al lado extracelular de la membrana celular y es accesible a una porción de unión a antígeno de un anticuerpo. Un "LEPR expresado en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína LEPR expresada en la superficie de una célula que normalmente (por ejemplo, en el estado nativo o de tipo silvestre) expresa la proteína LEPR. Alternativamente, "LEPR expresado en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína LEPR expresada en la superficie de una célula que normalmente no expresa el LEPR humano en su superficie pero que ha sido diseñada técnicamente de forma artificial para expresar al LEPR en su superficie.
Como se usa en el presente documento, las expresiones tales como "anticuerpo anti-LEPR", o "anticuerpo que se une al receptor de leptina humano", incluyen tanto anticuerpos monovalentes con una única especificidad, como anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer brazo que se une al LEPR y un segundo brazo que se une a un segundo antígeno (diana), en donde el brazo anti-LEPR comprende cualquiera de las secuencias de HCVR/LCVR o de CDR como se expone en la Tabla 1 en el presente documento.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a o interacciona con un antígeno particular (por ejemplo, el LEPR). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o Vh) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (Cl1). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (las CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En distintas realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-LEPR (o porción de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de línea germinal humana, o pueden estar modificadas de forma natural o artificial. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usa en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, que pueda obtenerse enzimáticamente, sintético o técnicamente diseñado, que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas, utilizando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas recombinantes de ingeniería genética que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica los dominios variables y, opcionalmente, los constantes, de un anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o utilizando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o delecionar aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades mínimas de reconocimiento que consisten en los restos de aminoácido que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada tal como un péptido CDR3), o un péptido restringido FR3-CDR3-FR4. Otras moléculas técnicamente diseñadas, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de único dominio, anticuerpos de dominio delecionado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (los SMIP, forma siglada de small modular immunopharmaceuticals) y dominios variables de IgNAR (forma siglada de immunoglobulin new antigen receptor, nuevo receptor de antígeno de la inmunoglobulina) de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos, y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias de armazón. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado con un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Alternativamente, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
En determinados aspectos, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones ilustrativas no limitantes de dominios variables y constantes que se pueden encontrar dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-CH3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado un enlace flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Además, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios VH o VL monoméricos (por ejemplo, mediante un enlace (o enlaces) disulfuro).
Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables distintos, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo distinto en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos divulgados en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención utilizando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.
En determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos anti-LEPR de la invención son anticuerpos humanos. La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir restos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular en CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias de armazón humanas.
Los anticuerpos de la divulgación pueden, en algunas realizaciones, ser anticuerpos humanos recombinantes. La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresados, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora (descrito más adelante), anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante, combinatoria de anticuerpos humanos (descrito más adelante), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de, y están relacionadas con, secuencias de Vh y Vl de línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, Ch2 o Ch3 que pueden ser convenientes, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.
Los anticuerpos de la invención son anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o retirado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en que el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o de agentes químicos.
La presente divulgación incluye variantes de los anticuerpos anti-LEPR divulgados en el presente documento que comprenden una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones de armazón conservadas y/o CDR de los dominios variables de la cadena pesada y ligera en comparación con las correspondientes secuencias de línea germinal de las que proceden los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos que se divulgan en el presente documento con secuencias de línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones de armazón y/o CDR están mutados al resto (o restos) correspondiente de la secuencia de línea germinal de la que se obtuvo el anticuerpo, o al resto (o restos) correspondientes de otra secuencia de línea germinal humana, o a una sustitución de aminoácidos conservativa del resto (o restos) de línea germinal correspondientes (tales cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente como "mutaciones de línea germinal"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En determinados aspectos, todos los restos del armazón y/o la CDR dentro de los dominios Vh y/o Vl mutan de vuelta a los restos encontrados en la secuencia de línea germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros aspectos, únicamente determinados restos se mutan de vuelta a la secuencia de línea germinal original, por ejemplo, únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros aspectos, uno o más de los restos de armazón y/o la CDR se mutan al resto (o restos) correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta (es decir, una secuencia de línea germinal que es distinta de la secuencia de línea germinal de la que procede originalmente el anticuerpo). Adicionalmente, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco conservadas y/o las CDR, por ejemplo, en donde determinados restos individuales se mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de línea germinal original se mantienen o se mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden analizarse fácilmente en cuanto a una o más propiedades deseadas, tales como, especificidad de unión mejorada, afinidad de unión aumentada, propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según pueda ser el caso), inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están abarcados en la presente divulgación.
La presente divulgación incluye anticuerpos anti-LEPR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden secuencias de aminoácidos que son sustancialmente similares o sustancialmente idénticas a una o más secuencias de aminoácidos del dominio variable o de CDR que se encuentran en cualquiera de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos divulgados en el presente documento.
Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos el 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véanse, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanintirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparaginaglutamina. Alternativamente, una sustitución conservativa es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Una sustitución "moderadamente conservativa" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente utilizando un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares utilizando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit, que pueden utilizarse con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de distintas especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véanse, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse utilizando FASTA, utilizando los parámetros por defecto o los recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000), citado anteriormente). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de distintos organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, utilizando los parámetros por defecto. Véanse, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.
Anticuerpos anti-LEPR que comprenden variantes de Fc
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que potencian o disminuyen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-LEPR que comprenden una mutación en la región Ch2 o Ch3 del dominio Fc, en donde la mutación (o mutaciones) aumenta la afinidad del dominio Fc por el FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de tales modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/q /e /D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación en 428L, 259I (por ejemplo, V259I), y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (por ejemplo, H433K) y una en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254t y 256E); una modificación en 250q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).
Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-LEPR que comprenden un dominio Fc que comprende una o más parejas o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Se contemplan todas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anteriores y otras mutaciones dentro de los dominios variables de los anticuerpos divulgados en el presente documento.
Los anticuerpos anti-LEPR de la presente invención pueden comprender un dominio Fc modificado que tenga una función efectora reducida. Como se usa en el presente documento, un "dominio Fc modificado que tiene una función efectora reducida" significa cualquier porción Fc de una inmunoglobulina que se ha modificado, mutado, truncado, etc., con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre de origen natural, de manera que una molécula que comprende el Fc modificado presente una reducción de la gravedad o el alcance de al menos un efecto seleccionado del grupo que consiste en destrucción celular (por ejemplo, la ADCC y/o la CDC), activación del complemento, fagocitosis y opsonización, con respecto a una molécula de comparación que comprende la versión de tipo silvestre de origen natural de la porción Fc. En determinadas realizaciones, un "dominio Fc modificado que tiene una función efectora reducida" es un dominio Fc con unión reducida o atenuada a un receptor de Fc (por ejemplo, FcyR).
En determinadas realizaciones de la presente invención, el dominio Fc modificado es una variante del Fc de IgG1 o una variante del Fc de IgG4 que comprende una sustitución en la región bisagra. Por ejemplo, una Fc modificada para su uso en el contexto de la presente invención puede comprender una variante del Fc de IgG1 en donde al menos un aminoácido de la región bisagra del Fc de IgG1 se sustituye por el aminoácido correspondiente de la región bisagra del Fc de IgG2. Alternativamente, una Fc modificada para su uso en el contexto de la presente invención puede comprender una variante del Fc de IgG4 en donde al menos un aminoácido de la región bisagra del Fc de IgG4 se sustituye por el aminoácido correspondiente de la región bisagra del Fc de IgG2. En la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2014/0243504 se exponen regiones Fc modificadas ilustrativas no limitantes que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención.
Otros dominios Fc modificados y modificaciones de Fc que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención incluyen cualquiera de las modificaciones expuestas en los documentos US 2014/0171623; US 8,697,396; US 2014/0134162; WO 2014/043361. Los métodos para construir anticuerpos u otras proteínas de fusión de unión a antígeno que comprenden un dominio Fc modificado como se describe en el presente documento son conocidos en la técnica.
Características biológicas de los anticuerpos
La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se define en las reivindicaciones, que se unen al LEPR humano y activan la señalización por el LEPR. Dichos anticuerpos pueden denominarse en el presente documento "anticuerpos agonistas". En el contexto de la presente divulgación, "activación de la señalización por el LEPR" significa la estimulación de un efecto intracelular que normalmente es el resultado de la interacción de la leptina con el LEPR en células que expresan el LEPR. En la invención, "activación de la señalización por el LEPR" significa la activación transcripcional de STAT3, que se puede detectar utilizando cualquier método que pueda medir o identificar, directa o indirectamente, la actividad de STAT3, por ejemplo, utilizando una versión marcada de STAT3 expresada en una línea celular indicadora. Por ejemplo, los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno de la presente invención activan la señalización por el LEPR en un ensayo indicador basado en células, por ejemplo, utilizando el formato de ensayo basado en células como se define en el Ejemplo 7 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. Los ensayos de indicadores basados en células que detectan la activación por el LEPR, tal como el ensayo expuesto en el Ejemplo 7 en el presente documento, pueden producir una señal detectable que puede expresarse en términos de un valor de CE50 (es decir, la concentración de anticuerpo necesaria para producir una señalización semimáxima) y/o un porcentaje de la señalización máxima observada en presencia de leptina. En la presente invención, los anticuerpos anti-LEPR activan la señalización por el LEPR con un valor de CE50 de menos de 12,0 nM en un ensayo indicador basado en células, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 7 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar. En determinadas realizaciones ilustrativas de la presente invención, los anticuerpos anti-LEPR también activan la señalización por el LEPR con un porcentaje máximo de activación con respecto a la señalización por leptina de más del 65 % en un ensayo indicador basado en células, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 7 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar.
La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEPR humano monomérico con alta afinidad. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano monomérico (por ejemplo, hLEPR.mmh, SEQ ID NO: 114) con una Kd de menos de aproximadamente 150 nM medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano monomérico a 25 °C con una Kd de menos de aproximadamente 150 nM, menos de aproximadamente 140 nM, menos de aproximadamente 130 nM, menos de aproximadamente 120 nM, menos de aproximadamente 110 nM, menos de aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 90 nM, menos de aproximadamente 80 nM, menos de aproximadamente 70 nM, menos de aproximadamente 60 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 40 nM, menos de aproximadamente 30 nM, menos de aproximadamente 20 nM, menos de aproximadamente 10 nM, menos de aproximadamente 9 nM, menos de aproximadamente 8 nM, menos de aproximadamente 7 nM, menos de aproximadamente 6 nM, menos de aproximadamente 5 nM, menos de aproximadamente 4 nM, menos de aproximadamente 3 nM, menos de aproximadamente 2 nM, menos de aproximadamente 1 nM, menos de aproximadamente 900 pM, menos de aproximadamente 800 pM, menos de aproximadamente 700 pM, menos de aproximadamente 600 pM, menos de aproximadamente 500 pM, menos de aproximadamente 400 pM o menos de aproximadamente 300 pM, medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar.
La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEPr humano monomérico (por ejemplo, hLEPR.mmh, SEQ ID NO: 114) con una semivida disociativa (t1^ ) de más de aproximadamente 50 minutos medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano monomérico a 25 °C con una t1^ superior a aproximadamente 50 minutos, superior a aproximadamente 55 minutos, superior a aproximadamente 60 minutos, superior a aproximadamente 65 minutos o más, medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar.
La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEPr humano dimérico (por ejemplo, hLEPR.mFC, SEQ ID NO: 115) con alta afinidad. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano dimérico con una Kd de menos de aproximadamente 1,5 nM medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano dimérico a 25 °C con una Kd de menos de aproximadamente 150 nM, menos de aproximadamente 130 nM, menos de aproximadamente 110 nM, menos de aproximadamente 80 nM, menos de aproximadamente 70 nM, menos de aproximadamente 60 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 40 nM, menos de aproximadamente 30 nM, menos de aproximadamente 20 nM o menos de aproximadamente 10 nM, medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar.
La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEPR humano dimérico (por ejemplo, hLEPR.mFC, SEQ ID NO: 115) con una semivida disociativa (t1^ ) de más de aproximadamente 10 minutos medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano dimérico a 25 °C con una t1^ superior a aproximadamente 10, superior a aproximadamente 15 minutos, superior a aproximadamente 20 minutos, superior a aproximadamente 25 minutos, superior a aproximadamente 30 minutos, superior a aproximadamente 40 minutos, superior a aproximadamente 50 minutos, superior a aproximadamente 60 minutos, superior a aproximadamente 70 minutos o más, medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar.
La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEpR formando complejo con la leptina humana ("LEPR formando complejo con la leptina humana" también puede representarse mediante la expresión "leptina:LEPR"). Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son capaces de unirse a un complejo preformado que comprende hLEPR y leptina humana. Es decir, de acuerdo con determinadas realizaciones, la interacción entre los anticuerpos anti-LEPR y el LEPR no se inhibe por la presencia de leptina formando complejo con el LEPR; asimismo, la interacción entre la leptina y el LEPR, de acuerdo con este aspecto de la invención, no se inhibe por la presencia de un anticuerpo anti-LEPR. Un formato de ensayo ilustrativo para determinar si un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al LEPR formando complejo con la leptina humana se expone en el Ejemplo 4 en el presente documento.
De forma similar, la presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEPR y no bloquean la interacción LEPR:leptina. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son capaces de unirse a LEPR, produciendo de este modo un complejo de anticuerpo: LEPR, en donde el complejo resultante anticuerpo: LEPR es capaz de interactuar con la leptina para producir un complejo de tres miembros que comprende el anticuerpo, el LEPR y la leptina. Un formato de ensayo ilustrativo para determinar si un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse al LEPR de una manera que no bloquee o interfiera con la interacción entre el LEPR y la leptina se expone en el Ejemplo 5 en el presente documento.
La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEPr expresado en la superficie celular en presencia y/o ausencia de leptina humana. LEPR expresado en la superficie celular significa el LEPR o una porción del mismo (por ejemplo, una porción extracelular del LEPR) expresado en la superficie de una célula, ya sea de forma natural o en una línea celular técnicamente diseñada, de manera que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo sea capaz de unirse a la molécula de LEPR. En determinadas realizaciones, el LEPR expresado en la superficie celular incluye complejos recombinantes que comprenden un dominio extracelular del LEPR conectado a una célula a través de una etiqueta o anclaje (por ejemplo, un anclaje de GPI como se ilustra en el Ejemplo 6 en el presente documento). De acuerdo con este aspecto de la invención, se proporcionan anticuerpos que son capaces de unirse al LEPR expresado en la superficie celular en ausencia de leptina, y también son capaces de unirse al LEPR expresado en la superficie celular en presencia de leptina (es decir, en circunstancias en donde la leptina es capaz de unirse a la leptina expresada en la superficie celular). Es decir, de acuerdo con determinadas realizaciones, la interacción entre los anticuerpos anti-LEPR y el LEPR expresado en la superficie celular no se inhibe por la presencia de leptina formando complejo con el LEPR expresado en la superficie celular. Los anticuerpos de acuerdo con este aspecto de la invención son capaces de formar un complejo de tres miembros en la superficie de una célula, que comprende el anticuerpo, el LEPR expresado en la superficie celular y la leptina. Un formato de ensayo ilustrativo para determinar si un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse al LEPR expresado en la superficie celular en presencia y ausencia de la leptina humana se expone en el Ejemplo 6 en el presente documento.
Los anticuerpos de la presente invención pueden poseer una o más de las características biológicas mencionadas anteriormente, o cualquier combinación de las mismas. El listado anterior de características biológicas de los anticuerpos de la invención no pretende ser exhaustivo. Otras características biológicas de los anticuerpos de la presente invención serán evidentes para un experto en la materia a partir de una revisión de la presente divulgación, incluyendo los Ejemplos de trabajo en el presente documento.
Mapeo epitópico y tecnologías relacionadas
La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-LEPR que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-LEPR que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones de aminoácidos conservativas con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR expuestas en la Tabla 1 en el presente documento. En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-LEPR que comprenden secuencias de aminoácidos variantes de HCVR, LCVR y/o CDR con respecto a las secuencias expuestas en la Tabla 1 en el presente documento (por ejemplo, que comprenden sustituciones de aminoácidos conservativas), en donde tales anticuerpos variantes presentan, no obstante, una o más funciones y/o propiedades de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos divulgados en el presente documento.
El dominio extracelular del LEPR humano contiene un dominio de homología con receptor de citocinas (CRH-1) N-terminal, un dominio similar a la inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CRH (CRH-2) que se denomina dominio de unión a leptina (LBD, forma siglada de leptin-binding domain). (Carpenter et al. (2012) Structure 20:487-97). Adicionalmente, el LEPR comparte la mayor homología y un tamaño y organización del dominio extracelular similares al factor estimulante de las colonias de granulocitos (GCSF) y la glicoproteína 130 (gp13). (Haniu et al. (1998) J Biol Chem 273(44): 28691-699).
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocido como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, distintos anticuerpos pueden unirse a distintas áreas en un antígeno y pueden tener distintos efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por aminoácidos espacialmente yuxtapuestos de distintos segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En una determinada circunstancia, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.
La presente invención incluye anticuerpos anti-LEPR que interactúan con uno o más epítopos que se encuentran dentro de los aminoácidos M1-D839 del LEPR humano (SEQ ID NO: 113). Como se expone en el Ejemplo 11, 201 péptidos del LEPR humano presentaron una captación de deuteración significativamente reducida cuando se unían al anticuerpo H4H16650P2. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 162-169 (aminoácidos LYVLPEVL del LEPR humano, SEQ ID NO: 113) y 170-191 (aminoácidos EDSPLVPQKGSF del LEPR humano, SEQ ID NO: 113) tuvieron tasas de deuteración más lentas cuando se unieron a H4H16650P2, lo que indica que este anticuerpo se une al menos a dos epítopos del LEPR humano que tienen las secuencias LYVLPEVL o EDSPLVPQKGSF (aminoácidos 162-169 o 170-191, respectivamente, de la SEQ ID NO: 113).
El epítopo al que se unen los anticuerpos de la presente invención puede consistir en una única secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos de una proteína LEPR. Alternativamente, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos (o secuencias de aminoácidos) no contiguos del LEPR. En algunas realizaciones, el epítopo está ubicado en o cerca del dominio de unión a leptina del LEPR. En otras realizaciones, el epítopo está ubicado en una región distinta del dominio de unión a leptina del LEPR, por ejemplo, en una ubicación en la superficie del LEPR en la que un anticuerpo, cuando se une a tal epítopo, no interfiere con la unión de leptina al LEPR.
Se pueden utilizar diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia para identificar los aminoácidos dentro de un epítopo reconocido por un anticuerpo particular. Las técnicas ilustrativas incluyen, por ejemplo, análisis mutacional de barrido con alanina, análisis por transferencia de péptidos y análisis de escisión de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Otro método que puede utilizarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio de hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los restos, excepto en los restos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasa y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véanse, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. El análisis por cristalografía de rayos X de un anticuerpo formando complejo con su antígeno también puede utilizarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo.
La presente divulgación incluye además anticuerpos anti-LEPR que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se expone en la Tabla 1 en el presente documento). Asimismo, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-LEPR que compiten por la unión a LEPR con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se expone en la Tabla 1 en el presente documento).
Se puede determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-LEPR de referencia utilizando métodos rutinarios conocidos en la técnica y ejemplificados en el presente documento. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de prueba se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-LEPR de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína LEPR. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de prueba para unirse a la molécula de LEPr . Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse al LEPR después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-LEPR de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de prueba se une a un epítopo distinto que el anticuerpo anti-LEPR de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de prueba no puede unirse a la molécula de LEPR después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-LEPR de referencia, entonces el anticuerpo de prueba puede unirse al mismo epítopo al que se une el anticuerpo anti-LEPR de referencia de la invención. A continuación, puede llevarse a cabo experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la falta de unión del anticuerpo de prueba observada se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse utilizando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la materia. De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente divulgación, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o a epítopos solapantes) si, por ejemplo, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos el 50 %, pero preferentemente el 75 %, el 90 % o incluso el 99 %, medido en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alternativamente, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos solapantes" si únicamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión (o compite de forma cruzada por la unión) con un anticuerpo anti-LEPR de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína LEPR en condiciones de saturación, seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de prueba a la molécula de LEPR. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de prueba se una a una molécula de LEPR en condiciones de saturación, seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula LEPR. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unirse a la molécula de LEPR, entonces se concluye que el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a LEPR. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede no unirse necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Preparación de anticuerpos humanos
Los anticuerpos anti-LEPR de la presente invención pueden ser anticuerpos completamente humanos. Los métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos, son conocidos en la materia. Cualquiera de tales métodos conocidos puede utilizarse en el contexto de la presente invención para fabricar anticuerpos humanos que se unan específicamente al LEPR humano.
Utilizando la tecnología VELOClMMUNE™, por ejemplo, o cualquier otro método conocido similar para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos, se aíslan inicialmente anticuerpos quiméricos de alta afinidad para LEPR que tengan una región variable humana y una región constante de ratón. Al igual que en la siguiente sección experimental los anticuerpos se caracterizan y seleccionan por sus características convenientes, incluyendo la afinidad, la actividad bloqueante de ligandos, la selectividad, el epítopo, etc. Si fuera necesario, las regiones constantes de ratón se sustituyen por una región constante humana deseada, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificadas, para generar un anticuerpo anti-LEPR completamente humano. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable. En determinados casos, los anticuerpos anti-LEPR completamente humanos se aíslan directamente de linfocitos B positivos para el antígeno.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-LEPR y los fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos pero que conservan la capacidad de unirse al LEPR humano. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia parental, pero presentan una actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Asimismo, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-LEPR de la presente divulgación abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia divulgada, pero que codifican un anticuerpo anti-LEPR o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-LEPR o fragmento de anticuerpo de la invención. Anteriormente se han analizado ejemplos de tales secuencias de ADN y de aminoácidos variantes.
Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en una única dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su tasa de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes porque tales diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el etiquetado, no son esenciales para alcanzar concentraciones corporales eficaces del fármaco en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el fármaco concreto estudiado.
En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.
En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio significativo desde el punto de vista clínico en la inmunogenicidad, o una eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que se conozcan dichos mecanismos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en la que se mide la concentración del anticuerpo 0 sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico en función del tiempo; (b) una prueba in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictiva de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos en la que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos anti-LEPR de la invención pueden construirse, por ejemplo, haciendo diversas sustituciones de restos o secuencias o delecionando restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden delecionarse o sustituirse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o sustituirse por otros aminoácidos, para impedir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo anti-LEPR que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o retiran la glucosilación.
Selectividad de especie y reactividad cruzada de especie
La presente invención, de acuerdo con determinadas realizaciones, proporciona anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano, pero no al LEPR de otras especies. La presente invención también incluye anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPr humano y al LEPR de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-LEPR de la invención pueden unirse al LEPR humano y pueden unirse o no, según sea el caso, a uno o más de LEPR de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, macaco cangrejero, tití, macaco cangrejero o chimpancé. De acuerdo con determinadas realizaciones ilustrativas de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que se unen específicamente al LEPR humano y al LEPR de macaco cangrejero (por ejemplo, Macaca fascicularis). Otros anticuerpos anti-LEPR de la invención se unen al LEPR humano, pero no se unen, o se unen débilmente, al LEPR de macaco cangrejero.
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para distintos epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véanse, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-LEPR de la presente invención pueden unirse a o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares distintas, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.
La presente divulgación incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina se une al LEPR humano, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un segundo antígeno. El brazo de unión al LEPR puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se expone en la Tabla 1 en el presente documento.
Un formato de anticuerpo biespecífico ilustrativo que puede utilizarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominios Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la Proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig está unido a Proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a Proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Las modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Otros formatos biespecíficos ilustrativos que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, botones en ojales, cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con botones en ojales, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, por ejemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores). Además, pueden construirse anticuerpos biespecíficos utilizando conjugación de péptido/ácido nucleico, por ejemplo, en donde se utilizan aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal para generar conjugados de anticuerpo-oligonucleótido específicos de sitio que después se autoensamblan en complejos multiméricos de composición, valencia y geometría definidas. (Véase, por ejemplo, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4 de diciembre de 2012]).
Formulación terapéutica y administración
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-LEPR o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con transportadores, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una transferencia, entrega, tolerancia y similares mejorados. Se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, geles, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LiPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
La dosis de anticuerpo administrada a un paciente puede variar dependiendo de la edad y las dimensiones del paciente, la enfermedad diana, las afecciones, la vía de administración y similares. La dosis preferida se calcula normalmente de acuerdo con el peso corporal o la superficie corporal. En un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención, normalmente en una única dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosificaciones y dosificaciones eficaces para administrar anticuerpos anti-LEPR pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede controlarse el progreso del paciente mediante evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Además, pueden realizarse aumentos de escala de las dosificaciones entre especies utilizando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden utilizarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem.
262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de recubrimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, la mucosa oral, la mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede suministrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringuilla convencionales. Además, con respecto al suministro subcutáneo, un dispositivo de suministro de pluma tiene fácilmente aplicaciones en el suministro de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo de suministro de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de suministro de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho que puede sustituirse que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y sustituirse por un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de suministro de pluma puede entonces reutilizarse. En un suministro de pluma desechable, no hay cartucho sustituible. En cambio, el dispositivo de suministro de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica contenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha el dispositivo completo.
Numerosos dispositivos de suministro de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DlSETRONlC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OpTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Fráncfort, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de suministro de pluma desechables que tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), la PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), la EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.
En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede utilizarse una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización, pueden utilizarse materiales poliméricos; véanse, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. En otra realización más, puede colocarse en las proximidades de la diana de la composición un sistema de liberación controlada, siendo necesaria, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, pág. 115-138). Se analizan otros sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer, 1990, Science 249: 1527-1533.
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos públicamente conocidos. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal, descrito anteriormente, en un medio acuoso estéril o un medio oleoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, están, por ejemplo, la solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que puede utilizarse en combinación con un agente de solubilización apropiado, tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., los cuales pueden utilizarse en combinación con un agente de solubilización tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se carga preferentemente en una ampolla apropiada.
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, pastillas, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.
Usos terapéuticos de los anticuerpos
La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composición terapéutica que comprende un anticuerpo anti-LEPR (por ejemplo, un anticuerpo anti-LEPR que comprenda cualquiera de las secuencias de HCVR/LCVR o de CDR como se expone en la Tabla 1 en el presente documento). La composición terapéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos anti-LEPR divulgados en el presente documento, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otros, para el tratamiento, prevención y/o la mejoría de cualquier enfermedad o trastorno asociado con o mediado por la deficiencia de leptina, la resistencia a la leptina, la hipoleptinemia, o que pueda tratarse de otro modo estimulando o activando la señalización por el LEPR o imitando la actividad natural de la leptina in vitro o en vivo. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención son útiles para tratar afecciones de lipodistrofia. Las afecciones de lipodistrofia ilustrativos que pueden tratarse mediante los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención incluyen, por ejemplo, lipodistrofia generalizada congénita, lipodistrofia generalizada adquirida, lipodistrofia parcial familiar, lipodistrofia parcial adquirida, lipodistrofia centrífuga abdominal, lipoatrofia anular, lipodistrofia localizada y lipodistrofia asociada al VIH.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-LEPR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención que son útiles para restablecer la señalización por leptina en las células, tejidos y órganos que expresan una o más mutaciones del LEPR asociadas con la obesidad. Por ejemplo, se han identificado determinados mutantes del LEPR que presentan una señalización nula o reducida en presencia de leptina y que están asociados a la obesidad y a trastornos relacionados. Como se usa en el presente documento, un mutante del LEPR que no presenta señalización en presencia de leptina se denomina "mutante del LEPR con señalización defectuosa". Una mutación del LEPR con señalización defectuosa ilustrativo es LEPR-A409E (Farooqi et al., 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247). Como se usa en el presente documento, un mutante del LEPR que presenta una señalización reducida en presencia de leptina (en comparación con el LEPR de tipo silvestre) se denomina "mutante del LEPR con señalización alterada". Una mutación del LEPR de señalización alterada ilustrativo es LEPR-P316T (Mazen et al., 2011, Mol Genet Metab 102:461-464). Por tanto, la presente invención incluye anticuerpos anti-LEPR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención que son útiles para el tratamiento, la prevención y/o la mejoría de enfermedades y trastornos provocados por o asociados con uno o más mutantes del LEPR con señalización defectuosa (por ejemplo, A409E) y/o señalización alterada (por ejemplo, P316T).
Los anticuerpos anti-LEPR y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención también son útiles para el tratamiento o la prevención de una o más enfermedades o trastornos seleccionados del grupo que consiste en obesidad, síndrome metabólico, ansia por la comida inducida por la alimentación, amenorrea hipotalámica funcional, diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, resistencia a la insulina, resistencia grave a la insulina, incluida la resistencia grave a la insulina debida a una mutación del receptor de insulina, resistencia grave a la insulina no provocada por una mutación del receptor de insulina, resistencia grave a la insulina provocada por una mutación en las rutas de señalización aguas abajo o inducida por otras causas, enfermedades del hígado graso alcohólico y no alcohólico, enfermedad de Alzheimer, deficiencia de leptina, resistencia a la leptina, lipodistrofias, leprechaunismo/síndrome de Donohue, síndrome de Rabson-Mendenhall.
En el contexto de los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-LEPR puede administrarse como monoterapia (es decir, como único agente terapéutico) o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales (de los cuales se describen ejemplos en otra parte en el presente documento).
Terapias y formulaciones de combinación
La presente invención incluye composiciones y formulaciones terapéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-LEPR de la invención en combinación con uno o más componentes terapéuticamente activos adicionales.
Los anticuerpos anti-LEPR de la presente invención pueden coformularse y/o administrarse en combinación con uno o más componentes terapéuticamente activos adicionales, tales como, por ejemplo, productos farmacéuticos recetados para el tratamiento de la obesidad, la hipercolesterolemia, la hiperlipidemia, la diabetes de tipo 2, la diabetes de tipo 1, el control del apetito, la esterilidad, etc. Los ejemplos de tales componentes terapéuticamente activos adicionales incluyen, por ejemplo, leptina humana recombinante (por ejemplo, metreleptina [MYALEPT]), inhibidores de PCSK9 (por ejemplo, anticuerpos anti-PCSK9 [alirocumab, evolocumab, bococizumab, lodelcizumab, ralpancizumab, etc.]), estatinas (atorvastatina, rosuvastatina, cerivastatina, pitavastatina, fluvastatina, simvastatina, lovastatina, pravastatina, etc.), ezetimiba, insulina, variantes de insulina, secretagogos de insulina, metformina, sulfonilureas, inhibidores del cotransportador de sodio y glucosa 2 (SGLT2) (por ejemplo, dapaglifocina, canaglifocina, empagliflocina, etc.), agonistas/análogos de GLP-1 (por ejemplo, extendina-4, exenatida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida, dulaglutida, etc.), inhibidores del glucagón (GCG) (por ejemplo, anticuerpos anti-GCG), inhibidores del receptor de glucagón (GCGR) (por ejemplo, anticuerpos anti-GCGR, antagonistas de GCGR de molécula pequeña, oligonucleótidos antisentido específicos de GCGR, aptámeros anti-GCGR [por ejemplo, Spiegelmers], etc.), inhibidores de la proteína similar a la angiopoyetina (ANGPTL) (por ejemplo, anticuerpos anti-ANGPTL3, anticuerpos anti-ANGPTL4, anticuerpos anti-ANGPTL8, etc.), Fentermina, Orlistat, Topiramato, Bupropión, Topiramato/Fentermina, Bupropión/Naltrexona, Bupropión/Zonisamida, Pramlintida/Metrelepina, Lorcaserina, Cetilistat, Tesofensina, Velneperit, etc.
El componente (o componentes) terapéuticamente activo adicional, por ejemplo, cualquiera de los agentes enumerados anteriormente u obtenidos de los mismos, puede administrarse justo antes de, simultáneamente con o poco después de la administración de un anticuerpo anti-LEPR de la presente invención; (para los fines de la presente divulgación, tales pautas posológicas se consideran la administración de un anticuerpo anti-LEPR "en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional). La presente invención incluye composiciones farmacéuticas en las que un anticuerpo anti-LEPR de la presente invención se coformula con uno o más de los componentes terapéuticamente activos adicionales como se describe en otra parte del presente documento.
Pautas posológicas
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, pueden administrarse múltiples dosis de un anticuerpo anti-LEPR (o una composición farmacéutica que comprenda una combinación de un anticuerpo anti-LEPR y cualquiera de los agentes terapéuticamente activos adicionales mencionados en el presente documento) a un sujeto durante un transcurso de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un anticuerpo anti-LEPR de la invención. Como se usa en el presente documento, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis del anticuerpo anti-LEPR se administra al sujeto en un punto de tiempo distinto, por ejemplo, en días distintos separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una dosis inicial única de un anticuerpo anti-LEPR, seguida por una o más dosis secundarias del anticuerpo anti-LEPR y, opcionalmente, seguidas por una o más dosis terciarias del anticuerpo anti-LEPR.
Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración del anticuerpo anti-LEPR de la invención. Por tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio del régimen de tratamiento (también denominada "dosis de referencia", "dosis de carga", "dosis de inicio" y similares); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis iniciales, secundarias y terciarias pueden contener todas la misma cantidad de anticuerpo anti-LEPR, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de la frecuencia de administración. En determinadas realizaciones, sin embargo, la cantidad de anticuerpo anti-LEPR contenida en las dosis iniciales, secundarias y/o terciarias varían entre sí (por ejemplo, ajustadas al alza o a la baja según sea apropiado) durante el ciclo del tratamiento. En determinadas realizaciones, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis se administran al principio del régimen de tratamiento como "dosis de carga", seguidas de dosis posteriores que se administran con menor frecuencia (por ejemplo, las "dosis de mantenimiento").
Usos diagnósticos y analíticos de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-LEPR de la presente invención también pueden utilizarse para detectar y/o medir al LEPR, o células que expresan al LEPR, en una muestra, por ejemplo, con fines diagnósticos. Por ejemplo, un anticuerpo anti-LEPR, o un fragmento del mismo, puede utilizarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión anómala (por ejemplo, la sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) del LEPR. Los ensayos diagnósticos ilustrativos para el LEPR pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-LEPR de la invención, en donde el anticuerpo anti-LEPR está marcado con un marcador detectable o molécula indicadora. Alternativamente, un anticuerpo anti-LEPR sin marcar puede utilizarse en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado él mismo de manera detectable. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; una fracción fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los ensayos específicos ilustrativos que pueden utilizarse para detectar o medir al LEPR en una muestra incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y tomografía de emisión de positrones (PET).
Las muestras que pueden utilizarse en los ensayos de diagnóstico del LEPR de acuerdo con la presente invención incluyen cualquier muestra de tejido o liquido obtenible de un paciente que contenga cantidades detectables de proteína LEPR, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. Generalmente, los niveles del LEPR en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente que no padece una enfermedad o afección asociada con niveles o una actividad anómalos de LEPR) se medirá para establecer inicialmente un nivel de referencia, o patrón, de LEPR. Este nivel de referencia de LEPR puede después compararse con los niveles de LEPR medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen un trastorno o afección relacionado con el LEPR.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de cómo preparar y utilizar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se ha intentado garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.
Ejemplo 1. Generación de proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente al receptor de leptina (LEPR)
Los anticuerpos anti-LEPR se obtuvieron inmunizando un ratón VELOCIMMUNE® (es decir, un ratón técnicamente diseñado que comprende ADN que codifica las regiones variables de la cadena ligera kappa y pesada de la inmunoglobulina humana) con un inmunógeno que comprende el dominio extracelular del LEPR. La respuesta inmunitaria de anticuerpos se controló mediante un inmunoensayo específico de LEPR. Utilizando las técnicas descritas anteriormente, se aislaron y purificaron anticuerpos anti-LEPR completamente humanos.
Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos generados en conformidad con los métodos de este Ejemplo se describen en detalle en los Ejemplos expuestos a continuación.
Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de la región variable de las cadenas pesada y ligera
La Tabla 1 expone los identificadores de secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-LEPR seleccionados de la invención. Los identificadores de secuencias de ácido nucleico correspondientes se exponen en la Tabla 2.
Tabla 1: Identificadores de secuencias de aminoácidos
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Tabla 2: Identificadores de secuencias de ácido nucleico
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Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo de Fc (por ejemplo, "H4H", "H1M", "H2M", etc.), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "16650", "16679", etc.), seguido de un sufijo "P" o "N". Por tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, por ejemplo, "H4H16650P2", "H4H16679P2", etc. Los prefijos Fc en las designaciones de anticuerpos utilizadas en el presente documento (H4H, H1M y H2M) indican el isotipo particular de la región Fc del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H4H" tiene una Fc de IgG4 humana, mientras que un anticuerpo "H1M" tiene una Fc de IgG1 de ratón, (todas las regiones variables son completamente humanas, como se indica con la primera 'H' en la designación del anticuerpo). Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que tiene un isotipo de Fc particular puede convertirse en un anticuerpo con un isotipo de Fc distinto (por ejemplo, un anticuerpo con una Fc de IgG1 de ratón puede convertirse en un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), que se indican mediante los identificadores numéricos mostrados en las Tablas 1 y 2, seguirán siendo los mismos, y se espera que las propiedades de unión sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio Fc.
"Acm de comparación" como se usa en los Ejemplos en el presente documento se refiere al Fab9F8 descrito en Fazeli et al. (2006) J Immunol Methods 312:190-200 y Carpenter et al. (2012) Estructura 20(3):487-97.
Ejemplo 3: Afinidades de unión y constantes cinéticas obtenidas por resonancia de plasmón superficial de los anticuerpos monoclonales anti-LEPR humanos
Las constantes de disociación en equilibrio (valores de Kd) para la unión de LEPR a anticuerpos monoclonales anti-LEPR purificados se determinaron utilizando un biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real utilizando un instrumento Biacore 4000. Todos los estudios de unión se realizaron en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, tampón de ejecución a pH 7,4 (HBS-ET) a 25 °C y 37 °C. La superficie del sensor Biacore se derivatizó primero mediante acoplamiento de amina con un anticuerpo monoclonal anti-Fc humano de ratón (GE, n.° BR-1008-39) para capturar anticuerpos monoclonales anti-LEPR. Se realizaron estudios de unión sobre los siguientes reactivos de LEPR: dominio extracelular del LEPR humano expresado con una etiqueta de myc-myc-hexahistidina C-terminal (hLEPR.mmh; SEQ ID NO: 114), dominio extracelular del LEPR de Macaca fascicularis expresado con una etiqueta de myc-myc-hexahistidina C-terminal (mfLEPR.mmh; SEQ ID NO: 117), dominio extracelular del LEPR humano expresado con una etiqueta de Fc de IgG2a de ratón C-terminal (hLEPR.mFc; SEQ ID NO: 115), dominio extracelular del LEPR de ratón expresado con una etiqueta de myc-mychexahistidina C-terminal (mlEPR.mmh; SEQ ID NO: 118) y el dominio extracelular del LEPR de rata expresado con una etiqueta de myc-myc-hexahistidina C-terminal (rLEPR.mmh; SEQ ID NO: 119). En primer lugar, se prepararon distintas concentraciones de reactivos de LEPR en tampón de ejecución HBS-ET (100 nM - 3,7 nM; dilución seriada con factor 3) y se inyectaron sobre la superficie con anticuerpo monoclonal anti-LEPR capturado con anti-Fc humano durante 4 minutos a un caudal de 30 pl/minuto, mientras que la disociación del reactivo de LEPR unido a anticuerpo monoclonal se controló durante 10 minutos en el tampón de ejecución HBS-ET. Se determinaron las constantes cinéticas de asociación (ka) y disociación (ko) ajustando los sensogramas de unión en tiempo real a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa utilizando el programa informático de ajuste a la curva Scrubber 2.0c. Las constantes de disociación en equilibrio (Kd) de unión y las semividas disociativas (t1^ ) se calcularon a partir de las constantes cinéticas como:
Kd (M) = — y t / (min)
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Los parámetros de cinética de unión para hLEPR.mmh, mfLEPR.MMH o hLEPR.mFc, uniéndose a distintos anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención a 25 °C y 37 °C se muestran en las Tablas 3 a 8.
Tabla 3: Parámetros de cinética de unión de la unión de hLEPR-MMH a anticuerpos monoclonales para LEPR a 25 °C.
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Tabla 4: Parámetros de cinética de unión de la unión de hLEPR-MMH a anticuerpos monoclonales para LEPR a 37 °C.
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Tabla 5: Parámetros de cinética de unión de la unión de mfLEPR.MMH a anticuerpos monoclonales para LEPR a 25 °C.
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Tabla 6: Parámetros de cinética de unión de la unión de mfLEPR.MMH a anticuerpos monoclonales para LEPR a 37 °C.
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Tabla 7: Parámetros de cinética de unión de la unión de hLEPR.mFc a anticuerpos monoclonales para LEPR a 25 °C.
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Tabla 8: Parámetros de cinética de unión de la unión de hLEPR.mFc a anticuerpos monoclonales para LEPR a 37 °C.
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A 25 °C, los anticuerpos monoclonales anti-LEPR se unieron a hLEPR-MMH con valores de Kd valores que variaban de 7,93 nM a 148 nM, como se muestra en la Tabla 5. A 37 °C, los anticuerpos monoclonales anti-LEPR se unieron a hLEPR-MMH con valores de Kd valores que variaban de 14,8 nM a 326 nM, como se muestra en la Tabla 4.
Diez de los 12 anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unieron a mfLEPR.MMH. A 25 °C, los anticuerpos monoclonales anti-LEPR se unieron a mfLEPR.MMH con valores de Kd valores que variaban de 2,27 nM a 139 nM, como se muestra en la Tabla 7. A 37 °C, los anticuerpos monoclonales anti-LEPR se unieron a mfLEPR.MMH con valores de Kd valores que variaban de 5,18 nM a 264 nM, como se muestra en la Tabla 8.
A 25 °C, los anticuerpos monoclonales anti-LEPR se unieron a hLEPR-mFc con valores de Kd que variaban de 613 pM a 5,7 nM, como se muestra en la Tabla 7. A 37 °C, los anticuerpos monoclonales anti-LEPR se unieron a hLEPR-mFc con valores de Kd que variaban de 1,16 nM a 12,8 nM, como se muestra en la Tabla 8.
Ninguno de los anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unió a mlEPR.MMH o rLEPR.MMH a 25 °C o a 37 °C (datos no mostrados).
Ejemplo 4. Los anticuerpos anti-LEPR de la invención se unen al LEPR en presencia de unión leptina:LEPR
Se evaluó el bloqueo de la unión de los anticuerpos anti-LEPR al LEPR por parte de la leptina humana utilizando un biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real en un instrumento Biacore T200. Todo el estudio se realizó en HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDt A 3 mM y tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v (tampón de ejecución HBS-ET) a 25 °C. La superficie del sensor Biacore CM5 se derivatizó en primer lugar mediante acoplamiento de amina de leptina humana (R&D Systems, n.° 398-LP) utilizando química de superficie convencional con EDC/NHS. Se formó un complejo de LEPR humano y leptina humana, inyectando 20 nM del dominio extracelular del LEPR humano expresado con una etiqueta C-terminal de myc-myc-hexahistidina (hLEPR-MMH; SEQ ID NO: xx), sobre la superficie del sensor Biacore con leptina humana inmovilizada a un caudal de 10 pl/minuto o de 25 pl/minuto durante 4 minutos, para lograr una respuesta de unión de aproximadamente 200 UR. Para evaluar si la leptina humana bloquea la unión de anticuerpos a hLEPR-MMH, se inyectó 200 nM de anticuerpos monoclonales anti-LEPR sobre el complejo de hLEPR-MMH:leptina humana preformado, a un caudal de 50 pl/minuto o 25 pl/minuto durante 4 - 5 minutos. Todos los anticuerpos anti-LEPR de la presente invención se unieron al complejo de hLEPR-MMH y leptina humana ("leptina:LEPR") con una fuerza de señal casi similar y la unión observada, expresada en UR, se presentan en la Tabla 9. Este resultado indica que la leptina humana no bloquea la unión de hLEPR-MMH a los anticuerpos anti-LEPR probados.
T l : ni n n i r m n l n l n i-LEPR l r m l hLEPR-MMH l in h m n .
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Ejemplo 5. ELISA de bloqueo del receptor de leptina humano
Para el ELISA, se recubrió leptina humana (hLeptina; R&D Systems, n.° 398-LP-01M) a una concentración de 5 pg/ml en PBS en una placa de microtitulación de 96 pocillos durante una noche a 4 °C. Los sitios de unión no específica se bloquearon posteriormente con una solución de BSA al 0,5 % (p/v) en PBS. Una cantidad constante de 10 nM de la porción del dominio extracelular de la proteína LEPR que se expresó con una etiqueta de Fc humano C-terminal (hLEPR.hFc; SEQ ID NO: 116) se tituló con anticuerpos anti-LEPR, proteína hLeptina, o un anticuerpo de control de isotipo que variaba de 8,5 pM a 500 nM en dilución seriada. Estos complejos de anticuerpo-proteína o de proteínaproteína se incubaron a continuación durante 1,5 horas a temperatura ambiente (TA). Posteriormente, los complejos se transfirieron a placas de microtitulación recubiertas con hLeptina y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron los pocillos y se detectó hLEPR.hFc unida a la placa con un anticuerpo policlonal anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Inc, n.° 109-035-098). Las muestras se desarrollaron con una solución de TMB (BD Biosciences, n.° 555214; sustrato A y B mezclados en una relación de 1:1 según las instrucciones del fabricante) para producir una reacción colorimétrica, y luego se neutralizó con ácido sulfúrico 1 M antes de medir la absorbancia a 450 nm en un lector de placas Victor X5.
El análisis de los datos se realizó utilizando un modelo de respuesta a la dosis sigmoidal dentro del programa informático Prism™ (GraphPad). El porcentaje de bloqueo a la concentración máxima del anticuerpo analizado se calculó como un indicador de la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de 10 nM de hLEPR.hFc a la leptina humana en la placa. En el cálculo, la señal de unión de 10 nM de hLEPR.hFc sin la presencia del anticuerpo se consideró el 100 % de unión o del 0 % de bloqueo; y la señal de referencia del tampón solo sin la presencia de hLEPR.hFc se consideró el 0 % de unión o el 100 % de bloqueo. Los datos de bloqueo a una concentración de anticuerpo de 500 nM se resumen en la Tabla 10.
Como se muestra en la Tabla 10, ninguno de los anticuerpos anti-LEPR de la invención mostró un bloqueo >28 % de la unión de hLEPR.hFc a la superficie recubierta de hLeptina. Sin embargo, el anticuerpo de comparación y la hLeptina, como control positivo, fueron capaces de bloquear el 99 % de la unión de hLEPR.hFc a la superficie recubierta con hLeptina. El anticuerpo de control de isotipo no mostró un bloqueo medible a concentraciones de hasta 500 nM.
T l 1 : Bl r ELI A l ni n hLEPR.hF hL in r n i r n i-LEPR
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Ejemplo 6. Unión celular mediante análisis de FACS con células HEK293/Mycx2-hLepR(ecto)-con anclaje de GPI
El receptor de leptina, LEPR, es un receptor transmembrana de un solo cruce de la familia de receptores de citocinas de clase I (Tartaglia et al. (1997) J Biol Chem 7:272(10):6093-6). El LEPR puede unirse a la leptina, una proteína expresada predominantemente por el tejido adiposo que está implicada en la regulación de la ingesta de alimentos y el metabolismo (Friedman et al. (2014) J Endocrinol 223(1):T1-8).
Para evaluar la unión celular por anticuerpos anti-LEPR, se generaron líneas celulares estables HEK293. Una línea celular, conocida en lo sucesivo en el presente documento como HEK293/hLEPR-GPI, expresaba de manera estable el dominio extracelular del LEPR humano (aminoácidos 22-839 del número de referencia P48357 (SEQ ID NO: 113), Isoforma B) con una etiqueta myc-myc N-terminal y una secuencia peptídica C-terminal de la carboxipeptidasa M humana que guía la adición de GPI (glucosilfosfatidilinositol) (Deddish et al. (1990) J. Biological Chemistry 265:25:15083-89), de forma que la proteína pueda anclarse por GPI a la membrana. Se generó otra línea celular HEK293 para expresar de forma estable el LEPR humano de longitud completa (aminoácidos 1-1165 del número de referencia N.° P48357 (SEQ ID NO: 113), Isoforma B) junto con un indicador de luciferasa (Stat3-luciferasa, Stat3-luc, SA Bioscience, n.° CLS-6028L), y en lo sucesivo conocida como HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL. También se generaron células HEK293 con el indicador de Stat3-luciferasa solamente (HEK293/Stat3-luc) como línea celular de control.
Para el análisis de FACS, las células parentales HEK293 y las células HEK293/hLEPR-GPI se disociaron y se sembraron en placas con fondo en V de 96 pocillos a 5 X 105 células/pocillo en PBS que contenía SFB al 2 % (tampón de FACS). Para probar si la capacidad de los anticuerpos anti-hLEPR para unirse a las células se ve afectada por la presencia de leptina, se incubó tampón de FACS con o sin leptina humana 1 pM (R&D Systems, n.° 398-LP) con las células durante 30 minutos a 4 °C, seguido de la adición de anticuerpos anti-LEPR o anticuerpos de control a 10 nM en tampón de FACS. Posteriormente, las células se incubaron durante 30 minutos a 4 °C, seguido de lavado y luego incubación con 16 pg/ml de anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor®-647 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., n.° 109-547-003) durante 30 minutos a 4 °C. Posteriormente, las células se fijaron utilizando BD CytoFix™ (Becton Dickinson, n.° 554655), se filtraron y analizaron en un citómetro de flujo HyperCyt (Beckman Coulter). También se analizaron controles sin teñir y con anticuerpos secundarios solos para todas las líneas celulares. Los resultados se analizaron utilizando ForeCyt (IntelliCyt) y el programa informático FlowJo versión 10 para determinar las medias geométricos de fluorescencia para las células viables. A continuación, se normalizó la media geométrica de la fluorescencia para cada muestra con respecto a la media geométrica de las células no teñidas para obtener la unión relativa por condición, denominado "relaciones de unión", y estas relaciones de unión se registraron para cada anticuerpo probado.
Como se muestra en la Tabla 11, 9 anticuerpos anti-LEPR de la invención probados a 10 nM mostraron unión a las células HEK293/hLEPR-GPI con relaciones de unión que variaban de 824 a 3374 veces sin leptina. Los anticuerpos anti-LEPR también se unieron en presencia de leptina 1 pM con relaciones de unión de 398 y 4184 veces. Como se muestra en la Tabla 11, el anticuerpo comparador probado a 10 nM mostró una unión a las células HEK293/hLEPR-GPI con una relación de unión de 2349 veces la de sin leptina, pero presentó una unión a las células significativamente menor en presencia de leptina 1 pM con una relación de unión de 112. Los anticuerpos anti-LEPR no mostraron ninguna unión significativa a las células parentales HEK293 con relaciones de unión con y sin leptina 1 pM que variaban de 1 a 9 veces. Las muestras de anticuerpos de control de isotipo y las de anticuerpos secundarios solos tampoco mostraron una unión significativa a ninguna línea celular con o sin leptina, con relaciones de unión que variaban de 1 a 6 veces.
Como se muestra en la Tabla 12, cuatro anticuerpos de la invención probados a 70 nM sin leptina, mostraron unión a células HEK293/hLEPR-GPI con relaciones de unión que variaban de 707 a 1131 veces y a células HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL con relaciones de unión que variaban de 42 a 51. Los anticuerpos anti-LEPR no mostraron ninguna unión significativa a las células HEK293/Stat3-luc con relaciones de unión que variaban de 1 a 8 veces. Las muestras de anticuerpos de control de isotipo y de anticuerpos secundarios solos tampoco mostraron una unión significativa a ninguna de las líneas celulares probadas, con relaciones de unión que variaban de 1 a 2 veces.
Tabla 11: Unión de los anticuerpos anti-LEPR 10 nM a HEK293/hLEPR-GPI y a células parentales HEK293 +/-l in h m n 1 M
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Tabla 12: Unión de anticuerpos anti-LEPR 70 nM a HEK293/hLEPR-GPI, HEK293/Stat3-hLEPR-FL y células arentales HEK293/Stat3-luc
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continuación
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Ejemplo 7. Los anticuerpos anti-LEPR de la invención activan la señalización por el LEPR en presencia o ausencia de leptina
Se desarrolló un bioensayo para detectar la activación transcripcional de STAT3 a través de la activación por LEPR utilizando una línea celular indicadora que expresa de forma estable LEPR humano de longitud completa (hLEPR; aminoácidos 1 a 1165 del número de referencia NP_002294.2) junto con un indicador de luciferasa (STAT3-Luc; Qiagen, n.° CLS-6028L) en una línea celular IMR-32, una línea celular de neuroblastoma humano. La línea celular estable resultante, denominada IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR, se aisló y mantuvo en medio MEM-Earl complementado con SFB al 10 %, AANE, puromicina 1 ug/ml, Higromicina B 100 ug/ml y Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (Medio Completo).
El bioensayo resultante se utilizó para medir el efecto de los anticuerpos anti-LEPR de la invención sobre la señalización por el LEPR en presencia o ausencia de leptina. Para el bioensayo, se sembraron células IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR en placas a una densidad de 20.000 células/100 ul/pocillo para un formato de 96 pocillos en el medio completo, y al día siguiente se sustituyó por el volumen apropiado de medio Opti-MEM complementado con BSA al 1 % y SFB al 0,1 % (tampón de ensayo) durante 30 minutos. Para medir el efecto de los anticuerpos de la invención en ausencia de leptina, los anticuerpos anti-LEPR o un anticuerpo de control de isotipo y la leptina humana (hLeptina; R&D Systems, n.° 398-LP) se diluyeron en serie de forma semilogarítmica hasta concentraciones finales que variaban de 100 nM a 300 fM en tampón de ensayo, las cuales se añadieron a las células y posteriormente se incubó durante una noche a 37 °C en CO2 al 5 %.
Para medir el efecto de los anticuerpos de la invención en presencia de leptina, se añadió a las células una concentración fija de leptina humana a 200 pM en tampón de ensayo, seguido inmediatamente por la adición de anticuerpos anti-LEPR o anticuerpos de control de isotipo que se diluyeron en serie de forma semilogarítmica hasta concentraciones finales que variaban de 100 nM a 300 fM. A continuación, las muestras se incubaron durante una noche a 37 °C en CO2 al 5 %. A continuación, se añadió el reactivo OneGlo (Promega, n.° E6051) a las muestras y se midió la actividad de la luciferasa en un lector de placas Envision Multilable (Perkin Elmer) en modo luminiscente. Se obtuvieron los valores de unidades de luz relativas (ULR) y los resultados se analizaron mediante regresión no lineal con el programa informático GraphPad Prism (GraphPad). El valor máximo de ULR obtenido a partir de la respuesta a la dosis de hLeptina se definió como una activación del 100 % en el ensayo con IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR.
Como se muestra en la Tabla 13, en el Estudio 1, en ausencia de hLeptina, todos los anticuerpos anti-LEPR probados mostraron una estimulación débil de las células IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR con valores de CE50 que variaban de 134 pM a 11,9 nM y activación máxima que variaba del 5 % al 13 %, respectivamente, de la activación máxima obtenida a partir de la respuesta a la dosis de hLeptina. En el Estudio 2, en ausencia de hLeptina, los 4 anticuerpos anti-LEPR probados mostraron estimulación de las células IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR con valores de CE50 que variaban de 61,9 pM a 206,9 pM con una activación máxima que variaba del 65 % al 68 % con respecto a la activación máxima obtenida a partir de la respuesta a la dosis de hLeptina. En el Estudio 1, en presencia de 200 pM de hLeptina, todos los anticuerpos anti-LEPR probados mostraron estimulación de las células IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR con valores de CE50 que variaban de 20,2 pM a 523 pM con una activación máxima que variaba del 66 % al 107 %, respectivamente, de la activación máxima obtenida a partir de la respuesta a la dosis de hLeptina. Debido a que estos anticuerpos potenciaron la señalización por el LEPR inducida por leptina, estos anticuerpos se clasificaron como "potenciadores", como se define en el presente documento. En el Estudio 2, en presencia de 200 pM de hLeptina, los 4 anticuerpos anti-LEPR probados mostraron estimulación de las células IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR con valores de CE50 que variaban de 51,9 pM a 257,3 pM con una activación máxima que variaba del 76 % al 88 % de la activación máxima obtenida a partir de la respuesta a la dosis de hLeptina. Estos anticuerpos no potenciaron la señalización por el LEPR de manera apreciable en presencia de leptina. El anticuerpo de control de isotipo no mostró ninguna estimulación medible de las células IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR en ninguno de los ensayos.
Tabla 13: Activación de hLEPR por anticuerpos anti-LEPR
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Ejemplo 8. Los anticuerpos anti-LEPR de la invención activan la señalización en células que expresan mutantes del LEPR con señalización defectuosa o con señalización alterada
Se han identificado mutantes del LEPR que presentan una señalización mediada por leptina defectuosa o alterada y que están asociados con la obesidad de inicio temprano. Por ejemplo, LEPR-A409E es una proteína LEPR mutante de señalización defectuosa que no transduce señales de leptina a STAT3; el mutante A409E se identificó originalmente como una causa monogénica de la obesidad de inicio temprano. (Farooqi et al., 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247). LEPR-P316T es una proteína LEPR mutante con señalización alterada que también se ha demostrado que está asociada con la obesidad de inicio temprano. (Mazen et al., 2011, Mol Genet Metab 102:461-464).
En este Ejemplo, se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-LEPR de la invención para estimular la señalización por el LEPR en líneas celulares que expresan mutantes del LEPR con señalización defectuosa o señalización alterada. En particular, se construyeron líneas celulares indicadoras (HEK293) que expresan el LEPR de tipo silvestre, LEPR-A409E (señalización defectuosa) o LEPR-P316T (señalización alterada). Las células se trataron con cualquiera de vehículo solamente, leptina humana recombinante, IgG de control o anticuerpos anti-LEPR agonistas de la presente invención (H4H16650 o H4H16679), y se determinó el grado de señalización por el LEPR (medida por detección por transferencia de Western de la expresión de pSTAT3-Y705 con respecto a la expresión de STAT3).
En estos experimentos, se demostró que los anticuerpos anti-LEPR agonistas de la presente invención (H4H16650 y H4H16679) estimulan la señalización por el LEPR en células que expresan el mutante LEPR-A409E o el mutante LEPR-P316T (medido por la expresión de STAT3) en una forma dependiente de la dosis (Figura 2, paneles B y C). Por el contrario, el tratamiento con leptina indujo solo una señalización modesta en las células que expresaban el mutante LEPR-P316T y ninguna señalización en las células que expresaban el mutante LEPR-A409E. (Figura 2, panel A). Además, no se detectó señalización por el LEPR en ninguna de las líneas celulares tratadas con vehículo o anticuerpo de control IgG (datos no mostrados). En este ensayo se probaron otros mutantes del LEPR con señalización defectuosa o señalización alterada, pero no fueron activados por los anti-LEPR mutantes (datos no mostrados), lo que sugiere que este efecto de rescate puede ser dependiente del mutante.
Los resultados de este Ejemplo indican que los anticuerpos anti-LEPR agonistas de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades y trastornos (por ejemplo, obesidad de inicio temprano) que están provocados por o asociados con determinados mutantes del LEPR con señalización alterada o señalización defectuosa (por ejemplo, LEPR-P316T o LEPR-A409E).
Ejemplo 9: Competencia cruzada por Octet entre distintos anticuerpos monoclonales anti-LEPR.
La competencia de unión entre un panel de distintos anticuerpos monoclonales anti-LEPR se determinó utilizando un ensayo de interferometría de biocapa sin marcadores en tiempo real en la plataforma de biosensores Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Todo el experimento se realizó a 25 °C en un tampón que contenía HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, BSA 1 mg/ml, pH 7,4 (HBS-EBT), agitando la placa a la velocidad de 1000 rpm. Para evaluar si los dos anticuerpos eran capaces de competir entre sí para unirse a sus respectivos epítopos en el LEPR humano recombinante expresado con una etiqueta de myc-myc-hexahistidina C-terminal (hLEPR.mmh; SEQ ID NO: 114), se capturaron en primer lugar aproximadamente 0,25 nm o 0,34 nm de hLEPR-MMH en las puntas del biosensor Octet recubiertas con anticuerpo anti-penta-His (Fortebio Inc, n.° 18-5122) sumergiendo las puntas del biosensor durante 5 minutos en pocillos que contenían hLEPR-MMH 20 pg/ml. Las puntas del biosensor con el antígeno capturado se saturaron a continuación con un primer anticuerpo monoclonal anti-LEPR (posteriormente denominado Acm-1) sumergiéndolo en pocillos que contenían una solución de Acm-1 50 pg/ml durante 210 segundos. Las puntas del biosensor se sumergieron posteriormente en pocillos que contenían una solución a 50 |jg/ml de un segundo anticuerpo monoclonal anti-LEPR (posteriormente denominado Acm-2) durante 150 segundos. Las puntas del biosensor se lavaron en tampón HBS-EBT entre las etapas del experimento. La respuesta de unión en tiempo real se controló durante todo el transcurso del experimento y se registró la respuesta de unión al final de cada etapa. Se comparó la respuesta de unión del Acm-2 a hLEPR-MMH formando complejo previamente con el Acm-1 y se determinó el comportamiento competitivo/no competitivo de distintos anticuerpos monoclonales anti-LEPR como se muestra en la Tabla 14 y la Tabla 15.
Tabla 14: Com etición cruzada entre anticuer os monoclonales anti-LEPR
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Tabla 15: Com etición cruzada entre anticuer os monoclonales anti-LEPR
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Ejemplo 10: Eficacia in vivo de los anticuerpos agonistas de LEPR H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 y H4H17321P2 en un modelo de ratón inducible de deficiencia de leptina.
Los efectos de cuatro anticuerpos anti-LEPR agonistas específicos de la invención, H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 y H4H17321P2 sobre la ingesta de alimentos, el peso corporal y la adiposidad se determinaron en un modelo inducible de deficiencia de leptina en ratones transgénicos LEPRHu/Hu, que expresan un receptor de leptina que está compuesto por la secuencia del ectodominio del LEPR humano en lugar de la secuencia del ectodominio del LEPR murino. El modelo de deficiencia de leptina se indujo mediante el suministro hidrodinámico de ADN (HDD, forma siglada de hydrodynamic DNA delivery) de un plásmido que codifica un ectodominio del LEPR de ratón etiquetado con hFc (denominado en el presente documento mlEPR.hFc o "trampa de leptina"; SEQ ID NO: 120). Cuando se expresa la trampa de leptina se secreta y se une a la leptina en circulante. Después de1HDD de 50 jg de la construcción de ADN que codifica la trampa de leptina, los ratones presentaron un consumo aumentado de alimentos y una adiposidad y peso corporal aumentados.
La ingesta diaria de alimentos de referencia se midió entre 7 y 4 días antes de la administración de la trampa de leptina (días -7 y -4). El día 0, treinta y cinco ratones LEPRHu/Hu macho de 13 a 17 semanas se sometieron satisfactoriamente al HDD con la trampa de leptina. En los días 6 y 13 posteriores al HDD, se recogieron muestras de sangre retrorbitales y se cuantificó la composición corporal, incluida la adiposidad, mediante jTC. El día 7 después de1HDD, los ratones se distribuyeron al azar en cinco grupos de 7 ratones en función del cambio porcentual del peso corporal desde el día 0. Cada grupo recibió mediante inyección subcutánea una dosis única de anticuerpo de control de isotipo a 3 mg/kg, H4H16650P2 a 3 mg/kg, H4H16679P2 a 3 mg/kg, H4H17319P2 a 3 mg/kg o H4H17321 a 3 mg/kg. El anticuerpo de control de isotipo no se unía a ninguna proteína de ratón conocida. Se midió la ingesta de alimentos y el peso corporal de cada animal durante la duración del estudio. La Figura 3 resume la ingesta diaria promedio de alimentos para cada grupo de tratamiento. En la Figura 3, la línea punteada representa la ingesta de alimentos promedio de referencia antes de la inyección de HDD. Se calculó el cambio porcentual del peso corporal desde el día 0 para cada animal en cada punto de tiempo. La Figura 4 resume el cambio porcentual promedio del peso corporal de los animales en cada grupo de tratamiento con anticuerpo. La Figura 5 resume la masa grasa promedio para los animales en cada grupo de tratamiento con anticuerpo cuantificada por pTC 1 día antes y 6 días después del tratamiento con anticuerpos. Todos los valores se expresan como la media ± ETM.
Como se muestra en las Figuras 3 y 4, después del HDD con la trampa de leptina, se observaron aumentos similares en la ingesta de alimentos y del cambio porcentuales del peso corporal entre los grupos de ratones antes del tratamiento con anticuerpo. Como se muestra en la Figura 3, los ratones tratados con los anticuerpos H4H16650P2 o H4H16679P2 a 3 mg/kg presentaron reducciones significativas de la ingesta de alimentos a partir de un día después del tratamiento con anticuerpo (día 8 después del HDD) y en puntos de tiempo posteriores, medido en comparación con los ratones a los que se les inyectó el anticuerpo de control de isotipo. Los ratones tratados con los anticuerpos H4H17319P2 o H4H17321P2 a 3 mg/kg presentaron una reducción significativa de la ingesta de alimentos a los dos días postratamiento con anticuerpo (día 9 después del HDD) y en los otros puntos de tiempo posteriores, medido en comparación con los ratones a los que se les inyectó anticuerpo de control de isotipo. Como se muestra en la Figura 4, los ratones tratados con el anticuerpo H4H16650P2 a 3 mg/kg presentaron una reducción significativa del cambio porcentual del peso corporal un día después del tratamiento con anticuerpo (día 8 después de1HDD) y en otros puntos de tiempo posteriores, medido en comparación con los ratones a los que se les inyectó el anticuerpo de control de isotipo. Un día después del tratamiento con anticuerpos, en el día 8, los ratones tratados con el control de isotipo mostraron un aumento del peso corporal del 21,16 ± 1,27 % desde el día 0, mientras que los ratones tratados con H4H16650P2 tuvieron un aumento del peso corporal del 15,57 ± 0,9 % desde el día 0. Los ratones tratados con los anticuerpos H4H16679P2, H4H17319P2 o H4H17321 P2 a 3 mg/kg presentaron una reducción significativa del cambio porcentual del peso corporal dos días después del tratamiento con anticuerpo (día 9 después de1HDD) y en otros puntos de tiempo posteriores, medido en comparación con ratones con los ratones a los que se les inyectó el anticuerpo de control de isotipo. El día 9, los cambios % del peso corporal desde el día 0 fueron 23,18 ± 1,22, 13,17 ± 1,05, 12,95 ± 1,26, 15,98 ± 1,78 y 15,83 ± 2,01 para ratones tratados con control de isotipo, H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 o H4H17321P2, respectivamente. Como se muestra en la Figura 5, los ratones tratados con anticuerpo de control de isotipo a 3 mg/kg mostraron un aumento significativo de la masa grasa 6 días después del tratamiento con anticuerpo (día 13 después del HDD) en comparación con 1 día antes del tratamiento con anticuerpo (día 6 después del HDD). Los ratones tratados con los anticuerpos H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 o H4H17321P2 a 3 mg/kg no ganaron masa adiposa después del tratamiento con anticuerpo en comparación con antes del tratamiento con anticuerpo. Después de 6 días de tratamiento (día 13 después de1HDD), los ratones tratados con los anticuerpos H4H16650P2, H4H16679P2 o H4H17319P2 a 3 mg/kg mostraron disminuciones significativas de la masa grasa en comparación con los ratones tratados con anticuerpo de control de isotipo a 3 mg/kg.
Ejemplo 11: Mapeo epitópico de la unión de H4H16650P2 al receptor de leptina humano (hLEPR.mmh) mediante intercambio de hidrógeno deuterio.
Se realizaron experimentos para determinar los restos de aminoácidos de hLEPR.mmh (aminoácidos M1-D839 de SEQ ID NO: 114) con los que interactúa H4H16650P2. Para este fin, se llevó a cabo un mapeo epitópico de intercambio de H/D con espectrometría de masas. Se expone una descripción general del método de intercambio de H/D en, por ejemplo, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; y Engen y Smith (2001) Anal. Chem.
73:256A-265A.
Procedimiento experimental. Los experimentos de HDX-MS se realizaron en una plataforma integrada Waters HDX/MS, que consiste en un sistema Leaptec HDX PAL para el marcaje de deuterio, un Waters Acquity M-Class (administrador auxiliar de disolventes) para la digestión y carga de muestras, un Waters Acquity M-Class (administrador de disolventes pBinary) para el gradiente de columna analítica y un espectrómetro de masas Synapt G2-Si para la medición péctica de masas peptídicas.
La solución de marcaje se preparó en tampón PBS 10 mM en D2O a pD 7,0 (equivalente a pH 6,6). Para el marcaje con deuterio, se incubaron 3,8 pl de hLEPR.mmh (8 pmol/pl) o hLEPR.mmh premezclado con el anticuerpo en una proporción molar de 2:1 con 56,2 pl de solución de marcaje de D2O durante diversos puntos de tiempo (por ejemplo, control no deuterado = 0 segundos, marcaje durante 1 min y 20 min). La deuteración se inactivó transfiriendo 50 pl de muestra a 50 pl de tampón de inactivación preenfriado (TCEP 0,2 M, cloruro de guanidina 6 M en tampón de fosfato 100 mM, pH 2,5) y la muestra mezclada se incubó a 1,0 °C durante dos minutos. A continuación, la muestra inactivada se inyectó en un administrador Waters HDX para la digestión en línea con pepsina/proteasa XIII. Los péptidos digeridos se atraparon en una precolumna ACQUITY UPLC BEH C18 de 1,7 pm, 2,1 x 5 mm VanGuard a 0 °C y se eluyeron a una columna analítica ACQUITY UPLC BEH C18 de 1,7 pm, 1,0 x 50 mm para una separación en gradiente de 9 minutos del 5 %-40 % B (fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua, fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo). El espectrómetro de masas se ajustó a un voltaje de cono de 37 V, tiempo de exploración de 0,5 s e intervalo de masa/carga de 50-1700 Th.
Para la identificación de los péptidos del LEPR humano, Los datos por LC-MSE de la muestra no deuterada se procesaron y se buscaron en la base de datos que incluye el LEPR humano, la pepsina y sus secuencias aleatorizadas mediante el programa informático ProteinLynx Global Server (PLGS) de Waters. Los péptidos identificados se importaron al programa informático DynamX y se filtraron por dos criterios: 1) productos mínimos por aminoácido: 0,2 y 2) umbral del archivo de replicación: 3. A continuación, el programa informático DynamX determinó automáticamente la captación de deuterio de cada péptido basada en el tiempo de retención y la alta precisión de masa (<10 ppm) en múltiples puntos de tiempo con 3 repeticiones en cada tiempo.
Resultados. Utilizando la columna en línea de pepsina/proteasa XIII junto con adquisición de datos de MSE, se identificaron 201 péptidos totales de LEPR humano de forma reproducible en ausencia o presencia del anticuerpo, lo que representa una cobertura de secuencia del 70 %. Cinco péptidos tenían una captación de deuteración significativamente reducida (valores delta del centroide > 0,4 daltons con valores p < 0,05) cuando se unían a H4H16650P2, como se muestra en la Tabla 16. La masa peptídica registrada corresponde al valor promedio de la masa de MH+ del centroide de tres repeticiones. Estos péptidos, correspondiente a los aminoácidos 162-169 (aminoácidos LYVLPEVL del LEPR humano; SEQ ID NO: 113), y a los aminoácidos 170-181 (aminoácidos EDSPLVPQKGSF del LEPR humano; SEQ ID NO: 113), tenían una velocidad de deuteración más lenta cuando se estaban unidos a H4H16650P2. Estos restos identificados también corresponden a los restos ácidos 162-169 y 170­ 181 del LEPR humano como se define en la entrada de Uniprot P48357 (SEQ ID NO. 113; Receptor de leptina humano)
Tabla 16: Péptidos del receptor de leptina humano con protección significativa al unirse al anticuerpo
H4H16650P2
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Ejemplo 12: Prueba de eficacia in vivo de anticuerpos potenciadores del LEPR en ratones con LEPR humanizado.
Se determinaron los efectos de tres anticuerpos anti-LEPR potenciadores específicos de la invención, H4H18482P2, H4H18487P2 y H4H18492P2, sobre el peso corporal y la adiposidad de ratones técnicamente diseñados LEPRHu/Hu alojados individualmente, que expresan un receptor de leptina que está compuesto por la secuencia del ectodominio del LEPR humano en lugar de la secuencia del ectodominio del LEPR murino (mlEPR.hFc, SEQ ID NO: 120).
En el día -19, la composición corporal, incluida la adiposidad, se cuantificó mediante |j TC. En el día 0, cuarenta y ocho ratones LEPRHu/Hu hembra de 14 a 16 semanas de edad se distribuyeron al azar en cuatro grupos de 12 ratones basándose en el peso corporal. En los días 0 y 11, los ratones de cada grupo recibieron mediante inyección subcutánea una dosis única de anticuerpo de control de isotipo a 30 mg/kg, H4H18482P2 a 30 mg/kg, H4H18487P2 a 30 mg/kg o H4H18492P2 a 30 mg/kg. El anticuerpo de control de isotipo no se une a ninguna proteína de ratón conocida. Se midió el peso corporal durante la duración del estudio para cada animal. Se calculó el cambio porcentual del peso corporal desde el día 0 para cada animal en cada punto de tiempo. La Figura 6 resume el cambio porcentual promedio del peso corporal de los animales en cada grupo de tratamiento. La Figura 6 resume la masa grasa promedio para los animales en cada grupo de tratamiento con anticuerpo cuantificada por pTC 19 días antes y 11 días después del tratamiento con anticuerpos. Todos los valores se expresan como la media ± ETM.
Como se muestra en la Figura 6, se observaron disminuciones en el cambio porcentual del peso corporal después de la dosificación con los anticuerpos potenciadores del LEPR, pero no con el anticuerpo de control de isotipo. Como se muestra en la Figura 6, los ratones tratados con H4H18482P2 a 30 mg/kg presentaron disminuciones significativas del cambio porcentual de peso corporal a partir de dos días después del tratamiento (día 2), y en los otros puntos de tiempo en comparación con los ratones a los que se les inyectó un anticuerpo de control de isotipo. Los ratones tratados con H4H18487P2 a 30 mg/kg presentaron disminuciones significativas del cambio porcentual de peso corporal a partir del día 2 y en los otros puntos de tiempo en comparación con los ratones a los que se les inyectó anticuerpo de control de isotipo. Los ratones tratados con H4H18492P2 a 30 mg/kg presentaron una reducción significativa del cambio porcentual de peso corporal en los días 4, 5 y 17, pero no en otros puntos de tiempo en comparación con los ratones a los que se les inyectó anticuerpo de control de isotipo. Los ratones tratados con H4H18482P2 a 30 mg/kg presentaron una disminución significativa del cambio porcentual de peso corporal a partir del día 6 y en los días posteriores, pero no en los días 7, 14 y 17, en comparación con los ratones a los que se les inyectó H4H18492P2. Los ratones tratados con H4H18487P2 a 30 mg/kg presentaron una disminución significativa del de cambio porcentual de peso corporal a partir del día 3 y en los otros puntos de tiempo, pero no en los días 4 y 5, en comparación con los ratones a los que se les inyectó H4H18492P2.
Como se muestra en la figura 7A, no hubo diferencias en la masa grasa entre los grupos antes del tratamiento (día -19). Como se muestra en la Figura 7B, los ratones tratados con los anticuerpos H4H18482 y H4H18487, pero no con H4H18492, a 30 mg/kg, mostraron una disminución estadísticamente significativa de la masa grasa 17 días después del tratamiento (día 12) en comparación con el anticuerpo de control de isotipo.
El alcance de la presente invención no debe estar limitado por las realizaciones específicas descritas en el presente documento. De hecho, diversas modificaciones de la invención, además de las descritas en el presente documento, serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas. Se pretende que tales modificaciones estén dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 13: Efecto de los anticuerpos anti-LEPR de la invención sobre la señalización por el LEPR en monos
Para evaluar la activación transcripcional del receptor de leptina de mono, se desarrolló una línea celular estable. Se generaron células IMR-32 (neuroblastoma humano, ATCC) para expresar de forma estable el dominio extracelular de LEPR de Macaca fascicularis (MfLEPR; aminoácidos 22 a 837 del número de referencia XP_005543194.1, con la treonina en 827 cambiada a alanina) fusionados con los dominios transmembrana y citosólico del LEPR humano (hLEPR; aminoácidos 840 a 1165 de número de referencia NP_002294.2), junto con un indicador de luciferasa (STAT3-Luc; SABiosciences, N.° CLS-6028L). La línea celular resultante, denominada en lo sucesivo en el presente documento IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR, se aisló y mantuvo en medio MEM-Earl complementado con SFB al 10 %, AANE, puromicina 1 ug/ml, higromicina B 100 ug/ml y Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina.
El bioensayo se realizó para medir el efecto de los anticuerpos anti-LEPR de la invención sobre la señalización por el LEPR de monos en ausencia de leptina. Para el bioensayo, se sembraron en placas células IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR a 10.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos en SFB al 0,1 % en Optimem con penicilina/estreptomicina (tampón de ensayo) y se incubaron durante una noche a 37 °C en CO2 al 5 %. Al día siguiente, la leptina humana (hLeptina), los anticuerpos anti-LEPR o un anticuerpo de control de isotipo se diluyeron de en serie de 50 nM a 0,8 pM en el tampón de ensayo (más una muestra que contenía solo el tampón sin la molécula de prueba) y se añadieron a las células. Después de 5,5 horas a 37 °C en CO2 al 5 %, la actividad de luciferasa se midió con el reactivo OneGlo™ (Promega, n.° E6031) y el lector de placas para múltiples marcadores Victor™ X (Perkin Elmer). Los resultados se analizaron utilizando regresión no lineal (logístico de 4 parámetros) con el programa informático Prism™6 (GraphPad) para obtener los valores de CE50. El porcentaje de activación de los anticuerpos se calculó como el intervalo máximo de ULR logrado mediante el anticuerpo con respecto al intervalo máximo de ULR logrado por la hLeptina.
Como se muestra en la Tabla 17, en ausencia de hLeptina, todos los anticuerpos anti-LEPR probados mostraron activación de la señalización por el LEPR de mono en células IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR, con valores de CE50 que variaban de 266 pM a 368 pM y una activación máxima que variaba del 76 % al 82 %, donde se obtuvo el 100 % de activación con hLeptina. La hLeptina se activó con un valor de CE50 de 333 pM. El anticuerpo de control de isotipo no mostró ninguna estimulación medible de las células IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR.
Ta - PR
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Ejemplo 14: Unión a epítopos en el dominio extracelular de longitud completa del LEPR humano utilizando la señal de IFM por Luminex
Para determinar el epítopo del LEPR humano al que se unen los anticuerpos anti-LEPR de la invención, se utilizó un análisis basado en citometría de flujo Luminex FLEXMAP (FM3DD, LuminexCorp) para caracterizar la interacción de los anticuerpos anti-LEPR con los dominios de la proteína LEPR humana recombinante. Para el ensayo, aproximadamente 3 millones de microesferas carboxiladas MicroplexR (Luminex, n.° de cat. LC1000A), se lavaron, se agitaron y se sometieron a ultrasonidos en NaPO4 0,1 M, pH 6,2 (tampón de activación) y a continuación se centrifugaron para eliminar el sobrenadante. Las microesferas se resuspendieron en 120 pl de tampón de activación y los grupos carboxilato (-COOH) se activaron mediante la adición de 15 pl de 50 mg/ml de N-hidroxisuccinimida (NHS, Thermo Scientific, n.° de cat. 24500) seguido de la adición de 15 pl de 50 mg/ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC, ThermoScientific, n.° de cat. 22980) a 25 °C. Después de 10 minutos, el pH de la reacción se redujo a 5,0 con la adición de 600 pl de MES 50 mM, pH 5 (tampón de acoplamiento), y las microesferas se agitaron vorticialmente y centrifugaron para eliminar el sobrenadante. Las perlas activadas se mezclaron inmediatamente con 500 j l de anticuerpos monoclonales anti-myc 20 jg/m l con IgG de ratón o IgG humana, en tampón de acoplamiento, y se incubaron durante dos horas a 25 °C. La reacción de acoplamiento se inactivó mediante la adición de 50 j l de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 y las microesferas se agitaron vorticialmente rápidamente, se centrifugaron y se lavaron cuatro veces con 1 ml de DPBS, para eliminar las proteínas no acopladas y otros componentes de la reacción.
Las proteínas LEPR expresadas de forma transitoria, que incluían el dominio extracelular del LEPR humano expresado con una etiqueta de myc-myc hexahistidina C-terminal (LEPR humano-MMH, SEQ ID NO: 113), el CRH1 del LEPR humano (D1) expresado con una etiqueta de myc-myc hexahistidina C-terminal (CRH1 del LEPR humano (D1)-MMH, aminoácidos 1-208 de la SEQ ID NO: 113 con una etiqueta de myc-myc hexahistidina, aminoácidos 209-236), el dominio CRH1 del LEPR humano (D1,D2) expresado con una etiqueta de myc-myc hexahistidina C-terminal (CRH1 del LEPR humano (D1,D2)-MMH, aminoácidos 1-318 de la SEQ ID NO: 113 con una etiqueta de myc-myc hexahistidina, aminoácidos 319-346), el dominio lg-CRH1 del LEPR humano (D1,D2,D3) expresado con una etiqueta de mycmyc hexahistidina C-terminal (CRH1 del LEPR humano (D1,D2,D3)-Mm H, aminoácidos 1-278 de la SEQ ID NO: 113 con una etiqueta de myc-myc hexahistidina, aminoácidos 279-306), el dominio CRH1-lg del LEPR humano (D2,D3) expresado con una etiqueta de myc-myc hexahistidina C-terminal (CRH1-lg del LEPR humano (D2,D3)-MMH, aminoácidos 1-198 de la SEQ ID NO: 113 con una etiqueta de myc-myc hexahistidina, aminoácidos 199-226), el dominio Ig del LEPR humano (D3) expresado con una etiqueta de myc-myc hexahistidina C-terminal (Ig del LEPR humano (D3)-MMH, aminoácidos 1-88 de la SEQ ID NO: 113 con una etiqueta de myc-myc hexahistidina, aminoácidos 89-116), el dominio CRH2 del LEPR humano expresado con una etiqueta de myc-myc hexahistidina C-terminal (CRH2 del LEPR humano-MMH, aminoácidos 1-207 de la SEQ ID NO: 113 con una etiqueta de myc-myc-hexahistidina, aminoácidos 208-235), dominio FNIII del LEPR humano expresado con una etiqueta de myc-myc hexahistidina C-terminal (FNIII del LEPR humano-MMH, aminoácidos 1-204 de la SEQ ID NO: 113 con una etiqueta de myc-myc hexahistidina, aminoácidos 205-232), y dominio Ig-CRH2-FNIII del LEPR humano expresado con una etiqueta de mycmyc hexahistidina C-terminal (Ig-CRH2-FNIII del LEPR-MMH, aminoácidos 1-510 de la SEQ ID NO: 113 con una etiqueta de myc-myc-hexahistidina, aminoácidos 511-538), se suspendieron en medio CHO-S-SFM II sin suero (Thermo Fisher, n.° de cat. 31033020) y a continuación se clarificaron por centrifugación. Se añadieron alícuotas de las microesferas con los anticuerpos monoclonales anti-myc inmovilizados, preparadas como se ha descrito anteriormente, individualmente a 1 ml de cada uno de estos sobrenadantes proteicos. Las microesferas se mezclaron suavemente, se incubaron durante dos horas a 25 °C, se lavaron dos veces con 1 ml de DBPS, se centrifugó para eliminar el sobrenadante y finalmente se resuspendieron en 1 ml de tampón DPBS. Se extrajeron cuarenta y ocho j l de microesferas acopladas con IgG anti-myc procedentes de las reacciones individuales con LEPR humano de longitud completa y con cada una de las proteínas de dominios del LEPR humano, y se mezclaron juntos en 3,6 ml de PBS BSA 20 mg/ml azida sódica al 0,05 % (tampón de bloqueo).
De este conjunto mixto, se sembraron en placas 75 j l de microesferas por pocillo en una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore, n.° de Cat.: MSBVN1250) y se mezclaron con 25 j l de anticuerpos monoclonales individuales anti-LEPR humano (0,5 o 5 jg/ml), se incubó durante dos horas a 25 °C y a continuación se lavó dos veces con 200 j l de DPBS con Tween 20 al 0,05 % (tampón de lavado). Para detectar y cuantificar las cantidades de niveles de anticuerpo anti-LEPR unido a las microesferas individuales, 100 j l de F(ab')2 anti-kappa humana de cabra conjugado con R-Ficoeritrina 2,5 jg/m l (Southern Biotech, n.° de cat. 2063-09) en tampón de bloqueo o 100 j l de anti-IgG de ratón de cabra fragmento F(ab')2 AffiniPure R-Ficoeritrina 1,25 jg/ml, Fragmento Específico F(ab')2 (Jackson Immunoresearch, N.° de cat.: 115-116-072) en tampón de bloqueo, y se incubó durante 30 minutos a 25 °C. Después de 30 minutos, las muestras se lavaron dos veces con 200 j l de tampón de lavado y se resuspendieron en 150 j l de tampón de lavado. La intensidad de fluorescencia media (IFM) de las microesferas se midió en un analizador Luminex.
Figure imgf000033_0001

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor de leptina (LEPR) humano y activa la señalización por el LEPR con un valor de CE50 de menos de 12,0 nM en un ensayo indicador basado en células que detecta la activación transcripcional de STAT3, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:
(i) una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 4,
una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 6, y
una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 8; y
una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12,
una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y
una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16;
(ii) una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 20,
una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 22, y
una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 24; y
una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12,
una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y
una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16;
(iii) una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 28,
una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 30, y
una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 32; y
una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12,
una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y
una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16;
(iv) una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 36,
una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 38, y
una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 40; y
una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12,
una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y
una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16;
(v) una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 44,
una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 46, y
una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 48; y
una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12,
una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y
una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16;
(vi) una región variable de cadena pesada que comprende: una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 52, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 54, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 56; y una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16;
(vii) una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 60, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 62, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 64; y una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16;
(viii) una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 68, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 70, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 72; y una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16;
(ix) una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 76, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 78, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 80; y una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16;
(x) una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 84, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 86, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 88; y una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 92, una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 94, y una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 96;
(xi) una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 100, una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 102, y una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 104; y una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 92,
una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 94, y
una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 96; o
(xii) una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 108,
una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 110, y
una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 112; y
una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 92,
una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 94, y
una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 96.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende:
una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 36,
una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 38, y
una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 40; y
una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12,
una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y
una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende:
una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 4,
una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 6, y
una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 8; y
una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12,
una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y
una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16.
4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende:
una región variable de cadena pesada que comprende:
una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 28,
una HCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 30, y
una HCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 32; y
una región variable de cadena ligera que comprende:
una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 12,
una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 14, y
una LCDR3 como se expone en la SEQ ID NO: 16.
5. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor de leptina (LEPR) humano y comprende:
(i) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 2;
(ii) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 18;
(iii) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 26;
(iv) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 34;
(v) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 42;
(vi) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 50;
(vii) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 58;
(viii) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 66;
(ix) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 74;
(x) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 90; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 82;
(xi) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 90; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 98; o
(xii) una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 90; y una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 106.
6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5. que es un anticuerpo.
7. El anticuerpo de la reivindicación 6, que comprende una región variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO: 26; y una región variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO: 10.
8. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con o provocada por la deficiencia de leptina o la resistencia a la leptina, que se selecciona del grupo que consiste en una lipodistrofia, obesidad, síndrome metabólico, amenorrea hipotalámica funcional, diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, resistencia a la insulina, resistencia grave a la insulina debida a una mutación en el receptor de insulina, enfermedad de Alzheimer, deficiencia de leptina, resistencia a la leptina, leprechaunismo/síndrome de Donohue y síndrome de Rabson-Mendenhall, comprendiendo el método administrar la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso en un método para el tratamiento de una afección de lipodistrofia en un paciente, comprendiendo el método administrar la composición farmacéutica a un paciente que lo necesite, en donde la afección de lipodistrofia se selecciona del grupo que consiste en lipodistrofia generalizada congénita, lipodistrofia generalizada adquirida, lipodistrofia parcial familiar, lipodistrofia parcial adquirida, lipodistrofia centrífuga abdominal, lipoatrofia anular, lipodistrofia localizada y lipodistrofia asociada al VIH.
11. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con o provocada por una mutación del LEPR con señalización defectuosa o señalización alterada, comprendiendo el método administrar la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite, en donde:
(a) la mutación del LEPR con señalización defectuosa o señalización alterada es LEPR-A409E o LEPR-P316T; y (b) la enfermedad o afección asociada con o provocada por una mutación del LEPR con señalización defectuosa o señalización alterada es obesidad de inicio temprano.
12. La composición farmacéutica para su uso en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, comprendiendo el método además administrar un segundo agente terapéutico al sujeto, en donde el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en una leptina humana recombinante, un inhibidor de PCSK9, una estatina, ezetimiba, insulina, una variante de insulina, un secretagogo de insulina, metformina, una sulfonilurea, un inhibidor del cotransportador de sodio y glucosa 2, un agonista/análogo de GLP-1, un inhibidor del glucagón, un inhibidor del receptor de glucagón, un inhibidor de la proteína similar a la angiopoyetina, Fentermina, Orlistat, Topiramato, Bupropión, Topiramato/Fentermina, Bupropión/Naltrexona, Bupropión/Zonisamida, Pramlintida/Metrelepina, Lorcaserina, Cetilistat, Tesofensina y Velneperit.
13. Un polinucleótido aislado que codifica una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
14. Un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 13 o una célula hospedadora que comprende el vector.
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