CN103314011A - 胰高血糖素受体的人抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了与人胰高血糖素受体(称作GCGR)结合的抗体和使用所述抗体的方法。根据本发明的某些实施方案,所述抗体是与人GCGR结合的完全人抗体(fully human antibody)。本发明的抗体可用于降低血糖水平和血酮水平,并且还可用于治疗与一种或更多种GCGR生物活性相关的疾病和紊乱,其包括治疗糖尿病、糖尿病酮症酸中毒和与糖尿病相关的长期并发症或者以升高的血糖水平为部分特征的其他代谢紊乱。
Description
技术领域
本发明涉及与胰高血糖素受体特异性结合的人抗体和人抗体的抗原结合片段以及使用这些抗体的治疗方法。
背景技术
胰高血糖素是由胰岛之α细胞产生的29个氨基酸的激素。胰高血糖素通过平衡胰岛素的作用来使动物(包括人)体内的葡萄糖保持在正常水平。在数种疾病(例如糖尿病和糖尿病酮症酸中毒)中胰高血糖素与胰岛素的不平衡可具有重要作用。特别地,研究已表明较高的基础胰高血糖素水平和对餐后胰高血糖素分泌之抑制的缺乏导致人的糖尿病病症(Muller等,N Eng J Med283:109-115(1970))。
认为胰高血糖素升高血糖水平的作用部分地通过胰高血糖素(glucagon,GCG)与其受体(称作GCGR)结合后的某些细胞通路的激活来介导。GCGR是G蛋白偶联受体的分泌素亚家族(B家族)的成员,主要在肝脏中表达。胰高血糖素与其受体的结合触发G蛋白信号转导级联,激活细胞内环AMP并且导致通过从头合成(de novo synthesis)(糖异生)和糖原之降解(糖原分解)的葡萄糖输出量的增加(Wakelam等,Nature,(1986)323:68-71;Unson等,Peptides,(1989),10:1171-1177;以及Pittner和Fain,Biochem.J.(1991),277:371-378)。
Jelinek等首先分离和纯化了大鼠胰高血糖素受体(Jelinek,L.J.等(1993)Science259(5101):1614-1616)。随后,使用大鼠序列鉴别和克隆477个氨基酸的人胰高血糖素受体序列(Lok,S.等(1994)Gene140:203-209;MacNeil,D.J.等.(1994)Biochem.and Biophys.Res.Comm)。美国专利No.5,776,725公开了编码人或大鼠胰高血糖素受体的分离的核酸序列。
用胰高血糖素受体拮抗剂(如抗GCGR抗体)来靶向胰高血糖素的产生或功能可以是控制和降低血糖的一种方法,因此,可以证明其可用于治疗疾病,例如糖尿病或糖尿病酮症酸中毒。此外,通过降低血糖水平,可预防或减轻糖尿病患者体内与高血糖水平相关的某些长期并发症。
早期研究证实大鼠胰高血糖素受体的多克隆抗体能够阻断胰高血糖素的结合(Unson,C.G.(1996)PNAS93(1):310-315)。Buggy等描述了人胰高血糖素受体的单克隆抗体(Buggy,J.J.等(1995)J.Biol.Chem.270(13):7474;Buggy,J.J.等(1996)Horm Metab Res.28(5):215-9)。Buggy等描述的抗体与胰高血糖素竞争受体的激素结合位点,并且识别人和大鼠两者的胰高血糖素受体,但是不识别小鼠的受体。Wright等在小鼠体内产生了人胰高血糖素受体的单克隆抗体,并且对受体的单克隆抗体进行了详细的蛋白质结构测定(Wright,L.M.(2000)Acta Crystallographica Section D.56(5):573-580)。在以下文献中描述了胰高血糖素受体的另一些抗体:美国专利5,770,445和7,947,809;欧洲专利申请EP2074149A2;欧洲专利EP0658200B1;美国专利公开2009/0041784、2009/0252727和2011/0223160;以及PCT公开WO2008/036341。
发明概述
在第一个方面,本发明提供了完全(fully)人单克隆抗体(mAb)及其抗原结合片段,所述人单克隆抗体及其抗原结合片段与人胰高血糖素受体(human glucagon receptor,hGCGR)结合并且抑制或阻断其活性(例如,阻断胰高血糖素与其受体的结合)从而阻断血糖水平的升高。所述抗体或其抗原结合片段可用于降低患有特征为高血糖水平之疾病(例如糖尿病)的对象体内的血糖水平。所述抗体还可用于治疗许多病症和紊乱,其中期望阻断胰高血糖素与胰高血糖素受体的相互作用,因此具有有益作用。最后,所述抗体可用于预防与糖尿病患者体内的高血糖水平相关的长期并发症或改善与糖尿病患者体内的高血糖水平相关的至少一种症状。
本发明的抗体可以是全长的(例如,IgG1或IgG4抗体)或者可仅包含抗原结合片段(例如,Fab、F(ab’)2或scFv片段),并且可被修饰以影响功能(例如,清除残余的效应子功能(effector function))(Reddy等,2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
在一个实施方案中,本发明提供了与人胰高血糖素受体(hGCGR)特异性结合的分离的人抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体与人GCGR的胞外域(ectodomain)和/或胞外(extracellular,EC)环(loop)结合,其中所述胞外域是GCGR的N端结构域并且其中所述EC环是EC1、EC2和EC3中的一种或更多种。
在一个实施方案中,本发明提供了这样的抗体或其片段,其与所述N端结构域结合,所述N端结构域包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基编号27至约氨基酸残基144的氨基酸残基,或者与hGCGR的EC环结合,其中所述EC环是EC1、EC2和EC3中的一种或更多种,其中EC1包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基194至约氨基酸残基226的氨基酸残基,EC2包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基285至约氨基酸残基305的氨基酸残基;并且EC3包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基369至约氨基酸残基384的氨基酸残基。
在一个实施方案中,与hGCGR结合的人抗体或人抗体的抗原结合片段包含重链可变区(heavy chain variable region,HCVR),其具有选自SEQ ID NO:2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130和146的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列。在某些实施方案中,与hGCGR结合的抗体或抗体的抗原结合片段包含HCVR,其具有选自SEQ ID NO:34、70、86、110和126的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列。
在一个实施方案中,与hGCGR结合的人抗体或人抗体的抗原结合片段包含轻链可变区(light chain variable region,LCVR),其具有选自SEQ ID NO:10、26、42、58、68、78、88、98、108、118、128、138和148的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列。在某些实施方案中,与hGCGR结合的抗体或抗体的抗原结合片段包含LCVR,其具有选自SEQ ID NO:42、78、88、118和128的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列。
在某些实施方案中,与hGCGR结合的人抗体或其片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对,其选自SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/68、70/78、86/88、90/98、106/108、110/118、126/128、130/138和146/148。在某些实施方案中,所述HCVR/LCVR氨基酸序列对选自SEQ ID NO:34/42、70/78、86/88、110/118和126/128。
在一个相关实施方案中,本发明包括与hGCGR特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段,其中所述抗体或其片段包含重链和轻链CDR结构域,所述重链和轻链CDR结构域被包含在选自SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/68、70/78、86/88、90/98、106/108、110/118、126/128、130/138和146/148的重链和轻链序列对内。用于鉴别HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域熟知的,并且可用于鉴别本文公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴别CDR之界限的示例性协定包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言,Kabat定义基于序列可变性,Chothia定义基于结构环区的位置,AbM定义是Kabat和Chothia方法的折中。参见,例如Kabat,″Sequences of Proteins of Immunological Interest,″NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991);Al-Lazikani等,J.Mol.Biol.273:927-948(1997);和Martin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)。公共数据库也可用于鉴别抗体内的CDR序列。
在某些实施方案中,本发明提供了与hGCGR特异性结合的分离的人抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体包含HCVR,其包含三条重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3),其被包含在选自SEQ ID NO:2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130和146的HCVR序列中;以及LCVR,其包含三条轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3),其被包含在选自SEQ ID NO:10、26、42、58、68、78、88、98、108、118、128、138和148的LCVR中。
在一个实施方案中,本发明提供了与hGCGR结合的分离的人抗体或人抗体的抗原结合片段,其包含HCDR3结构域,所述HCDR3结构域具有选自SEQ ID NO:8、24、40、56、76、96、116和136的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列;以及LCDR3结构域,其具有选自SEQ ID NO:16、32、48、64、84、104、124和144的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列。
在一个实施方案中,本发明提供了这样的抗体或其片段,其还包含HCDR1结构域,所述HCDR1结构域具有选自SEQ ID NO:4、20、36、52、72、92、112和132的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列;HCDR2结构域,其具有选自SEQ ID NO:6、22、38、54、74、94、114和134的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列;LCDR1结构域,其具有选自SEQ ID NO:12、28、44、60、80、100、120和140的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列;以及LCDR2结构域,其具有选自SEQ ID NO:14、30、46、62、82、102、122和142的氨基酸序列,或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列。
在一个实施方案中,所述抗体或抗体的抗原结合片段包含:
(a)HCDR3结构域,其具有选自SEQ ID NO:8、24、40、56、76、96、116和136的氨基酸序列;和
(b)LCDR3结构域,其具有选自SEQ ID NO:16、32、48、64、84、104、124和144的氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述抗体或抗体的抗原结合片段还包含:
(c)HCDR1结构域,其具有选自SEQ ID NO:4、20、36、52、72、92、112和132的氨基酸序列;
(d)HCDR2结构域,其具有选自SEQ ID NO:6、22、38、54、74、94、114和134的氨基酸序列;
(e)LCDR1结构域,其具有选自SEQ ID NO:12、28、44、60、80、100、120和140的氨基酸序列;和
(f)LCDR2结构域,其具有选自SEQ ID NO:14、30、46、62、82、102、122和142的氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR,其包含:具有选自SEQ ID NO:4、20、36、52、72、92、112和132之一的氨基酸序列的HCDR1结构域,具有选自SEQ ID NO:6、22、38、54、74、94、114和134之一的氨基酸序列的HCDR2结构域,具有选自SEQ ID NO:8、24、40、56、76、96、116和136之一的氨基酸序列的HCDR3结构域;以及LCDR,其包含:具有选自SEQ ID NO:12、28、44、60、80、100、120和140之一的氨基酸序列的LCDR1结构域,具有选自SEQ ID NO:14、30、46、62、82、102、122和142之一的氨基酸序列的LCDR2结构域,和具有选自SEQ ID NO:16、32、48、64、84、104、124和144之一的氨基酸序列的LCDR3结构域。
在某些实施方案中,与人GCGR结合的人抗体或人抗体的抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:8/16、24/32、40/48、56/64、76/84、96/104、116/124和136/144的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。具有这些HCDR3/LCDR3对的抗GCGR抗体的非限制性实例是分别被称为H4H1345N、H4H1617N、H4H1765N、H4H1321B和H4H1321P、H4H1327B和H4H1327P、H4H1328B和H4H1328P、H4H1331B和H4H1331P、H4H1339B和H4H1339P的抗体。
在一个实施方案中,所述人抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:4、6和8的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和分别为SEQ ID NO:12、14和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述人抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:20、22和24的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和分别为SEQ ID NO:28、30和32的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述人抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:36、38和40的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和分别为SEQ ID NO:44、46和48的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述人抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:52、54和56的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和分别为SEQ ID NO:60、62和64的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述人抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:72、74和76的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和分别为SEQ ID NO:80、82和84的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述人抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:92、94和96的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和分别为SEQ ID NO:100、102和104的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述人抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:112、114和116的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和分别为SEQ ID NO:120、122和124的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述人抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQID NO:132、134和136的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列和分别为SEQ ID NO:140、142和144的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述抗hGCGR抗体或其抗原结合片段包含:HCDR1序列,其包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:202),其中X1是Gly,X2是Phe,X3是Thr,X4是Phe或Ser,X5是Ser,X6是Ser或Asn,X7是Tyr或Phe,并且X8是Asp、Leu或Gly;HCDR2序列,其包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:203),其中X1是Ile,X2是Ser、Gln、Asp或Trp,X3是Ser、Glu、Thr或Phe,X4是Asp或Ala,X5是Gly或Glu,X6是Arg、Ile或不存在,X7是Asp或Glu,并且X8是Lys或Thr;HCDR3序列,其包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21(SEQ ID NO:204),其中X1是Ala或Thr,X2是Lys或Arg,X3是Glu,X4是Met、Pro、Gly或Asp,X5是Val、Ser、Lys、Arg或不存在,X6是Tyr、His、Asn或不存在,X7是Tyr,X8是Asp或Glu,X9是Ile,X10是Leu,X11是Thr,X12是Gly,X13是Tyr、Asp或His,X14是His、Asp、Tyr或不存在,X15是Asn、Tyr、His或不存在,X16是Tyr、X17是Tyr或His,X18是Gly或Ala,X19是Met,X20是Asp,并且X21是Val或Ile;LCDR1序列,其包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6(SEQID NO:205),其中X1是Gln,X2是Gly或Ala,X3是Ile,X4是Asn或Arg,X5是Asn,并且X6是Tyr或Asp;LCDR2序列,其包含式X1-X2-X3(SEQ ID NO:206),其中X1是Thr或Ala,X2是Ala或Thr,以及X3是Ser或Phe;以及LCDR3序列,其包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:207),其中X1是Gln或Leu,X2是Gln,X3是Tyr、His或Asp,X4是Asn或Tyr,X5是Thr或Ser,X6是Tyr、Asn或His,X7是Pro,X8是Leu、Phe、Arg或不存在,并且X9是Thr。
在一个实施方案中,所述抗体或抗原结合片段与人、猴、小鼠和大鼠GCGR结合。
在一个实施方案中,所述抗体或抗原结合片段与人、猴和小鼠GCGR结合,但是不与大鼠GCGR结合。
在一个实施方案中,所述抗体或抗原结合片段与人、猴和大鼠GCGR结合,但是不与小鼠GCGR结合。
在一个实施方案中,所述抗体或抗原结合片段与人和猴GCGR结合,但是不与大鼠或小鼠GCGR结合。
在一个实施方案中,所述抗体或抗原结合片段与人GCGR结合,但是不与猴、小鼠或大鼠GCGR结合。
在一个实施方案中,本发明提供了中和hGCGR活性的完全人单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其片段表现出一种或更多种以下特征:(i)包含HCVR,其具有选自SEQ ID NO:2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130和146的氨基酸序列;(ii)包含LCVR,其具有选自SEQ ID NO:10、26、42、58、68、78、88、98、108、118、128、138和148的氨基酸序列;(iii)包含HCDR3结构域,其具有选自SEQID NO:8、24、40、56、76、96、116和136的氨基酸序列或者与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列;以及LCDR3结构域,其具有选自SEQ ID NO:16、32、48、64、84、104、124和144的氨基酸序列或者与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列;(iv)包含HCDR1结构域,其具有选自SEQ ID NO:4、20、36、52、72、92、112和132的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列;HCDR2结构域,其具有选自SEQ ID NO:6、22、38、54、74、94、114和134的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列;LCDR1结构域,其具有选自SEQ ID NO:12、28、44、60、80、100、120和140的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列;以及LCDR2结构域,其具有选自SEQ ID NO:14、30、46、62、82、102、122和142的氨基酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列;(v)与人、猴、小鼠或大鼠GCGR中的任意一种或更多种结合;(vi)可阻断或可不阻断至少一种人以外的物种中的GCGR活性;(v)表现出约10-8至约10-12的KD;(vi)使具有高血糖水平的哺乳动物体内的血糖水平降低至少约25%至约75%;(vii)可使或可不使甘油三酯水平降低至在正常哺乳动物体内观察到的水平;或者(viii)对哺乳动物体内的LDL、HDL或总胆固醇的血液水平不表现出不利影响。
在另一相关实施方案中,本发明提供了这样的抗体或其抗原结合片段,其与包含重链和轻链CDR结构域的抗体或抗原结合片段竞争与hGCGR的特异性结合,所述重链和轻链CDR结构域被包含在选自SEQID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/68、70/78、86/88、90/98、106/108、110/118、126/128、130/138和146/148的重链和轻链序列对内。
在另一相关实施方案中,本发明提供了这样的抗体或其抗原结合片段,其与hGCGR上被包含重链和轻链序列对之抗体所识别的相同表位结合,所述重链和轻链序列对选自SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/68、70/78、86/88、90/98、106/108、110/118、126/128、130/138和146/148。
在一个实施方案中,本发明提供了具有一种或更多种以下特征的抗hGCGR的抗体:
a)在以约1mg/kg至约30mg/kg的剂量施用时,能够使血糖水平在在至少7天的一段时间内降低25%至约75%;
b)在向有此治疗需要的哺乳动物施用时,能够使体重减轻至少10%;
c)在以约1mg/kg至约30mg/kg的剂量施用时,能够使血酮水平降低约25%至75%;或
d)在与对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin(proproteinconvertase subtilisin/kexin,PCSK)-9特异的抗体一起施用时,能够使血糖水平降低至少约20%至40%而不引起血脂或胆固醇显著升高,并且在治疗后至少7天内保持降低的血糖水平。
在第二个方面,本发明提供了编码抗hGCGR抗体或其片段的核酸分子。本发明还涵盖携带本发明之核酸的重组表达载体和其中引入了这样的载体的宿主细胞,以及通过在允许产生抗体的条件下培养宿主细胞并回收所产生的抗体来生产抗体的方法。
在一个实施方案中,本发明提供了包含这样的HCVR的抗体或其片段,所述HCVR由选自SEQ ID NO:1、17、33、49、65、69、85、89、105、109、125、129和145的核酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本相同序列所编码。在一个实施方案中,所述HCVR由选自SEQ ID NO:33、69、85、109和125的核酸序列所编码。
在一个实施方案中,所述抗体或其片段还包含这样的LCVR,所述LCVR由选自SEQ ID NO:9、25、41、57、67、77、87、97、107、117、127、137和147的核酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本相同序列所编码。在一个实施方案中,所述LCVR由选自SEQ ID NO:41、77、87、117和127的核酸序列所编码。
在一个实施方案中,本发明还提供了抗体或抗体的抗原结合片段,其包含:HCDR3结构域,其由选自SEQ ID NO:7、23、39、55、75、95、115和135的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列所编码;以及LCDR3结构域,其由选自SEQ ID NO:15、31、47、63、83、103、123和143的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列所编码。
在一个实施方案中,本发明提供了抗体或抗体的抗原结合片段,其包含:HCDR1结构域,其由选自SEQ ID NO:3、19、35、51、71、91、111和131的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列所编码;HCDR2结构域,其由选自SEQ ID NO:5、21、37、53、73、93、113和133的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列所编码;LCDR1结构域,其由选自SEQ ID NO:11、27、43、59、79、99、119和139的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列所编码;以及LCDR2结构域,其由选自SEQ ID NO:13、29、45、61、81、101、121和141的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列所编码。
在第三个方面,本发明的特征在于人抗hGCGR抗体或抗体的抗原结合片段,其包含:HCVR,其由来源于VH、DH和JH种系序列的核苷酸序列片段所编码;以及LCVR,其由来源于VK和JK种系序列的核苷酸序列片段所编码,它们如表2所示组合。
本发明涵盖具有经修饰之糖基化模式的抗hGCGR抗体。在一些应用中,可使用修饰以除去不期望的糖基化位点或者例如除去岩藻糖部分以增强抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity,ADCC)功能(参见,Shield等(2002)JBC277:26733)。在另一些应用中,可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(complementdependent cytotoxicity,CDC)。
在第四个方面,本发明的特征在于这样的药物组合物,其包含与hGCGR特异性结合的重组人抗体或其片段以及可药用载体或稀释剂。
在一个实施方案中,本发明的特征在于这样的组合物,其为本发明的抗体或抗体的抗原结合片段与第二治疗剂的组合。第二治疗剂可以是与本发明的抗体或其片段有利地组合的任何药剂。
在一个实施方案中,第二治疗剂可以是能够降低患有特征为高血糖水平的疾病或病症(例如,糖尿病)的患者体内的血糖或减轻至少一种所述患者之症状的药剂。
在某些实施方案中,第二治疗剂可以是有助于抵消或减轻与本发明的抗体或抗体的抗原结合片段相关之任何可能的副作用(如果应发生这样的副作用)的药剂。例如,在任何抗hGCGR抗体增加脂质或胆固醇水平的情况下,可有益地施用有效降低脂质或胆固醇水平的第二药剂。
第二治疗剂可以是小分子药物、蛋白质/多肽、抗体、核酸分子(例如反义分子)或siRNA。第二治疗剂可以是合成的或天然来源的。
在一个实施方案中,第二治疗剂可以是胰高血糖素拮抗剂或第二胰高血糖素受体拮抗剂,例如与本文所述抗体不同的胰高血糖素受体之其他抗体。还将认识到本发明的抗体和可药用组合物可用于联合治疗,也就是说,抗体和可药用组合物可在一种或更多种其他的期望治疗或医疗过程的同时、之前或之后施用。联合方案中使用的治疗方法(疗法或过程)的特定组合将考虑期望的治疗和/或过程与待实现之期望治疗效果的兼容性。还将认识到使用的治疗方法对于相同疾病可实现期望效果(例如,抗体可与用于治疗相同疾病的其他药剂同时施用)或其可实现不同效果(例如,控制任何不良作用)。如本文使用的,正常施用以治疗或预防特定疾病或病症的另外的治疗剂适合于正被治疗的疾病或病症。
在一个实施方案中,本发明的抗hGCGR抗体可用于与一种或更多种以下当前可得的2型糖尿病治疗物相组合。这些包括双胍(二甲双胍)、磺脲类(例如,格列本脲、格列吡嗪)、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)γ激动剂(吡格列酮、罗格列酮);和α葡萄糖苷酶抑制剂(阿卡波糖、伏格列波糖)。另外的治疗剂包括可注射治疗物,例如(胰高血糖素样肽1)和(普兰林肽)。
在某些实施方案中,组合物可包含选自以下的第二治疗剂:非磺酰脲促分泌素、胰岛素、胰岛素类似物、唾液素-4多肽(exendin-4polypeptide)、β3肾上腺素能受体激动剂、PPAR激动剂、二肽基肽酶IV抑制剂、他汀类和含他汀的组合、胆固醇摄取和/或胆汁酸再吸收的抑制剂、LDL-胆固醇拮抗剂、胆固醇酯转移蛋白拮抗剂、内皮素受体拮抗剂、生长激素拮抗剂、胰岛素增敏剂、糊精(amylin)模拟物或激动剂、大麻素受体拮抗剂、胰高血糖素样肽-1激动剂、黑皮质素、黑色素聚集激素受体激动剂、SNRI、成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor21,FGF21)模拟物(参见,例如US20110002845和US20080261236)、成纤维细胞生长因子受体1c(fibroblast growth factor receptor1c,FGFR1c)激动剂(参见,例如US20110150901)、晚期糖基化终产物形成的抑制剂,例如但不限于:氨基胍和蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂。
在某些实施方案中,组合物可包含有助于降低脂质或胆固醇水平的第二药剂,并可包含例如3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂(例如,他汀,如阿托伐他汀氟伐他汀洛伐他汀匹伐他汀普伐他汀瑞舒伐他汀和辛伐他汀等)的药剂。
在某些实施方案中,可有益地联合以下的一种或更多种来施用本发明的抗体:(1)烟酸,其增加脂蛋白分解代谢;(2)贝特类或两亲性羧酸,其降低低密度脂蛋白(LDL)水平,提高高密度脂蛋白(HDL)和TG水平,并且降低非致命性心脏病发作的数量;以及(3)LXR转录因子的活化剂,其在胆固醇消除中具有重要作用,例如22-羟基胆固醇,或固定组合,例如(依泽替米贝和辛伐他汀);烟酸与他汀的固定组合(例如,烟酸与洛伐他汀)、他汀与胆汁树脂(例如,消胆胺、考来替泊、考来维仑);或其他降脂药如Ω3脂肪酸乙酯(例如,omacor)。此外,第二治疗剂可以是一种或更多种的胰高血糖素或GCGR之其他抑制剂,以及其他分子的抑制剂,例如血管生成素样蛋白质3(ANGPTL3)、血管生成素样蛋白质4(ANGPTL4)、血管生成素样蛋白质5(ANGPTL5)、血管生成素样蛋白质6(ANGPTL6),其涉及脂质代谢,特别是胆固醇和/或甘油三脂的体内平衡。这些分子的抑制剂包括与这些分子特异性结合并阻断其活性的小分子和抗体。
在某些实施方案中,可有益地与抑制hPCSK9之活性的核酸(例如反义分子、双链RNA或siRNA分子)联合来施用本发明的抗GCGR抗体。US2011/0065644、US2011/0039914、US2008/0015162和US2007/0173473中描述了抑制PCSK9之活性的示例性核酸分子。
在某些实施方案中,可有益地与特异性结合hPCSK9并且抑制其活性的抗体联合来施用本发明的抗hGCGR抗体,从而抑制所述hPCSK9的活性,其中这样的抗体作用是降低脂质或胆固醇水平。US2010/0166768中描述了示例性抗hPCSK9抗体。可以以约0.01mg/kg至约30mg/kg的剂量施用与人PCSK9特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段。其可作为单剂量或作为多剂量施用。抗hPCSK9抗体可与抗GCGR抗体同时施用,或者可在抗GCGR抗体之前或之后施用。
在一个实施方案中,待与本发明的抗体联合使用的第二治疗剂包含与人PCSK9特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗hPCSK9抗体包含:三条重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3),其被包含在选自SEQ ID NO:173和177之HCVR序列的任一个中;以及三条轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3),其被包含在选自SEQ ID NO:175和185之LCVR序列的任一个中。
在一个实施方案中,与人PCSK9特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:173和177的重链可变区(HCVR)。
在一个实施方案中,与人PCSK9特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:175和185的轻链可变区(LCVR)。
在一个实施方案中,与人PCSK9特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段包含具有选自SEQ ID NO:173和177之氨基酸序列的HCVR和具有选自SEQ ID NO:175和185之氨基酸序列的LCVR。
在一个实施方案中,与人PCSK9特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR),其中HCVR/LCVR序列对选自SEQ ID NO:173/175和SEQ ID NO:177/185。
在一个实施方案中,与人PCSK9特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段包含:HCDR1,其包含选自SEQ ID NO:161和179的氨基酸序列;HCDR2,其包含选自SEQ ID NO:163和181的氨基酸序列;HCDR3,其包含选自SEQ ID NO:165和183的氨基酸序列;LCDR1,其包含选自SEQ ID NO:167和187的氨基酸序列;LCDR2,其包含选自SEQ ID NO:169和189的氨基酸序列;以及LCDR3,其包含选自SEQ IDNO:171和191的氨基酸序列。
在某些实施方案中,用于与本发明的抗GCGR抗体联合的hPCSK9抗体由本文所述核酸分子编码。例如,在一个实施方案中,本发明提供了抗hPCSK9抗体或其片段,其包含HCVR,其由选自SEQ ID NO:172和176的核酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本相同序列编码;以及LCVR,其由选自SEQ ID NO:174和184的核酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本相同序列编码。
在一个实施方案中,本发明提供了待与本发明的抗GCGR抗体联合使用的抗hPCSK9抗体,其中所述抗PCSK9抗体或其片段包含:HCDR1结构域,其由选自SEQ ID NO:160和178的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列编码;HCDR2结构域,其由选自SEQ ID NO:162和180的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列编码;HCDR3结构域,其由选自SEQ ID NO:164和182的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列编码;LCDR1结构域,其由选自SEQ ID NO:166和186的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列编码;LCDR2结构域,其由选自SEQ ID NO:168和188的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列编码;以及LCDR3结构域,其由选自SEQ ID NO:170和190的核苷酸序列或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的基本相似序列编码。
当共施用多种治疗剂时,如相关领域所认识的,可相应地调节剂量。
在第五个方面,本发明的特征在于使用本发明的抗hGCGR抗体或抗体的抗原结合部分用于抑制hGCGR活性的方法,其中治疗方法包括施用治疗有效量的包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明的抗体可用于治疗通过消除、抑制或降低hGCGR活性而改善、减轻、抑制或预防的任何病症或紊乱。预期可单独使用本发明的抗体或作为已知为用于治疗患有以血糖或血酮水平升高为部分特征之疾病或病症(例如但不限于糖尿病)的标准治疗之其他药剂或方法的辅助治疗。这样的标准治疗方法可包括流体施用或施用可用于降低血糖、酮或脂质或用于减重的任何其他药剂。
本发明的抗hGCGR抗体可作用于阻断胰高血糖素与其受体之间的相互作用,从而抑制胰高血糖素的升糖作用(glucose elevating effect)。使用胰高血糖素受体拮抗剂(例如本文所述抗体)可以是实现正常葡萄糖水平的有效方法,从而减轻或预防与例如糖尿病相关的一种或更多种症状或长期并发症。使用胰高血糖素受体拮抗剂(例如本文所述抗体)还可以是实现非糖尿病患者体内正常葡萄糖水平的有效发方法,所述非糖尿病患者患有由非糖尿病相关的病症或紊乱导致的高血糖症,例如围术期高血糖症(仅在手术之前或手术之后在患者体内观察到高血糖症)。在某些实施方案中,预期使用本发明的抗体来降低糖尿病酮症酸中毒的血糖水平或血酮水平的方法。在某些实施方案中,还预期使用本发明的抗体的治疗患者以实现体重减轻或预防体重增加或保持正常体重的方法。
本发明的抗体还可用于减轻病症(例如葡萄糖耐量受损、肥胖)或用于治疗糖尿病病症或者用于预防或降低与糖尿病相关的任意一种或更多种长期并发症的严重性,所述并发症例如肾病、神经病、视网膜病、白内障、中风、动脉粥样硬化、伤口愈合受损以及本领域技术人员已知的与糖尿病相关的其他并发症。
可通过本发明的治疗方法治疗的其他病症或紊乱包括糖尿病酮症酸中毒、高血糖症(包括围术期高血糖症、特护病房患者高血糖症和高渗高血糖症综合征)、高胰岛素血症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合症、空腹血糖受损,或与高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高血脂症和一般血脂异常相关的高血糖症。在某些实施方案中,本发明提供了如本文所述对GCGR特异的分离的抗体或其抗原结合片段,其用于降低血糖或血酮水平,或者用于治疗患有与高血糖或高血酮水平相关或以高血糖或高血酮水平为部分特征之疾病或病症的患者,其中所述病症或疾病选自糖尿病、葡萄糖耐量受损、肥胖、肾病、神经病、视网膜病、白内障、中风、动脉粥样硬化、伤口愈合受损、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高渗综合征、围术期高血糖症、特护病房患者高血糖症、高胰岛素血症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合症和空腹血糖受损。在某些实施方案中,考虑使用本发明的分离的抗体或抗原结合片段来制备药物,所述药物用于降低血糖或血酮水平,或者用于治疗患有与高血糖或高血酮水平相关或以高血糖或高血酮水平为部分特征之疾病或病症的患者,或者用于减轻这样的疾病或病症的至少一种症状,其中所述病症或疾病选自任意的上述疾病或病症。
所述抗体还可用于治疗患有不能手术的胰高血糖素瘤(具有或不具有坏死松懈性游走性红斑(necrolytic migratory erythema)和高血糖症的胰腺内分泌肿瘤)的患者。
通过接下来的发明详述的论述,其他实施方案将变得显而易见。
附图说明
图1:示出了当单独或联合给药时施用H4H1327P(抗GCGR抗体)和/或H1H316P(抗PCSK9抗体)后,C57BL6小鼠体内血糖水平的百分比变化。对照(带有X的实线);3mg/kg H4H1327P(带有■的实线);10mg/kgH4H1327P(带有▲的实线);10mg/kgH1H316P(带有的实线);3mg/kg H4H1327P+10mg/kg H1H316P(带有◆的虚线);10mg/kgH4H1327P+10mg/kgH1H316P(带有○的虚线)。
图2示出了当单独或联合给药时施用H4H1327P和/或H1H316P后,C57BL6小鼠体内的血浆LDL-C水平。对照(带有X的实线);3mg/kgH4H1327P(带有■的实线);10mg/kg H4H1327P(带有▲的实线);10mg/kg H1H316P(带有的实线);3mg/kg H4H1327P+10mg/kg H1H316P(带有◆的虚线);10mg/kgH4H1327P+10mg/kgH1H316P(带有○的虚线)。
图3示出了当单独或联合给药时施用H4H1327P和/或H1H316P后,C57BL6小鼠体内的血浆HDL-C水平。对照(带有X的实线);3mg/kgH4H1327P(带有■的实线);10mg/kg H4H1327P(带有▲的实线);10mg/kg H1H316P(带有的实线);3mg/kg H4H1327P+10mg/kg H1H316P(带有◆的虚线);10mg/kgH4H1327P+10mg/kgH1H316P(带有○的虚线)。
图4示出了当单独或联合给药时施用H4H1327P和/或H1H316P后,C57BL6小鼠体内的总血浆胆固醇水平。对照(带有X的实线);3mg/kgH4H1327P(带有■的实线);10mg/kg H4H1327P(带有▲的实线);10mg/kg H1H316P(带有的实线);3mg/kg H4H1327P+10mg/kg H1H316P(带有◆的虚线);10mg/kgH4H1327P+10mg/kgH1H316P(带有○的虚线)。
图5示出了当单独或联合给药时施用H4H1327P和/或H1H316P后,C57BL6小鼠体内的血浆甘油三酯水平。对照(带有X的实线);3mg/kgH4H1327P(带有■的实线);10mg/kg H4H1327P(带有▲的实线);10mg/kg H1H316P(带有的实线);3mg/kg H4H1327P+10mg/kg H1H316P(带有◆的虚线);10mg/kgH4H1327P+10mg/kgH1H316P(带有○的虚线)。
图6示出了当单独或联合给药时施用H4H1327P和/或H1H316P后,C57BL6小鼠体内的肝脏甘油三酯水平。对照(X);3mg/kgH4H1327P(■);10mg/kg H4H1327P(▲);10mg/kg H1H316P3mg/kgH4H1327P+10mg/kg H1H316P(◆);10mg/kg H4H1327P+10mg/kgH1H316P(○)。
发明详述
在描述本发明方法之前,应理解本发明不限于所描述的特定方法和实验条件,因为这样的方法和实验条件可以改变。还应理解本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的,而不是旨在限制,因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
除非另外定义,否则本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域一般技术人员的通常理解相同的意思。虽然在本发明的实施或测试中可使用与本文所描述的方法和材料相似或等效的那些,但是现在描述优选的方法和材料。
定义
“胰高血糖素受体”(在本文中也称作“GCGR”)属于G蛋白偶联受体2类家族,由长的氨基端胞外结构域(参见,编码N端胞外结构域的DNA的SEQ ID NO:158和N端胞外结构域的氨基酸序列的SEQ ID NO:159)、7个跨膜片段和细胞内C端结构域(Jelinek等,Science259:1614-1616(1993),Segre等,Trends Endocrinol.Metab4:309-314(1993))组成。胰高血糖素受体主要在肝细胞表面表达,在该处其与胰高血糖素结合并且将因此提供的信号转导到细胞内。因此,术语“胰高血糖素受体”也指特异性与胰高血糖素相互作用以产生生物信号的一种或更多种受体。在本领域内已分离和公开了编码大鼠和人源胰高血糖素受体的DNA序列(EP0658200B1)。还公开并且测序了鼠类(murine)和食蟹猴(cynomolgusmonkey)同源物(homologue)(Burcelin等,Gene164(1995)305-310);McNally等,Peptides25(2004)1171-1178)。如本文所使用的,“胰高血糖素受体”和“GCGR”可交换地使用。本文使用的表述“GCGR”、“hGCGR”或其片段是指人GCGR蛋白质或其片段,除非特别指出来源于非人物种,例如“小鼠GCGR”、“大鼠GCGR”或“猴GCGR”。此外,本文使用的“GCGR”或“hGCGR”是指具有SEQ ID NO:157所示核酸序列和SEQ IDNO:153之氨基酸序列的人GCGR或其生物学活性片段。有多个GCGR基因相关的序列,其具有以下基因银行保藏号(Genbank AccessionNumber):NP_000151.1(人)、NP_742089.1(大鼠)、XP_001111894.1(猕猴)和NP_032127.2(小鼠)。本文公开的另一些序列包括人GCGR(SEQ ID NO:153)、小鼠GCGR(SEQ ID NO:154)、食蟹猴GCGR(SEQID NO:155)、大鼠GCGR(SEQ ID NO:156)。在某些实施方案中,可在本发明中使用的融合蛋白可包括SEQ ID NO:149(hGCGR-hFc,与人IgG的Fc区融合的NP_000151.1的残基27-144)、SEQ ID NO:150(hGCGR-hFc,与人IgG的Fc区融合的NP_000151.1的残基27-144)、SEQ ID NO:151(hGCGR-mmH,与myc-myc-his标签融合的NP_000151.1的残基27-144)和SEQ ID NO:152(MfGCGR-hFc,其包含食蟹猴Mf的N端序列,与猕猴(Macaca mulatta)的GCGR的残基27-144相同,具有保藏号XP_001111894.1,并且其与人IgG的Fc区融合)。
本文使用的术语“人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型”或“hPCSK9”是指由SEQ ID NO:192所示核酸序列编码并且具有SEQ IDNO:193的氨基酸序列的hPCSK9或其生物活性片段。
本文使用的术语“抗体”旨在指包含通过二硫键相互连接之四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子(即“完全抗体分子”)以及其多聚体(例如IgM)或其抗原结合片段。每条重链包含重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(包含结构域CH1、CH2和CH3)。每条轻链包含轻链可变区(“LCVR”或“VL”)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区还可以细分成称为互补决定区(CDR)的超变区,其间具有称为框架区(FR)的较保守区域。每条VH和VL由3个CDR和4个FR构成,其由氨基端至羧基端按照以下顺序排布:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的某些实施方案中,抗GCGR抗体(或其抗原结合片段)的FR可与人种系序列相同,或者可以是天然的或人工修饰的。可基于两个或更多个CDR的并排分析来确定氨基酸共有序列。
也可以替换一个或更多个CDR残基或省略一个或更多个CDR。科学文献中已经描述了这样的抗体,其中一个或两个CDR对于结合是可以舍弃的。Padlan等(1995FASEB J.9:133-139)基于公开的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区,推断实际上仅有约五分之一至三分之一的CDR残基与抗原接触。Padlan还发现了许多这样的抗体,其中的一个或两个CDR不具有与抗体接触的氨基酸(同样参见,Vajdos等2002J MolBiol320:415-428)。
可基于之前的研究(例如,CDRH2中的残基H60-H65通常是不需要的)通过分子建模和/或经验地从位于Chothia CDR外部的Kabat CDR区域鉴别未与抗原接触的CDR残基。如果省略了CDR或其残基,通常用占据另一人抗体序列或这样的序列的一致序列中的对应位置的氨基酸来替换。还可凭经验选择CDR内用于替换的位置和待替换的氨基酸。经验替换可以是保守或非保守替换。
与相应种系序列相比,本文公开的完全人抗GCGR抗体可在重链和轻链可变结构域的框架区和/或CDR区包含一个或更多个氨基酸替换、插入和/或缺失。这样的突变可通过将本文公开的氨基酸序列与可得自例如公共抗体序列数据库的种系序列进行比较来容易地确定。本发明包括来源于本文公开的任意氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段,其中一个或更多个框架区和/或CDR区内的一个或更多个氨基酸被突变成抗体来源之种系序列的相应残基,或者突变成另一人种系序列的相应残基,或者突变成相应种系残基的保守氨基酸替换(本文将这样的序列改变统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列出发可容易地生产包含一个或更多个单独种系突变或其组合的多种抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中,VH和/或VL结构域中的全部框架和/或CDR残基突变回抗体来源的原种系序列中存在的残基。在另一些实施方案中,仅某些残基突变回原种系序列,例如,仅在FR1的前8个氨基酸中或FR4的后8个氨基酸中存在突变残基,或仅在CDR1、CDR2或CDR3中存在突变残基。在另一些实施方案中,一个或更多个框架和/或CDR残基突变成不同种系序列(即,与抗体最初来源的种系序列不同的种系序列)的相应残基。此外,本发明的抗体可包含框架区和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任何组合,例如,其中某些单个残基突变成特定种系序列的相应残基,而与原种系序列不同的某些其他残基被保留或突变成不同种系序列的相应残基。一旦得到,可容易地测试包含一个或更多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或更多种期望性质,例如提高的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或竞争生物学性质(可根据具体情况)、降低的免疫原性等。以这种一般方式得到的抗体和抗原结合片段被涵盖在本发明内。
本发明还包括这样的抗hGCGR抗体,其包含具有一个或更多个保守替换的任何本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体。例如,本发明包括具有这样的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗hGCGR抗体,所述HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列相对于本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸替换。
本文使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人mAb可例如在CDR并且特别是CDR3中包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过随机或体外位点特异性突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是,本文使用的术语“人抗体”不旨在包括这样的mAb,所述mAb中来源于其他哺乳动物物种种系(例如,小鼠)的CDR序列被移植到人FR序列上。本发明的抗人GCGR抗体也称作“抗hGCGR”或“抗GCGR”。
术语“特异性结合”等是指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合用至少约1×10-6M或以下(例如,较小的KD表明较紧密的结合)的平衡解离常数表征。确定两分子是否特异性结合的方法是本领域熟知的,包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。但是,与hGCGR特异性结合的分离的抗体可表现出与其他抗原(例如来源于其他物种的GCGR分子)的交叉反应性。此外,然而如本文所使用的,与hGCGR以及一个或更多个另外的抗原结合的多特异性抗体或与hGCGR的两个不同区域结合的双特异性被认为是与hGCGR“特异性结合”的抗体。
术语“高亲和力”抗体是指如通过表面等离子体共振(例如,BIACORETM或溶液亲和力ELISA)测量的,与hGCGR具有如下结合亲和力(表示为KD)的那些mAb:至少10-9M,优选10-10M,更优选10-11M,甚至更优选10-12M。
术语“缓慢解离速率(slow off rate)”、“Koff”或“kd”是指如通过表面等离子体共振(例如,BIACORETM)所确定的以1×10-3s-1或以下,优选1×10-4s-1或以下的速率常数与hGCGR分离的抗体。
本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括与抗原特异性结合以形成复合物的任何天然形成的、可酶促得到的、合成的或基因改造的多肽或糖蛋白。本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”、“抗体片段”等是指抗体保持与hGCGR特异性结合之能力的一个或更多个片段。
一些具体实施方案,本发明的抗体或抗体片段可与治疗部分缀合(“免疫缀合物”),例如第二GCGR拮抗剂、或双胍(二甲双胍)、磺酰脲(例如,格列本脲、格列吡嗪)、PPARγ激动剂(例如,吡格列酮或罗格列酮)、α葡萄糖苷酶抑制剂(例如,阿卡波糖或伏格列波糖)、(胰高血糖素样肽1)、(普兰林肽)、化疗剂、放射性同位素或可用于治疗部分地由不期望的胰高血糖素活性引起的疾病或病症的其他任何治疗部分。
本文使用的“分离的抗体”旨在指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体(Ab)的抗体(例如,与hGCGR特异性结合的分离的抗体或其片段基本不含与hGCGR之外的抗原特异性结合的Ab)。
本文使用的“阻断抗体”或“中和抗体”(或“中和GCGR活性的抗体”)旨在指与hGCGR结合导致抑制GCGR的至少一种生物活性的抗体。例如,本发明的抗体可有助于防止与胰高血糖素水平之升高相关的血糖水平的升高。或者,本发明的抗体可表现出阻断响应胰高血糖素的cAMP之产生的能力。GCGR之生物活性的这种抑制可通过用本领域已知的数种标准体外或体内测定中的一种或更多种测量GCGR生物活性的一种或更多种指标来评估(见以下实施例)。
本文使用的术语“表面等离子体共振”是指一种光学现象,其允许通过例如使用BIACORETM系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化来分析实时生物分子相互作用。
本文使用的术语“KD”旨在指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”是指与抗体分子的可变区中的特定抗原结合部位(被称为互补位(paratope))相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有不止一个表位。因此,不同抗体可结合于抗原上的不同区域且可具有不同的生物效应。术语“表位”还指抗原上B细胞和/或T细胞响应的部位。其还指结合抗体的抗原区域。表位可以定义为结构的或功能的。功能表位一般为结构表位的子集,并且具有直接有助于相互作用之亲和力的残基。表位还可以是构象的,即由非线性氨基酸构成。在某些实施方案中,表位可包括是分子的化学活性表面基团的决定簇,所述基团例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基,并且在某些实施方案中,可具有特定的三维结构特性和/或特定电荷特性。
当提及核酸或其片段时,术语“基本一致”或“基本相同”表示当与另一核酸(或其互补链)以合适的核苷酸插入或缺失最佳比对(align)时,在至少约90%,更优选至少约95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸碱基中存在核苷酸序列一致性(如通过任何熟知的序列一致性算法(例如下文讨论的FASTA、BLAST或GAP)测量的)。在某些情况下,与参照核酸分子基本相同的核酸分子可编码具有与参照核酸分子编码之多肽相同或基本相似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时,术语“基本相似”或“基本类似”是指当最佳比对时(例如通过使用缺省间隙重量(default gap weight)的程序GAP或BESTFIT),两种肽序列具有至少90%的序列一致性,甚至更优选至少95%、98%或99%的序列一致性。优选地,不一致的残基位置因保守氨基酸替换而不同。“保守氨基酸替换”是氨基酸残基被含具有相似化学性质(例如,电荷或疏水性)之侧链(R基)的另一氨基酸残基替换。通常,保守氨基酸替换基本不改变蛋白质的功能性质。当两个或更多个氨基酸序列因保守替换而彼此不同时,可向上调节相似性百分比或程度以校正替换的保守性。用于进行这种调节的方法是本领域技术人员熟知的。例如,参见Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。含具有相似化学性质之侧链的氨基酸的实例组包括:(1)脂肪族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;(2)脂肪羟基侧链:丝氨酸和苏氨酸;(3)含酰胺侧链:天冬酰胺和谷氨酰胺;(4)芳香族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸:(5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸和组氨酸;(6)酸性侧链:天冬氨酸和谷氨酸;以及(7)含硫侧链:半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换组是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者,保守替换是在Gonnet等(1992)Science256:144345中公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250log-likelihood matrix)中具有正值的任何改变。“适度保守(moderately conservative)”替换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何改变
通常使用序列分析软件测量多肽的序列相似性。蛋白质分析软件使用分配给多种替换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸替换)的相似性测量来匹配相似序列。例如,GCG软件包含程序如GAP和BESTFIT,其可用缺省参数来确定密切相关的多肽(例如来源于不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质和其突变体之间的序列同源性或序列一致性。参见,例如GCG6.1版。也可用使用缺省或推荐参数的FASTA(GCG6.1版中的一个程序)比较多肽序列。FASTA(例如,FASTA2和FASTA3)提供了查询序列与研究序列之间最佳重叠区的比对和序列一致性百分比(Pearson(2000),同上)。当将本发明的序列与包含大量来源于不同生物体的序列的数据库进行比较时,另一优选算法是使用缺省参数的计算机程序BLAST,尤其是BLASTP或TBLASTN。参见,例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403410和(1997)Nucleic Acids Res.25:3389402。
在一些具体实施方案中,本发明方法中使用的抗体或抗体片段可以是单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可对一个靶多肽的不同表位特异或可包含对多于一种靶多肽表位特异的抗原结合结构域。可在本发明的情况下使用的示例性双特异性抗体形式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域,其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸,并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比,至少一个氨基酸的差异降低双特异性抗体与蛋白质A的结合。在一个实施方案中,第一Ig CH3结构域与蛋白质A结合,并且第二Ig CH3结构域包含降低或消除与蛋白质A的结合的突变,例如H95R修饰(通过IMGT外显子编号;通过EU编号的H435R)。第二CH3还可包含Y96F修饰(通过IMGT;通过EU的Y436F)。可在第二CH3中存在的另一些修饰,其包括:IgG1mAb情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(通过IMGT;通过EU的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I);IgG2mAb情况下的N44S、K52N和V82I(IMGT;通过EU的N384S、K392N和V422I);以及IgG4mAb情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(通过IMGT;通过EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。本发明的范围中预期了上述双特异性抗体形式的变体。
短语“治疗有效量”是指产生期望效果的施用量。精确量将取决于治疗目的,并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见,例如,Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding)。“正常葡萄糖水平”是指人体内低于约80mg/dL的空腹水平平均血浆葡萄糖值和低于约110-120mg/dL的餐后水平平均血浆葡萄糖值。可根据Etgen等(Metabolism2000;49(5):684-688)确定血浆葡萄糖或根据D′Orazio等(Clin.Chem.Lab.Med.2006;44(12):1486-1490)由转换全血葡萄糖浓度计算血浆葡萄糖。“胆固醇正常化”或“正常胆固醇水平”是指人体内的约低于200mg/dL的总胆固醇水平,认为约200-240mg/dL为边界高度。由总正常胆固醇,认为人体内约100至约129mg/dL的平均LDL值是正常的,并且认为高于约45mg/dL的HDL值是正常的。人体内的正常甘油三酯水平低于150mg/dL。正常总/HDL之比小于4.5,正常LDL/HDL之比小于3。这些值可根据标准实验室实践确定(另见,Friedewald,WT,Clin.Chem(1972),18:499-502;Chen,Y.等Lipids HealthDis.(2010);9:52;Keevil,JG等,Circulation(2007),115:1363-1370;和Bairaktari,E.等,Clin.Biochem.(2000),33:549-555)。在本发明的某些实施方案中,抗GCGR抗体可用于使血糖水平降低至正常范围内。在本发明的某些实施方案中,抗GCGR抗体可用于升高HDL-C水平。在本发明的某些实施方案中,抗GCGR抗体可用于降低甘油三酯水平。
一般说明
由于胰高血糖素通过经胰高血糖素受体的信号转导发挥其生理作用,所以胰高血糖素受体可以是糖尿病和其他胰高血糖素相关的代谢紊乱的潜在治疗靶点。使用胰高血糖素受体拮抗剂(例如本文描述的抗体)可以是实现正常葡萄糖水平从而减轻或预防与糖尿病相关的一种或更多种症状或长期并发症的有效方法。本发明的抗体还可用于减轻与例如葡萄糖耐量受损相关的病症、用于治疗肥胖症、用于预防体重增加、用于治疗代谢综合征或用于治疗糖尿病病症(包括糖尿病酮症酸中毒)或用于预防和/或降低发生与糖尿病相关的任一种或更多种并发症的风险,所述并发症例如肾病、神经病、视网膜病、白内障、中风、动脉粥样硬化、伤口愈合受损以及本领域技术人员已知的与糖尿病相关的其他并发症。
使用本文所述抗hGCGR抗体还可用于治疗其他病症,包括高血糖症、高血糖高渗综合征(Stoner,G.D.,American Family Physician,(2005),71(9):1723-1730;Diabetes Spectrum,Umpierrez,G.E.,(2002),15(1):28-36;Nugent,B.W.,Emergency Medicine Clinics of North America,(2005),23:629-648)、围术期高血糖症(Frisch,A.等,Diabetes Care,(2010),33(8):1783-1788;Hanazaki,K.等,World J Gastroenterol,(2009),15(33):4122-4125;Smiley,D.D.等,Southern Medical Journal,(2006),99(6):580-589;Hermanides,J.等,The Netherlands J.of Med.67(6):226-229;Maerz,L.L.等,Current Opinion in Critical Care,(2011),17:370-375)、特护病房患者高血糖症(Gunst,J.等,Seminars in Dialysis,(2010),23(2):157-162;Losser,M-R.,Critical care,(2010),14:231)、高胰岛素血症和胰岛素抵抗综合征以及胰高血糖素瘤(具有或不具有坏死松懈性游走性红斑和高血糖症的胰腺内分泌肿瘤)(参见例如,Boden,G.等,NEngl J Med(1986);314:1686-1689)。
在某些实施方案中,本发明的抗体获自通过第一免疫原(primaryimmunogen)免疫然后通过第二免疫原(secondary immunogen)免疫的小鼠。免疫原可以是表达GCGR蛋白或其生物活性片段的细胞系或编码GCGR蛋白或其活性片段的DNA或GCGR蛋白或其活性片段。例如,在某些实施方案中,第一免疫原可以是使用本领域已知的标准程序改造以过表达全长hGCGR的细胞系(例如,小鼠MG87细胞系)。或者,可使用以下来实施DNA免疫:编码全长hGCGR(例如,来源于保藏号NP_000151.1的hGCGR结构)的DNA或编码其生物活性片段的DNA(例如,编码GCGR的N端结构域的DNA(参见,例如SEQ ID NO:158,其编码SEQ ID NO:159))或者可溶性N端蛋白质(其包括SEQ ID NO:159的可溶性N端蛋白质,或跨越SEQ ID NO:153之残基27-144的氨基酸)。第二免疫原可以是GCGR蛋白或其生物活性片段或融合蛋白,例如hGCGR-mmH(REGN547,SEQ ID NO:151)或hGCGR-hFc(REGN315,SEQ ID NO:150;REGN316,SEQ ID NO:149)。
在本发明的某些实施方案中,可使用具有SEQ ID NO:159所示氨基酸序列的N端结构域(不具有信号序列)或GCGR的任意一种或更多种胞外域(例如,任意一种或更多种胞外区)(或其片段)制备与GCGR结合并且抑制其功能(例如,其与胰高血糖素结合的能力,该能力导致血糖水平降低)的抗体。
SEQ ID NO:153示出了人GCGR的全长氨基酸序列。信号肽跨越SEQ ID NO:153的氨基酸残基1-26,N端结构域跨越SEQ ID NO:153的氨基酸残基27-144,胞外域1(EC1)跨越SEQ ID NO:153的氨基酸残基194-226,胞外域2(EC2)跨越SEQ ID NO:153的氨基酸残基285-305,并且胞外域3(EC3)跨越SEQ ID NO:153的氨基酸残基369-384。
在某些实施方案中,可使用上述胞外区的片段,或从本文所述区域的N或C端中一者或两者通过约5至约20个氨基酸残基延伸到指定区域之外的肽来制备与GCGR特异性结合的抗体。在某些实施方案中,可使用上述区域或其片段的任意组合来制备GCGR特异性抗体。在某些实施方案中,可使用GCGR的任意一个或更多个上述区域或其片段来制备单特异性、双特异性或多特异性抗体。
抗体的抗原结合片段
除非另外特别指出,否则应将本文使用的术语“抗体”理解为涵盖包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的抗体分子(即,“完全抗体分子”)以及其抗原结合片段。本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括与抗原结合以形成复合物的任何天然存在、可酶促得到、合成或基因改造的多肽或糖蛋白。本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗体片段”是指保持与hGCGR的特异性结合能力之抗体的一个或更多个片段。抗体片段可包括Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段、dAb片段、包含CDR的片段或分离的CDR。抗体的抗原结合片段可使用任何合适的标准技术(例如蛋白裂解消化或涉及操作和表达编码抗体可变结构域和(任选地编码)恒定结构域之DNA的重组基因工程技术)来源于例如完整抗体分子。这样的DNA是已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA库(包括例如噬菌体-抗体库)得到或可以被合成。可对DNA进行测序以及使用化学方法或通过使用分子生物学技术对DNA进行操作,例如以将一个或更多个可变和/或恒定结构域排列成合适的构型或引入密码子,产生半胱氨酸残基,修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括:(i)Fab片段;(ii)F(ab′)2片段;(iii)Fd片段;(iv)Fv片段;(v)单链Fv(scFv)分子;(vi)dAb片段;和(vii)由模拟抗体的超变区的氨基酸残基(例如,分离的互补决定区(CDR)如CDR3肽)或经限制的(constrained)FR3-CDR3-FR4肽组成的最小识别单位。另一些经改造分子也被涵盖在本发明所使用的表述“抗原结合片段”内,所述经改造分子例如:结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、微小抗体(minibodies)、纳米抗体(例如,单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(small modular immunopharmaceutical,SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域(shark variable IgNAR domain)。
抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任意大小或氨基酸组成,并且一般将包含至少一个CDR,其与一个或更多个框架序列相邻或与它们同框(in frame)。在具有与VL结构域相关的VH结构域的抗原结合片段中,VH和VL结构域可以以任何合适的排列彼此相对定位。例如,可变区可以是二聚的并且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者,抗体的抗原结合片段可以包含单体的VH或VL结构域。
在某些实施方案中,抗体的抗原结合片段可包含与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可在本发明抗体的抗原结合片段中存在的可变结构域和恒定结构域的非限制示例性构型包括:(i)VH-CH1;(ii)VH-CH2;(iii)VH-CH3;(iv)VH-CH1-CH2;(v)VH-CH1-CH2-CH3;(vi)VH-CH2-CH3;(vii)VH-CL;(viii)VL-CH1;(ix)VL-CH2;(x)VL-CH3;(xi)VL-CH1-CH2;(xii)VL-CH1-CH2-CH3;(xiii)VL-CH2-CH3;和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中(包括以上所列任意示例性构型),可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可通过完整或部分铰链或接头区连接。铰链区可由至少2个(例如,5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成,其形成单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。此外,本发明的抗体的抗原结合片段可包含以上列出的任何可变结构域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体),它们彼此之间和/或与一个或更多个单体VH或VL结构域非共价连接(例如,通过二硫键)。
对于完全抗体分子,抗原结合片段可以是单特异性或多特异性(例如,双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变结构域,其中各可变结构域能够与分别的抗原或同一抗原上的不同表位特异性结合。可使用本领域可利用的常规技术使任何多特异性抗体形式(包括本文公开的示例性双特异性抗体形式)适用于本发明抗体的抗原结合片段的情况中。
人抗体的制备
在转基因小鼠中产生人抗体的方法是本领域中已知的。可将任何这样的已知方法用于本发明的情况中来制备与人GCGR特异性结合的人抗体。
使用VELOCIMMUNETM技术(参见,例如US6,596,541,RegeneronPharmaceuticals,)或用于产生单克隆抗体的任何其他已知方法,最先分离具有人可变区和小鼠恒定区的对GCGR的高亲和力嵌合抗体。技术包括产生转基因小鼠,其具有包含与内源小鼠恒定区基因座可操作地连接的人重链和轻链可变区的基因组,从而使得小鼠响应抗原刺激产生包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。分离编码抗体的重链和轻链之可变区的DNA,并且与编码人重链和轻链恒定区的DNA可操作地连接。然后使DNA在能够表达完全人抗体的细胞中表达。
一般地,用目标抗原刺激小鼠,并且从表达抗体的小鼠中回收淋巴细胞(例如B细胞)。可将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以制备永生的杂交瘤细胞系,筛选并选择这样的杂交瘤细胞系以鉴别产生对目标抗原特异之抗体的杂交瘤细胞系。可分离编码重链和轻链之可变区的DNA,并且与重链和轻链的期望的同型恒定区连接。可在细胞如CHO细胞中产生这样的抗体蛋白。或者,可从抗原特异性淋巴细胞中直接分离编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链的可变结构域的DNA。
最初分离具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。如在下文实验部分中所述,对抗体进行表征并且根据期望特性(包括亲和力、选择性、表位等)进行选择。将小鼠恒定区替换成期望的人恒定区以产生本发明的完全人抗体,例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。尽管所选择的恒定区可根据特定用途而改变,但是高亲和的抗原结合和靶标特异性特征存在于可变区。
一般来说,本发明的抗体具有非常高的亲和力,当通过与固定在固相上或溶液相中的抗原结合来测量时,通常具有约10-12至约10-9M的KD。将小鼠恒定区替换成期望的人恒定区以产生本发明的完全人抗体。虽然所选择的恒定区可根据特定用途而改变,但是高亲和的抗原结合和靶标特异性特征存在于可变区。
生物等效性
本发明的抗GCGR抗体和抗体片段涵盖这样的蛋白质,其具有与所描述抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列,但是其保持与人GCGR结合的能力。当与亲本序列(parent sequence)比较时,这样的变体抗体和抗体片段包含一个或更多个氨基酸的添加、缺失或替换,但是表现出与所描述抗体的生物活性基本等效的生物活性。同样地,本发明的编码抗GCGR抗体的DNA序列涵盖这样的序列,当与所公开的序列比较时,其包含一个或更多个核苷酸的添加、缺失或替换,但是其编码与本发明的抗GCGR抗体或抗体片段基本生物等效的抗GCGR抗体或抗体片段。
例如,如果两种抗原结合蛋白或抗体是药物等效物或药物替代物(pharmaceutical alternative)(在相似实验条件下以相同的摩尔剂量(单剂量或多剂量)施用时,它们的吸收速率和程度不具有显著差异),那么认为它们是生物等效的。如果一些抗体在其吸收程度上等效但是在其吸收速率上不同,那么将认为它们是等效物或药物替代物,并且也可认为是生物等效的,这是因为吸收速率中这样的差异是蓄意的并且反映在标记上,在例如长期使用时不是必需达到有效身体药物浓度,并且认为对于所研究的特定药物产品是医学上不显著的。
在一个实施方案中,如果两种抗原结合蛋白在其安全性、纯度和效力上没有临床上有意义的差异,那么它们就是生物等效的。
在一个实施方案中,如果患者可以在参照产品与生物产品之间切换一次或更多次,与持续治疗而不切换相比没有预计的不良作用风险增加(包括免疫原性的临床显著变化)或效力降低,那么这两种抗原结合蛋白质是生物等效的。
在一个实施方案中,如果两种抗原结合蛋白在使用条件方面通过共同的作用机理来起作用(在这样的机理是已知的程度内),那么它们是生物等效的。
可通过体内和/或体外方法证明生物等效性。生物等效性的测量包括:例如(a)人或其他哺乳动物的体内测试,其中测量作为时间之函数的血液、血浆、血清或其他生物流体中的抗体或其代谢物的浓度;(b)已经与人体内生物利用度数据相关并且对其有合理的预测性的体外测试;(c)人或其他哺乳动物的体内测试,其中测量作为时间之函数的抗体(或其靶标)的适当急性药理效果;和(d)建立抗体的安全性、效力或生物利用度或生物等效性的良好控制的临床实验。
可通过例如进行残基或序列的多种替换或者缺失对于生物活性不必须的末端或内部残基或序列来构建本发明抗GCGR抗体的生物等效变体。例如,缺失对生物活性不必须的半胱氨酸残基或将其替换成其他氨基酸,以防止通过复性形成不需要的或错误的分子内二硫键。在另一些情况下,生物等效抗体可包括抗GCGR抗体的变体,其包含修饰抗体之糖基化特性的氨基酸变化,例如消除或除去糖基化的突变。
抗体的生物学特性
一般而言,本发明的抗体可通过与hGCGR的至少一个胞外区结合来起作用。在某些实施方案中,本发明的抗体可与位于至少N端区域的表位或与位于hGCGR的至少一个胞外(EC)环内的表位结合。
在某些实施方案中,本发明的抗体可通过与胞外N端区(SEQ IDNO:159中所示的氨基酸序列,由SEQ ID NO:158中所示的核酸序列编码)结合以阻断或抑制GCGR活性来起作用。
在某些实施方案中,本发明的抗体可通过与整个受体内的至少一个EC环或环片段结合以阻断或抑制GCGR活性来起作用。在一个实施方案中,本发明的抗体可与位于EC1中的表位结合,其位于SEQ ID NO:153的约氨基酸残基194至约氨基酸残基226。或者,或另外地,本发明的抗体可与EC2中存在的表位结合,其位于SEQ ID NO:153的约氨基酸残基285至约氨基酸残基302。或者,或另外地,本发明的抗体可与EC3中存在的表位结合,其位于SEQ ID NO:153的约氨基酸残基369至约氨基酸残基384。
在某些实施方案中,本发明的抗体可以是双特异性抗体。本发明的双特异性抗体可与EC1内的一个表位结合,并且还可与hGCGR中EC1以外的区域内的一个表位结合。在某些实施方案中,本发明的双特异性抗体可与EC1中的一个表位结合,并且还可与hGCGR的EC2或EC3,或者N端区域,或者EC1、EC2或EC3内的任意其他区域内,或者其任何组合的一个表位结合。在某些实施方案中,本发明的双特异性抗体可与同一胞外区内的两个不同部位结合。
更特别地,本发明的抗GCGR抗体可展现出以下一种或更多种特性:(1)与人GCGR或其片段结合并且与非人(例如,小鼠、猴、大鼠、兔、狗、猪等)GCGR或其片段结合的能力;(2)与人GCGR或其片段结合但不与非人(例如,小鼠、猴、大鼠、兔、狗、猪等)GCGR或其片段结合的能力;(3)与人GCGR或其片段和非人灵长类(例如,猴)GCGR或其片段结合但不与小鼠、大鼠、兔、狗或猪GCGR或GCGR片段结合的能力;(4)与人GCGR或其片段和非人灵长类(例如,猴)GCGR或其片段结合并且与小鼠GCGR或其片段结合,但不与大鼠GCGR结合的能力;(5)与人GCGR或其片段和非人灵长类(例如,猴)GCGR或其片段结合并且与大鼠GCGR或其片段结合,但不与小鼠GCGR结合的能力;(6)阻断胰高血糖素与GCGR的结合;(7)阻断胰高血糖素诱导的cAMP的产生;(8)表现出降低患有糖尿病的人和糖尿病动物模型体内之血糖水平的能力;(9)可以使或可以不使甘油三酯水平降低至在正常动物中观察到的水平;或(10)不会不利地影响血浆脂质水平。
本发明的某些抗GCGR抗体在体外或体内测试中能够抑制或减弱GCGR活性。可使用本领域技术人员已知的任何标准方法测量本发明的抗体与GCGR结合或抑制胰高血糖素与GCGR的结合的能力,所述方法包括结合测定、报告基因生物测定(reporter bioassay)(如荧光素酶报告基因测定)。
本文实施例4和5举例说明了用于测量GCGR活性的非限制性示例性体外测定。在实施例4中,通过表面等离子体共振确定人抗hGCGR抗体的结合亲和力和动力学常数,并且在T100Biacore仪器上进行测量。在实施例5中,在表达全长人、猴和小鼠GCGR连同荧光素蛋白酶报告基因的HEK293细胞系中进行生物测定,以便通过Gαs来检测活化和随后的cAMP水平和转录活化的升高。实施例6、7、8、9和10表明了在多个动物模型中抗体降低血糖水平、血酮水平和体重减轻的体内效果。
本发明还包括与任一以下蛋白质或肽的至少一个生物活性片段结合的抗GCGR抗体及其抗原结合片段:SEQ ID NO:153(全长hGCGR),SEQ ID NO:153的残基编号27-144(hGCGR的N端结构域);SEQ IDNO:153的残基194-226;SEQ ID NO:153的残基285-305;SEQ ID NO:153的残基369-384。可使用本文所述的任意GCGR肽或其片段以产生抗GCGR抗体。
可修饰肽以包含某些残基的添加或替换,以便标记或为了与载体分子(例如,KLH)缀合的目的。例如,可在肽的N端或C端末端添加半胱氨酸,或者可添加接头序列制备用于免疫的与例如KLH缀合的肽。对GCGR特异的抗体可不包含另外的标记或部分或者其可包含N端或C端标记或部分。在一个实施方案中,标记或部分为生物素。在结合测定中,标记(若有的话)的位置可决定肽相对于使肽连接其上之表面的方向。例如,如果表面包被有抗生物素蛋白,那么包含N端生物素的肽将被定向以使肽的C端部分将远离表面。
在一个实施方案中,本发明提供了与hGCGR特异性结合或中和hGCGR的活性的完全人单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其片段表现出一种或更多种以下特性:(i)包含这样的HCVR,所述HCVR具有选自SEQ ID NO:2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130和146的氨基酸序列;(ii)包含这样的LCVR,所述LCVR具有选自SEQ ID NO:10、26、42、58、68、78、88、98、108、118、128、138和148的氨基酸序列;(iii)包含:选自4、20、36、52、72、92、112和132的任意一个或更多个重链CDR1序列;选自6、22、38、54、74、94、114和134的任意一个或更多个重链CDR2序列;选自8、24、40、56、76、96、116和136的任意一个或更多个重链CDR3序列;选自12、28、44、60、80、100、120和140的任意一个或更多个轻链CDR1序列;选自14、30、46、62、82、102、122和142的任意一个或更多个轻链CDR2序列;选自16、32、48、64、84、104、124和144的任意一个或更多个轻链CDR3序列;以及它们的组合;(iv)表现出对以下任意一项或更多项的结合特异性:包含SEQ ID NO:153的氨基酸残基27-144的GCGR的N端区域,或GCGR的任意一种或更多种胞外环,其包括例如EC1、EC2或EC3,其中EC1包含SEQ ID NO:153的约残基194至约残基226的氨基酸残基,其中EC2包含SEQ ID NO:153的约残基285至约残基305的氨基酸残基,其中EC3包含SEQ ID NO:153的约残基369至约残基384的氨基酸残基;(v)与人、猴、小鼠或大鼠GCGR中任意一种或更多种结合;(vi)阻断胰高血糖素与GCGR的结合;(vi)阻断胰高血糖素诱导的cAMP的产生;(vii)表现出降低患有糖尿病的人和糖尿病动物模型中之血糖水平或血酮水平的能力;(viii)可以使或可以不使甘油三酯水平降低至在正常动物中观察到的水平;或(ix)不会不利地影响血浆脂质水平。
表位作图(Epitope Mapping)及相关技术
为了筛选与特定表位结合的抗体,可实施例如在Antibodies,Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中描述的常规交叉阻断测定。另一些方法包括丙氨酸扫描突变体(alaninescanning mutant)分析、肽印迹(peptide blot)分析(Reineke(2004)Methods Mol Biol248:443-63)或肽切割(peptide cleavage)分析。此外,可使用方法如表位切除(epitope excision)、表位提取(epitope extraction)和抗原的化学修饰(Tomer(2000)Protein Science9:487-496)。
术语“表位”是指B和/或T细胞响应的抗原部位。B细胞表位可由相邻氨基酸或由通过蛋白质的三级折叠并列的非相邻氨基酸形成。由相邻氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常被保留,而由三级折叠形成的表位在用变性溶剂的处理通常被丢失。表位通常在独特的空间构型中包括至少3个,更通常地至少5或8至10个氨基酸。
修饰辅助谱(Modification-Assisted Profiling,MAP),也称作基于抗原结构的抗体谱(Antigen Structure-based Antibody Profiling,ASAP),是根据每一抗体对于化学修饰或酶修饰抗原表面的结合谱的相似性对针对相同抗原的大量单克隆抗体(mAb)进行分类的方法(见US2004/0101920)。每一类可反映独特表位,其与用另一类表示的表位明显不同或部分重叠。这种技术允许快速过滤基因相同的抗体,使得表征可集中于基因不同的抗体。当应用于杂交瘤筛选时,MAP可有助于识别产生具有期望特性之mAb的稀有杂交瘤克隆。MAP可用于将本发明的抗GCGR抗体分类成与不同表位结合的抗体组。
在某些实施方案中,抗GCGR抗体或抗体的抗原结合片段与GCGR的至少一个GCGR胞外区内的表位或其片段结合,其中所述胞外区是如前描述的N端结构域或一个EC环(包括EC1、EC2或EC3)。
在一个实施方案中,抗体与GCGR的N端区内的表位或其片段结合,其包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基27-144的氨基酸序列。在一个实施方案中,抗体与EC1内的表位或其片段结合,其包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基194-226的氨基酸序列。在一个实施方案中,抗体与EC2内的表位或其片段结合,其包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基285-305的氨基酸序列。在一个实施方案中,抗体与EC3内的表位或其片段结合,其包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基369-384的氨基酸序列。
在某些实施方案中,所述抗体或抗体片段与这样的表位结合,其包含N端结构域内,或者EC1、EC2或EC3内,和/或两个或三个不同胞外区内的多于一个的所列举之GCGR表位,例如,N端区、EC1、EC2和EC3环内的表位,或EC1、EC2和EC3内的表位,或N端区、EC2和EC3环内的表位。或N端区、EC1和EC3环内的表位。
在某些实施方案中,所述抗体是双特异性抗体,其与GCGR的一个胞外区内的一个表位结合并且与GCGR的不同胞外区(包括N端结构域、或EC1、EC2或EC3)内的另一个表位结合。
在一个实施方案中,所述抗体是双特异性抗体,其与hGCGR的N端区内的一个表位以及hGCGR的EC1内的另一个表位结合。在一个实施方案中,抗体是双特异性抗体,其与hGCGR的N端区内的一个表位以及GCGR的EC1内的另一个表位结合。在一个实施方案中,抗体是双特异性抗体,其与hGCGR的N端区内的一个表位以及hGCGR的EC2内的另一个表位结合。在一个实施方案中,抗体是双特异性抗体,其与hGCGR的N端区内的一个表位以及hGCGR的EC3内的另一个表位结合。在一个实施方案中,抗体是双特异性抗体,其与hGCGR的EC1内的一个表位以及hGCGR的EC2内的另一个表位结合。在一个实施方案中,抗体是双特异性抗体,其与hGCGR的EC1内的一个表位以及hGCGR的EC3内的另一个表位结合。在一个实施方案中,抗体是双特异性抗体,其与hGCGR的EC2内的一个表位以及hGCGR的EC3内的另一个表位结合。
在一个实施方案中,所述抗体是双特异性抗体,其与hGCGR的N端结构域内的一个表位以及hGCGR的EC1内的第二表位结合,其中所述一个表位为SEQ ID NO:153的约残基27至约残基144,其中所述第二表位为SEQ ID NO:153的约残基编号194至约残基编号226。在一个实施方案中,所述抗体是双特异性抗体,其与上述残基内的hGCGR的N端结构域内的一个表位以及hGCGR的EC2内的第二表位结合,其中所述第二表位为SEQ ID NO:153的约残基编号285至约残基编号305。在一个实施方案中,所述抗体是双特异性抗体,其与上述残基内的hGCGR的N端结构域内的一个表位和hGCGR的EC3内的第二表位结合,其中所述第二表位为SEQ ID NO:153的约残基编号369至约残基编号384。
在一个实施方案中,所述抗体是双特异性抗体,其与SEQ ID NO:153的约残基194至约残基226之hGCGR的EC1内的一个表位以及SEQID NO:153的约残基285至约残基305之GCGR的EC2内的第二表位结合。在一个实施方案中,所述抗体是双特异性抗体,其与SEQ ID NO:153的约残基194至约残基226之hGCGR的EC1内的一个表位以及SEQ IDNO:153的约残基369至约残基384之GCGR的EC3内的第二表位结合。在一个实施方案中,抗体是双特异性抗体,其与SEQ ID NO:153的约残基285至约残基305的EC2内的一个表位以及SEQ ID NO:153的约残基369至约残基384的GCGR的EC3内的第二表位结合。
本发明还包括与本文描述的任何特定示例性抗体(例如,H4H1345N、H4H1617N、H4H1765N、H4H1321B和H4H1321P、H4H1327B和H4H1327P、H4H1328B和H4H1328P、H4H1331B和H4H1331P、H4H1339B和H4H1339P等)结合相同表位的抗GCGR抗体。同样地,本发明还包括与本文描述的任何特定示例性抗体竞争结合GCGR或GCGR片段的抗GCGR抗体。
可使用本领域已知的常规方法容易地确定抗体是否与参照抗GCGR抗体结合相同表位或与参照抗GCGR抗体竞争结合。例如,为了确定测试抗体是否与本发明的参照抗GCGR抗体结合相同表位,在饱和条件下使参照抗体与GCGR蛋白质或肽结合。接下来,评价测试抗体与GCGR分子结合的能力。如果测试抗体在GCGR与参照抗GCGR抗体饱和结合后还能够与GCGR8结合,那么可推断测试抗体与参照抗GCGR抗体结合于不同表位。另一方面,如果测试抗体在GCGR与参照抗GCGR抗体饱和结合后不能与GCGR分子结合,那么测试抗体可结合于与本发明的参照抗GCGR抗体结合的表位相同的表位。
为了确定抗体是否与参照抗GCGR抗体竞争结合,以两个方向实施上述结合方法学:在第一方向,使参照抗体在饱和条件下与GCGR分子结合,之后评估测试抗体与GCGR分子的结合。在第二方向,使测试抗体在饱和条件下与GCGR分子结合,之后评估参照抗体与GCGR分子的结合。如果在两个方向下,仅第一(饱和)抗体能够与GCGR分子结合,那么推断测试抗体与参照抗体竞争结合GCGR。如本领域一般技术人员将理解的,与参照抗体竞争结合的抗体可能不一定与参照抗体结合相同的表位,而可以通过结合重叠或相邻表位来立体阻断参照抗体的结合。
如果两种抗体的每一种都竞争性抑制(阻断)另一种与抗原的结合,那么这两种抗体结合相同或重叠表位。也就是说,如在竞争性结合测定中测量的,1、5、10、20或100倍过量的一种抗体抑制另一种抗体至少50%,但优选75%、90%或甚至99%的结合(参见,例如Junghans等,CancerRes.1990:50:1495-1502)。或者,如果抗原中基本所有降低或消除一种抗体的结合的氨基酸突变均降低或消除另一种抗体的结合,那么这两种抗体具有相同的表位。如果降低或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合,那么这两种抗体具有“重叠表位”。
可实施另外的常规实验(例如,肽突变和结合分析)来确认所观察到的测试抗体的结合缺乏实际上是否是由于与参照抗体结合于相同表位,或者观察到的结合的缺乏是否是出于立体阻碍(或其他现象)的原因。该类实验可使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或本领域可利用的任意其他定量或定性抗体结合测定来实施。
物种选择性和物种交叉反应性
根据本发明的某些实施方案,抗GCGR抗体与人GCGR结合但是不与其他物种的GCGR结合。或者,在某些实施方案中,本发明的抗GCGR抗体与人GCGR和来自一种或更多种非人物种的GCGR结合。例如,本发明的抗GCGR抗体可与人GCGR结合,并且可根据情况与以下一种或更多种物种的GCGR结合或不结合:小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴、绒猴、恒河猴或黑猩猩。
免疫缀合物
本发明涵盖与治疗部分(例如,能够降低血糖水平的药剂、放射性同位素或化疗剂)缀合的人抗GCGR单克隆抗体(“免疫缀合物”)。可与抗GCGR抗体缀合的治疗部分的种类将考虑待治疗的病症和期望实现的治疗效果。例如,为了治疗糖尿病或者期望使血糖降低和/或保持正常血糖水平的任何其他病症,可将药剂如双胍(例如,二甲双胍)、磺酰脲(例如,格列本脲、格列吡嗪)、PPARγ激动剂(例如,吡格列酮、罗格列酮)、α葡萄糖苷酶抑制剂(例如,阿卡波糖、伏格列波糖)、高级糖基化终产物形式的抑制剂(例如,氨基胍)或第二GCGR抑制剂与GCGR抗体缀合。或者,如果期望的治疗效果是治疗与糖尿病相关的后遗症或症状或由高的或不受控制的血糖水平导致的任何其他病症,可有利地与适于治疗病症的后遗症或症状的药剂缀合,适于形成免疫缀合物的药剂的实例是本领域已知的,参见例如WO05/103081。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可对一个靶多肽的不同表位特异或可包含对不止一种靶多肽特异的抗原结合结构域。参见,例如Tutt等,1991,J.Immunol.147:60-69;Kufer等,2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本发明的抗GCGR抗体可与另一功能分子(如另一肽或蛋白质)连接或共表达。例如,抗体或其片段可与一个或更多个其他分子实体(例如其他抗体或抗体片段)功能性连接(例如,通过化学偶联、基因融合、非共价缔合等)以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如,本发明包括这样的双特异性抗体,其中免疫球蛋白的一条臂对人GCGR或其片段特异,并且免疫球蛋白的另一条臂对第二治疗靶标特异或与治疗部分缀合。在本发明的某些实施方案中,免疫球蛋白的一条臂对hGCGR或其片段的N端结构域上的表位特异,并且免疫球蛋白的另一条臂对hGCGR或其片段的一个EC环上的表位特异。在某些实施方案中,免疫球蛋白的一条臂对一个EC环或其片段特异,并且第二条臂对第二EC环或其片段特异。在某些实施方案中,免疫球蛋白的一条臂对hGCGR的一个EC环上的一个表位特异,并且另一条臂对hGCGR的同一EC环上的第二表位特异。
可在本发明的情况下使用的示例性双特异性抗体形式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域,其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸,并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比,至少一个氨基酸的差异降低双特异性抗体与蛋白质A的结合。在一个实施方案中,第一Ig CH3结构域与蛋白质A结合,第二Ig CH3结构域包含降低或消除结合蛋白质A的突变,例如H95R修饰(通过IMGT外显子编号;通过EU编号的H435R)。第二CH3还可包含Y96F修饰(通过IMGT,通过EU的Y436F)。可在第二CH3中存在的另一些修饰包括:IgG1抗体情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(通过IMGT;通过EU的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I);IgG2抗体情况下的N44S、K52N和V82I(IMGT;通过EU的N384S、K392N和V422I);以及IgG4抗体情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(通过IMGT;通过EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。本发明的范围中预期了上述双特异性抗体形式的变体。
治疗性施用和制剂
本发明提供了包含本发明的抗GCGR抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。根据本发明的治疗组合物的施用将与合适的载剂、赋形剂和被包含在制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等的其他药剂一起施用。可在所有药剂师已知的处方中发现大量的合适制剂:Remington′sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括例如:散剂、糊剂、软膏剂、胶冻剂、蜡状物、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(emulsions carbowax)(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和包含碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等″Compendium of excipients for parenteral formulations″PDA(1998)J Pharm Sci Technol52:238-311。
抗体的剂量可根据以下因素而不同:待施用对象的年龄和体型、目标疾病、病症、施用途径等。当使用本发明的抗体来降低与GCGR活性相关的多种病症和疾病(例如糖尿病)中的血糖水平时,在成年患者中,有利地通常以约0.01至约30mg/kg体重,更优选约0.02至约7,约0.03至约5或约0.05至约3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本发明的抗体。根据病症的严重程度,可调节治疗的频率和持续时间。在某些实施方案中,可以以至少约0.1mg至约800mg,约1至约500mg,约5至约300mg,或约10至约200mg、至约100mg、或至约50mg的初始剂量施用本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中,可在初始剂量之后第二次或多次施用近似等于或小于初始剂量的随后剂量的抗体或其抗原结合片段,其中所述随后剂量分成至少1天至3天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少12周或至少14周。
多种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的药物组合物,例如封装在脂质体中、微粒、微囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞(参见,例如Wu等,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于:真皮内、透皮、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。可通过任何方便的途径施用组合物,例如,通过灌输或快速浓注(bolus injection),通过上皮或粘膜衬里(例如,口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收来施用,并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。
还可以在囊泡中(特别是脂质体)中递送药物组合物(参见,例如,Langer(1990),Science249:1527-1533)。
在某些情况下,可在受控的释放系统中递送药物组合物。在一个实施方案中,可使用泵。在另一个实施方案中,可使用聚合物材料。在另一个实施方案中,受控的释放系统可放置在组合物之靶标的附近,从而仅需要系统剂量的一部分。
可注射制剂可包含用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可通过公知的方法制备。例如,可例如通过将上述抗体或其盐在通常用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化来制备可注射制剂。对于用于注射的水性介质,有例如生理盐水,包含葡萄糖和其他助剂等的等渗溶液等,其可与适当的增溶剂如醇(例如,乙醇)、多元醇(例如,丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如,聚山梨醇80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。对于油性介质,使用例如芝麻油、豆油等,其可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。如此制备的注射剂优选装填在合适的安瓿瓶中。
可利用标准针和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。此外,对于皮下递送,已容易地将笔型递送装置应用于递送本发明的药物组合物。这样的笔型递送装置可以是可重复利用的或一次性的。可重复利用的笔型递送装置通常使用含有药物组合物可替换药筒(cartridge)。一旦药筒中的全部药物组合物被施用而且药筒为空的,可容易地丢弃空药筒并且替换成含有药物组合物的新药筒。然后可重新利用笔型递送装置。在一次性笔型递送装置中,没有可替换药筒。相反,一次性笔型递送装置预装填有容纳在装置内的贮库(reservoir)中的药物组合物。一旦贮库内没有药物组合物,就丢弃整个装置。
多种可重复利用的笔型和自动注射递送装置应用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但当然不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX75/25TM笔、HUMALOGTM pen、HUMALIN70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI,II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPENJUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)等。用于本发明药物组合物的皮下递送的一次性笔型递送装置的实例包括但当然不限于SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousands Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs,AbbottPark IL)等。
有利地,将用于上述经口或胃肠外使用的药物组合物制备成符合活性成分剂量的单位剂量剂型。这样的单位剂量剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。所包含的前述抗体的量一般为每单位剂量剂型约5至约500mg;尤其在注射的形式下,优选包含前述抗体约5至约100mg和约10至约250mg(对于其他剂型)。
抗体的治疗用途
由于本发明的抗体与胰高血糖素受体的相互作用,所述抗体可用于降低血糖水平以及用于治疗其中有益地阻断胰高血糖素与其受体之相互作用的广泛病症和失调。这些失调和病症可选自任何胰高血糖素相关的代谢失调,其涉及导致紊乱的病理生理学或对于紊乱之稳态响应的胰高血糖素受体信号传导。因此,抗体可用于例如预防、治疗或减轻内分泌系统、中枢神经系统、周围神经系统、心血管系统、肺系统和胃肠系统的疾病或病症或相关症状或后遗症,同时减少和/或消除与当前治疗相关的一种或更多种不期望的副作用。胰高血糖素相关的代谢紊乱包括但不限于:1型和2型糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖症高渗综合征、围术期高血糖症、特护病房患者高血糖症、高胰岛素血症、餐后高血糖症、空腹血糖受损(IFG)、代谢综合征、高低钾血症、低LDL/HDL比率、饮食失调、体重增加、糖尿病导致的肥胖、小儿糖尿病、妊娠期糖尿病、糖尿病晚期并发症、微量/大量清蛋白尿、肾病、视网膜病、神经病、糖尿病足部溃疡、伤口愈合、葡萄糖耐量受损(IGT)、胰岛素抵抗综合征、综合征X、胰高糖素瘤、胃肠紊乱、肥胖、肥胖导致的糖尿病等。本发明还提供了:治疗哺乳动物体中由过量胰高血糖素导致之病症的方法;抑制哺乳动物中胰高血糖素受体的方法;抑制哺乳动物中胰高血糖素受体介导的细胞响应的方法,或者降低哺乳动物中血糖水平的方法,其包括向有此治疗需要的哺乳动物施用胰高血糖素受体-抑制量的抗GCGR抗体或其生物活性片段。
本发明的抗体有效降低空腹和餐后两种状态下的血糖。在本发明的某些实施方案中,本抗体用于制备用于治疗2型糖尿病的药物组合物。在本发明的另一个实施方案中,本抗体用于制备用于延迟或预防由葡萄糖耐量受损向2型糖尿病之发展的药物组合物。在本发明的另一个实施方案中,本抗体用于制备用于延迟或预防由不需要胰岛素的糖尿病向需要胰岛素的糖尿病发展的药物组合物。在本发明的另一个实施方案中,本抗体用于制备用于治疗1型糖尿病的药物组合物。这样的治疗通常伴随有胰岛素治疗。
联合疗法
联合疗法可包括本发明的抗hGCGR抗体和可有利地与本发明的抗体或与本发明的抗体的生物活性片段相组合的任何另外的治疗剂。
例如,可使用第二治疗剂以在患有特征为高血糖水平之疾病或病症(例如糖尿病)的患者中有助于进一步降低血糖水平或减少至少一种症状。这样的第二药剂可选自,例如,胰高血糖素拮抗剂或另外的GCGR拮抗剂(例如,抗胰高血糖素或抗GCGR抗体或者胰高血糖素或GCGR的小分子抑制剂),或者可包含可用于治疗糖尿病或与高血糖水平或糖代谢受损相关或由其导致的疾病或病症的另一些治疗部分,或者可用于治疗与高的和/或不受控制的血糖水平相关之任何长期并发症的药剂。这些药剂包括:降低肝脏中的葡萄糖的产生并增加对胰岛素之敏感性的双胍(例如,二甲双胍)或刺激胰岛素的产生的磺酰脲(例如格列本脲、格列吡嗪)。旨在维持葡萄糖稳态的另外的治疗物包括作为胰岛素增敏剂的PPARγ激动剂(例如吡格列酮、罗格列酮)以及减慢淀粉吸收和葡萄糖产生的α葡萄糖苷酶抑制剂(例如,阿卡波糖、伏格列波糖)。另外的治疗物包括可注射治疗物,例如(胰高血糖素样肽1)和(普兰林肽)。
在某些另外的实施方案中,组合物可包含选自以下的第二药剂:非磺酰脲促分泌素、胰岛素、胰岛素类似物、唾液素4多肽、β3肾上腺受体激动剂、PPAR激动剂、二肽基肽酶IV抑制剂、他汀和含他汀的组合、胆固醇吸收抑制剂、LDL-胆固醇拮抗剂、胆固醇酯转移蛋白拮抗剂、内皮素受体拮抗剂、生长激素拮抗剂、胰岛素增敏剂、糊精模拟物或激动剂、大麻素(cannabinoid)受体拮抗剂、胰高血糖素样肽1激动剂、黑皮质素、黑色素浓集激素受体激动剂、SNRI和蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂。
在某些另外的实施方案中,联合疗法可包括施用第二药剂以抵消施用本发明的抗体所导致的任何潜在副作用(如果这样的副作用发生)。例如,在任何抗GCGR抗体升高脂质或胆固醇水平的情况下,可有益地施用第二药剂以降低脂质或胆固醇水平,使用药剂例如:HMG-CoA还原酶抑制剂(例如他汀,如阿托伐他汀氟伐他汀洛伐他汀匹伐他汀普伐他汀瑞舒伐他汀和辛伐他汀)。或者,本发明的抗体可与药剂如(其为他汀与另外的药剂(例如依泽替米贝/辛伐他汀)的制剂)组合。
在某些实施方案中,可有益地组合以下任意一种或更多种来施用本发明的抗体:(1)烟酸,其增加脂蛋白分解代谢;(2)贝特类或两亲性羧酸,其降低低密度脂蛋白(LDL)水平,提高高密度脂蛋白(HDL)和TG水平,并且降低非致命性心脏病发作的次数;和(3)LXR转录因子活化剂,其在胆固醇消除中发挥作用,例如22-羟胆固醇,或烟酸与他汀的固定组合(例如,烟酸与洛伐他汀)、他汀与胆酸树脂(例如,消胆胺、考来替泊、考来维仑);或与其他降脂药组合,例如Ω-3脂肪酸乙酯(例如,omacor)。
此外,第二治疗剂可以是胰高血糖素或GCGR的一种或更多种其他抑制剂以及其他分子的抑制剂,所述其他分子例如血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)、血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)、血管生成素样蛋白5(ANGPTL5)、血管生成素样蛋白6(ANGPTL6),其涉及脂质代谢,特别是胆固醇和/或甘油三酯稳态。这些分子的抑制剂包括与这些分子特异性结合并且阻断其活性的小分子和抗体。
在某些实施方案中,可有益地与作用是降低脂质或胆固醇水平的抗体联合来施用本发明的抗体,所述降低脂质或胆固醇水平的抗体例如但不限于,例如,任何抗PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型)抗体,例如US2010/0166768中描述的那些。以下专利中描述了另一些抗PCSK9抗体:US2010/0040611、US2010/0041102、US2010/0040610、US2010/0113575、US2009/0232795、US2009/0246192、US2010/0233177、US2009/0142352、US2009/0326202、US2010/0068199、US2011/0033465、US2011/0027287、US2010/0150937、US2010/0136028和WO2009/055783。
在某些实施方案中,可有益地与抑制PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型)之活性的核酸(如反义分子、双链RNA或siRNA分子)联合来施用本发明的抗GCGR抗体。US2011/0065644、US2011/0039914、US2008/0015162和US2007/0173473中描述了抑制PCSK9之活性的示例性核酸分子。
另外的治疗上活性组分可在施用本发明的抗GCGR抗体之前、同时或之后施用。为了本公开的目的,这样的施用方案被认为是与第二治疗上活性组分“联合”施用抗GCGR抗体。
抗体的诊断用途
本发明的抗GCGR抗体还可用于检测和/或测量样品中的GCGR,例如为了诊断目的。例如,抗GCGR抗体或其片段可用于诊断特征为GCGR之异常表达(例如,过表达、表达不足、表达缺乏等)的病症或疾病。GCGR的示例性诊断测定可包括例如:使获得自患者的样品与本发明的抗GCGR抗体接触,其中抗GCGR抗体标记有可检测标记或报告分子,或者用作捕捉配体以选择性从患者样品中分离GCGR蛋白。或者,可将未标记的抗GCGR抗体与本身被可检测地标记的第二抗体组合用于诊断应用。可检测的标记或报告分子可以是放射性同位素,例如3H、14C、32P、35S或125I;荧光或化学发光部分,例如异硫氰酸荧光素或若丹明;或者酶,例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可用于检测或测量样品中的GCGR的具体示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
可用于根据本发明的GCGR诊断测定的样品包括可获得自患者的任何组织或流体样品,其在正常或病理条件下包含可检测量的GCGR蛋白或其片段。一般而言,将测量获得自健康患者(例如,未患有与异常GCGR水平或活性相关之疾病或病症的患者)的特定样品中的GCGR水平以初始地建立GCGR水平的基线或标准。然后可将GCGR的基线水平与在获得自被怀疑患有GCGR相关疾病或病症或与该疾病或病症相关之症状的个体的样品中测量的GCGR水平进行比较。
实施例
提出以下实施例以向本领域一般技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开内容和描述,并且不旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已经尽力确保所使用数值(例如,量、温度等)的精确度,但是应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外明确指出,否则份是指重量份,分子量是平均分子量,温度是摄氏度,压力是大气压或接近大气压。
实施例1人GCGR的人抗体的产生
可使用包括以下任意之一的免疫原产生hGCGR的抗体。例如,在某些实施方案中,使用表达hGCGR的细胞作为免疫原以产生hGCGR的抗体。此外,在某些实施方案中,使用编码hGCGR的DNA作为免疫原以制备本发明的抗体。此外,在某些实施方案中,使用包含hGCGR的N端结构域之氨基酸序列的肽作为免疫原以产生人GCGR的抗体。此外,在某些实施方案中,可使用包含hGCGR的任意胞外环区EC1、EC2或EC3之氨基酸序列的肽作为免疫原以产生人GCGR的抗体。将如上所述用作免疫原的细胞、DNA或肽与刺激免疫应答的佐剂一起直接施用至小鼠,所述小鼠包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA。通过GCGR特异性免疫测定来监测抗体的免疫应答。当实现期望的免疫应答时,收集脾细胞并且与小鼠骨髓瘤细胞融合以保存其生存力并且形成杂交瘤细胞系。筛选和选择杂交瘤细胞系以鉴别产生GCGR特异性抗体的细胞系。使用该技术和上述多种免疫原,得到数种抗GCGR嵌合抗体(即,具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体);以该方法产生的某些示例性抗体名称为H4H1345N、H4H1617N和H4H1765N。
如在U.S.2007/0280945A1中的描述,还直接从抗原阳性B细胞(不与骨髓瘤细胞融合)中直接分离抗GCGR抗体。使用该方法得到数种完全人抗GCGR抗体(即,具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体);以该方法产生的示例性抗体名称如下:H4H1321B、H4H1321P、H4H1327B、H4H1327P、H4H1328B、H4H1328P、H4H1331B、H4H1331P、H4H1339B和H4H1339P。
以下提出的实施例中详细描述了根据本实施例之方法产生的示例性抗GCGR抗体的生物学性质。
实施例2重链和轻链可变区的氨基酸序列
表1给出了所选择的抗GCGR抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列对及其对应的抗体标识。具有相同数值之抗体名称但是字母后缀N、B或P不同的抗体是指具有含相同的CDR序列但是在CDR序列之外的区域(即,在框架区内)中含序列改变之重链和轻链的抗体。因此,特定抗体的N、B和P变体在其重链和轻链可变区内具有相同的CDR序列,但在其框架区内彼此不同。
表1
实施例3可变基因应用分析
为了分析所产生的抗体的结构,对编码抗体可变区的核酸进行克隆和测序。从抗体的核酸序列和推测的氨基酸序列中,鉴别每一重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的基因应用。表2示出了根据本发明的所选抗体的基因应用。
表2
实施例4通过表面等离子共振确定与可溶性GCGR结合的抗体
在25℃和37℃两个温度下通过表面等离子共振确定人单克隆抗hGCGR抗体与人和猴可溶性重组hGCGR胞外域(分别与hGCGR和MfGCGR)结合的结合亲和力和动力学常数。在T100Biacore仪上进行测量。通过共价连接的抗人κ抗体捕捉表面将抗体捕捉在Biacore传感器芯片表面,并且将可溶性GCGR蛋白质以单价(表达有myc-myc-hexa-组氨酸C端标签的hGCGR)或二价(表达有N端Fc融合的hGCGR和MfGCGR)形式应用于所述表面。表3示出了本实施例中使用之试剂的氨基酸序列标识。
表3
将可溶性GCGR以3.1nM至50nM的多种浓度单独注射应用于流动细胞,并且通过使用Scrubber v2.0a曲线拟合软件将数据拟合至1∶1结合模型来确定动力学缔合(ka)和解离(kd)速率常数。由动力学速率常数计算结合解离平衡常数和解离半衰期(dissociation half-time):KD=kd/ka;t1/2=(ln2/kd)。
表4a:25℃下结合的Biacore数据
表4b:37℃下结合的Biacore数据
如表4a和4b所示,示例性抗体表现出与人和猴GCGR可溶性蛋白质两者结合的高亲和力。与单价hGCGR相比,当流动二价hGCGR时,观察到结合亲和力的显著增加(5倍至15倍)。与hGCGR相比,抗体始终以更高的亲和力(3倍至10倍)与猴变体MfGCGR结合。
实施例5测量抗GCGR抗体对GCGR活化之影响的生物测定
GCGR是G蛋白偶联受体,其配体胰高血糖素(GCG)通过Gαs刺激腺苷酸环化酶活性,并且通过Gq刺激磷酸肌醇转化(turnover)(Jiang和Zhang,(2003),Am J Physiol Endocrinol Metab284:E671-E678)。进行生物测定以检测通过Gαs的活化,随后检测cAMP水平和转录活化的升高。产生HEK293细胞系以稳定地表达全长人GCGR(GenBank保藏号NP_000151.1;SEQ ID NO:153)、猴(食蟹猴(Macacafascicularis))GCGR(SEQ ID NO:155)和小鼠GCGR(NP_032127.2;SEQ ID NO:154),连同进行荧光素酶报告基因测定。分离稳定的细胞系并且保持在10%FBS、DMEM、NEAA、Pen/Strep和500mg/ml G418中。对于大鼠GCGR,使用Lipofectamine2000(Invitrogen)以全长大鼠GCGR(NP_742089.1;SEQ ID NO:156)来瞬时转染表达报告基因[CRE(4X)-荧光素酶-IRES-GFP]的HEK293细胞系。
对于生物测定,将293/GCGR细胞在低血清培养基、0.1%FBS和OPTIMEM中以20,000个细胞/孔接种在96孔测定板上,并且在37℃和5%CO2下孵育过夜。次日,将GCG以1∶3连续稀释并且以100nM至0.002nM添加到细胞(包括不含GCG对照)中用于剂量响应。对于抑制,将抗体以1∶3连续稀释并且以200至0.003(对于hGCGR细胞)或100nM至0.002nM(对于猴、小鼠和大鼠GCGR细胞)(包括不含抗体对照)添加到具有恒定浓度100pM的GCG的细胞中。在37℃和5%CO2下孵育5.5小时后检测荧光素酶活性。
表5a示出了通过100pM GCG刺激每一报告基因细胞系的EC50值。表5b示出了抗体阻断100pM GCG对于细胞之刺激的IC50值的结果,其包括两种对照抗体的结果:对照mAb1(表示为hIgG4同种型的阳性对照,例如,参见WO2008/036341,称为“A-9”的抗体具有SEQ ID NO:275的HCVR,SEQ ID NO:102的HCDR1,SEQ ID NO:128的HCDR2,SEQ ID NO:169的HCDR3以及SEQ ID NO:229的LCVR、SEQ ID NO:14的LCDR1、SEQ ID NO:50的LCDR2和SEQ ID NO:74的LCDR3)和对照mAb2(同种型匹配的阴性对照)
关于通过抗GCGR抗体对人GCGR的抑制,通过GCG对GCGR的活化表现为刺激荧光素酶活性的EC50为113pM,并且除了对照mAb2(同种型匹配的阴性对照)外的全部抗体在100pM阻断GCG的活化并且降低荧光素酶活性。
对于通过抗GCGR抗体对猴GCGR的抑制,通过GCG对GCGR的活化表现为刺激荧光素酶活性的EC50为36pM,并且除了对照mAb2(同种型匹配的阴性对照)外的全部抗体在100pM阻断GCG的活化并且降低荧光素酶活性。在100nM的最高测试抗体浓度中,H4H1765N表现出抑制部分的GCG。
关于通过抗GCGR抗体对小鼠GCGR的抑制,通过GCG对GCGR的活化表现为刺激荧光素酶活性的EC50为83pM,并且除了H4H1345N、H4H1617N、H4H1765N和对照mAb2(同种型匹配的阴性对照)外的全部抗体在100pM阻断GCG的活化并且降低荧光素酶活性。
对于通过抗GCGR抗体对大鼠GCGR的抑制,通过GCG对GCGR的活化表现为刺激荧光素酶活性的EC50为252pM,并且除了H4H1765N和对照mAb2(同种型匹配的阴性对照)外的全部抗体在100pM阻断GCG的活化并且降低荧光素酶活性。
表5a
表5b
总之,测试了8种抗hGCGR完全人抗体,并且证明其阻断报告基因细胞系中100pM GCG对人GCGR的活化,其中当单独用GCG刺激时,所述人GCGR表现出的EC50为113pM。在猴GCGR报告基因细胞系中,在八种测试抗体中有七种完全抑制通过100pM GCG的活化。H4H1765N在100nM的最高测试抗体浓度下不完全抑制猴GCGR。在小鼠GCGR报告基因细胞系中,在八种抗体中有五种完全抑制通过100pMGCG的活化,并且在大鼠GCGR转染报告基因细胞系中,在八种抗体中有七种抑制通过100pM GCG的活化。
实施例6.抗GCGR抗体在ob/ob小鼠中的作用。
测试所选择的抗hGCGR抗体(其全部与小鼠GCGR交叉反应)降低ob/ob小鼠(2型糖尿病小鼠模型)体内血糖水平的能力。将ob/ob小鼠分成10组,每组5或6只动物。每一组接受1或10mg/kg各个抗体的皮下注射。对照组注射不与任何已知的小鼠蛋白质结合的hIgG同种型对照抗体。在抗体以1或10mg/kg分别给药2或7天后,从小鼠中采集通过尾部出血获得的数滴血液。特别地,对于给予10mg/kg名称为H4H1327P之抗体的组,更频繁地在给药后第2、4、7、9、11、14、16、18和21天采集尾部血液。通过Compact Plus(Roche)确定尾部血液样品中的血糖水平。计算每个时间点每只动物的与对照组之平均血糖水平相比的血糖降低百分比。计算每个抗体组的血糖降低平均百分比。表6总结了对照组的平均血糖水平。表7a和表7b示出了表示为(平均值±SEM)的血糖降低百分比的结果。
表6
时间 | 血糖(mg/dL) |
第0天 | 197±14 |
第2天 | 185±13 |
第4天 | 167±6 |
第7天 | 202±20 |
第9天 | 205±18 |
第11天 | 195±23 |
第14天 | 229±13 |
第16天 | 206±6 |
第18天 | 187±11 |
第21天 | 209±16 |
表7a
表7b
用经测试的抗hGCGR抗体治疗的小鼠(表7a和7b所示)与注射对照抗体的小鼠相比表现出血糖水平显著减低。
实施例7抗GCGR抗体在表达人GCGR蛋白的转基因小鼠中的作用
确定抗GCGR抗体对表达人GCGR蛋白的转基因小鼠(“人源化GCGR小鼠”)中血糖和血脂水平的影响。通过在C57BL6/129(F1H4)胚胎干细胞中将小鼠GCGR基因替换成人GCGR基因(SEQ ID NO:157;编码全长蛋白质,GenBank保藏号NP_000151.1;SEQ ID NO:153)来产生人源化GCGR小鼠。在种系转移(germ line transmission)完成后,将杂合体小鼠(GCGRhum/+)一起喂养以在C57BL6背景下产生纯合体小鼠(GCGRhum/hum)。将纯合体人源化GCGR小鼠分成10组,每组3或4只动物。每一组接受3mg/kg各个抗体的皮下注射。对照I组注射不与任何已知的小鼠蛋白质结合的hIgG同种型对照抗体。对照II组注射已经验证降低人源化GCGR小鼠之血糖水平的抗hGCGR hIgG4抗体。在抗体给药3天后,对小鼠取血,通过Compact Plus(Roche)确定血糖水平。计算每只动物与对照I组的平均血糖水平相比的血糖降低百分比。计算每个抗体组的平均血糖降低百分比。表8a总结了对照组的平均血糖水平。表8b示出了表示为血糖降低百分比的(平均值±SEM)的结果。
此外对于对照I、对照II和H4H1765N组,在抗体给药之前以及3天和8天之后对小鼠取血,并且通过1650Chemistry System(Siemens)确定血脂水平。计算这三组中每组的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、总胆固醇(总C)、甘油三酯(TG)、未酯化脂肪酸(NEFA)水平的每一测量的平均值。表8c示出了表示为血脂浓度的(平均值±SEM)的结果。
用大部分测试抗hGCGR抗体治疗的小鼠(表8b所示)表现出与接受对照抗体的小鼠相比显著降低的血糖水平。用某些测试抗hGCGR抗体处理的小鼠(表8c所示)表现出与接受对照抗体的小鼠相比显著降低的甘油三酯水平。特别地,观察到名称为H4H1765N(数据在下表8c示出)和另一种名称为H4H1327P(数据未示出)的两种抗GCGR抗体降低甘油三酯水平。
表8a
时间 | 血糖(mg/dL) |
第0天 | 155±6 |
第1天 | 160±5 |
第3天 | 155±5 |
第6天 | 164±7 |
第8天 | 156±7 |
第10天 | 154±9 |
第13天 | 149±5 |
表8b
抗体名称 | 血糖降低(%) |
对照I I | 37±3 |
H4H1321P | 32±4 |
H4H1327P | 40±7 |
H4H1328P | 31±7 |
H4H1331P | 33±4 |
H4H1339P | 31±6 |
H4H1617N | 15±5 |
H4H1345N | 14±2 |
H4H1765N | 32±4 |
表8c
实施例8抗GCGR抗体和对PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型)特异的抗体的联合疗法对小鼠血糖、血脂和肝脏甘油三酯水平的影响。
试剂
使用以下抗体研究抗GCGR抗体和对PCSK9特异的抗体的联合疗法对C57BL/6小鼠血糖水平、血脂水平和肝脏甘油三酯水平的影响:名称为REGN496的抗hIL4R抗体,其为hIgG4同种型对照;名称为H4H1327P的抗GCGR(hIgG4)抗体;和名称为H1H316P的抗PCSK9(hIgG1)抗体。下面的表9示出了HCVR、LCVR、HCDR和LCDR的氨基酸序列标识。
表9
实验过程
在C57BL/6小鼠中确定抗hGCGR抗体H4H1327P和抗hPCSK9抗体H1H316P对血糖、血脂和肝脏甘油三酯(TG)水平的组合效应。
H4H1327P与小鼠GCGR交叉反应,H1H316P与小鼠PCSK9交叉反应。将C57BL/6小鼠分成6组,每组6只动物。每组一周接受一次一种抗体或两种抗体之组合的皮下注射。第一组注射10mg/kg不与任何已知小鼠蛋白质结合的hIgG4同种型对照抗体。第二和第三组分别接受3mg/kg和10mg/kg H4H1327P。第四组注射10mg/kg H1H316P。第五组接受3mg/kg H4H1327P和10mg/kg H1H316P的组合,第六组注射10mg/kg H4H1327P和10mg/kg H1H316P的组合。在最初抗体给药后第11天和第19天,对小鼠取血以进行血糖和血脂测量。在第19天,获取肝脏以确定肝脏TG含量。使用Compact Plus(Roche)测量血糖水平。计算每种动物与同种型对照组的平均血糖水平相比的血糖降低百分比。然后通过求每一组单个动物之值的平均数来计算每一治疗组的血糖的降低百分比和相关误差。表10a和图1示出了表示为血糖降低百分比的(平均值±SEM)的结果。
通过1650Chemistry System(Siemens)确定血脂水平。在用氯仿/甲醇从组织中萃取TG后,使用比色测定(Teco Diagnostics)测量肝脏TG含量。计算每一组的血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、总胆固醇(总C)、TG和肝脏TG水平的每一测量值的平均值。以下图中示出了表示为血浆和肝脏脂质浓度的(平均值±SEM)的结果:表10b和图2(血浆LDL-C水平)、图3(血浆HDL-C水平)、图4(血浆总C水平)、图5(血浆TG水平)和图6(肝脏TG含量)。
结果总结和结论:
表10a
表10b
NA:不适用
列表数据总结
单独用H4H1327P处理的小鼠与接受对照mAb的小鼠相比表现为血糖水平显著降低以及LDL、HDL和总胆固醇水平升高。单独用H1H316P处理的小鼠表现为胆固醇水平显著降低而血糖水平无变化。用H4H1327P和H1H316P的组合处理的小鼠与接受对照mAb的小鼠相比表现为血糖水平显著降低而胆固醇水平无变化。与同种型对照组相比,任何治疗组中肝脏TG含量无变化。
实施例9抗GCGR抗体在饮食诱导肥胖小鼠模型中的作用
在2型糖尿病(T2D)的饮食诱导肥胖(DIO)小鼠模型中确定与小鼠GCGR交叉反应的抗hGCGR抗体H4H1327P对血糖水平和体重的影响。
通过从5~6周龄开始给小鼠喂食高脂肪(60%kcal)饮食(HFD)来建立DIO模型。在喂食约6周后,小鼠发生了包括胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良和肥胖的代谢异常。与另两种常用的T2D模型ob/ob和db/db小鼠相比,DIO模型在小鼠中诱导出更接近于人T2D的生理状态,因为所述另两种常用模型分别由瘦素(leptin)或瘦素受体基因导致,其为人体内不常见的T2D起因。
在本研究中,从5周龄开始给予HFD的11周龄雄性C57BL/6小鼠购自Taconic farms有限公司并且另外保持该饮食8周。在19周龄时将小鼠分成4组,每组10只动物。每组每周(在第0、7、14和21天)接受皮下注射3、10或30mg/kg H4H1327P或者30mg/kg不与任何已知的小鼠蛋白质结合的hIgG4同种型对照。定期测量血糖水平和体重,并且在最后一次抗体给药6天后(在第27天),每组处死6只小鼠。在接下来的6周中,监测每组剩余的4只小鼠的血糖和体重。计算每只动物与同种型对照组的平均血糖水平相比的血糖水平降低百分比。然后通过求每组单个动物的值的平均数来计算每一处理组的血糖的降低百分比和相关误差。表11示出了表示为血糖降低百分比的(平均值±SEM)的结果。计算每只动物与基线(第0天的重量)相比的体重变化百分比。然后通过求每组单个动物的值的平均数来计算每一处理组的体重的变化百分比和相关误差。表12示出了表示为相对于基线之体重变化百分比的(平均值±SEM)的结果。
结果总结和结论:
与同种型对照组相比,H4H1327P在全部测试剂量下降低DIO小鼠的血糖和体重。最大相对血糖降低(48.5%)发生于第10天的最高剂量(30mg/kg)组,最大相对体重降低(12.8%)发生于第28天的最高剂量组。最低剂量(3mg/kg)组经过第28天(最后一次给药后1周)得到为最高剂量组所表现之值的至少70%的平均相对血糖降低和平均体重降低值。与较低剂量组相比,较高H4H1327P剂量组的观察到的血糖和体重降低作用在第21天的最后一次治疗之后(即,第28、47和68天)持续时间较长。
表11
表12
实施例10抗GCGR抗体在链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病酮症酸中毒小鼠模型中的作用
在链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病酮症酸中毒(DKA)小鼠模型中确定与小鼠GCGR交叉反应的抗hGCGR抗体H4H1327P对血浆酮和葡萄糖水平的影响。STZ对哺乳动物的胰腺β细胞具有化学毒性,因此当向啮齿类动物施用时STZ会破坏这类细胞。向C57BL/6小鼠单次高剂量(200mg/kg)注射STZ导致在3天内引起严重的高血糖症和酮尿症(表现于人DKA中的病症)。将购自Taconic farms有限公司的9周龄雄性C57BL/6小鼠分成两组,每组10只动物。每一组接受腹腔内注射200mg/kg STZ(在柠檬酸盐缓冲剂中)或载剂(也在柠檬酸盐缓冲剂中)。三天后,确认全部STZ处理动物中的严重高血糖症(血糖水平>400mg/dL)和酮尿症。次日早上,将STZ处理的小鼠分成2组,每组5只动物,每组接受静脉注射10mg/kg的hIgG4同种型对照或H4H1327P。将用柠檬酸盐缓冲剂处理的小鼠也分成2组,每组5只动物,每一组接受静脉注射10mg/kg的hIgG4同种型对照或H4H1327P。在小鼠抗体给药18小时之前(STZ施用之后2.5天)和抗体给药28小时之后在异氟烷麻醉下对取血以采集血浆。通过β羟丁酸测定(beta-hydroxybutyrate assay)(Biovision)确定血浆酮水平,通过1650Chemistry System(Siemens)确定血浆葡萄糖水平。计算四组中每一组的β羟丁酸和葡萄糖水平测量的平均值。表13示出了表示为血浆β羟丁酸和葡萄糖浓度的(平均值±SEM)的结果。
结果总结和结论:
观察到与处理前18小时的血浆水平相比,用H4H1327P处理28小时后的STZ诱导糖尿病酮症酸中毒小鼠中血浆β羟丁酸(酮)浓度降低(平均67%),表明H4H1327P有效降低了DKA小鼠模型中的血浆酮水平。对于以同种型对照抗体给药的STZ处理小鼠,观察到与抗体治疗前18小时收集的样品相比,对照抗体处理28小时后收集的血清样品的平均血糖升高为14%,然而对于STZ处理组中H4H1327P给药的小鼠,观察到在这两个时间点收集的血清样品之间葡萄糖的平均变化小于1%。
表13
实施例11双特异性抗体的产生
产生了多种用于实践本发明方法的双特异性抗体。例如,产生了双特异形式的GCGR特异性抗体(“双特异体(bi-specific)”),其中与GCGR上独特的胞外域和/或EC环表位结合的可变区连接在一起从而在单个结合分子内形成双环特异性。适当设计的双特异体可通过增加GCGR特异性和结合亲和力两者来增强全部胰高血糖素受体的阻断效果。具有对单个胞外域表位(例如,N端结构域或EC1、EC2或EC3GCGR环的片段)的特异性或可与一个胞外域片段或环内不同区域结合的可变区在结构架(structural scaffold)上配对,这允许每一可变区同时与分开的表位或与在一个胞外域或EC环内的不同区域结合。在双特异体的一个实例中,具有一个胞外域或环特异性的结合剂的重链可变区(VH)与具有第二胞外域或EC环特异性的一系列结合体(binder)的轻链可变区(VL)重组以鉴别非同源VL亲本,其可与原始VH配对而不干扰对VH的原始特异性。以该方式,单个VL片段(例如,VL1)可与两种不同的VH结构域(例如,VH1和VH2)结合,以产生包含两个结合“臂”(VH1-VL1和VH2-VL1)的双特异体。使用单个VL片段降低了系统的复杂度,从而使用于产生双特异体的克隆、表达和纯化过程简化并使其效率增加(参见,例如USSN13/022759和US2010/0331527)。
或者,可使用本文所述技术或本领域技术人员已知的其他技术将与GCGR和第二靶标(例如但不限于,例如,人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(hPCSK9))结合的抗体制备成双特异体形式。与暴露于细胞外的独特的GCGR区结合的抗体可变区和与例如PCSK9上的相关位点结合的可变区连接在一起,从而赋予单个结合分子中双抗原特异性。适当设计的这种性质的双特异体具有双重功能。例如,在与GCGR和PCSK9两者结合的双特性性抗体的情况下,能够借助双特异性抗体的一条臂与GCGR的结合来降低血糖,同时借助抗体的第二条臂与PCSK9的结合来降低血脂。具有对GCGR的单个胞外域表位的特异性的可变区与具有对PCSK9的特异性的可变区组合并且在结构架上配对,这允许每一可变区与分开的抗原相结合。
在对抗体的上述任何测定中,测试了双特异性结合体的结合和阻断目标抗原(例如,GCGR和/或PCSK9)的功能。例如,用于测量可溶性蛋白质结合的标准方法被用于评价双特异体-PCSK9相互作用,所述标准方法例如Biacore、ELISA、尺寸排阻色谱、多角度激光散射、直接扫描量热法以及其他方法。通过流式细胞术确定双特异性抗体与表达GCGR之细胞的结合,其使用与细胞结合的识别两种目标抗原中之一种或两种的荧光标记的第二抗体。使用ELISA结合测定来评估与不同物种变体内和不同物种变体之间之不同GCGR胞外域或环的交叉反应性,在该ELISA结合测定中将代表不同胞外域或环的合成肽包被在微量滴定板的孔上,并且通过使用第二检测抗体来确定双特异体的结合。还可使用表面等离子体共振实验进行与环肽的结合实验,其中通过使肽或双特异体流过其上分别捕捉双特异体或肽的传感器表面来测量肽与抗体的实时结合相互作用。使用例如本文描述的任何生物测定来确定体外双特异体对GCGR受体的功能阻断,或者其通过体内确定合适动物模型中的血糖水平(例如本文描述的那些)来进行。使用如WO2010/077854或US2010/0166768中描述的任何生物测定来确定双特异体对PCSK9的体外功能阻断,或者其通过体内确定合适动物模型中的血脂水平(例如本文描述的那些)来进行。
Claims (22)
1.与人胰高血糖素受体(hGCGR)特异性结合的分离的人抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体与人GCGR的胞外域和/或胞外(EC)环结合,其中所述胞外域是GCGR的N端结构域并且其中所述EC环是EC1、EC2和EC3中的一种或更多种。
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段,其中所述N端结构域包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基编号27至约氨基酸残基144的氨基酸残基;EC1包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基194至约氨基酸残基226的氨基酸残基;EC2包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基285至约氨基酸残基305的氨基酸残基;并且EC3包含SEQ ID NO:153的约氨基酸残基369至约氨基酸残基384的氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段,其包含:重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR),其中所述HCVR具有选自SEQ ID NO:2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130和146之一的氨基酸序列;以及轻链可变区(LCVR)的CDR,其中所述LCVR具有选自SEQ ID NO:10、26、42、58、68、78、88、98、108、118、128、138和148之一的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其片段,其中所述HCVR包含:HCDR1结构域,其具有选自SEQ ID NO:4、20、36、52、72、92、112和132之一的氨基酸序列;HCDR2结构域,其具有选自SEQID NO:6、22、38、54、74、94、114和134之一的氨基酸序列;HCDR3结构域,其具有选自SEQ ID NO:8、24、40、56、76、96、116和136之一的氨基酸序列;并且
LCVR包含:LCDR1结构域,其具有选自SEQ ID NO:12、28、44、60、80、100、120和140之一的氨基酸序列;LCDR2结构域,其具有选自SEQ ID NO:14、30、46、62、82、102、122和142之一的氨基酸序列;以及LCDR3结构域,其具有选自SEQ ID NO:16、32、48、64、84、104、124和144之一的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:(a)HCVR,其具有选自SEQ ID NO:2、18、34、50、66、70、86、90、106、110、126、130和146之一的氨基酸序列;以及(b)LCVR,其具有选自SEQ ID NO:10、26、42、58、68、78、88、98、108、118、128、138和148的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其包含选自SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/68、70/78、86/88、90/98、106/108、110/118、126/128、130/138和146/148的HCVR/LCVR序列对。
7.抗体或其抗原结合片段,其与根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争与hGCGR的特异性结合。
8.抗体或其抗原结合片段,其与根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段结合hGCGR上的相同表位。
9.分离的核酸分子,其编码根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段。
10.表达载体,其包含根据权利要求9所述的核酸分子。
11.产生抗人GCGR抗体或其抗原结合片段的方法,其包括以下步骤:向分离的宿主细胞中引入根据权利要求10所述的表达载体,在允许产生所述抗体或其片段的条件下培养所述细胞,以及回收所产生的所述抗体。
12.药物组合物,其包含根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及可药用载体或稀释剂。
13.用于降低血糖或血酮水平的方法,或者用于治疗以高血糖或高血酮水平为部分特征或与高血糖或高血酮水平相关之病症或疾病或者与所述病症或疾病相关的至少一种症状或并发症的方法,所述方法包括:向有此需要的患者施用根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据权利要求12所述的药物组合物,从而降低血糖或血酮水平或者调节所述病症或疾病或者减轻或降低与所述病症或疾病相关的至少一种症状或并发症的严重程度。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述病症或疾病选自:糖尿病、葡萄糖耐量受损、肥胖、肾病、神经病、视网膜病、白内障、中风、动脉粥样硬化、伤口愈合受损、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高渗综合征、围术期高血糖症、特护病房患者高血糖症、高胰岛素血症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合症和空腹血糖受损。
15.根据权利要求13或14中任一项所述的方法,其中与第二治疗剂联合向所述患者施用所述抗体或抗原结合片段。
17.根据权利要求15所述的方法,其中所述第二治疗剂是3-羟基-3-甲基-戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)抑制剂。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述HMG-CoA还原酶抑制剂是他汀类,其选自阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
19.根据权利要求15所述的方法,其中所述第二治疗剂是与人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(PCSK9)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段。
20.药物组合物,其包含根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及第二治疗剂和可药用载体或稀释剂,所述第二治疗剂包含与人PCSK9特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段。
21.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段或者根据权利要求12或20中任一项所述的药物组合物,其用于降低血糖或血酮水平或者治疗患有与高血糖或高血酮水平相关或以高血糖或高血酮水平为部分特征之疾病或病症的患者,其中所述病症或疾病选自糖尿病、葡萄糖耐量受损、肥胖、肾病、神经病、视网膜病、白内障、中风、动脉粥样硬化、伤口愈合受损、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高渗综合征、围术期高血糖症、特护病房患者高血糖症、高胰岛素血症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合症和空腹血糖受损。
22.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求12或20中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于降低血糖或血酮水平或者用于治疗患有与高血糖或高血酮水平相关或以高血糖或高血酮水平为部分特征之疾病或病症的患者,其中所述病症或疾病选自糖尿病、葡萄糖耐量受损、肥胖、肾病、神经病、视网膜病、白内障、中风、动脉粥样硬化、伤口愈合受损、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高渗综合征、围术期高血糖症、特护病房患者高血糖症、高胰岛素血症、代谢综合征、胰岛素抵抗综合症和空腹血糖受损。
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107847543A (zh) * | 2015-04-01 | 2018-03-27 | 斯克利普斯研究院 | 与gpcr激动剂多肽相关的方法和组合物 |
CN108025060A (zh) * | 2014-06-08 | 2018-05-11 | 瑞美德生物医药科技有限公司 | 使用胰高血糖素受体拮抗性抗体治疗1型糖尿病的方法 |
CN108330112A (zh) * | 2015-06-01 | 2018-07-27 | 中国药科大学 | HMG-CoA还原酶的两个B细胞表位及包含其中一个或两个表位的抗原肽 |
CN108368177A (zh) * | 2015-10-12 | 2018-08-03 | 瑞泽恩制药公司 | 激活瘦素受体的抗原结合蛋白 |
WO2019196603A1 (zh) * | 2018-04-10 | 2019-10-17 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质,以及其药物组合物和应用 |
CN110520151A (zh) * | 2017-01-27 | 2019-11-29 | 恩格姆生物制药公司 | 胰高血糖素受体结合蛋白和其使用方法 |
WO2020125744A1 (zh) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 双特异性蛋白 |
Families Citing this family (57)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JO3672B1 (ar) * | 2008-12-15 | 2020-08-27 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9). |
US8771696B2 (en) | 2010-11-23 | 2014-07-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of reducing the severity of stress hyperglycemia with human antibodies to the glucagon receptor |
JO3756B1 (ar) | 2010-11-23 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون |
AR087305A1 (es) | 2011-07-28 | 2014-03-12 | Regeneron Pharma | Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit |
JP6158813B2 (ja) | 2011-09-16 | 2017-07-05 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン−9(PCSK9)の阻害剤を投与することによってリポタンパク質(a)レベルを低下させる方法 |
US9255154B2 (en) | 2012-05-08 | 2016-02-09 | Alderbio Holdings, Llc | Anti-PCSK9 antibodies and use thereof |
EP2888283B1 (en) | 2012-08-24 | 2018-09-19 | The Regents of The University of California | Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis |
AR095196A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Regeneron Pharma | Medio de cultivo celular libre de suero |
SG11201508264UA (en) | 2013-05-07 | 2015-11-27 | Rinat Neuroscience Corp | Anti-glucagon receptor antibodies and methods of use thereof |
US10111953B2 (en) | 2013-05-30 | 2018-10-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9) |
CN104231083A (zh) * | 2013-06-09 | 2014-12-24 | 杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司 | 抗胰高血糖素受体的抗体及其用途 |
WO2016010927A1 (en) * | 2014-07-14 | 2016-01-21 | Amgen Inc. | Crystalline antibody formulations |
WO2016044337A1 (en) | 2014-09-16 | 2016-03-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-glucagon antibodies and uses thereof |
EP3250609A4 (en) * | 2015-01-26 | 2018-07-11 | The University of Chicago | Il13ra alpha 2 binding agents and use thereof in cancer treatment |
JP6912386B2 (ja) * | 2015-01-26 | 2021-08-04 | ザ ユニバーシティー オブ シカゴ | 癌特異的なIL13Rα2を認識するCAR T細胞 |
TWI797060B (zh) | 2015-08-04 | 2023-04-01 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
TW201713690A (zh) | 2015-08-07 | 2017-04-16 | 再生元醫藥公司 | 抗angptl8抗體及其用途 |
US10772956B2 (en) | 2015-08-18 | 2020-09-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for reducing or eliminating the need for lipoprotein apheresis in patients with hyperlipidemia by administering alirocumab |
WO2017055966A1 (en) | 2015-10-01 | 2017-04-06 | Pfizer Inc. | Low viscosity antibody compositions |
CN107474134B (zh) * | 2016-06-08 | 2021-07-27 | 苏州康乃德生物医药有限公司 | 用于结合白细胞介素4受体的抗体 |
US10688181B2 (en) | 2016-06-27 | 2020-06-23 | The Regents Of The University Of California | Cancer treatment combinations |
EP3504328A1 (en) | 2016-08-24 | 2019-07-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Host cell protein modification |
MX2019002437A (es) | 2016-08-30 | 2019-10-09 | Regeneron Pharma | Metodos para tratar la resistencia severa a la insulina interfiriendo con la señalizacion del receptor de glucagon. |
WO2018075792A1 (en) | 2016-10-20 | 2018-04-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of lowering blood glucose levels |
KR20190078650A (ko) | 2016-11-17 | 2019-07-04 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 항-angptl8 항체를 사용하는 비만의 치료 방법 |
JP7265494B2 (ja) | 2017-07-06 | 2023-04-26 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 糖タンパク質を作製するための細胞培養方法 |
JP2020531532A (ja) * | 2017-08-22 | 2020-11-05 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | グルカゴン受容体シグナル伝達に干渉することによって尿素サイクル異常症を治療する方法 |
WO2019126194A1 (en) | 2017-12-18 | 2019-06-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Angptl8 assay and uses thereof |
MX2020006639A (es) | 2017-12-22 | 2020-09-14 | Regeneron Pharma | Sistema y metodo para caracterizar las impurezas de un producto farmaceutico. |
KR20200115485A (ko) | 2018-01-31 | 2020-10-07 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 약물 생성물 불순물을 특성화하기 위한 시스템 및 방법 |
TWI786265B (zh) | 2018-02-02 | 2022-12-11 | 美商再生元醫藥公司 | 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法 |
CA3088906A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Systems and methods for identifying viral contaminants |
EP4317959A3 (en) | 2018-03-19 | 2024-03-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents |
TW202016125A (zh) | 2018-05-10 | 2020-05-01 | 美商再生元醫藥公司 | 用於定量及調節蛋白質黏度之系統與方法 |
WO2020023847A1 (en) | 2018-07-27 | 2020-01-30 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Use of glucagon receptor antagonists with immunotherapeutic agent |
BR112020024296A2 (pt) | 2018-08-27 | 2021-03-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Métodos para produção de um intermediário de purificação de proteína concentrado, para monitoramento e controle dos atributos de qualidade críticos em um intermediário de purificação de proteína e para monitorar e controlar os níveis de excipientes no fluido de cultura de células colhido e/ou intermediário de purificação de proteína, e, intermediário de purificação de proteína |
SG11202011969WA (en) | 2018-08-30 | 2020-12-30 | Regeneron Pharma | Methods for characterizing protein complexes |
EA202191841A1 (ru) | 2019-01-16 | 2021-10-07 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Способы для идентификации свободных тиолов в белках |
AU2020346886A1 (en) * | 2019-09-13 | 2022-04-14 | Memorial Hospital For Cancer And Allied Diseases | Anti-CD371 antibodies and uses thereof |
US20220323937A1 (en) | 2019-09-24 | 2022-10-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Systems and methods for chromatography use and regeneration |
CN110694068A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-01-17 | 北京市心肺血管疾病研究所 | 一种抑制血管生成素样蛋白8的物质的应用 |
IL293112A (en) | 2019-11-25 | 2022-07-01 | Regeneron Pharma | Sustained release formulations using non-aqueous emulsions |
KR20230088853A (ko) | 2020-01-21 | 2023-06-20 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 당질화된 단백질의 전기영동을 위한 탈당질화 방법 |
MX2023002417A (es) | 2020-08-31 | 2023-03-22 | Regeneron Pharma | Estrategias de suministro de asparagina para mejorar el rendimiento del cultivo celular y mitigar las variantes de secuencia de asparagina. |
US20220160828A1 (en) | 2020-11-25 | 2022-05-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Sustained release formulations using non-aqueous membrane emulsification |
MX2023007225A (es) | 2020-12-17 | 2023-06-27 | Regeneron Pharma | Fabricacion de microgeles encapsuladores de proteina. |
JP2024503408A (ja) | 2021-01-20 | 2024-01-25 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 細胞培養におけるタンパク質力価の改善方法 |
BR112023017442A2 (pt) | 2021-03-03 | 2023-09-26 | Regeneron Pharma | Métodos para identificar regiões em uma proteína e para modificar a viscosidade de uma droga proteica, e, droga proteica |
BR112023018665A2 (pt) | 2021-03-26 | 2023-10-03 | Regeneron Pharma | Métodos e sistemas para desenvolvimento de protocolos de mistura |
TW202314240A (zh) | 2021-06-01 | 2023-04-01 | 美商再生元醫藥公司 | 微晶片毛細管電泳分析及試劑 |
US20230077710A1 (en) | 2021-09-08 | 2023-03-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | HIGH-THROUGHPUT AND MASS-SPECTROMETRY-BASED METHOD FOR QUANTITATING ANTIBODIES AND OTHER Fc-CONTAINING PROTEINS |
CA3232463A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Philip Mellors | Methods of controlling antibody heterogeneity |
AU2022360838A1 (en) | 2021-10-07 | 2024-03-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Systems and methods of ph modeling and control |
CA3230985A1 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Ross BROWNE | Ph meter calibration and correction |
CA3236367A1 (en) | 2021-10-26 | 2023-05-04 | Michelle Lafond | Systems and methods for generating laboratory water and distributing laboratory water at different temperatures |
US20230296559A1 (en) | 2022-03-18 | 2023-09-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for analyzing polypeptide variants |
US20240198253A1 (en) | 2022-12-16 | 2024-06-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for assessing chromatographic column integrity |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009055783A2 (en) * | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Schering Corporation | Anti-pcsk9 and methods for treating lipid and cholesterol disorders |
Family Cites Families (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994005789A1 (en) * | 1992-08-28 | 1994-03-17 | Zymogenetics, Inc. | Glucagon receptors |
US5776725A (en) * | 1992-08-28 | 1998-07-07 | Zymogenetics, Inc. | Recombinant production of glucagon receptors |
US6596541B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US20070173473A1 (en) | 2001-05-18 | 2007-07-26 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
US20030199445A1 (en) | 2002-02-07 | 2003-10-23 | Knudsen Lotte Bjerre | Use of GLP-1 compound for treatment of critically ill patients |
US20040101920A1 (en) | 2002-11-01 | 2004-05-27 | Czeslaw Radziejewski | Modification assisted profiling (MAP) methodology |
WO2005103081A2 (en) | 2004-04-20 | 2005-11-03 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against cd20 |
CN103554205A (zh) | 2006-05-05 | 2014-02-05 | Isis制药公司 | 调节gccr的表达的化合物和方法 |
MX2008014804A (es) | 2006-06-02 | 2009-01-27 | Regeneron Pharma | Anticuerpos de afinidad elevada a receptor de il-6 humano. |
CL2007002668A1 (es) | 2006-09-20 | 2008-05-09 | Amgen Inc | Proteina de union a antigeno que se une al receptor de glucagon humano; acido nucleico que la codifica; metodo de produccion; composicion farmaceutica que la comprende; y su uso para tratar o prevenir la diabetes tipo 2. |
CA2667869A1 (en) | 2006-11-07 | 2008-05-15 | Merck & Co., Inc. | Antagonists of pcsk9 |
WO2008057457A2 (en) | 2006-11-07 | 2008-05-15 | Merck & Co., Inc. | Antagonists of pcsk9 |
US20100040610A1 (en) | 2006-11-07 | 2010-02-18 | Ayesha Sitlani | Antagonists of pcsk9 |
AU2007322265B2 (en) | 2006-11-07 | 2013-06-20 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Antagonists of PCSK9 |
EP2142217B1 (en) | 2007-03-27 | 2014-11-05 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method for detecting autoprocessed, secreted pcsk9 |
EP2137218A2 (en) | 2007-04-13 | 2009-12-30 | Novartis Ag | Molecules and methods for modulating proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (pcsk9) |
US7537903B2 (en) | 2007-04-23 | 2009-05-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner |
KR20100017169A (ko) | 2007-05-22 | 2010-02-16 | 노파르티스 아게 | Fgf21-관련 장애의 치료, 진단 및 검출 방법 |
JOP20080381B1 (ar) | 2007-08-23 | 2023-03-28 | Amgen Inc | بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9) |
AR070315A1 (es) | 2008-02-07 | 2010-03-31 | Merck & Co Inc | Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9 |
AR070316A1 (es) | 2008-02-07 | 2010-03-31 | Merck & Co Inc | Antagonistas de pcsk9 (proproteina subtilisina-kexina tipo 9) |
CN104975020B (zh) | 2008-02-11 | 2020-01-17 | 菲奥医药公司 | 经修饰的RNAi多核苷酸及其用途 |
US8334253B2 (en) | 2008-02-21 | 2012-12-18 | Dermacare Neuroscience Institute | Cosmetic and dermatological formulations of MNTF peptides |
WO2009114475A2 (en) | 2008-03-09 | 2009-09-17 | Intradigm Corporation | Compositions comprising human pcsk9 and apolipoprotein b sirna and methods of use |
PE20091674A1 (es) | 2008-03-27 | 2009-11-04 | Lilly Co Eli | Antagonistas del receptor de glucagon |
TWI516501B (zh) | 2008-09-12 | 2016-01-11 | 禮納特神經系統科學公司 | Pcsk9拮抗劑類 |
JO3672B1 (ar) | 2008-12-15 | 2020-08-27 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9). |
CN102471378B (zh) | 2009-06-26 | 2014-04-02 | 瑞泽恩制药公司 | 容易地分离的具有天然免疫球蛋白形式的双特异性抗体 |
NZ598670A (en) * | 2009-09-08 | 2014-05-30 | Neopharm Co Ltd | Antibodies against glucagon receptor and their use |
AU2010326024A1 (en) | 2009-12-02 | 2012-07-05 | Amgen Inc. | Binding proteins that bind to human FGFR1c, human beta-Klotho and both human FGFR1c and human beta-Klotho |
JO3756B1 (ar) | 2010-11-23 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون |
US8771696B2 (en) | 2010-11-23 | 2014-07-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of reducing the severity of stress hyperglycemia with human antibodies to the glucagon receptor |
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2022
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009055783A2 (en) * | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Schering Corporation | Anti-pcsk9 and methods for treating lipid and cholesterol disorders |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
CECILIA G. UNSON ET AL.: "Antibodies against specific extracellular epitopes of the glucagon receptor block glucagon binding", 《PROC. NATL. ACAD. SCI.》 * |
J. BUGGY ET AL.: "Human Glucagon Receptor Monoclonal Antibodies:Antagonism of Glucagon Action and Use in Receptor Characterization", 《HORM. METAB. RES.》 * |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108025060A (zh) * | 2014-06-08 | 2018-05-11 | 瑞美德生物医药科技有限公司 | 使用胰高血糖素受体拮抗性抗体治疗1型糖尿病的方法 |
CN107847543A (zh) * | 2015-04-01 | 2018-03-27 | 斯克利普斯研究院 | 与gpcr激动剂多肽相关的方法和组合物 |
CN108330112A (zh) * | 2015-06-01 | 2018-07-27 | 中国药科大学 | HMG-CoA还原酶的两个B细胞表位及包含其中一个或两个表位的抗原肽 |
CN108368177B (zh) * | 2015-10-12 | 2022-05-31 | 瑞泽恩制药公司 | 激活瘦素受体的抗原结合蛋白 |
CN108368177A (zh) * | 2015-10-12 | 2018-08-03 | 瑞泽恩制药公司 | 激活瘦素受体的抗原结合蛋白 |
CN110520151A (zh) * | 2017-01-27 | 2019-11-29 | 恩格姆生物制药公司 | 胰高血糖素受体结合蛋白和其使用方法 |
US11732049B2 (en) | 2017-01-27 | 2023-08-22 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods of reducing or lowering blood glucose levels in a human subject by administering an antibody that specifically binds human glucagon receptor |
CN110520151B (zh) * | 2017-01-27 | 2024-04-12 | 恩格姆生物制药公司 | 胰高血糖素受体结合蛋白和其使用方法 |
WO2019196603A1 (zh) * | 2018-04-10 | 2019-10-17 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质,以及其药物组合物和应用 |
CN110357959A (zh) * | 2018-04-10 | 2019-10-22 | 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 | Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质,以及其药物组合物和应用 |
US11542336B2 (en) | 2018-04-10 | 2023-01-03 | Gmax Biopharm Llc | GCGR antibody and GLP-1 fusion protein thereof, pharmaceutical composition thereof and application thereof |
WO2020125744A1 (zh) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 双特异性蛋白 |
CN112996811A (zh) * | 2018-12-21 | 2021-06-18 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 双特异性蛋白 |
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