CN114391022A - 抗瘦素受体的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及预防或治疗与突变瘦素受体、瘦素缺乏或瘦素功能障碍相关的疾病的组合物和方法。本发明还涉及施用有效量的抗瘦素受体抗体，以治疗患有或易患与突变瘦素受体、肥胖、瘦素缺乏、瘦素抵抗和/或低瘦素血症相关的疾病的受试者。

Description

抗瘦素受体的抗体

技术领域

本发明一般涉及特异性结合瘦素受体蛋白的免疫球蛋白相关组合物(例如抗体或其抗原结合片段)及其用途。具体而言，本发明涉及瘦素受体结合抗体的制备及其在检测和治疗与瘦素缺乏或低瘦素血症、瘦素抵抗和/或引起瘦素信号传导缺陷或受损的瘦素受体突变相关或由其引起的病症(包括肥胖)中的用途。

背景技术

本文提供以下描述以帮助读者理解。本文所提供的信息或引用的参考文献均不被认为是现有技术。

包括儿童肥胖在内的肥胖在全球范围内以惊人的速度发生，全球患病率为12％。肥胖还伴随着高发生率的严重且危及生命的并发症，例如2型糖尿病、心血管疾病和癌症。肥胖的根本原因很复杂，包括致肥胖环境和遗传易感性。还存在单基因肥胖和综合征性肥胖。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种抗瘦素受体抗体或其抗原结合片段，其包含重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)和轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，其中V_H包含选自由以下组成的组的V_H-CDR1序列：SEQ ID NO:3、13、23、33、43、53、63、73和83；选自由以下组成的组的V_H-CDR2序列：SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74和84；和选自由以下组成的组的V_H-CDR3序列：SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75和85；并且V_L包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：选自由以下组成的组的V_L-CDR1序列：SEQ ID NO:8、18、28、38、48、58、68、78和88；选自由以下组成的组的V_L-CDR2序列：SEQ ID NO:9、19、29、39、49、59、69、79和89；和选自由以下组成的组的V_L-CDR3序列：SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60、70、80和90。

在一个方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含V_H氨基酸序列，所述V_H氨基酸序列包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:82，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体；和/或V_L氨基酸序列，所述V_L氨基酸序列包含SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:87，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。

另外地或替代地，在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的V_H氨基酸序列和V_L氨基酸序列：分别是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7(S1scAb06)；SEQID NO:12和SEQ ID NO:17(S1scAb11)；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27(S2H1)；SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37(S2H2)；SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:47(S2H3)；SEQ ID NO:52和SEQ IDNO:57(S2H4)；SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:67(S2H5)；SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:77(S2H6)；以及SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:87(S2H7)。

在一个方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列，所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列与SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77或87中任一者的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同；和/或(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列(V_H)，所述重链免疫球蛋白可变结构域序列(V_H)与SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72或82中任一者中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。

另外地或替代地，在本文公开的任何实施方案中，抗体或其抗原结合片段还包含选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD及IgE组成的组的同种型的Fc结构域。另外地或替代地，在一些实施方案中，抗原结合片段选自由Fab、F(ab’)₂、Fab’、scF_v和F_v组成的组。另外地或替代地，在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。另外地或替代地，在一些实施方案中，抗瘦素受体抗体或抗原结合片段结合于人瘦素受体的CRH2结构域。在一些实施方案中，本发明的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段结合于构象表位。

在一个方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗与瘦素缺乏或低瘦素血症、瘦素抵抗或引起瘦素信号传导缺陷或受损的瘦素受体突变相关或由其引起的病症的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的本发明的抗体或抗原结合片段。

在另一个方面，本发明提供一种在有需要的受试者中减轻与瘦素缺乏或低瘦素血症、瘦素抵抗或引起瘦素信号传导缺陷或受损的瘦素受体突变相关或由其引起的病症的一种或多种症状的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的本文所公开的抗体或抗原结合片段。此类病症的症状的实例包括体重增加、食物摄入增加、血糖水平增加、胰岛素水平降低、葡萄糖耐量降低等。

另外地或替代地，在本文公开的方法的一些实施方案中，与引起瘦素信号传导缺陷或受损的瘦素受体突变相关或由其引起的病症是肥胖。

在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本文公开的任何实施方案的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段。

在一个方面，本发明提供了一种核酸序列，其编码本文公开的任何实施方案的抗体或抗原结合片段。另外地或替代地，在一些实施方案中，核酸序列选自由SEQ ID NO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66、71、76、81和86组成的组。

在一个方面，本发明提供了一种表达所述核酸的宿主细胞或载体。

在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本文公开的任何一个实施方案的抗体或抗原结合片段。另外地或替代地，在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段与至少一种选自由放射性标记、荧光标记和显色标记组成的组的可检测标记偶联。另外地或替代地，在一些实施方案中，试剂盒还包含特异性地结合于本文公开的抗体或抗原结合片段的二抗。

在一个方面，本发明提供了一种检测生物样品中的瘦素受体的方法，其包括使生物样品与本文公开的抗体或其抗原结合片段接触，其中所述抗体或抗原结合片段与可检测的标记物缀合；并检测生物样品中可检测标记的水平。

附图说明

图1A显示了瘦素或抗瘦素受体抗体S1scAb06、S1scAb11和S2H6对含有SIS诱导元件(SIE)-荧光素酶载体的细胞的荧光素酶表达的影响。同种型对照抗体用作阴性对照。

图1B显示了瘦素或抗瘦素受体抗体S2H1、S2H2、S2H3、S2H4、S2H5、S2H6和S2H7对含有SIS诱导元件(SIE)-荧光素酶载体的细胞的荧光素酶表达的影响。同种型对照抗体用作阴性对照。

图2A显示了瘦素或抗瘦素受体抗体S1scAb06、S1scAb11和S2H6对瘦素依赖性Ba/F3-lepR报告细胞的增殖的影响。同种型对照抗体用作阴性对照。

图2B显示了瘦素或抗瘦素受体抗体S2H1、S2H2、S2H3、S2H4、S2H5、S2H6和S2H7对瘦素依赖性Ba/F3-lepR报告细胞的增殖的影响。同种型对照抗体用作阴性对照。

图3A显示了瘦素或抗瘦素受体抗体S2H6对ob/ob小鼠体重的影响。对六周龄雌性ob/ob小鼠皮下施用载体(PBS，每天两次)、瘦素(0.5mg/kg，每天两次)或S2H6(5mg/kg，每隔一天一次)，持续两周(n＝8)。每天监测体重。

图3B显示了瘦素或抗瘦素受体抗体S2H6对ob/ob小鼠的食物摄入的影响。如图3A所述进行实验。每天监测食物摄入。

图3C显示了瘦素或抗瘦素受体抗体S2H6对ob/ob小鼠的血糖水平的影响。如图3A所述进行实验。每周测量两次血糖水平，并显示连续测量值。****：p<0.0001；***：p＝0.0001-0.001；**p＝0.001-0.01；*p＝0.01-0.05。

图3D显示了瘦素或抗瘦素受体抗体S2H6对ob/ob小鼠血液中的胰岛素水平的影响。如图3A所述进行实验。两周试验后，小鼠禁食16小时，并测量血胰岛素浓度。****：p<0.0001。

图3E显示了瘦素或抗瘦素受体抗体S2H6对ob/ob小鼠的葡萄糖耐量的影响。如图3A所述进行实验。两周试验后，小鼠禁食16小时，并进行腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)以评估机体代谢葡萄糖的能力。

图3F显示了瘦素或抗瘦素受体抗体S2H6对ob/ob小鼠中存在的体脂肪的影响。如图3A所述进行实验。两周试验后处死小鼠，分离指定的脂肪组织并称重。****：p<0.0001；***：p＝0.0001-0.001；**p＝0.001-0.01；*p＝0.01-0.05。

图4A显示了瘦素与S1scAb06抗体之间结合瘦素受体的竞争测定结果。在所述测定中使用增加浓度的瘦素(在X轴上指示)和指定固定浓度的S1scAb06抗体。结果表明，瘦素可以与S1scAb06抗体竞争结合瘦素受体，EC₅₀为6.55nM。

图4B显示了瘦素与S2H6抗体之间结合瘦素受体的竞争测定结果。在所述测定中使用增加浓度的瘦素(在X轴上指示)和指定固定浓度的S2H6抗体。结果表明瘦素不能与S2H6抗体竞争结合瘦素受体。

图5A-5D显示了瘦素受体激动剂S1scAb06(图5A)、S1scAb11(图5B)、S2H6(图5C)和瘦素(图5D)与重组瘦素受体(细胞外结构域)的结合动力学，如使用Biacore T200^TMSPR(表面等离子体共振)系统所测定的。线图描绘了在加入指定浓度的激动剂后，共振单位(RU，反映了表面的分析物结合能力的变化)随时间的变化。

图6显示了瘦素或抗瘦素受体抗体对突变瘦素受体激活的影响，如通过表达SIS诱导元件(SIE)-GFP报告基因的细胞使用GFP表达所测定的。

图7显示了抗体S2H6结合于细胞因子受体同源结构域。进行了S2H6与以下结构域结合的ELISA：瘦素受体胞外结构域、N末端结构域(NTD)、第一细胞因子受体同源结构域(CRH1)、免疫球蛋白样结构域(IgD)、第二细胞因子受体同源结构域(CRH2)和纤连蛋白III型结构域(FNIII)。

图8A显示了抗体S1scAb06的V_H结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。

图8B显示了抗体S1scAb06的V_H结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。V_H CDR1(SEQID NO:3)、V_H CDR2(SEQ ID NO:4)和V_H CDR3(SEQ ID NO:5)序列用带下划线的粗体字表示。

图8C显示了抗体S1scAb06的V_L结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。

图8D显示了抗体S1scAb06的V_L结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。V_L CDR1(SEQID NO:8)、V_L CDR2(SEQ ID NO:9)和V_L CDR3(SEQ ID NO:10)序列用带下划线的粗体字表示。

图9A显示了抗体S1scAb11的V_H结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)。

图9B显示了抗体S1scAb11的V_H结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。V_H CDR1(SEQID NO:13)、V_H CDR2(SEQ ID NO:14)和V_H CDR3(SEQ ID NO:15)序列用带下划线的粗体字表示。

图9C显示了抗体S1scAb11的V_L结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:16)。

图9D显示了抗体S1scAb11的V_L结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。V_L CDR1(SEQID NO:18)、V_L CDR2(SEQ ID NO:19)和V_L CDR3(SEQ ID NO:20)序列用带下划线的粗体字表示。

图10A显示了抗体S2H1的V_H结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)。

图10B显示了抗体S2H1的V_H结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。V_H CDR1(SEQ IDNO:23)、V_H CDR2(SEQ ID NO:24)和V_H CDR3(SEQ ID NO:25)序列用带下划线的粗体字表示。

图10C显示了抗体S2H1的V_L结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:26)。

图10D显示了抗体S2H1的V_L结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)。V_L CDR1(SEQ IDNO:28)、V_L CDR2(SEQ ID NO:29)和V_L CDR3(SEQ ID NO:30)序列用带下划线的粗体字表示。

图11A显示了抗体S2H2的V_H结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:31)。

图11B显示了抗体S2H2的V_H结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)。V_H CDR1(SEQ IDNO:33)、V_H CDR2(SEQ ID NO:34)和V_H CDR3(SEQ ID NO:35)序列用带下划线的粗体字表示。

图11C显示了抗体S2H2的V_L结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:36)。

图11D显示了抗体S2H2的V_L结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)。V_L CDR1(SEQ IDNO:38)、V_L CDR2(SEQ ID NO:39)和V_L CDR3(SEQ ID NO:40)序列用带下划线的粗体字表示。

图12A显示了抗体S2H3的V_H结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:41)。

图12B显示了抗体S2H3的V_H结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)。V_H CDR1(SEQ IDNO:43)、V_H CDR2(SEQ ID NO:44)和V_H CDR3(SEQ ID NO:45)序列用带下划线的粗体字表示。

图12C显示了抗体S2H3的V_L结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:46)。

图12D显示了抗体S2H3的V_L结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)。V_L CDR1(SEQ IDNO:48)、V_L CDR2(SEQ ID NO:49)和V_L CDR3(SEQ ID NO:50)序列用带下划线的粗体字表示。

图13A显示了抗体S2H4的V_H结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:51)。

图13B显示了抗体S2H4的V_H结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:52)。V_H CDR1(SEQ IDNO:53)、V_H CDR2(SEQ ID NO:54)和V_H CDR3(SEQ ID NO:55)序列用带下划线的粗体字表示。

图13C显示了抗体S2H4的V_L结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:56)。

图13D显示了抗体S2H4的V_L结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:57)。V_L CDR1(SEQ IDNO:58)、V_L CDR2(SEQ ID NO:59)和V_L CDR3(SEQ ID NO:60)序列用带下划线的粗体字表示。

图14A显示了抗体S2H5的V_H结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:61)。

图14B显示了抗体S2H5的V_H结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:62)。V_H CDR1(SEQ IDNO:63)、V_H CDR2(SEQ ID NO:64)和V_H CDR3(SEQ ID NO:65)序列用带下划线的粗体字表示。

图14C显示了抗体S2H5的V_L结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:66)。

图14D显示了抗体S2H5的V_L结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:67)。V_L CDR1(SEQ IDNO:68)、V_L CDR2(SEQ ID NO:69)和V_L CDR3(SEQ ID NO:70)序列用带下划线的粗体字表示。

图15A显示了抗体S2H6的V_H结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:71)。

图15B显示了抗体S2H6的V_H结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:72)。V_H CDR1(SEQ IDNO:73)、V_H CDR2(SEQ ID NO:74)和V_H CDR3(SEQ ID NO:75)序列用带下划线的粗体字表示。

图15C显示了抗体S2H6的V_L结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:76)。

图15D显示了抗体S2H6的V_L结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:77)。V_L CDR1(SEQ IDNO:78)、V_L CDR2(SEQ ID NO:79)和V_L CDR3(SEQ ID NO:80)序列用带下划线的粗体字表示。

图16A显示了抗体S2H7的V_H结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:81)。

图16B显示了抗体S2H7的V_H结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:82)。V_H CDR1(SEQ IDNO:83)、V_H CDR2(SEQ ID NO:84)和V_H CDR3(SEQ ID NO:85)序列用带下划线的粗体字表示。

图16C显示了抗体S2H7的V_L结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:86)。

图16D显示了抗体S2H7的V_L结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:87)。V_L CDR1(SEQ IDNO:88)、V_L CDR2(SEQ ID NO:89)和V_L CDR3(SEQ ID NO:90)序列用带下划线的粗体字表示。

具体实施方式

应当理解，本发明的某些方面、模式、实施方案、变体和特征在下文以各种详细程度进行描述，以便提供对本发明的实质性理解。

定义

下面提供了本说明书中使用的某些术语的定义。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

如本说明书和随附权利要求书中所用的，除非内容另外明确指示，否则单数形式“一”和“所述”包括复数个引用对象。例如，提及“一个细胞”包括两个或更多个细胞的组合等。一般而言，本文使用的命名法和下文描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学以及杂交中的实验室程序是本领域熟知和常用的那些。

如本文所用，关于数字的术语“约”通常被认为包括在数字的任一方向(大于或小于)的1％、5％或10％范围内的数字，除非另有说明或从上下文中另外可以看出(所述数字将小于可能值的0％或超过可能值的100％的情况除外)。

如本文所用，向受试者“施用”药剂、药物或肽包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)或局部。在一些实施方案中，本发明的抗瘦素受体抗体通过冠状动脉内途径或动脉内途径施用。施用包括自我施用和由他人施用。

如本文所用，术语“氨基酸”用于指包含至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机分子。通常，至少一个氨基位于相对于羧基的α位。术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸和合成氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜(methionine sulfoxide)、甲硫氨酸甲基锍(methionine methylsulfonium)。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的结构的化合物。氨基酸在本文中可以通过它们通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来指代。

如本文所用，术语“抗体”统指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，其包括例如但不限于任何脊椎动物(例如哺乳动物，如人类、山羊、兔子和小鼠，以及非哺乳动物物种，如鲨鱼免疫球蛋白)中的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合，以及在免疫反应过程中产生的类似分子。如本文所用，“抗体”(包括完整的免疫球蛋白)和“抗原结合片段”特异性地结合于目的分子(或一组高度相似的目的分子)，基本上排除结合于其他分子(例如抗体和抗体片段，其对目的分子的结合常数比生物样品中其他分子的结合常数至少大10³M^-1、至少大10⁴M^-1或至少大10⁵M^-1)。术语“抗体”还包括基因工程形式，例如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(例如，双特异性抗体)。另外参见Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)；Kuby,J.,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。

更具体而言，抗体是指至少包含特异性识别并结合抗原表位的免疫球蛋白轻链可变区或免疫球蛋白重链可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链组成，每条链都有可变区，称为重链可变(V_H)区和轻链可变(V_L)区。V_H区和V_L区一起负责结合由抗体识别的抗原。通常，免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。轻链有两种类型，lambda(λ)和kappa(κ)。有五个主要的重链类别(或同种型)，它们决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链和轻链都包含恒定区和可变区(这些区域也称为“结构域”)。组合时，重链和轻链可变区特异性结合抗原。轻链和重链可变区包含被三个高变区中断的“框架”区，高变区也称为“互补决定区”或“CDR”。已经定义了框架区和CDR的范围(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生与人类服务部，1991，其通过引用并入本文)。Kabat数据库现在在线维护。不同轻链或重链的框架区序列在一个物种内是相对保守的。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，主要采用β-折叠构象，并且CDR形成环，连接β-折叠结构，并且在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，框架区起到形成支架的作用，所述支架通过链间的非共价相互作用将CDR定位在正确的方向上。

CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始按顺序编号，并且通常也由特定CDR所在的链标识。因此，V_H CDR3位于发现它的抗体的重链的可变结构域中，而V_L CDR1是来自发现它的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合瘦素受体蛋白的抗体将具有特异性的V_H区和V_L区序列，因此具有特异性的CDR序列。具有不同特异性(即用于不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管CDR因抗体而异，但CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR中的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。如本文所用，“本发明的抗瘦素受体抗体”是指抗体(包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体、双特异性抗体等)以及抗体片段。抗体或其抗原结合片段特异性地结合于抗原。

如本文所用，术语“抗体相关多肽”是指抗原结合抗体片段(包括单链抗体)，其可单独包含可变区，或包含可变区以及全部或部分以下多肽元件：抗体分子的铰链区、CH₁、CH₂和CH₃结构域。所述技术还包括可变区和铰链区、CH₁、CH₂和CH₃结构域的任何组合。可用于本方法的抗体相关分子，例如但不限于Fab、Fab′和F(ab′)₂、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包含V_L或V_H结构域的片段。实例包括：(i)Fab片段，它是由V_L、V_H、C_L和CH₁结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，它是包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和CH₁结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)，它由V_H结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。因此，“抗体片段”或“抗原结合片段”可以包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段或抗原结合片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双价抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用，术语“缀合”是指两个分子通过本领域技术人员已知的任何方法进行缔合。合适的缔合类型包括化学键和物理键。化学键包括例如共价键和配位键。物理键包括例如氢键、偶极相互作用、范德华力、静电相互作用、疏水相互作用和芳族堆积。

如本文所用，术语“双价抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含在同一条多肽链(V_H V_L)中的与轻链可变结构域(V_L)连接的重链可变结构域(V_H)。通过使用因太短而不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双价抗体更充分地描述在例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。

如本文所用，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域V_L和V_H的抗体融合分子。单链抗体分子可以包含具有多个单独分子的聚合物，例如二聚体、三聚体或其他聚合物。此外，虽然Fv片段的两个结构域V_L和V_H由单独基因编码，但V_L和V_H可使用重组方法通过合成接头接合，使得它们可作为单一蛋白链制备，其中V_L和V_H区域配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv))。Bird等人(1988)Science 242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA85:5879-5883。这类单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶促或化学裂解来制备。

如本文所用，“抗原”是指抗体(或其抗原结合片段)可以选择性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原可以是多肽(例如瘦素受体多肽)。也可以将抗原施用于动物以在动物中产生免疫反应。

术语“抗原结合片段”是指整个免疫球蛋白结构的片段，其具有负责与抗原结合的多肽的一部分。可用于本发明的抗原结合片段的实例包括scFv、(scFv)₂、scFv-Fc、Fab、Fab′和F(ab′)₂，但不限于此。

使用本领域技术人员已知的常规技术获得任何上述抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的结合特异性和中和活性。

“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原或抗原肽)之间的总体非共价相互作用的强度。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(K_D)表示。亲和力可以通过本领域已知的标准方法测量，包括本文所述的那些。低亲和力复合物包含通常倾向于容易与抗原解离的抗体，而高亲和力复合物包含通常倾向于保持与抗原结合更长时间的抗体。

如本文所用，术语“生物样品”是指源自活细胞的样品材料。生物样品可以包括从受试者分离的组织、细胞、蛋白质或细胞膜提取物和生物体液(例如，腹水或脑脊液(CSF))，以及存在于受试者体内的组织、细胞和体液.本发明的生物样品包括但不限于自以下获取的样品：乳房组织、肾组织、子宫颈、子宫内膜、头部或颈部、胆囊、腮腺组织、前列腺、大脑、垂体、肾组织、肌肉、食道、胃、小肠、结肠、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、胸腺、血液、头发、口腔、皮肤、血清、血浆、CSF、精液、前列腺液、精浆、尿液、粪便、汗液、唾液、痰液、粘液、骨髓、淋巴和眼泪。生物样品也可以从内部器官的活组织检查中获得。生物样品可以从受试者获得以用于诊断或研究，也可以从非患病个体获得，作为对照或用于基础研究。样品可以通过包括例如静脉穿刺和手术活检的标准方法获得。在某些实施方案中，生物样品是脂肪组织。

如本文所用，“对照”是在实验中用于比较目的的替代样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如，如果实验的目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗功效的相关性，则通常使用阳性对照(已知显示期望治疗效果的化合物或组合物)和阴性对照(未接受治疗或接受安慰剂的受试者或样品)。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现期望治疗和/或预防效果的量，例如导致预防或减少本文所述的疾病或病症或一种或多种与本文所述的疾病或病症相关的体征或症状的量。在治疗或预防应用的情况下，施用于受试者的组合物的量将取决于以下因素而变化：组合物、疾病的程度、类型和严重性以及个体的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。熟练的技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。组合物也可以与一种或多种额外的治疗化合物组合施用。在本文所述的方法中，可将治疗组合物施用于具有本文所述的疾病或病症的一种或多种体征或症状的受试者。如本文所用，组合物的“治疗有效量”是指其中疾病或病症的生理效应得到改善或消除的组合物水平。可以在一次或多次施用中给予治疗有效量。

“分离的”或“纯化的”多肽或肽基本上不含来自衍生试剂的细胞或组织来源的细胞材料或其他污染多肽，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。例如，本发明的分离的抗瘦素受体抗体将不含会干扰试剂的诊断或治疗用途的材料。此类干扰材料可能包括酶、激素和其他蛋白质溶质和非蛋白质溶质。

如本文所用，术语“表位”是指能够特异性结合于抗体的蛋白质决定簇。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面组组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合会丧失，而与后者的结合则不会。在一些实施方案中，“表位”是本发明的抗瘦素受体抗体特异性结合的第二细胞因子受体同源结构域。在一些实施方案中，表位是构象表位或非构象表位。为了筛选与表位结合的抗瘦素受体抗体，可以进行常规交叉阻断测定，例如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Harlow and DavidLane编(1988)中所述的测定。所述测定可用于确定抗瘦素受体抗体是否与本发明的抗瘦素受体抗体结合相同的位点或表位。替代地或另外地，可以通过本领域已知的方法进行表位作图。例如，可以例如通过丙氨酸扫描对抗体序列进行诱变，以鉴定接触残基。在不同的方法中，对应于瘦素受体蛋白不同区域的肽可用于与测试抗体或与测试抗体和具有已表征或已知表位的抗体的竞争测定中。

如本文所用，“表达”包括以下一项或多项：将基因转录成前体mRNA；前体mRNA的剪接和其他加工以产生成熟的mRNA；mRNA稳定性；将成熟的mRNA翻译成蛋白质(包括密码子使用和tRNA可用性)；和翻译产物的糖基化和/或其他修饰，如果这是适当的表达和功能所需要的。

如本文所用，术语“基因”是指包含RNA产物的受调控生物合成的所有信息的DNA区段，其包括启动子、外显子、内含子和其他控制表达的非翻译区。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述位置可以为了比较的目的而被比对。当所比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在所述位置上是同源的。序列之间的同源性程度是序列具有的匹配或同源位置的数量的函数。多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一个序列具有一定百分比(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意味着，当比对时，碱基(或氨基酸)的百分比在比较两个序列时是相同的。这种比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定。在一些实施方案中，默认参数用于比对。一种比对程序是BLAST，其使用默认参数。特别地，程序是BLASTN和BLASTP，其使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；按＝高分排序；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的细节可以在国家生物技术信息中心找到。生物等效多核苷酸是那些具有指定同源性百分比并编码具有相同或相似生物活性的多肽的多核苷酸。如果两个序列彼此具有少于40％的同一性或少于25％的同一性，则它们被认为是“不相关的”或“非同源的”。

如本文所用，“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是嵌合抗体，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中受体的高变区残基被来自具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类动物的高变区残基取代。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修改以进一步改进抗体性能，例如结合亲和力。通常，人源化抗体将包含至少一个，通常是两个可变结构域(例如，Fab、Fab′、F(ab′)₂或Fv)的基本上全部，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区都是人免疫球蛋白共有FR序列的那些，尽管FR区可以包括一个或多个提高结合亲和力的氨基酸取代。FR中这些氨基酸取代的数量通常在H链中不超过6个，在L链中不超过3个。人源化抗体还可任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于其他细节，请参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。参见例如Ahmed&Cheung,FEBS Letters 588(2):288-297(2014)；Saxena&Wu,Frontiers in immunology 7:580(2016)。

如本文所用，术语“相同”或百分比“同一性”，当用于两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中时，是指在比较窗口或指定区域上比较和比对最大相似性时，两个或更多个序列或亚序列是相同的或具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域(例如，编码本文所述的抗体或本文所述的抗体的氨基酸序列的核苷酸序列)上约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法和下面描述的默认参数或通过手动比对和目视检查(例如，NCBI网站)所测量的。此类序列然后被称为“基本相同”。所述术语还指或可以应用于测试序列的互补序列。所述术语还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在一些实施方案中，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸，或长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。

如本文所用，术语“完整抗体”或“完整免疫球蛋白”是指至少具有通过二硫键互连的两条重(H)链多肽和两条轻(L)链多肽的抗体。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或V_H)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH₁、CH₂和CH₃构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或V_L)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域C_L构成。V_H和V_L区可进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布有被称为框架区(FR)的更保守区域。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR₁、CDR₁、FR₂、CDR₂、FR₃、CDR₃、FR₄。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)，和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。

如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可以是个体有机体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中，个体、患者或受试者是人。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体，即，构成所述群体的单独抗体是相同的，除了可能以少量存在的天然发生的突变。例如，单克隆抗体可以是衍生自单个克隆的抗体，其包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是产生它的方法。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体是高特异性的，其针对单抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体中获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，其包括例如但不限于杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。例如，根据本发明的方法使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人,Nature 256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)制备。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等人,Nature352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离得到。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌化合物、等渗和吸收延迟化合物等。药学上可接受的载体及其制剂是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Remington′s PharmaceuticalSciences(第20版,A.Gennaro编,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.)。

如本文所用，疾病或病症的“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指这样的一种化合物，其在统计样品中相对于未处理的对照样品减少经处理样品中疾病或病症的发生率，或相对于未处理的对照样品延迟疾病或病症的发作或降低疾病或病症的一种或多种症状的严重性。

如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以表示包含通过肽键或修饰的肽键(即，肽等排体)彼此连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。多肽既指短链，通常称为肽、糖肽或寡聚体，也指长链，通常称为蛋白质。多肽可能含有除20种基因编码氨基酸之外的氨基酸。多肽包括通过天然过程如翻译后加工或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。

如本文所用，术语“分开的”治疗使用是指同时或基本上同时通过不同途径施用至少两种活性成分。

如本文所用，术语“顺序”治疗使用是指在不同时间施用至少两种活性成分，施用途径是相同或不同的。更具体地，顺序使用是指在全部施用一种活性成分之后，施用另一种或其他活性成分。因此，可以在几分钟、几小时或几天内施用一种活性成分之后，施用另一种或多种活性成分。在这种情况下没有同时治疗。

如本文所用，术语“同时”治疗使用是指通过相同途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。

如本文所用，“特异性结合”是指识别和结合另一个分子(例如，抗原)但基本上不识别和结合其他分子的分子(例如，抗体或其抗原结合片段)。如本文所用，术语对特定分子(例如多肽，或多肽上的表位)的“特异性结合”、“特异性地结合”或“具有特异性”例如可以通过分子对其所结合的分子的K_D为约10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M来展示。术语“特异性结合”还可以指在分子(例如抗体或其抗原结合片段)结合特定多肽(例如瘦素受体多肽)或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位的情况下的结合。

如本文所用，术语“受试者”、“个体”或“患者”可以是个体有机体、脊椎动物、哺乳动物或人。

如本文所用的“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”涵盖在受试者例如人中的本文所述的疾病或病症的治疗，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即，阻止其发展；(ii)缓解疾病或病症，即，导致病症消退；(iii)减缓病症的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。例如，如果受试者在根据本文所述的方法接受治疗量的本发明的抗瘦素受体抗体之后，表现出可观察和/或可测量的突变瘦素受体功能的恢复，则受试者被成功地“治疗”了肥胖、瘦素缺乏、瘦素抵抗和/或低瘦素血症。

还应理解，如本文所述的各种病症治疗模式旨在表示“基本上”，其包括完全治疗但也小于完全治疗，并且其中实现了一些生物学或医学相关结果。治疗可以是针对慢性疾病的连续延长治疗或用于治疗急性病症的单次或几次给药。

考虑了本文所述的抗瘦素受体抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗瘦素受体抗体的氨基酸序列变体通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。只要获得的抗体具有期望的特性，就可以进行缺失、插入和替换的任何组合以获得目的抗体。修饰还包括蛋白质糖基化模式的改变。取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑了FR改变。“保守取代”如下表所示。

一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基。产生这类取代变体的一种方便方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。具体而言，突变几个高变区位点(例如，6-7个位点)以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒中展示，作为与包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合体。然后如本文公开的，筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如，结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。替代地或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基和相邻残基是根据本文阐述的技术进行取代的候选者。一旦产生了这样的变体，就如本文所述对一组变体进行筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有相似或优越特性的抗体用于进一步开发。

瘦素、瘦素受体以及与瘦素缺乏或不足相关或由瘦素缺乏或不足引起的病症

瘦素是一种16kD蛋白，通过抑制食物摄入和刺激能量消耗，在体重调节中发挥着关键作用。瘦素生产的缺陷会导致啮齿动物和人的严重遗传性肥胖。除了对体重的影响外，瘦素还具有各种其他功能，包括调节造血、血管生成、伤口愈合以及免疫和炎症反应。LEP基因是小鼠“肥胖”表型中的基因(ob)突变体的人类同源物。瘦素缺乏的特征是严重的早发性肥胖、贪食、促性腺激素功能减退和神经内分泌/代谢功能障碍。Ozata等人,J.Clin.Endocr.Metab.84:3686-3695(1999)。

瘦素通过瘦素受体(LEPR)发挥作用，LEPR是细胞因子受体家族的一种跨膜结构域受体，以若干种选择性剪接形式存在于许多组织中。位于1p31的瘦素受体基因编码I类细胞因子受体家族的单个跨膜受体。与瘦素缺乏/不足相关或由瘦素缺乏/不足引起的病症包括低瘦素血症、瘦素抵抗以及由导致瘦素信号传导缺陷或受损的瘦素受体突变引起的病症。例如，瘦素受体(LEPR)的某些突变导致严重的早发性肥胖、糖尿病。White和Tartaglia,Cytokine Growth Factor Rev 7:303-309(1996)；Chen等人Cell 84:491-495(1996)；Morton和Schwartz,Physiol Rev91:389-411(2011)；Bjorbaek和Kahn,Recent ProgHormone Res 59:305-331(2004)；以及Wauman和Tavernier,Front Biosci 17:2771-2793(2012)。

本发明的免疫球蛋白相关组合物

本发明描述了用于产生和使用抗瘦素受体免疫球蛋白相关组合物(例如，抗瘦素受体抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物。本发明的抗瘦素受体抗体是瘦素受体激动剂；即，本发明的抗瘦素受体抗体与瘦素受体的结合导致瘦素受体信号传导的激活。因此，本发明的抗瘦素受体抗体是有用的，例如用于模拟、替代或补充受试者中瘦素的正常生物活性。因此，本发明的抗体和抗原结合片段可用于与瘦素抵抗和瘦素缺乏或功能障碍相关的疾病和病症的治疗性治疗。

因此，本发明的抗瘦素受体免疫球蛋白相关组合物可用于诊断或治疗与瘦素受体缺陷相关的病症，包括肥胖、糖尿病、瘦素缺乏、瘦素抵抗和低瘦素血症。本发明范围内的抗瘦素受体免疫球蛋白相关组合物包括例如但不限于特异性结合目标多肽、同系物、衍生物或其片段的单克隆、嵌合、人源化、双特异性抗体和双价抗体。本发明还提供了本文公开的任何抗瘦素受体抗体的抗原结合片段，其中抗原结合片段选自由Fab、F(ab)′2、Fab’、scF_v和F_v组成的组。本发明公开了可激活在瘦素结合或瘦素介导的信号传导方面有缺陷或受损的瘦素受体突变体的抗瘦素受体抗体形式。

图8-16提供了V_H和V_L的核苷酸和氨基酸序列以及本文公开的抗体的CDR序列(SEQID NO:1-90)。

本发明提供了一种抗瘦素受体抗体或其抗原结合片段，其包含重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)和轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，其中V_H包含选自由以下组成的组的V_H-CDR1序列：SEQ ID NO:3、13、23、33、43、53、63、73和83；选自由以下组成的组的V_H-CDR2序列：SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74和84；和选自由以下组成的组的V_H-CDR3序列：SEQID NO:5、15、25、35、45、55、65、75和85；并且V_L包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：选自由以下组成的组的V_L-CDR1序列：SEQ ID NO:8、18、28、38、48、58、68、78和88；选自由以下组成的组的V_L-CDR2序列：SEQ ID NO:9、19、29、39、49、59、69、79和89；和选自由以下组成的组的V_L-CDR3序列：SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60、70、80和90。在一些实施方案中，抗体还包含任何同种型的Fc结构域，所述同种型例如但不限于IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE或IgM和IgY。

恒定区序列的非限制性实例包括：

人IgD恒定区，Uniprot：P01880(SEQ ID NO:91)

人IgG1恒定区，Uniprot：P01857(SEQ ID NO:92)

人IgG2恒定区，Uniprot：P01859(SEQ ID NO:93)

人IgG3恒定区，Uniprot：P01860(SEQ ID NO:94)

人IgM恒定区，Uniprot：P01871(SEQ ID NO:95)

人IgG4恒定区，Uniprot：P01861(SEQ ID NO:96)

人IgA1恒定区，Uniprot：P01876(SEQ ID NO:97)

人IgA2恒定区，Uniprot：P01877(SEQ ID NO:98)

人Igκ恒定区，Uniprot：P01834(SEQ ID NO:99)

在一些实施方案中，本发明的免疫球蛋白相关组合物包含与SEQ ID NO:91-98至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的重链恒定区。另外地或替代地，在一些实施方案中，本发明的免疫球蛋白相关组合物包含与SEQ ID NO:99至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明的免疫球蛋白相关组合物结合于瘦素受体的CRH2结构域。在一些实施方案中，表位是构象表位。

在另一方面，本发明提供一种分离的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或抗原结合片段)，其包含V_H氨基酸序列，所述V_H氨基酸序列包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:82，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。另外地或替代地，在一些实施方案中，本发明的免疫球蛋白相关组合物包含V_L氨基酸序列，所述V_L氨基酸序列包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:87，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。

在一些实施方案中，本发明的免疫球蛋白相关组合物包含选自由以下组成的组的V_H氨基酸序列和V_L氨基酸序列：分别是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7(S1scAb06)；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17(S1scAb11)；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27(S2H1)；SEQ ID NO:32和SEQID NO:37(S2H2)；SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:47(S2H3)；SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:57(S2H4)；SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:67(S2H5)；SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:77(S2H6)；SEQID NO:82和SEQ ID NO:87(S2H7)。

在免疫球蛋白相关组合物的任何上述实施方案中，重链(HC)和轻链(LC)免疫球蛋白可变结构域序列形成抗原结合位点，其结合于瘦素受体的CRH2结构域。在一些实施方案中，表位是构象表位。

在一些实施方案中，HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列是同一条多肽链的组分。在其他实施方案中，HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列是不同多肽链的组分。在某些实施方案中，抗体是全长抗体。

在一些实施方案中，本发明的免疫球蛋白相关组合物特异性结合于至少一种瘦素受体多肽。在一些实施方案中，本发明的免疫球蛋白相关组合物以约10^-3M、10^-4M、10^-5M、10^{- 6}M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M的解离常数(K_D)结合至少一种瘦素受体多肽。在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。在一些实施方案中，抗体包含人抗体框架区。

在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物包括一种或多种以下特征：(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列，所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列与SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77或87中任一者中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同；和/或(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列，所述重链免疫球蛋白可变结构域序列与SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72或82中任一者中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。在另一方面，本文提供的免疫球蛋白相关组合物中的一个或多个氨基酸残基被另一种氨基酸取代。所述取代可以是如本文所定义的“保守取代”。

在一些方面，本文所述的抗瘦素受体免疫球蛋白相关组合物包含结构修饰以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，本发明的抗瘦素受体免疫球蛋白相关组合物(例如抗体)可以在CH2恒定重链区中包含缺失以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，Fab片段用于促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)′₂片段用于促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。

在一个方面，本发明提供了一种编码本文所述的任何免疫球蛋白相关组合物的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列选自由SEQ ID NO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66、71、76、81和86组成的组。

在另一方面，本发明提供了一种宿主细胞或表达载体，其表达编码本文所述的任何免疫球蛋白相关组合物的任何核酸序列。

本发明的免疫球蛋白相关组合物(例如抗瘦素受体抗体)可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更大的多特异性。多特异性抗体可以特异于一种或多种瘦素受体多肽的不同表位，或者可以特异于瘦素受体多肽以及异源组合物，例如异源多肽或固体支持材料。参见例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利号5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648、6,106,835；Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。在一些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是嵌合的。在一些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是人源化的。

本发明的免疫球蛋白相关组合物可进一步在N-端或C-端重组融合至异源多肽，或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至多肽或其他组合物。例如，本发明的免疫球蛋白相关组合物可以重组融合或缀合至在检测测定中用作标记的分子和效应分子，例如异源多肽、药物或毒素。参见例如WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995；和EP 0 396 387。

在本发明的免疫球蛋白相关组合物的任何上述实施方案中，抗体或抗原结合片段可以任选地缀合至选自由以下组成的组的试剂：同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。对于化学键或物理键，免疫球蛋白相关组合物上的官能团通常与试剂上的官能团缔合。或者，试剂上的官能团与免疫球蛋白相关组合物上的官能团缔合。

试剂和免疫球蛋白相关组合物上的官能团可以直接缔合。例如，试剂上的官能团(例如，巯基)可以与免疫球蛋白相关组合物上的官能团(例如，巯基)缔合以形成二硫化物。或者，官能团可以通过交联剂(即，接头)缔合。下面描述了一些交联剂的实例。交联剂可以连接至试剂或免疫球蛋白相关组合物。缀合物中的试剂或免疫球蛋白相关组合物的数量也受到另一者上存在的官能团数量的限制。例如，与缀合物相关的试剂的最大数量取决于免疫球蛋白相关组合物上存在的官能团的数量。或者，与试剂缔合相关的免疫球蛋白相关组合物的最大数量取决于试剂上存在的官能团的数量。

在又一个实施方案中，缀合物包含与一种试剂缔合的一种免疫球蛋白相关组合物。在一个实施方案中，缀合物包含与至少一种免疫球蛋白相关组合物化学键合(例如缀合)的至少一种试剂。所述试剂可以通过本领域技术人员已知的任何方法与免疫球蛋白相关组合物化学键合。例如，试剂上的官能团可以直接连接至免疫球蛋白相关组合物上的官能团。合适的官能团的一些实例包括例如氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基和羟基。

所述试剂还可以通过交联剂例如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺等化学键合至免疫球蛋白相关组合物。例如，交联剂可以从Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,Ill获得。The Pierce Biotechnology,Inc.网站可以提供帮助。额外的交联剂包括KreatechBiotechnology,B.V.,Amsterdam,The Netherlands的美国专利5,580,990、5,985,566和6,133,038中描述的铂交联剂。

或者，试剂和免疫球蛋白相关组合物上的官能团可以相同。同双功能交联剂通常用于交联相同的官能团。同双功能交联剂的实例包括EGS(即乙二醇双[琥珀酰亚胺琥珀酸酯])、DSS(即二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、DMA(即二亚胺代己二酸二甲酯.2HCl)、DTSSP(即3,3′-二硫代双[磺基琥珀酰亚胺丙酸酯])、DPDPB(即1,4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷)和BMH(即双马来酰亚胺基己烷)。此类同双功能交联剂也可从PierceBiotechnology,Inc获得。

在其他情况下，从免疫球蛋白相关组合物中裂解试剂可能是有益的。上述PierceBiotechnology,Inc.的网站也可以帮助本领域技术人员选择可以被例如细胞中的酶裂解的合适交联剂。因此，所述试剂可以与免疫球蛋白相关组合物分离。可裂解接头的实例包括SMPT(即，4-琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基-a-[2-吡啶基二硫代]甲苯)、磺基-LC-SPDP(即，磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、LC-SPDP(即，琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)，磺基-LC-SPDP(即，磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代])-丙酰胺基)己酸酯)、SPDP(即，N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基己酸酯)和AEDP(即，3-[(2-氨基乙基)二硫代]丙酸盐酸盐)。

在另一个实施方案中，缀合物包含与至少一种免疫球蛋白相关组合物物理结合的至少一种试剂。可以使用本领域技术人员已知的任何方法将试剂与免疫球蛋白相关组合物物理结合。例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将免疫球蛋白相关组合物和试剂混合在一起。混合的顺序并不重要。例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将试剂与免疫球蛋白相关组合物物理混合。例如，可以将免疫球蛋白相关组合物和试剂放置在容器中并搅拌(例如通过摇动容器)，以混合免疫球蛋白相关组合物和试剂。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法来修饰免疫球蛋白相关组合物。例如，免疫球蛋白相关组合物可以通过如上所述的交联剂或官能团进行修饰。

制剂

举例来说，本发明的抗瘦素受体抗体被配制在简单的递送载体中。然而，本发明的抗瘦素受体抗体可以冻干或掺入凝胶、乳膏、生物材料、缓释递送载体中。

本发明的抗瘦素受体抗体通常与药学上可接受的载体组合。术语“药学上可接受的载体”是指本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体并且可以在没有过度毒性的情况下施用的任何药用载体。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。此类载体是本领域普通技术人员熟知的。治疗组合物中的药学上可接受的载体可以包括液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等，也可以存在于此类载体中。药学上可接受的盐也可以存在于药物组合物中，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。

本发明的抗瘦素受体抗体可以敷料的形式提供。也就是说，本发明的抗瘦素受体抗体以液体、半固体或固体组合物的形式提供，用于直接施用于皮肤表面，或者将所述组合物施用于固体皮肤接触层例如敷料纱布或薄膜的表面，或掺入其中。敷料组合物可以流体或凝胶的形式提供。本发明的抗瘦素受体抗体可以与常规药物赋形剂组合提供，用于局部施用于伤口。合适的载体包括：含有纤维素衍生物的水凝胶，其包括羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素及其混合物；和含有聚丙烯酸(卡波(Carbopol))的水凝胶。合适的载体还包括用于局部药物制剂的乳膏/软膏，例如基于聚西托醇乳化软膏的乳膏。上述载体可以包括海藻酸盐(作为增稠剂或刺激剂)、防腐剂如苯甲醇、控制pH的缓冲剂如磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、调节渗透压的试剂如氯化钠，和稳定剂如EDTA。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段被配制成软膏、油膏、凝胶或乳膏。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段被配制成注射剂。

给药模式和有效剂量

可以使用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与免疫球蛋白相关组合物接触的任何方法。合适的方法包括体外、离体或体内方法。体内方法通常包括将本发明的抗瘦素受体抗体，例如上文描述的那些，施用于哺乳动物，合适地是人。当体内用于治疗时，本发明的抗瘦素受体抗体以有效量(即，具有期望治疗效果的量)施用于受试者。剂量和给药方案将取决于受试者中疾病症状的程度、所使用的本发明的特定抗瘦素受体抗体的特征(例如其治疗指数)、受试者和受试者病史。

有效量可以在临床前试验和临床试验期间通过医师和临床医师熟悉的方法确定。有效量的可用于这些方法的免疫球蛋白相关组合物可通过用于施用药物化合物的许多众所周知的方法中的任一种施用于有需要的哺乳动物。免疫球蛋白相关组合物可以全身或局部施用。

本文所述的本发明的抗瘦素受体抗体可掺入药物组合物中，以单独或组合施用于受试者，用于治疗或预防本文所述的病症。此类组合物通常包括活性剂和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充活性化合物也可以掺入组合物中。

药物组合物通常被配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内、皮内、腹膜内或皮下)、口服、吸入、经皮(局部)、眼内、离子电渗疗法和经粘膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。pH值可以用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。为方便患者或治疗医师，可在包含治疗过程(如7天治疗)所需的所有必要设备(如药瓶、稀释剂瓶、注射器和针头)的试剂盒中提供给药制剂。

在一些实施方案中，本发明的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段通过肠胃外途径施用。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段通过局部途径施用。

适用于可注射用途的药物组合物可包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，用于肠胃外施用的组合物必须是无菌的并且应该是流体，以达到易于注射的程度。它在制造和储存条件下应该是稳定的，并且必须被防腐保存以防止例如细菌和真菌的微生物的污染作用。

本文所述的免疫球蛋白相关组合物可以包括载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用涂层如卵磷脂、通过在分散液的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。可以包括谷胱甘肽及其他抗氧化剂以防止氧化。在许多情况下，组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶来延长可注射组合物的吸收。

可以通过将所需量的活性化合物与上面列举的成分中的一种或组合(根据需要)掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散液是通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备的，所述载体含有基本分散介质和来自上述列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其可以从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂组合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用，例如明胶胶囊。口服组合物也可以使用流体载体制备，用作漱口水。药学相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有以下任何成分或类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂。

对于吸入施用，本发明的免疫球蛋白相关组合物可以气溶胶喷雾剂的形式从包含合适的推进剂(例如气体，如二氧化碳)的加压容器或分配器，或喷雾器中递送。此类方法包括在美国专利号6,468,798中描述的那些。

如本文所述的本发明的免疫球蛋白相关组合物的全身施用也可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，制剂中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂来完成。对于经皮施用，将活性化合物配制成本领域公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。在一个实施方案中，可通过离子电渗法进行经皮施用。

本发明的免疫球蛋白相关组合物可以在载体系统中配制。载体可以是胶体系统。胶体系统可以是脂质体，这是一种磷脂双层载体。在一个实施方案中，治疗性免疫球蛋白相关组合物被封装在脂质体中，同时保持结构完整性。如本领域技术人员将理解的，存在多种制备脂质体的方法。(参见Lichtenberg等人,Methods Biochem.Anal.,33:337-462(1988)；Anselem等人,Liposome Technology,CRC Press(1993))。脂质体制剂可以延迟清除并增加细胞摄取(参见Reddy,Ann.Pharmacother.,34(7-8):915-923(2000))。还可以将活性剂加载到由药学上可接受的成分制备的颗粒中，这些成分包括但不限于可溶性、不溶性、可渗透性、不可渗透性、可生物降解或胃滞留性聚合物或脂质体。此类颗粒包括但不限于纳米颗粒、可生物降解的纳米颗粒、微粒、可生物降解的微粒、纳米球、可生物降解的纳米球、微球、可生物降解的微球、胶囊、乳液、脂质体、胶束和病毒载体系统。

载体也可以是聚合物，例如可生物降解的、生物相容的聚合物基质。在一个实施方案中，本发明的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段可以嵌入聚合物基质中，同时保持蛋白质完整性。聚合物可以是天然的，例如多肽、蛋白质或多糖，或合成的，例如聚α-羟基酸。实例包括由例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶及其组合制成的载体。在一个实施方案中，聚合物是聚乳酸(PLA)或共聚乳酸/乙醇酸(PGLA)。聚合物基质可以多种形式和尺寸制备和分离，包括微球和纳米球。聚合物制剂可以延长治疗效果的持续时间。(参见Reddy,Ann.Pharmacother.,34(7-8):915-923(2000))。用于人类生长激素(hGH)的聚合物制剂已用于临床试验。(参看Kozarich和Rich,ChemicalBiology,2:548-552(1998))。

聚合物微球缓释制剂的实例描述于PCT公开WO 99/15154(Tracy等人)、美国专利号5,674,534和5,716,644(皆授予Zale等人)、PCT公开WO 96/40073(Zale等人)和PCT公开WO 00/38651(Shah等人)。美国专利号5,674,534和5,716,644以及PCT公开WO 96/40073描述了一种包含促红细胞生成素颗粒的聚合物基质，这些颗粒被盐稳定以防止聚集。

在一些实施方案中，本发明的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段与将保护抗瘦素受体抗体或抗原结合片段免于从体内快速消除的载体一起制备，例如控释制剂，其包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂可以使用已知技术制备。材料也可以从商业上获得，例如从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.获得。脂质体悬浮液(包括靶向特异性细胞的脂质体，其具有针对细胞特异性抗原的单克隆抗体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利号4,522,811中所述。

本发明的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段也可以被配制以增强细胞内递送。例如，脂质体递送系统是本领域已知的，参见例如Chonn和Cullis,“Recent Advances inLiposome Drug Delivery Systems,”Current Opinion in Biotechnology 6:698-708(1995)；Weiner,“Liposomes for Protein Delivery:Selecting Manufacture andDevelopment Processes,”Immunomethods,4(3):201-9(1994)；和Gregoriadis,“Engineering Liposomes for Drug Delivery:Progress and Problems,”TrendsBiotechnol.,13(12):527-37(1995)。Mizguchi等人,Cancer Lett.,100:63-69(1996)描述了使用融合脂质体将蛋白质体内和体外递送至细胞。

本发明的抗瘦素受体抗体的剂量、毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如，用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为比值LD50/ED50。在一些实施方案中，本发明的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段表现出高治疗指数。虽然可以使用表现出毒副作用的本发明的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段，但应注意设计一种将此类化合物靶向到受影响组织的部位的递送系统，以尽量减少对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于制定用于人类的一系列剂量。此类化合物的剂量在包括ED50在内的循环浓度范围内，毒性很小或没有毒性。根据所用剂型和所用施用途径，剂量可在此范围内变化。对于方法中使用的本发明的任何抗瘦素受体抗体或抗原结合片段，治疗有效剂量可以最初从细胞培养测定来估计。可以在动物模型中制定剂量以达到循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养中测定的IC50(即，实现症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)。此类信息可用于更准确地确定人体内的有用剂量。例如，可以通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。

通常，足以实现治疗或预防效果的本发明的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段的有效量在每天每公斤体重约0.000001mg至每天每公斤体重约10,000mg的范围内。合适地，剂量范围为每天每公斤体重约0.0001mg至每天每公斤体重约100mg。例如，剂量可以是每天、每两天或每三天1mg/kg体重或10mg/kg体重，或在每周、每两周或每三周1-10mg/kg的范围内。在一个实施方案中，免疫球蛋白相关组合物的单剂量范围为每公斤体重0.001-10,000微克。在一个实施方案中，本发明的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段在载体中的浓度范围为每递送毫升0.2至2000微克。示例性治疗方案需要每天一次或每周一次施用。在治疗应用中，有时需要以相对短的间隔使用相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且直到受试者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以对患者施用预防性方案。

在一些实施方案中，本发明的免疫球蛋白相关组合物的治疗有效量可以定义为靶组织处10^-12至10^-6摩尔，例如大约10^-7摩尔的免疫球蛋白相关组合物的浓度。所述浓度可通过0.001至100mg/kg的全身剂量或按体表面积计算的等效剂量来递送。将优化给药方案以维持靶组织处的治疗浓度。在一些实施方案中，剂量通过单次每日或每周施用来施用，但也可包括连续施用(例如，肠胃外输注或经皮应用)。在一些实施方案中，本发明的免疫球蛋白相关组合物的剂量以“低”、“中”或“高”剂量水平提供。在一个实施方案中，提供的低剂量为约0.0001至约0.5mg/kg/h，合适地为约0.001至约0.1mg/kg/h。在一个实施方案中，提供的中剂量为约0.01至约1.0mg/kg/h，合适地为约0.01至约0.5mg/kg/h。在一个实施方案中，提供的高剂量为约0.5至约10mg/kg/h，合适地为约0.5至约2mg/kg/h。

例如，治疗有效量可以部分或完全减轻肥胖、瘦素缺乏、瘦素抵抗和/或低瘦素血症的一种或多种症状，包括体重增加、食物摄入增加、血糖水平增加、胰岛素水平降低，葡萄糖耐量降低等。

本领域技术人员将理解某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄，和存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的本文所述的治疗组合物治疗受试者可包括单一治疗或一系列治疗。

根据本发明方法治疗的哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括例如农场动物，例如羊、猪、牛和马；宠物，例如狗和猫；实验动物，如大鼠、小鼠和兔子。在一些实施方案中，哺乳动物是人。

本发明的抗瘦素受体抗体的用途

概述。本发明的抗瘦素受体抗体可用于本领域已知的与瘦素受体蛋白或其突变体的定位和/或定量相关的方法(例如，用于测量适当生理样品内瘦素受体的水平、用于诊断方法、用于对多肽成像等)。本发明的抗瘦素受体抗体可用于通过标准技术例如亲和层析或免疫沉淀来分离瘦素受体。本发明的抗瘦素受体抗体可以促进从生物样品(例如哺乳动物血清或细胞)纯化天然免疫反应性瘦素受体以及促进纯化在宿主系统中表达的重组产生的免疫反应性瘦素受体。此外，本发明的抗瘦素受体抗体可用于检测免疫反应性瘦素受体(例如，在血浆、细胞裂解物或细胞上清液中的)，以评估免疫反应性多肽的丰度和表达模式。本发明的抗瘦素受体抗体可以在诊断上用于监测组织中的免疫反应性瘦素受体水平，作为临床测试程序的一部分，例如，以确定给定治疗方案的功效。如上所述，可通过将本发明的抗瘦素受体抗体与可检测物质偶联(即物理连接)来促进检测。

瘦素受体的检测。用于检测生物样品中存在或不存在免疫反应性瘦素受体的示例性方法包括从测试对象获得生物样品，并将所述生物样品与能够检测免疫反应性瘦素受体的本发明的抗瘦素受体抗体接触，从而在生物样品中检测到免疫反应性瘦素受体的存在。检测可以通过附着在抗体上的可检测标记来完成。

关于本发明的抗瘦素受体抗体的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质与抗体偶联(即物理连接)来直接标记抗体，以及通过与另一种直接标记的化合物(如二抗)的反应性间接标记抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗检测一抗，和用生物素对DNA探针进行末端标记，从而可以用荧光标记的链霉亲和素检测所述DNA探针。

在一些实施方案中，本文公开的本发明的抗瘦素受体抗体与一种或多种可检测标记缀合。对于此类用途，本发明的抗瘦素受体抗体可以通过共价或非共价连接显色标记、酶标记、放射性同位素标记、同位素标记、荧光标记、毒性标记、化学发光标记、核磁共振造影剂标记或其他标记来可检测地标记。

合适的显色标记的实例包括二氨基联苯胺和4-羟基偶氮-苯-2-羧酸。合适的酶标记的实例包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。

合适的放射性同位素标记的实例包括³H、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³⁵S、¹⁴C、⁵¹Cr、⁵⁷To、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、¹⁵²Eu、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、²¹⁷Ci、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷Sc、¹⁰⁹Pd等。¹¹¹In是使用体内成像的示例性同位素，因为它避免了¹²⁵I或¹³¹I标记的瘦素受体-蛋白结合抗体被肝脏脱卤的问题。此外，这种同位素具有更利于成像的伽马发射能量(Perkins等人,Eur.J.Nucl.Med.70:296-301(1985)；Carasquillo等人,J.Nucl.Med.25:281-287(1987))。例如，¹¹¹In与含有1-(对异硫氰氧基苯甲基)-DPTA的单克隆抗体偶联后，在非肿瘤组织、尤其是肝脏中几乎没有摄取，并增强了肿瘤定位的特异性(Esteban等人,J.Nucl.Med.28:861-870(1987))。合适的非放射性同位素标记的实例包括¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Tr和⁵⁶Fe。

合适的荧光标记的实例包括¹⁵²Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸酯标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二甲醛标记和荧光胺标记。合适的毒素标记的实例包括白喉毒素、蓖麻毒素和霍乱毒素。

化学发光标记的实例包括鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、荧光素标记、荧光素酶标记和水母发光蛋白标记。核磁共振造影剂的实例包括重金属核，例如Gd、Mn和铁。

本发明的检测方法可用于体外和体内检测生物样品中的免疫反应性瘦素受体。用于检测免疫反应性瘦素受体的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光。此外，用于检测免疫反应性瘦素受体的体内技术包括将标记的抗瘦素受体抗体引入受试者。例如，本发明的抗瘦素受体抗体可以用放射性标记物标记，所述放射性标记物在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术检测。在一个实施方案中，生物样品含有来自测试对象的瘦素受体分子。

免疫测定和成像。本发明的抗瘦素受体抗体可用于使用基于抗体的技术测定生物样品(例如人血浆)中的免疫反应性瘦素受体水平。例如，可以用经典的免疫组织学方法研究组织中的蛋白质表达。Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.101:976-985,1985；Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.105:3087-3096,1987。其他可用于检测蛋白质基因表达的基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的并且包括酶标记(例如葡萄糖氧化酶)和放射性同位素或其他放射性试剂，例如碘(¹²⁵I、¹²¹I、¹³¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹²In)和锝(⁹⁹mTc)，以及荧光标记，例如荧光素、罗丹明和绿色荧光蛋白(GFP)，以及生物素。

除了测定生物样品中的免疫反应性瘦素受体水平以外，本发明的抗瘦素受体抗体可用于瘦素受体的体内成像。可用于所述方法的抗体包括可通过X射线照相术、NMR或ESR检测到的抗体。对于X射线照相术，合适的标记包括放射性同位素，例如钡或铯，它们会发出可检测的辐射，但不会对受试者造成明显的伤害。用于NMR和ESR的合适标记物包括具有可检测特征自旋的标记物，例如氘，通过标记相关scFv克隆的营养物，可以将这些标记物掺入本发明的抗瘦素受体抗体中。

已用适当的可检测成像部分(例如放射性同位素(例如，¹³¹I、¹¹²In、⁹⁹mTc)、不透射线的物质或可通过核磁共振检测到的材料)标记的本发明的抗瘦素受体抗体被引入(例如，肠胃外、皮下或腹膜内)到受试者中。本领域将理解，受试者的大小和所使用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的数量。在放射性同位素部分的情况下，对于人类受试者，注入的放射性的数量通常在约5到20毫居里的⁹⁹mTc的范围内。然后，标记的抗瘦素受体抗体将积聚在含有特异性靶多肽的细胞位置。例如，本发明的标记的抗瘦素受体抗体将在受试者体内积聚在瘦素受体已定位的细胞和组织中。

因此，本发明提供了一种医学病症的诊断方法，其包括：(a)通过测量本发明的抗瘦素受体抗体在个体的细胞或体液中的结合来测定免疫反应性瘦素受体的表达；(b)将样品中存在的免疫反应性瘦素受体的量与标准参考进行比较，其中免疫反应性瘦素受体水平与标准相比的增加或降低指示医学病症。

亲和纯化。本发明的抗瘦素受体抗体可用于从样品中纯化免疫反应性瘦素受体。在一些实施方案中，抗体被固定在固体支持物上。此类固体支持物的实例包括塑料如聚碳酸酯、复合碳水化合物如琼脂糖和sepharose、丙烯酸树脂和聚丙烯酰胺和乳胶珠。将抗体与此类固体支持物偶联的技术是本领域众所周知的(Weir等人,“Handbook ofExperimental Immunology”第4版,Blackwell Scientific Publications,Oxford,England,Chapter 10(1986)；Jacoby等人,Meth.Enzym.34Academic Press,N.Y.(1974))。

将抗原结合到抗体支持基质上的最简单方法是将珠子收集在柱中，然后使抗原溶液向下通过柱。这种方法的效率取决于固定化抗体和抗原之间的接触时间，可以通过使用低流速来延长接触时间。当抗原流过时，固定化抗体会捕获抗原。或者，可以通过将抗原溶液与支持物(例如，珠子)混合并旋转或摇动浆液来使抗原与抗体-支持基质接触，从而使抗原和固定化抗体之间的接触最大化。结合反应完成后，使浆液进入柱中以收集珠子。使用合适的洗涤缓冲液洗涤珠子，然后洗脱纯或基本上纯的抗原。

可以将目的抗体或多肽缀合至固体支持物，例如珠子。此外，如果需要，第一固体支持物例如珠子也可以通过任何合适的手段(包括本文公开的用于将多肽缀合至支持物的手段)与第二固体支持物缀合，第二固体支持物可以是第二珠子或其他支持物。因此，本文公开的关于将多肽缀合至固体支持物的任何缀合方法和手段也可用于将第一支持物缀合至第二支持物，其中第一和第二固体支持物可以相同或不同.

用于将多肽缀合至固体支持物的合适的接头可以是交联剂，包括可以与存在于支持物表面上的官能团或与多肽或与两者反应的多种试剂。可用作交联剂的试剂包括同双功能试剂，特别是异双功能试剂。有用的双功能交联剂包括但不限于N-SIAB、二马来酰亚胺、DTNB、N-SATA、N-SPDP、SMCC和6-HYNIC。可以选择交联剂以在多肽和固体支持物之间提供选择性可裂解的键。例如，光不稳定的交联剂，例如3-氨基-(2-硝基苯基)丙酸可以用作从固体支持物上裂解多肽的手段。(Brown等人,Mol.Divers,第4-12页(1995)；Rothschild等人,Nucl.Acids Res.,24:351-66(1996)；和美国专利号5,643,722)。其他交联试剂在本领域中是众所周知的。(参见例如Wong(1991)，同上；和Hermanson(1996)，同上)。

抗体或多肽可以通过在羧基官能化的珠子和多肽的氨基末端之间形成的共价酰胺键或相反地通过在氨基官能化的珠子和多肽的羧基末端之间形成的共价酰胺键固定在固体支持物例如珠子上。此外，可通过氨基树脂通过树脂上的氨基或羧基，将双功能三苯甲基接头连接至支持物，例如，连接至树脂例如Wang树脂上的4-硝基苯基活性酯。使用双功能三苯甲基方法，固体支持物可能需要用挥发性酸例如甲酸或三氟乙酸处理，以确保多肽被裂解并且可以被去除。在这种情况下，多肽可以作为无珠贴片沉积在固体支持物的孔底部或固体支持物的平坦表面上。加入基质溶液后，多肽可以解吸到MS中。

通过使用挥发性酸或适当的基质溶液，例如含有3-HPA的基质溶液，疏水性三苯甲基接头也可用作酸不稳定接头，以从多肽上裂解氨基连接的三苯甲基。酸不稳定性也可以改变。例如，三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三甲氧基三苯甲基可以改变为多肽的合适的对位取代的或对酸更不稳定的三苯甲基胺衍生物，即，可以在多肽上形成三苯甲基醚和三苯甲基胺键。因此，可以例如通过破坏疏水性吸引或通过在酸性条件下(如果需要，包括在典型MS条件下，其中基质例如3-HPA充当酸)裂解三苯甲基醚或三苯甲胺键，从疏水性接头上去除多肽。

正交可裂解的接头也可用于将第一固体支持物例如珠子与第二固体支持物结合，或用于将目的多肽与固体支持物结合。使用此类接头，第一固体支持物例如珠子可以从第二固体支持物选择性地裂解，而不从支持物裂解多肽；然后可以稍后将多肽从珠子上裂解下来。例如，可使用还原剂例如DTT裂解的二硫化物接头可用于将珠子与第二固体支持物结合，并且可使用酸可裂解的双功能三苯甲基将多肽固定到支持物上。根据需要，可以首先裂解多肽与固体支持物的连接，例如，从而使第一和第二支持物之间的连接保持完整。三苯甲基接头可以提供共价或疏水缀合，并且无论缀合的性质如何，三苯甲基在酸性条件下很容易裂解。

例如，珠子可以通过连接基团与第二支持物结合，所述连接基团可以被选择为具有一定的长度和化学性质，使得珠子与固体支持物的高密度结合或多肽与珠子的高密度结合得到促进。此类连接基团可以具有例如“树状”结构，从而在固体支持物上的每个附着位点提供多个官能团。此类连接基团的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、五碳赤藓醇(penta-erythrole)和三羟基-氨基甲烷。

非共价结合缔合。抗体或多肽可以与固体支持物缀合，或者第一固体支持物也可以通过非共价相互作用与第二固体支持物缀合。例如，能够被磁化的由铁磁材料制成的磁珠可以被吸引到磁性固体支持物上，并且可以通过去除磁场从支持物上释放。或者，固体支持物可以具有离子或疏水部分，这可以允许离子或疏水部分分别与多肽(例如含有连接的三苯甲基的多肽)或与具有疏水性的第二固体支持物相互作用。

固体支持物还可以具有特异性结合对的成员，因此可以与含有互补结合部分的多肽或第二固体支持物缀合。例如，用亲和素或链霉亲和素包被的珠子可以与其中掺入了生物素部分的多肽结合，或与用生物素或生物素衍生物如亚氨基生物素包被的第二固体支持物结合。

应该认识到，本文公开的或本领域已知的任何结合成员都可以颠倒。因此，生物素例如可以掺入多肽或固体支持物中，相反，亲和素或其他生物素结合部分将分别掺入支持物或多肽中。预期用于本文的其他特异性结合对包括但不限于激素及其受体、酶及其底物、核苷酸序列及其互补序列、抗体及其特异性相互作用的抗原，以及本领域技术人员已知的其他此类结合对。

A.本发明的抗瘦素受体抗体的诊断用途

概述。本发明的抗瘦素受体抗体可用于诊断方法中。因此，本发明提供了使用抗体诊断受试者的瘦素受体活性的方法。可选择本发明的抗瘦素受体抗体，使得它们具有任何水平的表位结合特异性和非常高的对瘦素受体的结合亲和力。一般而言，抗体的结合亲和力越高，在免疫测定中可以进行的洗涤条件就越严格，从而去除非特异性结合的材料而不去除靶多肽。因此，可用于诊断测定的本发明的抗瘦素受体抗体通常具有约10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1或10¹²M^-1的结合亲和力。此外，期望用作诊断试剂的本发明的抗瘦素受体抗体具有足够的动力学结合率，以在标准条件下在至少12小时、至少五(5)小时或至少一(1)小时内达到平衡。

本发明的抗瘦素受体抗体可用于以多种标准测定形式检测免疫反应性瘦素受体。此类形式包括免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定和免疫测量测定。参见Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Publications,New York,1988)；美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,879,262；4,034,074；3,791,932；3,817,837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876。生物样品可以从受试者的任何组织或体液中获得。在某些实施方案中，受试者处于癌症的早期阶段。在一个实施方案中，癌症的早期阶段由从受试者获得的样品中瘦素受体的水平或表达模式确定。在某些实施方案中，样品选自由尿液、血液、血清、血浆、唾液、羊水、脑脊液(CSF)和活检的身体组织组成的组。

免疫测量或夹心测定是本发明的诊断方法的一种形式。参见美国专利号4,376,110、4,486,530、5,914,241和5,965,375。此类测定使用固定到固相的一种抗体，例如，抗瘦素受体抗体或抗瘦素受体抗体群体，以及溶液中的另一种抗瘦素受体抗体或抗瘦素受体抗体群体。通常，溶液抗瘦素受体抗体或抗瘦素受体抗体群体被标记。如果使用抗体群体，则所述群体可以包含与靶多肽内的不同表位特异性结合的抗体。因此，相同的群体可用于固相和溶液抗体。如果使用本发明的抗瘦素受体抗体，则具有不同结合特异性的第一和第二瘦素受体单克隆抗体用于固相和溶液相。固相(也称为“捕获”)和溶液(也称为“检测”)抗体可以按顺序或同时与靶抗原接触。如果首先接触固相抗体，则所述测定被称为正向测定。相反，如果首先接触溶液抗体，则所述测定被称为反向测定。如果目标同时与两种抗体接触，则所述测定被称为同时测定。在使瘦素受体与抗瘦素抗体接触后，将样品孵育一段时间，所述时间通常从约10分钟到约24小时不等，通常为约1小时。然后进行洗涤步骤以去除样品中未与用作诊断试剂的抗瘦素受体抗体特异性结合的组分。当固相和溶液抗体在单独的步骤中结合时，可以在一个或两个结合步骤之后进行洗涤。洗涤后，对结合进行量化，通常是通过与标记溶液抗体的结合来检测与固相连接的标记。通常对于给定的一对抗体或抗体群体和给定的反应条件，校准曲线由含有已知浓度靶抗原的样品制备。然后通过从校准曲线(即标准曲线)插值来读取被测样品中免疫反应性瘦素受体的浓度。分析物可以从平衡时结合的标记溶液抗体的量来测量，也可以通过在达到平衡之前的一系列时间点结合的标记溶液抗体的动力学测量值来测量。此类曲线的斜率是样品中瘦素受体浓度的量度。

适用于上述方法的支持物包括例如硝酸纤维素膜、尼龙膜和衍生尼龙膜，以及颗粒，例如琼脂糖、葡聚糖基凝胶、试纸、微粒、微球、磁性颗粒、试管、微量滴定孔、SEPHADEX^TM(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway NJ)等。可以通过吸收或通过共价连接进行固定。任选地，本发明的抗瘦素受体抗体可以接合至接头分子，例如生物素，以连接至表面结合的接头，例如亲和素。

在一些实施方案中，本发明提供了与诊断剂缀合的本发明的抗瘦素受体抗体。诊断剂可以包括放射性或非放射性标记、造影剂(例如用于磁共振成像、计算机断层扫描或超声)，并且放射性标记可以是发射γ电子、β电子、α电子、俄歇电子或正电子的同位素。诊断剂是与抗体部分(即抗体或抗体片段或亚片段)缀合施用的分子，并且可用于通过定位含有抗原的细胞来诊断或检测疾病。

有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(例如具有生物素-链霉亲和素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子以及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁离子)。美国专利6,331,175描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备，并通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，诊断剂选自由放射性同位素、用于磁共振成像的增强剂和荧光化合物组成的组。为了用放射性金属或顺磁离子加载抗体组分，可能需要使抗体组分与具有长尾的试剂反应，所述长尾连接有多个螯合基团以结合离子。此类尾部可以是聚合物，例如聚赖氨酸、多糖或其他具有侧基的衍生的或可衍生的链，所述侧基可以是结合的螯合基团，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双硫代缩氨基脲、聚肟和已知可用于此目的的类似基团。螯合物可以使用标准化学与本发明的抗体偶联。螯合物通常通过这样的基团与抗体连接，所述基团能够与分子形成键，而免疫反应性损失最小，聚集和/或内部交联最小。用于将螯合物与抗体缀合的其他方法和试剂公开于美国专利号4,824,659。特别有用的金属-螯合物组合包括2-苯甲基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，与用于放射成像的诊断同位素一起使用。当与本发明的瘦素受体抗体一起使用时，相同的螯合物与非放射性金属如锰、铁和钆络合时可用于MRI。

B.本发明的抗瘦素受体抗体的治疗用途

概述。本发明的抗瘦素受体抗体是瘦素受体激动剂；即，本发明的抗瘦素受体抗体与瘦素受体的结合导致瘦素受体信号传导的激活。因此，本发明的抗瘦素受体抗体是有用的，例如用于模拟、替代或补充受试者中瘦素的正常生物活性。因此，本发明的抗体和抗原结合片段可用于与瘦素抵抗和瘦素缺乏或功能障碍相关的疾病和病症的治疗性治疗。

本发明包括结合人瘦素受体并激活瘦素受体信号传导的抗体及其抗原结合片段。在本发明的上下文中，“瘦素受体信号传导的激活”是指细胞内作用的刺激，所述作用通常由瘦素与瘦素受体在表达瘦素受体的细胞中的相互作用引起。在某些实施方案中，“瘦素受体信号传导的激活”是指STAT3的转录激活，这可以使用任何可以直接或间接测量或鉴定STAT3活性的方法来检测，例如，使用在报告细胞系中表达的STAT3的标记版本来检测。例如，本发明包括在基于细胞的报告测定中激活瘦素受体信号传导的抗体及其抗原结合片段，例如，使用如本文实施例7中定义的基于细胞的测定形式，或基本上相似的测定。瘦素受体信号传导的激活可使用报告细胞系进行测定，所述报告细胞系用于检测磷酸化STAT3，或通过SIE元件(sis诱导元件)诱导基因表达，如实施例中所述，特别是在实施例1-3中所述。

在一些方面，本发明的抗瘦素受体抗体可用于本文公开的方法，提供用于预防、改善或治疗与瘦素受体活性降低相关的病症的疗法。

在一些实施方案中，与瘦素受体活性降低相关的病症是肥胖、瘦素缺乏、瘦素抵抗和/或低瘦素血症。在一些实施方案中，与瘦素受体活性降低相关的病症是与瘦素受体突变相关的遗传病症。在一些实施方案中，遗传病症是肥胖。此类瘦素受体突变的非限制性实例包括Q223R、P316T、L372A、A409E、L505/506S、R612H、W664R和H684P。

在一个方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗与瘦素缺乏或低瘦素血症、瘦素抵抗或引起瘦素信号传导缺陷或受损的瘦素受体突变相关或由其引起的病症的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段。此类病症的实例包括肥胖。

在一个方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中减轻与瘦素缺乏或低瘦素血症、瘦素抵抗或引起瘦素信号传导缺陷或受损的瘦素受体突变相关或由其引起的病症的一种或多种症状的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的本文所公开的抗体或抗原结合片段。此类病症的症状的实例包括体重增加、食物摄入增加、血糖水平增加、胰岛素水平降低、葡萄糖耐量降低等。

在一些实施方案中，本发明的抗瘦素受体抗体是瘦素受体激动剂。因此，例如，本发明的抗瘦素受体抗体中的一种或多种可以：(1)与其他活性剂或本发明的抗瘦素受体抗体在组合制剂中单独或同时共同配制和施用或递送；(2)作为单独的制剂交替或并行递送；或(3)通过本领域已知的任何其他联合治疗方案。当在交替治疗中递送时，本文所述的方法可以包括例如以单独的溶液、乳液、悬浮液、片剂、丸剂或胶囊的形式，或通过在单独的注射器中的不同注射来依次施用或递送活性成分。一般而言，在交替治疗期间，每种活性成分的有效剂量依次(即连续)施用，而在同时治疗中，两种或更多种活性成分的有效剂量一起施用。也可以使用各种顺序的间歇性联合治疗。当以治疗有效量对患有与瘦素缺乏或低瘦素血症、瘦素抵抗或引起瘦素信号传导缺陷或受损的瘦素受体突变相关或由其引起的病症的受试者施用时，施用本发明的抗瘦素受体抗体和其他活性剂的此类组合可导致协同生物效果。此类方法的一个优点是，可能需要较低剂量的本发明的抗瘦素受体抗体和/或其他活性剂即可预防、改善或治疗患有或易患肥胖、瘦素缺乏、瘦素抵抗和/或低瘦素血症的受试者。此外，可以通过使用较低剂量的本发明的抗瘦素受体抗体和/或其他活性剂来避免治疗的潜在副作用。

本发明的抗瘦素受体抗体可以与一种或多种额外的治疗活性组分，例如用于治疗肥胖、高胆固醇血症、高脂血症、2型糖尿病、1型糖尿病、食欲控制、不孕症等的药品共同配制和/或组合施用。这些额外的治疗活性组分的实例包括例如重组人类瘦素(例如美曲普汀(metreleptin)[MYALEP1])、PCSK9抑制剂(例如抗PCSK9抗体[阿利库单抗(alirocumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、伯考赛珠单抗(bococizumab)、洛迪赛珠单抗(lodelcizumab)、雷泮赛珠单抗(ralpancizumab)等])、他汀类药物(阿托伐他汀(atorvastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等)、依折麦布(ezetimibe)、胰岛素、胰岛素变体、胰岛素促分泌素、二甲双胍、磺脲类药物、葡萄糖钠协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂(例如达格列净(dapaglifozin)、卡格列净(canaglifozin)、恩格列净(empagliflozin)等)、GLP-1激动剂/类似物(例如extendin-4、艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、利西拉肽(lixisenatide)、阿必鲁肽(albiglutide)、度拉鲁肽(dulaglutide)等)、胰高血糖素(GCG)抑制剂(例如抗GCG抗体)、胰高血糖素受体(GCGR)抑制剂(例如抗GCGR抗体、小分子GCGR拮抗剂、GCGR特异性反义寡核苷酸、抗GCGR适配体[例如Spiegelmers]、等)、血管生成素样蛋白(ANGPTL)抑制剂(例如抗ANGPTL3抗体、抗ANGPTL4抗体、抗ANGPTL8抗体等)、芬特明(Phentermine)、奥利司他(Orlistat)、托吡酯(Topiramate)、安非他酮(Bupropion)、托吡酯/芬特明、安非他酮/纳曲酮(Bupropion/Naltrexone)、安非他酮/唑尼沙胺(Bupropion/Zonisamide)、普兰林肽/美曲普汀(Pramlintide/Metrelepin)、氯卡色林(Lorcaserin)、新利司他(Cetilistat)、替索芬辛(Tesofensine)、维奈派瑞(Velneperit)等。

本发明的抗瘦素受体抗体的生物学效果的确定。

在各种实施方案中，进行合适的体外或体内测定以确定基于本发明的抗瘦素受体抗体的特定治疗剂的效果以及其施用是否适用于治疗。在各种实施方案中，可以用代表性细胞系进行体外测定。在各种实施方案中，可以用代表性动物模型，例如携带突变瘦素受体(例如具有L372A、A409E、L505/506S突变中的一种或多种)的小鼠进行体内测定。这些实验可用于确定本发明的给定抗瘦素受体抗体是否在促进突变瘦素受体的信号转导活性或恢复突变瘦素受体的功能方面发挥所需作用。

在人类受试者中进行测试之前，用于治疗的化合物可以在包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等的合适的动物模型系统中进行测试。类似地，对于体内测试，本领域已知的任何动物模型系统都可以在施用于人类受试者之前使用。

在一些实施方案中，瘦素受体活性通过本领域熟知的测定来确定。Peng等人(2015),Chemistry&Biology 22:1-10(2015)；和Bhaskar等人,Obesity 24:1687-1694(2016)。在一些实施方案中，瘦素受体活性通过测量在携带瘦素受体突变如L372A、A409E或L505/506S的动物模型中的生物活性的测定来确定。在一些实施方案中，使用测量动物模型的突变表型拯救的测定来确定瘦素受体活性。

C.试剂盒

本发明提供用于检测和/或治疗突变瘦素受体相关疾病的试剂盒，其包含至少一种本发明的免疫球蛋白相关组合物(例如，本文所述的任何抗体或抗原结合片段)，或其功能变体(例如，取代变体)。任选地，本发明的试剂盒的上述组分被包装在合适的容器中并标记用于诊断和/或治疗突变瘦素受体相关疾病。上述组分可以作为含水的、优选无菌的溶液或作为冻干的、优选无菌的用于重构的制剂储存在单元容器或多剂量容器中，例如密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管中。所述试剂盒还可以包括装有稀释剂的第二容器，所述稀释剂适用于将药物组合物稀释到更高的体积。合适的稀释剂包括但不限于药物组合物的药学上可接受的赋形剂和盐水溶液。此外，所述试剂盒可包括稀释药物组合物的说明和/或施用药物组合物的说明，无论是否稀释。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉溶液袋或具有塞子的小瓶，所述塞子可以被皮下注射针刺穿)。所述试剂盒还可以包括更多的容器，这些容器包括药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户的角度看需要的其他材料，这些材料包括用于一种或多种合适宿主的其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器、培养基。试剂盒可任选地包括通常包括在治疗或诊断产品的商业包装中的说明书，所述说明书包含例如关于使用此类治疗或诊断产品的适应症、用法、剂量、制造、给药、禁忌症和/或警告的信息。

所述试剂盒可用于检测生物样品例如任何体液中免疫反应性瘦素受体的存在，所述任何体液包括但不限于例如血清、血浆、淋巴液、囊液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液，且包括身体组织的活检样品。例如，所述试剂盒可包括：一种或多种能够结合生物样品中的瘦素受体的本发明的人源化、嵌合或双特异性抗瘦素受体抗体(或其抗原结合片段)；用于确定样品中瘦素受体量的装置；以及用于将样品中免疫反应性瘦素受体的量与标准进行比较的装置。可以标记一种或多种抗瘦素受体抗体。试剂盒组分(例如试剂)可以包装在合适的容器中。试剂盒还可以包括使用所述试剂盒检测免疫反应性瘦素受体的说明。

对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可以包括例如1)第一种抗体，例如本发明的人源化或嵌合瘦素受体抗体(或其抗原结合片段)，其连接于与瘦素受体结合的固相支持物；和任选地，2)第二种不同的抗体，其与瘦素受体或第一种抗体结合，并与可检测标记缀合。

试剂盒还可包括例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包括检测可检测标记所必需的组分，例如酶或底物。试剂盒还可以包含一个对照样品或一系列对照样品，可以对对照样品进行测定并与测试样品进行比较。试剂盒的每种组分都可以封装在单独的容器中，所有各种容器都可以放在单个包装中，并附有解释使用所述试剂盒所进行的测定的结果的说明。本发明的试剂盒可以在试剂盒容器之上或之中包括书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中包含的试剂，例如，用于体外或体内检测瘦素受体，或用于治疗有需要的受试者的突变瘦素受体相关疾病。在某些实施方案中，试剂的使用可以根据本发明的方法进行。

实施例

以下实施例进一步说明了本发明，不应将其解释为以任何方式构成限制。对于以下每个实施例，可以使用本文所述的任何免疫结合剂，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和基因修饰的IgG及其片段。举例来说，但不限于，以下实施例中使用的scFv-Fc抗体可以是S1scAb06、S1scAb11、S2H1、S2H2、S2H3、S2H4、S2H5、S2H6、S2H7等。

实施例1：抗体生成

对于抗体选择，噬菌体展示和表型选择与用于检测磷酸化STAT3的报告细胞系相组合。简而言之，在用重组瘦素受体胞外结构域进行两轮淘选后，富集了单链组合抗体文库，以获得更小但具有更多特异性克隆的子文库。两轮噬菌体淘选后，选择～10⁶个菌落并提取噬菌粒。使用限制性酶SfiI消化抗体编码序列并克隆到慢病毒载体中以允许哺乳动物细胞表面展示，所述慢病毒载体是系留系统的成员。对于来自子文库的选择激动剂抗体，使用了β-内酰胺酶LepR报告细胞系，因为所述细胞系为检测磷酸化STAT3的读数提供了非常好的信噪比。β-内酰胺酶LepR报告细胞系以MOI＝2感染慢病毒文库。接种8小时后，更换培养基并将细胞再培养40小时。收集报告细胞并与LiveBLAzer^TM-FRET底物CCF4-AM(Invitrogen)一起在黑暗中孵育2小时，用FACS缓冲液洗涤并进行单细胞分选。使β-内酰胺酶阳性单细胞克隆达到汇合，并根据来自慢病毒载体的序列通过PCR扩增来自每个菌落的抗体基因。对克隆进行测序。序列分析揭示了两个有希望的克隆，称为S1scAb06和S1scAb11，它们显示出最大的磷酸化STAT3，这表明LepR激活。这里，抗体名称中的“S1”是指第一轮选择出的对人瘦素受体具有激动作用的抗体。

实施例2：抗体的定向进化

通过使用酵母展示和流式细胞术来使用定向进化方法，以选择更高亲和力的抗体。简而言之，在S1scAb06核酸中对应于V_H CDR3的位置处引入终止密码子以生成用于突变文库构建的模板抗体序列。V_H CDR3中四个氨基酸的密码子被简并密码子NNK(其中，N＝A/C/G/T&K＝G/T)取代，以构建具有～10⁷不同蛋白质序列的突变抗体库。携带scFv抗体文库的酵母细胞在SD/Trp^-培养基中在30℃下振荡培养至对数期。然后酵母细胞在SGR-CAA培养基中在20℃下振荡生长24小时以诱导酵母展示。纯化与His标签融合的重组瘦素受体胞外结构域并使用EZ-LINK NHS-PEG4-BIOTIN试剂盒用生物素进行标记。以生物素标记的重组瘦素受体胞外结构域蛋白被用作抗原以结合酵母抗体文库，并且3轮流式细胞术选择出亲和力较高的命中。提取和测序来自最后一轮的酵母展示质粒中的抗体序列。从酵母中获得的七个命中被命名为S2H1到S2H7。这里，抗体名称中的“S2”是指第二轮选择出的对人瘦素受体具有激动作用的抗体。

下表和图8-16提供了V_H和V_L的核苷酸和氨基酸序列以及本文公开的抗体的CDR序列(SEQ ID NO:1-90)。

实施例3：本发明的抗瘦素受体抗体是瘦素受体激动剂

瘦素激活Stat1和Stat3信号传导通路，并通过SIE元件(sis诱导元件)调节基因表达，SIE元件是一个典型的STAT结合序列。参见例如Bendinelli等人,Mol CellEndocrinol.168(1-2):11-20(2000)。为了了解本文公开的抗瘦素受体抗体是否通过SIE元件调节基因表达，使用了SIE-荧光素酶报告基因。将SIE-荧光素酶报告细胞稀释至40万个细胞/毫升，并接种到经过TC处理的白色不透明96孔板(50μl/孔)中。将瘦素或抗瘦素受体抗体S1scAb06、S1scAb11和S2H6连续稀释并添加到细胞中(50μl/孔)。将细胞培养6-8小时。荧光素酶测定底物用于细胞并使用酶标仪测量发光。如图1A所示，瘦素以及S1scAb11、S1scAb6和S2H6抗体诱导荧光素酶表达。用作瘦素受体结合的阴性对照的同种型对照抗体不诱导SIE-荧光素酶报告基因的可检测表达(图1A)。如图1A所示，与瘦素相比，在第一轮选择中选出的S1scAb11和S1scAb6抗体在更高浓度下诱导了SIE-荧光素酶报告基因表达。与S1scAb11和S1scAb6抗体相比，在第二轮选择中选出的S2H6抗体在较低浓度下诱导了SIE-荧光素酶报告基因表达。因此，S1scAb11、S1scAb6和S2H6抗体结合于瘦素受体并激活下游信号转导。因此，这些数据表明S1scAb11、S1scAb6和S2H6抗体是瘦素受体激动剂。下表显示了通过荧光素酶测定测量的瘦素受体激活的EC₅₀值(M)。

SC2H6	S1scAb06	S1scAb11	h瘦素
				4.78E-10	3.18E-9	ND	6.40E-10

对于通过SIE荧光素酶报告细胞中的SIE元件调节基因表达，在第二轮选择中选出的抗瘦素受体抗体S2H1、S2H2、S2H3、S2H4、S2H5、S2H6和S2H7也与瘦素进行了比较。如图1B所示，S2H1、S2H2、S2H3、S2H4、S2H5、S2H6和S2H7中的每一个都诱导了SIE-荧光素酶报告基因表达。下表显示了通过荧光素酶测定测量的瘦素受体激活的EC₅₀值(M)。

SC2H1

SC2H2

SC2H3

SC2H4

SC2H5

SC2H6

SC2H7

4.53E-010

6.52E-010

3.28E-010

3.87E-010

7.38E-010

4.78E-010

4.94E-010

这些结果证明本发明的抗瘦素受体抗体是瘦素受体激动剂，因此可用于治疗肥胖、瘦素缺乏、瘦素抵抗和/或低瘦素血症的方法中。

实施例4：本发明的抗瘦素受体抗体促进瘦素依赖性细胞的生长

瘦素依赖性Ba/F3-lepR报告细胞在补充有浓度为2ng/ml的瘦素的RPMI 1640培养基中培养。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞三次，稀释至20万个细胞/毫升，并接种到96孔板(50μl/孔)中。将瘦素或抗瘦素受体抗体S1scAb06、S1scAb11和S2H6连续稀释并添加到细胞中(50μl/孔)。细胞在37℃再培养72小时。为了检测增殖，将CellTiter 96AQueous OneSolution Reagent添加到装有细胞的孔中(20μl/孔)，并在37℃下孵育2小时。用酶标仪记录490nm处的吸光度以测量细胞增殖水平。如图2A所示，抗瘦素受体抗体S1scAb06、S1scAb11和S2H6支持瘦素依赖性Ba/F3-lepR报告细胞的生长。用作阴性对照的同种型对照抗体不促进瘦素依赖性细胞的增殖(图2A)。如图2A所示，与瘦素相比，在第二轮选择后获得的S2H6抗体更有效地促进瘦素依赖性细胞的生长。下表比较通过荧光素酶测定和细胞增殖测定测量的瘦素受体激活的EC₅₀值(M)。

EC<sub>50</sub>(M)	SC2H6	S1scAb06	S1scAb11	h瘦素
					荧光素酶测定	4.78E-10	3.18E-9	ND	6.40E-10
细胞增殖测定	7.73E-10	9.14E-9	2.30E-8	3.01E-9

对于促进瘦素依赖性Ba/F3-lepR报告细胞的生长，第二轮选择后获得的抗瘦素受体抗体S2H1、S2H2、S2H3、S2H4、S2H5、S2H6和S2H7也与瘦素进行了比较。如图2B所示，与瘦素相比，S2H1、S2H2、S2H3、S2H4、S2H5、S2H6和S2H7中的每一个都更有效地促进了瘦素依赖性细胞的生长。下表比较通过荧光素酶测定和细胞增殖测定测量的瘦素受体激活的EC₅₀值(M)。

EC<sub>50</sub>(M)

SC2H1

SC2H2

SC2H3

SC2H4

SC2H5

SC2H6

SC2H7

荧光素酶测定

4.53E-010

6.52E-010

3.28E-010

3.87E-010

7.38E-010

4.78E-010

4.94E-010

细胞增殖测定

4.19E-010

6.87E-010

1.93E-010

2.17E-010

1.63E-009

7.73E-010

1.15E-009

这些结果证明本发明的抗瘦素受体抗体是瘦素受体激动剂，因此可用于治疗肥胖、瘦素缺乏、瘦素抵抗和/或低瘦素血症的方法中。

实施例5：本发明的抗瘦素受体抗体对肥胖小鼠模型有效

为了评价本发明的抗瘦素受体抗体的治疗效果，通过实验确定了它们对肥胖小鼠模型的影响。用于本研究的肥胖小鼠模型是瘦素缺乏(ob/ob)小鼠。将6周大的雌性ob/ob小鼠饲养在具有12小时光/暗循环的房间中，并随意提供食物和水。在开始给药前每天监测体重和食物摄入3-4天，并将小鼠随机分为三个治疗组：载体(PBS)、瘦素和S2H6抗体。给小鼠皮下注射载体(每天两次)、瘦素(0.5mg/kg，每天两次)和S2H6(5mg/kg，每隔一天一次)持续两周(n＝8)。载体治疗组作为缺乏任何治疗的阴性对照。瘦素治疗组作为减少肥胖的阳性对照。每天记录体重和食物摄入。

每天测量载体治疗组的体重。如图3A所示，在实验过程中，载体治疗组的体重增加。与载体治疗组相比，瘦素治疗组和S2H6治疗组显示出体重减轻(图3A)。从图3A可以明显看出，体重减轻的程度比瘦素治疗组中观察到的要大。下表显示了治疗两周后动物的体重。如通过学生t检验计算的，S2H6治疗所诱导的体重减轻具有统计学意义(P<0.0001)。

治疗	治疗两周后的体重(显示的值是平均值±SEM)
		仅载体(n＝8)	50.30±0.49g
瘦素(n＝8)	36.39±0.61g
		S2H6(n＝8)	25.55±0.78g

在实验过程中每天记录食物摄入。如图3B所示，与开始给药前相比，载体治疗组的食物摄入保持不变。与载体治疗组相比，瘦素治疗组和S2H6治疗组表现出食物摄入的减少(图3B)。如图3B所示，与瘦素治疗组相比，S2H6治疗组表现出食物摄入减少更多。

每周测量两次血糖。在实验过程中，载体治疗组的血糖基本保持不变(图3C)。如图3C所示，与载体治疗组相比，瘦素治疗组和S2H6治疗组表现出血糖的显著降低。与瘦素治疗组(参见图3C中的第二组)相比，S2H6治疗组表现出更为显著的血糖降低。在抗体治疗后第12天(图3C所示的最后时间点)，瘦素治疗组和S2H6治疗组的血糖水平之间的这种差异具有统计学意义(p<0.01)。

给药两周后，小鼠禁食16小时，并测量血胰岛素浓度。如图3D所示，与载体治疗组相比，瘦素治疗组和S2H6治疗组表现出血胰岛素水平的显著降低。

对禁食的小鼠进行腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)。如图3E所示，与载体治疗组相比，瘦素治疗组和S2H6治疗组表现出IPGTT期间的血糖降低。与瘦素治疗组相比，S2H6治疗组显示出更为显著的血糖降低(图3E)。

最后，处死小鼠，提取不同部位的脂肪组织并称重。如图3F所示，与载体治疗组相比，瘦素治疗组和S2H6治疗组表现出IPGTT期间脂肪组织水平的降低。与瘦素治疗组相比，S2H6治疗组显示出更为显著的脂肪组织降低(图3F)。

这些结果证明本发明的抗瘦素受体抗体是瘦素受体激动剂，因此可用于治疗肥胖、瘦素缺乏、糖尿病、瘦素抵抗和/或低瘦素血症的方法中。

实施例6：本发明的抗瘦素受体抗体可以与瘦素竞争瘦素受体的占有率

探索了本发明的抗瘦素受体抗体是否可以与瘦素竞争结合人瘦素受体。为了实现这一目标，用人瘦素受体的胞外结构域涂覆微孔板，并将越来越高浓度的瘦素(如图4A-4B的X轴所示)与指示的固定抗体浓度一起添加到微孔板中，以建立人瘦素受体占有率的竞争。二抗用于检测抗体的结合。如图4A所示，瘦素可与第一轮选择后获得的S1scAb06抗体竞争，其中S1scAb06结合抑制的IC₅₀为6.55nM。然而，如图4B所示，瘦素不能与在第二轮选择后获得的S2H6竞争。这与S2H6对瘦素受体的亲和力高于本文所公开的瘦素相一致。

实施例7：本发明的抗瘦素受体抗体对瘦素受体的亲和力

表面等离子体共振(SPR)用于准确测定本发明的抗瘦素受体抗体的结合参数。使用Biacore T200^TM(GE Healthcare)进行SPR结合测定。简而言之，通过胺偶联试剂盒(AmineCoupling Kit)(GE Healthcare)将具有His标签的瘦素受体的重组胞外结构域固定在Series S Sensor CM5芯片(GE Healthcare)的表面上。瘦素和不同的激动剂抗体作为分析物被连续稀释。所有操作均按照制造商用户指南中的说明进行。结果分析在BIAevaluationsoftware^TM中进行处理。如图5A-5D所示，S1scAb06、S1scAb11、S2H6和瘦素与瘦素受体的胞外结构域结合。下表显示结合的K_D、K_on和K_off值。

	瘦素	S1scAb06	S1scAb11	S2H6
					K<sub>D</sub>(M)	5.04E-10	7.47E-9	2.35E-8	3.90E-10
K<sub>on</sub>(1/M·s)	2.59E+6	6.91E+6	4.72E+5	7.86E+5
					K<sub>off</sub>(1/s)	1.30E-3	5.16E-2	1.11E-2	3.08E-4

还使用SPR测定了抗瘦素受体抗体S2H1、S2H2、S2H3、S2H4、S2H5、S2H6和S2H7的结合参数。下表显示了S2H1、S2H2、S2H3、S2H4、S2H5、S2H6和S2H7与瘦素受体胞外结构域的结合的K_D、K_on和K_off值。

S2H1

S2H2

S2H3

S2H4

S2H5

S2H6

S2H7

KD(M)

5.785E-10

3.549E-10

4.291E-10

5.086E-10

6.258E-10

3.904E-10

6.388E-10

Kon(1/M·s)

4.678E+5

3.362E+5

4.663E+5

4.768E+5

2.618E+5

7.86E+5

2.676E+5

Koff(1/s)

2.706E-4

1.193E-4

2.000E-4

2.425E-4

1.638E-4

3.08E-4

1.709E-4

实施例8：本发明的抗瘦素受体抗体可以激活信号传导有缺陷或受损的突变人瘦 素受体

已鉴定出许多瘦素受体突变体，它们在瘦素结合能力或瘦素介导的信号传导方面表现出缺陷或受损。例如，最初被鉴定为早发性肥胖的单基因原因的LEPR-A409E突变体是一种信号传导缺陷型突变瘦素受体，其不会将瘦素信号转导至STAT3。L372A突变体也是一种瘦素信号传导缺陷型突变体。L505/506S突变体在瘦素信号传导方面存在缺陷，因为当亮氨酸被丝氨酸取代时，瘦素不能与受体结合。

为了了解本发明的抗瘦素受体抗体是否可以激活这些突变受体，构建了具有信号传导缺陷的瘦素受体突变体，包括L372A、A409E、L505/506S。使用标准方案进行DNA诱变，并且所有DNA构建体都通过DNA测序进行验证。突变体在SIE-GFP报告细胞中被瞬时转染。培育24小时后，向细胞中添加瘦素和不同的激动剂抗体进行8小时刺激。携带野生型(WT)瘦素受体的细胞被用作信号传导能力的阳性对照。单独使用载体作为阴性对照(NC)，以检测其激活瘦素受体的能力。使用流式细胞仪分析GFP的表达，并表明其为瘦素信号传导的激活。S1scAb06、S1scAb11、S2H6和瘦素都能够通过WT瘦素受体激活GFP表达(图6)。瘦素不能通过L372A、A409E和L505/506S突变体激活GFP表达(图6)。相反，如图6所示，S1scAb06、S1scAb11和S2H6抗体能够通过L372A、A409E和L505/506S突变体激活GFP表达。S2H6抗体通过L505/506S突变体激活GFP表达的能力比S1scAb06和S1scAb11抗体更强。

具体而言，这些结果表明，本发明的抗瘦素受体抗体可以激活在瘦素结合或瘦素介导的信号传导方面有缺陷或受损的瘦素受体突变体。因此，这些结果证明本发明的抗瘦素受体抗体是瘦素受体激动剂，因此可用于治疗肥胖、瘦素缺乏、瘦素抵抗和/或低瘦素血症。

实施例9：本发明抗体的表位的鉴定

表达并纯化了瘦素受体的胞外结构域的以下六个小亚结构域：N末端结构域(NTD)、第一细胞因子受体同源结构域(CRH1)、免疫球蛋白样结构域(IgD)、第二CRH结构域(CRH2)和纤连蛋白III型结构域(FNIII)。这些结构域的序列如下表所示。

为了测试抗体是否能结合这些结构域，将这些亚结构域用于基于ELISA的结合测定中。人瘦素受体(hECD)的全长胞外结构域用作阳性对照。如图7所示，只有hECD和CRH2能够与S2H6抗体结合，表明S2H6的表位位于CRH2结构域中。

为了鉴定表位，使用二琥珀酰亚胺亚砜(DSSO)将S2H6抗体交联到人类瘦素受体的胞外结构域。在蛋白酶消化后，使用质谱法鉴定具有交联的肽。这些实验鉴定了以下三个小肽片段：

肽01.AVQVRC[K]RL(SEQ ID NO:100)

肽02.DA[K]SKSVSLPVPDLCAVY(SEQ ID NO:101)

肽03.E[K]PVFPENNLQF(SEQ ID NO:102)

[K]表示与DSSO交联的推定位点。这些数据指示S2H6抗体与分布在这三个肽上的表位结合，表明S2H6抗体与构象表位结合。

等同物

本发明不受本申请中描述的特定实施方案的限制，这些实施例旨在作为本发明的各个方面的单一说明。如对本领域技术人员显而易见的，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行许多修改和变化。除了在本文中列举的那些之外，在本发明的范围内的功能等效的方法和装置对于本领域技术人员来说从前面的描述是显而易见的。此类修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本发明仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求所享有的等同物的全部范围的限制。应当理解，本发明不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然也可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不打算构成限制。

此外，当根据马库什组(Markush group)描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，本发明因而也根据马库什组的任何个别成员或成员子群而被描述。

如本领域技术人员所理解的，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并能够将相同的范围分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员也将理解的，所有语言，例如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等，都包括所列举的数字并指代可以随后分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员所理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组等等。

本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物在不与本说明书的明确教导相抵触的程度上通过引用整体并入，包括所有图和表。

在以下权利要求中阐述了其他实施方案。

Claims (20)

1.一种抗瘦素受体抗体或其抗原结合片段，其包含重链免疫球蛋白可变结构域(V_H)和轻链免疫球蛋白可变结构域(V_L)，

其中所述V_H包含：选自由以下组成的组的V_H-CDR1序列：SEQ ID NO:3、13、23、33、43、53、63、73和83；选自由以下组成的组的V_H-CDR2序列：SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74和84；和选自由以下组成的组的V_H-CDR3序列：SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75和85；并且

所述V_L包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：选自由以下组成的组的V_L-CDR1序列：SEQ ID NO:8、18、28、38、48、58、68、78和88；选自由以下组成的组的V_L-CDR2序列：SEQ IDNO:9、19、29、39、49、59、69、79和89；和选自由以下组成的组的V_L-CDR3序列：SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60、70、80和90。

2.一种抗瘦素受体抗体或其抗原结合片段，其包含

V_H氨基酸序列，所述V_H氨基酸序列包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22、SEQID NO:32、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:82，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体，和/或

V_L氨基酸序列，所述V_L氨基酸序列包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27、SEQID NO:37、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:87，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。

3.根据权利要求2所述的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段，其包含选自由以下组成的组的V_H氨基酸序列和V_L氨基酸序列：

分别是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7(S1scAb06)；

SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17(S1scAb11)；

SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27(S2H1)；

SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37(S2H2)；

SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:47(S2H3)；

SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:57(S2H4)；

SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:67(S2H5)；

SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:77(S2H6)；和

SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:87(S2H7)。

4.一种抗瘦素受体抗体或其抗原结合片段，其包含

(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列，所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列与SEQ IDNO:7、17、27、37、47、57、67、77或87中任一者的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同；和/或

(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列(V_H)，所述重链免疫球蛋白可变结构域序列(V_H)与SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72或82中任一者中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段，其还包含选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE组成的组的同种型的Fc结构域。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的抗瘦素受体抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自由Fab、F(ab’)₂、Fab’、scF_v和F_v组成的组。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的抗瘦素受体抗体，其中所述抗瘦素受体抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段，其中所述抗瘦素受体抗体或抗原结合片段结合于人瘦素受体的CRH2结构域。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段，其中抗瘦素受体抗体或抗原结合片段结合于构象表位。

10.一种编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段的核酸序列。

11.一种选自由SEQ ID NO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66、71、76、81和86组成的组的核酸序列。

12.一种表达根据权利要求10或权利要求11所述的核酸的宿主细胞或表达载体。

13.一种包含根据权利要求1至9中任一项所述的抗瘦素受体抗体或抗原结合片段的组合物。

14.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段和使用说明。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述抗体或抗原结合片段与至少一种选自由放射性标记、荧光标记和显色标记组成的组的可检测标记偶联。

16.一种检测生物样品中的瘦素受体的方法，其包括

使所述生物样品与根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触，其中所述抗体或抗原结合片段缀合至可检测标记；和

检测所述生物样品中所述可检测标记的水平。

17.一种在有需要的受试者中治疗与瘦素缺乏或低瘦素血症、瘦素抵抗或引起瘦素信号传导缺陷或受损的瘦素受体突变相关或由其引起的病症的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

18.一种在有需要的受试者中减轻与瘦素缺乏或低瘦素血症、瘦素抵抗或引起瘦素信号传导缺陷或受损的瘦素受体突变相关或由其引起的病症的一种或多种症状的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种症状包括体重增加、食物摄入增加、血糖水平增加、胰岛素水平降低和/或葡萄糖耐量降低。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述病症是肥胖。

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