CN112063591B - 分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗、应用 - Google Patents

分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗、应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株保藏编号分别为CCTCC NO:C202093和CCTCC NO:C202094。本发明还提供了分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体；本发明提供含有所述单克隆抗体的试剂盒。本发明通过获得分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株，获得针对Spondin1不同抗原表位的单克隆抗体2种，特异性强且灵敏度高，可通过配对检测体液、组织中人底板反应蛋白Spondin1含量，应用于检测Spondin1蛋白过量表达或诊断以Spondin1蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

Description

分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗、应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株。
背景技术
细胞外基质底物反应蛋白1，即Spondin1，是由SPON1基因编码的一种细胞粘附蛋白，最初是从脊椎动物的胚胎底板分离出来，有调节胚胎中枢神经系统轴突生长的作用，还能促进血管平滑肌细胞增殖并且抑制血管生成。Spondin1蛋白含有807个氨基酸，分子量为90.97Kda，含有若干个二硫键，为典型的分泌型细胞外基质糖蛋白。
研究发现Spondin1在很多组织中有表达，如卵巢、胚胎生长板软骨、牙周组织、骨关节炎软骨等。随着人们对肿瘤发病机理研究的不断深入，发现Spondin1在肿瘤的发生、发展、浸润和转移过程中起着非常重要的作用，如Spondin1可通过SPON1/Fak/Src 相联通路控制骨肉瘤转移，也有报道Spondin1蛋白在卵巢癌上皮细胞中表达量升高。因此Spondin1的定量检测具有重要的临床意义。而现有的检测试剂盒多是R-Spondin1的试剂盒，体系中多采用多克隆抗体；抗体特异性差，不能区分Spondin1高度同源家族蛋白，由于其抗体本身效价或特异性的原因，也使得其对Spondin1检测的临床效用受到局限，降低了样本检测的特异性，同时也对灵敏度产生一定的影响。因此急需获得特异性识别Spondin1蛋白单克隆抗体，满足临床样本检测要求，提高检测的灵敏度和特异性。
有报道表明Spondin1蛋白在卵巢癌上皮细胞中表达量升高。因此Spondin1的定量检测具有重要的临床意义。而现有的检测试剂盒多是R-Spondin1的试剂盒，体系中多采用多克隆抗体；抗体特异性差，不能区分Spondin1高度同源家族蛋白，由于其抗体本身效价或特异性的原因，也使得其对Spondin1检测的临床效用受到局限，降低了样本检测的特异性，同时也对灵敏度产生一定的影响。因此急需获得特异性识别Spondin1蛋白单克隆抗体，满足临床样本检测要求，提高检测的灵敏度和特异性。
现有的检测试剂盒多是R-Spondin1的试剂盒，且体系中多采用多克隆抗体；抗体特异性差，不能区分Spondin1高度同源家族蛋白，由于其抗体本身效价或特异性的原因，也使得其对Spondin1检测的临床效用受到局限，降低了样本检测的特异性，同时也对灵敏度产生一定的影响。本发明通过双抗体夹心的原理，利用高亲和力高特异性配对单克隆抗体制备检测试剂盒，采用全自动化学发光仪检测样品浓度。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株；本发明的目的之二在于提供分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体；本发明的目的之三在于提供含有所述单克隆抗体的试剂盒；本发明的目的之四在于提供所述单克隆抗体在制备检测Spondin1蛋白试剂中的应用。
本发明技术方案的其中一方面，提供了分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株为2D3F5和/或4B6F2，保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏中心地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期皆为2020年6月19日，电话：027-68752319），2D3F5保藏号保藏编号分别为CCTCC NO: C202093，4B6F2保藏编号为CCTCC NO: C202094。
本发明技术方案的其中一方面，提供了上述的分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，单克隆抗体的抗原表位处于Spondin1蛋白的C端和/或Spondin1蛋白的M段，处于Spondin1蛋白的C端的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；处于Spondin1蛋白的M段的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明技术方案的其中一方面，提供了Spondin1蛋白检测试剂盒， Spondin1蛋白检测试剂盒包含上述单克隆抗体包被的磁微粒。
本发明技术方案的其中一方面，提供了Spondin1蛋白检测试剂盒， Spondin1蛋白检测试剂盒还包含校准品Spondin1蛋白、碱性磷酸酶标记的检测抗体和化学发光底物。
本发明技术方案的其中一方面，提供了Spondin1蛋白检测试剂盒，化学发光底物为AMPPD，包被的抗体（单克隆抗体包被的磁微粒）为杂交瘤细胞株2D3F5分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株4B6F2分泌的单克隆抗体。
本发明技术方案的其中一方面，提供了上述单克隆抗体的应用，单克隆抗体用于制备检测Spondin1蛋白过量表达或诊断以Spondin1蛋白异常表达的试剂中。
本发明技术方案的其中一方面，提供了上述单克隆抗体的应用，上述试剂用于制备Spondin1蛋白检测试剂盒。
本发明的有益效果在于：本发明通过获得分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株，获得针对Spondin1不同抗原表位的单克隆抗体2种，特异性强且灵敏度高，可通过配对检测体液、组织中人底板反应蛋白Spondin1含量，应用于检测Spondin1蛋白过量表达或诊断以Spondin1蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。
附图说明
图1为重组Spondin1蛋白SDS-PAGE电泳图；
图2为1A5B6、2D3F5和4B6F2抗体SDS-PAGE电泳图；
图3为Spondin1截断蛋白免疫印迹WB检测结果；
图4为试剂条示意图；
图5为ROC曲线统计图。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J .萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、Spondin1的重组蛋白表达和纯化
从卵巢癌组织提取RNA后经随机引物RT-PCR得到的cDNA为模板，设计引物进行Spondin1基因的克隆，引物具体为：Spondin1-F：5’-TGTTCATCCTTGTTA-3’(SEQ ID NO.1)；Spondin1-R：5’-CGGGGACAGCCTCAT-3’(SEQ ID NO.2)。扩增的Spondin1基因插入到含有6×His标签的pcDNA3.1载体上，得Spondin1-pcDNA3.1。然后将Spondin1-pcDNA3.1转化至DH5α，挑取阳性克隆并大量培养后，用高纯度质粒提取试剂盒提取重组质粒Spondin1-pcDNA3.1。重组质粒转入293T细胞中，并同时转染pcDNA3.1空载体作为阴性对照，分别在含10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO2条件下培养72h，收集上清，利用0.22μm滤膜过滤上清液。
将所得500mL滤液进行非变性条件下的Ni-NTA亲和层析，平衡缓冲液为50mM PBS、10mM咪唑、150mM NaCl，pH 7.6。上样完毕后，清洗10mL；用50mM PBS、250mM咪唑、150mMNaCl，pH7.6洗脱，收集洗脱液。利用30kD超滤管浓缩蛋白溶液，将蛋白保存于pH 7.450mMPBS缓冲液中，-80℃保存。纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳纯度鉴定，分子量大小在90kD左右，灰度分析表明蛋白纯度达到95％以上，见图1。
实施例2、Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
小鼠免疫：用Spondin1蛋白免疫3批BALB/c小鼠，每次3只。每只小鼠每次免疫50μg抗原。首次免疫Spondin1抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，随后Spondin1与弗氏不完全完全佐剂1:1混合，每隔两周免疫一次，共免疫3次，第三次免疫十天后断尾采血，检测血清效价。
杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:100000后用Spondin1抗原(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在50mL离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1mL预热50％PEG-1450作用。
1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清DMEM培养基15mL，37℃水浴5min，然后补加无血清DMEM培养基至40mL，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40mL预热的HAT 培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μL，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞3株，分别为1A5B6、2D3F5和4B6F2。
实施例3、Spondin1单克隆抗体制备、纯化、效价检测及特异性分析
单抗腹水制备：将筛选的3株杂交瘤细胞株分别在培养基中培养至90％密度，收集细胞，将细胞稀释至3×106个/mL。10-12周BALB/c小鼠适应性饲养一周后，腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的杂交瘤细胞，约(1-2)×106个/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，收集腹水上清。
抗体纯化：收集小鼠腹水，用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mM PBS溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1mL/min流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mMPBS，pH7 .0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M pH 9 .0Tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mM PBS溶液透析3次。将透析后的抗体进行10％SDS-PAGE电泳，结果显示，3种抗体在50kD与25kD处有条带，灰度分析纯度均大于90％，1A5B6、2D3F5和4B6F2抗体SDS-PAGE见图2所示。
单克隆抗体效价检测：以1μg/ml的重组Spondin1蛋白的碳酸盐缓冲液(pH 9 .5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体 (1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000)，加入羊抗鼠IgG-AP(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(S/N>2 .1)，1A5B6、2D3F5和4B6F2单克隆抗体效价均为1:128000。
单克隆抗体特异性分析：分别以1μg/ml的Spondin1、R-Spondin1和R-Spondin2蛋白的CBS缓冲液100μl体积4℃过夜包被微孔板，将各个抗体倍比稀释(500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml和0ng/ml)后加入到微孔反应板，然后加入羊抗鼠 IgG-AP(50ng/ml)，结果如表1所示2D3F5对SPON1有较好的结合能力，随着抗体量升高，检测值相应升高，线性较好，该抗体对SPON1的亲和力更高。而1A5B6和4B6F2同时与R-SPON2发生交叉反应。因此采用2D3F5作为捕获抗体。
表1.单克隆抗体特异性分析
Figure 268612DEST_PATH_IMAGE001
实施例4、Spondin1单克隆抗体配对验证
以3μg/ml2D3F5抗体包被微孔反应板，加入100μl不同浓度(5-1280ng/mL)的Spondin1校准品，37℃孵育60min，洗涤后分别加入100μL浓度为100ng/ml的AP标记的1A5B6和4B6F2，并于37℃孵育60min，洗涤后加入AMPPD化学发光底物于仪器测定其化学发光值，结果如表2所示。表2从结果上看，2D3F5作为包被抗体，4B6F2作为检测抗体线性相关系数高，线性范围更宽，因此，2D3F5与4B6F2配对更佳，灵敏度和发光值更高。
表2 .Spondin1单克隆抗体配对结果
Figure 461784DEST_PATH_IMAGE002
实施例5、Spondin1单克隆抗体表位鉴定
重组截断Spondin1蛋白构建表达：根据Spondin1蛋白序列，设计了N、M、C端的序列以及Spondin1全长蛋白(记为Spondin1-F)，连接表达载体pET30a，并转入表达菌株BL21(DE3)中。在LB培养基中，IPTG 0.2mmol/L 25℃条件下过夜诱导Spondin1截断重组蛋白可溶性表达。原核重组表达经6×His标签亲和纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，纯度均在90％以上。
Spondin1-N片段(29-128) (SEQ ID NO.3)：
FSDETLDKVPKSEGYCSRILRAQGTRREGYTEFSLRVEGDPDFYKPGTSYRVTLSAAPPSYFRGFTLIALRENREGDKEEDHAGTFQIIDEEETQFMSNC；
Spondin1-M片段(129-665) (SEQ ID NO.4)：
PVAVTESTPRRRTRIQVFWIAPPAGTGCVILKASIVQKRIIYFQDEGSLTKKLCEQDSTFDGVTDKPILDCCACGTAKYRLTFYGNWSEKTHPKDYPRRANHWSAIIGGSHSKNYVLWEYGGYASEGVKQVAELGSPVKMEEEIRQQSDEVLTVIKAKAQWPAWQPLNVRAAPSAEFSVDRTRHLMSFLTMMGPSPDWNVGLSAEDLCTKECGWVQKVVQDLIPWDAGTDSGVTYESPNKPTIPQEKIRPLTSLDHPQSPFYDPEGGSITQVARVVIERIARKGEQCNIVPDNVDDIVADLAPEEKDEDDTPETCIYSNWSPWSACSSSTCDKGKRMRQRMLKAQLDLSVPCPDTQDFQPCMGPGCSDEDGSTCTMSEWITWSPCSISCGMGMRSRERYVKQFPEDGSVCTLPTEETEKCTVNEECSPSSCLMTEWGEWDECSATCGMGMKKRHRMIKMNPADGSMCKAETSQAEKCMMPECHTIPCLLSPWSEWSDCSVTCGKGMRTRQRMLKSLAELGDCNEDLEQVEKCMLPEC；
Spondin1-C片段(666-807) (SEQ ID NO.5)：
PIDCELTEWSQWSECNKSCGKGHVIRTRMIQMEPQFGGAPCPETVQRKKCRIRKCLRNPSIQKLRWREARESRRSEQLKEESEGEQFPGCRMRPWTAWSECTKLCGGGIQERYMTVKKRFKSSQFTSCKDKKEIRACNVHPC；
Spondin1- F片段 (1-807) (SEQ ID NO.6)：
MRLSPAPLKLSRTPALLALALPLAAALAFSDETLDKVPKSEGYCSRILRAQGTRREGYTEFSLRVEGDPDFYKPGTSYRVTLSAAPPSYFRGFTLIALRENREGDKEEDHAGTFQIIDEEETQFMSNCPVAVTESTPRRRTRIQVFWIAPPAGTGCVILKASIVQKRIIYFQDEGSLTKKLCEQDSTFDGVTDKPILDCCACGTAKYRLTFYGNWSEKTHPKDYPRRANHWSAIIGGSHSKNYVLWEYGGYASEGVKQVAELGSPVKMEEEIRQQSDEVLTVIKAKAQWPAWQPLNVRAAPSAEFSVDRTRHLMSFLTMMGPSPDWNVGLSAEDLCTKECGWVQKVVQDLIPWDAGTDSGVTYESPNKPTIPQEKIRPLTSLDHPQSPFYDPEGGSITQVARVVIERIARKGEQCNIVPDNVDDIVADLAPEEKDEDDTPETCIYSNWSPWSACSSSTCDKGKRMRQRMLKAQLDLSVPCPDTQDFQPCMGPGCSDEDGSTCTMSEWITWSPCSISCGMGMRSRERYVKQFPEDGSVCTLPTEETEKCTVNEECSPSSCLMTEWGEWDECSATCGMGMKKRHRMIKMNPADGSMCKAETSQAEKCMMPECHTIPCLLSPWSEWSDCSVTCGKGMRTRQRMLKSLAELGDCNEDLEQVEKCMLPECPIDCELTEWSQWSECNKSCGKGHVIRTRMIQMEPQFGGAPCPETVQRKKCRIRKCLRNPSIQKLRWREARESRRSEQLKEESEGEQFPGCRMRPWTAWSECTKLCGGGIQERYMTVKKRFKSSQFTSCKDKKEIRACNVHPC。
蛋白免疫印迹法WB确认抗体识别表位：重组蛋白Spondin1-N/M/C、Spondin1全长4种蛋白取5μg上样，进行15％SDS-PAGE电泳。电泳完成后，150V恒压条件下，蛋白转0.45pgmPVDF。转膜完成后利用含5％BSA的PBST溶液37℃封闭两小时。分别用5μg/mL的抗体(S2/S7)溶液37℃孵育1小时。孵育完成后，加入50ng/ml的兔抗鼠IgG-HRP孵育1小时。清洗完成后，加入DAB显色液进行显色。Spondin1全长蛋白作为阳性对照，Spondin1-N/M/C片段位置棕色沉淀物质，则表明抗体识别该目的片段。结果显示，2D3F5抗体识别Spondin1蛋白的C段，4B6F2抗体识别Spondin1蛋白M段，见图3。
实施例6、Spondin1检测试剂盒
本实施例提供一种化学发光免疫检测试剂条，试剂条分别设有一个样本孔4和一个检测孔3，从样本孔4依次设有九个试剂孔2、两个反应孔1，如图4。由于所述试剂条除了样本孔中样本为外源添加外，试剂孔中的试剂为预先封装进试剂条，采用铝塑复合材料进行封膜，这些试剂含有包被捕获抗体2D3F5的磁珠保存液、清洗液、AP标记4B6F2检测抗体保存液、底物等试剂。
（一）样本-磁珠孵育
将50μL血浆样本加入试剂条的样本孔4中，将试剂条加入到配套的分析仪器中，仪器中的移液模块将50μL样本转移至反应孔1中，随后将试剂孔2中的100μL含包被捕获抗体2D3F5的磁珠保存液转移至样本所在反应孔1，仪器的温育结构维持反应孔1恒温状态，为37度，30min。
（二）磁珠转移清洗
上一步温育结束，仪器的磁分离模块将反应孔1中的磁微粒吸附富集，随后移液模块将不含磁微粒的废液吸去。然后，移液模块将试剂孔2中的清洗液加入反应孔1中，同时，磁分离模块关闭，移液模块对反应孔1进行吹打混合，静止30秒，磁分离模块启动，将磁微粒吸附，移液模块将清洗液吸去，完成一次清洗。以上清洗步骤进行三次。
（三）检测抗体结合
当清洗完成后，仪器模块将试剂孔2中的200μL AP标记4B6F2抗体转移至反应孔1中，吹打，将磁微粒和抗体混合，仪器的温育结构维持反应孔1恒温状态，为37度，30min。
（四）磁珠转移清洗
上一步温育结束，仪器的磁分离模块将反应孔1中的磁微粒吸附富集，随后移液模块将不含磁微粒的废液吸去。然后，移液模块将试剂孔2中的清洗液加入反应孔1中，同时，磁分离模块关闭，移液模块对反应孔1进行吹打混合，静止30秒，磁分离模块启动，将磁微粒吸附，移液模块将清洗液吸去，完成一次清洗。以上清洗步骤进行三次。
（五）信号检测
当上一步清洗完成后，移液模块将反应底物从试剂孔2中转移至反应孔1中，随后，吹打混匀，将混合液吸取转移至检测孔3中，仪器的信号测定模块对检测孔3的信号进行信号采集分析，获得对应的浓度值。
（六）Spondin1检测试剂盒用于卵巢癌诊断
从医院收集100例卵巢癌患者术前血清；同时收集100例健康人员血清。使用Spondin1检测试剂盒检测卵巢癌、正常人血清中Spondin1浓度。ROC曲线统计如图5，结果显示，曲线下面积为0.932，以2670pg/mL作为检测参考值，Spondin1检测试剂盒特异性为94％，灵敏度为93％。
综上所述，本发明提供的2种单克隆抗体均可用于样品中Spondin1蛋白的检测，且特异性强、灵敏度高。2种单克隆抗体特异识别Spondin1的不同区段，可通过配对检测体液、组织中人Spondin1含量，应用于检测Spondin1蛋白过量表达或诊断以Spondin1蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。
上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
序列表
<110> 苏州仁端生物医药科技有限公司
<120> 分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗、应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tgttcatcct tgtta 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cggggacagc ctcat 15
<210> 3
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Phe Ser Asp Glu Thr Leu Asp Lys Val Pro Lys Ser Glu Gly Tyr Cys
1 5 10 15
Ser Arg Ile Leu Arg Ala Gln Gly Thr Arg Arg Glu Gly Tyr Thr Glu
20 25 30
Phe Ser Leu Arg Val Glu Gly Asp Pro Asp Phe Tyr Lys Pro Gly Thr
35 40 45
Ser Tyr Arg Val Thr Leu Ser Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Phe Arg Gly
50 55 60
Phe Thr Leu Ile Ala Leu Arg Glu Asn Arg Glu Gly Asp Lys Glu Glu
65 70 75 80
Asp His Ala Gly Thr Phe Gln Ile Ile Asp Glu Glu Glu Thr Gln Phe
85 90 95
Met Ser Asn Cys
100
<210> 4
<211> 537
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Pro Val Ala Val Thr Glu Ser Thr Pro Arg Arg Arg Thr Arg Ile Gln
1 5 10 15
Val Phe Trp Ile Ala Pro Pro Ala Gly Thr Gly Cys Val Ile Leu Lys
20 25 30
Ala Ser Ile Val Gln Lys Arg Ile Ile Tyr Phe Gln Asp Glu Gly Ser
35 40 45
Leu Thr Lys Lys Leu Cys Glu Gln Asp Ser Thr Phe Asp Gly Val Thr
50 55 60
Asp Lys Pro Ile Leu Asp Cys Cys Ala Cys Gly Thr Ala Lys Tyr Arg
65 70 75 80
Leu Thr Phe Tyr Gly Asn Trp Ser Glu Lys Thr His Pro Lys Asp Tyr
85 90 95
Pro Arg Arg Ala Asn His Trp Ser Ala Ile Ile Gly Gly Ser His Ser
100 105 110
Lys Asn Tyr Val Leu Trp Glu Tyr Gly Gly Tyr Ala Ser Glu Gly Val
115 120 125
Lys Gln Val Ala Glu Leu Gly Ser Pro Val Lys Met Glu Glu Glu Ile
130 135 140
Arg Gln Gln Ser Asp Glu Val Leu Thr Val Ile Lys Ala Lys Ala Gln
145 150 155 160
Trp Pro Ala Trp Gln Pro Leu Asn Val Arg Ala Ala Pro Ser Ala Glu
165 170 175
Phe Ser Val Asp Arg Thr Arg His Leu Met Ser Phe Leu Thr Met Met
180 185 190
Gly Pro Ser Pro Asp Trp Asn Val Gly Leu Ser Ala Glu Asp Leu Cys
195 200 205
Thr Lys Glu Cys Gly Trp Val Gln Lys Val Val Gln Asp Leu Ile Pro
210 215 220
Trp Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Val Thr Tyr Glu Ser Pro Asn Lys
225 230 235 240
Pro Thr Ile Pro Gln Glu Lys Ile Arg Pro Leu Thr Ser Leu Asp His
245 250 255
Pro Gln Ser Pro Phe Tyr Asp Pro Glu Gly Gly Ser Ile Thr Gln Val
260 265 270
Ala Arg Val Val Ile Glu Arg Ile Ala Arg Lys Gly Glu Gln Cys Asn
275 280 285
Ile Val Pro Asp Asn Val Asp Asp Ile Val Ala Asp Leu Ala Pro Glu
290 295 300
Glu Lys Asp Glu Asp Asp Thr Pro Glu Thr Cys Ile Tyr Ser Asn Trp
305 310 315 320
Ser Pro Trp Ser Ala Cys Ser Ser Ser Thr Cys Asp Lys Gly Lys Arg
325 330 335
Met Arg Gln Arg Met Leu Lys Ala Gln Leu Asp Leu Ser Val Pro Cys
340 345 350
Pro Asp Thr Gln Asp Phe Gln Pro Cys Met Gly Pro Gly Cys Ser Asp
355 360 365
Glu Asp Gly Ser Thr Cys Thr Met Ser Glu Trp Ile Thr Trp Ser Pro
370 375 380
Cys Ser Ile Ser Cys Gly Met Gly Met Arg Ser Arg Glu Arg Tyr Val
385 390 395 400
Lys Gln Phe Pro Glu Asp Gly Ser Val Cys Thr Leu Pro Thr Glu Glu
405 410 415
Thr Glu Lys Cys Thr Val Asn Glu Glu Cys Ser Pro Ser Ser Cys Leu
420 425 430
Met Thr Glu Trp Gly Glu Trp Asp Glu Cys Ser Ala Thr Cys Gly Met
435 440 445
Gly Met Lys Lys Arg His Arg Met Ile Lys Met Asn Pro Ala Asp Gly
450 455 460
Ser Met Cys Lys Ala Glu Thr Ser Gln Ala Glu Lys Cys Met Met Pro
465 470 475 480
Glu Cys His Thr Ile Pro Cys Leu Leu Ser Pro Trp Ser Glu Trp Ser
485 490 495
Asp Cys Ser Val Thr Cys Gly Lys Gly Met Arg Thr Arg Gln Arg Met
500 505 510
Leu Lys Ser Leu Ala Glu Leu Gly Asp Cys Asn Glu Asp Leu Glu Gln
515 520 525
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<210> 5
<211> 142
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Pro Ile Asp Cys Glu Leu Thr Glu Trp Ser Gln Trp Ser Glu Cys Asn
1 5 10 15
Lys Ser Cys Gly Lys Gly His Val Ile Arg Thr Arg Met Ile Gln Met
20 25 30
Glu Pro Gln Phe Gly Gly Ala Pro Cys Pro Glu Thr Val Gln Arg Lys
35 40 45
Lys Cys Arg Ile Arg Lys Cys Leu Arg Asn Pro Ser Ile Gln Lys Leu
50 55 60
Arg Trp Arg Glu Ala Arg Glu Ser Arg Arg Ser Glu Gln Leu Lys Glu
65 70 75 80
Glu Ser Glu Gly Glu Gln Phe Pro Gly Cys Arg Met Arg Pro Trp Thr
85 90 95
Ala Trp Ser Glu Cys Thr Lys Leu Cys Gly Gly Gly Ile Gln Glu Arg
100 105 110
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115 120 125
Lys Asp Lys Lys Glu Ile Arg Ala Cys Asn Val His Pro Cys
130 135 140
<210> 6
<211> 807
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Met Arg Leu Ser Pro Ala Pro Leu Lys Leu Ser Arg Thr Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ala Leu Ala Leu Pro Leu Ala Ala Ala Leu Ala Phe Ser Asp Glu
20 25 30
Thr Leu Asp Lys Val Pro Lys Ser Glu Gly Tyr Cys Ser Arg Ile Leu
35 40 45
Arg Ala Gln Gly Thr Arg Arg Glu Gly Tyr Thr Glu Phe Ser Leu Arg
50 55 60
Val Glu Gly Asp Pro Asp Phe Tyr Lys Pro Gly Thr Ser Tyr Arg Val
65 70 75 80
Thr Leu Ser Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Phe Arg Gly Phe Thr Leu Ile
85 90 95
Ala Leu Arg Glu Asn Arg Glu Gly Asp Lys Glu Glu Asp His Ala Gly
100 105 110
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Pro Val Ala Val Thr Glu Ser Thr Pro Arg Arg Arg Thr Arg Ile Gln
130 135 140
Val Phe Trp Ile Ala Pro Pro Ala Gly Thr Gly Cys Val Ile Leu Lys
145 150 155 160
Ala Ser Ile Val Gln Lys Arg Ile Ile Tyr Phe Gln Asp Glu Gly Ser
165 170 175
Leu Thr Lys Lys Leu Cys Glu Gln Asp Ser Thr Phe Asp Gly Val Thr
180 185 190
Asp Lys Pro Ile Leu Asp Cys Cys Ala Cys Gly Thr Ala Lys Tyr Arg
195 200 205
Leu Thr Phe Tyr Gly Asn Trp Ser Glu Lys Thr His Pro Lys Asp Tyr
210 215 220
Pro Arg Arg Ala Asn His Trp Ser Ala Ile Ile Gly Gly Ser His Ser
225 230 235 240
Lys Asn Tyr Val Leu Trp Glu Tyr Gly Gly Tyr Ala Ser Glu Gly Val
245 250 255
Lys Gln Val Ala Glu Leu Gly Ser Pro Val Lys Met Glu Glu Glu Ile
260 265 270
Arg Gln Gln Ser Asp Glu Val Leu Thr Val Ile Lys Ala Lys Ala Gln
275 280 285
Trp Pro Ala Trp Gln Pro Leu Asn Val Arg Ala Ala Pro Ser Ala Glu
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325 330 335
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Trp Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Val Thr Tyr Glu Ser Pro Asn Lys
355 360 365
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Pro Gln Ser Pro Phe Tyr Asp Pro Glu Gly Gly Ser Ile Thr Gln Val
385 390 395 400
Ala Arg Val Val Ile Glu Arg Ile Ala Arg Lys Gly Glu Gln Cys Asn
405 410 415
Ile Val Pro Asp Asn Val Asp Asp Ile Val Ala Asp Leu Ala Pro Glu
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435 440 445
Ser Pro Trp Ser Ala Cys Ser Ser Ser Thr Cys Asp Lys Gly Lys Arg
450 455 460
Met Arg Gln Arg Met Leu Lys Ala Gln Leu Asp Leu Ser Val Pro Cys
465 470 475 480
Pro Asp Thr Gln Asp Phe Gln Pro Cys Met Gly Pro Gly Cys Ser Asp
485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
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565 570 575
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Ser Arg Arg Ser Glu Gln Leu Lys Glu Glu Ser Glu Gly Glu Gln Phe
740 745 750
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Leu Cys Gly Gly Gly Ile Gln Glu Arg Tyr Met Thr Val Lys Lys Arg
770 775 780
Phe Lys Ser Ser Gln Phe Thr Ser Cys Lys Asp Lys Lys Glu Ile Arg
785 790 795 800
Ala Cys Asn Val His Pro Cys
805

Claims (7)

1.分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株为两株细胞2D3F5和4B6F2，保藏于中国典型培养物保藏中心，所述2D3F5保藏编号为CCTCC NO: C202093，所述4B6F2保藏编号为CCTCC NO: C202094。
2.权利要求1所述的分泌抗Spondin1单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的抗原表位处于Spondin1蛋白的C端和Spondin1蛋白的M段，处于Spondin1蛋白的C端的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；处于Spondin1蛋白的M段的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.Spondin1蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述Spondin1检测试剂盒包含权利要求2所述的单克隆抗体包被的磁微粒。
4.根据权利要求3所述的Spondin1蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述Spondin1蛋白检测试剂盒还包含校准品Spondin1蛋白、碱性磷酸酶标记的检测抗体、洗涤液和化学发光底物。
5.根据权利要求4所述的Spondin1蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为AMPPD，所述的单克隆抗体包被的磁微粒中的抗体为杂交瘤细胞株2D3F5分泌的单克隆抗体，所述检测抗体为杂交瘤细胞株4B6F2分泌的单克隆抗体。
6.权利要求2所述的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述单克隆抗体用于制备检测Spondin1蛋白过量表达或诊断以Spondin1蛋白异常表达的试剂中。
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述试剂用于制备Spondin1蛋白检测试剂盒。
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Wnt通路新调控因子R-spondin家族在结直肠癌中的表达及其临床意义;刘合利 等;《中南大学学报(医学版)》;20171231;第42卷(第5期);501-506 *

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