CN111334480A - 一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分泌抗Aβ1‑42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株包括杂交瘤细胞株2A8和杂交瘤细胞株3F6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202060和CCTCC NO:C202061。本发明还公开了一种由分泌抗Aβ1‑42单克隆抗体的杂交瘤细胞株所分泌的特异性识别脑脊液或血液中Aβ1‑42多肽的单克隆抗体及其应用。本发明通过获得针对Aβ1‑42多肽不同抗原表位的单克隆抗体2种，特异性强且灵敏度高，可通过配对检测脑脊液或血液中的Aβ1‑42多肽的含量，应用于检测Aβ1‑42多肽含量变化或诊断以Aβ1‑42多肽异常表达为表征的疾病的产品的应用。

Description

一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）是神经系统退行性疾病，伴有特殊病理和生化变化，是一种获得性、持续性及全面性的认知功能障碍的临床综合症。目前AD的诊断仍依赖于检测量表、MCI、CT等传统手段，这就会出现诊断不及时等情况。
研究表明，β-淀粉样蛋白（Aβ）是淀粉样蛋白前体（APP）经蛋白水解酶作用后的底物，由第21号染色体编码，是阿尔兹海默症的主要病理蛋白之一。APP被至少3种酶加工，其切割途径包括分泌酶途径I和分泌酶途径II。在分泌酶途径中，APP首先被β-分泌酶裂解，随后在γ-分泌酶作用下，被切割形成含有39-43个氨基酸的多肽。其中，Aβ1-42是最常见的亚型之一，由42-43个氨基酸组成的蛋白质片段，主要位于阿尔兹海默症患者的脑内。阿尔茨海默症患者的脑脊液和血液中，Aβ1-42的含量会出现明显的降低，这是由于Aβ1-42易聚集导致的。
因此，亟需一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
发明内容
为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明的第一目的是提供一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，包括杂交瘤细胞株2A8和杂交瘤细胞株3F6，保藏于中国典型培养物保藏中心，所述杂交瘤细胞株2A8的保藏号为CCTCC NO:C202060，所述杂交瘤细胞株3F6的保藏号为CCTCC NO:C202061。
本发明的第二目的是提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞株所分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别脑脊液或血液中的Aβ1-42多肽。
本发明的第三目的是提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株2A8所分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别脑脊液或血液中的Aβ1-16多肽。
本发明的第四目的是提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株3F6所分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别脑脊液或血液中的Aβ28-42多肽。
本发明的第五目的是提供一种含有上述单克隆抗体的试剂盒。
作为优选，所述试剂盒中包含有所述单克隆抗体的固相载体、校准品Aβ1-42蛋白、碱性磷酸酶标记的检测抗体、发光底物。其中，固相载体选用磁微粒。
本发明的第六目的是提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测 Aβ1-42多肽的试剂中的应用。
作为优选，所述检测Aβ1-42多肽的试剂为检测Aβ1-42多肽含量减少或诊断以Aβ1-42多肽异常表达为表征的试剂。
作为优选，所述检测Aβ1-42多肽的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株2A8分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株3F6分泌的单克隆抗体。
本发明的有益效果是：
第一，本发明通过获得分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，获得针对Aβ1-42多肽不同抗原表位的单克隆抗体2种，特异性强且灵敏度高，可通过配对检测脑脊液或血液中的Aβ1-42多肽的含量，应用于检测Aβ1-42多肽含量变化或诊断以Aβ1-42多肽异常表达为表征的疾病的产品的应用。本发明作为新的阿尔兹海默症诊断标志物对于阿尔兹海默症的诊断和预示，具有关键意义。
第二，采用磁微粒化学发光法进行试剂盒开发，相较于酶联免疫技术，有助于提高检测灵敏度和操作便捷性，同时，也有助于后期配套自动化检测仪器的检测产品的开发。
细胞保藏：
本发明提供的一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，包括杂交瘤细胞株2A8和杂交瘤细胞株3F6，所述杂交瘤细胞株2A8和杂交瘤细胞株3F6是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏于中国典型培养物保藏中心，所述杂交瘤细胞株2A8的保藏号为CCTCC NO:C202060，所述杂交瘤细胞株3F6的保藏号为CCTCC NO:C202061，保藏日期为2020年4月3日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
附图说明
图1是本发明实施例2中2A8、3F6、4E7和4F7抗体SDS-PAGE分析示意图。
图2是本发明实施例3中2A8、3F6、4E7和4F7抗体的抗体特异性识别分析示意图。
图3是本发明中Aβ1-42检测试剂盒校准曲线图。
图4是本发明中ROC曲线统计结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1： Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备。
小鼠免疫：用Aβ1-42多肽偶联蛋白免疫BALB/c小鼠，每只小鼠每次免疫50ug抗原。首次免疫Aβ1-42多肽抗原与弗氏完全佐剂1：1混合，随后Aβ1-42多肽与弗式不完全佐剂1：1混合，每个两周免疫一次，共免疫3次，第三次免疫十天后断尾采血，检测血清效价。
杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:10000后用Aβ1-42多肽偶联蛋白(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合在 50mL离心管，然后加入1mL预热PEG作用45s后，立即缓慢滴加37℃预热的无血清DMEM培养基至35mL，42℃水浴15min，1000rpm/mim离心10min弃上清，加50mL预热HAT 培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μL，置培养箱中培养。采用Aβ1-42多肽鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞4株，分别为2A8、3F6、4E7和4F7，并鉴定抗体亚型，结果显示2A8和4E7为IgG2a，3F6和4F7为IgG2b。
实施例2：Aβ1-42单克隆抗体的制备、纯化、效价检测及特异性分析。
单抗腹水制备：10-12周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹腔接种上述杂交瘤细胞株，1x106 /只， 7-10d后，待小鼠腹部膨胀，收集腹水上清备用。
抗体纯化：将收集的腹水用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mM PBS溶液重溶沉淀。将得到的粗纯抗体以1mL/min流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mMPBS，pH7.0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M pH 9.0Tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mM PBS溶液透析3次。将透析后的抗体进行10％SDS-PAGE电泳，结果显示，4种抗体在50kD与25kD处有条带，灰度分析纯度均大于90％，2A8、3F6、4E7和4F7抗体SDS-PAGE，见图1所示。
单克隆抗体效价检测：以1μg/ml的Aβ1-42多肽的碳酸盐缓冲液(pH 9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1：64000、1:128000)，加入羊抗鼠IgG-HRP(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(S/N>2.1)，2A8、3F6、4E7和4F7单克隆抗体效价分别均为1：128000、1：256000、1：128000、1：512000。
实施例3：单克隆抗体表位鉴定。
根据Aβ1-42多肽序列，设计了N、M、C端的序列以及Aβ1-40/Aβ1-42全长多肽，并合成相应的多肽序列，信息如下：
Aβ1-16：DAEFRHDSGYEVHHQK ，其序列如SEQ ID NO:1所示；
Aβ15-30：QKLVFFAEDVGSNKGA，其序列如SEQ ID NO:2所示
Aβ28-42：KGAIIGLMVGGVVIA，其序列如SEQ ID NO:3所示；
Aβ1-40：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV，其序列如SEQ ID NO:4所示；
Aβ1-42：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA，其序列如SEQ ID NO:5所示。
蛋白免疫印迹法WB确认抗体识别表位：Aβ1-16、Aβ15-30、Aβ28-42和Aβ1-42全长4种多肽取5μg 上样，进行15％SDS-PAGE电泳。电泳完成后，150V恒压条件下，蛋白转入0.45pgmPVDF。转膜完成后利用含5％BSA的PBST溶液37℃封闭两小时。分别用5μg/mL的抗体(2A8、3F6、4E7和4F7)溶液37℃孵育1小时。孵育完成后，加入50ng/ml的兔抗鼠IgG-HRP孵育1小时。清洗完成后，加入DAB显色液进行显色。Aβ1-42全长作为阳性对照，Aβ1-16、Aβ15-30、Aβ28-42片段位置棕色沉淀物质，则表明抗体识别该目的片段。结果显示，2A8抗体特异性识别Aβ1-16，3F6抗体特异性识别Aβ28-42，4E7和4F7与Aβ15-30和Aβ28-42蛋白均可反应，见图2。
ELISA法确认抗体识别表位：分别以CBS缓冲液100μl体积包被5μg/ml的Aβ1-16、Aβ1-40和Aβ1-42蛋白4℃过夜，将4株抗体分别倍比稀释(250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml和0ng/ml)后加入到微孔反应板，然后加入羊抗鼠IgG-HRP(50ng/ml)，结果如表1所示。结果确定2A8特异性识别Aβ1-16，3F6特异性识别Aβ1-42，4E7和4F7与Aβ1-40和Aβ1-42蛋白均可反应，因此2A8特异性针对Aβ1-16，3F6特异性针对Aβ1-42，但因3F6不与Aβ1-40片段反应，因此3F6特异性针对Aβ1-42，且不与Aβ1-40发生交叉反应。
表1：单克隆抗体特异性分析。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例4：Aβ1-42单克隆抗体配对验证。
根据上述单抗特异性验证结果推测2A8、4E7及4F7可作为试剂盒的捕获抗体，3F6作为试剂盒的检测抗体用于特异性识别Aβ1-42多肽，从而区别于Aβ1-40。以5μg/ml 2A8、4E7及4F7抗体包被微孔反应板，加入100μl不同浓度(0-1200pg/mL)的Aβ1-42校准品，37℃孵育60min，洗涤后加入100μL浓度为100ng/ml的HPR标记的3F6抗体，并于37℃孵育60min，洗涤后加入底物于酶标仪测定其吸光度，结果如表2所示，可见2A8可作为试剂盒的捕获抗体，3F6作为试剂盒的检测抗体用于特异性识别Aβ1-42多肽，且不与Aβ1-40发生交叉反应。
表2：Aβ1-42多肽单克隆抗体配对结果。
Aβ1-42多肽( pg/ml) 2A8 4E7 4F7
0 0.042 0.814 0.075
75 0.083 0.709 0.063
150 0.16 0.902 0.097
300 0.372 0.913 0.108
600 0.779 0.879 0.178
1200 1.563 1.052 0.156
实施例5：Aβ1-42检测试剂盒。
校准曲线绘制：首先在微孔板或磁珠表面包被捕获抗体2A8，浓度为2.5μg/ml，将人Aβ1-42校准品蛋白用20％FBS溶液稀释为0、75、150、300、600、1200pg/ml，每孔100μL，再加入碱性磷酸酶标记的3F6抗体，浓度100ng/ml，每孔100μl，37℃孵育1小时。用PBST清洗3次，化学发光底物加入后，检测RUL值（发光值）。从校准曲线计算出被测样品的Aβ1-42含量。校准曲线线性范围 0～1200pg/ml，图3为Aβ1-42检测试剂盒校准曲线，其中，Y轴代表RUL值（发光值），X轴代表 Aβ1-42校准品的浓度。
Aβ1-42检测试剂盒用于阿尔兹海默症诊断：从医院收集30例阿尔兹海默症患者的脑脊液和血清；同时从医院收集30例非阿尔茨海默症患者的脑脊液和血清。使用Aβ1-42检测试剂盒检测阿尔兹海默症、非阿尔茨海默症患者脑脊液中Aβ1-42蛋白浓度。如图4所示，ROC曲线统计结果显示，曲线下面积为0.88，以130pg/ml作为检测参考值，Aβ1-42检测试剂盒特异性为96.67％，灵敏度为93.33％。使用Aβ1-42检测试剂盒检测阿尔兹海默症、非阿尔茨海默症患者血清中Aβ1-42蛋白浓度。ROC曲线统计结果显示，曲线下面积为0.85，以130pg/ml作为检测参考值，Aβ1-42检测试剂盒特异性为 90.00％，灵敏度为86.67％。
综上所述，本发明提供的一对单克隆抗体可用于样品中Aβ1-42蛋白多肽的检测，且能够特异性检测Aβ40-42。2种单克隆抗体特异识别Aβ1-42的不同区段，可通过配对检测如脑脊液、血清等样品中Aβ1-42含量，应用于Aβ1-42特别是Aβ40-42蛋白含量检测或诊断以Aβ40-42蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州仁端生物医药科技有限公司
<120> 一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
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<211> 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
1 5 10 15
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<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
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<212> PRT
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Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40

Claims (9)

1.分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，包括杂交瘤细胞株2A8和杂交瘤细胞株3F6，保藏于中国典型培养物保藏中心，所述杂交瘤细胞株2A8的保藏号为CCTCCNO:C202060，所述杂交瘤细胞株3F6的保藏号为CCTCC NO:C202061。
2.单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株2A8和3F6所分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别脑脊液或血液中的Aβ1-42多肽。
3.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株2A8所分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别脑脊液或血液中的Aβ1-16多肽。
4.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株3F6所分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别脑脊液或血液中的Aβ28-42多肽。
5.一种含有如权利要求2-4任一所述的单克隆抗体的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含有所述单克隆抗体的固相载体、校准品Aβ1-42蛋白、碱性磷酸酶标记的检测抗体、发光底物。
7.一种如权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于检测 Aβ1-42多肽的试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测Aβ1-42多肽的试剂为检测Aβ1-42多肽含量减少或诊断以Aβ1-42多肽异常表达为表征的试剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测Aβ1-42多肽的试剂的捕获抗体为杂交瘤细胞株2A8分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株3F6分泌的单克隆抗体。
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