CN115135670A - 抗d-二聚体重组抗体、其方法和用途 - Google Patents

抗d-二聚体重组抗体、其方法和用途 Download PDF

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Abstract

本申请涉及与纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)诸如D‑二聚体、片段DD和片段D以高结合亲和力特异性地结合并且不与片段E和纤维蛋白原结合的抗D‑二聚体重组抗体。本发明还涉及使用所述重组抗体检测样品中D‑二聚体和FDP片段的方法和测定。

Description

抗D-二聚体重组抗体、其方法和用途
描述
技术领域
本申请涉及与纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)诸如D-二聚体、片段DD和片段D以高结合亲和力特异性地结合并且不与片段E和纤维蛋白原结合的抗D-二聚体重组抗体。本发明还涉及使用所述重组抗体检测样品中D-二聚体和FDP片段的方法和测定。
背景
纤维蛋白原是存在于血浆中的循环可溶性蛋白质，当用凝血酶(因子IIa)处理时，在凝血级联期间形成纤维蛋白聚合物。纤维蛋白原由三条链组成；即α、β和γ，它们形成了较大的哑铃形结构，具有作为末端的两个D结构域以及中心E结构域。纤维蛋白聚合物由纤维蛋白原单体的交错组装产生。纤维蛋白聚合物可以通过形成异肽键、共价连接纤维蛋白链的因子XIII(FXIII)进一步交联。
在纤维蛋白溶解期间，交联的纤维蛋白聚合物(凝血的产物)被丝氨酸蛋白酶纤溶酶降解，得到降解产物的异质混合物，其中最小的是D-二聚体(图1)。其他纤维蛋白(纤维蛋白原)降解产物(FDP)是片段X、片段Y、片段D片段和E。D-二聚体由两个交联的D结构域和一个E结构域组成。通过尿素抽提可以将D结构域和E结构域分离，得到片段DD和片段E。由于两个D结构域之间的异肽键稳定了二聚化，所以片段DD是独特的。
纤维蛋白(纤维蛋白原)降解产物(FDP)的检测被用于诊断静脉血栓栓塞(VTE)，诸如深静脉血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)。当FDP大量存在时，FDP可以通过与血小板表面结合、干扰血小板功能以及与纤维蛋白单体形成可溶性复合物、阻止聚合和凝块(clot)稳定而干扰止血过程。
D-二聚体和片段DD由于存在交联的D结构域而引起诊断兴趣，它们指示凝血事件诸如DVT或PE。目前存在许多可用的D-二聚体测定，然而，由于使用识别不同表位的不同的单克隆抗体，不同的测定形式、测定校准标准和范围以及不同的仪器，这些D-二聚体测定都是不同的1。ELISA和基于凝集(agglutination)的测定是最常见的，并且测试可以是定性或定量的。凝集测试有许多种形式，并且在自动化胶乳测定的情况下，与抗D-二聚体抗体缀合的珠在存在患者血浆的条件下凝集，并且透射比浊法检测被用于表征凝集。在一些装置中，结合D-二聚体和红细胞两者的双特异性抗体被用于引起红细胞凝集，从而提供定性结果2。
D-二聚体测定是最常被要求的凝血测试中的一种，最常用于排除静脉血栓栓塞(VTE)。当四肢或腹股沟的深静脉中形成血凝块(DVT)时，发生VTE并且VTE可能移动至肺(PE)3。国际血栓形成和止血学会(International Society of Thromobosis andHaemostasis)已经认可D-二聚体测试用于弥散性血管内凝血(DIC)的作用。然而，循环D-二聚体可能存在于冠状动脉疾病、癌症、创伤、妊娠、感染性疾病、炎性疾病、高龄和许多其他状况和疾病状态中4。当D-二聚体测试用于DVT或PE的诊断级联时，可以排除针对DVT或PE的进一步测试。这突出了进行灵敏测试的重要性，使得具有VTE的患者不被不适当地排除。一般而言，ELISA的灵敏度高于胶乳凝集测定，然而，自动化和重复性的价值使胶乳测定在许多临床实验室中更易于操作。D-二聚体测试对于特定诊断的特异性取决于测试前概率5。此外，D-二聚体测试可能对来自异嗜性抗体的干扰敏感6，或对干扰性的人抗小鼠抗体敏感(如果使用小鼠抗D-二聚体单克隆抗体)7。如同大多数临床测试，它不能孤立存在，并且在诊断过程期间需要作为更大证据体的一部分来考虑。
许多抗D-二聚体单克隆抗体已被产生，并且是在杂交瘤在上清液中时或是在杂交瘤注射到小鼠腹部产生腹水时产生的。尽管杂交瘤通常是一种稳健且有效的产生单克隆抗体(mAb)的方式，但该技术存在局限性。首先，杂交瘤可能变得耗竭，并且不再产生抗体，尽管产生了细胞库，但可能失去作为生产来源的杂交瘤。第二，杂交瘤可能由于冷冻箱故障或其他事故而损失。以及最后，杂交瘤以抗体的天然形式产生抗体，使得测序和重组表达对于进一步进行mAb工程化成为必要。
因此，对于可以容易且重复地产生并提供针对D-二聚体的高特异性以用于血栓检测测定的抗D-二聚体抗体存在需求。
本发明提供了重组抗体和抗原结合片段(Fab或F(ab’)2)，它们能够特异性地检测FDP，与现有技术的单克隆抗体(以杂交瘤产生)相比具有若干优点。
首先，与通常认为不稳定的杂交瘤细胞系产生的蛋白质相比，在使用重组蛋白质时存在提高的控制和重复性8,9。第二，通过以受控的生化和物理过程参数使用稳定的细胞系，可以实现更大的批次间一致性10。第三，无动物技术允许在不使用任何动物的情况下进行生产，消除了福利和伦理方面的考虑。第四，本发明的重组抗体可以被工程化以包含用于尤其是纯化或可溶性等目的的其他功能性结构域。第五，如果需要，则可以选择同种型(IgG1，IgG2a，IgG3)以产生更高产量或更稳定的蛋白质。最后，通过能够对重组蛋白质进行工程化，在降低人抗小鼠抗体干扰(HAMA)的可能性方面提供了额外的优点7，在病例研究中显示，HAMA引起不清楚的读取，对患者的诊断产生不利影响。
因此，本发明涉及能够实现用于检测D-二聚体、片段DD和片段D的测定，在临床上在诊断DVT、PE和其他急性疾病状态方面具有效用的重组抗体。
概述
本发明的第一方面涉及一种抗D-二聚体重组抗体，其与纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)D-二聚体、片段DD和片段D特异性地结合，并且不与片段E和纤维蛋白原结合。
在一种实施方案中，所述重组抗体包括包含互补决定区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链，所述互补决定区中的每一个包含选自SEQ ID NO:18的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸的序列。在一种优选的实施方案中，所述选自SEQ ID NO:18的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸包括SEQ ID NO:18的氨基酸24至34、或50至56或89至97中的至少一个。在一种优选的实施方案中，所述轻链的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别包含SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32和SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在一种实施方案中，所述轻链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在另一种实施方案中，所述重组抗体包括包含互补决定区H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链，所述互补决定区中的每一个包含选自SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20、或SEQID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸的序列。在优选的实施方案中，所述选自SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸包括SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22的氨基酸31至35、或50至65或95至102中的至少一个。在一种优选的实施方案中，所述重链的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别包含SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的重组抗体可以具有分别包含SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:37和SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。
在一些实施方案中，本发明的重组抗体可以具有分别包含SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:38和SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。
在一种实施方案中，所述重链包含SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在一种实施方案中，本发明的重组抗体可以包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR2)；和SEQ ID NO:33的氨基酸序列(L-CDR3)；以及
重链可变区，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:35的氨基酸序列(H-CDR2)；和SEQ ID NO:36的氨基酸序列(H-CDR3)。
在另一种实施方案中，本发明的重组抗体可以包含：
轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:18中列出的序列至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％相同的氨基酸序列，以及
重链可变区，其包含与选自由SEQ ID NO:19、20、21和22组成的组的序列至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％相同的氨基酸序列。
在又另外的实施方案中，本发明的重组抗体可以包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列，以及
重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:19、20、21和22组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的重组抗体可以包含：
轻链可变区，其包含SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列，以及
重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:19和20组成的组的氨基酸序列。
在另一种实施方案中，本发明的重组抗体是单克隆抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体片段选自可变片段(Fv)、单链Fv(scFv)、双特异性抗体(sc(Fv)2)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、二硫化物连接的Fv(dsFv)、化学缀合的Fv(ccFv)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体和单抗体(unibody)。在另一种实施方案中，所述抗体片段是选自Fab片段和F(ab’)2片段的抗原结合片段。
在一种实施方案中，本发明的重组抗体包含鼠IgG1类或鼠IgG2a类的恒定区。
在另一种实施方案中，本发明的重组抗体还包含亲和标签。所述亲和标签可以选自由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25组成的组。
在另外的实施方案中，本发明的重组抗体的轻链包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在另一种实施方案中，本发明的重组抗体的重链包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在另一种实施方案中，本发明的重组抗体的轻链包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且所述重组抗体的重链包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在本文描述的另一种实施方案中，重组抗体包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列和SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
在一种实施方案中，本发明的重组抗体与固体支持物结合。
在另一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少(约)3倍。例如，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少(约)10倍。在另一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少(约)20倍。在另一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少(约)30倍。在另一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少(约)40倍。在另一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少(约)50倍。在另一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少(约)60倍。在另一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少(约)70倍。在另一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少(约)80倍。
在另一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力可以比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少约20倍和约100倍之间。例如，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力可以比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少约40倍和约100倍之间。例如，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力可以比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少约60倍和约100倍之间。例如，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力可以比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少约70倍和约100倍之间。例如，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力可以比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少约70倍和约90倍之间。例如，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力可以比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少约80倍和约90倍之间。
在另一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少1个数量级。例如，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强约2个数量级。在一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少1个数量级但小于3个数量级。
如本文使用的，术语“结合亲和力”是指抗原的表位和抗体的抗原结合位点之间的相互作用的强度，如在约23℃和1大气压在来自Sartorius(先前是FortéBio)的OctetRed96e系统上通过生物层干涉测量法测量的。
有利地，与商业可得的抗D-二聚体抗体相比，本发明的重组抗体/抗体表现出改进的与纤维蛋白降解产物的结合。此外，本发明的重组抗体/抗体对纤维蛋白原或片段E没有示出结合亲和力。
在另外的方面，本发明涉及包含本发明的重组抗体的细胞。本发明还涉及包含编码本发明的重组抗体的核苷酸序列、可操作地连接至该核苷酸序列的启动子和选择性标志物的核酸。本发明还涉及包含所述核酸的细胞。
本发明还涉及包含本发明的重组抗体和固体支持物的组合物，其中所述重组抗体与固体支持物共价或非共价结合。在优选的实施方案中，固体支持物包括颗粒、珠、膜、表面、多肽芯片、微量滴定板或色谱柱的固相。优选地，所述固体支持物是胶乳颗粒。
在另一方面，本发明涉及一种用于检测样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的存在的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据本发明的重组抗体和固体支持物，其中所述至少一种重组抗体与固体支持物共价或非共价结合。
在另外的方面，本发明涉及一种用于检测样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的存在的方法，所述方法包括：
-使所述样品与至少一种本发明的重组抗体在足以形成抗体/抗原复合物的条件下并持续一段时间接触，以及
-检测所述抗体/抗原复合物。
在另外的方面，本发明涉及一种测量样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的结合亲和力的方法，所述方法包括：
-使所述样品与至少一种本发明的重组抗体在足以形成抗体/抗原复合物的条件下并持续一段时间接触，以及
-确定抗体和样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D之间的结合亲和力。
在另外的方面，本发明涉及一种测量样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的浓度的方法，所述方法包括：
-使所述样品与至少一种根据本发明的重组抗体在足以形成抗体/抗原复合物的条件下并持续一段时间接触，以及
-测量样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的浓度。
附图简述
图1是纤维蛋白单体组装以形成纤维蛋白原的示意图。凝血酶作用于纤维蛋白或纤维蛋白原以从α链和β链释放E结构域处的纤维蛋白肽，导致纤维蛋白通过纤维蛋白的交错连接聚合为纤维蛋白原。FXIIIa通过形成异肽键来交联α-α链和γ-γ链以稳定原丝。丝氨酸蛋白酶纤溶酶消化纤维蛋白，产生片段X(280kDa)、片段Y(150kDa)、片段D(94kDa)和片段E(50kDa)。由于通过FXIIIa交联，经交联的纤维蛋白的消化产生多种不同尺寸的产物，其中最小的是D-二聚体(240kDa)。可以通过尿素抽提分离D-二聚体的D结构域和E结构域，得到片段DD(190kDa)和片段E(50kDa)。
图2示出了本发明的重组抗体在还原(R)和非还原条件(N或NR)下的SDS-PAGE结果，抗体#4和抗体#6除外，对其替代地示出了CE-SDS的结果。
图3示出了抗体#9和抗体#12的代表性光散射数据。A280示踪峰与跨每个峰的测量摩尔质量相交，并且每个峰的平坦摩尔质量数据指示单分散样品。#9：预测的质量＝48.8kDa，测量的质量＝48.3±1％kDa，Mw/Mn＝1.001。#12：预测的质量＝103kDa，测量的质量＝105±4％kDa，Mw/Mn＝1.000。所有重组抗D-二聚体抗体均显示出单分散峰(数据未示出)。
图4示出了结合研究中使用的经纯化的FDP。
图5是示出重组抗体#12与片段DD、片段D、片段E和纤维蛋白原的结合亲和力的比较的图。当使用Octet BLI平台时，来自纤维蛋白的片段DD(A)和来自纤维蛋白原的片段D(B)两者均显示出与抗体#12的结合。片段E(C)和纤维蛋白原(D)均未显示出与抗体#12的结合。
图6是示出血浆样品中D-二聚体的存在在ACL TOP凝血分析仪上的HemosILDDHS500和Q SMART系统上的各种抗体之间相关良好的图。A)示出使用已知的8D3杂交瘤来源的抗体的线性相关，B)示出在IgG1抗体(#6)的情况下的线性相关，C)示出在IgG2a(#5)的情况下的线性相关，以及D)示出使用胃蛋白酶消化的IgG2a#5的F(ab’)2的线性相关。
图7示出A)使用Grifols Q SMART系统的#12和D-二聚体与使用HemosIL DDHS550和具有不同D-二聚体存在的血浆样品的ACL TOP凝血分析仪之间的线性相关，以及B)当在QSMART系统上使用#12或杂交瘤8D3 mAb分析血浆样品中存在的D-二聚体时的线性相关。
定义
以下描述仅意图说明本公开内容的各种实施方案。因此，所讨论的特定修改并非意图是限制性的。对于本领域技术人员将明显的是，在不偏离本文呈现的主题的精神或范围的情况下，可以具有各种等同物、改变和修改，并且应理解，这样的等同的实施方案将被包括在本文中。
如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非内容另有清楚指示。
贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”或变化形式诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的要素或整数，或者要素或整数的组，但不排除任何其他的要素或整数，或者要素或整数的组。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。下文描述了示例性的方法和材料，尽管与本文描述的方法和材料类似或等效的方法和材料也可以使用，并且对本领域技术人员将是明显的。本文提及的所有出版物和其他参考文献均通过引用以其整体并入。在冲突的情况下，应以本说明书(包括定义)为准。材料、方法和实例仅为说明性的而并非意图限制。
除非另外明确陈述，否则本说明书中的每种实施方案将在适当修改后适用于每一种其他实施方案。
除非另外指示，否则以下术语应被理解为具有以下含义：
如本文使用的，术语“核酸”是指包括DNA或RNA的任何材料。核酸可以合成地制备或由活细胞制备。
如本文使用的，术语“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物链。该术语包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA或合成DNA)和RNA分子(例如，mRNA或合成RNA)，以及含有非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键或两者的DNA或RNA的类似物。核酸可以呈任何拓扑构象。例如，核酸可以是单链、双链、三链、四链、部分双链、支链、发夹形、环形或挂锁形的构象。
如本文使用的，术语“蛋白质”是指由一个或更多个氨基酸残基的链组成的大的生物分子或大分子。许多蛋白质是催化生化反应的酶，并且对代谢至关重要。蛋白质还具有结构功能或机械功能，诸如肌肉中的肌动蛋白和肌球蛋白以及细胞骨架中的蛋白质，它们形成了维持细胞形状的支架系统。其他蛋白质在细胞信号传导、免疫应答、细胞粘附和细胞周期中是重要的。然而，蛋白质可以是完全人工的或重组的，即，不是天然存在于生物系统中的。
如本文使用的，术语“多肽”是指天然存在和非天然存在的蛋白质，以及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体的或聚合的。多肽可以包含许多不同的结构域(肽)，结构域(肽)中的每一个具有一种或更多种不同的活性。
如本文使用的，术语“重组”是指这样的生物分子，例如基因或蛋白质，所述生物分子(1)已从其天然存在的环境中去除，(2)不与自然界中发现该基因的多核苷酸的全部或部分缔合，(3)与自然界中不与其连接的多核苷酸可操作地连接，或(4)未出现于自然界中。术语“重组”可以用于指克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物、或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由这样的核酸编码的蛋白质和/或mRNA。
如本文使用的，术语“抗原”是指与相应的抗体特异性地结合的生物分子。来自不同库(repertoire)的抗体借助于其可变区相互作用结合特定的抗原结构。
如本文使用的，术语“融合蛋白”是指包含两个或更多个不共存于天然存在的蛋白中的氨基酸序列的蛋白。融合蛋白可以包含两个或更多个来自相同或不同生物体的氨基酸序列。融合蛋白的两个或更多个氨基酸序列通常同框(in frame)，它们之间没有终止密码子，并且通常作为融合蛋白的一部分从mRNA翻译。
如本文使用的，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体(完全或部分人源化的)、动物抗体、重组抗体、嵌合抗体和抗体片段。因此，如本文使用的术语“抗体片段”包括但不限于可变片段(Fv)、单链Fv(scFv)、双特异性抗体(sc(Fv)2)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、二硫化物连接的Fv(dsFv)、化学缀合的Fv(ccFv)、双抗体和抗独特型(抗Id)抗体，以及上述任何一种的功能活性表位结合片段。在某些实施方案中，抗体还包括亲和体、纳米抗体和单抗体。在某些实施方案中，特定抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2)或亚类。
如本文使用的，术语“抗原结合片段(Fab)”是指包含重链和轻链中的每一个的一个恒定结构域和一个可变结构域的抗体片段。可变结构域包含抗原结合位点。通常，抗体包含片段可结晶区(Fc)和两个抗原结合片段(Fab)。Fab片段可以与Fc区分离，得到两个Fab片段，其也被称为F(ab')2片段或抗原结合性二聚体片段。
在天然抗体中，两条重链通过二硫键彼此连接，并且每个重链通过二硫键与轻链连接。存在两种类型的轻链，lambda(λ)和kappa(κ)。存在决定抗体分子功能活性的五种主要的重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链包含不同的序列结构域。轻链包含两个结构域，即一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。重链包含四个结构域，即一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予了重要的生物学性质，诸如抗体链缔合、分泌、跨胎盘运动、补体结合以及与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N末端部分，并且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基构成。偶尔，来自非高变区或框架区(FR)的残基影响整个结构域结构，并且因此影响结合位点。互补决定区或CDR是指共同定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原结合位点通常包含六个CDR，包含来自重链V区和轻链V区中的每一个的CDR集。框架区(FR)是指插入CDR之间的氨基酸序列。
CDR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。抗体CDR可以被标识为Kabat等人最初定义的高变区。参见，例如，Kabat等人，1992，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，NIH，Washington D.C.。CDR的位置也可以被标识为Chothia和其他人最初描述的结构环结构(参见，例如Chothia等人，Nature 342:877-883，1989)。CDR标识的其他方法包括“AbM定义”，其为Kabat和Chothia之间的折中，并且是使用Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(现在的Accelrys0)导出的；基于观察到的抗原接触的CDR的“接触定义”，在MacCallum等人，J.Mol.Biol.,262:732-745,1996中阐述；或“IMGT独特编号”，其依赖于可变区的结构的高保守性(参见Lefranc，M.-P.Nucl.Acids Res.，33，D593-D597，2005)。在本文称为CDR的“构象定义”的另一种方法中，CDR的位置可以被标识为对抗原结合做出焓贡献的残基。参见，例如，Makabe等人，Journal of Biological Chemistry，283:1156-1166，2008。鉴于预测或实验发现，特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合，又其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上述方法中的一种，但仍将与Kabat CDR的至少一部分重叠，尽管它们可能被缩短或延长。如本文使用的，CDR可以指由本领域中已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。本文使用的方法可以利用根据这些方法中的任何一种定义的CDR。对于包含多于一个CDR的任何特定实施方案，每个CDR可以根据Kabat定义、Chothia定义、扩展定义、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义或构象定义中的任何一种来定义。
抗体序列的示例性数据库在以下描述并且可以通过以下访问：“Abysis”网站www.bioinf.org.uk/abs(由Department of Biochemistry&Molecular BiologyUniversity College London,London,England的A.C.Martin维护)，以及VBASE2网站www.vbase2.org，如Retter等人，Nucl.Acids Res.，33(数据库专刊)：D671-D674(2005)中描述的。优选地，使用Abysis数据库分析序列，该数据库将来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据整合。除非另外指示，否则本文列出的所有CDR都是根据Abysis数据库网站按照所指示的方案导出的。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指具有与同一表位结合的同质抗体群的抗体组合物。该术语不限于抗体的种类或来源，也不意图受限于其制备方式。因此，该术语包括从鼠杂交瘤获得的抗体，以及使用人类而非鼠的杂交瘤获得的人类单克隆抗体。
如本文使用的，术语“表位”是指抗原的与抗体特异性结合的部分。因此，术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何蛋白质决定簇。
如本文使用的，术语“重组抗体”是指非天然存在并可以与自然界中不存在的多肽或其片段缔合的抗体或其片段。重组抗体可以通过技术人员熟知的任何重组技术来产生。
如本文使用的，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性百分比”是指当进行比较和对齐以获得最大对应时相同或具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。为了确定同一性百分比，为了最佳比较的目的将序列对齐(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位以便与第二氨基酸或核酸序列最佳对齐)。然后将在对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被第二序列中对应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性％＝相同位置数目/位置(例如，重叠位置)总数目×100)。在一些实施方案中，在适当地(例如，排除延伸超出所比较的序列的另外的序列)在序列内引入空位之后，所比较的两个序列长度相同。对于在两个序列之间的序列比较，“对应的”CDR是指两个序列中相同位置的CDR(例如，每个序列的CDR-H1)。
对两个序列之间的同一性百分比或相似性百分比的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选的、非限制性实例是Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268中的算法，如在Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中修改的。这样的算法被并入Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序进行，评分＝100，字长＝12，以获得与编码感兴趣的蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，评分＝50，字长＝3，以获得与感兴趣的蛋白质同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的对齐，可以利用Gapped BLAST，如Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述的。当利用BLAST和GappedBLAST时，可以使用相应的程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。用于序列比较的数学算法的另一优选的、非限制性实例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。这样的算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12和空位罚分4。
当由于抗体识别多肽中包含的特定表位而引起多肽与抗体结合时，多肽与抗体具有“免疫反应性”。免疫反应性可以通过抗体结合，更特别地通过抗体结合的动力学，和/或通过使用包含抗体所针对的表位的已知多肽作为竞争物的结合中的竞争来确定。用于确定多肽与抗体是否具有免疫反应性的技术是本领域已知的。
如本文使用的术语“样品”是指从受试者或患者获得的任何生物材料。在一方面，样品可以包括血液、腹膜液、CSF、唾液或尿液。在其他方面中，样品可以包括全血、血浆、血清、从血液样品中富集的B细胞和经培养的细胞(例如，来自受试者的B细胞)。样品还可以包括活检或组织样品，包括神经组织。在又其他的方面中，样品可以包括完整细胞和/或细胞裂解物。
如本文使用的术语“诊断的”或“被诊断的”意指鉴定病理状况的存在或性质或易受疾病影响的患者。诊断方法的灵敏度和特异性不同。诊断测定的“灵敏度”是患病个体被测试为阳性的百分比(“真阳性”的百分比)。未被测定检测出的患病个体是“假阴性”。未患病并且在测定中被测试为阴性的受试者称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率被定义为无疾病、测试为阳性的那些受试者的比例。尽管特定的诊断方法可能不提供状况的确定性诊断，但是如果该方法提供了有助于诊断的有用指示，它就合格了。
术语“患者”或“个体”在本文可互换地使用，并且指待治疗的哺乳动物受试者，其中人类患者是优选的。在一些情况下，本发明的方法可用于实验动物、兽医应用和疾病动物模型的开发，包括但不限于啮齿类动物(包括小鼠、大鼠和仓鼠)和灵长类动物。
详述
I.重组抗体
本发明涉及一种抗D-二聚体重组抗体，其与纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)D-二聚体、片段DD和片段D特异性地结合，并且不与片段E和纤维蛋白原结合。
在本文描述的一种实施方案中，重组抗体包含轻链和重链。在本文描述的其他实施方案中，重组抗体包含两条轻链和两条重链。本发明的重组抗体的轻链可以包含两个结构域，即一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。本发明的重组抗体的重链可以包含四个结构域，即一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。
在另一种实施方案中，本发明的重组抗体是单克隆抗体或抗体片段。在优选的实施方案中，所述抗体片段选自可变片段(Fv)、单链Fv(scFv)、双特异性抗体(sc(Fv)2)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、二硫化物连接的Fv(dsFv)、化学缀合的Fv(ccFv)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、亲和体、纳米抗体和单抗体。
在本文描述的一种实施方案中，重组抗体包含Fc区和两个Fab片段。在本文描述的其他实施方案中，重组抗体是抗原结合片段，并且不包含Fc区。在本文描述的其他实施方案中，重组抗体由一个Fab片段组成。在本文描述的其他实施方案中，重组抗体由两个Fab片段组成(F(ab)2)。
在本文描述的一种实施方案中，重组抗体可以是任何已知类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，或任何已知类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2)或任何已知亚类。
在本文描述的一种实施方案中，重组抗体是IgG类型。在优选的实施方案中，重组抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类。在另一种优选的实施方案中，重组抗体是IgG1或IgG2类。在另一种优选的实施方案中，重组抗体是IgG2a类。
在最优选的实施方案中，本发明的重组抗体包含鼠IgG1类或鼠IgG2a类的恒定区。
A.轻链
在本文描述的一种实施方案中，重组抗体包括包含互补决定区(CDR)的轻链。所述CDR对应于根据技术人员已知的任何CDR定义方法标识的序列。在一些优选的实施方案中，CDR区对应于根据Kabat标识的序列。在一些优选的实施方案中，CDR区对应于根据Chothia标识的序列。在另一种实施方案中，CDR可以是Kabat定义、Chothia定义、AbM定义、扩展定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义、组合CDR或其组合中的任何一种。
在本文描述的一种实施方案中，重组抗体包括包含互补决定区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链，所述互补决定区中的每一个包含选自SEQ ID NO:18的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸的(不同的)序列。在一种优选的实施方案中，所述选自SEQ ID NO:18的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸包括SEQ ID NO:18的氨基酸24至34、或50至56或89至97中的至少一个。在一种实施方案中，所述轻链的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在该实施方案中，SEQ ID NO:31至33分别表示SEQ ID NO:18的Kabat定义的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。
在本文描述的另一种实施方案中，本发明的重组抗体的轻链的可变区包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列或其片段。在又一种实施方案中，重组抗体的轻链的可变区可以与由SEQ ID NO:18组成的氨基酸序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的同源性。
在本文描述的另一种实施方案中，重组抗体包括包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其片段的轻链。在其他实施方案中，重组抗体的轻链可以与由SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:18组成的氨基酸序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的同源性。
B.重链
在本文描述的一种实施方案中，重组抗体包括包含互补决定区(CDR)的重链。所述CDR对应于根据技术人员已知的任何CDR定义方法标识的序列。在一些优选的实施方案中，CDR区对应于根据Kabat标识的序列。在一些优选的实施方案中，CDR区对应于根据Chothia标识的序列。在另一种实施方案中，CDR可以是Kabat定义、Chothia定义、AbM定义、扩展定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义、组合CDR或其组合中的任何一种。
在本文描述的一种实施方案中，重组抗体包括包含互补决定区H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链，所述互补决定区中的每一个包含选自SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸的序列。在优选的实施方案中，所述选自SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸包括SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21或SEQID NO:22的氨基酸31至35、或50至65或95至102中的至少一个。在一种优选的实施方案中，所述重链的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3可以分别包含SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ IDNO:36的氨基酸序列。在该实施方案中，SEQ ID NO:34和36分别表示SEQ ID NO:19至22的如通过Kabat确定的H-CDR1和H-CDR3，并且SEQ ID NO:35表示SEQ ID NO:19至22的如通过Chothia确定的H-CDR2。
在另外的实施方案中，重链可以包含如分别由SEQ ID NO:34、37和36定义的互补决定区H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。在该实施方案中，SEQ ID NO:34、37和36分别表示SEQ IDNO:19至20的Kabat定义的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。
在又另外的实施方案中，重链可以包含如分别由SEQ ID NO:34、38和36定义的互补决定区H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。在该实施方案中，SEQ ID NO:34、38和36分别表示SEQID NO:21至22的Kabat定义的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3。
在本文描述的另一种实施方案中，本发明的重组抗体的重链的可变区包含SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其片段。在其他实施方案中，重组抗体的重链的可变区可以与由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22组成的氨基酸序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的同源性。
在本文描述的另一种实施方案中，重组抗体包括包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其片段的重链。在其他实施方案中，重组抗体的重链可以与由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22组成的氨基酸序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的同源性。
C.亲和标签
根据本发明的重组抗体可以任选地包含亲和标签。亲和标签可用于纯化。示例性亲和标签包括多组氨酸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、壳多糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)、链霉亲和素结合肽(Strep-标签)、异肽键形成、FLAG-标签、V5-标签、Myc-标签、HA-标签、NE-标签、AviTag、钙调蛋白-标签、聚谷氨酸、S-标签、SBP-标签、Softag 1、Softag 3、TC标签、VSV-标签、Xpress标签、Isopeptag、SpyTag、SnoopTag、生物素羧基载体蛋白、绿色荧光蛋白标签、HaloTag、Nus标签以及硫氧还蛋白标签，不过亲和标签的选择不特别限制。然而，重组抗体可以缺少亲和标签，例如，如果亲和标签在使用之后被去除，或者如果重组抗体使用不需要亲和标签的策略纯化。示例性亲和标签是多组氨酸，其典型地包括包含4个和10个之间的连续组氨酸的氨基酸序列。优选的亲和标签是包含6个至10个之间的连续组氨酸的多组氨酸标签。示例性亲和标签对应于SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。
本发明的重组抗体可以任选地包含亲和标签，并且可以任选地使用所述亲和标签纯化。现有技术中有若干种纯化重组抗体的方法可用，并且技术人员熟知这些方法。包含或不包含亲和标签的重组抗体的示例性纯化方法是固定化金属亲和色谱法(IMAC)、蛋白质A/G亲和、交换色谱法(IEX或IEC)、疏水相互作用色谱法(HIC)和/或另外使用标签和除IMAC或蛋白质A/G之外的亲和色谱法技术。所使用的纯化方法和标签不应被认为是限制性的。
在优选的实施方案中，本发明的重组抗体还包含亲和标签。所述亲和标签可以选自由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25组成的组。
D.示例性重组抗体
在本文描述的一种实施方案中，重组抗体包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在本文描述的一种实施方案中，重组抗体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
在本文描述的优选的实施方案中，重组抗体包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列和选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
在本文描述的最优选的实施方案中，重组抗体包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列和SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
在另一种优选的实施方案中，重组抗体的轻链可以与由SEQ ID NO:17组成的氨基酸序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的同源性，并且重组抗体的重链可以与由SEQ ID NO:12组成的氨基酸序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的同源性。
在一种实施方案中，本发明的重组抗体与固体支持物结合。
在另一种实施方案中，本发明的重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少3倍。
III.核酸、克隆细胞和表达细胞
本发明还涉及包含编码本文描述的重组抗体的核苷酸序列的核酸。核酸可以是DNA或RNA。包含编码本文描述的重组抗体的核苷酸序列的DNA通常包含与该核苷酸序列可操作地连接的启动子。启动子优选地能够在感兴趣的表达细胞中驱动核苷酸序列的组成型或诱导型表达。所述核酸还可以包含可用于选择包含感兴趣的所述核酸的细胞的选择性标志物。有用的选择性标志物是技术人员熟知的。核酸的精确核苷酸序列不受特别限制，只要核苷酸序列编码本文描述的重组抗体。密码子可以选择为，例如，匹配感兴趣的表达细胞(例如，哺乳动物细胞，诸如人类细胞)的密码子偏好和/或为了克隆期间的方便。DNA可以是质粒，例如，质粒可以包含复制起点(例如，用于质粒在原核细胞中的复制)。
在本文描述的一种实施方案中，核酸包含编码本发明的重组抗体的核苷酸序列、可操作地连接至该核苷酸序列的启动子和选择性标志物。
本发明的多个方面还涉及包含核酸的细胞，该核酸包含编码如本文描述的重组抗体的核苷酸序列。细胞可以是表达细胞或克隆细胞。核酸通常在大肠杆菌(E.coli)中克隆，尽管可以使用其他克隆细胞。
如果细胞是表达细胞，则所述核酸任选地是染色体的核酸，即，其中核苷酸序列被整合到染色体中，尽管核酸可以例如作为染色体外DNA或载体(诸如质粒、粘粒、噬菌体等)存在于表达细胞中。载体的形式不应被认为是限制性的。
在本文描述的一种实施方案中，细胞通常是表达细胞。表达细胞的性质不特别限制。哺乳动物表达细胞可以允许重组抗体或寡聚重组抗体的有利折叠、翻译后修饰和/或分泌，尽管其他真核细胞或原核细胞也可以用作表达细胞。示例性表达细胞包括TunaCHO、ExpiCHO、Expi293、BHK、NS0、Sp2/0、COS、C127、HEK、HT-1080、PER.C6、HeLa和Jurkat细胞。细胞还可以针对载体的整合(更优选地针对质粒DNA的整合)进行选择。
本发明的重组抗体可以通过包含编码重组抗体的核苷酸序列的核酸向哺乳动物细胞中的适当转染策略来产生。技术人员知悉可用于将核酸转染到所选择的细胞系中的不同技术(脂质体转染、电穿孔等)。因此，哺乳动物细胞系和转染策略的选择不应被认为是限制性的。细胞系可以进一步针对质粒DNA的整合进行选择。
在本文描述的一种优选的实施方案中，细胞包含本发明的重组抗体。
IV.与测定相关的组合物和方法
本发明的多个方面涉及包含如本文描述的重组抗体的组合物。
在本文描述的一种实施方案中，组合物包含本发明的重组抗体和固体支持物。
在其他实施方案中，组合物包含本发明的重组抗体和固体支持物，其中重组抗体与固体支持物共价或非共价结合。如本文使用的术语“非共价结合”是指特异性结合，诸如在抗体和其抗原之间、配体和其受体之间、或者酶和其底物之间的特异性结合，例如由链霉亲和素结合蛋白和链霉亲和素之间或抗体和其抗原之间的相互作用例示。
在其他实施方案中，组合物包含本发明的重组抗体和固体支持物，其中重组抗体与固体支持物直接或间接结合。如本文使用的术语“直接”结合是指分子与固体支持物的直接缀合，例如，将重组抗体的半胱氨酸硫醇结合至金表面的金-硫醇相互作用。如本文使用的术语“间接”结合包括重组抗体与直接结合至固体支持物的另一分子的特异性结合，例如，重组抗体可以结合直接结合至固体支持物的抗体，从而将重组抗体间接结合至固体支持物。术语“间接”结合与重组抗体和固体支持物之间的分子数目无关，只要(a)分子的菊花链之间的每个相互作用是特异性或共价的相互作用，以及(b)菊花链的末端分子直接结合至固体支持物。
固体支持物可以包括颗粒、珠、膜、表面、多肽芯片、微量滴定板或色谱柱的固相。例如，固体支持物可以是胶乳珠。
组合物可以包含多于一个珠或颗粒，其中所述多于一个珠或颗粒中的每个珠或颗粒与至少一种如本文描述的重组抗体直接或间接结合。组合物可以包含多于一个珠或颗粒，其中所述多于一个珠或颗粒中的每个珠或颗粒与至少一种如本文描述的重组抗体共价或非共价结合。
实施方案的多个方面涉及用于检测样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的存在的试剂盒，所述试剂盒包括如本文描述的重组抗体和固体支持物或组合物。
本文描述的组合物和试剂盒可以用于测定或用于在测定进行期间产生的组合物。本发明的多个方面涉及包括如本文描述的组合物的诊断医学装置。
本发明的多个方面涉及测定。测定可以是用于测量本发明的重组抗体与样品中的D-二聚体、片段DD和/或片段D的相对结合亲和力(例如，相对于一个或更多个对照样品或标准)的测定。测定可以是用于测量本发明的重组抗体与任何纤维蛋白(纤维蛋白原)降解产物的相对结合亲和力(例如，相对于一个或更多个对照样品或标准)的测定。
测定通常以允许测量(诸如通过透射比浊法、散射比浊法、UV/Vis/IR光谱法(例如，吸收、发射)、荧光或磷光光谱法、或表面等离子体共振)，或者有助于将直接或间接结合固体支持物的组分与不直接或间接结合固体支持物的组分分离，或者两者的固体支持物为特征。例如，测定可以包括包含颗粒或珠的组合物，颗粒或珠允许通过透射比浊法或散射比浊法进行测量(例如，在凝血测定中)和/或有助于机械分离直接或间接结合颗粒或珠的组分。
可以包括本发明的重组抗体或组合物的其他示例性测定包括但不限于ELISA、粘弹性测试诸如Sonoclot、凝胶技术、荧光测定和使用这些技术中的任何一种的其他护理点测试。
本发明的多个方面涉及检测样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的存在的方法。
在本文描述的一种实施方案中，检测样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的存在的方法包括以下步骤：
a)使样品与至少一种本文描述的重组抗体在足以形成抗体/抗原复合物的条件下并持续一段时间接触，以及
b)检测所述抗体/抗原复合物。
本发明的多个方面涉及测量样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的结合亲和力的方法。
在本文描述的一种实施方案中，测量样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的结合亲和力的方法包括以下步骤：
a)使样品与至少一种本文描述的重组抗体在足以形成抗体/抗原复合物的条件下并持续一段时间接触，以及
b)确定抗体与样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D之间的结合亲和力。
本发明的多个方面涉及测量样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的浓度的方法。
在本文描述的一种实施方案中，测量样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的量的方法包括以下步骤：
a)使样品与至少一种本文描述的重组抗体在足以形成抗体/抗原复合物的条件下并持续一段时间接触，以及
b)测量样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的浓度。
范例
实施例1：免疫策略和单克隆抗体的选择
将雌性Balb/c小鼠用与0.1M的完全弗氏佐剂混合的0.2mL的盐水中的50μg经纯化的D-二聚体进行皮下初免(prime)。在融合之前第4天和第2天，将小鼠用相同量的盐水中的抗原进行腹膜内加强免疫(boost)。将P3X63-Ag8-6.5.3骨髓瘤细胞与来自经免疫的Balb/c小鼠的脾细胞融合。对细胞培养上清液筛选对于来自纤维蛋白原或非交联纤维蛋白的经纯化的片段D和D-二聚体特异性的抗体。产生对D-二聚体而不是纤维蛋白原特异性的抗体的克隆被用于在原始初免的Balb/c小鼠中产生腹水。通过在蛋白A琼脂糖凝胶上进行亲和色谱法从腹水中纯化单克隆抗体的IgG部分11,12。
实施例2：对选择的单克隆抗体进行从头MS/MS测序
对实施例1中选择的单克隆抗体进一步进行从头MS/MS测序。
简言之，经纯化的抗体首先通过完整质谱法确认。然后将每种mAb还原以分离重链(HC)和轻链(LC)，它们被一系列酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)单独地消化。收集自下而上的MS/MS数据，提供关于经消化的肽和关于b和y离子的信息，进一步识别肽内的个体氨基酸以便组装。然后对信息进行处理，并确定单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列。
总共确定了16种抗体的序列。下文公开了每种抗体的相应序列。
抗体 轻链 重链
#1 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:1
#2 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:2
#3 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:3
#4 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:4
#5 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:5
#6 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:6
#7 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:7
#8 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:8
#9 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:9
#10 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:10
#11 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:11
#12 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:12
#13 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:13
#14 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:14
#15 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:15
#16 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:16
实施例3：重组抗体的瞬时表达和纯化
进行包含HC和LC两者的多顺反子载体的单一转染或包含HC或LC的载体双重转染，以产生期望的抗体或抗原结合片段。使用利用来自脑心肌炎病毒(ECMV)的内部核糖体进入位点(IRES)序列的三顺反子载体。
对一组仅具有LC、仅具有HC、具有LC-IRES-HC和具有HC-IRES-LC的载体进行了比较，并且选择了期望的抗体的最高产生者。最高抗体产生者是LC-IRES-HC。此外，使用了多于一种信号肽来产生期望的抗体(序列表)。对于三顺反子载体，IL2信号肽被用于LC和HC两者。
在稳定细胞系开发期间，用三顺反子载体转染ExpiCHO细胞，并且使用G418和新霉素两者进行选择。使用两轮有限稀释克隆以分离克隆细胞系。对第二轮有限稀释克隆进行成像以支持克隆性。在稳定细胞系开发期间，评估细胞的生存力和期望的抗体的生产力。
感兴趣的重组抗体的纯化通过蛋白A或蛋白G纯化针对全长抗体来完成。对于缺少Fc区的抗体(Fab和F(ab’)2形式)，对HC添加了C端融合的His标签，从而允许IMAC纯化和随后的SEC精制(polishing)。
实施例4：产生的抗体的表征
SDS-PAGE
在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE验证每种重组抗体的产生(除了抗体#4(无蛋白质)和抗体#6(通过CE-SDS表征)之外)(图2)。
在所有情况下，在非还原条件下可以观察到完整的抗体，并且在还原条件下可以观察到相应的HC和LC。对于抗体#1-3观察到低产生，而对于抗体#4未显示出产生。
SEC-MALS
为了评估本发明的抗D-二聚体重组抗体的组装和聚集，使用尺寸排阻多角度光散射(SEC-MALS)。SEC-MALS提供了分子量并表征了多分散性(Mw/Mn)。在抗体的产生期间，发现经纯化的蛋白质是单分散的，具有1％-2％的差异。图3提供了抗体#9和抗体#12的实例数据。
对于抗D-二聚体抗体，使用了NHS和EDAC化学以将蛋白质缀合至胶乳珠。
生物层干涉测量法(BLI)
在BLI测试前，人类血浆来源的片段D、片段DD、片段E、纤维蛋白原、纤维蛋白原片段X和纤维蛋白原片段Y在机构内通过SDS-PAGE进行表征，并且如果存在可见污染物，则通过SEC(Superdex 200Increase10/300GL)进一步纯化。在所提及的片段中，有若干种是在机构内产生的，因为蛋白量太小而无法从污染物中进行SEC纯化，或者它们不是商业可得的。为了产生纤维蛋白原片段X、纤维蛋白原片段Y和纤维蛋白原片段D，将1mg量的经纯化的人类纤维蛋白原(Aniara)与2mM CaCl2、50mM Tris-HCl pH 7.4、100mM NaCl和0.055U/mL人类纤溶酶(HTI)一起孵育。温度设置为37℃，并以800RPM振荡7分钟。立即添加1000KIU/mL抑肽酶(Sigma)，并将样品置于-20℃，直到准备注射到SEC柱(Superdex 200Increase 10/300GL)上。在纯化的持续期间将收集的级分保持在低温。然后将选择的峰级分在SDS-PAGE上运行，并且根据对应于纤维蛋白原片段X、Y和D的MW进行汇集和浓缩。经纯化的人类血浆蛋白质的SDS-PAGE凝胶在图4中可见。
制备FDP并在4％-20％TGX标准无染色凝胶上运行，以检查品质和纯度，然后进行表征研究。
纯化之后，进行了一系列生物层干涉测量法(BLI)研究，以确定本发明的重组抗体的结合亲和力。
测试了重组抗体#12与来自纤维蛋白的片段DD、来自纤维蛋白原的片段D、片段E和纤维蛋白原的结合亲和力(在室温和室压)(图5)。结果显示，与来自纤维蛋白的片段DD和来自纤维蛋白原的片段D两者均存在结合，然而与片段DD的结合比与片段D的结合强两个数量级。从未对本领域已知的杂交瘤单克隆抗体报导这些结合特性，特别是抗体#12与片段DD和片段D的结合强度的差异12。
实施例5：胶乳珠凝集测定。
进行透射比浊法测量以评估本发明的重组抗体与胶乳珠通过标准程序(诸如EDAC和/或NHS化学)缀合之后的功能。
在所有情况下，在已知的D-二聚体测定HemosIL DDHS500和用抗体#6和抗体#5开发的测定之间存在线性相关，指示在POC测定期间，血浆中的D-二聚体通过本发明的抗体易于检测到。对抗体#6和抗体#5获得的结果(图6B和图6C)与现有技术中已知的抗D-二聚体(图6A)可比较。然而，对于IgG2a#5的胃蛋白酶消化的F(ab’)2显示出较好的相关(图6D)。
在图7中，可以观察到抗体#12和DDHS500 ACL之间显示出线性一致(linearagreement)的相关(图7A)，并且在Q SMART平台上抗体#12与现有技术的抗D-二聚体抗体显示出1:1一致。
因此，本发明提供了重组抗D-二聚体抗体，其功能已经通过传统的生物物理测量(BLI)和通过安装在胶乳上的测定两者进行了评估。结果令人惊讶地显示出，所述抗D-二聚体抗体不同于现有技术中已知的抗体，因为所述抗D-二聚体抗体的特异性、它们与片段DD和片段D的结合强度以及它们可以在哺乳动物细胞中容易地产生的事实，因此与来自杂交瘤细胞系的抗体相比，为胶乳测定的开发提供了若干优点，如先前所讨论的。
实施例6：表位分箱(Epitope Binning)研究
使用来自Sartorius的BLI Octet Red96e系统，将抗体#12与其他商业可得的抗D-二聚体抗体在与经纯化的纤维蛋白和纤维蛋白原片段的分箱研究和结合研究中进行了比较。实验在室温和室压进行。分箱研究是通过装载抗体#12，与片段DD结合，并且然后引入其他商业可得的mAb来进行的。响应是以干涉模式中的nm位移来测量的，并且与结合至生物传感器表面的分子数目成正比。在存在抗体#12的情况下，所选择的mAb显示出与片段DD的结合(参见表1，单位是在添加后位移的nm)，表明这些抗体与抗体#12识别不同的表位。
Figure BDA0003806171550000291
表1
使用来自Sartorius的BLI Octet Red96e系统，进行同一组mAb与纤维蛋白原、D-二聚体和经纯化的纤维蛋白和纤维蛋白原片段的结合研究(参见表2)。KD是通过将生物素化的抗体样品装载到链霉亲和素BLI尖端上并引入制备的片段的系列稀释物来测量的。KD：++++(10-11-10-12M)；+++(10-10M)；++(10-9M)；+(≥10-8M)。实验在室温和室压进行。
Grifols抗体#12与纤维蛋白原或来自纤维蛋白或纤维蛋白原的片段E未显示出结合，与纤维蛋白原片段X、Y和D显示出弱结合；与片段X和片段D显示出中度结合；并且与D-二聚体和片段DD显示出亚纳摩尔浓度的结合。相比之下，DCABY-4394与D-二聚体和片段DD显示出最强的结合，但也与纤维蛋白原显示出强结合。3B6不识别片段X，并且与D-二聚体和片段DD显示出较弱结合；NB110-8376较弱地识别纤维蛋白原片段X、Y，但不识别片段D；并且与抗体#12相比，DD225与纤维蛋白片段X和D显示出更弱的结合。
Figure BDA0003806171550000301
表2
序列表
与本发明的重组抗体相关的序列在下表3中概述。
Figure BDA0003806171550000302
Figure BDA0003806171550000311
Figure BDA0003806171550000321
Figure BDA0003806171550000331
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1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Trp Ile His Trp Leu Lys Gln Gly Pro His Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Leu Asp Pro Asp Asp Ser Glu Thr His Tyr Leu Glu Lys Phe
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Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
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Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
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Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
260 265 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
275 280 285
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290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
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Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
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340 345 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
355 360 365
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370 375 380
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<400> 15
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Ala Arg Thr Asn Trp Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
180 185 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
210 215 220
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val His His His His His His Lys
225 230 235
<210> 16
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Leu Lys Gln Gly Pro His Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Leu Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Asn Trp Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
180 185 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
210 215 220
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val His His His His His His Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Lys
<210> 17
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu
145 150 155 160
Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr
180 185 190
Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr
195 200 205
Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215 220
<210> 18
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Leu Lys Gln Gly Pro His Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Leu Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Asn Trp Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Leu Lys Gln Gly Pro His Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Leu Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Asn Trp Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Ala Ser Ala
115
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Leu Lys Gln Gly Pro His Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Leu Asp Pro Asp Asp Ser Glu Thr His Tyr Leu Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Glu Leu Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Asn Trp Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 22
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Leu Lys Gln Gly Pro His Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Leu Asp Pro Asp Asp Ser Glu Thr His Tyr Leu Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Glu Leu Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Asn Trp Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Ala Ser Ala
115
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
His His His His His His His His
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
His His His His His His Lys
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
His His His His His His Gly Ser Gly Gly Lys
1 5 10
<210> 26
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Ala Ser
20 25
<210> 27
<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 28
<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 29
<211> 24
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<220>
<223> 合成肽
<400> 29
Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly
20
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Gln Gln His Tyr Arg Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Ser Tyr Trp Ile His
1 5
<210> 35
<211> 6
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<220>
<223> 合成肽
<400> 35
Asp Pro Asp Asp Ser Glu
1 5
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<211> 9
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<220>
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<400> 36
Thr Asn Trp Asp Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5
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<211> 17
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<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Arg Ile Asp Pro Asp Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
Arg Leu Asp Pro Asp Asp Ser Glu Thr His Tyr Leu Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly

Claims (38)

1.一种抗D-二聚体重组抗体，特征在于其与纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)D-二聚体、片段DD和片段D特异性地结合，并且不与片段E和纤维蛋白原结合。
2.根据权利要求1所述的重组抗体，其中所述重组抗体包括包含互补决定区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链，所述互补决定区中的每一个包含选自SEQ ID NO:18的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸的序列。
3.根据权利要求2所述的重组抗体，其中所述选自SEQ ID NO:18的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸包括SEQ ID NO:18的氨基酸24至34、或50至56或89至97中的至少一个。
4.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述轻链的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3分别包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述重组抗体包括包含互补决定区H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链，所述互补决定区中的每一个包含选自SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸的序列。
7.根据权利要求6所述的重组抗体，其中所述选自SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸包括SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸31至35、或50至65或95至102中的至少一个。
8.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述重链的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别包含SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述重链的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别包含SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的重组抗体，其中所述重链的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3分别包含SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，包含：
轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:32的氨基酸序列(L-CDR2)；和SEQ ID NO:33的氨基酸序列(L-CDR3)；以及
重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:35的氨基酸序列(H-CDR2)；和SEQ ID NO:36的氨基酸序列(H-CDR3)。
13.根据权利要求12所述的重组抗体，其中所述H-CDR2的氨基酸序列还包括选自由SEQID NO:36和SEQ ID NO:37组成的组的序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，包含：
轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:18至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％相同的氨基酸序列，以及
重链可变区，所述重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:19、20、21和22组成的组的序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％相同的氨基酸序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，包含：
轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，以及
重链可变区，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:19、20、21和22组成的组的氨基酸序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，包含：
轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，以及
重链可变区，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:19和20组成的组的氨基酸序列。
17.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述重组抗体是单克隆抗体或抗体片段。
18.根据权利要求17所述的重组抗体，其中所述抗体片段选自可变片段(Fv)、单链Fv(scFv)、双特异性抗体(sc(Fv)2)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、二硫化物连接的Fv(dsFv)、化学缀合的Fv(ccFv)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、亲和体、纳米抗体和单抗体。
19.根据权利要求17所述的重组抗体，其中所述抗体片段是选自Fab片段和F(ab’)2片段的抗原结合片段。
20.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述重组抗体包含鼠IgG1类或鼠IgG2a类的恒定区。
21.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，还包含亲和标签。
22.根据权利要求21所述的重组抗体，其中所述亲和标签的氨基酸序列选自由SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25组成的组。
23.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述重组抗体的轻链包含SEQID NO:17的氨基酸序列。
24.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述重组抗体的重链包含SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
25.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述重组抗体的轻链包含SEQID NO:17的氨基酸序列，并且所述重组抗体的重链包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
26.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述重组抗体包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列和SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
27.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述抗体与固体支持物结合。
28.根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体，其中所述重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少3倍，或
所述重组抗体与片段DD的结合亲和力比所述重组抗体与片段D的结合亲和力强至少1个数量级。
29.一种细胞，包含根据前述权利要求中任一项所述的重组抗体。
30.一种核酸，包含编码根据权利要求1至26或28中任一项所述的重组抗体的核苷酸序列、可操作地连接至所述核苷酸序列的启动子和选择性标志物。
31.一种细胞，包含权利要求30所述的核酸。
32.一种组合物，包含权利要求1至26或28中任一项所述的重组抗体和固体支持物，其中所述重组抗体与所述固体支持物共价或非共价结合。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述固体支持物包括颗粒、珠、膜、表面、多肽芯片、微量滴定板或色谱柱的固相。
34.根据权利要求32所述的组合物，其中所述固体支持物是胶乳颗粒。
35.一种用于检测样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的存在的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据权利要求1至26或28中任一项所述的重组抗体和固体支持物，其中所述至少一种重组抗体与固体支持物共价或非共价结合。
36.一种检测样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的存在的方法，所述方法包括：
使所述样品与至少一种根据权利要求1至26或28中任一项所述的重组抗体在足以形成抗体/抗原复合物的条件下并持续一段时间接触，以及
检测所述抗体/抗原复合物。
37.一种测量样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的结合亲和力的方法，所述方法包括：
使所述样品与至少一种根据权利要求1至26或28中任一项所述的重组抗体在足以形成抗体/抗原复合物的条件下并持续一段时间接触，以及
确定所述抗体与所述样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D之间的结合亲和力。
38.一种测量样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的浓度的方法，所述方法包括：
使所述样品与至少一种根据权利要求1至26或28中任一项所述的重组抗体在足以形成抗体/抗原复合物的条件下并持续一段时间接触，以及
测量所述样品中D-二聚体、片段DD和/或片段D的浓度。
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