CN113249335B

CN113249335B - 分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Info

Publication number: CN113249335B
Application number: CN202110647263.1A
Authority: CN
Inventors: 张玉基; 叶生宝; 王鹏
Original assignee: Nanjing Liding Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Liding Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2021-06-10
Filing date: 2021-06-10
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2041-06-10
Also published as: CN113249335A

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，尤其是一种分泌抗Aβ1‑42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，其中，杂交瘤细胞株Aβ1‑42的微生物保藏编号为CCTCC NO：C2021123；所述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体为Anti‑Aβ1‑42‑1和Anti‑Aβ1‑42‑2。单克隆抗体为Anti‑Aβ1‑42‑1和Anti‑Aβ1‑42‑2作为检测抗体，能够用于人血清中Aβ1‑42蛋白含量检测。

Description

分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体领域为一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及单克隆抗体。

背景技术

目前，阿尔茨海默病（AD）是起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，为德国医生阿尔茨海默最先发现的一种脑神经疾病。它的主要症状有两个：（1）β-淀粉样蛋白在神经元细胞外异常沉积形成的老年斑；（2）tau蛋白的异常磷酸化所形成的NFTs（神经元纤维缠结），严重影响患者的生活与社交功能，严重影响患者及至亲的生活质量。

AD的病因及发病机制尚未明了，特征性病理改变为β-淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及小胶质细胞增生性神经炎和神经元丢失。这些主要的病理改变目前仍然是AD神经病理学诊断的标准。

目前，全球有超过5000多万的人患有痴呆。国际工作组（IWG）及美国国家老龄问题研究所修订了新的IWG诊断标准，即IWG-2诊断标准，发表于《Lancet Neurology》杂志上，这是目前为止最新的AD诊断标准。IWG-2诊断标准首次将 AD生物标志物分为诊断标志物和进展标志物。脑脊液β-淀粉样蛋白和Tau、淀粉样蛋白正电子发射型计算机断层显像（positron emission tomography，PET）和AD致病基因携带为AD的诊断标志物。然而，CSF和PET检查过于“高大上”，很难在大众群体中被普及，也很难被大众所接受。因此，寻找更加“接地气”的检测方法至关重要。血清中的Aβ蛋白和tau蛋白可以作为AD临床实验室诊断的生物标志物。β 淀粉样蛋白( amyloid-β，Aβ) 是由淀粉样前体蛋白( amyloid precursorprotein，APP) 经 β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39～43个氨基酸的多肽。

中国专利CN111334480A提供了一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，其中具体公开了一种Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法：

小鼠免疫：用Aβ1-42多肽偶联蛋白免疫BALB/c小鼠，每只小鼠每次免疫50ug抗原。首次免疫Aβ1-42多肽抗原与弗氏完全佐剂1：1混合，随后Aβ1-42多肽与弗式不完全佐剂1：1混合，每个两周免疫一次，共免疫3次，第三次免疫十天后断尾采血，检测血清效价。

杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:10000后用Aβ1-42多肽偶联蛋白(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合在 50mL离心管，然后加入1mL预热PEG作用45s后，立即缓慢滴加37℃预热的无血清DMEM培养基至35mL，42℃水浴15min，1000rpm/mim离心10min弃上清，加50mL预热HAT 培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μL，置培养箱中培养。采用Aβ1-42多肽鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞4株，分别为2A8、3F6、4E7和4F7，并鉴定抗体亚型，结果显示2A8和4E7为IgG2a，3F6和4F7为IgG2b。

但是，该方案中免疫蛋白Aβ1-42为人工合成，只有一级结构，无天然构象（即蛋白质的高级结构）。在后期开发诊断试剂盒当中，同时具备特异性强、亲和力高非常关键，无论检测血清中的Aβ1-42还是脑脊液中的Aβ1-42蛋白，都是以天然构象存在的。仅有一级结构，在筛选出的单克隆中特异性相对较低。

该专利中虽然进行了30例临床试验，显示其具有一定的特异性，但众所周知，在检测试剂盒开发当中干扰因素很多，随地域、人种不同，所带来的检测干扰非常大。在开发试剂盒当中都有校准品和质控品，人工合成蛋白既增大了成本，产量也不高，并且后期再重组表达Aβ1-42蛋白，极有可能导致与其获得的单克隆抗体不匹配。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株Aβ1-42，其微生物保藏编号为CCTCC NO：C2021123。保藏日期为2021年5月18日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

本发明所述的杂交瘤细胞株在制备诊断、预防或治疗阿尔茨海默病的试剂或药物中的应用。

本发明所述的杂交瘤细胞株在制备人血清中Aβ1-42蛋白含量检测试剂中的应用。

本发明所述的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体Anti-Aβ1-42-1和Anti-Aβ1-42-2，抗体的可变区核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11所示，对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12所示。

本发明所述的单克隆抗体Anti-Aβ1-42-1、Anti-Aβ1-42-2在制备诊断、预防或治疗阿尔茨海默病的试剂或药物中的应用。

本发明所述的单克隆抗体Anti-Aβ1-42-1、Anti-Aβ1-42-2在制备人血清中Aβ1-42蛋白含量检测试剂中的应用。

一种用于人血清中Aβ1-42蛋白含量检测的化学发光试剂盒，其检测抗体为上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体Anti-Aβ1-42-1和Anti-Aβ1-42-2。

本发明所述的用于人血清中Aβ1-42蛋白含量检测的化学发光试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记Anti-Aβ1-42-1的抗体溶液、包被Anti-Aβ1-42-2抗体的酶标板、浓缩洗液、发光底物液和校准品。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本申请所采用的Aβ1-42蛋白是用Sf9昆虫表达系统表达的，并且进行了密码子优化，与CN111334480A相比，本发明表达的Aβ1-42蛋白具有较为完整的天然构象，从而在免疫筛选过程中能够筛选出特异性更强的抗体Anti-Aβ1-42-1、Anti-Aβ1-42-2，进而开发的检测试剂盒不会随地域、人种不同而带来检测干扰，更加大众化，可以满足不同的市场的需求。而且，本申请的试剂盒当中有匹配的校准品，产量高，成本低。

附图说明

图1为目的基因的扩增；其中，A为第一轮扩增，B为第二轮扩增，C为第三轮扩增，D为第四轮扩增；

图2为菌落PCR鉴定；

图3为转染重组Aβ1-42-Bacmid至Sf9细胞中P1，P2代细胞特征图；

图4为Aβ1-42蛋白纯化结果；

图5为细胞生长情况的照片；

图6为筛选配对Aβ1-42单克隆抗体在化学发光检测中的相关性曲线；

图7为试剂盒的定标曲线；

图8为线性相关曲线；

图9为实验组试剂盒测试浓度与对照组试剂盒测试浓度的相关性分析曲线；其中，实验组为本发明制备的Aβ1-42化学发光检测试剂盒，对照组为深圳安群生物工程有限公司的Aβ1-42检测试剂盒（酶联免疫）。

生物保藏说明

杂交瘤细胞株Aβ1-42保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏机构简称：CCTCC，保藏日期为2021年5月18日，生物保藏编号为CCTCC NO：C2021123，命名：杂交瘤细胞株Aβ1-42。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 Aβ1-42基因的克隆及表达载体的构建

以生工合成Aβ1-42质粒为模板，扩增Aβ1-42片段，如图1所示，通过同源重组构建Aβ1-42-pFastBac重组表达载体，先经菌落PCR鉴定成功如图2所示，再测序成功后转化DH10Bac中，随后蓝白斑筛选中选出白斑保存甘油菌备用。其中在目的基因Aβ1-42前加分泌信号肽gp67，同源重组位点为BamHⅠ，HindⅢ；引物序列见下表1：

表1

Aβ1-42核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；Aβ1-42氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；分泌信号肽gp67序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例2 Aβ1-42蛋白的表达与纯化

一、重组Bacmid提取：

1）溶液Ⅰ配制：15mM Tris-Hcl（pH8.0）+10Mm EDTA+0.1mg/mL RNase+50mM葡萄糖；

溶液Ⅰ-A液（60mM Tris-Hcl，4×）：0.7266g Tris（Coolaber，CT-11411）至70mLddH₂O中，浓盐酸调pH至8.0后用ddH₂O定容至100mL，0.22μm过滤器过滤；

溶液Ⅰ-B液（40mM EDTA，4×）：1.48896g EDTA×2H₂O（BioFroxx）至80mL ddH₂O中溶解后用ddH₂O定容至100mL，0.22μm过滤器过滤；

葡萄糖溶液（200mM，4×）：3.9634g葡萄糖至80mL ddH₂O中溶解后用ddH₂O定容至100mL，0.22μm过滤器过滤。

2）溶液Ⅱ配制：0.2M NaOH+2% SDS；（现配现用）

溶液Ⅱ-A液（0.4M NaOH，2×）：2.4g NaOH溶解至120mL ddH₂O中后用ddH₂O定容至150mL，0.22μm过滤器过滤；

溶液Ⅱ-B液（4% SDS，2×）：3g SDS溶解至120mL ddH₂O中后用ddH₂O定容至150mL，0.22μm过滤器过滤；

3）溶液Ⅲ：3M KAc（pH5.5）；

29.442g KAc溶解在70mL ddH₂O中后用冰醋酸调pH至5.5，用ddH₂O定容至100mL，0.22μm过滤器过滤。

4）溶液Ⅳ：3M NaAc（pH5.2）；

12.3g KAc溶解在30mL ddH₂O中后用冰醋酸调pH至5.2，用ddH₂O定容至50mL，0.22μm过滤器过滤。

5）溶液Ⅴ：70%酒精；

70mL无水乙醇加入30mL ddH₂O。

二、Aβ1-42-Bacmid提取：

将保存的重组的Aβ1-42-Bacmid活化后放大培养（10ml菌液），当菌液浓度OD值达到0.6-0.8时，收集菌液，以12000rpm 1min离心至两个1.5mL离心管，弃上清后加入300μL溶液Ⅰ进行重悬；加入300μL溶液Ⅱ，轻轻颠倒混匀数次至菌液变透明；快速加入300μL溶液Ⅲ，轻轻颠倒混匀至大量白色絮状沉淀出现；12000rpm离心10min，慢速吸取全部上清至15mL无菌离心管中（约1.6mL，尽量不要吸取到白色沉淀），分别加入3.2mL无水乙醇与80μL 3MNaAc（pH5.2），轻轻颠倒混匀后在-20℃过夜沉淀。将沉淀样品以4000rpm水平离心5min，弃上清；在无菌操作台中，5mL 70%酒精轻轻悬浮沉淀，4000rpm水平离心5min，弃上清；重复3次；无菌操作台中倒置离心管与吸水纸上，待管底酒精和水挥发完后用50μL灭菌水溶解沉淀，溶解好的溶液即为提取好的重组Bacmid；取2μL重组Bacmid用于浓度和纯度测定，加入50μL灭菌水将其稀释至约2μg/μL。

三、转染重组Bacmid至Sf9细胞：

取生长对数期，细胞存活率高于95%且细胞密度为300万个/mL Sf9细胞适量用于转染。将用于转染的细胞用培养基稀释至40万个/mL密度，在培养瓶中贴壁至少30min，贴壁完成后将旧培养基换为新鲜培养基即可用于转染。

1）混匀转染试剂，8μL转染试剂稀释于100μL不含添加剂细胞培养基，短暂涡流混匀；

2）3μg各Bacmid稀释于100μL不含添加剂细胞培养基，轻轻混匀；

3）分别混合各稀释后Bacmid与稀释后转染试剂，轻轻混匀，室温孵育20min；

4）分点加入DNA-脂质体混合物，28℃孵育细胞4h（3~5h）；

5）吸出转染混合物，加入新鲜培养基；

6）28℃培养至观察到病毒感染征象，感染征象明显后（图3）的细胞培养上清即为P1杆状病毒液。获取病毒液后可短暂避光保存于4℃，长期不用则避光冻存与-80℃。

准备20mL细胞状态好，传代次数少（5-20代）、细胞密度为200万个/mL且存活率高于95%的Sf9悬浮细胞，以1：10接种P1病毒液。悬浮培养至50~60%细胞死亡时收集病毒液，此病毒液即为P2病毒液，以同样方式扩增P3、P4、P5病毒液。

将细胞培养至P2代时开始检测蛋白表达情况，结果表明Aβ1-42在P2开始表达，连续监测到P5，收集P4所有表达上清进行纯化，如图4所示：

1.将P4代细胞培养液10000r/min离心20min，收集上清，用0.1M NaOH调PH之8.0后用0.45um孔径的膜过滤。

2.填料：在20*20mm的层析柱中填10纯化介质（NI-柱层析）。

3.层析柱平衡（NI-柱层析）：用50ml的Lysis Buffer 平衡层析柱。

4.孵育结合：将过滤后的上清过层析柱子，流速1ml/min。

5.洗涤：用100ml Washing Buffer洗涤层析柱，流速1ml/min。

6.洗脱：用25ml Elution Buffer洗涤层析柱，流速1ml/min。

7.洗涤：用20ml 0.5 M NaOH 洗涤层析柱，流速1ml/min。

8.洗涤：用100ml dd H₂O 洗涤层析柱，流速1ml/min。

保存：用500ml 25% 乙醇洗涤并保存层析柱，流速1ml/min。

实施例3 动物免疫

取雌性6周龄的BALB/c小鼠，免疫用上述50ug的Aβ1-42重组蛋白，需加福氏佐剂充分乳化，经腹腔注射，总量0.2mL；每隔2周以同样的方法免疫1次，共免疫3次，末次免疫后的第8天，从经三次免疫后的小鼠的眼球采血，离心分离血清，用ELISA法选出效价高的小鼠：用CB包被液稀释Aβ1-42蛋白至2 ug /mL，以每孔100 μL加入到酶标板孔中，4℃过夜包被。拍干，每孔加入200 μL封闭液（含1% BSA 的PBS），于37 ℃封闭2小时，拍干。将收集的血清按梯度稀释（1：300、1：900、1：2700、1：8100、1：24 300、1：72 900、1：218 700、1：656 100）后加入100 μL至酶标板孔中。常温孵育1小时后洗板3次，洗液为PBST（含0.05 %吐温20的PBS），拍干。用含1% BSA的PBST将羊抗鼠二抗（HRP标记）稀释成5 000倍，每孔加100 μL，常温孵育1小时，洗板4次并拍干。每孔加入100 μL TMB显色液反应10分钟。每孔加50 μL的终止液，在酶标仪上测OD450 nm，并记录数据。

实施例4 杂交瘤细胞株的制备

一、免疫脾细胞的制备：

1．取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75%酒精中浸泡5-10min消毒。

2．将消毒好的老鼠固定于解剖板上，前肢固定，后肢固定，用镊子夹住下腹部皮肤，剪一小口，撕开皮露出腹膜，换一套镊子和剪刀，剪开腹膜，暴露出脾脏，再换一套器械，用镊子夹住脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织，剪破脾脏外膜（可以将脾脏少许剪几下，便于脾细胞的分离），放入灭菌的匀浆器中。

3．加5ml 1640基础液于匀浆器中，研磨(不要太剧烈，以免损伤脾细胞，可选用比较松的匀浆器)，挤压出脾细胞，取出匀浆棒，补加10ml 1640基础液，静置2min，吸取上层细胞悬液于另一无菌的50ml离心管，再补加10ml 1640液于匀浆器中，同上重复2次（在重悬的过程中，第一次应只吸出5ml，因为第一次匀浆器里面的细胞和大的组织块比较多，细胞下沉的速度比较；

4．1000r/min离心10min去上清，细胞重悬后计数。

二、饲养细胞的制备：

1．取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清；

2．四肢固定后，先撕开皮，露出腹膜，在腹膜上剪一小口，然后用吸管3ml 1640基础液注入小鼠腹腔，吸打几次，再将液体吸出放于一50ml离心管，再重复一次，此为腹腔巨噬细胞；

3．同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中；

4．1000r/min离心10min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃，5%CO₂培养箱中待用。

三、细胞融合：

1．将1-2*10⁷个SP2/0与10⁸个免疫细胞(1:10-1:15)于50ml离心管中混匀，1000r/min，离心8min；

2．倒空上清（用灭菌的滤纸吸干），轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动（便于PEG充分的作用细胞）；

3．将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50%PEG 0.8ml(sigma)，边加边轻轻用吸管尖搅拌；

4．继续搅拌30s，静置30s；

5．然后慢慢加入37℃预温的1640基础液10ml。具体方法为：第一分钟逐滴滴入1ml。第二分钟加lml，第3min加3ml，第5min加其余的5ml，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入30ml 1640液，也需慢慢加入；

6．1000r/min离心5min，去上清于37℃放置5min；

7．用悬浮饲养脾细胞的HAT培养基与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约250ul/孔。一次融合可接种4块96孔板。

8．于37℃，5%CO₂培养箱中培养。

9．融合后第二天开始观察，有无污染，第4天吸去100ul培养基换HT培养基100ul。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测，选择抗体滴度高的杂交瘤细胞进行克隆（抗体滴度取100ul培养基进行检测，一般用TMB法检测OD值大于0.8均可进行单克隆）。

抗体检测方法及流程：

1.包被：用碳酸缓冲液（PH9.5）将上述纯化的Aβ1-42重组蛋白稀释到2μg/ml，以每孔100μl加入到酶标板孔中，4℃包被过夜。

2.封闭：将酶标板拍干，每孔加入200μl封闭液（含1%BSA 的PBS），于37℃封闭1.5-2h，拍干。

3.加抗体：将96孔培养板中的培养基每孔各取50-100ul加入酶标板孔中，37℃孵育1h后洗板3次，洗液为0.05%的PBST（1L PBS中加入0.5ml Tween-20），拍干。

4.加二抗（羊抗鼠-HRP）：用含1%BSA的洗液将羊抗鼠-HRP稀释成5000倍的工作液，每孔加100μl，37℃孵育1h，洗板4次并拍干。

5.显色：将TMB显色液恢复至室温，，每孔加入100μl。37℃孵育10min。

6.终止：往酶标板也中加入终止液（0.5M H₂SO₄），每孔加50μl。

7.读数：在酶标仪上用450nm读取OD值。结果如下表2所示：

表2

将上述OD值大于0.8的对应细胞继续按上述方法克隆。

实施例5 Aβ1-42单克隆抗体的制备及配对筛选

一、Aβ1-42单克隆抗体的制备

1．克隆前制备小鼠饲养细胞层。

2．将上述OD值大于0.8的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数。

3．将上述细胞用完全培养基稀释到5、10、50个细胞/毫升。

4．将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的孔培养，100ul/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和5个细胞。

5．培养到第4天补液一滴培养基，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。

6．特异性抗体的检测：在克隆后第7~9天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测（检测方法同上）。检测结果如下表3：

表3

选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的8个孔的细胞，扩大培养，直到该杂交瘤细胞株很纯后就可扩大培养。如图5所示。纯化采用汇研生物纯化试剂盒（Protein GFocurose 4FF）。

上述8个阳性孔的的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠采制腹水制备单克隆抗体。

二、Aβ1-42单克隆抗体的配对筛选

在筛选出的上述单克隆中按组合排列的方式进行筛选配对抗体：分别为包被抗体Aβ1-42-1；包被抗体Aβ1-42-2；包被抗体Aβ1-42-3；包被抗体Aβ1-42-4；标记抗体Aβ1-42-1；标记抗体Aβ1-42-2；标记抗体Aβ1-42-3；标记抗体Aβ1-42-4。

用双抗夹心法筛选出了亲和力较高的一对单克隆抗体Anti-Aβ1-42-1、Anti-Aβ1-42-2（即上文中的Aβ1-42-1、Aβ1-42-2），两个抗体的可变区核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11所示，对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12所示。

包被：用CB将包被抗体稀释到2μg/ml，以每孔100μl加入到酶标板孔中，4℃包被过夜。

封闭：将酶标板拍干，每孔加入200μl封闭液（含1%BSA的PBS），于37℃封闭1-2h，拍干。

加抗原：将重组Aβ1-42蛋白按梯度稀释成（160，80，40，20，10，5，0pg/ml），加入100μl至酶标板孔中，设置复孔及空白对照。37℃孵育1h后洗板3次，洗液为0.05%的PBST（1LPBS中加入0.5ml Tween-20），拍干。

加标记抗体：用含1%BSA的洗液将标记抗体稀释成1000倍的工作液，每孔加100μl，37℃孵育1h，洗板4次并拍干。

显色：将发光液A和发光液B恢复至室温，以1:1混合成工作液，每孔加入100μl。37℃孵育10min。

读数：在化学发光检测仪上读取发光值。筛选配对Aβ1-42单克隆抗体在化学发光检测中的相关性曲线如图6所示。

发光底物液A的配制：

（1）称取硼砂11.44g、硼酸4.948g、鲁米诺2.0g 和对碘苯酚0.2mg 于1L 烧杯中；

（2）用量筒量取纯化水于1L 烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH，控制其范围在7.95-8.05 之间；

（3）用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得；

发光底物液B的配制：

（1）称取硼砂11.44g、硼酸4 .948g、过氧化脲0 .2g 和PC300 500μl 于1L 烧杯中；

（2）用量筒量取纯化水于1L 烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调 pH 控制其范围在7.95-8.05 之间；

（3）用0.2μm 滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。

实施例6 Aβ1-42化学发光检测试剂盒

Aβ1-42化学发光检测试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记Anti-Aβ1-42-1的抗体溶液、包被Anti-Aβ1-42-2抗体的酶标板、浓缩洗液、发光底物液和校准品。

辣辣根过氧化物酶标记Anti-Aβ1-42-1的抗体溶液的制备：取0.5mg 辣根过氧化物酶（HRP）溶于0.25ml的蒸馏水中，再加入0.1ml NaIO4（0.06M/L）溶液，混匀后置于4℃避光条件下30min，溶液呈黄绿色；加入0.1ml 乙二醇溶液，室温避光条件下轻微搅拌30min；加入0.5mg的Anti-Aβ1-42-1抗体（浓度调为3mg/ml），混合均匀后装入透析袋中（mw=3500-14000），置于CB溶液（pH=9.5的碳酸缓冲液）中避光条件下透析6h；从透析袋中取出反应液0.45ml，加入25ul NaBH₄（4mg/ml）溶液，混匀置于4℃避光条件下2h；缓慢加入0.45ml的饱和硫酸铵溶液，混匀并置于4℃避光条件下30min，然后10000rpm离心10min，取沉淀；将沉淀溶于100ul的0.1M PBS（pH=7.4）中，将其置于0.1M PBS中平衡12h，期间换液2次，每次约500ml的PBS。取出溶液并测量体积，加入等体积的甘油，充分混匀后保存于-20℃。

包被Anti-Aβ1-42-2抗体的酶标板的配制：配制0.01M的碳酸缓冲液，调节pH至pH9.6±0.1，备用；在上述0.01M的碳酸缓冲液中加入Anti-Aβ1-42-2抗体至终浓度为2ug/ml，搅拌30分钟至混合均匀；将上述混匀后的溶液按包被量为100μL每孔加入酶标板中，采用恒温包被，包被温度为37±1℃，包被时间为1小时，包被后用力甩板将包被液完全甩掉；

配制0.1M pH 7.4 PBS缓冲液，含1% BSA（质量比），0.1%（体积比）羊血清，0 .1%Proclin300（体积比），1%（质量比）鱼皮明胶，10%（质量比）蔗糖，作为封闭液加入到清洗后的包被板中，封闭量为200uL每孔，封闭温度为37±1℃，封闭时间为1.5小时；吸掉封闭液，放置在干燥箱中，干燥温度控制在37±1℃，干燥时间为0.5小时，再真空包装，贴签备用。

浓缩洗液的制备：称取6.00g KH₂PO₄，90.75g Na₂HPO₄，5.00g KCl，200.00g NaCl，于1L 容器中；称取20.0g Tween-20于100ml容器中加50ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；调pH，控制其范围在7.35～7.45 之间后定容至1000ml，完全溶解后用0.2um 滤器过滤即得。

发光底物液的配制：发光液同上。

校准品的配制：用重组表达的蛋白Aβ1-42将浓度配置成0，75，150，300，600，1200pg/ml。

检测方法：

（1）将配制的校准品及待测样本按照顺序加入包被Anti-Aβ1-42-2抗体的酶标板，为了保证实验的稳定性，每个浓度加两个孔，校准品及待测样本每孔各加入100 uL。用膜封闭微孔反应板，置于37℃环境孵育1h。其中校准品浓度分别为0，10，20，40，80，160 pg/ml；

（2）洗板：洗涤液注满各孔，静置10s，甩净孔里的液体，在吸水纸上拍干，如此反复进行3次，其中洗涤液为采用去离子水对洗涤液按体积比为1:25进行稀释。

（3）酶标记物：每孔加入100uL辣根过氧化物酶标记的Anti-Aβ1-42-1抗体溶液，加完以后，置于37℃环境孵育1h。

（4）洗板：同步骤（2）。

（5）检测：每孔加入100uL(其中A液：B液=1：1提前混合)发光底物，在5min内用化学发光仪器测量各孔的发光强度值。

图7为该试剂盒的定标曲线。

线性范围：将低值校准品75pg/mL（L）与1200pg/mL（H）的高浓度校准品，分别制成（5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、L+4H、5H）共6个不同的稀释浓度样本。使用制备的试剂分别对这些样本进行测试，每个稀释浓度测试3次，求出每个稀释浓度检测结果的均值。测量结果以稀释浓度为自变量，以检测结果均值为因变量求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数（r）。

精密度：在重复性条件下，测试（150±30）pg/mL、（600±120）pg/mL，用同一批号试剂盒，重复测定至少10次（n≥10），计算变异系数CV。

结果显示：线性相关曲线如图8所示，线性回归方程为y＝1.1262x-41.489，R2＝0.9993，说明线性关系良好。

精密度如表4所示，变异系数CV（150pg/mL）=2.3%，CV（600pg/mL）=2.1%，计算结果满足重复性能要求。

表4

该Aβ1-42化学发光检测试剂盒用于阿尔兹海默症诊断：随机选取医院50粒临床血清样本（包含15粒阿尔兹海默症患者），以本发明制备的Aβ1-42化学发光检测试剂盒为实验组，以深圳安群生物工程有限公司的产品Aβ1-42检测试剂盒（酶联免疫）为对照组，将实验组试剂盒与对照组试剂盒进行相关性分析（如图9所示），相关很好，R2 可达到 0.9366，结果表明本发明的Aβ1-42化学发光检测试剂盒能够用于临床检测阿尔兹海默症的诊断。

通过上述结果可以看出，本发明的杂交瘤细胞株及其分泌的Aβ1-42单克隆抗体特异性强，亲和力高，在适用于辅助检测阿尔兹海默症的诊断具有较好的效果，试剂盒的线性范围、稳定性、精密度都能满足检测试剂盒相关性能要求。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 南京立顶医疗科技有限公司

<120> 分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 126

<212> DNA

<213> Aβ1-42核苷酸序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt 60

gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc 120

atagcg 126

<210> 2

<211> 42

<212> PRT

<213> Aβ1-42氨基酸序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210> 3

<211> 117

<212> DNA

<213> 分泌gp67信号肽(Artificial Sequence)

<400> 3

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta 60

agcgctattc ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcg 117

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> gp67-1F(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaccatcg ggcgcggatc caccatgatg ctactagtaa atcagtcaca ccaaggc 57

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> gp67-2F(Artificial Sequence)

<400> 5

aatcagtcac accaaggctt caataaggaa cacacaagca agatggtaag cgctattct 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> gp67-3F(Artificial Sequence)

<400> 6

caagatggta agcgctattc ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcct 59

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> Aβ1-42-F(Artificial Sequence)

<400> 7

cggcggcgca ttctgcctga tgcagaattc cga 33

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> Aβ1-42-R(Artificial Sequence)

<400> 8

cagctcttca tgatcaagct tttaatggtg atggtgatga tgcgctatga caacaccg 58

<210> 9

<211> 990

<212> DNA

<213> Anti-Aβ1-42-1(Artificial Sequence)

<400> 9

gcggtgaagc cggtggagag cggaggcggc ctggtgacgc ccggcggcag ccagaagcag 60

agctgcgccg ccagcgcctt caccttcagc agcttcggca tgcgctgggt gaggcaggcc 120

cccgagaagg gcctggagtg ggtggccatg acctggtacg tcggcaccaa gaagtcctac 180

atcgacagcg tgaagggcag gttcacaatc aacaggcaca acgccaagag caccccgttc 240

ctgaagatga ccagcctgag gagcgacgac accgacatgt actactgcgc cagggccagg 300

ggcatcgaca ccaggcacgg cccctacttc atggacgtgt ggggccaggg caccagcgtg 360

accgtgagca gcgacatcca gatgaaccag agccccagca gcctgagcgc cagcctgggc 420

gacaccatca ccatcacctg ccacgccagg cacaacgtga ggagctacct gaactggtac 480

cagcagaagc ccggcaccat ccgcaagctg ctgatctacg ccgccagcag ccagcagagg 540

ggcgtgccca gcaggttcag cggcagcggc agcggcaccg gcttcaccct gaccatcagc 600

agcctgcagc ccgaggacat cgccacctac tactgcctgc agagcttcgg cacccccctg 660

accttcggcg gcgacatcca gatgaaccag aaccccaaca gcctgagcgc cagcctaggc 720

gacaccatca ccatcaccta ccacgccagg cacaacgtga ggaactacct gaactggtac 780

caacagaagc ccggcaacat acccaagcta ctgatctcgg ccgccagcac ccaacagagg 840

ggcgtgacca caggttcagc gccagcagaa gaggcaccgg cttcacccag accatcagca 900

gactgcagcc cgaggacatc gccacctact actgcctgca gagcttcggc accccccaga 960

ccttcgacgg cggcaacaag ccggcaatca 990

<210> 10

<211> 330

<212> PRT

<213> Anti-Aβ1-42-1(Artificial Sequence)

<400> 10

Ala Val Lys Pro Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gln Lys Gln Ser Cys Ala Ala Ser Ala Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Met Thr Trp Tyr Val Gly Thr Lys Lys Ser Tyr Ile Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Asn Arg His Asn Ala Lys Ser Thr Pro Phe

65 70 75 80

Leu Lys Met Thr Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Asp Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Arg Gly Ile Asp Thr Arg His Gly Pro Tyr Phe Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Ile Gln Met

115 120 125

Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Thr Ile Thr

130 135 140

Ile Thr Cys His Ala Arg His Asn Val Arg Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ile Arg Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

165 170 175

Ser Gln Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

180 185 190

Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

195 200 205

Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Gly Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly

210 215 220

Asp Ile Gln Met Asn Gln Asn Pro Asn Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

225 230 235 240

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Tyr His Ala Arg His Asn Val Arg Asn Tyr

245 250 255

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Ala Ala Ser Thr Gln Gln Arg Gly Val Thr Thr Gly Ser Ala Pro

275 280 285

Ala Glu Glu Ala Pro Ala Ser Pro Arg Pro Ser Ala Asp Cys Ser Pro

290 295 300

Arg Thr Ser Pro Pro Thr Thr Ala Cys Arg Ala Ser Ala Pro Pro Arg

305 310 315 320

Pro Ser Thr Ala Ala Thr Ser Arg Gln Ser

325 330

<210> 11

<211> 993

<212> DNA

<213> Anti-Aβ1-42-2(Artificial Sequence)

<400> 11

gaggtgaagc tggaggagag cggaggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgacgctg 60

agctgcgccg acagtgtctt cacttacagc agctacggct tgcactggga gaggcaggcc 120

tctgagaagg gcctggagtg ggtggccatg atcaggtccg acggcaccaa gaagtactac 180

agcgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa caccctgttc 240

ctgcagatga cctgcctgag gagcgaggac accgacatgt actactgcga cagggacagg 300

ggcatcggca ccaggcacgg cccctacttc atggacgtgt ggggccaggg caccagcgtg 360

accgtgagca gcgacatcca gatgaaccag agccccagca gcctgagcgc cagcctgggc 420

gacaccatca ccatcaccta ccacgacagg caatacgtga ggagctacct gaactggtac 480

cagcagaagc ccggcaacat ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcag ccggcagagg 540

ggcgtgccca gcaggtacag cggcagcggc agcggcaccg gcttcaccct gaccatcagc 600

agcctgcagc ccgaggacat cgccagctac tcatgcctgc agaacttcgg caccttcctg 660

accttcggcg gcgacatcca gatgaaccag agccccagca tcctgagcgc cagcctgggc 720

gacaccatca ccatcacctg ccacgccagg cacaacgtga ggagctacct gaactggtac 780

cagcagaagc ccggcaacat ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcag ccagcagagg 840

cgcgtgccca gcaggttcag cggcagcggc agcggcaccg gcttcaccct gaccatcagc 900

agcctgcagc ccgaggacat cgccacctac tactgcctgc agagcttcgg cacccccctg 960

accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc aag 993

<210> 12

<211> 331

<212> PRT

<213> Anti-Aβ1-42-2(Artificial Sequence)

<400> 12

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Asp Ser Val Phe Thr Tyr Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Leu His Trp Glu Arg Gln Ala Ser Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Met Ile Arg Ser Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Cys Leu Arg Ser Glu Asp Thr Asp Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asp Arg Asp Arg Gly Ile Gly Thr Arg His Gly Pro Tyr Phe Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Ile Gln Met

115 120 125

Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Thr Ile Thr

130 135 140

Ile Thr Tyr His Asp Arg Gln Tyr Val Arg Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

165 170 175

Ser Arg Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Tyr Ser Gly Ser Gly Ser Gly

180 185 190

Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala

195 200 205

Ser Tyr Ser Cys Leu Gln Asn Phe Gly Thr Phe Leu Thr Phe Gly Gly

210 215 220

Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Ala Ser Leu Gly

225 230 235 240

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Arg His Asn Val Arg Ser Tyr

245 250 255

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile

260 265 270

Tyr Ala Ala Ser Ser Gln Gln Arg Arg Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

275 280 285

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

290 295 300

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Gly Thr Pro Leu

305 310 315 320

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

325 330

Claims

1.一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：为杂交瘤细胞株Aβ1-42，其微生物保藏编号为CCTCC NO：C2021123。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断、预防或治疗阿尔茨海默病的试剂或药物中的应用。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备人血清中Aβ1-42蛋白含量检测试剂中的应用。

4.单克隆抗体Anti-Aβ1-42-1和Anti-Aβ1-42-2，其特征在于：所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株所分泌，所述单克隆抗体的可变区核苷酸序列分别如SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11所示，对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12所示。

5.权利要求4所述的单克隆抗体Anti-Aβ1-42-1、Anti-Aβ1-42-2在制备诊断、预防或治疗阿尔茨海默病的试剂或药物中的应用。

6.权利要求4所述的单克隆抗体Anti-Aβ1-42-1、Anti-Aβ1-42-2在制备人血清中Aβ1-42蛋白含量检测试剂中的应用。

7.一种用于人血清中Aβ1-42蛋白含量检测的化学发光试剂盒，其特征在于：其检测抗体为权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体Anti-Aβ1-42-1和Anti-Aβ1-42-2。

8.根据权利要求7所述的用于人血清中Aβ1-42蛋白含量检测的化学发光试剂盒，其特征在于：包括辣根过氧化物酶标记Anti-Aβ1-42-1的抗体溶液、包被Anti-Aβ1-42-2抗体的酶标板、浓缩洗液、发光底物液和校准品。