ES2770787T3 - Método y composición para tratar el cáncer, destruir las células cancerosas metastásicas y evitar la metástasis del cáncer usando anticuerpo para productos finales de glicación avanzada (AGE) - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un anticuerpo anti-AGE para su uso en el tratamiento de cáncer metastásico y/o en la prevención de metástasis de cáncer en un sujeto, en donde el anticuerpo anti-AGE se une a una proteína modificada con carboximetil-lisina.

Description

DESCRIPCIÓN

Método y composición para tratar el cáncer, destruir las células cancerosas metastásicas y evitar la metástasis del cáncer usando anticuerpo para productos finales de glicación avanzada (AGE)

Antecedentes

Las células senescentes son células que son parcialmente funcionales o no funcionales y se encuentran en un estado de detención proliferativa. La senescencia es un estado distinto de una célula y está asociado a los biomarcadores, tales como la activación del biomarcador p16Ink4a (“p16”) y la expresión de la p-galactosidasa. La senescencia comienza con el daño o el estrés (tales como la sobreestimulación por parte de factores de crecimiento) de las células. El daño o el estrés tiene un impacto negativo en el ADN mitocondrial de las células que provoca que estas produzcan radicales libres que reaccionan con azúcares en la célula para formar metilglioxal (MG). El MG a su vez reacciona con proteínas o lípidos para generar productos finales de glicación avanzada (AGE, por sus siglas en inglés). En el caso del componente de proteína lisina, el MG reacciona para formar carboximetil-lisina, que es un AGE. Los AGE también se forman a partir de la reacción no enzimática de azúcares en la sangre con proteínas de células externas.

El daño o el estrés en el ADN mitocondrial también activa una respuesta al daño del ADN que induce a la célula a producir proteínas bloqueadoras del ciclo celular. Estas proteínas bloqueadoras evitan que la célula se divida. El daño o el estrés continuado provocan la producción de mTOR, que a su vez activa la síntesis de proteínas e inactiva la ruptura de proteínas. La estimulación adicional de las células conduce a la muerte celular programada (apoptosis).

La p16 es una proteína implicada en la regulación del ciclo celular, mediante la inhibición de la fase S. Puede activarse durante el envejecimiento o en respuesta a diversos estreses, tales como daño en el ADN, estrés oxidativo o exposición a fármacos. Típicamente, se considera que p16 es una proteína supresora de tumor, que provoca que una célula se vuelva senescente en respuesta al daño en el ADN y evita de forma irreversible que la célula entre en un estado hiperproliferativo. Sin embargo, ha habido cierta ambigüedad en este aspecto, ya que algunos tumores muestran sobreexpresión de p16, mientras que otros muestran expresión regulada negativamente. La evidencia sugiere que la sobreexpresión de p16 en algunos tumores da como resultado una proteína del retinoblastoma (“Rb”) defectuosa. La p16 actúa en la Rb inhibiendo la fase S, y la Rb regula negativamente a la p16, lo que crea una retroalimentación negativa. La Rb defectuosa no logra inhibir la fase S ni regular negativamente a la pl6, lo que da como resultado la sobreexpresión de p16 en células hiperproliferativas. Romagosa, C. et al., p16Ink4a overexpression in cancer: a tumor suppressor gene associated with senescence and high-grade tumors, Oncogene, Vol. 30, 2087­ 2097 (2011).

Se sabe que las células senescentes contribuyen al crecimiento de las células cancerosas. Las células senescentes están asociadas a la secreción de muchos factores implicados en la señalización intercelular, que incluyen factores proinflamatorios; la secreción de estos factores se ha denominado fenotipo secretor asociado a la senescencia o SASP. Un estudio demostró que las células madre mesenquimales senescentes promueven la proliferación y migración de células de cáncer de mama mediante la secreción de IL-6 (Di, G-h. et al. IL-6 Secreted from Senescent Mesenchymal Stem Cells Promotes Proliferation and migration of Breast Cancer Cells, PLOS One, Vol. 9, 11, e113572 (2014)). Otro estudio demostró que los fibroblastos humanos senescentes aumentan el crecimiento de tumores mediante la secreción de metaloproteinasa de matriz (Liu, D. et al. Senescent Human Fibroblasts Increase the Early Growth of Xenograft Tumors via Matrix Metalloproteinase Secretion, Cancer Res, Vol. 67, 3117-3126 (2007)).

Las células senescentes secretan especies reactivas de oxígeno (“ROS”, por sus siglas en inglés) como parte del SASP. Se cree que las ROS cumplen un papel importante en el mantenimiento de la senescencia de las células. La secreción de ROS crea un efecto testigo, donde las células senescentes inducen la senescencia en células cercanas: Las ROS crean el mismo daño celular conocido porque activa la expresión de p16, lo que provoca la senescencia (Nelson, G., A senescent cell bystander effect: senescence-induced senescence, Aging Cell, Vol. 11, 345-349 (2012)). La vía de p16/Rb conduce a la inducción de ROS, que a su vez activa la proteína quinasa C delta lo que crea un bucle de retroalimentación positiva que mejora adicionalmente las ROS, ayudando a mantener la detención del ciclo celular irreversible; se ha sugerido que exponer las células cancerosas a ROS puede ser eficaz para tratar el cáncer mediante la inducción de la detención de la fase celular en células hiperproliferativas (Rayess, H. et al., Cellular senescence and tumor suppressor gene p16, Int J Cancer, Vol. 130, 1715-1725 (2012)).

Los productos finales de glicación avanzada (AGE; también denominados proteínas modificadas por AGE o productos finales de glicación) surgen de una reacción no enzimática de azúcares con cadenas laterales de proteínas (Ando, K. et al., Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999)). Este proceso comienza con una reacción reversible entre el azúcar reductor y el grupo amino para formar una base de Schiff, que procede a formar un producto de transposición de Amadori con enlace covalente. Una vez formado, el producto de Amadori experimenta una transposición adicional para producir los AGE. La hiperglucemia, provocada por la diabetes mellitus (DM) y el estrés oxidativo promueven esta modificación postraduccional de las proteínas de membrana (Lindsey JB, et al., “Receptor For Advanced Glycation End-Products (RAGE) and soluble rAg E (sRAGE): Cardiovascular Implications,” Diabetes Vascular Disease Research, Vol. 6(1), 7-14, (2009)). Los AGE se ha asociado a varias afecciones patológicas que incluyen complicaciones diabéticas, inflamación, retinopatía, nefropatía, aterosclerosis, apoplejía, disfunción de células endoteliales y trastornos neurodegenerativos (Bierhaus A, “AGEs and their interaction with AGE-receptors in vascular disease and diabetes mellitus. I. The AGE concept,” Cardiovasc Res, Vol. 37(3), 586-600 (1998)).

Las proteínas modificadas por AGE también son un marcador de las células senescentes. Esta asociación entre el producto final de glicación y la senescencia es bien conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Gruber, L. (WO 2009/143411, 26 nov. 2009), Ando, K. et al. (Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999)), Ahmed, E.K. et al. (“Protein Modification and Replicative Senescence of WI-38 Human Embryonic Fibroblasts” Aging Cells, vol. 9, 252, 260 (2010)), Vlassara, H. et al. (Advanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell Surface Induce Receptor-Mediated Phagocytosis by Macrophages, J. Exp. Med., Vol. 166, 539, 545 (1987)) y Vlassara et al. (“High-affinity-receptor-mediated Uptake and Degradation of Glucose-modified Proteins: A Potential Mechanism for the Removal of Senescent Macromolecules” Proc. Natl. Acad. Sci. USAI, Vol. 82, 5588, 5591 (1985)). Adicionalmente, Ahmed, E.K. et al. indica que los productos finales de glicación son “una de las principales causas del daño espontáneo en las proteínas celulares y extracelulares” (Ahmed, E.K. et al. véase anteriormente, página 353). Por consiguiente, la acumulación de productos finales de glicación está asociada a la senescencia. Ya que la formación de productos finales de glicación está asociada a la oxidación, la acumulación de los productos finales de glicación puede ser resultado de la formación de ROS en las células senescentes (Fu, M.-X., et al., The Advanced Glycation End Product, NE-(Carboxymehtyl)lysine, Is a Product of both Lipid Peroxidation and Glycoxidation Reactions, J. Biol. Chem., Vol.

271, 9982-9986 (1996)).

Van Heijst J. W. J. et al. (2005) menciona la detección de NE-(carboximetil)lisina (CML) y argpirimidina en tejidos de cáncer humanos (van Heijst J. W. J. et al., Advanced glycation end products in human cancer tissues: detection of NE-(Carboxymehtyl)lysine and argpyrimidine. Ann. N. Y. Acad. Sci. Vol. 1043, 725-733 (2005)).

Sumario

La invención se define de acuerdo con las reivindicaciones. De esta manera, la invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-AGE para su uso en el tratamiento de cáncer metastásico y/o en la prevención de la metástasis del cáncer en un sujeto, en donde el anticuerpo anti-AGE se une a una proteína modificada con carboximetil-lisina.

En algunas realizaciones, la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, el sujeto se selecciona del grupo que consiste en humanos, ratones, ratas, cabras, ovejas, vacas, caballos, perros y gatos. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-AGE no es inmunogénico para una especie seleccionada del grupo que consiste en humanos, gatos, perros, caballos, camellos, alpacas, ganado vacuno, ovejas y cabras.

En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer metastásico. En algunas realizaciones, el sujeto no tiene cáncer metastásico.

En algunas realizaciones, la composición está en forma de dosificación unitaria.

En algunas realizaciones, (a) el sujeto es un humano; (b) el anticuerpo anti-AGE no es inmunogénico para una especie seleccionada del grupo que consiste en humanos, gatos, perros, caballos, camellos, alpacas, ganado vacuno, ovejas y cabras; (c) el sujeto tiene cáncer metastásico; y (d) la composición está en forma de dosificación unitaria.

En algunas realizaciones, la composición está en forma de dosificación múltiple. En algunas realizaciones, la composición es estéril.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-AGE se une a una célula de cáncer metastásica que expresa una modificación AGE. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-AGE se une a una célula circulante que expresa una modificación AGE.

En algunas realizaciones, el sujeto está embarazada. En algunas realizaciones, el sujeto se ha diagnosticado previamente con caquexia por cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un sistema inmunológico comprometido.

En algunas realizaciones, el cáncer metastásico es cáncer de mama metastásico.

Se desvela en el presente documento un método para tratar el cáncer, destruir las células cancerosas metastásicas, destruir las células de neoplasias potencialmente malignas y/o evitar la metástasis del cáncer que comprende administrarle a un sujeto una composición que comprende un anticuerpo anti-AGE.

Se desvela en el presente documento un método para tratar el cáncer, destruir las células cancerosas metastásicas, destruir las células de neoplasias potencialmente malignas y/o evitar la metástasis del cáncer que comprende administrar una composición que comprende un primer anticuerpo anti-AGE y un segundo anticuerpo anti-AGE. El segundo anticuerpo anti-AGE es diferente al primer anticuerpo anti-AGE.

Se desvela en el presente documento un método para tratar un sujeto con cáncer, destruir células cancerosas metastásicas, destruir las células de neoplasias potencialmente malignas y/o evitar la metástasis del cáncer que comprende una primera administración de un anticuerpo anti-AGE; seguida por el análisis del sujeto para determinar la eficacia de la primera administración para tratar el cáncer, destruir células cancerosas metastásicas, destruir las células de neoplasias potencialmente malignas y/o evitar la metástasis del cáncer; seguido de una segunda administración del anticuerpo anti-AGE.

Se desvela en el presente documento el uso de un anticuerpo anti-AGE para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer, destruir las células cancerosas metastásicas, destruir las células de neoplasias potencialmente malignas y/o evitar la metástasis del cáncer.

Se desvela en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo anti-AGE para usar para tratar el cáncer, destruir las células cancerosas metastásicas, destruir las células de neoplasias potencialmente malignas y/o evitar la metástasis del cáncer.

Se desvela en el presente documento una composición para tratar el cáncer, destruir las células cancerosas metastásicas, destruir las células de neoplasias potencialmente malignas y/o evitar la metástasis del cáncer que comprende un primer anticuerpo anti-AGE, un segundo anticuerpo anti-AGE y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El primer anticuerpo anti-AGE es diferente al segundo anticuerpo anti-AGE.

Se desvela en el presente documento un método para diagnosticar el cáncer metastásico que comprende detectar un complejo inmunitario que comprende un anticuerpo anti-AGE unido a una célula que expresa una modificación de AGE.

Se desvela en el presente documento un complejo inmunitario que comprende un anticuerpo anti-AGE unido a una célula cancerosa metastásica. La célula cancerosa metastásica expresa una modificación de AGE.

Se desvela en el presente documento un kit para diagnosticar el cáncer metastásico que comprende un anticuerpo anti-AGE, una muestra de control y, opcionalmente, un reactivo que se une al anticuerpo anti-AGE.

Definiciones

El término “péptido” significa una molécula compuesta por 2-50 aminoácidos.

El término “proteína” significa una molécula compuesta por más de 50 aminoácidos.

Las frases “producto final de glicación avanzada”, “AGE”, “péptido o proteína modificada por AGE”, “producto final de glicación” y “antígeno de AGE” se refieren a péptidos o proteínas modificadas que se forman como resultado de la reacción de azúcares con cadenas laterales de proteínas que se reorganizan adicionalmente y forman reticulaciones irreversibles. Este proceso comienza con una reacción reversible entre un azúcar reductor y un grupo amino para formar una base de Schiff, que procede a formar un producto de transposición de Amadori con enlace covalente. Una vez formado, el producto de Amadori experimenta una transposición adicional para producir los AGE. Las proteínas modificadas por AGE y anticuerpos de las proteínas modificadas por AGE se describen en el documento U.S.

5.702.704 de Bucala (“Bucala”) y U.S. 6.380.165 de Al-Abed et al. (“Al-Abed”). Los péptidos o proteínas glicadas que no han experimentado trasposición necesaria para formar los AGE, tales como la N-desoxifructosil-lisina encontrada en la albúmina glicada, no son AGE. Los AGE pueden identificarse mediante la presencia de modificaciones de AGE (también denominadas epítopos de AGE o restos de AGE) tales como 2-(2-furoil)-4(5)-(2-furanil)-1H-imidazol ("FFI"); 5-hidroximetil-1-alquilpirrolo-2-carbaldehído ("Pirralina"); 1-alquil-2-formil-3,4-diglicosil pirrolo ("AFGP"), un AGE de modelo no fluorescente; carboximetil-lisina; y pentosidina. ALI, otro AGE, se describe en Al-Abed.

“Un anticuerpo que se une a una proteína modificada por AGE en una célula”, “anticuerpo anti-AGE” o “anticuerpo de AGE” significa un anticuerpo u otra proteína o péptido que se une a un péptido o proteína modificada por AGE e incluye una región constante de un anticuerpo, donde la proteína o péptido que se ha modificado por AGE es una proteína o péptido encontrado normalmente unido en la superficie de una célula, preferentemente una célula de mamífero, más preferentemente una célula de ser humano, gato, perro, caballo, camélido (por ejemplo, camello o alpaca), ganado, oveja o cabra. “Un anticuerpo que se une a una proteína modificada por AGE en una célula”, “anticuerpo anti-AGE” o “anticuerpo de AGE” no incluye un anticuerpo u otra proteína que se une con la misma especificidad y selectividad tanto al péptido como a la proteína modificados por AGE, y el mismo péptido o proteína no modificado por AGE (es decir, la presencia de la modificación de AGE no aumenta la unión). La albúmina modificada por AGE no es una proteína modificada por AGE en una célula, porque la albúmina no es una proteína encontrada normalmente unida en la superficie de las células. “Un anticuerpo que se une a una proteína modificada por AGE en una célula”, “anticuerpo anti-AGE” o “anticuerpo de AGE” solo incluye aquellos anticuerpos que provocan la eliminación, destrucción o muerte de la célula. También se incluyen anticuerpos que están conjugados, por ejemplo, con una toxina, fármaco u otro producto químico o partícula. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales pero también se permiten los anticuerpos policlonales.

La frase “célula senescente” significa una célula que se encuentra en un estado de detención proliferativa y expresa uno o más biomarcadores de senescencia, tales como la activación de p16Ink4a o la expresión de p-galactosidasa asociada a la senescencia.

El término “variante” significa un nucleótido, proteína o secuencia de aminoácidos diferente a las secuencias específicamente identificadas, en donde uno o más nucleótidos, proteínas o restos de aminoácidos están eliminados, sustituidos o añadidos. Las variantes pueden ser variantes alélicas de origen natural o variantes de origen no natural. Las variantes de las secuencias identificadas pueden retener algunas o todas las características de las secuencias identificadas.

El término “porcentaje (%) de identidad de secuencia” se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en una secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación a efectos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras mediante el uso de software informático disponible al público, tales como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Preferentemente, los valores del % de identidad de secuencia se generan mediante el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se encuentra disponible al público de Genentech, Inc. (South San Francisco, CA), o puede compilarse a partir del código fuente, que se ha archivado con documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos y está registrado con el n.° de Registro de Derechos de Autor de Estados Unidos TXU510087. El programa ALlGN-2 debería compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, que incluye UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias están establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.

En las situaciones donde se utiliza ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que se puede expresar de manera alternativa como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y, donde X es la cantidad de restos de aminoácido calificados como correspondencias idénticas mediante el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento del programa de A y B y donde Y es la cantidad total de restos de aminoácido en B. Cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. Salvo que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos que se utilizan en el presente documento se obtienen mediante el programa informático ALIGN-2.

La frase “complejo inmunitario” significa la combinación de un anticuerpo unido a un antígeno. Un complejo inmunitario también puede denominarse “complejo de anticuerpo-antígeno”.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una gráfica de la respuesta en función del tiempo en un experimento de unión a anticuerpos. La Figura 2 ilustra un kit para diagnosticar metástasis de cáncer.

La Figura 3 ilustra una gráfica del volumen tumoral normalizado durante el curso de un estudio in vivo que investiga el efecto de un anticuerpo anti-AGE en el crecimiento tumoral, el potencial metastásico y la caquexia.

La Figura 4 ilustra una gráfica del peso corporal normalizado de los ratones durante el curso de un estudio in vivo que investiga el efecto de un anticuerpo anti-AGE en el crecimiento tumoral, el potencial metastásico y la caquexia.

Descripción detallada

La investigación reciente en C. elegans sugiere que las células que están proliferando de manera activa no son invasivas y esas células invasivas tales como las células cancerosas metastásicas no están proliferando y deben encontrarse en una detención del ciclo celular (Matus et al., Invasive Cell Fate Requires G1 Cell-Cycle arrest and Histone Deacetylase-Mediated Changes in Gene Expression, Developmental Cell, Vol. 35, 162-174 (2015)). Otros investigadores han descubierto que la formación de ROS puede inducir la metástasis de las células cancerosas (Porporato, P. E., et al. A Mitochondrial Switch Promotes Tumor Metastasis, Cell Reports, Vol. 8, 754-766 (2014)).

La detención de la fase celular y la producción de ROS le otorga a las células cancerosas metastásicas muchas características de las células senescentes, que se esperaría que incluya la presencia de proteínas modificadas por AGE en la superficie celular. Por lo tanto, las proteínas modificadas por AGE proporcionan un antígeno que puede dirigirse usando anticuerpos, para localizar y destruir las células cancerosas metastásicas. La administración de anticuerpos anti-AGE destruiría las células cancerosas metastásicas, tratando así el cáncer. La administración de anticuerpos anti-AGE evitaría la metástasis en un paciente con cáncer y podría utilizarse para evitar propagación del cáncer, de manera profiláctica.

Las neoplasias potencialmente malignas, tales como queratosis seborreica, queratosis actínica y carcinoma in situ, tienen muchas características de células senescentes, tales como la expresión de p16, que se esperaría que incluya la presencia de proteínas modificadas por AGE en la superficie celular. Por lo tanto, las proteínas modificadas por AGE proporcionan un antígeno que puede dirigirse usando anticuerpos, para localizar y destruir las células de neoplasias potencialmente malignas. La administración de anticuerpos anti-AGE destruiría las células de neoplasias potencialmente malignas, evitando así el cáncer. La administración de anticuerpos anti-AGE evitaría el cáncer en un paciente, de manera profiláctica.

Un anticuerpo que se une a una proteína modificada por AGE en una célula (“anticuerpo anti-AGE” o “anticuerpo AGE”) se conoce en la técnica. Algunos ejemplos incluyen aquellos descritos en el documento U.S. 5.702.704 (Bucala) y el documento U.S. 6.380.165 (Al-Abed et al.). Los ejemplos incluyen un anticuerpo que se une a una o más proteínas modificadas por AGE que tienen una modificación de AGE tales como FFI, pirralina, AFGP, ALI, carboximetil-lisina, carboxietil-lisina y pentosidina y mezclas de dichos anticuerpos. Los anticuerpos anti-AGE para su uso de acuerdo con la invención unen proteínas modificadas con carboximetil-lisina. Preferentemente, el anticuerpo es no inmunogénico al animal en el cual se usará, tales como no inmunogénico a los seres humanos; animales de compañía que incluyen gatos, perros y caballos; y animales comercialmente importantes, tales como camellos (o alpaca), ganado (bovino), ovejas y cabras. Más preferentemente, el anticuerpo tiene la región constante de la misma especie que los anticuerpos del animal para reducir la respuesta inmunitaria contra el anticuerpo, tales como estando humanizado (para seres humanos), felinizado (para gatos), caninizado (para perros), equinizado (para caballos), camelizado (para camellos o alpaca), bovinizado (para ganado), ovinizado (para ovejas) o caperizado (para cabras). Lo más preferentemente, el anticuerpo es idéntico al del animal en el cual se utilizará (excepto por la región variable), tales como un anticuerpo humano, un anticuerpo de gato, un anticuerpo de perro, un anticuerpo de caballo, un anticuerpo de camello, un anticuerpo bovino, un anticuerpo de oveja o un anticuerpo de cabra. Los detalles de las regiones constantes y otras partes de anticuerpos para estos animales se describen más adelante. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal pero también se permiten los anticuerpos policlonales.

Los anticuerpos anti-AGE para su uso de acuerdo con la invención incluyen aquellos que se unen a proteínas o péptidos que exhiben una modificación de carboximetil-lisina. Los anticuerpos anti-AGE particularmente preferidos de acuerdo con la divulgación incluyen aquellos que se unen a proteínas o péptidos que exhiben una modificación de AGE de carboxietil-lisina. La carboximetil-lisina (también conocida como N(épsilon)-(carboximetil)lisina, N(6)-carboximetil-lisina o ácido 2-Amino-6-(carboximetilamino)hexanoico) y la carboxietil-lisina (también conocida como N-épsilon-(carboxietil)lisina) se encuentran en proteínas o péptidos y lípidos como resultado del estrés oxidativo y la glicación química. Los péptidos o proteínas modificados por CML y CEL son reconocidos por el receptor RAGE que se expresa en una diversidad de células. La CML y CEL se han estudiado ampliamente y los productos relacionados con CML y CEL se encuentran disponibles en el mercado. Por ejemplo, Cell Biolabs, Inc. Vende antígenos de CML-BSA, anticuerpos policlonales de CML, kits de inmunotransferencia de CML y kits de ELISA competitivo de CML (www.cellbiolabs.com/cml-assays) así como también antígenos de CEL-BSA y kits de ELISA competitivo de CEL (www.cellbiolabs.com/cel-n-epsilon-carboxyethyl-lysine-assays-and-reagents). Un anticuerpo particularmente preferido incluye la región variable del anticuerpo anti-producto final de glicación de ratón disponible en el mercado generado contra la carboximetil lisina conjugada con hemocianina de lapa californiana, el MAb de carboximetil lisina (Clon 318003) disponible de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN; n.° de catálogo MAB3247), modificado para que tenga una región constante humana (o la región constante del animal en el cual será administrado). Los anticuerpos disponibles en el mercado, tales como el anticuerpo de carboximetil lisina que corresponde al n.° de catálogo MAB3247 de R&D Systems, Inc., puede preverse con fines de diagnóstico y puede contener material que no es adecuado para utilizar en animales o seres humanos. Preferentemente, los anticuerpos disponibles en el mercado se purifican y/o aíslan antes de utilizarlos en animales o seres humanos para retirar las toxinas u otro material potencialmente dañino.

El anticuerpo anti-AGE tiene baja velocidad de disociación del complejo de anticuerpo-antígeno, o kd (también denominada kback o constante de disociación), preferentemente 9 x 10'3, 8 x 10'3, 7 x 10'3 o 6 x 10'3 (s_1) como máximo. El anticuerpo anti-AGE tiene alta afinidad por la proteína modificada por AGE de una célula, que puede expresarse como una constante de disociación K^d baja de 9 x 10'6, 8 x 10'6, 7 x 10'6, 6 x 10'6, 5 x 10'6, 4 x 10'6 o 3 x 10'6 (M) como máximo. Preferentemente, las propiedades de unión del anticuerpo anti-AGE son similares, iguales o superiores al MAb carboximetil lisina (Clon 318003) disponible de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN; n.° de catálogo MAB3247), ilustrado en la Figura 1.

El anticuerpo anti-AGE puede destruir células modificadas por AGE a través de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés). La ADCC es un mecanismo de defensa inmunitaria mediada por células en el cual una célula efectora del sistema inmunitario lisa de forma activa una célula diana, cuyos antígenos de superficie de membrana se han unido mediante anticuerpos específicos. La ADCC puede estar mediada por linfocitos citolíticos (NK, por sus siglas en inglés), macrófagos, neutrófilos o eosinófilos. Las células efectoras se unen a la parte Fc del anticuerpo unido. La administración de células NK, tales como células NK92 (una línea celular disponible de NantKwest, Culver City, CA), junto con, o posterior a, la administración de anticuerpos anti-AGE, puede mejorar la actividad de complemento y, por lo tanto, la eficacia de los anticuerpos anti-AGE para destruir las células cancerosas metastásicas. El anticuerpo anti-AGE también puede destruir células modificadas por AGE a través de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés). En CDC, la cascada del complemento del sistema inmunitario es activada por un anticuerpo que se une a un antígeno diana.

En anticuerpo anti-AGE puede conjugarse con un agente que provoca la destrucción de las células modificadas por AGE. Dichos agentes pueden ser una toxina, un agente citotóxico, nanopartículas magnéticas y discos de vórtice magnético.

Una toxina, tales como toxinas formadoras de poros (PFT, por sus siglas en inglés) (Aroian R. et al., “Pore-Forming Toxins and Cellular Non-Immune Defenses (CNIDs),” Current Opinión in Microbiology, 10:57-61 (2007)), conjugada con un anticuerpo anti-AGE puede inyectarse a un paciente para que se dirija de forma selectiva a las células modificadas por AGE y las elimine. El anticuerpo anti-AGE reconoce y se une a células modificadas por AGE. Luego, la toxina provoca la formación de poros en la superficie celular y la posterior eliminación de células a través de la lisis osmótica.

Las nanopartículas magnéticas conjugadas con el anticuerpo anti-AGE pueden inyectarse en un paciente para se dirija a las células modificadas por AGE y las elimine. Las nanopartículas magnéticas se pueden calentar al aplicar un campo magnético con el fin de eliminar de manera selectiva las células modificadas por AGE.

Como alternativa, los discos de vórtice magnético, que se magnetizan solo cuando se aplica un campo magnéti evitar la autoagregación que puede bloquear los vasos sanguíneos, comienzan a girar cuando se aplica un campo magnético, lo que provoca la alteración de la membrana de células diana. Los discos de vórtice magnético, conjugados con anticuerpos anti-AGE se dirigen específicamente a tipos de células modificadas por AGE, sin eliminar otras células.

Los anticuerpos típicamente comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras de polipéptidos unidos para formar una molécula con forma de "Y". La región constante determina el mecanismo utilizado para dirigir el antígeno. La secuencia de aminoácidos en las puntas de la "Y" (la región variable) varía entre diferentes anticuerpos. Esta variación le da al anticuerpo su especificidad para unirse al antígeno. La región variable, que incluye los extremos de las cadena ligera y pesada, se subdivide adicionalmente en regiones hipervariables (HV - también a veces denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR) y regiones marco (FR). Cuando los anticuerpos se preparan de manera recombinante, también es posible tener un solo anticuerpo con regiones variables (o regiones determinantes de complementariedad) que se unen a dos antígenos diferentes, donde cada punta de la “Y” es específica de uno de los antígenos; estos se denominan anticuerpos biespecíficos.

Un anticuerpo anti-AGE humanizado de acuerdo con la presente invención puede tener la secuencia de región constante humana de los aminoácidos mostrados en la SEQ ID NO: 22. Las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada del anticuerpo anti-AGE humanizado pueden tener una o más de las secuencias de proteína mostradas en la SEQ ID NO: 23 (CDR1H), SEQ ID NO: 24 (CDR2H) y SEQ ID NO: 25 (CDR3H). Las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera del anticuerpo anti-AGE humanizado pueden tener una o más de las secuencias de proteína mostradas en la SEQ ID NO: 26 (CDR1L), SEQ ID NO: 27 (CDR2L) y SEQ ID NO: 28 (CDR3L).

La cadena pesada de la inmunoglobulina G1 de anticuerpo humano (Homo sapiens) puede tener o puede incluir la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 1. El dominio variable de la cadena pesada puede tener o puede incluir la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 2. Las regiones determinantes de complementariedad del dominio variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 2) se muestran en la SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43. La cadena ligera kappa de la inmunoglobulina G1 de anticuerpo humano (Homo sapiens) puede tener o puede incluir la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 3. El dominio variable de la cadena ligera kappa puede tener o puede incluir la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 4. Opcionalmente, el resto de arginina (Arg o R) en la posición 128 de la SEQ ID NO: 4 puede omitirse. Las regiones determinantes de complementariedad del dominio variable de la cadena ligera (SEQ ID ^{NO: 4) se muestran en la SEQ ID NO: 44, SEQ ID} nO: ^{45 y SEQ ID NO: 46. Las regiones variables pueden optimizarse} por codones, sintetizarse y clonarse en vectores de expresión que contienen regiones constantes de inmunoglobulina G1 humana. Además, las regiones variables pueden usarse en la humanización de anticuerpos no humanos.

La cadena pesada de anticuerpo puede estar codificada por la secuencia de ADN de la secuencia de SEQ ID NO: 12, una cadena pesada de inmunoglobulina G2b anti-AGE murina. La secuencia de proteína de la cadena pesada de inmunoglobulina G2b anti-AGE murina codificada por la SEQ ID NO: 12 se muestra en la SEQ ID NO: 16. La región variable del anticuerpo murino se muestra en la SEQ ID NO: 20, que corresponde a las posiciones 25-142 de la SEQ ID NO: 16. De manera alternativa, la cadena pesada de anticuerpo puede codificarse mediante la secuencia de ADN de la secuencia SEQ ID NO: 13, una cadena pesada de inmunoglobulina G1 anti-AGE humana quimérica. La secuencia de proteína de la cadena pesada de inmunoglobulina G1 anti-AGE humana quimérica codificada por la SEQ ID NO: 13 se muestra en la SEQ ID NO: 17. La inmunoglobulina humana anti-AGE quimérica incluye la región variable murina de la SEQ ID NO: 20 en las posiciones 25-142. La cadena ligera de anticuerpo puede estar codificada por la secuencia de ADN de la secuencia SEQ ID NO: 14, una cadena ligera kappa anti-AGE murina. La secuencia de proteína de la cadena ligera kappa anti-AGE murina codificada por la SEQ ID NO: 14 se muestra en la SEQ ID NO: 18. La región variable del anticuerpo murino se muestra en la SEQ ID NO: 21, que corresponde a las posiciones 21­ 132 de la SEQ ID NO: 18. De manera alternativa, la cadena ligera de anticuerpo puede estar codificada por la secuencia de ADN de la secuencia SEQ ID NO: 15, una cadena ligera kappa anti-AGE humana quimérica. La secuencia de proteína de la cadena ligera kappa anti-AGE humana quimérica codificada por la SEQ ID NO: 15 se muestra en la SEQ ID NO: 19. La inmunoglobulina humana anti-AGE quimérica incluye la región variable murina de la SEQ ID NO: 21 en las posiciones 21-132.

Un anticuerpo anti-AGE humanizado de acuerdo con la presente invención puede tener o puede incluir una o más cadenas pesadas humanizadas o cadenas ligeras humanizadas. Una cadena pesada humanizada puede codificarse mediante la secuencia de ADN de la secuencia SEQ ID NO: 30, 32 o 34. Las secuencias de proteína de las cadenas pesadas humanizadas codificadas por las SEQ ID NO: 30, 32 y 34 se muestran en las sEq ^{ID NO: 29, 31 y 33,} respectivamente. Una cadena ligera humanizada puede codificarse mediante la secuencia de ADN de la secuencia SEQ ID NO: 36, 38 o 40. Las secuencias de proteína de las cadenas ligeras humanizadas codificadas por las SEQ ID NO: 36, 38 y 40 se muestran en las SEQ ID NO: 35, 37 y 39, respectivamente. Preferentemente, el anticuerpo anti­ AGE humanizado maximiza la cantidad de secuencia humana y al mismo tiempo retiene la especificidad del anticuerpo original. Puede construirse un anticuerpo humanizado completo que contenga una cadena pesada que tiene una secuencia de proteína que se selecciona de las SEQ ID NO: 29, 31 y 33 y una cadena ligera que tiene una secuencia de proteína que se selecciona de las SEQ ID NO: 35, 37 y 39.

Los anticuerpos anti-AGE particularmente preferidos pueden obtenerse mediante la humanización de anticuerpos anti­ AGE murinos monoclonales. Los anticuerpos anti-AGE murinos monoclonales tienen la secuencia de proteína de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 47 (la secuencia de proteína del dominio variable se muestra en la SEQ ID NO: 52) y la secuencia de proteína de cadena ligera se muestra en la SEQ ID NO: 57 (la secuencia de proteína del dominio variable se muestra en la SEQ ID NO: 62). Una cadena pesada humanizada preferida puede tener la ^{secuencia de proteína mostrada en la SEQ ID NO: 48, SEQ ID} nO: ^{49, SEQ ID NO: 50 o SEQ ID NO: 51 (las} secuencias de proteína de los dominios variables de las cadenas pesadas humanizadas se muestran en la SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56, respectivamente). Una cadena ligera humanizada preferida ^{puede tener la secuencia de proteína mostrada en la SEQ ID NO: 58,} SeQ ^{ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 o la SEQ ID} NO: 61 (las secuencias de proteína de los dominios variables de las cadenas ligeras humanizadas se muestran en la ^{SEQ ID NO: 63, SEQ ID} nO: ^{64, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, respectivamente). Preferentemente, un anticuerpo} monoclonal anti-AGE humanizado está compuesto por una cadena pesada que tiene una secuencia de proteína ^{seleccionada del grupo que consiste en la} sEq ^{ID NO: 48, SEQ ID} nO: ^{49, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51 y una} cadena ligera que tiene una secuencia de proteína seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61. Los anticuerpos anti-AGE monoclonales humanizados compuestos por estas secuencias de proteína pueden tener mejor unión y/o mejor activación del sistema inmunitario, lo que provoca una mayor efectividad.

La secuencia de proteína de un anticuerpo de una especie no humana puede modificarse para que incluya el dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2 o la cadena ligera kappa que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4. La especie no humana puede ser un animal de compañía, tales como el gato doméstico o perro doméstico, o ganado, tales como reses, el caballo o el camello. Preferentemente, la especie no humana no es el ratón. La cadena pesada de la inmunoglobulina gamma 4 de anticuerpo de caballo (Equus caballus) puede tener o puede incluir la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 5 (número de acceso EMBL/GenBank AY445518). La cadena pesada de la inmunoglobulina delta de anticuerpo de caballo (Equus caballus) puede tener o puede incluir la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 6 (número de acceso EMBL/GenBank AY631942). La cadena pesada de la inmunoglobulina A de anticuerpo de perro (Canis familiaris) puede tener o puede incluir la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 7 (número de acceso GenBank L36871). La cadena pesada de la inmunoglobulina E de anticuerpo de perro (Canis familiaris) puede tener o puede incluir la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 8 (número de acceso GenBank L36872). La cadena pesada de la inmunoglobulina G2 de anticuerpo de gato (Felis catus) puede tener o puede incluir la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 9 (número de acceso DDBJ/EMBL/GenBank KF811175).

Los animales de la familia de los camélidos, tales como los camellos (Camelus dromedarius y Camelus bactrianus), llamas (Lama glama, Lama pacos y Lama vicugna), alpacas (Vicugna pacos) y guanacos (Lama guanicoe), tienen un anticuerpo único que no se encuentra en otros mamíferos. Además de los anticuerpos de inmunoglobulina G convencionales compuestos por tetrámeros de cadena pesada y ligera, los camélidos también tienen anticuerpos de inmunoglobulina G de cadena pesada que no contienen cadenas ligeras y existen como dímeros de cadena pesada. Estos anticuerpos se conocen como anticuerpos de cadena pesada, HCAb, anticuerpos de dominio simple o sdAb, y el dominio variable de un anticuerpo de cadena pesada de camélido se conoce como el VHH. Los anticuerpos de cadena pesada de camélidos carecen del dominio CH1 de cadena pesada y tienen una región bisagra que no se encuentra en otras especies. La región variable del anticuerpo de dominio simple del camello árabe (Camelus dromedarius) puede tener o puede incluir la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 10 (número de acceso GenBank AJ245148). La región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina tetramérica del camello árabe (Camelus dromedarius) puede tener o puede incluir la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 11 (número de acceso GenBank AJ245184).

Además de los camélidos, los anticuerpos de cadena pesada también se encuentran en peces cartilaginosos, tales como tiburones, ráyidos y mantarrayas. Este tipo de anticuerpo se conoce como un receptor nuevo del antígeno de la inmunoglobulina o IgNAR, y el dominio variable de un IgNAR se conoce como el VNAR. El IgNAR existe como dos dímeros de cadena pesada idénticos compuestos de un dominio variable y cinco dominios constantes cada uno. Al igual que en los camélidos, no hay cadena ligera.

Las secuencias de proteína de especies no humanas adicionales pueden encontrarse fácilmente en bases de datos en línea, tales como el sistema de información internacional ImMunoGeneTics (www.imgt.org), el Instituto Europeo de Bioinformática (www.ebi.ac.uk), el banco de datos de ADN de Japón (ddbj.nig.ac.jp/arsa) o el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Un anticuerpo anti-AGE o una variante de este puede incluir una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 20, que incluye modificaciones postraduccionales de las mismas. Una región variable que tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia puede contener sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-AGE que incluye esa secuencia retiene la capacidad de unirse al AGE. Las sustituciones, inserciones o eliminaciones pueden producirse en regiones fuera de la región variable.

Un anticuerpo anti-AGE o una variante de este puede incluir una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 21, que incluye modificaciones postraduccionales de las mismas. Una región variable que tiene al menos un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia puede contener sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-AGE que incluye esa secuencia retiene la capacidad de unirse al AGE. Las sustituciones, inserciones o eliminaciones pueden producirse en regiones fuera de la región variable.

De manera alternativa, el anticuerpo puede tener las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo anti-producto final de glicación de ratón disponible en el mercado generado contra la carboximetil lisina conjugada con hemocianina de lapa californiana (CML-KLH), el MAb de carboximetil lisina (Clon 318003) disponible de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN; n.° de catálogo MAB3247).

El anticuerpo puede tener o puede incluir regiones constantes que permiten la destrucción de células diana por parte del sistema inmunitario de un sujeto.

También pueden usarse mezclas de anticuerpos que se unen a más de un tipo de AGE de proteínas modificadas por AGE.

También pueden usarse anticuerpos biespecíficos, que son anticuerpos anti-AGE dirigidos de dos epítopos diferentes. Dichos anticuerpos tendrán una región variable (o región determinante de complementariedad) de aquellos de un anticuerpo anti-AGE y una región variable (o región determinante de complementariedad) de un anticuerpo diferente.

Pueden usarse fragmentos de anticuerpo en lugar de anticuerpos completos. Por ejemplo, la inmunoglobulina G puede dividirse en fragmentos más pequeños mediante la digestión con enzimas. La digestión con papaína escinde el lado de extremo N de puentes disulfuro entre cadenas pesadas para producir fragmentos Fab. Los fragmentos Fab incluyen la cadena ligera y uno de los dos dominios de extremo N de la cadena pesada (también conocido como el fragmento Fd). La digestión con pepsina escinde el lado de extremo C de los puentes disulfuro entre cadenas pesadas para producir fragmentos F(ab')2. Los fragmentos F(ab')2 incluyen ambas cadenas ligeras y los dos dominios de extremo N unidos por puentes disulfuro. La digestión con pepsina también puede formar los fragmentos Fv (fragmento variable) y Fc (fragmento cristalizable). El fragmento Fv contiene los dos dominios variables de extremo N. El fragmento Fc contiene los dominios que interactúan con receptores de inmunoglobulina en células y con los elementos iniciales de la cascada de complemento. La pepsina también puede escindir la inmunoglobulina G antes del tercer dominio constante de la cadena pesada (C^h3) para producir un fragmento grande F(abc) y un fragmento pequeño pFc'. De manera alternativa, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse de forma recombinante.

Si se desean anticuerpos adicionales, estos pueden producirse usando métodos bien conocidos. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales (pAb) pueden generarse en un hospedador mamífero mediante una o más inyecciones de un inmunógeno, y si se desea, un adyuvante. Típicamente, el inmunógeno (y adyuvante) se inyecta en un mamífero mediante inyección subcutánea o intraperitoneal. El inmunógeno puede ser una proteína modificada por AGE de una célula, tales como AGE-antitrombina III, AGE-calmodulina, AGE-insulina, AGE-ceruloplasmina, AGE-colágeno, AGE-catepsina B, AGE-albúmina tales como AGE-albúmina de suero bovino (AGE-BSA), AGE- albúmina sérica humana y ovalbúmina, AGE-cristalina, AGE-activador de plasminógeno, AGE-proteína de membrana plasmática endotelial, AGE-aldehído reductasa, AGE-transferrina, AGE-fibrina, AGE-SOD con cobre/zinc, AGE-apo B, AGE-fibronectina, AGE-ribosa pancreática, AGE-apo A-I y II, AGE-hemoglobina, AGE-Na+/K+-ATPasa, AGE-plasminógeno, AGE-mielina, AGE-lisozima, AGE-inmunoglobulina, AGE-proteína de transporte de glóbulos rojos Glu, AGE-p-N-acetil hexominasa, AGE-apo E, AGE-proteína de membrana de glóbulos rojos, AGE-aldosa reductasa, AGE-ferritina, AGE-espectrina de glóbulos rojos, AGE-alcohol deshidrogenasa, AGE-haptoglobina, AGE-tubulina, AGE-hormona tiroidea, AGE-fibrinógeno, AGE-p2-microglobulina, AGE-sorbitol deshidrogenasa, AGE-ai-antitripsina, AGE-carbonato deshidratasa, AGE-RNAsa, AGE-lipoproteína de baja densidad, AGE-hexoquinasa, AGE-apo C-I, AGE-RNAsa, AGE-hemoglobina tales como AGE-hemoglobina humana, AGE-albúmina tales como AGE-albúmina de suero bovino (AGE-BSA) y AGE-albúmina sérica humana, AGE-lipoproteína de baja densidad (AGE-LDL) y AGE-colágeno IV. Las células modificadas por AGE, tales como eritrocitos modificados por AGE, enteros, lisados o parcialmente digeridos, también pueden usarse como antígenos de AGE. Los ejemplos de adyuvantes incluyen completo de Freund, monofosforil Lípido A dicorinomicolato de trehalosa sintético, hidróxido de aluminio (alumbre), proteínas de choque térmico HSP 70 o HSP96, emulsión de escualeno que contiene monofosforil lípido A, a2-macroglobulina y sustancias tensioactivas, que incluyen emulsiones de aceite, polioles pleurónicos, polianiones y dinitrofenol. Para mejorar la respuesta inmunitaria, puede conjugarse un inmunógeno con un polipéptido que es inmunogénico en el hospedador, tales como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina sérica, tiroglobulina bovina, toxina colérica, enterotoxina lábil, partículas de sílice o inhibidor de tripsina de soja. Un conjugado de inmunógeno preferido es AGE-KLH. De manera alternativa, pueden generarse pAbs en pollos, lo que produce moléculas de IgY.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) también pueden generarse al inmunizar un hospedador o linfocitos de un hospedador, cosechar los linfocitos que secretan mAb (o potencialmente los secretan), fusionar esos linfocitos con células inmortalizadas (por ejemplo, células de mieloma), y seleccionar esas células que secretan el mAb deseado. Pueden usarse otras técnicas, tales como la técnica de hibridoma de EBV. Las técnicas para la generación de anticuerpos quiméricos mediante el corte y empalme de genes que codifican los dominios variables de anticuerpos en genes de los dominios constantes de la inmunoglobulina humana (u otro animal) dan como resultado "anticuerpos quiméricos" que son sustancialmente humanos (humanizados) o sustancialmente “izados” en otro animal (tales como gato, perro, caballo, camello o alpaca, ganado, oveja o cabra) a nivel de aminoácidos. Si se desea, los mAb pueden purificarse a partir del medio de cultivo o fluido de ascitis mediante procedimientos convencionales, tales como proteína A-sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, precipitación de sulfato de amonio o cromatografía de afinidad. De manera adicional, pueden generarse anticuerpos monoclonales humanos mediante la inmunización de ratones transgénicos que contienen loci trans humano de IgG de tercera copia y loci de Ig de ratón endógeno silenciado o mediante el uso de ratones transgénicos-humanos. La producción de anticuerpos monoclonales humanizados y fragmentos de estos también se puede generar a través de tecnologías de visualización de fagos.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualesquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que son compatibles con la administración farmacéutica. Los ejemplos preferidos de dichos vehículos o diluyentes incluyen agua, solución salina, soluciones de Ringer y solución de dextrosa. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones. Las soluciones y suspensiones usadas para la aplicación parenteral pueden incluir un diluyente estéril, tales como agua para inyección, solución salina, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos, antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para ajustar la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustare con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede colocarse en ampollas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Diversos excipientes pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas de anticuerpos adecuados para la inyección. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, CREMOPHOR EL® (BASF; Parsippany, NJ) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y fluida de modo que se pueda administrar usando una jeringa. Dichas composiciones deben ser estables durante la fabricación y almacenamiento y se deben conservan contra la contaminación de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, y timerosal, pueden contener contaminación por microorganismos. Los agentes isotónicos tales como azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, y cloruro sódico pueden incluirse en la composición. Las composiciones que pueden retardar la absorción incluyen agentes tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación de anticuerpos y, opcionalmente, otros componentes terapéuticos, en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con un ingrediente o una combinación de ingredientes, según sea necesario, seguido de esterilización. Los métodos de preparación de sólidos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles incluyen secado al vacío y liofilización para proporcionar un sólido.

Para la administración mediante inhalación, los anticuerpos pueden administrarse como un pulverizador en aerosol mediante un nebulizador o un recipiente presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tales como dióxido de carbono. Los anticuerpos también pueden administrarse mediante inhalación como un polvo seco, por ejemplo, usando la plataforma de administración de fármacos inhalados iSPERSE™ (PULMATRIX, Lexington, Mass.). El uso de anticuerpos anti-AGE que son anticuerpos de pollo (IgY) puede ser no inmunogénico en una diversidad de animales, incluyendo seres humanos, cuando se administran mediante inhalación.

La aplicación tópica puede ser eficaz para cánceres y neoplasias potencialmente malignas presentes en la piel, por ejemplo, melanomas, queratosis seborreica y queratosis actínica. Las composiciones para la administración tópica pueden encontrarse en forma de cremas o lociones.

Un nivel de dosificación adecuado de cada tipo de anticuerpo generalmente será de aproximadamente 0,01 a 500 mg por kg de peso corporal del paciente. Preferentemente, el nivel de dosificación será de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 250 mg/kg; más preferentemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 mg/kg. Un nivel de dosificación adecuado puede ser de aproximadamente 0,01 a 250 mg/kg, aproximadamente 0,05 a 100 mg/kg o aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg. Dentro de este intervalo la dosificación puede ser de 0,05 a 0,5, 0,5 a 5 o 5 a 50 mg/kg. Aunque cada tipo de anticuerpo puede administrarse en un régimen de 1 a 4 veces por día, tales como una vez o dos veces por día, los anticuerpos típicamente tienen una semivida in vivo prolongada. Por consiguiente, cada tipo de anticuerpo puede administrarse una vez, una vez a la semana, una vez cada dos o tres semanas, una vez al mes, o una vez cada 60 a 90 días.

Un sujeto que recibe administración de un anticuerpo anti-AGE puede analizarse para determinar si ha sido eficaz para tratar el cáncer mediante examen del paciente de la diseminación del cáncer a diferentes partes del cuerpo, particularmente en los ganglios linfáticos. Puede usarse cualquier prueba diagnóstica, tales como una biopsia, endoscopía, análisis de sangre o prueba de formación de imagen diagnóstica tales como rayos X o escaneo por TC. La prueba diagnóstica también puede incluir anticuerpos anti-AGE para la detección. La administración de anticuerpo y el análisis posterior pueden repetirse hasta que se logre el resultado terapéutico deseado. De manera similar, se puede analizar un sujeto para determinar si se ha tratado una neoplasia potencialmente maligna de manera eficaz mediante una reducción de tamaño, o desaparición, de la neoplasia.

Pueden crearse formas de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de dosificación. Las formas de dosificación unitaria se refieren a unidades físicamente separadas adecuadas como dosis únicas para tratar a un sujeto, que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más tipos de anticuerpos en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. Preferentemente, la forma de dosificación unitaria se encuentra en un recipiente sellado y es estéril.

Cualquier mamífero que pudiera desarrollar cáncer metastásico puede tratarse con los métodos descritos en el presente documento. Los seres humanos son un mamífero preferido para el tratamiento. Otros mamíferos que pueden tratarse incluyen ratones, ratas, cabras, ovejas, vacas, caballos y animales de compañía, tales como perros o gatos. Puede identificarse un sujeto que necesita tratamiento mediante el diagnóstico de un cáncer. Los cánceres que se someten particularmente a metástasis incluyen cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de cuello del útero, cáncer de vejiga, cáncer rectal, cáncer de esófago, cáncer de hígado, cáncer de boca y garganta, mieloma múltiple, cáncer de ovarios y cáncer de estómago. El tratamiento puede ser de pacientes que padecen cáncer metastásico. También puede administrarse el tratamiento a pacientes que tienen cáncer, pero antes de cualquier metástasis identificada, con el fin de evitar la metástasis. De manera similar, cualquier mamífero que pudiera desarrollar neoplasias potencialmente malignas se puede tratar con los métodos descritos en el presente documento. Los seres humanos son un mamífero preferido para el tratamiento. Otros mamíferos que pueden tratarse incluyen ratones, ratas, cabras, ovejas, vacas, caballos y animales de compañía, tales como perros o gatos. Puede identificarse un sujeto que necesita tratamiento mediante el diagnóstico de una neoplasia potencialmente maligna.

Un grupo de tratamiento particularmente preferido incluye sujetos que no pueden recibir tratamientos convencionales contra el cáncer tales como cirugía, terapia de radiación o quimioterapia. Un paciente con cáncer metastásico o en riesgo de metástasis del cáncer puede no ser capaz de someterse a determinados tratamientos contra el cáncer debido a otros diagnósticos, condiciones físicas o complicaciones. Por ejemplo, una mujer embarazada no puede recibir terapia de radiación debido al riesgo de dañar al feto. Es posible que los pacientes ancianos o debilitados, tales como los que experimentan caquexia del cáncer, no sean buenos candidatos para la cirugía debido al riesgo de no sobrevivir a un procedimiento invasivo. Es probable que los pacientes que ya tienen un sistema inmunitario comprometido o una infección crónica no puedan recibir quimioterapia ya que muchos fármacos de quimioterapia dañar el sistema inmunitario.

Los anticuerpos anti-AGE pueden usarse en los procesos de purificación celular, tales como inmunocribado e inmunoadsorción. Los procesos de purificación son útiles para aislar células deseables o no deseadas de los cultivos de tejidos, cultivos celulares o sangre. La purificación celular puede usarse en trasplantes, tales como trasplante de médula ósea, o transfusiones, tales como transfusión de sangre. La purificación celular es especialmente útil en el trasplante de células madre autólogas durante la quimioterapia para eliminar las células malignas metastásicas y concentrar las células madre beneficiosas. El inmunocribado o inmunoadsorción usando un anticuerpo anti-AGE puede aislar cáncer metastásico, de un cultivo de tejido, cultivo celular o muestra de sangre.

Los anticuerpos anti-AGE también pueden usarse para diagnosticar metástasis de cáncer. Un complejo inmunitario (también conocido como complejo de anticuerpo-antígeno) que incluye un anticuerpo anti-AGE unido a la célula cancerosa metastásica que expresa proteínas modificadas por AGE es un analito único que puede predecir o indicar un cáncer metastásico. La unión específica de los anticuerpos anti-AGE a las células cancerosas metastásicas pueden permitir la detección de metástasis de cáncer a niveles subclínicos. Los anticuerpos anti-AGE de diagnóstico pueden usarse para detectar células cancerosas metastásicas en circulación que presentan riesgo de metástasis en una nueva ubicación. De manera alternativa, los anticuerpos anti-AGE de diagnóstico pueden usarse para analizar células obtenidas de una ubicación específica para determinar la presencia de células cancerosas metastásicas. Una biopsia puede implicar recolectar células de una parte específica del cuerpo que presenta un riesgo conocido de acumulación de células cancerosas metastásicas, tales como los ganglios linfáticos, pulmones, hígado, cerebro o huesos, o de una parte del cuerpo donde se sospecha la presencia de metástasis debido a otros síntomas, tales como un bulto sospechoso. Los anticuerpos anti-AGE pueden usarse en cualquier método de diagnóstico que emplee anticuerpos para la detección de un analito de interés. Por ejemplo, puede detectarse un complejo inmunitario usando una técnica de formación de imagen adecuada después de colocar un marcador en los anticuerpos, tales como un marcador fluorescente o radiomarcador; usando técnicas citológicas tales como inmunofluorescencia, citometría de flujo o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés); usando técnicas bioquímicas tales como inmunoensayos, especialmente ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), transferencia Western o inmunoprecipitación; o usando técnicas de purificación celular tales como el inmunocribado.

La Figura 2 ilustra un kit 200 para diagnosticar metástasis de cáncer. El kit puede incluir un anticuerpo anti-AGE 210, un control 220 y, opcionalmente, un reactivo 230 para detectar el anticuerpo anti-AGE. El anticuerpo anti-AGE, el control y el reactivo opcional pueden proporcionarse en cualquier recipiente adecuado, tales como botellas, ampollas, envoltorios, tubos de ensayo, viales, matraces o jeringas. El anticuerpo anti-AGE y/o el reactivo puede estar marcado opcionalmente, tales como con un marcador fluorescente, un radiomarcador o partícula de oro. El control puede ser suero normal de un animal en el cual se elaboró el anticuerpo secundario, una solución que contiene una cantidad conocida de una proteína o péptido modificado por AGE o células fijas o conservadas que exhiben una modificación de AGE. Los ejemplos de reactivos para detectar el anticuerpo anti-AGE incluyen anticuerpos secundarios, tales como un anticuerpo policlonal anti-humano elaborado en un burro y marcado con rodamina. El kit puede alojarse opcionalmente en un recipiente 240. El kit puede incluir opcionalmente instrucciones impresas 250. Preferentemente, el contenido del kit es estéril y está listo para su uso.

El kit puede incluir opcionalmente un recipiente para alojar los ingredientes del kit. El recipiente puede estar hecho de un material rígido duradero, tales como plástico, o puede ser flexible, tales como una bolsa o caja blanda.

El kit puede incluir opcionalmente instrucciones para su uso. Las instrucciones pueden proporcionarse como instrucciones impresas o en formato electrónico, tales como en una memoria de bus de serie universal (USB, por sus siglas en inglés), en una tarjeta digital segura (SD, por sus siglas en inglés), o en un servidor en internet y a las que se puede acceder a través de un código de respuesta rápida (QR, por sus siglas en inglés).

Los kits pueden contener opcionalmente materiales o equipos de diagnóstico adicionales tales como tampones, fijadores, soluciones bloqueadoras, inhibidores de proteasa, sustratos para análisis tales como portaobjetos y/o cubreobjetos de microscopio, placas de microtitulación y reactivos de extracción celular tales como detergentes y soluciones detergentes.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 1 se muestra a continuación: 10 20 30 40 50

MNLLLILTFV AAAVAQVQLL QPGAELVKPG ASVKLACKAS GYLFTTYWMH

60 70 80 90

WLKQRPGQGL EWIGEISPTN GRAYYNARFK SEATLTVDKS

100 110 120 130

SNTAYMQLSS LTSEASAVYY CARAYGNYEF AYWGQGTLVT

140 150 160 170

VSVASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV

180 190 200 210 220

TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS W TVPSSSLG TQTYICNVNH

230 240 250 260

KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP

270 280 290 300

PKPKDTLMIS RTPEVTCW V DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV

310 320 330 340

HNAKTKPREE QYNSTYRW S VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS

350 360 370 380 390

NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP

400 410 420 430

SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK

440 450 460

SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

Las posiciones 16-133 de la secuencia de aminoácidos anterior corresponde a la SEQ ID NO: 2. Las posiciones 46­ 50 de la secuencia de aminoácidos anterior corresponde a la SEQ ID NO: 41. Las posiciones 65-81 de la secuencia de aminoácidos anterior corresponde a la SEQ ID NO: 42. Las posiciones 114-122 de la secuencia de aminoácidos anterior corresponde a la SEQ ID NO: 43.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 3 se muestra a continuación:

10 20 30 40 50

MNLLLILTFV AAAV AD W M T QTPLSLPVSL GDQASISCRS RQSLVNSNGN

60 70 80 90 100

TFLQWYLQKP GQSPKLLIYK VSLRFSGVPD RFSGSGSGTD FTLKISRVEA

110 120 130 140 150

EDLGLYFCSQ STHVPPTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA

160 170 180 190

SW CLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD

200 210 220 230

STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC

Las posiciones 16-128 de la secuencia de aminoácidos anterior corresponde a la SEQ ID NO: 4. Opcionalmente, el resto de arginina (Arg o R) en la posición 128 de la SEQ ID NO: 4 puede omitirse. Las posiciones 39-54 de la secuencia de aminoácidos anterior corresponde a la SEQ ID NO: 44. Las posiciones 70-76 de la secuencia de aminoácidos anterior corresponde a la SEQ ID NO: 45. Las posiciones 109-117 de la secuencia de aminoácidos anterior corresponde a la SEQ ID NO: 46.

La secuencia de ADN que corresponde a la SEQ ID NO: 12 se muestra a continuación:

ATGGACCCCAAGGGCAGCCTGAGCTGGAGAATCCTGCTGTTCCTGAGCCTGGC

CTTCGAGCTGAGCTACGGCCAGGTGCAGCTGCTGCAGCCAGGTGCCGAGCTC

GTGAAACCT GGCGCCT CT GT G AAGCTGGCCT GCAAGGCTT CCGGCT ACCT GTT

CACCACCT ACTGGAT GCACT GGCT GAAGCAG AGGCCAGGCCAGGGCCT GGAA

TGGAT CGGCGAGAT CT CCCCCACCAACGGCAG AGCCT ACT ACAACGCCCGGTT

CAAGTCCGAGGCCACCCT G ACCGT GGACAAGT CCT CCAACACCGCCT ACAT GC

AGCTGTCCTCCCTGACCTCTGAGGCCTCCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGCT

TACGGCAACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTC

TGTGGCTAAGACCACCCCTCCCTCCGTGTACCCTCTGGCTCCTGGCTGTGGCG

ACACCACCGGATCCTCTGTGACCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGGCTACTTCCCT

GAGTCCGTGACCGTGACCTGGAACTCCGGCTCCCTGTCCTCCTCCGTGCACAC

CTTT CCAGCCCT GCTGCAGT CCGGCCT GT ACACCAT GT CCT CCAGCGT GACAG

TGCCCTCCT CCACCT GGCCTTCCCAG ACCGT GACAT GCTCTGT GGCCCACCCT

GCCTCTTCCACCACCGTGGACAAGAAGCTGGAACCCTCCGGCCCCATCTCCAC

CAT CAACCCTTGCCCT CCCT GCAAAG AAT GCCACAAGT GCCCT GCCCCCAACC

TGGAAGGCGGCCCTT CCGT GTT CAT CTT CCCACCCAACAT CAAGGACGT GCT G

ATGATCTCCCTGACCCCCAAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCGAGGA

CGACCCT GACGT GCAGAT CAGTT GGTT CGTGAACAACGTGGAAGT GCACACCG

CCCAGACCCAGACACACAGAGAGGACT ACAACAGCACCAT CAGAGTGGT GT CT

ACCCTGCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGTCCGGCAAAGAATTCAAGTGCAA

AGT GAACAACAAGGACCTGCCCAGCCCC AT CG AGCGG ACCAT CT CCAAGAT CA

AGGGCCT CGTGCGGGCT CCCCAGGT GT ACATT CTGCCT CCACCAGCCGAGCA

GCTGTCCCGGAAGGATGTGTCTCTGACATGTCTGGTCGTGGGCTTCAACCCCG

GCGACATCTCCGTGGAATGGACCTCCAACGGCCACACCGAGGAAAACTACAAG

GACACCGCCCCT GTGCT GGACT CCGACGGCTCCT ACTT CAT CT ACT CCAAGCT

GAACAT GAAGACCT CCAAGT GGG AAAAGACCG ACT CCTT CT CCT GCAACGT GC

GGCACGAGGGCCT GAAG AACT ACT ACCT G AAG AAAACCAT CT CCCGGT CCCCC

GGCTAG

La secuencia de ADN que corresponde a la SEQ ID NO: 13 se muestra a continuación:

ATGG ACCCCAAGGG CAGCCT G AGCTGG AG AAT CCTG CTG TT CCT GAGCCTGGC

CTTCGAGCTGAG CTACG GCCAGGTGCAG CTGCTGCAG CCAGGTGCCGAG CTC

GT GAAACCT GGCGCCT CT GT GAAGCTGGCCT GCAAG G CTT CCGGCT ACCT GTT

CACCACCT ACT GGAT GCACT GGCT G AAG CAG AG G CCAG G CCAG G G CCT GGAA

TG G ATCG GCGAGATCTCCCCCACCAACGGCAGAGCCTACTACAACGCCCGGTT

CAAGTCCGAGGCCACCCTG ACCG TGGACAAGTCCTCCAACACCG CCTACATG C

AG CTGTCCTCCCTGACCTCTG AGG CCTCCG CCGTG TACTACTG CG CCAGAGCT

TACGGCAACT ACG AG TTCG CCT ACT GGG GCCAG G G CACCCT CGT GACAGT GT C

TGTGGCT AG CACCAAG G G CCCCAG CG T GTT CCCTCT GGCCCCCAGCAGCAAG

AG CACCAGCGGCGGAACCGCCG CCCTGGG CTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCC

CCG AGCCCGT GACCGT GT CCT GG AACAGCGGCGCT CT G ACCAG CG G AG TG CA

CACCTT CCCT G CCG TG CT GCAGAGCAGCGGCCT GTACT CCCT G AG CAGCGT G

GT GACCGT G CCCAGCAG CAGCCTG GGCACCCAG ACCT AC AT CTGCAACGT GAA

CCACAAG CCCTCCAACACCAAGGTGGACAAG AAG GTGGAGCCTAAGAGCTG C

GACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTG CTGG GCGGAC

CCAGCGTGTTCCTG TTCCCTCCCAAG CCCAAGGACACCCTGATG ATCAGCCGC

ACCCCCGAGGTGACCTGCGTGG TGGTGGACG TGAGCCACGAGGACCCCGAGG

TG AAGTTCAACTGGTACG TG GACGG CG TG GAGG TGCACAACGCCAAGACCAAG

CCTCGG GAGG AGCAG TACAACTCCACCTACCG CG TG GTGAG CG TG CTGACCG

TGCT GCACCAGG ACT GGCT G AACGGCAAGGAG T ACAAG TG CAAG G T GAGCAA

CAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAG AAG ACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAG

CCCCGG GAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGCGACG AGCTGACCA

AGAACCAGGT GAGCCT G ACCT GCCT GGT GAAGGG CTT CT ACCCCT CCGACAT C

GCCGTGGAGTGGGAGAG CAACGGCCAG CCTGAGAACAACTACAAGACCACCC

CT CCCGT GCTGG ACAGCG ACGGC AGCTT CTT CCT G TACAG CAAG CT GACCGT G

GACAAGT CCCGGT GGCAGCAGGG CAACGT GTT CAG CTG CAG CG T GATGCACG

AG GCCCTG CACAACCACTACACCCAG AAG AG CCTG AG CCTG AG CCCCG G ATA

G

La secuencia de ADN que corresponde a la SEQ ID NO: 14 se muestra a continuación:

AT G G AG ACCG ACACCCTG CT GCT CT G GG TGCT GCT GCT CT G G G TG CCCG G CT

CCACCGGAG AC G T CGT G AT GACCCAG ACCCCT CT G TC C C TG C C T GT G T CT CT G

G G C G AC C AG G C C TCC ATC TC C TG CC G G TC TAG AC AG TC C C TC G TG AAC TC CAA

CG G CAACACCTT CCTG C AG TG G T AT CTGCAG AAG CCCGG CCAG T CCCCCAAGC

TGCT GAT CT AC AAG G T GT CCCT GCGG TTCT CCG G CG TG CCCG AC AG ATTTT CC

G G C TC TG G C TC TG G C AC C G AC TTCAC CC TG AAG ATC TC C CG G G TG G AAG C C G A

G G ACCTG G G C CTG TAC TTC TG C AG C C AG TC C AC C C AC G TG C C CC C TAC ATTTG

G CG G AG G CAC C AAG C TG G AAATC AAAC G G G C AG ATG C TG C AC C AACTG TATCC

ATC TTCC C AC C ATC C AG TG AG C AG TTAAC ATC TG G AG G TG C CTC AG TC G TG TG C

TT CTT G AAC AAC TT CT ACCCCAAAG ACAT CAAT GT CAAGT GG AAG ATT GATGGC

AG T G AAC G AC AAAAT G G CG T CCT GAAC AG TTG G ACT G AT CAGG AC AG C AAAG A

CAG CACC TAC AG CATG AG CAG C AC C CTC AC G TTG ACC AAG G AC G AG TATG AAC

G ACATAACAG CT AT ACCT GT G AG G CCACT CAC AAG AC AT C AACTTCACCCATTG

T CAAG AG CTT C AACAG G AAT G AG T GTT GA

La secuencia de ADN que corresponde a la SEQ ID NO: 15 se muestra a continuación:

ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCT

CCACCGGAG ACGT CGT GAT G ACCCAGACCCCT CTGTCCCTGCCT GT GTCTCTG

GGCGACCAGGCCTCCATCTCCTGCCGGTCTAGACAGTCCCTCGTGAACTCCAA

CGGCAACACCTTCCTGCAGTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCAAGC

TGCT GAT CT ACAAGGT GT CCCT GCGGTT CT CCGGCGTGCCCGACAG ATTTT CC

GGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGA

GGACCTGGGCCTGTACTTCTGCAGCCAGTCCACCCACGTGCCCCCTACATTTG

GCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTT

CATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGT

GCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGA

CAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCC

AAGG ACAGCACCT ACAGCCT GAGCAGCACCCT G ACCCT G AGCAAGGCCGACT A

CGAGAAGCACAAGGT GT ACGCCT GCG AGGT GACCCACCAGGGACT GT CT AGC

CCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAA

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 16 se muestra a continuación:

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLLQPGAELVKPGASVKLACKASGYLFTTY

WMHWLKQRPGQGLEWIGEISPTNGRAYYNARFKSEATLTVDKSSNTAYMQLSSLT

SEASAVYYCARAYGNYEFAYWGQGTLVTVSVAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVT

LGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQT

DVLMISLTPKVTCVWDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRWS

TLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRK

DVSLTCLWGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKW

EKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPG*

El resto de alanina en la posición 123 de la secuencia de aminoácidos anterior puede reemplazarse opcionalmente con un resto de serina. El resto de tirosina en la posición 124 de la secuencia de aminoácidos anterior puede reemplazarse opcionalmente con un resto de fenilalanina. Las posiciones 25-142 de la secuencia de aminoácidos anterior corresponde a la SEQ ID NO: 20. La SEQ ID NO: 20 puede incluir opcionalmente sustituciones en las posiciones 123 y 124. La SEQ ID NO: 20 puede contener opcionalmente un resto de lisina adicional después del resto de valina terminal.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 17 se muestra a continuación:

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLLQPGAELVKPGASVKLACKASGYLFTTY

WMHWLKQRPGQGLEWIGEISPTNGRAYYNARFKSEATLTVDKSSNTAYMQLSSLT

SEASAVYYCARAYGNYEFAYWGQGTLVTVSVASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA

LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQT

YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS

RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL

TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 18 se muestra a continuación:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSRQSLVNSNGN

TFLQWYLQKPGQSPKLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYF

CSQSTHVPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDI

NVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHK

TSTSPIVKSFNRNEC*

Las posiciones 21-132 de la secuencia de aminoácidos anterior corresponde a la SEQ ID NO: 21.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 19 se muestra a continuación:

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSRQSLVNSNGN

TFLQWYLQKPGQSPKLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYF

CSQSTHVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREA

KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ

GLSSPVTKSFNRGEC*

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 22 se muestra a continuación: 10 20 30 40 50

A S T K G P S V F P L A P C S R S T S E S T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V

60 70 80 90 100

H T F P A V L Q S S G L Y S L S S W T V P S S N F G T Q T Y T C N V D H K P S N T K V D K T V E R

110 120 130 140 150

K C C V E C P P C P A P P V A G P S V F L F P P K P K D T L M IS R T P E V T C V W D V S H E D P

160 170 180 190

E V Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T F R W S V L T W H Q

200 210 220 230 240

D W L N G K E Y K C K V S N K G L P A P IE K T IS K T K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N

250 260 270 280 290

Q V S L T C L V K G F Y P S D IS V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P M L D S D G S F F L Y S K L T

300 310 320

V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A LH N H Y T Q K S L S LS P G K

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 23 es SYTMGVS.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 24 es TISSGGGSTYYPDSVKG.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 25 es QGGWLPPFAX, donde X puede ser cualquier aminoácido de origen natural.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 26 es RASKSVSTSSRGYSYMH.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 27 es LVSNLES.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 28 es QHIRELTRS.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 29 es

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTTY

WMHVWRQAPGQGLEWMGEISPTNGRAYYNQKFQGRVTMTVDKSTNTVYMELSS

LRSEDTAVYYCARAYGNYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA

ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQ

TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS

RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELKNQVSLT

CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

La secuencia de ADN que corresponde a la SEQ ID NO: 30 es

ATGGACCCCAAGGGCAGCCT G AGCTGG AGAAT CCT GCTGTT CCT GAGCCT GGC

CTTCGAGCTGAGCTACGGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTG

AAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACCTGTTC

ACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAAT

GG ATGGGCGAGAT CT CCCCT ACCAACGGCAG AGCCT ACT ACAACAG AAATT CC

AGGGCAGAGT G ACCAT GACCGTGG ACAAGT CCACCAACACCGT GT ACATGG AA

CT GT CCTCCCTGCGGAGCG AGGACACCGCCGT GT ACT ACTGCGCT AGAGCCT A

CGGCAACT ACGATT CGCCT ACTGGGGCCAGGGCACCCT CGT G ACAGT GT CCT C

TGCT AGCACCAAGGGCCCCAGCGT GTT CCCTCT GGCCCCCAGCAGCAAGAGC

ACCAGCGGCGGAACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGGAAGGACTACTTCCCCGA

GCCCGTGACCGT GTCCT GGAACAGCGGCGCT CT GACCAGCGGAGT GCACACC

TTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGA

CCGTGCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACA

AGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGAGCTGCGACAA

GACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCCGCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCG

TGTTCCTGTTCCCTCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCC

GAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAGTT

CAACT GGT ACGT GG ACGGCGTGGAGGT GCACAACGCCAAGACCAAGCCT CGG

GAGGAGCAGT ACAACTCCACCT ACCGCGTGGT G AGCGTGCT GACCGTGCTGC

ACCAGGACTGGCT GAACGGCAGG AGT ACAAGT GCAAGGT G AGCAACAAGGCC

CTGCCCGCTCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGG

AGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACAAGAACCAG

GTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGA

GTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTG

CT GGACAGCG ACGCAGCTT CTTCCT GT ACAGCAAGCT GACCGTGG ACAAGT CC

CGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGC

ACAACCACT ACACCCAGAAG AGCCT GAGCCT G AGCCCG G AT AGT AA.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 31 es

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTTY

WMHWVRQAPGQGLEWMGEISPTNGRAYYNAKFQGRVTMTVDKSTNTAYMELSS

LRSEDTAVYYCARAYGNYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA

ALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQ

RTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELKNQVSLT

CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

La secuencia de ADN que corresponde a la SEQ ID NO: 32 es

AT GGACCCC AAGGGCAGCCT G AGCT GG AGAAT CCT GCT GTT CCT GAGCCTGGC

CTT CGAGCT GAGCT ACGGCCAGGTGCAGCT GGT GCAGT CTGGCG CCG AAGT G

AAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACCTGTTC

ACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAAT

GGATGGGCGAGATCTCCCCTACCAACGGCAGAGCCTACTACAACCAAAATTCC

AGGGCAGAGTGACCATGACCGTGGACAAGTCCACCAACACCGCTTACATGGAA

CTGTCCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGAGCCTA

CGGCAACTACGATTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCCTC

TGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGC

ACCAGCGGCGGAACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGGAAGGACTACTTCCCCGA

GCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGCGCTCTGACCAGCGGAGTGCACACC

TTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGA

CCGTGCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACA

AGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGAGCTGCGACAA

GACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCCGCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCG

TGTT CCT GTTCCCTCCCAAGCCCAAGGACACCCT G AT GAT CAGCCGCACCCCC

GAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAGTT

CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGG

GAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGC

ACCAGGACTGGCTGAACGGCAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCC

CTGCCCGCTCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGG

AGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACAAGAACCAG

GTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGA

GTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTG

CT GGACAG CG ACGCAGCTT CTTCCT GT ACAGCAAGCT GACCGTGG ACAAGTCC

CGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGC

ACAACCACT ACACCCAG AAG AGCCT G AGCCT GAGCCCGG AT AGTAA.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 33 es

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTTY

WMHWVRQAPGQGLEWMGEISPTNGRAYYNAKFQGRVTMTVDKSINTAYMELSRL

RSDDTAVYYCARAYGNYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA

LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQT

TPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLH

QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELKNQVSLTC

LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV

FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.

La secuencia de ADN que corresponde a la SEQ ID NO: 34 es

ATGGACCCCAAGGGCAGCCTGAGCTGGAGAATCCTGCTGTTCCTGAGCCTGGC

CTTCGAGCT GAGCT ACGGCCAGGTGCAGCTGGT GCAGT CT GGCGCCGAAGT G

AAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACCTGTTC

ACCACCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAAT

GGAT GGGCGAGAT CT CCCCT ACCAACGGCAG AGCCT ACT ACAACCAAAATT CC

AGGGCAGAGT G ACCAT GACCGTGG ACAAGTCCAT CAACACCGCTT ACAT GG AA

CTGTCCAGACTGCGGAGCGATGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGAGCCTA

CGGCAACTACGATTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACAGTGTCCTC

TGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGC

ACCAGCGGCGGAACCGCCGCCCT GGGCT GCCT GGGAAGGACT ACTTCCCCGA

GCCCGT GACCGT GT CCT GGAACAGCGGCGCT CT GACCAGCGGAGT GCACACC

TTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGA

CCGTGCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACA

AGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCTAAGAGCTGCGACAA

GACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCCGCCCCGAGCTGCTGGGCGGACCCAGCG

T GTT CCT GTT CCCT CCCAAGCCCAAGGACACCCT GAT GAT CAGCCGCACCCCC

GAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAGTT

CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGG

GAGGAGCAGT ACAACTCCACCT ACCGCGTGGT G AGCGT GCT GACCGTGCTGC

ACCAGGACTGGCT GAACGGCAGGAGT ACAAGTGCAAGGT GAGCAACAAGGCC

CTGCCCGCTCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGG

AGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACAAGAACCAG

GTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGA

GTGGGAGAGCAACGGCCAGCCT GAG AACAACT ACAAG ACCACCCCT CCCGT G

CTGGACAGCGACGCAGCTT CTT CCT GT ACAGCAAGCT GACCGTGG ACAAGTCC

CGGT GGCAGCAGGGCAACGT GTT CAGCT GCAGCGT GATGCACG AGGCCCTGC

ACAACCACT ACACCCAGAAG AGCCT G AGCCT G AGCCCGG AT AGT AA.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 35 es

METDTLLLVWLLLWVPGSTGDWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVNSNGNT

FLQWYQQRPGQSPRLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY

CSQSTHVPPTFGGGTVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK

VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG

LSSPVTKSFNRGEC.

La secuencia de ADN que corresponde a la SEQ ID NO: 36 es

ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCT

CCACCGG AG ACGT CGTG AT G ACCC AGT CCCCT CTGTCCCTGCCTGT G ACCCT G

GGACAGCCTGCCT CCAT CTCCT CAG ATCCT CCCAGT CCCT CGT GAACT CCAAC

GGCAACACCTTCCTGCAGTGGTATCAGCAGCGGCCTGGCCAGAGCCCCAGAC

TGCTGATCTACAAGGTGTCCCTGCGGTTCTCCGGCGTGCCCGACGATTTTCCG

GCTCTGGCT CTGGCACCGACTT CACCCT G AAGAT CTCCCGGGT GGAAGCCG AG

GACGTGGGCGT GT ACT ACT GCT CCCAG AGCACCCACGT GCCCCCT ACATTT GG

CGGAGGCACCAAGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCA

TCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCT GAAGT CT GGCACCGCCAGCGTGGT GTG

CCT GCT GAACAACTT CT ACCCCCGCG AGGCCAAGGGCAGT GGAAGGTGGACA

ACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAA

GGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTAC

GAGAAGACAAGGT GT ACGCCTGCGAGGT G ACCCACCAGGGACT GT CT AGCCC

CGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAA.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 37 es

METDTLLLW VLLLWVPGSTGDW MTQSPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVNSNGN

TFLQWYQQRPGQSPRLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY

YCSQSTHVPPTFGGGTVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW CLLNNFYPREA

KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ

GLSSPVTKSFNRGEC.

La secuencia de ADN que corresponde a la SEQ ID NO: 38 es

ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCT

CCACCGGAGACGTCGTGATGACCCAGTCCCCTCTGTCCCTGCCTGTGACCCTG

GGACAGCCTGCCTCCATCTCCTCAGATCCAGGCAGTCCCTCGTGAACTCCAAC

GGCAACACCTTCCTGCAGTGGTATCAGCAGCGGCCTGGCCAGAGCCCCAGAC

TGCTGATCTACAAGGTGTCCCTGCGGTTCTCCGGCGTGCCCGACGATTTTCCG

GCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAG

GACGT GGGCGT GT ACT ACT GCT CCCAG AGCACCCACGT GCCCCCT ACATTTGG

CGGAGGCACCAAGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCA

TCTT CCCTCCCAGCGACGAGCAGCT GAAGT CT GGCACCGCCAGCGT GGT GT G

CCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGGCAGTGGAAGGTGGACA

ACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAA

GGACAGCACCT ACAGCCT GAGCAGCACCCT G ACCCT G AGCAAGGCCGACT AC

GAGAAGACAAGGT GT ACGCCT GCG AGGT G ACCCACCAGGGACT GT CT AGCCC

CGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAA.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 39 es

METDTLLLVW LLLWVPGSTGDW MTQSPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVNSNGN

TFLQWYHQRPGQPPRLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGAGKDFTLKISRVEAEDVGVY

YCSQSTHVPPTFGQGTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW CLLNNFYPREA

KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ

GLSSPVTKSFNRGEC.

La secuencia de ADN que corresponde a la SEQ ID NO: 40 es

ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGCT

CCACCGGAGACGT CGT G AT G ACCCAGT CCCCT CT GT CCAGT CCT GT G ACCCT G

GGACAGCCTGCCTCCAT CT CCT CAG AT CCT CCCAGT CCCT CGTG AACT CCAAC

GGCAACACCTTCCTGCAGTGGTATCACCAGCGGCCTGGCCAGCCTCCCAGACT

GCTGATCTACAAGGTGTCCCTGCGGTTCTCCGGCGTGCCCGACGA1 rCCGG

CTCTGGCGCTGGCAAGGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAG

GACGTGGGCGTGTACTACTGCTCCCAGAGCACCCACGTGCCCCCTACATTTGG

CCAGGGCACCAACTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCA

T CTT CCCT CCCAGCGACGAGCAGCT GAAGT CT GGCACCGCCAGCGT GGTGTG

CCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGGCAGTGGAAGGTGGACA

ACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAA

GGACAGCACCT ACAGCCT GAGCAGCACCCT G ACCCT G AGCAAGGCCG ACT AC

GAG AAG ACAAGGT GT ACGCCT GCG AGGT G ACCC ACCAGGG ACT GTCT AGCCC

CGT GACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGT GCT AA.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 47 es

MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLLQPGAELVKPGASVKLACKASGYLFTTYWMHW

LKQRPGQGLEWIGEISPTNGRAYYNARFKSEATLTVDKSSNTAYMQLSSLTSEASA

VYYCARSFGNYEFAYWQGTLVTVSVASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK

DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN

HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT

CVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL

NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVLTCLVKGF

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

MHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 48 es

MGWTLVFLFLLSVTAGVHSEVQLLESGAEAKKPGASVKLSCKASGYLFTTYW MHW

VHQAPGQRLEW MGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDT

AVYYCARSFGNYEFAYW QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV

KDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNV

M_{IN ]}u _{! r}i/ _\n _r c _o M _{i N}T _i i _r/ _xx _v/n _ui _i/l _M/x _W/C _L D _r I _f/ _xO _{i j}r _un _{i j}i _i/ _xTU _{i i}T _{i i}P _wD _i D _i r _vD _{^ > i}A _{r -}D _u C _I—I _I— I _I— r _v—;₁D ₁ C _{v_>}\ _v/C _i I _{i_} C _i D _I D _I K _{i \}’ _iD _I / _\ n _{i s} T _I I _L M _{t . n}I _wQR _\T _IP _I P _1—V _v/

TCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDW

LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVLTCLVKG

FYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 49 es

MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTTYWMH

WVRQAPGQRLEWIGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDT

AVYYCARSFGNYEFAYWQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV

KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV

NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV

TCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDW

LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVLTCLVKG

FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 50 es

MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYLFTTYWMH

VWRQAPGQGLEWMGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSED

TAVYYCARSFGNYEFAYWQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL

VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICN

VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE

VTCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQD

WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVLTCLV

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 51 es

M GW TLVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYLFTTYW MH

VW RQAPGQGLEW MGEISPTNGRAYYNARFKSRVTITRDTSINTAYMELSRLRSDD

TAVYYCARSFGNYEFAYW QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL

VKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLG TQ TYICN

VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPE

VTCVW DVSH EDPEVKFNW YVDG VEVH NAKTKPR EEQ YN STYR W SVLTVLHQ D

W LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVLTCLV

KGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 52 es

Q VQ LLQ PG AELVKPG ASVKLACKASG YLFTTYW M HW LKQ RPG Q G LEW IG EISPTN

G RAYYNARFKSEATLTVDKSSNTAYM Q LSSLTSEASAVYYCARSFG NYEFAYW G Q

GTLVTVSV.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 53 es

EVQ LLESG AEAKKPG ASVKLSCKASG YLFTTYW M HW VHQ APG Q RLEW M G EISPT

N G R AYYNARFKSRVTITVDKSASTAYM ELSSLRSEDTAVYYCARSFG NYEFAYW G

QGTLVTVSS.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 54 es

QVQLVQSG AEVKKPG ASVKVSCKASG YLFTTYW M HW VRQ APG Q RLEW IG EISPT

NG RAYYNARFKSRVTITRDTSASTAYM ELSSLRSEDTAVYYCARSFG NYEFAYW G

QGTLVTVSS.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 55 es

Q VQ LVQSG AEVKKPGSSVKVSCKASG YLFTTYW M HW VRQAPGQG LEW M GEISP

TNGRAYYNARFKSRVTITADKSTSTAYM ELSSLRSEDTAVYYCARSFGNYEFAYW

GQGTLVTVSS.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 56 es

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYLFTTYW M HW VRQAPGQGLEW M GEISP

TNGRAYYNARFKSRVTITRDTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFGNYEFAYW G

QGTLVTVSS.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 57 es

M VSSAQFLGLLLLCFQGTRCDW MTQTPLSLPVSLGDQASISCRSRQSLVNSNGNT

FLQWYLQKPGQSPKLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYF

CSQSTHVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW CLLNNFYPREA

KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ

GLSSPVTKSFNRGEC.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 58 es

MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVNSNGNT

FLQWLQQRPGQPPRLLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLTISRVEAEDVGIYF

CSQSTHVPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW CLLNNFYPREA

KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ

GLSSPVTKSFNRGEC.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 59 es

M VSSAQ FLG LLLLC FQ G TR C DIVM TQ TPLSLSVTPG Q PASISCR SRQ SLVN SN G N T

FLQ W YLQ KPG Q SPQ LLIYKVSLR FSG VPD RFSG SG SG TD FTLKISR VEPED VG VYY

CSQ STHVPPTFG G G TKVEVKRTVAAPSVFIFPPSD EQ LKSG TAS W C L L N NFYPRE

AKVQ W KVD N ALQ SG N SQ ESVTEQ D SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYAC EVTH

Q G LSSPVTKSFNRGEC.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 60 es

M VSSAQ FLG LLLLCFQ G TRCDW M TQ SPLSLPVTLG Q PASISCRSRQ SLVNSNG NT

FLQ W FQQRPGQSPRRLIYKVSLRFSGVPDRFSGSGSDTDFTLRISRVEAEDVGLYY

C SQ STHVPPTFG Q G TKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSG TASW CLLNNFYPREA

KVQW KVDNALQSG NSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ

GLSSPVTKSFNRGEC.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 61 es

M VSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVM TQTPLSLSVTPGQPASISCRSRQSLVNSNGNT

FLQW LLQKPGQPPQLLIYKVSLRFSGVPNRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYY

CSQSTHVPPTFG G G TKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSG TASW CLLNNFYPREA

KVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ

GLSSPVTKSFNRGEC.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 62 es

DW M TQTPLSLPVSLG DQ ASISCRSRQSLVNSNGNTFLQ W YLQKPGQSPKLLIYKV

SLRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTHVPPTFGGGTKLEIK.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 63 es

DIVM TQTPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQW LQQRPGQPPRLLIYKV

SLRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLTISRVEAEDVGIYFCSQSTHVPPTFGQGTKVEIK.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 64 es

DIVM TQTPLSLSVTPGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQW YLQKPGQSPQLLIYKV

SLRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEPEDVGVYYCSQSTHVPPTFGG GTKVEV

K.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 65 es

DW MTQSPLSLPVTLGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQW FQQRPGQSPRRLIYK

VSLRFSGVPDRFSGSGSDTDFTLRISRVEAEDVGLYYCSQSTHVPPTFGQGTKLEI

K.

La secuencia de aminoácidos de una letra que corresponde a la SEQ ID NO: 66 es

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSRQSLVNSNGNTFLQW LLQKPGQPPQLLIYKV

SLRFSGVPNRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCSQSTHVPPTFGGGTKVEIK.

Ejemplos

Ejemplo 1: Estudio in vivo de la administración del anticuerpo anti-producto final de glicación. Este ejemplo muestra que el anticuerpo anti-AGE que puede dirigirse a la célula tiene proteínas modificadas por AGE en la superficie celular. Aunque las células consideradas en este estudio son células senescentes, pueden considerarse como modelo de células cancerosas metastásicas.

Para examinar los efectos de un anticuerpo anti-producto final de glicación, el anticuerpo se administró al ratón envejecido CD1(ICR) (Charles River Laboratories), dos veces al día mediante inyección intravenosa, una vez a la semana, durante tres semanas (Días 1, 8 y 15), seguido de un período de 10 semanas sin tratamiento. El anticuerpo de prueba fue un anticuerpo anti-producto final de glicación de ratón disponible en el mercado generado contra la carboximetil lisina conjugada con hemocianina de lapa californiana, el MAb de carboximetil lisina (Clon 318003) disponible de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN; n.° de catálogo MAB3247). Se utilizó una referencia de control de suero fisiológico en los animales de control.

Los ratones denominados “jóvenes” tenían 8 semanas de edad, mientras que los ratones denominados “viejos” tenían 88 semanas (± 2 días) de edad. No se observaron eventos adversos de la administración del anticuerpo. Los diferentes grupos de animales utilizados en el estudio se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: Los diferentes grupos de animales utilizados en el estudio

Se cuantificó el ARNm de P16INK4a, un marcador para las células senescentes, en el tejido adiposo de los grupos mediante qPCR en tiempo real. Los resultados se muestran en la Tabla 2. En la tabla AACt = ACt Grupo de control promedio (2) - ACt Grupo experimental promedio (1 o 3 o 5); Veces de expresión= 2 -AACt.

Tabla 2. ARNm de P16INK4a cuantificado en el tejido adiposo

La tabla anterior indica que los ratones viejos no tratados (Grupo de Control 2) expresan 2,55 veces más ARNm de p16Ink4a que los ratones jóvenes no tratados (Grupo de Control 1), tales como se esperaba. Esto se observó al comparar los ratones viejos no tratados del Grupo 2 sometidos a eutanasia el final del Día 85 de recuperación con los ratones jóvenes no tratados del Grupo 1 sometidos a eutanasia el final del Día 22 de tratamiento. Cuando se compararon los resultados de los ratones viejos no tratados del Grupo 2 con los resultados de los ratones viejos tratados del Grupo 3 sometidos a eutanasia el Día 85, se observó que el ARNm de p16Ink4a era 1,23 veces mayor en el Grupo 2 que en el Grupo 3. Por lo tanto, el nivel de la expresión del ARNm de p16Ink4a fue menor cuando los ratones viejos se trataron con 2,5 pg/gramo/BID/semana del anticuerpo.

Cuando se compararon los resultados de los ratones viejos no tratados del Grupo 2 (Control) con los resultados de los ratones viejos tratados del Grupo 5 (5 pg/gramo) sometidos a eutanasia el Día 22, se observó que el ARNm de p16Ink4a era 3,03 veces mayor en el Grupo 2 (controles) que en el Grupo 5 (5 pg/gramo). Esta comparación indicó que los animales del Grupo 5 tuvieron menores niveles de expresión del ARNm de p16Ink4a cuando fueron tratados con 5,0 pg/gramo/BID/semana, lo que proporciona niveles de expresión del ARNm de p16Ink4a comparables a los de los ratones jóvenes no tratados (es decir, Grupo 1). A diferencia de los ratones del Grupo 3 (2,5 pg/gramo) que se sometieron a eutanasia al final del Día 85 de recuperación, los ratones del Grupo 5 se sometieron a eutanasia al final del Día 22 de tratamiento.

Estos resultados indican que la administración del anticuerpo dio como resultado la destrucción de las células senescentes.

También se midió la masa del músculo gastrocnemio, para determinar el efecto de la administración del anticuerpo en la sarcopenia. Los resultados se presentan en la Tabla 3. Los resultados indican que la administración del anticuerpo aumentó la masa muscular en comparación con los controles, pero solo con la dosificación más elevada de 5,0 pg/g/BID/semana.

Tabla 3: Efecto de la administración del anticuerpo en la masa del músculo gastrocnemio

Peso con respecto a la

ⁿ Peso absoluto del

Grupo ^Informació

_Resumida músculo gastrocnemio masa corporal del

músculo gastrocnemio

1 Promedio 0,3291 1,1037

SD 0,0412 0,1473

N 20 20

2 Promedio 0,3304 0,7671

SD 0,0371 0,1246

N 20 20

3 Promedio 0,3410 0,7706

SD 0,0439 0,0971

N 19 19

5 Promedio 0,4074 0,9480

SD 0,0508 0,2049

N 9 9

Estos resultados demuestran que la administración de anticuerpos que se unen a los AGE de una célula dan como resultado la reducción de células que expresan p16Ink4a, un biomarcador de senescencia. Los datos muestran que la reducción de células senescentes conduce directamente a un aumento en la masa muscular en ratones envejecidos. Estos resultados indican que la pérdida de masa muscular, un signo clásico de sarcopenia, puede tratarse mediante la administración de anticuerpos que se unen a los AGE de una célula. Los resultados sugieren que la administración de los anticuerpos sería eficaz para tratar las metástasis del cáncer al eliminar las células senescentes.

Ejemplo 2: Afinidad y cinética del anticuerpo de prueba

La afinidad y cinética del anticuerpo de prueba utilizado en el Ejemplo 1 se analizaron usando sal de trifluoroacetato de Na,Na-bis(carboximetil)-L-lisina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como sustrato modelo para una proteína modificada por AGE de una célula. Se realizó un análisis de interacción sin etiqueta en un BIACORE™ T200 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA), usando un chip sensor CM5 de serie S (GE Healthcare, Pittsburgh, PA), con Fc1 fijado como blanco, y Fc2 inmovilizado con el anticuerpo de prueba (peso molecular de 150.000 Da). El tampón de ejecución era un tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y P-20 al 0,05 %, pH de 7,4), a una temperatura de 25 °C. El software fue el software de evaluación BIACORE™ T200, versión 2.0. Se utilizó una referencia doble (Fc2-1 e inyección de tampón solo) en el análisis, y los datos se ajustaron a un modelo de unión de Langmuir 1:1.

Tabla 4: Configuración experimental de análisis de afinidad y cinética

Una gráfica de la respuesta en función del tiempo se ilustra en la Figura 1. Se determinaron los siguientes valores del análisis: ka (1/Ms) = 1,857 x 103; kd (1/s) = 6,781 x 10-3; Kd (M) = 3,651 x 10-6; Rmáx (RU) = 19,52; y Chi2 = 0,114. Dado que el valor de Chi2 del ajuste es menor que 10 % de Rmáx, el ajuste es fiable.

Ejemplo 3: Construcción y producción del anticuerpo de IgG2b anti-AGE murino y anticuerpo de IgG1 anti-AGE quimérico

Se prepararon anticuerpos anti-AGE quiméricos humanos y murinos. La secuencia de ADN de la cadena pesada del anticuerpo de IgG2b anti-AGE murino se muestra en la SEQ ID NO: 12. La secuencia de ADN de la cadena pesada del anticuerpo de IgG1 anti-AGE humano quimérico se muestra en la SEQ ID NO: 13. La secuencia de ADN de la cadena ligera kappa del anticuerpo anti-AGE murino se muestro en la SEQ ID NO: 14. La secuencia de ADN de la cadena ligera kappa del anticuerpo anti-AGE humano quimérico se muestra en la SEQ ID NO: 15. Las secuencias génicas se sintetizaron y se clonaron en vectores de mamíferos de alta expresión. Las secuencias se optimizaron mediante codones. Las construcciones completadas se confirmaron mediante secuencias antes de proceder a la transfección.

Se sembraron células HEK293 en un matraz de agitación un día antes de la transfección y se cultivaron usando un medio sin suero definido químicamente. Las construcciones de expresión de ADN se transfectaron de forma transitoria en 0,03 litros de células HEK293 en suspensión. Después de 20 horas, las células se muestrearon para obtener las viabilidades y conteos de células viables, y se midieron las titulaciones (Octet QKe, ForteBio). Se tomaron lecturas adicionales a través de las cadenas de producción de transfección transitoria. Los cultivos se cosecharon el día 5 y se midió la densidad celular, viabilidad y titulación de una muestra adicional para cada uno.

El medio acondicionado para anticuerpos anti-AGE murino y quimérico se cosechó y se clarificó de las cadenas de producción de transfección transitoria mediante centrifugación y filtración. Los sobrenadantes se colocaron en una columna de Proteína A y eluyeron con un tampón de bajo pH. Se realizó la filtración usando un filtro de membrana de 0,2 |jm antes de separar en alícuotas. Después de la purificación y filtración, se calcularon las concentraciones de proteína de la OD280 y el coeficiente de extinción. Se muestra un resumen de los rendimientos y alícuotas en la Tabla 5:

Tabla 5. Rendimientos y alícuotas

La pureza del anticuerpo se evaluó mediante análisis de dodecil sulfato sódico de electroforesis capilar (CE-SDS) usando LabChip® GXII (PerkinElmer).

Ejemplo 4: Unión de anticuerpos anti-AGE murino (original) y quimérico

La unión de los anticuerpos anti-AGE murino (original) y quimérico descritos en el Ejemplo 3 se investigó mediante ELISA de unión directa. Un anticuerpo anti-carboximetil lisina (CML) (R&D Systems, MAB3247) se utilizó como control. CML se conjugó con KLH (CML-KLH) y tanto CML como CML-KLH se recubrieron durante la noche en una placa de ELISA. Se utilizó Fc anti-ratón de HRP-cabra para detectar los anticuerpos anti-AGE de control y murino (original). Se utilizó Fc anti-humano de HRP-cabra para detectar el anticuerpo anti-AGE quimérico.

Los antígenos se diluyeron hasta 1 jg/m l en 1x tampón de fosfato a pH 6,5. Una placa de ELISA de microtitulación de 96 pocillos se recubrió con 100 jl/pocillo del antígeno diluido y se dejó reposar a 4 °C durante la noche. La placa se bloqueó con 1x PBS, BSA al 2,5 % se dejó reposar durante 1-2 horas la mañana siguiente a temperatura ambiente. Las muestras de anticuerpo se prepararon en diluciones en serie con 1x PBS, BSA al 1 % con la concentración de partida de 50 jg/ml. Los anticuerpos secundarios se diluyeron 1:5000. Se aplicaron 100 j l de las diluciones de anticuerpo a cada pocillo. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 0,5-1 hora en un agitador de microplacas. La placa se lavó 3 veces con 1x PBS. Se aplicaron 100 jl/pocillo del anticuerpo secundario Fc anti­ humano de cabra conjugado con HRP diluido a los pocillos. La placa se incubó durante 1 hora en un agitador de microplacas. Luego la placa se lavó 3 veces con 1x PBS. Se agregaron 100 j l de sustrato de TMB de HRP a cada pocillo para desarrollar la placa. Después del transcurso de 3-5 minutos, la reacción finalizó al agregar 100 j l de HCl 1N. Se realizó un segundo ELISA de unión directa solamente con recubrimiento de CML. La absorbancia a DO450 se leyó usando un lector de microplacas.

Los datos en bruto de absorbancia a DO450 para ELISA de CML y CML-KLH se muestran en el mapa de placa a continuación. Se utilizaron 48 de los 96 pocillos en la placa de pocillos. Los pocillos en blanco en el mapa de placa indican pocillos no usados.

Mapa de placa de ELISA de CML y CML-KLH:

Conc. 1 2 3 4 5 6 7

R&D R&D

control Anti-AGE Anti-AGE Anti-AGE Anti-AGE positivo original quimérico control original quimérico positivo

Recubrimiento de CML-KLH Recubrimiento de CML

Los datos en bruto de absorbancia a DO450 para ELISA solo de CML se muestran en el mapa de placa a continuación. Se usaron 24 de los 96 pocillos en la placa de pocillos. Los pocillos en blanco en el mapa de placa indican pocillos no utilizados.

Mapa de placa de ELISA solo de CML:

Conc.

1 2 3 4 5 6 7

R&D

control Anti-AGE Anti-AGE

positivo original quimérico

Los anticuerpos anti-AGE de control y quimérico mostraron unión tanto a CML como a CML-KLH. El anticuerpo anti­ AGE murino (original) mostró unión muy débil a nula a CML o CML-KLH. Los datos de ELISA repetidos confirman la unión del anti-AGE de control y quimérico a CML. Todos los controles de tampón mostraron una señal negativa.

Ejemplo 5: Anticuerpos humanizados

Se diseñaron anticuerpos humanizados mediante la creación de múltiples secuencias híbridas que fusionan partes selectas de la secuencia de anticuerpo original (ratón) con las secuencias de marco humanas. Se identificaron marcos aceptores en función de la identidad de secuencia general a lo largo del marco, coincidencia de posición de interfaz, posiciones canónicas de CDR con clasificación similar y presencia de sitios de N-glicosilación deberían eliminarse. Tres cadenas ligeras humanizadas y tres cadenas pesadas humanizadas se diseñaron en función de dos marcos aceptores humanos de cadena ligera y pesada diferentes. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas se muestran en las SEQ ID NO: 29, 31 y 33, que están codificadas por las secuencias de ADN mostradas en las SEQ ID NO: 30, 32 y 34, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras se muestran en las SEQ ID NO: 35, 37 y 39, que están codificadas por las secuencias de ADN mostradas en las SEQ ID NO: 36, 38 y 40, respectivamente. Las secuencias humanizadas se analizaron de forma metódica visualmente y mediante modelado informático para aislar las secuencias que más probablemente retendrían la unión al antígeno. El objetivo es maximizar la cantidad de secuencia humana en los anticuerpos humanizados finales y al mismo tiempo retener la especificidad de anticuerpo. Las cadenas humanizadas ligera y pesada podrían combinarse para crear nueve anticuerpos variantes completamente humanizados.

Se analizaron las tres cadenas pesadas y las tres cadenas ligeras para determinar su carácter humano. Las puntuaciones del carácter humano del anticuerpo se calcularon de acuerdo con el método descrito en Gao, S. H., et al., “Monoclonal antibody humanness score and its applications”, BMC Biotechnology, 13:55 (5 de julio de 2013). El puntaje del carácter humano representa cuán humana parece una secuencia de región variable de anticuerpo. Para las cadenas pesadas una puntuación de 79 o mayor indica que presenta aspecto humano; para las cadenas ligeras una puntuación de 86 o mayor indica que presenta aspecto humano. El carácter humano de las tres cadenas pesadas, las tres cadenas ligeras, una cadena pesada original (ratón) y una cadena ligera original (ratón) se muestra a continuación en la Tabla 6:

Tabla 6: Carácter humano del anticuerpo

Se construyeron genes de anticuerpo de longitud completa al sintetizar primero las secuencias de región variable. Las secuencias se optimizaron para su expresión en células de mamífero. Estas secuencias de región variable después se clonaron en vectores de expresión que ya contienen dominios Fc humanos; para la cadena pesada, se utilizó la IgG1.

La producción a poca escala de anticuerpos humanizados se realizó mediante la transfección de plásmidos para las cadenas pesada y ligera en células HEK293 en suspensión usando medio químicamente definido sin suero. Se purificaron anticuerpos enteros en el medio acondicionado usando el medio de Proteína A MabSelect SuRe (GE Healthcare).

Se produjeron nueve anticuerpos humanizados de cada combinación de las tres cadenas pesadas que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 29, 31 y 33 y tres cadenas ligeras que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 35, 37 y 39. También se preparó un anticuerpo original quimérico de comparación. Los anticuerpos y sus titulaciones respectivas se muestran a continuación en la Tabla 7:

Tabla 7: Titulaciones de anticuerpo

Puede evaluarse la unión de los anticuerpos humanizados, por ejemplo, mediante ELISA de unión dependiente de la dosis o ensayo de unión basado en células.

Ejemplo 6 (profético): destrucción de células cancerosas metastásicas y tratamiento de cáncer metastásico

Los agregados de células de cáncer de ovario humanas (Creative BioArray, Shirley, NY) se inoculan i.p. en dos grupos (A y B) de ratones prkdcscid (SCID) con deficiencia de células T y B, específicamente ratones NSG disponibles de Jackson Laboratories (Farmington, CT). El Grupo A es un grupo de control al que se le inyectó suero fisiológico por vía intravenosa y al Grupo B se le inyectó por vía intravenosa 5 |jg por gramo por ratón de cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti-AGE descritos.

80 días después de la inoculación con células cancerosas, los ratones de ambos Grupos A y B se someten a examen general e histológico. Los ratones del grupo B tratados con anticuerpo tienen significativamente menos focos metastásico que los ratones de control del Grupo A.

Ejemplo 6: Estudio in vivo de la administración del anticuerpo monoclonal de carboximetil lisina

Se investigó el efecto del anticuerpo de carboximetil lisina en el crecimiento tumoral, el potencial metastásico y la caquexia. Se realizaron estudios in vivo en ratones usando un modelo tumoral de cáncer de mama murino. Los ratones hembras BALB/c (BALB/cAnNCrl, Charles River) tenían once semanas de edad el Día 1 del estudio.

Se cultivaron células tumorales de mama murinas 4T1 (ATCC CRL-2539) en medio RPMI 1640 que contiene suero fetal bovino al 10 %, glutamina 2 mM, 25 pg/ml de gentamicina, 100 unidades/ml de penicilina G Na y 100 pg/ml de sulfato de estreptomicina. Las células tumorales se mantuvieron en frascos de cultivo de tejido en una incubadora humidificada a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % y aire al 95 %.

Las células de cáncer de mama cultivadas después se implantaron en los ratones. Se cosecharon células 4T1 durante el crecimiento de fase logarítmica y se volvieron a suspender en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 1 x 106 células/ml el día del implante. Los tumores se iniciaron mediante implante subcutáneo de 1 x 105 células 4T1 (0,1 ml de suspensión) en el flanco derecho de cada animal de prueba. Los tumores se monitorizaron a medida que sus volúmenes se aproximaban a un intervalo objetivo de 80-120 mm3. El volumen tumoral se determinó usando la fórmula: volumen tumoral = (ancho del tumor)2(longitud del tumor)/2. Se aproximó el peso tumoral usando la suposición de que 1 mm3 de volumen tumoral tiene un peso de 1 mg. Trece días después del implante, indicado como Día 1 del estudio, los ratones se clasificaron en cuatro grupos (n=15/grupo) con volúmenes tumorales individuales que varían de 108 a 126 mm3 y un volumen tumoral medio de 112 mm3. Los cuatro grupos de tratamiento se muestran en la Tabla 8 a continuación:

Tabla 8: Grupos de tratamiento

Se usó un anticuerpo monoclonal de carboximetil lisina como el agente terapéutico. Se obtuvieron 250 mg del anticuerpo monoclonal de carboximetil lisina de R&D Systems (Minneapolis, MN). Las soluciones de dosificación del anticuerpo monoclonal de carboximetil lisina se prepararon a 1 y 0,5 mg/ml en un vehículo (PBS) para proporcionar las dosificaciones activas de 10 y 5 pg/g, respectivamente, en un volumen de dosificación de 10 ml/kg. Las soluciones de dosificación se almacenaron a 4 °C protegidas de la luz.

Todos los tratamientos se administraron por vía intravenosa (i.v.) dos veces al día durante 21 días, excepto el Día 1 del estudio donde a los ratones se le administró una dosis. El Día 19 del estudio, se cambió de dosificación i.v. a dosificación intraperitoneal (i.p.) para aquellos animales que no podían recibir dosis i.v. debido a degradación de la vena de la cola. El volumen de dosificación fue 0,200 ml por 20 gramos de peso corporal (10 ml/kg), y se ajustó al peso corporal de cada animal individual.

El estudio continuó durante 23 días. Los tumores se midieron usando calibres dos veces por semana. Los animales se pesaron diariamente los Días 1-5, luego dos veces por semana hasta la finalización del estudio. También se observaron los ratones para determinar cualquier efecto secundario. Se definió la toxicidad aceptable como un descenso de peso corporal promedio grupal de menos del 20 % durante el estudio y no más de 10 % de muertes relacionadas con el tratamiento. La eficacia del tratamiento se determinó usando datos del día final del estudio (Día 23).

La capacidad del anticuerpo anti-carboximetil lisina de inhibir el crecimiento tumoral se determinó al comparar el volumen tumoral mediano (MTV, por sus siglas en inglés) para los Grupos 1-3. El volumen tumoral se midió tales como se describió anteriormente. El porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (% de TGI) se definió como la diferencia entre el MTV del grupo de control (Grupo 1) y el MTV del grupo tratado con fármaco, expresado como un porcentaje del MTV del grupo de control. El % de TGI puede calcularse de acuerdo con la fórmula: % de TGI = (1-MTVtratado/MTVcontrol) x 100. La Figura 3 ilustra una gráfica del volumen tumoral normalizado durante el curso de un estudio in vivo que investiga el efecto de un anticuerpo anti-AGE en el crecimiento tumoral, el potencial metastásico y la caquexia.

La capacidad del anticuerpo anti-carboximetil lisina de inhibir la metástasis del cáncer se determinó al comparar los focos del cáncer de pulmón para los Grupos 1-3. El porcentaje de inhibición (% de inhibición) se definió como la diferencia entre el conteo medio de focos metastásicos del grupo de control y el conteo medio de focos metastásicos de un grupo tratado con fármaco, expresado como un porcentaje del conteo medio de focos metastásicos del grupo de control. El % de inhibición puede calcularse de acuerdo con la siguiente fórmula: % de inhibición = (1-recuento medio de focostratados/recuento medio de focoscontrol) x 100.

La capacidad del anticuerpo anti-carboximetil lisina de inhibir la caquexia se determinó al comparar los pesos de los pulmones y músculos gastrocnemio para los Grupos 1-3. Los pesos del tejido también se normalizaron a 100 g de peso corporal. La Figura 4 ilustra una gráfica del peso corporal normalizado de los ratones durante el curso de un estudio in vivo que investiga el efecto de un anticuerpo anti-AGE en el crecimiento tumoral, el potencial metastásico y la caquexia.

La efectividad del tratamiento también se evaluó mediante la incidencia y la magnitud de las respuestas de regresión observadas durante el estudio. El tratamiento puede provocar una regresión parcial (PR) o regresión completa (CR) del tumor en un animal. En una respuesta de PR, el volumen tumoral fue 50 % o menos del volumen en el Día 1 en tres mediciones consecutivas durante el curso del estudio, e igual o mayor que 13,5 mm3 en una o más de estas tres mediciones. En una respuesta de CR response, el volumen tumoral fue menor que 13,5 mm3 en tres mediciones consecutivas durante el curso del estudio.

El análisis estadístico se llevó a cabo usando Prism (GraphPad) para Windows 6.07. Los análisis estadísticos de las diferencias entre los volúmenes tumorales medios (MTV) del Día 23 de dos grupos se lograron usando la prueba U de Mann-Whitney. Las comparaciones de focos metastásicos se evaluaron mediante ANOVA-Dunnett. Los pesos de tejido normalizado se compararon mediante ANOVA. Se realizaron análisis estadísticos de dos colas con nivel de significancia P = 0,05. Los resultados se clasificaron como estadísticamente significativos o no estadísticamente significativos.

Los resultados del estudio se muestran a continuación en la Tabla 9:

Tabla 9: Resultados

Todos los regímenes de tratamiento se toleraron de manera aceptable sin muertes relacionadas con el tratamiento. Las únicas muertes animales fueron muertes no relacionadas con el tratamiento debido a metástasis. El % de TGI tuvo una tendencia hacia la significancia (P > 0,05, Mann-Whitney) para el grupo de tratamiento con 5 pg/g (Grupo 2) y 10 pg/g (Grupo 3). El % de inhibición tuvo una tendencia hacia la significancia (P > 0,05, ANOVA-Dunnett) para el grupo de tratamiento con 5 pg/g. El % de inhibición fue estadísticamente significativo (P < 0,01, ANOVA-Dunnett) para el grupo de tratamiento con 10 pg/g. La capacidad del anticuerpo de carboximetil lisina para tratar la caquexia tuvo una tendencia hacia la significancia (P > 0,05, ANOVA) en función de una comparación de los pesos de órganos del pulmón y gastrocnemio entre los grupos de tratamiento y el grupo de control. Los resultados indican que la administración de un anticuerpo monoclonal anti-carboximetil lisina puede reducir la metástasis del cáncer.

Ejemplo 7: Diagnóstico de cáncer metastásico (profético)

Un paciente con cáncer de mama exhibe ganglios linfáticos agrandados. Una oncóloga sospecha que el cáncer de mama ha hecho metástasis en sus ganglios linfáticos. La oncóloga obtiene una muestra de sangre así como también una biopsia de uno de sus ganglios linfáticos agrandados. Las células de la muestra de sangre y la biopsia se analizan para determinar la presencia de células cancerosas modificadas por AGE usando un kit que contiene un anticuerpo anti-AGE con etiqueta fluorescente y un control. La prueba de diagnóstico indica la presencia de células cancerosas modificadas por AGE en circulación en la sangre del paciente así como también la presencia de células cancerosas de cáncer de mama metastásico en los ganglios linfáticos. Una segunda tinción de las células para determinar la presencia de la nucleolina de superficie celular, un marcador de cáncer conocido, tales como se describe en la patente estadounidense n.° 7.541.150 concedida a Miller et al. confirma la presencia de células cancerosas.

Referencias

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Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un anticuerpo anti-AGE para su uso en el tratamiento de cáncer metastásico y/o en la prevención de metástasis de cáncer en un sujeto,

en donde el anticuerpo anti-AGE se une a una proteína modificada con carboximetil-lisina.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en humanos, ratones, ratas, cabras, ovejas, vacas, caballos, perros y gatos.

4. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto es un humano.

5. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo anti-AGE no es inmunogénico para una especie seleccionada del grupo que consiste en humanos, gatos, perros, caballos, camellos, alpacas, ganado vacuno, ovejas y cabras.

6. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto tiene cáncer metastásico.

7. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto no tiene cáncer metastásico.

8. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición está en forma de dosificación unitaria.

9. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

(a) el sujeto es un humano;

(b) el anticuerpo anti-AGE no es inmunogénico para una especie seleccionada del grupo que consiste en humanos, gatos, perros, caballos, camellos, alpacas, ganado vacuno, ovejas y cabras;

(c) el sujeto tiene cáncer metastásico; y

(d) la composición está en forma de dosificación unitaria.

10. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición está en forma de dosificación múltiple.

11. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición es estéril.

12. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo anti-AGE se une a una célula de cáncer metastásica que expresa una modificación AGE.

13. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo anti-AGE se une a una célula circulante que expresa una modificación AGE.

14. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto está embarazada.

15. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto se ha diagnosticado previamente con caquexia por cáncer.

16. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto tiene un sistema inmunológico comprometido.

17. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cáncer metastásico es cáncer de mama metastásico.