ES2203651T3 - Anticuerpos monoclonales especificos para productos finales de glicosilacion avanzada en muestras. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA PRODUCTOS FINALES DE GLUCOSILACION AVANZADA FORMADOS IN VIVO Y CON REACCION CRUZADA CON PRODUCTOS FINALES DE GLUCOSILACION AVANZADA FORMADOS IN VITRO, ASI COMO A METODOS DE DIAGNOSTICO Y DE TRATAMIENTO BASADOS EN LOS MISMOS. EN PARTICULAR, LA INVENCION SE REFIERE A UN ANTICUERPO MONOCLONAL, O A UN FRAGMENTO DE UNION A ANTIGENO DEL MISMO, QUE REACCIONA CON PRODUCTOS FINALES DE GLUCOSILACION AVANZADA PRODUCIDOS IN VIVO (AGE), CUYO ANTICUERPO MONOCLONAL O SU FRAGMENTO DE UNION A ANTIGENO PRESENTA UNA CARACTERISTICA DE UNION INMUNOLOGICA DE ANTICUERPOS MONOCLONALES SELECCIONADOS DEL GRUPO FORMADO POR 4G9 SEGUN ES PRODUCIDO POR EL HIBRIDOMA 4G9, DEPOSITADO EN LA AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION (ATCC) Y CON EL NUMERO DE ACCESO CRL 11626, 2G6 SEGUN ES PRODUCIDO POR EL HIBRIDOMA 2G6, DEPOSITADO EN LA AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION (ATCC) EL 19 DE DICIEMBRE DE 1995 Y CON EL NUMERO DE ACCESO HB 12008, Y BH4 SEGUN ES PRODUCIDO POR ELHIBRIDOMA BH4, DEPOSITADO EN LA AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION (ATCC) EL 29 DE DICIEMBRE DE 1995 Y CON EL NUMERO DE ACCESO ZZZ.

Description

Anticuerpos monoclonales específicos para productos finales de glicosilación avanzada en muestras.

Campo de la invención

La presente invención trata de anticuerpos monoclonales para productos finales de glicosilación avanzada y procedimientos de diagnóstico y terapia basados en éstos.

Antecedentes de la invención

La presente invención trata generalmente de la detección y medida de proteínas glicosiladas no enzimáticamente, y particularmente de procedimientos y materiales asociados para la detección y medida de proteínas que han sido glicosiladas no enzimáticamente in vivo.

Antes, se habían observado notables diferencias entre la reactividad, identidad química y características inmunológicas de productos finales de glicosilación avanzada que se producen in vivo y ciertos AGEs modelo que han sido caracterizados a lo largo de varios años anteriores.

Productos finales de glicosilación avanzada (AGEs)

La reacción entre glucosa y proteínas se conoce desde hace tiempo. Su manifestación más temprana fue en la aparición de pigmentos marrones al cocinar alimentos. En 1912, Maillard observó que la glucosa u otros azúcares reductores reaccionan con aminoácidos para formar aductos que experimentan una serie de deshidrataciones y reordenamientos para formar pigmentos marrones estables (Maillard, 1912, C. R. Acad. Sci. 154:66-68).

En los años siguientes al descubrimiento inicial de Maillard, los bromatólogos estudiaron la reacción hipotética en detalle y determinaron que los alimentos almacenados y termotratados experimentan un pardeo no enzimático como resultado de la reacción entre la glucosa y las cadenas de polipéptidos y que, de ese modo, las proteínas se reticulan y muestran una biodisponibilidad reducida. En este punto, se determinó que los pigmentos responsables del desarrollo del color marrón que se desarrolla como resultado de la glicosilación de proteínas poseía propiedades espectrales y fluorescentes características; sin embargo, la estructura química de los pigmentos no se ha elucidado específicamente.

Se descubrió que la reacción entre los azúcares reductores y las proteínas alimenticias tratada anteriormente tenía su análogo in vivo. De este modo, se ha demostrado que la reacción no enzimática entre la glucosa y los grupos amino libres en proteínas para formar un aducto 1-desoxi cetosilo amino estable, conocido como el producto de Amadori, ocurre con hemoglobina, en la que un reordenamiento del extremo amino de la cadena \beta de la hemoglobina por reacción con glucosa forma un aducto y proporciona un producto conocido como hemoglobina A_{1c}. También se ha descubierto que ocurren reacciones similares con una variedad de otras proteínas del cuerpo, como proteínas del cristalino, el colágeno y nerviosas (véase Bunn y col., 1975, Biochem. Biophys. Res. Commun. 67:103-109; Koening y col., 1975, J. Biol. Chem. 252:2992-2997; Monnier y Cerami, en Maillard Reaction in Food and Nutrition, ed. Waller, G. A., American Chemical Society 1983, pp, 431-448; y Monnier y Cerami, 1982, Clinics in Endocrinology and Metabolism 11:431-452).

Además, también se han observado in vivo los pigmentos marrones con propiedades espectrales y fluorescentes similares a los productos de Maillard en la última etapa en asociación con varias proteínas de larga vida, como las proteínas del cristalino y colágeno de los individuos ancianos. Se observó un aumento lineal relacionado con la edad en el pigmento en el colágeno de duramadre humano entre las edades de 20 a 90 años (véase Monnier y Cerami, 1981, Science 211:491-493; Monnier y Cerami, 1983, Biochem. Biophys. Acta 760:97-103; y Monnier y col., 1984. “Accelerated Age-Related Browning of Human Collagen in Diabetes Mellitus”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:583-587). De manera interesante, el envejecimiento del colágeno se puede imitar in vitro en un periodo de tiempo mucho más corto mediante reticulación y otras reacciones de glicosilación (o glicación) no enzimáticas inducidas mediante la incubación de proteínas y otras biomoléculas (por ejemplo, ADN y fosfolípidos) en solución con concentraciones relativamente elevadas de glucosa. Se teoriza que ocurre la captura de otras proteínas y la formación de ciertos aductos intramoleculares en el colágeno, también advertida, mediante una reacción de reticulación, y se cree que representa, por ejemplo, la acumulación que se observa de albúmina y anticuerpos en la membrana basal del riñón (véase Brownlee y col., 1983, J. Exp. Med. 158:1739-1744; y Kohn y col., 1984, Diabetes 33:57-59).

La glucosa y otros azúcares reductores se unen no enzimáticamente a los grupos amino de las proteínas de una manera que depende de la concentración. A lo largo del tiempo, estos aductos de Amadori iniciales pueden experimentar reordenamientos adicionales, deshidrataciones y reticulaciones con otros grupos de proteínas para acumularse como una familia de estructuras complejas que se denominan en lo sucesivo productos finales de glicosilación avanzada (AGEs). Se ha hecho un progreso sustancial hacia la elucidación de los roles biológicos y la importancia clínica de los productos finales de glicosilación avanzada, de modo que ahora se conoce que muchos de los estados hasta ahora atribuidos al proceso de envejecimiento o a los efectos patológicos de enfermedades como la diabetes, son atribuibles al menos en parte a la formación, acumulación y/o actividad de AGEs in vivo.

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Según se indicó anteriormente, los productos finales de glicosilación avanzada tienden a acumularse en moléculas con largas vidas medias, especialmente en condiciones de concentración de azúcar relativamente elevada. De este modo, la acumulación de AGE puede ser indicativa de la vida media de la proteína, de la concentración de azúcar, o de ambas. Estos factores tienen consecuencias importantes. Numerosos estudios han sugerido que los AGEs desempeñan un papel importante en la alteración estructural y funcional que ocurre durante el envejecimiento y en una enfermedad crónica. Además, los productos finales de glicosilación avanzada son conocidos por formarse más rápidamente en tejido diabético u otro tejido enfermo que en un tejido normal.

La “familia” de AGEs incluye especies que se pueden aislar y caracterizar por estructura química, siendo algunas bastante estables, mientras que otras son inestables o reactivas. La reacción entre los azúcares reductores y los grupos reactivos de proteínas puede iniciar el procedimiento de glicosilación avanzada. Este procedimiento comienza normalmente con una reacción reversible entre el azúcar reductor y el grupo susceptible en una proteína por ejemplo, para formar una base de Schiff, que procede a reordenarse para proporcionar el producto de reordenamiento de Amadori unido covalentemente. Una vez formado, el producto de Amadori experimenta reordenamientos y reacciones no enzimáticas adicionales para producir el compuesto modificado por AGE.

Recientemente, se ha informado de que la oxidación in vivo de lípidos se inicia en algunos casos mediante la reacción de lípidos para formar AGE de lípidos y AGE de lipoproteínas de baja densidad (LDL) (publicación internacional número WO 93/13421 de Bucala y col.). Más particularmente, como la oxidación in vivo de lípidos se relaciona con el inicio y el curso de ateriosclerosis, la medida de niveles de AGE de lípidos y/o AGE de LDL en mamíferos representa un procedimiento para diagnosticar la probabilidad o el comienzo de aterosclerosis, o medir el curso o gravedad de la enfermedad, o la eficacia de los tratamientos anti-AGE. La detección de AGE de lípidos o AGE de LDL (en particular, AGE de ApoB) se puede usar para diagnosticar o supervisar diabetes, así como para supervisar niveles de LDL y colesterol en suero.

Anticuerpos reactivos con AGEs

Se han hecho esfuerzos para desarrollar anticuerpos para AGEs formados in vivo. Por ejemplo, Nakayama y col. (1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 162:740-745) estudiaron AGEs unidos a proteínas y en particular, cultivaron antisueros contra AGE de hemocianina de lapa californiana (KLH) en cobayas. Estos antisueros mostraron una unión de alta afinidad, y se observó que las curvas de dilución en serie de AGE de albúmina de suero bovino (ASB), AGE de albúmina de suero humano (ASH) y AGE de ribonucleasa (Rnasa) eran análogas entre sí, sugiriendo que los antisueros reconocen una estructura en común entre estas proteínas modificadas por AGE. El tratamiento de AGEs con un agente reductor no disminuyó la inmunorreactividad, sugiriendo que los antisueros reconocieron un AGE, en lugar de una base de Schiff o un producto de Amadori. Sin embargo, Nakayama y col., no informan de la capacidad de sus antisueros para unirse a AGEs producidos in vivo, o de la producción de un anticuerpo monoclonal que tiene tales propiedades.

Horiuchi y col. (1991, J. Biol. Chem. 266:7329-32) prepararon anticuerpos policlonales y monoclonales contra albúmina de suero bovino-ASB. Se informó que estos anticuerpos reconocieron proteínas modificadas por AGE formadas in vitro. El tratamiento de estas proteínas modificadas por AGE con una gente reductor no tuvo efecto en la inmunorreactividad. En una publicación posterior (Araki y col., 1992, J. Biol. Chem. 267:10211-14), se analizaron supuestamente estos anticuerpos con el fin de determinar su reactividad con AGEs de proteínas cristalinas del lente.

Makita y col. (1992, J. Biol. Chem. 267:5133-38) informaron del desarrollo de un antisuero de conejo policlonal, que fue la primera identificación del desarrollo de anticuerpos reactivos con AGEs producidos in vivo (véase la publicación internacional número WO 93/13421). En particular, Makita y col. demostraron la capacidad de un antisuero de AGE de RNasa de conejo para unirse a tejidos de individuos diabéticos y de componentes del suero conocidos por contener niveles elevados de AGEs. Una publicación posterior (Makita y col., 1992, “Hemoglobin-AGE: A Circulating Marker of Advanced Glycosylation” Science 258:651-653) informó de la capacidad de estos anticuerpos para detectar hemoglobina modificada por AGE. La capacidad para medir hemoglobina modificada por AGE es valiosa para detectar la presencia de diabetes mellitus y el grado de control glicémico en los pacientes diabéticos, que es importante para supervisar el curso a largo plazo de esta enfermedad, para detectar la intensificación o empeoramiento de tales dolencias, o de manera alternativa, la mejora o disminución de la dolencia, que pueden ocurrir espontáneamente o junto con el tratamiento. Bucala y col. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6434-38) informaron que los anticuerpos de AGE de anti-RNasa de conejo también eran reactivos con AGEs de lípidos formados in vivo.

Aunque el desarrollo de sueros policlonales reactivos con AGEs formados in vivo llevó finalmente a la capacidad para detectar AGEs en muestras biológicas, sigue habiendo una necesidad en la técnica de anticuerpos monoclonales reactivos con AGEs producidos in vivo. Hay una necesidad adicional en la técnica de un anticuerpo monoclonal con mayor afinidad para unirse a AGEs o de AGEs específicos que la que se demuestra mediante los anticuerpos policlonales disponibles actualmente.

La cita de antecedentes en la presente memoria no debe interpretarse como una admisión de que tal es una técnica anterior a la presente invención.

Resumen de la invención

La presente invención se dirige a un anticuerpo monoclonal, o a un fragmento de éste de unión al antígeno, reactivo con productos finales de glicosilación avanzada (AGEs) producidos in vivo, particularmente cuando tales anticuerpos monoclonales o fragmentos de éstos de unión al antígeno demuestran una característica de unión inmunológica de un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo formado por anticuerpo monoclonal 4G9 como el producido por el hibridoma 4G9, depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA (ATCC) el 27 de abril, 1994, con número de acceso CRL 11626, y anticuerpo monoclonal 2G6 como el producido por el hibridoma 2G6, depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) el 19 de diciembre, 1995, con número de acceso HB 12008.

Más particularmente, dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de éste de unión al antígeno pueden tener una característica de unión inmunológica, cuya característica se selecciona del grupo formado por reactividad con proteínas de AGE del suero, AGEs de lípidos del suero, péptidos de AGE del suero, AGE de LDL, AGE de colágeno, y 6-(N-carboximetilamino)caproatos.

En un aspecto preferido, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado o uno quimérico murino-humano. También se incluyen las composiciones terapéuticas que incluyen el anticuerpo o fragmentos activos de éste, o agonistas y moléculas de la misma naturaleza, o alternativamente, antagonistas del mismo, y procedimientos de uso de tales composiciones en la prevención, diagnóstico o tratamiento de una dolencia usando estas composiciones, en las que se administra una cantidad efectiva de la composición a un paciente que necesita tal tratamiento.

El fragmento de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal puede ser un fragmento Fv de cadena sencilla, un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab), y un fragmento F(ab')_{2}, o cualquier otro fragmento de unión al antígeno.

En una realización específica, infra, el anticuerpo monoclonal o fragmento de éste es un anticuerpo de isotipo IgG murino; más particularmente, el anticuerpo monoclonal o fragmento de éste puede ser el anticuerpo monoclonal 4G9 como el producido por el hibridoma 4G9, depositado en la American Type Culture Collection (ATTC) con número de acceso CRL 11626, o anticuerpo monoclonal 2G6 como el producido por el hibridoma 2G6, depositado en la American Type Culture Collection el 19 de diciembre, 1995, con número de acceso HB 12008.

Naturalmente, la invención se extiende a los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales 4G9, y 2G6, cuyos hibridomas se depositan con la ATCC según se indicó anteriormente en la presente memoria.

El anticuerpo monoclonal de la invención se une ventajosamente a AGEs producidos in vivo. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se dirige a un procedimiento para detectar la presencia de productos finales de glicosilación avanzada (AGEs) en una muestra biológica. El procedimiento comprende la puesta en contacto de una muestra sospechosa de contener AGEs con el anticuerpo monoclonal o el fragmento de éste de unión al antígeno de la invención en condiciones que permiten la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo monoclonal o el fragmento de éste de unión al antígeno y los AGEs; y detectar la formación de tales complejos de reacción que comprenden el anticuerpo monoclonal o el fragmento de éste de unión al antígeno y AGEs en la muestra. La detección de la formación de los complejos de reacción indica la presencia de AGEs en la muestra.

En una realización, se puede dejar que las moléculas de la muestra se unan o adhieran a un soporte sólido y las moléculas modificadas por AGE inmovilizadas de ese modo puedan ser reconocidas por la formación de complejos de reacción con el anticuerpo monoclonal de la presente invención o un fragmento de éste de unión al antígeno, mediante etapas de ensayo posteriores para detectar complejos de reacción.

En una realización adicional, el anticuerpo monoclonal o fragmento de éste unido al antígeno se une a un soporte de fase sólida, por ejemplo como el primer componente de un ensayo “tipo sándwich” para las moléculas modificadas por AGE reactivas con el anticuerpo monoclonal inmovilizado de la presente invención, o un fragmento de éste de unión al antígeno, en el que el segundo asociado de unión inmunológica puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, o una mezcla de éstos, que incluye sin limitación el anticuerpo monoclonal de la presente invención. En una realización adicional, la muestra se pone en contacto con un producto final de glicosilación avanzada (AGE) marcado, y las sustancias no unidas se eliminan antes de la detección de la formación de los complejos de reacción en un formato de ensayo competitivo. La formación de complejos de reacción con la muestra se detecta al observar un descenso en la cantidad de AGE marcado unido en el ensayo. Alternativamente, la formación de complejos de reacción se puede observar al detectar la unión de un anticuerpo anti-AGE marcado o un anticuerpo a un vehículo de AGE, como por ejemplo pero no limitado a albúmina, hemoglobina, lipoproteína de baja densidad, y similares, al complejo del anticuerpo monoclonal o fragmento de éste de unión al antígeno y el AGE.

En otra realización, un AGE se une a un soporte de fase sólida. En un aspecto adicional, la muestra se pone en contacto con dicho AGE inmovilizado unido al soporte de fase sólida, en presencia del anticuerpo monoclonal de la presente invención o un fragmento de éste de unión al antígeno. El anticuerpo monoclonal o el fragmento de éste de unión al antígeno se marca directamente o mediante etapas de un ensayo adicional usando reactivos disponibles que reconocen específicamente el anticuerpo monoclonal de la presente invención o un fragmento de éste de unión al antígeno. La formación de complejos de reacción con moléculas modificadas por AGE en la muestra se detecta al observar un descenso en la cantidad de marcador complejada al soporte de fase sólido.

Los procedimientos para detectar la presencia de AGEs en una muestra según la invención son útiles para evaluar el nivel de AGEs en una muestra biológica. Por consiguiente, la invención se dirige además a un procedimiento para evaluar el nivel de AGEs en una muestra biológica, que comprende la detección de la formación de los complejos de reacción en una muestra biológica; y la evaluación de la cantidad de complejos de reacción formados, cuya cantidad de complejos de reacción corresponde al nivel de AGEs en la muestra biológica.

El nivel de AGEs en una muestra puede tener un valor de diagnóstico o pronóstico grande. Por consiguiente, la invención se dirige además a un procedimiento para detectar o diagnosticar la presencia de una enfermedad asociada a con niveles de AGE elevados en un mamífero que comprende la evaluación del nivel de AGEs en una muestra biológica de un mamífero; y la comparación del nivel detectado con un nivel de AGEs presente normalmente en el mamífero. Un aumento en el nivel de AGEs en comparación con los niveles normales indica una enfermedad asociada con niveles elevados de AGEs. Similarmente, la invención trata de un procedimiento para supervisar el curso de una enfermedad asociada con niveles de AGE elevados en un mamífero que comprende la evaluación de AGEs en una serie de muestras biológicas obtenidas a diferentes tiempos de un mamífero. Un aumento en el nivel de AGEs frente al tiempo indica progresión de la enfermedad, y una disminución en el nivel de AGE frente al tiempo indica regresión de la enfermedad. Además, la invención trata de un procedimiento para supervisar un tratamiento terapéutico de una enfermedad asociada con niveles de AGE elevados en un mamífero que comprende la evaluación de los niveles de AGEs en una serie de muestras biológicas obtenidas a diferentes tiempos de un mamífero que recibe un tratamiento terapéutico para una enfermedad asociada con niveles de AGE elevados. Una disminución en el nivel de AGEs frente al tiempo indica un resultado terapéutico efectivo.

La invención proporciona ventajosamente formatos de kit de prueba convenientes para ejercer los procedimientos anteriores. Por consiguiente, la invención proporciona un kit de prueba para medir la presencia o cantidad de AGEs que se obtienen in vivo en un analito. Tal kit puede comprender un anticuerpo monoclonal de la invención o un fragmento de éste de unión al antígeno de la invención; medios para detectar la formación de complejos de reacción entre el anticuerpo monoclonal o el fragmento de éste de unión al antígeno y AGEs; otros reactivos; e instrucciones de uso del kit. En una realización, el kit de prueba puede comprender además una preparación de un AGE o AGEs, o moléculas modificadas por un AGE o AGEs, reconocidas por el anticuerpo monoclonal, por ejemplo, en las que dichas moléculas se asocian irreversiblemente con una fase sólida. En otra realización, el kit de prueba puede comprender además un anticuerpo anti-AGE marcado o un fragmento de éste de unión al antígeno, cuyo anticuerpo anti-AGE marcado es reactivo con AGEs producidos in vivo, o directamente reactivo con la molécula de analito cuyo grado de modificación de AGE debe determinarse, incluyendo por ejemplo un anticuerpo anti-lipoproteína de baja densidad marcado.

De este modo, un objeto primario de la invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal reactivo con AGEs producidos in vivo.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar una fuente indefinida de un anticuerpo reactivo con AGEs producidos in vivo, cuyo anticuerpo tiene características de unión inmunológicas particulares que le vuelven particularmente útil para este fin.

Otro objeto adicional de la invención es proporcionar un ensayo para detectar AGE de lipoproteína de baja densidad, en particular AGE de ApoB.

Otro objeto adicional más de la invención es proporcionar composiciones terapéuticas y procedimientos correspondientes para tratar estados caracterizados por niveles anormales de AGEs que se basan en o incluyen los anticuerpos de la presente invención.

Estos y otros objetos de la invención se comprenderán mejor en referencia a los siguientes dibujos, descripción detallada de la invención, y ejemplos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que demuestra la identificación de AGE de LDL por medios de la presente invención.

La Figura 2 representa un gráfico que muestra la detección de complejos de IgG-AGE en suero por medios de la presente invención.

La Figura 3 es un gráfico que representa la detección y medida de niveles de AGE de péptido del suero en normales y diabéticos por medios de la presente invención.

La Figura 4 es un gráfico que representa los resultados de la detección y medida de niveles de AGE urinarios por medios de la presente invención.

La Figura 5 es un gráfico que representa los resultados de la medida de niveles de AGE de colágeno en la piel de rata por medios de la presente invención.

La Figura 6 es un gráfico que representa los resultados de la media de los valores de AGE de hemoglobina de dos individuos no diabéticos y dos diabéticos, expresados como AGE U por mg de hemoglobina.

La Figura 7 es un gráfico que muestra la regresión de los valores obtenidos del ensayo competitivo de la LDL modificada con AGE de KLH biotinilado para el anticuerpo monoclonal recubierto en el pocillo expresado como % de inhibición frente a \mug de AGE de LDL/pocillo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se dirige a un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de éste de unión al antígeno, reactivo con productos finales de glicosilación avanzada (AGEs) producidos in vivo. En particular, dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de éste de unión al antígeno puede demostrar las características de unión inmunológicas de un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo formado por anticuerpo monoclonal 4G9 como el producido por el hibridoma 4G9, depositado en la American Type Culture Collection (ATTC) con número de acceso CRL 11626, y anticuerpo monoclonal 2G6, depositado en la American Type Culture Collection el 19 de diciembre, 1995, con número de acceso HB 12008. Naturalmente, la invención se extiende al hidridoma igualmente. De este modo, la invención proporciona ventajosamente una fuente de células prolongada indefinidamente a un anticuerpo monoclonal de la invención: el hibridoma.

La invención trata además de procedimientos de ensayo de diagnóstico y kits que comprenden el anticuerpo monoclonal de la invención y de procedimientos terapéuticos basados en éstos.

Se usan varios términos en la presente memoria, que tienen los siguientes significados:

Una molécula es “antigénica” cuando es capaz de interactuar específicamente con una molécula que identifica un antígeno del sistema inmune, como una inmunoglobulina (anticuerpo) o receptor de antígeno de célula T. Un polipéptido antigénico contiene al menos aproximadamente 5 y preferiblemente al menos aproximadamente 10 aminoácidos. Una parte antigénica de una molécula puede ser la parte que es inmunodominante para la identificación de un anticuerpo o un receptor de célula T, o puede ser una parte usada para generar un anticuerpo para la molécula al conjugar la parte antigénica a una molécula vehículo para la inmunización. Una molécula que es antigénica no necesita ser inmunogénica por sí misma, es decir, capaz de provocar una respuesta inmune sin un vehículo.

Cuando está presente, el término “características de unión inmunológicas”, u otras características de unión de un anticuerpo con un antígeno, en todas sus formas gramaticales, se refiere a la especificidad, afinidad, reactividad cruzada, y otras características de unión de un anticuerpo.

El término “adyuvante” se refiere a un compuesto o mezcla que potencia la respuesta inmune a un antígeno. Un adyuvante puede servir como depósito de tejido que libera lentamente el antígeno y también como un activador del sistema linfoide que potencia no específicamente la respuesta inmune (Hood y col., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamín/Cummings: Menlo Park, California, p. 384). A menudo, una prueba de provocación primaria con un antígeno solo, en ausencia de un adyuvante, no logra provocar una respuesta inmune humoral o celular. Los adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund incompleto, saponina, geles minerales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas como lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones aceitosas o hidrocarbonadas, hemocianinas de la lapa californiana, y adyuvantes humanos potencialmente útiles como BCG (bacille Calmetre-Guerin) y Corynebacterium parvum. Preferiblemente, el adyuvante es farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona ventajosamente procedimientos para preparar anticuerpos monoclonales que tienen las características de unión del anticuerpo monoclonal 4G9 al inmunizar con un antígeno como AGE de RNasa, AGE de lisozima, AGE de ASB, y AGE de KLH. Cualquier antígeno se puede usar como un inmunógeno para generar anticuerpos con las características inmunológicas del anticuerpo monoclonal 4G9. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen anticuerpo monoclonal 4G9, y anticuerpo monoclonal 2G6. Tales anticuerpos incluyen pero no se limitan a monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla, fragmentos Fab, y una biblioteca de expresión de Fab.

Se pueden usar varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales monoespecíficos que corresponden al anticuerpo monoclonal de la presente invención. Por ejemplo, la reproducción de un anticuerpo puede desarrollarse mediante la inmunización de varios animales huésped. En esta realización, el antígeno puede estar conjugado a un vehículo inmunogénico, por ejemplo, albúmina de suero bovino (ASB) o hemocianina de lapa californiana (KLH), o el vehículo puede reaccionar con un azúcar reductor como glucosa de modo que el vehículo sostiene determinantes de AGE. Se pueden usar varios adyuvantes como los expuestos anteriormente, para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped.

Para la producción de anticuerpos monoclonales de la presente invención, se puede usar cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en el cultivo. Éstas incluyen pero no se limitan a la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de célula B humana (Kozbor y col., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma del EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc, pág. 77-96). En una realización adicional de la invención, se pueden producir anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes utilizando la última tecnología (documento PCT/US90/02545). Según la invención, los anticuerpos humanos se pueden usar y se pueden obtener al usar hibridomas humanos (Cote y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) o al transformar células B humanas con virus EBV in vitro (Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77-96). De hecho, según la invención, se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de “anticuerpos quiméricos” o “anticuerpos humanizados” (Morrison y col., 1984, J. Bacteriol. 159-870; Neuberger y col., 1984, Nature 312:604-608; Takeda y col., 1985, Nature 314:452-454) al juntar los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de la presente invención, por ejemplo, anticuerpo monoclonal 4G9, junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de una actividad biológica apropiada. Los anticuerpos quiméricos son aquellos que contienen una parte Fc humana y una parte Fv murina (u otra no humana); los anticuerpos humanizados son aquellos en los que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de murina (u otra no humana) se incorporan en un anticuerpo humano; ambos anticuerpos quimérico y humano son monoclonales. Tales anticuerpos humano o quimérico humanizado se prefieren para uso en terapia o diagnóstico in vivo o de enfermedades o trastornos humanos (descritos infra), ya que los anticuerpos humanos o humanizados son mucho menos propensos que los anticuerpos xenogénicos a inducir una respuesta inmune, en particular una respuesta alérgica.

Según la invención, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente de Estados Unidos 4.946.778) se pueden adaptar para proporcionar anticuerpos de cadena sencilla de la presente invención. Una realización adicional de la invención utiliza las técnicas descritas para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Huse y col., 1989, Science 246:1257-1281) para permitir una identificación fácil y rápida de fragmentos de Fab monoclonales con la especificidad deseada para el anticuerpo de la presente invención, o sus derivados, o análogos.

Los fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula de anticuerpo se pueden generar por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no se limitan a: el fragmento F(ab')2 que se puede producir mediante la digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que se pueden generar mediante la reducción de puentes disulfuro del fragmento (Fab')_{2}, y los fragmentos Fab que se pueden generar al tratar la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor. Tales fragmentos de anticuerpo se pueden generar de cualquiera de los anticuerpos policlonales o monoclonales de la invención; preferiblemente, tales fragmentos de anticuerpo se generan usando anticuerpo monoclonal 4G9 o anticuerpo monoclonal 2G6.

En la producción de anticuerpos, se puede lograr la selección del anticuerpo deseado mediante técnicas conocidas, por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos “tipo sándwich”, ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (que usan marcadores de oro coloidal, enzima o radioisótopos, por ejemplo), transferencias de Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, se detecta la unión al anticuerpo al detectar un marcador en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta al detectar la unión de un anticuerpo secundario u otro reactivo al anticuerpo primario. En una realización adicional, se marca el anticuerpo secundario. Se conocen muchos medios en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo. Por ejemplo, para detectar anticuerpos de acuerdo con la presente invención, uno puede analizar hibridomas generados para un producto que se une a AGEs formados in vivo o formados in vitro. De manera alternativa, se puede seleccionar tal anticuerpo según la capacidad para competir por la unión del anticuerpo monoclonal 4G9, o el anticuerpo monoclonal 2G6 a tales AGEs.

Los anticuerpos anteriores se pueden usar en procedimientos conocidos en la técnica que se relacionan con la localización y actividad de proteínas o tejidos modificados por AGE, por ejemplo, para transferencia de Western, ELISA, detectar tejido modificado por AGE in situ, medir niveles de moléculas modificadas por AGE, por ejemplo incluyendo proteínas, péptidos, lípidos y ácidos nucleicos, y, en particular, AGE de hemoglobina, AGE de inmunoglobulina, y AGE de LDL, en muestras fisiológicas apropiadas, como muestras de suero.

Usando la presente invención, uno puede evaluar y/o detectar la presencia de estados patológicos estimulados, espontáneos, o idiopáticos en mamíferos, al medir la presencia correspondiente de productos finales de glicosilación avanzada. Más particularmente, la presencia o cantidad de los AGEs se puede seguir directamente mediante técnicas de ensayo como las tratadas en la presente memoria, por ejemplo, mediante el uso de una cantidad marcada apropiadamente del presente anticuerpo monoclonal anti-AGE, como se expone en la presente memoria.

El daño en el tejido y en un órgano terminal provocado por la glicosilación avanzada se acumula durante un periodo de meses a años. Las complicaciones diabéticas progresan durante una duración similar, de modo que es ventajoso detectar más pronto la acumulación de AGE que se ha relacionado con el desarrollo de patología en tales estados patológicos.

En particular, el anticuerpo monoclonal de la invención se puede usar para detectar la presencia de AGEs como por ejemplo, pero sin estar limitado a, AGE de hemoglobina, AGE de albúmina, AGEs de lípido, y péptidos modificados por AGE. Generalmente, se puede valorar la presencia de una enfermedad o un trastorno asociado con AGEs al detectar niveles mayores de AGEs en una muestra biológica de un individuo que padece tal enfermedad o trastorno, en comparación con un individuo normal. La eficacia de un agente, por ejemplo, aminoguanidina, para prevenir o inhibir la formación de AGEs se puede evaluar al observar una disminución en el nivel de AGEs en muestras biológicas obtenidas de un individuo durante un intervalo de tiempo.

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Por ejemplo, se ha determinado que los AGE de Hb suponen aproximadamente 0,42% de la hemoglobina humana que circula. Esta fracción aumenta hasta aproximadamente 0,75% en pacientes con hiperglicemia inducida por diabetes. Es importante que, los pacientes diabéticos tratados durante 28 días con aminoguanidina, un inhibidor de la formación de AGE in vivo, muestran niveles significativamente disminuidos de AGE de Hb al final del periodo de tratamiento (publicación internacional número WO 93/13421).

La presente invención también se extiende a la medida de otros AGEs y particularmente proteínas modificadas por AGE y péptidos modificados por AGE del suero y urinarios. Los péptidos modificados por AGE del suero y urinarios, como AGE de lípido y AGE de Hb, representan marcadores de circulación de acumulación de AGE que reflejan el comienzo y el grado de patologías y otras disfunciones donde tal acumulación es una característica. De este modo, aquellos estados diabéticos y relacionados con AGE donde se han observado niveles aumentados de AGEs, como, por ejemplo, aterosclerosis, cataratas y nefropatía diabética, pueden supervisarse y evaluarse a largo plazo mediante la medida de estos AGEs, particularmente recurriendo a los procedimientos de diagnóstico descritos en la presente memoria.

Similarmente, se pueden usar AGEs de péptidos del suero como un indicador que refleja el índice de filtración glomerular (IFG) y el daño en el riñón. Se pueden usar los AGEs de péptidos urinarios como indicadores para medir el cambio en las proteínas del tejido, y más particularmente, las proteínas del tejido que soportan las modificaciones por AGE.

En los AGE de LDL, AGE de Hb, y en los ensayos de AGE de péptidos del suero, se saca una muestra de sangre y se usa un procedimiento de separación. Para medir el nivel de AGEs de LDL o de lípido, se puede usar un procedimiento como el descrito en la publicación internacional número WO 93/13421 de Bucala y col.. Para detectar AGE de hemoglobina, se pueden separar los componentes celulares de la sangre del suero, y se puede extraer la hemoglobina de los glóbulos rojos. Se puede evaluar entonces el nivel de suero de AGE de LDL, AGEs de péptidos y la presencia o el alcance de AGEs de Hb presentes.

Al llevar a cabo estas pruebas con una única muestra de sangre, se puede estimar un marco temporal más amplio en el que los niveles de glucosa de la sangre se hacen incontrolados, por ejemplo, un intervalo de 60 días predecible por AGE de Hb por ejemplo, alarga el periodo a evaluar para el control glucémico hasta antes del marco temporal de las 3-4 semanas en el que se mide mediante determinación de Hb-A1c. Si se desea, se pueden ejecutar conjuntamente los análisis de AGE de Hb y AGEs de péptidos del suero con una determinación del nivel de glucosa en sangre u orina, una prueba de tolerancia de glucosa, y otras pruebas útiles para evaluar el control de la diabetes que incluye la medida de los AGEs de péptidos urinarios, para proporcionar un perfil completo del paciente.

En un aspecto preferido de la invención, se miden los AGEs de LDL usando el anticuerpo monoclonal de la invención en combinación con un anticuerpo anti-LDL (como por ejemplo, pero sin limitarse a, anti-ApoB) o un anticuerpo anti-AGE policlonal (como AGE de anti-RNasa de conejo).

Otro aspecto de la invención se dirige a productos finales de glicosilación avanzada que se pueden detectar en la orina. Las proteínas, incluyendo péptidos, se excretan en la orina en unas cantidades muy bajas en los individuos normales, y a unos niveles elevados en los individuos enfermos. Se puede determinar la presencia y/o nivel de AGEs de péptidos urinarios que son reflejo del cambio de AGEs del tejido, que se correlacionan y que predicen enfermedades o dolencias particulares.

La presencia de péptidos en la orina puede ser un síntoma de numerosas enfermedades o dolencias que son reflejo de un estado catabólico neto que existiría cuando el huésped o paciente experimenta una invasión como una infección. Bajo tales circunstancias, el huésped se moviliza frente al estímulo hostil mediante la secreción de numerosos factores como citocinas que suspenden la actividad de almacenamiento de energía anabólico y las actividades de reparación celular y promueve en su lugar el consumo catabólico de las existencias de energía y el reclutamiento de leucocitos y otros factores para combatir y neutralizar el estímulo. La medida de los AGEs de péptidos urinarios proporciona además otro índice de posible actividad hostil en el huésped, como caquexia y shock. De este modo, uno puede medir la presencia o nivel de AGEs de péptido en orina, y correlacionar este nivel con un patrón. En individuos normales, el nivel normal puede ser bajo. En pacientes diabéticos, el nivel de AGEs de péptidos puede ser mayor. Alternativamente, en un paciente que sufre una enfermedad renal avanzada asociada a AGE, el nivel de péptidos urinarios puede descender enormemente debido al comienzo de un fallo renal. En pacientes que experimentan una infección u otro trauma, el nivel de AGEs de péptidos puede ser significativamente mayor que en unos individuos normales. De este modo, el progreso o empeoramiento de diabetes antes del comienzo de complicaciones renales, el comienzo de complicaciones renales asociadas a diabetes u otras enfermedades relacionadas con AGE, o la presencia de la infección, se podrían detectar mediante la detección de niveles de AGEs de péptidos urinarios.

El anticuerpo monoclonal anti-AGE de la invención también se puede usar en el tratamiento de pacientes para reducir el nivel o acelerar la eliminación de AGEs o moléculas modificadas por AGE circulantes, o similares como AGEs o moléculas modificadas por AGE, que pueden estar presentes en niveles anormalmente elevados en ciertos tejidos, por ejemplo, páncreas, hígado, riñón o cerebro, y cuyos AGEs pueden ser no deseados.

Es una realización adicional de la invención descrita en la presente memoria utilizar el anticuerpo monoclonal anti-AGE para el diseño, detección y/o potenciación de fármacos o compuestos que son útiles para tratar niveles elevados de AGEs in vivo. En relación con esto, el anticuerpo monoclonal anti-AGE se puede usar para purificar proteínas que se han cultivado o producido especialmente para uso como agentes terapéuticos. El uso terapéutico de tales proteínas aumenta en importancia, y tales proteínas exógenas (como el tejido y proteínas circulantes propios del huésped) son susceptibles de glicación y la formación de AGEs. Tales AGEs son reactivos químicamente y biológicamente activos, así que es deseable limitar su introducción en un huésped durante la terapia. Como una consecuencia, la presente invención incluye un procedimiento para la purificación de grupos de tales proteínas al ponerlos en contacto con, por ejemplo, una cantidad del anticuerpo monoclonal anti-AGE de la presente invención o un fragmento de éste de unión al antígeno, inmovilizado en un sustrato adecuado. De este modo las proteínas glicosiladas se podrían separar del resto del grupo por procedimientos convencionales. El sustrato se podría renovar o sustituir periódicamente en el caso de un procedimiento comercial, de modo que se podría llevar a cabo una circulación continua del material proteico por el sustrato y posterior separación del componente de AGE de proteína. Naturalmente, el esquema anterior se presenta con fines de ilustración únicamente, y es capaz de varias modificaciones en el diseño y ejecución dentro de la capacidad de la técnica.

Todos los protocolos descritos en la presente memoria se pueden aplicar para la determinación cualitativa y cuantitativa de productos finales de glicosilación avanzada y del diagnóstico simultáneo y vigilancia de patologías en las que están implicados productos finales de glicosilación avanzada. Tales dolencias como diabetes y las dolencias asociadas con el envejecimiento, como aterosclerosis y arrugamiento de la piel representan ejemplos no limitantes, y por consiguiente se incluyen dentro de la presente invención procedimientos para diagnosticar y supervisar estas dolencias.

La presente invención también incluye ensayos y kits de prueba para el análisis cualitativo y/o cuantitativo del alcance o la presencia de productos finales de glicosilación avanzada. Tales sistemas de ensayo y kits de prueba pueden comprender un componente marcado preparado, por ejemplo, mediante una de las técnicas radiactivas y/o enzimáticas tratadas en la presente memoria, uniendo un marcador al anticuerpo monoclonal anti-AGE de la presente invención o un fragmento de éste de unión al antígeno, o a un asociado de enlace de éste. Uno de los componentes de los kits descritos en la presente memoria es el anticuerpo monoclonal anti-AGE de la presente invención o el fragmento de éste de unión al antígeno, en forma marcada o no marcada.

Según se indicó antes, los kits se pueden usar para medir la presencia de productos finales de glicosilación avanzada en proteínas recombinantes u otras purificadas, y particularmente aquellas destinadas a uso terapéutico, para analizarlas para la presencia de AGE en primer lugar, y en segundo lugar, para ayudar en su purificación adicional de material con modificaciones de AGE no deseadas.

De acuerdo con las técnicas de prueba tratadas anteriormente, una clase de tales kits contiene al menos el anticuerpo monoclonal o un fragmento de éste de unión al antígeno de la invención, medios para detectar uniones de tal anticuerpo o fragmento de éste a componentes de AGE en una muestra biológica, e instrucciones, por supuesto, dependiendo del procedimiento seleccionado, por ejemplo, “competitivo”, “tipo sándwich”, “DASP” y similares. Los kits también pueden contener reactivos periféricos como tampones, estabilizadores, etc.

Más específicamente, el kit de prueba diagnóstica preferida puede comprender además una cantidad conocida de un asociado de enlace a un anticuerpo anti-AGE según se describió anteriormente, unido generalmente a una fase sólida para formar un inmunoabsorbente, o por el contrario, unido a un marcador adecuado.

El kit de prueba de la invención puede comprender además un anticuerpo secundario, que puede estar marcado o se puede suministrar para unirse a un soporte sólido (o unido a un soporte sólido). Tal anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-AGE, o un anticuerpo específico para la parte no AGE del analito a evaluar para modificación por AGE, o un componente de AGE. Los ejemplos de los últimos incluyen, pero no se limitan a, anti-hemoglobina, anti- albúmina, y, como se muestra en la presente memoria, anti-ApoB. Tales anticuerpos para la parte “vehículo” de un componente de AGE pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales.

La presente invención se comprenderá mejor en referencia a los siguientes ejemplos, que son ilustrativos de la invención, y no se consideran como limitantes de la invención. Cuando está presente, la designación “PBS” denota una solución salina de tampón fosfato. Se puede preparar PBS al disolver 8,0 gramos de NaCl, 0,2 gramos de KCl, 1,44 gramos de Na_{3}HPO_{4}, y 0,24 gramos de KH_{2}PO_{4} en 800 ml de agua destilada, ajustando el pH a 7,2 y el volumen a 1 litro. La solución resultante se puede distribuir en volúmenes apropiados y esterilizados mediante autoclave, y pueden almacenarse a temperatura ambiente. Asimismo, los términos “Solución de Lavado” y “Solución de Lavado TBS-T” cuando están presentes hacen referencia a lo siguiente: Tween salino tris tamponado (TBS-T) (Trizma 0,01 M, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05%, azida sódica al 0,02%, ajustado a pH 7,4 con HCl). El término “Tampón de Ensayo” se refiere a una solución que contiene generalmente borato 25 mM - 1 M, pH 8,0, NaCl 150 mM, AAEDT al 0,01% y ASB al 1%. La concentraciones de los componentes que comprenden el Tampón de Ensayo que puede aparecer en los ejemplos enumerados a continuación pueden variar. Naturalmente, las formulaciones anteriores son ilustrativas y pueden variar dentro de la capacidad de la técnica, y se presentan en la presente memoria en cumplimiento del deber de presentar el mejor modo para la práctica de la invención.

Ejemplo 1 Un hibridoma que secreta un antciuerpo monoclonal específcio de AGE

El presente ejemplo describe la producción de un anticuerpo monoclonal que reacciona con AGEs producidos in vivo.

Preparación de inmunógeno

Un gramo de KLH (Sigma Cat. #2133) se combinó con 96 g de glucosa en 500 ml de un tampón fosfato sódico 400 mM, pH 7,4. La solución se desoxigenó al burbujear nitrógeno en la solución, y esterilizado al filtrar al pasar la solución a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 micrómetros. Tras la incubación a 37ºC durante 90 días, la solución se dializó frente a tampón fosfato sódico 20 mM, que contiene NaCl 0,15 M, pH 7,4. El contenido proteico se determinó usando un ensayo de Lowry, de nuevo esterilizado al filtrar, y se tomaron alícuotas. Las alícuotas se guardaron a -80ºC hasta que se usaron.

Programa de inmunización

A cinco ratones se les sacó sangre y se les marcó en la oreja. Cada ratón se inmunizó subcutáneamente con 0,2 ml de una preparación que contiene 100 \mug de KLH modificada mediante AGE en PBS (Inmunógeno) mezclado 1:1 con adyuvante de Freund completo (CAF). Los ratones se estimularon subcutáneamente en el día 21 con 0,2 ml de 50 \mug de Inmunógeno en adyuvante de Freund incompleto (IFA). Se administró un segundo estímulo de 50 \mug de Inmunógeno en IFA en el día 41 como antes. Finalmente, se administró un tercer estímulo de 50 \mug de Inmunógeno en el día 63 como antes y se tomó una muestra de sangre de la vena de la cola y se preparó suero. Se seleccionó el ratón que muestra la mayor concentración de sustancia según se determina en el procedimiento de Valoración del Sangrado en la Prueba de Antisueros descrito a continuación y se estimuló intravenosamente con 0,1 ml que contiene 50 \mug de Inmunógeno sin adyuvante. Tres días después, se retiró el bazo y se extrajo la sangre del animal.

Valoración del sangrado en la prueba de antisueros

Una dilución inicial de 1/100 de cada muestra de suero a valorar se preparó en PBS que contiene ASB al 0,1%, seguido de 10 diluciones 2 veces en serie en el mismo tampón para determinación por valoración. Se diluyeron sueros pre-inmunes indicados anteriormente del mismo modo que los sueros inmunes y se usaron como controles. Los pocillos de microvaloración se recubrieron con 1,5 \mug de antígeno de AGE de ASB preparado al incubar albúmina de suero bovino (ASB) de Calbiochem, Catálogo #12657, como describen Makita y col., J. Biol. Chem., 267(8), pág. 5133-5138 (1992). Los pocillos recubiertos de antígeno se sellaron con una cinta de sellado Mylar (Corning) se incubaron durante la noche a 4ºC. Las placas de microvaloración se lavaron posteriormente 6 veces con Solución de Lavado TBS-T y se bloquearon durante una hora a 37ºC al añadir 200 \mul de una solución de PBS que contiene ASB al 0,2% y azida sódica al 0,2%. Las placas de microvaloración se lavaron como antes y se añadieron 100 \mul de las diluciones de los sueros pre-inmunes e inmunes. Tras incubación durante 2 horas a temperatura ambiente, las placas de microvaloración se lavaron como se describe anteriormente y se añadieron a todos los pocillos 100 \mul de un anticuerpo (Sigma) conjugado a peroxidasa de rábano picante contra IgG anti-ratón de cabra (específico de cadena gamma) y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Se lavaron las placas de microvaloración como antes y se añadieron 100 \mul de sustrato de peroxidasa OPD (Sigma) a todos los pocillos y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras el periodo de incubación, las placas se leyeron a 450 nm en un lector de placas de microvaloración.

La producción de hibridoma se llevó a cabo al mezclar las células de bazo de ratón con la línea celular X63AG8.653 de mieloma según se describe en otro sitio (Harlow, E. y D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Procedimiento de detección de hibridoma

Tras la fusión de las células del bazo con la línea celular de mieloma, se añadió 1 gota de la mezcla de la fusión de 50 ml en cada uno de los 96 pocillos en placas de cultivo celular de 10 micropocillos (Corning). Las placas se numeraron de 1 a 10, las filas de cada placa por una letra, y las columnas por un número, para proporcionar un sistema de claves que identifica los cultivos de células parentales que se desarrollan a partir de cada gota de la mezcla de fusión. Tras cultivar en los medios de selección descritos en Harlow y Lane, supra, los cultivos de hibridoma se seleccionaron para la producción de anticuerpos para antígeno de AGE como sigue:

Los pocillos recubiertos con AGE de ASB se prepararon como se describe en la sección anterior Valoración del Sangrado en la Prueba de Antisueros. Además, se recubrieron los pocillos con ASB siguiendo el mismo procedimiento de recubrimiento que con AGE de ASB para detectar cualquier unión no específica. Las placas recubiertas de antígeno se usaron para seleccionar sobrenadantes de cultivo celular de cada uno de los cultivos parentales. Los sobrenadantes parentales se diluyeron 1:2 en PBS que contiene ASB al 0,2% y se aañadieron 100 ml de cada uno un pocillo de una placa de microvaloración recubierta por AGE de ASB y a una pocillo de una placa recubierta por ASB. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas y posteriormente se lavaron 6 veces con Solución de Lavado TBS-T. Se añadieron a cada pocillo cien \mul de un anticuerpo conjugado a peroxidasa de rábano picante contra IgG anti-ratón de cabra (específico de cadena gamma) diluido 1:1000 en PBS que contiene ASB al 1% y el procedimiento continuó como en la sección anterior Valoración del Sangrado en la Prueba de Antisueros. Se encontró que dieciséis cultivos parentales producen lecturas de absorbancia que exceden 0,3 D.O en los pocillos de AGE de ASB y ninguna reactividad en los pocillos recubiertos por ASB. Los últimos cultivos parentales se extendieron al incubar en placas de macropocillos de 24 pocillos (Corning) y tras una evaluación de sobrenadante/anticuerpo adicional, se re-clonaron (clonación secundaria) tres cultivos parentales. Siguiendo un procedimiento descrito en Harlow y Lane, supra, los cultivos parentales se diluyeron en un medio de cultivo RPMI 1640 que contiene suero de bovino fetal al 20% para proporcionar una densidad celular de 0,5-10 células por pocillo en los pocillos que se preincubaron con células alimentadoras de esplenocito.

Después de dos semanas sólo un cultivo de células parentales, designado 5D2, proporcionó 17 clones de anticuerpos que producen AGE específicos identificados al comprobar los sobrenadantes del cultivo en el procedimiento de selección anterior. Los otros dos parentales no proporcionaron ningunos subclones positivos. Después de la expansión de los 17 clones de 5D2 en cultivo celular, se seleccionó un cultivo clonal que tenía alta viabilidad y produjo el anticuerpo de mayor valoración a AGE de ASB en el ensayo de detección de anticuerpos mencionado anteriormente. Se hizo una subclonación adicional del último para asegurar la monoclonalidad y el clon resultante se designó 4D6 (5D2- 4D6). Se hizo una tercera clonación de 5D2-4D6 como antes, y se identificaron 10 subclones que produjeron buenas valoraciones de AGE de ASB a partir de la dilución de 0,3 células/pocillo. Se seleccionó uno de este grupo designado 4G9 (5D2-4D6-4G9) basado en el análisis de afinidad comparativa de acuerdo con Macdonald y col. (Macdonald, R. A. y col., 1988, Journal of Immunological Methods, 106:191-194). Las células de cada cultivo se prepararon de acuerdo con Harlow y Lane, supra, para almacenamiento frigorífico. 4G9 se extendió en el cultivo y se adaptó a un medio libre de proteínas (MaxiCell/Hybridoma-PF Medium, Cat. Número N10105, Atlanta Biologicals, Norcross, GA) para producción de anticuerpos monoclonales.

Ejemplo 2 Características de unión e inmunológicas del anticuerpo monoclonal 4G9 específcio de AGE

Se determinó la capacidad del anticuerpo monoclonal, Mab 4G9, cultivado contra KLH glicado no enzimáticamente mediante incubación prolongada con glucosa (AGE de KLH) para reconocer una variedad de las proteínas y péptidos glicados no enzimáticamente producidos al oscurecerse con varios azúcares.

Materiales y procedimientos

Producción de proteínas de AGE. Todas las proteínas y péptidos se oscurecieron con glucosa, ribosa o glucosa 6-fosfato en tampón fosfato de sodio 300mM, pH 7,4, durante 8-12 semanas a 37ºC. Las proteínas de control se trataron del mismo modo excepto porque se omitieron los azúcares.

ELISA directo y ELISA de competición. Para ELISA directo, se recubrió AGE de ASB o ASB modificada en placas de microvaloración, se bloquearon los sitios no unidos mediante incubación con Tampón de Ensayo (borato 25 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, AEDT al 0,01% y ASB al 1%). La placa se lavó seis veces y se añadieron concentraciones aumentadas de mAb en el Tampón de Ensayo. Tras esta incubación, la placa se lavó de nuevo y se incubó con anticuerpos anti-ratón de cabra marcados con fosfatasa alcalina (Cappel, Durham, NC) diluidos 1:1000 en tampón de ensayo. Los anticuerpos no unidos se eliminaron por lavados extensivos y los anticuerpos unidos se detectaron por adición de p-nitrofenilfosfato al registrar la densidad óptica a 410 nm.

El ELISA de competición se llevó a cabo mediante placas de microvaloración pre-recubiertas con AGE de ASB y bloqueadas con Tampón de Ensayo. La placa se lavó y se añadieron mAb 4G9 y concentraciones aumentadas de los competidores enumerados en la Tabla 1 y se incubaron simultáneamente durante 1 hora a 37ºC. Los materiales no unidos se eliminaron mediante un lavado extensivo y el mAb unido se detectó con anticuerpos anti-ratón marcados con fosfatasa alcalina similar al ELISA directo. Todos los lavados fueron en la solución de lavado TBS- T; todas las incubaciones se desarrollaron durante 1 hora a 37ºC.

Resultados

Interacción de mAb 4G9 con varios compuestos pardeados. El anticuerpo monoclonal 4G9 (descrito en el ejemplo 1, anteriormente) mostró un amplio intervalo de reconocimiento de las proteínas y péptidos que se habían pardeado, es decir, incubados para adquirir modificación de AGE, con diferentes azúcares. La tabla 1 muestra una serie de ejemplos de los compuestos pardeados que se unen con este mAb en el ensayo de competición que indican que las estructuras de AGE son determinantes antigénicos importantes para este anticuerpo. El mAb no mostró unión significativa a ninguna proteína no glicada ni a ningún azúcar analizado del mismo modo que la especie glicada.

TABLA 1

Proteína o péptido	azúcar	CI_{50} M
ASB	Glucosa	3 x 10^{-9}
Albúmina de suero de rata	Glucosa-6-fosfato	5 x 10^{-9}
Hemoglobina	Ribosa	2 x 10^{-9}
Arg-Lys	Glucose	2,5 x 10^{-4}
Arg-Lys	Ribose	5 x 10^{-5}
Gly-Lys	Ribosa	5 x 10^{-4}
Lys	Glucosa	5 x 10^{-4}
Ácido 6-aminocaproico	Glucosa	5 x 10^{-4}

1- CI_{50} eran del ELISA de competición basado en la concentración de las proteínas o péptidos originales.

2- CI_{50} para proteínas, péptidos o azúcares solos > 10^{-2} M

Discusión

De este modo, el anticuerpo monoclonal reconoce AGEs en diferentes proteínas, péptidos y aminoácidos, cuyos AGEs surgen de la reacción con diferentes azúcares reductores. El anticuerpo de la presente invención reconoce específicamente varias proteínas glicadas en sangre humana y de rata, que indica la presencia de estructuras de AGEs en fluidos fisiológicos y en tejidos.

Ejemplo 3 Capacidad para reconocer AGE de LDL en sueros y plasma humanos

En este ejemplo, se midieron AGE de LDL (lipoproteína de baja densidad) en muestras de sueros/plasma humanos pretratadas para seleccionar LDL mediante el uso de una combinación de anticuerpos que se dirigen hacia AGEs y LDL. La adición de polietilenglicol (PEG) a las muestras precipita selectivamente LDL y por lo tanto mejora la detección de AGE de LDL. Este ensayo facilita la determinación de niveles de formación de AGE en LDL sin la detección de otros complejos de AGE que pueden estar presentes en la sangre.

Para determinar niveles de complejos de AGE en LDL, se precipitó selectivamente LDL de muestras de sueros o plasma humanos usando PEG al 6-10% y se redisolvió en un tampón que contiene detergente SDS al 1%. Las muestras se diluyeron en un Tampón de Ensayo y se usaron en el protocolo tipo sándwich descrito en Materiales y Procedimientos a continuación. El ensayo detecta la presencia de AGEs en LDL al capturar moléculas modificadas por AGE mediante la unión al anticuerpo monoclonal inmovilizado 4G9, y entonces detecta los complejos de AGE en LDL capturados mediante el uso de un anticuerpo anti-ApoB.

Materiales y procedimientos

Se midieron los niveles de AGE en LDL usando un ensayo ELISA tipo sándwich. Se diluyeron cien \mul de suero o plasma en PBS que contiene PEG (concentración final al 6%) en un volumen final de 1 ml y de dejó reposar durante 10 minutos. Para obtener LDL, las muestras se centrifugaron a 14000 r.p.m. durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. El gránulo de LDL se disolvió en 50 \mul de PBS que contiene SDS al 1% y se dejó reposar durante la noche a temperatura ambiente. Después, se añadieron 950 \mul de Tampón de Ensayo que comprende ASB al 1%, 50 ml de solución de borato 1 M, AEDT al 0,01% en 950 ml de PBS, pH 8,0.

El ensayo de AGE en LDL se llevó a cabo usando 50 \mul de muestra por pocillo. Los pocillos se pre-recubrieron con mAb 4G9 al añadir 100 \mul por pocillo de mAb 4G9 diluido 1:10 en PBS e incubado durante la noche a 4ºC. Las soluciones de recubrimiento de anticuerpo se retiraron y la placa se lavó 6 veces con Solución Tampón TBS-T. La placa se bloqueó entonces con Tampón de Ensayo en PBS, 200 \mul por pocillo, y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Se retiró entonces el Tampón de Ensayo y la placa se lavó 6 veces con Solución de Lavado TBS-T. Se añadieron cincuenta \mul de Tampón de Ensayo a cada pocillo antes de la adición de la muestra. Ochenta \mul de una solución madre de 5 mg/ml de LDL modificada mediante AGE de origen natural purificada de la sangre humana (Cappel Company, #59392) se disolvieron en 100 \mul de una solución de PBS que contiene SDS al 1% y se dejó reposar durante 30 minutos. Esta solución se diluyó entonces con 1,82 ml de Tampón de Ensayo para proporcionar una solución madre patrón de 200 \mug/ml. La solución madre se diluyó entonces en serie 2 veces para obtener soluciones patrón en el intervalo de 50-3,12 \mug/ml.

Las muestras y los patrones se incubaron en la placa durante 1 hora a 37ºC y se lavaron entonces 6 veces como antes. La unión de LDL a AGE específica se detectó usando anticuerpo conjugado a peroxidasa de rábano picante contra proteína ApoB (Biodesign International, Kennebunkport, ME) diluido 1:500 en Tampón de Ensayo e incubado durante 1 hora a 37ºC. La adición del sustrato OPD (Sigma Chemical, St. Louis, MO) permitió la visualización de los complejos detectados a 450 nm.

Resultados

Los resultados se presenta en la figura 1 que muestra la curva de dilución de AGE de LDL humana normal según se detecta con el anticuerpo monoclonal 4G9.

Ejemplo 4 Capacidad para reconocer AGE de IgG en sueros y plasma humanos

La detección de moléculas modificadas por AGE en la sangre evidencia el comienzo o el progreso de una enfermedad asociada con este fenómeno. Este ejemplo demuestra la detección de AGE de IgG en sueros/plasma humanos con el anticuerpo monoclonal 4G9.

Para determinar niveles de AGE de IgG, se realizaron diluciones de muestras de suero en Tampón de Ensayo y se aplicaron a los pocillos recubiertos por 4G9. IgG anti-humano de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) actúa entonces como un anticuerpo detector. Se mide el desarrollo del color producido por la conversión enzimática de OPD, un sustrato para HRP, para indicar la cantidad de AGE presente. La figura 2 muestra los resultados de este procedimiento.

Materiales y procedimientos

Se midieron los niveles de AGE usando un ensayo ELISA tipo sándwich descrito como sigue. Los pocillos se recubrieron con mAb 4G9 al añadir 100 \mul por pocillo de mAb 4G9 en medios libres de proteína diluidos 1:10 en PBS e incubados durante la noche a 4ºC. Los anticuerpos se retiraron y la placa se lavó seis veces con Solución de Lavado TBS-T que contiene Tween 20 al 0,05%. La placa se bloqueó entonces con Tampón de Ensayo (ASB al 1%, borato 50 mM, AEDT al 0,01% en PBS), 200 \mul por pocillo, y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. El tampón de ensayo de retiró entonces y la placa se lavó como antes. Se añadieron cincuenta \mul de Tampón de Ensayo a cada pocillo antes de la adición de la muestra. Se diluyó IgG humano modificado mediante AGE de origen natural (Sigma Chemical, St. Louis, MO) en Tampón de Ensayo para proporcionar un intervalo de concentraciones de 25 ng/ml a 5,25 \mug/ml y se usó como un patrón. El ensayo de AGE de IgG se llevó a cabo usando 50 \mul de muestra por pocillo.

Las soluciones de AGE de IgG se incubaron en la placa durante 1 hora a 37ºC y entonces se lavaron. Se detectó el AGE unido usando IgG anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma Chemical, St. Louis, MO) diluido 1:500 en Tampón de Ensayo e incubado durante 1 hora a 37ºC. La adición del sustrato OPD (Sigma Chemical, St. Louis, MO) permitió la visualización de los complejos detectados a 450 nm.

Resultados

La figura 2 muestra la curva de dilución de IgG de suero humano normal. Este dato, así como los resultados de AGE de LDL del ejemplo 3, muestran que 4G9 detecta las modificaciones de AGE formadas en proteínas in vivo.

Ejemplo 5 Detección de niveles de péptido de AGE del suero

Se exploró el uso del anticuerpo monoclonal de la presente invención como indicador de los estados donde es probable que se detecten los niveles aumentados de AGEs con respecto a los análisis de niveles de péptidos de AGE del suero. Más particularmente, se investigó la capacidad para detectar niveles aumentados de péptidos de AGE del suero utilizando el presente anticuerpo monoclonal. De este modo, el suero de 10 sujetos normales y 10 diabéticos se diluyó 1:3 en PBS y se sometió a fraccionación mediante un microconcentrador Amicon Microcon 10 según las instrucciones del fabricante. De este modo, 50 \mul del ultrafiltrado que contiene moléculas de bajo peso molecular, incluyendo por ejemplo, péptidos de peso molecular de menos de 10.000, se añadió a los pocillos de microvaloración que se habían recubierto con AGE de ASB en un procedimiento de ensayo ELISA competitivo como se describe en Makita y col. (1992), J. Biol. Chem. 267(8):5133-5138. Este procedimiento se modificó, sin embargo, del siguiente modo:

\newpage

1. La solución de lavado fue la Solución de Lavado TBS-T como se describió anteriormente en la presente memoria;

2. El anticuerpo primario usado fue el anticuerpo monoclonal 4G9 de la presente invención;

3. El anticuerpo secundario usado fue un IgG anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Cappel) e incubado a 37ºC durante 45 minutos. Después de esto, los pocillos se lavaron 6 veces con Solución de Lavado TBS-T y se añadieron 100 \mul de sustrato PNPP (Sigma #N2507, St. Louis, MO) diluido en tampón de dietanolamina fabricado según el encarte del paquete del fabricante del sustrato y se incubó durante 30 minutos. La DO del producto de reacción se midió a 410 nm en un lector de placa de microvaloración Dynatech MR5000.

Los valores se expresaron por mililitro de suero, y se muestran en la figura 3.

Ejemplo 6 Detección y medida de niveles de AGE urinarios en ratas

Se examinaron los niveles de AGE urinarios en ratas, utilizando igualmente como parte del kit de diagnóstico y protocolo, el anticuerpo monoclonal de la presente invención. De este modo, la orina recogida de las ratas alojadas en jaulas metabólicas se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos para eliminar restos, se diluyó 1:30 en PBS y se pasaron posteriormente a través de un microconcentrador Amicon Microcon 10 usando el procedimiento según las instrucciones del fabricante. Cincuenta \mul del ultrafiltrado que contiene, entre otras pequeñas moléculas, péptidos de PM menor de 10.000, se añadió a pocillos de microvaloración que se habían recubierto con AGE de ASB en el procedimiento del ensayo ELISA competitivo descritos en Makita y col., y se modificó como se describe en el ejemplo 5, anteriormente. Tras la incubación del sustrato durante aproximadamente 1 hora, los pocillos se leyeron en un lector de placas de microvaloración a 410 nm. Los valores se expresaron como AGE U/ml (definidos en el documento WO 93/13421 de Bucala) de orina por volumen de orina recogido en ml, y los resultados se exponen en la figura 4.

Ejemplo 7 Detección y medida de niveles de AGE en piel de rata

En este ejemplo, se llevó a cabo un ensayo de los niveles en la piel de rata. Por consiguiente, se cortaron 5 centímetros cuadrados de piel de rata para eliminar el tejido conjuntivo y el músculo. Se separaron la epidermis y la dermis de la muestra de piel entre sí, y la dermis se dividió en pequeñas partes. El tejido se secó durante la noche en un Speed Vac (Speed Vac Plus. SC210A, Savant Instruments), y el día siguiente el tejido seco se disgregó usando una espátula. El tejido resultante se deslipidó usando 5 ml de cloroformo:metanol 1:1 (3 veces). Los sobrenadantes se retiraron, y el gránulo de tejido se secó durante un periodo de 2 horas en un Speed Vac. Se preparó entonces una solución de 1 mg/ml de colagenasa en PBS (Colagenasa-B Boehringer-Mannheim). Se preparó una reacción de digestión a un concentración de 60 mg de tejido seco por 1 mg de colagenasa, con 20 \mul de tolueno por ml para prevenir la contaminación.

La muestra preparada de este modo se agitó entonces a 37ºC durante 48 horas en un tubo de vidrio, tras lo cual se centrifugó a 12.000 rpm a 4ºC durante 20 minutos en un tubo de plástico. El sobrenadante se transfirió entonces a un tubo Eppendorf y se calentó a 70ºC durante 1 hora, tras lo cual se centrifugó de nuevo a 12.000 rpm a temperatura ambiente, y se recogió el sobrenadante. La muestra se sometió entonces a digestión con pepsina usando 200 microgramos de pepsina en HCl 0,01 N por 1 ml de muestra. El pH de la muestra se ajustó a 2,0 usando HCl 12 N. La muestra se incubó después de esto en un baño de agua a 37ºC durante 30 minutos. Se utilizó NaOH 6 N para ajustar el pH de la muestra a 7,0.

La muestra se fraccionó entonces usando un microconcentrador Amicon Microcon 10 y el ultrafiltrado se analizó entonces en un ensayo competitivo (Makita y col.) de acuerdo con la presente invención por el contenido de AGE. El contenido de hidroxiprolina (colágeno) se analizó según el procedimiento de Stegmann, H. y Stalder, K., Clin. Chim. Acta 18:267-271 (1967). Los valores de la muestra se expresan en AGE U/mg (definido en el documento WO 93/13421 por Bucala) colágeno y se exponen en la figura 5.

Ejemplo 8 Capacidad para reconocer AGE de hemoglobina en glóbulos rojos humanos

La detección de AGE de hemoglobina de los glóbulos rojos evidencia el estado de hiperglicemia en un individuo y el grado de diabetes en pacientes con esta enfermedad. La medida de este marcador se puede usar para determinar el efecto de los fármacos como aminoguanidina para bloquear la formación de productos finales de glicosilación avanzada formados por aductos con azúcares en ésta y otras proteínas.

Materiales y procedimientos

Para determinar niveles de complejos de AGE, se centrifugó sangre humana heparinizada a 3000 r.p.m. durante 10 minutos para recoger los glóbulos rojos, se retiró el sobrenadante del plasma, y los glóbulos rojos (gr's) se resuspendieron en PBS hasta un volumen igual al plasma retirado. La suspensión de gr en PBS se centrifugó como antes y se retiró mediante lavado el PBS. El último procedimiento se repitió tres veces. Tras retirar el último lavado de PBS, se añadió un volumen de agua destilada igual a 3 veces el volumen de glóbulos rojos y la mezcla se removió para lisar las células. La solución resultante se denomina un hemolisado. El hemolisado se extrajo con un tercer volumen (v/v) de tolueno para eliminar cualquier lípido. Tras agitar vigorosamente con tolueno, el tolueno se retira y el hemolizado se almacena a 4ºC.

Se digirió enzimáticamente un volumen de 0,5 ml de hemolizado mediante la adición de 80 \mug de Pronasa E (Sigma) y se incubó a 37ºC durante 18-24 horas. Tras la digestión, el hemolizado se pasó a través de un microconcentrador Microcon 3K (Amicon) mediante centrifugación según las instrucciones del fabricante. De este modo, se añadieron 50 \mul del ultrafiltrado que contiene péptidos de PM menor de 3.000 a los pocillos de microvaloración que se habían recubierto con AGE de ASB en un procedimiento de ensayo ELISA competitivo como se describe en Makita y col., (1992, J. Biol. Chem. 267:5133-5138) excepto porque se modifica como se describe en el ejemplo 5.

Los resultados de la media de los valores de AGE de hemoglobina de dos individuos no diabéticos y dos diabéticos, expresados como AGE U por mg de hemoglobina, se representan en la figura 6. Los datos demuestran claramente la capacidad del anticuerpo monoclonal 4G9 para detectar modificaciones de AGE formadas en esta proteína.

Ejemplo 9 Detección de LDL humana mediante 4G9 monoclonal en un ensayo competitivo

Según se describe en el ejemplo 3, se puede medir AGE de LDL usando anticuerpo monoclonal 4G9 inmovilizado en una fase sólida. En el presente ejemplo se usa un procedimiento similar que detecta la inhibición de la unión de un AGE de KLH marcado, el inmunógeno usado para producir 4G9, mediante co-incubación con una preparación de LDL modificada según se describe a continuación. Este formato de ensayo no distingue el componente proteico, ApoB, de los componentes lipídicos de la fracción de LDL del suero como es el caso en el ejemplo 3, y por lo tanto proporciona un peso de AGE total de la fracción de LSL.

Materiales y procedimientos

Se fabricó AGE de KLH al incubar 1 gramo de Hemocianina (Sigma Cat. #H2133) con 96 gramos de glucosa en tampón fosfato sódico 20 mM, pH 7,4, esterilizando la solución mediante un filtro de acetato de celulosa 0,2u e incubando durante 3 meses a 37ºC. Tras el periodo de incubación, la solución se dializó frente a salino esterilizado muchas veces, se filtró de manera esterilizada como antes, y se repartió en alícuotas de 1 ml. Se fabricó AGE de KLH biotinilado al disolver 2 mg de AGE de KLH en 1 ml de tampón borato 0,1 M, pH 8,5, y añadir 150 \mul de NHS-LC-Biotina (Pierce) fabricado en el último tampón a 12,5 mg/ml. La solución se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas, se dializó contra 4 cambios de 500 ml de PBS y el grado de biotinilación se determinó usando el reactivo HABA (Pierce) por las instrucciones del fabricante. Se modificó LDL humana (Cappel Company, #59392) por incubación de 1 mg/ml con glucosa 150 mM en un tampón fosfato de sodio 0,2 M, pH 7,4 a 37ºC durante 9 días.

Las placas de microvaloración de ELISA (Nunc) se recubrieron con 100 \mul de 4G9 purificado con proteína A disueltos en tampón carbonato 0,1 M pH 9,5 a una concentración de 10 \mug/ml e incubados durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron y se bloquearon con Tampón de Ensayo como se describe en Materiales y Procedimientos del ejemplo 3. Se hizo una serie de diluciones de la LDL modificada en el Tampón de Ensayo y se añadieron 0,5 \mul a la placa de microvaloración recubierta de anticuerpo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadieron a los pocillos 50 \mul de AGE de KLH biotinilado disuelto en el Tampón de Ensayo a 0,5 \mug/ml y la placa de microvaloración se hizo girar para mezclar las dos soluciones y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa de microvaloración se lavó como antes y se añadieron secuencialmente Avidina (Pierce) y fosfatasa alcalina biotinilada (Pierce) diluida hasta 1 \mug/\mul en el Tampón de Ensayo con lavados entre las adiciones e incubadas cada una durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras retirar la última solución y lavar, 100 \mul de p-nitrofenilfosfato sustrato (Sigma) a 1 mg/ml en tampón dietanolamina 1 M, pH 9,7 fabricado según las instrucciones del fabricante, se añadió a la placa de microvaloración y se incubó a temperatura ambiente. Se deja que la reacción del sustrato se desarrolle durante 1 hora y se lee a 410 nm en un lector de placa de microvaloración Dynatech MR5000.

Se desarrolló una cueva patrón mediante la competición de LDL modificado con AGE de KHL biotinilado por el anticuerpo monoclonal recubierto en el pocillo expresado como % de inhibición frente a \mug de AGE de LDL/pocillo. La figura 7 muestra la regresión de los valores obtenidos a partir del ensayo competitivo según se describe. A partir del gráfico resulta evidente que un aumento en la inhibición de AGE de KHL es un resultado del aumento de niveles de AGE de LDL unidos y detectados por el anticuerpo monoclonal 4G9. El ensayo, por lo tanto, presenta una alternativa y medios precisos para medir niveles de AGE de LDL.

Ejemplo 10

La repetición de los procedimientos detallados en el ejemplo 1 proporciona un anticuerpo monoclonal adicional, designado 2G6. Este anticuerpo, determinado para ser del mismo isotipo que 4G9, es decir, IgG_{t}K, se caracterizó mediante pruebas según los procedimientos detallados en el ejemplo 2-4 y se descubrió que posee las características de unión inmunológicas descritas para el anticuerpo monoclonal 4G9, cuya preparación se detalla en el ejemplo 1. En relación con esto, se llevó a cabo un ELISA competitivo para determinar las afinidades relativas de cada uno de los dos anticuerpos monoclonales, designados como 2G6 y 4G9, y los resultados de éstos se muestran en la tabla 2. Las actividades de todos los anticuerpos fueron virtualmente las mismas, dentro del intervalo de valores esperados en un ensayo competitivo de este tipo. En este aspecto, el antígeno, 6-(N-carboximetilamino)caproato disódico, designado en la tabla como ALT-927, se utilizó además en la caracterización de estos anticuerpos monoclonales.

TABLA 2

Caracterización con MAb
	Concentración del antígeno para la inhibición del 50% de
Antígeno (Unidades de conc.)	mAb 4G9	mAb 2G6
ALT-927 (pmol/pocillo)	5,7	11
Isotiocianato (M)	1,1	1,2
AGE de ASB (\mug/pocillo)	1,5	1,5
AGE de RNasa (\mug/pocillo)	0,50	0,47
AGE de KHL (\mug/pocillo)	0,066	0,076

ELISA competitivo: Placas recubiertas con AGE de ASB a 10 \mug/ml. Los valores son cantidad de inhibidor necesaria para el 50% de la inhibición de la unión. En el caso de isotiocianato las placas se empapan durante 15 minutos con concentraciones variables de isotiocianato y se mide el nivel de unión entonces.

Esta invención se puede realizar de otras formas o se puede llevar a cabo de otras maneras sin alejarse de las características esenciales de ésta. La presente descripción debe considerarse, por lo tanto, en todos los aspectos ilustrativa y no restrictiva.

Claims (23)

1.Un anticuerpo monoclonal, reactivo con productos finales de glicosilación avanzada (AGEs) producidos in vivo, en el que el antígeno al que se une el anticuerpo está competido por lisina o ácido 6-aminocaproico pardeado con glucosa con una CI_{50} de 5 x 10^{-4} M o menos, en el que la concentración de lisina o ácido 6-aminocaproico pardeado se basa en la concentración de lisina o ácido 6-aminocaproico sujeto a la reacción de pardeo, o siendo el anticuerpo uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales 4G9 producidos por el hibridoma 4G9 depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) el 27 de abril de 1994, con número de acceso CR 11626, y 2G6, producido por el hibridoma 2G6, depositado en la ATCC el 19 de diciembre, 1995, con número de acceso HB 12008.

2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, en el que el antígeno al que se une el anticuerpo está competido por ácido 6-aminocaproico pardeado con glucosa con una CI_{50} de 5 x 10^{-4} o menos.

3. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que es un anticuerpo humanizado o uno quimérico murino-humano.

4. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o reivindicación 2 que es un anticuerpo de isotipo IgG murino.

5. Uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales 4G9 o 2G6 según se define en la reivindicación 1.

6. Un fragmento de un anticuerpo monoclonal de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5.

7. El fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 6, que es un fragmento Fv de cadena sencilla, un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) o un fragmento F(ab')_{2}.

8. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 6 o la reivindicación 7 que está marcado.

9. Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Un procedimiento para detectar la presencia de AGEs en una muestra biológica que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener AGEs con el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 8 o el fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 bajo las condiciones que permiten la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno y los AGEs; y

b) detectar la formación de cualquiera de tales complejos de reacción en la muestra,

en el que la detección de la formación de tales complejos de reacción indican la presencia de AGEs en la muestra.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, que comprende además la puesta en contacto de la muestra con un AGE marcado en la etapa (a) y eliminar las sustancias no unidas antes de la etapa (b), en el que la formación de complejos de reacción en la muestra se detecta al observar un descenso en la cantidad de AGE marcado en la muestra.

12. El procedimiento de la reivindicación 10 en el que la formación de los complejos de reacción se observa al detectar la unión del anticuerpo monoclonal marcado o el fragmento de unión al antígeno marcado de la reivindicación 8 a tales complejos de reacción.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno está unido a un soporte de fase sólida.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en el que un AGE está unido a un soporte de fase sólida.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que el AGE es AGE de LDL o hemoglobina.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, que comprende además la evaluación de la cantidad de complejos de reacción formados, cuya cantidad corresponde al nivel de AGEs en la muestra biológica, por medio de la cual se hace una determinación de dicho nivel.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, que comprende además la comparación del nivel determinado de AGEs con un nivel de AGEs presente normalmente en un mamífero por medio de la cual se puede detectar o diagnosticar una enfermedad asociada con niveles elevados de AGEs si el nivel determinado está incrementado en comparación con el nivel normal.

18. Un procedimiento para supervisar el curso o el tratamiento terapéutico de una enfermedad asociada con niveles de AGE elevados en un mamífero que comprende la evaluación del nivel de AGEs en una serie de muestras biológicas de un mamífero obtenidas en tiempos distintos según el procedimiento de la reivindicación 17, en el que un aumento en el nivel de AGEs frente al tiempo indica la progresión de la enfermedad o el fallo del tratamiento y el descenso en el nivel de AGEs frente al tiempo indica la regresión de la enfermedad o un resultado terapéutico efectivo.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para detectar el inicio y/o supervisar el curso de una diabetes.

20. Un procedimiento para detectar el nivel de AGEs en una muestra biológica que comprende las etapas de:

a)

preparación de una serie de diluciones de una muestra sospechosa de contener AGEs usando cantidades conocidas de un tampón de dilución;

b)

poner en contacto muestras diluidas sospechosas de contener AGEs con el anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o con el fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 6 o reivindicación 7 en condiciones que permitan la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno y los AGEs; y

c)

poner en contacto una cantidad conocida de AGE marcado y el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno, cuyo AGE marcado se une al anticuerpo monoclonal o al fragmento no unido por la muestra, detectando el grado de formación de los complejos de reacción que comprenden el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno y AGEs marcados en la muestra;

en el que la detección del grado de formación de complejos anticuerpo-AGE marcados es inversamente proporcional al nivel de AGEs en la muestra.

21. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 6 o reivindicación 7 para uso en el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad, un síntoma de la cual es un nivel anormal de AGEs.

22. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 6 o reivindicación 7 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. Un kit de prueba para medir la presencia de una cantidad de AGEs en una muestra que comprende:

a)

el anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 6 o reivindicación 7;

b)

medios para detectar la formación de complejos de reacción entre el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno y AGEs; y

c)

otro reactivo.