CN111699000A - 靶沉默技术的细胞内递送 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于蛋白的治疗剂的细胞外囊泡(EV)介导的递送。更具体地说，本发明涉及复杂的基于多肽的药剂的递送，该药剂通常在细胞外、在细胞内或在细胞膜中与靶蛋白结合。

Description

靶沉默技术的细胞内递送

技术领域

本发明涉及诱导蛋白特异性蛋白介导的降解的药剂的递送。

背景技术

蛋白生物制品作为治疗剂在治疗和预防包含癌症、遗传紊乱和自身免疫性疾病在内的多种疾病中已经得到越来越多的应用。这些中的大多数是当今的畅销药物，并且由于它们的细胞外治疗活性，它们经常在没有任何递送剂的情况下施用。蛋白生物制品(例如重组产生的单克隆抗体)的最常见的作用方式是诱骗其细胞外靶，任选地随后增强免疫系统活化，例如通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

重要的是，细胞内环境高度地局限于大的基于蛋白的生物制品，这意味着细胞内靶蛋白的诱骗(例如沉默)在用于大多数蛋白治疗剂的范围之外。然而，在开发用于各种形式的RNA治疗剂(例如反义寡核苷酸、短干扰RNA、剪接转换RNA等)的递送载体方面已经做出了相当大的努力，这些RNA治疗剂干扰基因的表达或翻译，从而导致特定基因的沉默，并且重要的是，导致它们相应的蛋白的沉默。然而，RNA治疗剂并不处理靶蛋白的现有的群体，并且显示出针对长寿蛋白或其他抗消耗的蛋白的延迟的效力。因此，RNA治疗剂可能不太适合于其中需要快速作用治疗的急性病症，例如器官衰竭、中风或传染病。易于穿过细胞膜的小分子抑制剂的使用已经在靶蛋白的立即消耗/失活方面显示出功效，然而这些方法也充满了非特异性效应。US8530636、WO2012/078559、WO2010/125620教导了已经进行了翻译后蛋白消耗的尝试，然而这些方法对特定的靶蛋白是特异性的，并且缺乏新的药物形式或类别所要求的一般适用性。因此直到最近，还没有获得一种广泛适用的消耗靶蛋白群体的手段。TRIM-Away(Cliff等人，Cell，2018)是一种最近的系统，该系统能够以翻译后蛋白依赖性方式消耗特定的蛋白群体。该系统可广泛地应用于细胞内的大范围蛋白。TRIM-Away系统通过泛素连接酶的作用依赖于靶蛋白的泛素化。更具体地说，TRIM21(一种泛素连接酶)与靶向蛋白的抗体的Fc结构域特异性地相互作用；这种相互作用将靶蛋白带入通过TRIM21的适当泛素化中，这刺激靶蛋白的降解。TRIM-Away系统仅限于体外应用，因为TRIM21以及靶向相关蛋白的适当抗体的体内递送在体内环境中是相当大的障碍。TRIM系统(以及任何其它基于合适的泛素连接酶的作用的系统)的双组分性质也意味着常规的递送载体例如脂质纳米颗粒(LNP)、聚合物递送系统和/或脂质体不太可能是有效的，因为TRIM系统需要递送治疗相关剂量的泛素连接酶，并且在大多数情况下还需要递送针对靶蛋白的合适的抗体。

发明内容

因此，本发明的目的是克服围绕基于大生物分子泛素连接酶的蛋白降解技术的细胞内生物活性递送的上述问题。本发明解决了与复杂的蛋白降解系统的生产和递送相关的许多障碍，例如在一种递送载体中递送两种分离的大蛋白的问题；以使得能够实现蛋白生物制品例如泛素连接酶和介导靶蛋白降解的抗体的细胞内递送；使得能够实现基于泛素连接酶的蛋白降解系统的靶向递送；以及使得能够实现泛素连接酶(其任选地与合适的抗体结合)的规模化制造和纯化，以支持该技术在体内的治疗用途。

本发明的发明人已经惊奇地发现，细胞外囊泡(EV)(例如外泌体)可以被工程化以递送泛素连接酶，从而使得能够实现泛素介导的靶蛋白降解。因此，本发明涉及工程化的EV，其包括至少一种泛素连接酶但任选地还包括结合至待降解的靶蛋白的抗体。因此，本发明提供了一种高度可修饰的、可靶向的和模块化的递送载体，用于无法通过其他手段递送的非常复杂的生物系统。

在第一方面中，本发明涉及一种包括泛素连接酶的EV。泛素连接酶可以优选地为E3泛素连接酶，并且甚至更优选地为TRIM21连接酶或其结构域或区域。在优选的实施例中，泛素连接酶与外泌体蛋白融合，以便以每EV高数量的酶将连接酶装载到EV中。此外，在优选的实施例中，EV将优选地包括抗体，优选地针对细胞内靶的抗体。

在第二方面中，本发明提供了一种降解靶蛋白的方法，其包括以下步骤：(i)提供被抗体结合的靶抗原，和(ii)使用EV以将泛素连接酶递送到抗体的附近。在优选的实施例中，旨在结合至存在于被靶向降解的蛋白上的靶抗原的抗体也由EV(其可以任选地是相同的EV)递送。

在进一步的方面中，本发明涉及一种包括外泌体蛋白和泛素连接酶的多肽构建体，并且在另一些方面中，本发明涉及一种编码这样的多肽构建体的多核苷酸构建体，以及涉及一种包括多核苷酸构建体的载体。

在另一个方面中，本发明涉及一种用于生产如本文所描述的EV的方法。这样的用于EV生产的方法通常包括以下步骤：将至少一种多核苷酸构建体引入到EV产生细胞中并且在EV产生细胞中表达由至少一种多核苷酸构建体编码的至少一种多肽构建体。最后，通过用于EV分离和/或纯化的常规方法来获得由EV产生细胞所产生的EV。

在进一步的方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包括根据本发明的EV的群体，以及药学上可接受的赋形剂或稀释剂。药物组合物可以进一步包括至少一种抗体。自然地，本发明的EV、EV的群体和/或药物组合物可以用于医学，例如用于治疗癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病、心血管疾病和/或类似疾病。

附图说明

图1示出了根据本发明的各种实施例。从上到下，附图说明了(i)被工程化以包括多个拷贝的泛素连接酶(UL)的EV，(ii)被工程化以包括外泌体蛋白(EP)和泛素连接酶之间的融合多肽的EV，其中(a)外泌体蛋白是膜蛋白，例如CD63，(b)外泌体蛋白是可溶性蛋白，例如syntenin，(c)外泌体蛋白从泛素连接酶中释放，(iii)被工程化以在管腔中包括多个拷贝的泛素连接酶的EV，其与附着于其表面的抗体(AB)结合，这可以通过外泌体蛋白和Fc结合多肽(FBP)之间的融合蛋白的表达来实现，和(iv)被工程化以包括泛素连接酶和外泌体蛋白之间的融合多肽的EV，其中泛素连接酶(其可以有利地为TRIM21)与针对靶蛋白的抗体结合。

图2示出了在用包括TRIM21和抗GFP抗体的EV处理后靶细胞中GFP的减少。当包括泛素连接酶(TRIM21)和抗GFP抗体的组合的EV与表达GFP的细胞共孵育时，观察到GFP减少的最大效果，而EV、抗体或泛素连接酶的单独组合几乎没有效果。

图3示出了通过细胞与包括抗NFkB抗体和TRIM21的EV的共孵育的NFkB途径抑制的剂量反应。装载的EV的浓度的增加进一步增加了报告细胞系中的抑制反应。

具体实施方式

本发明的发明人已经惊奇地发现，细胞外囊泡(EV)(例如外泌体)可以被工程化以递送泛素连接酶，从而使得能够实现泛素介导的靶蛋白降解。EV是由EV产生细胞分泌到细胞外环境中的天然存在的纳米大小的囊泡。EV，并且特别是外泌体，已经被证明能够将蛋白生物制品(例如抗体和诱骗受体)转运到靶细胞中，使得能够实现利用EV的特性与重组蛋白的特异性相结合的全新形式的先进生物治疗剂。相对于常规的生物制品给药方法，EV提供了若干个优点。例如，当使用EV递送生物治疗剂时，它们被保护免于降解并且更稳定；EV构成一种多价药物递送方式，其可能会导致增强的功效；EV可以改善蛋白生物制品的药代动力学和药效学；EV可以靶向相关组织和细胞；EV可能具有反映其细胞源性的固有治疗作用；并且，EV还使得能够渗透血脑屏障并改善CNS递送。

因此，本发明涉及工程化的EV，其包括至少一种泛素连接酶但任选地还包括结合至待降解的靶蛋白的抗体。此外，本发明涉及如将在下文中更详细地描述的各种相邻方面，例如有助于EV的装载和逃逸的多肽构建体、编码这样的多肽构建体的多核苷酸构建体、包括这样的多核苷酸和/或多肽构建体的载体和细胞、生产方法、包括多个这样的含多肽的EV的组合物，以及这样的EV和包括这样的EV的药物组合物的医学应用。因此，本发明提供了一种高度可修饰的、可靶向的和模块化的递送载体，用于无法通过其他手段递送的非常复杂的生物系统。

为了方便和清楚，本文使用的某些术语在下面被收集并描述。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

为了方便和清楚，本文使用的某些术语在下面被收集并描述。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，结合EV描述的泛素连接酶应被理解为在含有泛素连接酶的多肽的上下文中以及在包含EV的药物组合物(其又包含这样的多肽构建体)的上下文中被公开并且也是相关的，或者作为根据本发明的多核苷酸构建体的表达产物。此外，结合某些方面描述的某些实施例，例如如关于与治疗某些医学适应症相关的方面描述的EV的给药途径，自然也可以与其他方面和/或实施例(例如与本发明的药物组合物或细胞内递送方法相关的方面/实施例)相关。总的来说，在不偏离本发明的范围和主旨的情况下，泛素连接酶、抗体、外泌体分选结构域(可互换地被称为EV分选结构域或EV蛋白或类似物)、多聚化结构域、切割结构域、内泌体逃逸结构域和靶向部分、细胞来源以及根据本发明的所有其他方面、实施例和替代方案可以以任何和所有可能的组合自由地组合。此外，本发明的任何多肽或多核苷酸或任何多肽或多核苷酸序列(分别是氨基酸序列或核苷酸序列)可以显著地偏离原始的多肽、多核苷酸和序列，只要任何给定的分子保持实现与其相关的技术效果的能力。只要它们的生物学特性被保留，根据本申请的多肽和/或多核苷酸序列与天然序列相比可以偏离多达50％(例如使用BLAST或ClustalW计算的)，尽管尽可能高的序列同一性是优选的。例如，至少一种泛素连接酶和至少一种外泌体分选结构域的组合(融合)意味着相应多肽的某些片段可以被替换和/或修饰，这意味着只要关键特性是保守的，与天然序列的偏离可能是相当大的。因此，类似的推理自然适用于编码这样的多肽的多核苷酸序列。

术语“细胞外囊泡”或“EV”或“外泌体”应被理解为涉及例如可从细胞获得的任何类型的囊泡，例如微囊泡(例如从细胞的质膜脱落的任何囊泡)、外泌体(例如从溶酶体内途径获得的任何囊泡)、凋亡体(例如可从凋亡细胞获得)、微粒(其可以从例如血小板获得)、核外颗粒体(可从例如血清中的中性粒细胞和单核细胞获得)、前列腺小体(例如可从前列腺癌细胞获得)或心脏小体(例如可从心脏细胞获得)等。此外，所述术语也应被理解为涉及脂蛋白颗粒，例如LDL、VLDL、HDL和乳糜微粒，以及细胞外囊泡模拟物、通过膜挤出或其他技术获得的细胞膜囊泡等。本质上，本发明可以涉及任何类型的基于脂质的结构(具有囊泡形态或具有其他任何类型的合适形态)，其可以充当用于泛素连接酶和任选地抗体的递送或转运载体。对于本领域技术人员来说将明显的是，当描述EV的医学和科学用途和应用时，本发明通常涉及多个EV，即，可能包括数千、数百万、数十亿或者甚至数万亿EV的EV群体，例如，每单位体积诸如10⁵、10⁸、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁸、10²⁵、10³⁰的浓度。同样，术语“群体”，其可以例如涉及包括泛素连接酶和抗体的各种组合或呈递的EV，应被理解为涵盖一起构成这样的群体的多个实体。换句话说，当以多个存在时，单个EV构成EV群体。因此，自然地，本发明既涉及包括泛素连接酶或泛素连接酶和抗体的各种组合的个体EV，并且也涉及包括EV的群体(其进而包括这样的泛素连接酶和/或抗体构建体)，如对于本领域技术人员来说将明显的。

如本文所描述的术语“抗体”和“mAb”和“Ab”应被理解为包含以其完整形式的抗体(即完整的抗体)及其任何具有抗原结合特性的衍生物。通常，抗体是指包括通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中被缩写为V_H)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文中被缩写为V_L)和轻链恒定区组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。V_H和V_L区可以进一步被细分为高变区(其被称为互补决定区(CDR))，其间散布有更保守的区域(被称为框架区(FR))。重要的是，为了本发明的目的，相关抗体优选地具有Fc结合物可以结合的Fc结构域，以便能够实现EV表面的包被。用于本发明的抗体可以是单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体，优选地是mAb。用于本发明的抗体可以是嵌合抗体、CDR移植抗体、纳米体、人或人源化抗体或其任何衍生物，只要它可以被包括在根据本发明的融合蛋白中的Fc结合蛋白结合。抗体的产生在本发明的范围之外，但是通常单克隆抗体和多克隆抗体都是在非人哺乳动物例如山羊、兔、大鼠或小鼠中通过实验产生的，但是合适的抗体也可以是其他产生方法(例如Kohler和Milstein的标准体细胞杂交技术)的结果。用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。在小鼠中的杂交瘤产生是一个非常成熟的程序，并且可以使用本领域中熟知的技术来实现。用于本发明的抗体可以是人抗体、人源化抗体和/或任何类型的嵌合抗体。如本文所使用的术语“人抗体”旨在包含具有可变区的抗体，其中框架和CDR区都来自人种系免疫球蛋白序列。用于本发明的人抗体可以包含未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或位点特异性诱变或由体内体细胞突变引入的突变)。术语“抗体衍生物”是指抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种药剂或抗体的缀合物。术语“人源化抗体”旨在是指其中来自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人类框架序列上的抗体。可以在人类框架序列中进行额外的框架区修饰。根据本发明的抗体可以包含所有的同种型和亚型，例如IgG、IgA、IgM、IgM、IgD等，及其单体、二聚体和寡聚体。此外，当在EV上展示时，根据本发明的抗体可以具有若干种功能：(1)根据本发明的优选的实施例，抗体可以识别并且结合至包括在特定靶生物分子中的抗原，所述抗原意味着使用如本文所描述的泛素连接酶系统降解；(2)抗体可以靶向特定的细胞类型、组织和/或器官，以便重新定向分布和优化如本文所描述的基于EV的治疗剂的递送；(3)与相关靶抗原相互作用的治疗性抗体可以使用EV被有效地递送至相关组织(例如递送至CNS或递送至大脑)；(4)EV的表面上的多重抗体可以显著更好地结合靶抗原(包含旨在经历泛素连接酶触发的降解的靶抗原)；(5)抗体-药物缀合物(ADC)可以在EV上多重化以显著地增强其治疗功效；以及(6)用抗体包被EV可以降低EV的调理作用和/或免疫介导的清除，这进而对治疗活性可能是重要的。

术语“EV蛋白”和“EV多肽”、“外泌体多肽”和“外泌体蛋白”以及类似物在本文中可互换使用，并且应被理解为涉及可以用于将多肽构建体(除EV蛋白外，其通常还包括Fc结合多肽)转运至合适的囊泡结构(即转运至合适的EV)的任何多肽。更具体地，这些术语应被理解为包括能够将融合蛋白构建体转运、贩运或穿梭至囊泡结构(例如EV)的任何多肽。这样的外泌体多肽的示例是例如CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71(也被称为运铁蛋白受体)及其内泌体分选结构域(即运铁蛋白受体内泌体分选结构域)、CD133、CD138(syndecan-1)、CD235a、ALIX、Syntenin-1，Syntenin-2、Lamp2b、syndecan-2、syndecan-3、syndecan-4、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II组分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、TSG101、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B，其他外泌体多肽及其任何组合，但是能够将多肽构建体转运至EV的许多其他多肽也包括在本发明的范围内。通常，在本发明的许多实施例中，将至少一种外泌体多肽与至少一种泛素连接酶和/或基本上任何Fc结合多肽融合，以便形成存在于EV中的融合蛋白。这样的融合蛋白还可以包括优化其功能的各种其他组分，包含接头、跨膜结构域、胞质结构域、多聚化结构域等。本文提及的蛋白和多肽优选是人来源的，但也可以获自其他哺乳动物或非哺乳动物。

术语“源细胞”或“EV源细胞”或“亲代细胞”或“细胞来源”或“EV产生细胞”或任何其它类似的术语应被理解为涉及通常在合适的细胞培养条件下，在体外、离体或体内能够产生EV(例如外泌体)的任何类型的细胞。这样的条件可以是悬浮细胞培养或贴壁细胞培养或任何其他类型的培养系统。中空纤维生物反应器、振荡培养箱和其他类型的生物反应器代表高度适合的细胞培养基础设施，并且用于悬浮细胞的各种生物反应器也是如此。根据本发明的源细胞可以选自多种细胞和细胞系，例如间充质干细胞或基质细胞或成纤维细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、沃顿果冻、围产期组织、胎盘、羊膜、牙胚、脐带血、皮肤组织等获得)、羊膜细胞(并且更具体地是羊膜上皮细胞，其任选地表达各种早期标记物)等。特别相关细胞系包含人脐带内皮细胞(HUVEC)、人胚胎肾(HEK)细胞、人羊膜上皮细胞、内皮细胞系例如微血管或淋巴内皮细胞、软骨细胞、MSC、气道或肺泡上皮细胞，以及细胞来源的各种其他非限制性示例。如上所述，MSC可以从各种来源获得，例如骨髓、脂肪组织、沃顿果冻、围产期组织(例如羊膜、羊膜、羊水、绒毛膜、胎盘、脐带、沃顿果冻)、牙胚、脐带血、皮肤等。一般来说，产生EV的源细胞对于待治疗的患者来说本质上可以是同种异体的、自体的或者甚至是异种的，即细胞可以来自患者本人或者来自不相关的或相关的、匹配的或不匹配的供体。本发明的源细胞优选地是人类来源，特别是当待治疗的受试者是人类时。然而，其他产生EV的细胞来源也在本发明的范围内，例如可从其他哺乳动物、啮齿动物或任何其它合适的物种或属获得的细胞。

在第一方面中，本发明涉及被工程化以包括泛素连接酶的EV。通过使用基因工程化和过表达策略，可以将泛素连接酶的多个拷贝装载到每个囊泡(例如每个外泌体)中，这意味着EV的任何群体都将包括大量的泛素连接酶。EV为泛素连接酶提供了一种独特的转运手段，尤其是在体内环境中。此外，EV提供了这样的平台，在该平台中多种生物活性大分子可以被结合和递送，从而使得能够转运具有额外活性组分的泛素连接酶，包含针对特定组织的主动靶向、免疫逃避、生物活性的DNA/RNA物种、生物活性的蛋白物种(例如抗体)和生物活性的小分子。

在本发明的一个实施例中，EV中包括的泛素连接酶是E3泛素连接酶。E3泛素连接酶直接参与其靶的泛素化，并且因此介导蛋白特异性蛋白调节。虽然优选的是将单一种类的E3泛素连接酶与EV装载(结合)，但是可以将若干个种类的E3连接酶与EV装载。E3泛素连接酶可以选自以下组中的泛素连接酶中的任何一种：AFF4、AMFR、ANAPC11、ANKIB1、AREL1、ARIH1、ARIH2、BARD1、BFAR、BIRC2、BIRC3、BIRC7、BIRC8、BMI1、BRAP、BRCA1、CBL、CBLB、CBLC、CBLL1、CCDC36、CCNB1IP1、CGRRF1、CHFR、CNOT4、CUL9、CYHR1、DCST1、DTX1、DTX2、DTX3、DTX3L、DTX4、DZIP3、E4F1、FANCL、G2E3、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECTD4、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HERC5、HERC6、HLTF、HUWE1、IRF2BP1、IRF2BP2、IRF2BPL、Itch、KCMF1、KMT2C、KMT2D、LNX1、LNX2、LONRF1、LONRF2、LONRF3、LRSAM1、LTN1、MAEA、MAP3K1、MARCH1、MARCH10、MARCH11、MARCH2、MARCH3、MARCH4、MARCH5、MARCH6、MARCH7、MARCH8、MARCH9、Mdm2、MDM4、MECOM、MEX3A、MEX3B、MEX3C、MEX3D、MGRN1、MIB1、MIB2、MID1、MID2、MKRN1、MKRN2、MKRN3、MKRN4P、MNAT1、MSL2、MUL1、MYCBP2、MYLIP、NEDD4、NEDD4L、NEURL1、NEURL1B、NEURL3、NFX1、NFXL1、NHLRC1，NOSIP、NSMCE1、PARK2、PCGF1、PCGF2、PCGF3、PCGF5、PCGF6、PDZRN3、PDZRN4、PELI1、PELI2、PELI3、PEX10、PEX12、PEX2、PHF7、PHRF1、PJA1、PJA2、PLAG1、PLAGL1、PML、PPIL2、PRPF19、RAD18、RAG1、RAPSN、RBBP6、RBCK1、RBX1、RC3H1、RC3H2、RCHY1、RFFL、RFPL1、RFPL2、RFPL3、RFPL4A、RFPL4AL1、RFPL4B、RFWD2、RFWD3、RING1、RLF、RLIM、RMND5A、RMND5B、RNF10、RNF103、RNF11、RNF111、RNF112、RNF113A、RNF113B、RNF114、RNF115、RNF121、RNF122、NF123、RNF125、RNF126、RNF128、RNF13、RNF130、RNF133、RNF135、RNF138、RNF139、RNF14、RNF141、RNF1 44A、RNF144B、RNF145、RNF146、RNF148、RNF149、RNF150、RNF151、RNF152、RNF157、RNF165、RNF166、RNF167、RNF168、RNF169、RNF17、RNF170、RNF175、RNF180、RNF181、RNF182、RNF183、RNF185、RNF186、RNF187、RNF19A、RNF19B、RNF2、RNF20、RNF207、RNF208、RNF212、RNF212B、RNF213、RNF214、RNF215、RNF216、RNF217、RNF219、RNF220、RNF222、RNF223、RNF224、RNF225、RNF24、RNF25、RNF26、RNF31、RNF32、RNF34、RNF38、RNF39、RNF4、RNF40、RNF41、RNF43、RNF44、RNF5、RNF6、RNF7、RNF8、RNFT1、RNFT2、RSPRY1、SCAF11、SH3RF1、SH3RF2、SH3RF3、SHPRH、SIAH1、SIAH2、SIAH3、SMURF1、SMURF2、STUB1、SYVN1、TMEM129、Topors、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRAF7、TRAIP、TRIM10、TRIM11、TRIM13、TRIM15、TRIM17、TRIM2、TRIM21、TRIM22、TRIM23、TRIM24、TRIM25、TRIM26、TRIM27、TRIM28、TRIM3、TIM31、TRIM32、TIM33、TIM34、TRIM35、TRIM36、TRIM37、TRIM38、TRIM39、TRIM4、TRIM40、TRIM41、TRIM42、TRIM43、TRIM43B、TRIM45、TRIM46、TIM47、TRIM48、TRIM49、TRIM49B、TRIM49C、TRIM49D1、TRIM5、TRIM50、TRIM51、TIM52、TIM54、TIM55、TRIM56、TRIM58、TRIM59、TIM6、TRIM60、TRIM61、TRIM62、TRIM63、TIM64、TIM64B、TRIM64C、TRIM65、TRIM67、TRIM68、TRIM69、TRIM7、TRIM71、TRIM72、TRIM73、TRIM74、TRIM75P、TRIM77、TRIM8、TRIM9、TRIML1、TRIML2、TRIP12、TTC3、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE3D、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR1、UBR2、UBR3、UBR4、UBR5、UBR7、UHRF1、UHRF2、UNK、UNKL、VPS11、VPS18、VPS41、VPS8、WDR59、WDSUB1、WWP1、WWP2、XIAP、ZBTB12、ZFP91、ZFPL1、ZNF280A、ZNF341、ZNF511、ZNF521、ZNF598、ZNF645、ZNRF1、ZNRF2、ZNRF3、ZNRF4、Zswim2、ZXDC。本发明的连接酶可以被产生EV的源细胞过表达，即EV产生细胞可以被基因工程化以大量表达本文的连接酶，以便产生工程化的、修饰的EV。

在优选的实施例中，E3泛素连接酶是TRIM连接酶，优选地TRIM21连接酶或其任何结构域、区域或功能衍生物。许多TRIM连接酶(例如TRIM21连接酶)具有结合Fc结构域的能力，这使得能够双重使用TRIM连接酶作为(1)自身的抗体结合物，其可以用于用抗体包被EV，和(2)通过TRIM连接酶的酶促泛素连接酶活性作为泛素诱导的靶蛋白降解的介体，其导致蛋白酶体介导的靶蛋白降解。

根据本发明的特别有利的融合蛋白可以包括与泛素连接酶的至少一个拷贝融合的EV蛋白CD63、CD81、CD9、Lamp2、syndecan和syntenin。将泛素连接酶(例如任何TRIM连接酶，例如TRIM21)设计为存在于EV的管腔内有时是优选的，以便防止TRIM21的Fc结合结构域与血清中天然存在的Fc结构域的相互作用。因此，在优选的实施例中，泛素连接酶基本上存在于EV内，即大多数泛素连接酶存在于囊泡内。这可以通过将泛素连接酶融合至合适的EV蛋白来实现，所述合适的EV蛋白存在于EV的管腔内，或者可以用作融合配偶体来定位EV内的泛素连接酶。这样的EV蛋白的示例包含若干个四链体的合适的结构域和部分，例如CD63，但也包含可溶性的EV蛋白，例如syntenin、syndecan或Alix。由于TRIM21通常与Fc结构域结合，暴露于像血清的环境可能会导致其结合环境抗体，从而使靶向降解能力更低效。然而，在替代的实施例中，TRIM21可以存在于EV的膜内或存在于EV的表面上。

在另外的方面中，EV将进一步包括抗体。这样的抗体可以使用TRIM连接酶(例如TRIM21)对抗体的Fc结构域的天然亲和力被装载到EV中或被装载到EV上。然而，抗体也可以通过其他手段例如与EV蛋白融合或通过将Fc结合多肽引入到EV中而被装载到EV中。除了抗体外，任何类型的多肽和/或蛋白都可以融合至Fc结构域，以便使泛素连接酶(例如TRIM)能够与其相互作用。这样的融合至Fc结构域的蛋白也可以用于蛋白靶向，包含纳米体、亲合体、DARPin、Fab、scFv、VL、VH、单体、抗铁蛋白(anticailin)以及任何其它与FC结构域融合的蛋白。自然地，一个单个EV可以包括有多于一种类型的含Fc结构域的蛋白，例如结合至不同抗原的两种不同类型的抗体，以便能够实现例如同时靶向。通常情况下，一个单个EV也可以包括大量的一种单一类型的含Fc结构域的蛋白，例如一种单克隆抗体。靶向抗体、治疗性抗体、抗体-药物缀合物(ADC)和用于减少调理作用和/或免疫细胞介导的清除的抗体的各种组合构成了本发明的优选实施例。在有利的实施例中，根据本发明的EV包括多个包括Fc结构域的蛋白。因此，本发明可以容纳至少10种包括Fc结构域的蛋白，优选地至少50种包括Fc结构域的蛋白，甚至更优选地至少100种包括Fc结构域的蛋白。这样的蛋白可以是同一种蛋白或多于一种的蛋白的拷贝。在一个实施例中，与EV相关的抗体具有位于细胞内、细胞外和/或位于跨膜定位中的特异性靶。优选的是细胞内靶，因为它能够利用宿主细胞的泛素化和降解途径，但是细胞外靶也具有很强的治疗意义。有利地，EV可以包括多于一种类型的抗体，其中亚组与用于泛素化的细胞内靶相互作用，并且另一个亚组与细胞外靶相互作用，有利于靶向特定组织或细胞类型。设想抗体的混合群体可能仅存在于EV管腔内，仅存在于EV的外部，或者存在于EV的内部和外部。示例可以是将与用于靶向降解的细胞内靶相关的抗体装载在管腔内，并且将与组织靶向相关的抗体展示在EV表面上。

在进一步的实施例中，附着于EV的外表面的抗体通过与EV表面的非共价相互作用而附着，例如通过与特定抗体结合蛋白例如蛋白A的Z结构域的相互作用或通过任何Fc受体，例如FCGRI(CD64)、FCGR2A(CD32A)、FCGR2B(CD32B)、FCGR2C(CD32C)、FCGR3A(CD16A)、FCGR3B(CD16B)、FCAMR、FCERA、FCAR或小鼠FCGRI、FCGRIIB、FCGRIII、FCGRIV和/或FCGRn。可替代地，可以通过共价结合来促进EV-抗体相互作用，例如，带有正确配体的适当修饰的抗体连接到带有适当化学受体的EV上，例如用于通过叠氮化物-炔环加成形成琥珀酰亚胺酯或连接。可替代地，如上所述，本文提及的外泌体多肽可以用于将抗体直接装载到EV中和/或EV上，但是外泌体多肽还可以用于与Fc结合多肽一起产生融合多肽，所述Fc结合多肽于是进而可以结合至抗体的Fc结构域。如上所述，抗体的Fc结构域可以例如使用例如TRIM21的抗体结合能力被EV中包括的Fc结合多肽和/或事实上被泛素连接酶本身结合。泛素连接酶和抗体(通常是IgG抗体)的Fc结构域之间的这种相互作用可以发生在多种环境中，例如在细胞内EV祖细胞环境中，在任何EV生产过程期间，在含有血清的环境例如细胞外环境中以及在含有抗体的靶的细胞内环境中。

在本发明的进一步的实施例中，EV可以进一步包括泛素缀合酶(例如E2泛素缀合酶)和/或泛素激活酶(例如E1泛素激活酶)。通过将泛素连接酶系统的这些额外组分工程化为EV，整个泛素化机制被包括在单个囊泡中，这意味着靶蛋白的降解非常高效。

在进一步的方面中，本发明涉及一种用于降解靶蛋白的方法，其包括以下步骤：(i)提供被抗体结合的靶抗原，和(ii)使用EV将泛素连接酶递送到抗体的附近。所述用于降解靶蛋白的方法可以是体外或非治疗性方法。

在另一个方面中，本发明涉及一种通过使用EV递送泛素连接酶和抗体来降解靶蛋白的方法。靶蛋白的降解是通过由EV递送的泛素连接酶对其进行的泛素化作用引起的。通过合适的抗体来促进靶蛋白(抗原)的识别，所述抗体本质上充当靶蛋白/抗原和泛素连接酶之间的衔接分子。虽然用于蛋白降解的优选的方法是在相同的EV中或至少在相同的EV群体中通过EV介导的泛素连接酶和抗体的共递送，但是它们的递送可以是独立的事件。此外，递送和抗原-抗体相互作用可能是与泛素连接酶递送完全独立的事件。因此，在优选的后续实施例中，抗体和泛素连接酶都由EV递送，并且优选地由相同的EV递送。

在进一步的方面中，本发明还涉及本发明的多核苷酸和多肽构建体。根据本发明的多核苷酸构建体通常包括编码至少一种泛素连接酶和至少一种外泌体多肽的核苷酸片段。非限制性示例将是编码泛素连接酶(优选地E3泛素连接酶，更优选泛素连接酶TRIM21)以及任何外泌体多肽的多核苷酸构建体。优选的外泌体多肽包含CD81、syntenin、syndecan、CD63、Alix、转铁蛋白受体、转铁蛋白受体的内泌体结构域等。因此，本发明自然也涉及相应的多肽构建体，即包括至少一种泛素连接酶多肽和至少一种外泌体多肽的多肽构建体。此外，本发明还涉及包括上述多核苷酸构建体和/或上述多肽的EV产生细胞(通常以细胞培养物的形式存在的细胞，但同样也包括单独的细胞)。

在另一个实施例中，本发明的EV进一步包括至少一个靶向部分。典型地，靶向部分存在于EV的表面上(即从EV膜突出到囊外环境中)，以便于在体内和/或体外达到正确的组织或细胞类型。EV还可以进一步包括增强泛素连接酶到EV中的装载及其在受体细胞中的功能的元件。这样的元件包含增强EV装载的多聚化结构域、增强摄取后EV货物的逃逸效率的内泌体逃逸结构域、提高EV腔内货物的溶解度的释放结构域。多肽构建体可以包括泛素连接酶、外泌体蛋白、靶向部分或增强元件作为单一实体，或者可替代地，这些不同的结构域可以存在于单独的多肽构建体中，该单独的多肽构建体可以由单个或多个多核苷酸构建体编码。

在另一个方面中，本发明涉及一种包括如本文所描述的多核苷酸构建体的载体。这样的载体可以用于产生装载有泛素连接酶和任选地抗体的EV，但它们本身也可以用作治疗剂。携带根据本发明的多核苷酸构建体的载体的非限制性示例包含任何线性或环化的多核苷酸、环状DNA或RNA多核苷酸、质粒、小环、病毒例如腺病毒或慢病毒、腺相关病毒、无衣壳病毒、病毒基因组、mRNA和/或修饰的mRNA。

将合适的多核苷酸构建体引入到源细胞中(通常在包括用于产生EV的合适的EV产生细胞类型的细胞培养物中)可以使用多种常规的技术(例如转染、病毒介导的转化、电穿孔等)来实现。转染可以使用常规的转染试剂(例如脂质体、CPP、阳离子脂质或聚合物、磷酸钙、树枝状聚合物等)进行。病毒介导的转导也是非常合适的方法，并且可以使用常规的病毒载体(例如腺病毒或慢病毒载体)来实现。用于稳定转染的病毒介导的转导和非病毒方法当为用于研究和开发目的的细胞库创建稳定的细胞和细胞系时特别相关，即产生EV的细胞来源的主细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)的创建。本发明的多核苷酸构建体和/或载体可以用于在生产细胞中过表达泛素连接酶，从而增加被引入到由生产细胞生产的EV中的泛素连接酶的水平。这有利地导致装载有更高水平的泛素连接酶的基因工程化的EV，因此其具有更强的治疗效力，这意味着需要每剂量更少的EV来实现相同的治疗效果。

在另一个方面中，本发明涉及一种用于生产根据本发明的EV的方法。所述方法可以包括以下步骤：(i)将至少一种如本文所描述的多核苷酸构建体引入到EV产生细胞中，(ii)在EV产生细胞中表达至少一种由所述至少一种多核苷酸构建体编码的多肽构建体；和(iii)获得由所述EV产生细胞产生的EV。EV的生产规模和时间线将严重依赖于EV产生细胞或细胞系，并且因此可以由本领域技术人员相应地调整。根据本发明的方法可以进一步包括EV纯化步骤。在其中抗体或任何其它类型的含Fc的蛋白待附着于EV表面上的Fc结合多肽的情况下，EV也可以以一个步骤通过与所讨论的含Fc结构域的蛋白(通常是抗体)共孵育。这可以在通过产生EV的源细胞的EV产生后立即发生，或者其可以在使用各种纯化和分离技术纯化EV一次或多次后发生。可以通过选自包括以下的一组技术的一种或多种程序来纯化EV：液相色谱法(LC)、离子交换LC、尺寸排阻LC、珠洗脱LC、高效液相色谱法(HPLC)、旋转过滤、切向流过滤(TFF)、中空纤维过滤、离心、免疫沉淀、流场分级、透析、基于微流体的分离等，或其任意组合。在有利的实施例中，使用过滤(优选地超滤(UF)、切向流过滤或中空纤维过滤)和尺寸排阻或离子交换液相色谱法(LC)或珠洗脱LC的顺序组合来进行EV的纯化。纯化步骤的这种组合导致优化的纯化，这进而导致优异的治疗活性。

在进一步的实施例中，所述方法可以包含将额外的多核苷酸构建体引入到EV产生细胞中，其中所述额外的构建体编码Fc结合多肽，所述Fc结合多肽因此被装载到EV中，用于结合至抗体和/或包括Fc结构域的其他蛋白。从这样的生产细胞产生EV是有利的，因为它们在其表面上包括用于结合含Fc多肽如抗体的Fc结合组分，从而增强EV靶向性。有利地，根据本发明的EV因此可以通过被工程化到EV中的Fc结合物和至少一种包括Fc结构域的蛋白之间的相互作用而被包括Fc结构域的多种蛋白包被。Fc结合物和蛋白(通常是包括Fc结构域的抗体)之间的相互作用通常主要基于非共价相互作用。自然地，一个单个EV可以用多于一种类型的含Fc结构域的蛋白(例如与不同的抗原结合的两种不同类型的抗体)包被，以便能够实现例如同时靶向和治疗性抗原结合用于随后的泛素介导的降解。通常情况下，一个单个EV也可以包括大量的一种单一类型的含Fc结构域的蛋白，例如一种具有特定靶的单克隆抗体。如上所述，抗体可以通过生产细胞的外源性装载或内源性生产而被引入到EV中。典型地，抗体或抗体衍生物的外源性添加是在由生产细胞产生EV之后进行的。可替代地，抗体或抗体衍生物可以在EV产生细胞中内源性产生，并在细胞内与EV结合。

在另一个方面中，本发明涉及根据本发明的包括EV(通常以EV的群体的形式)的药物组合物。典型地，根据本发明的药物组合物包括一种类型的用至少一种药学上可接受的赋形剂配制的治疗性EV(即，包括某种类型的融合蛋白(其包括外泌体蛋白和泛素连接酶)以及任选地包括一种或多种类型的抗体的EV的群体)，但是在药物组合物中自然地可以包括多于一种类型的EV群体，例如在其中组合的蛋白降解治疗是期望的情况下。然而，自然地，如上所述，单个EV或EV的单个群体可以包括多于一种的泛素连接酶和多于一种的含Fc的蛋白(例如多于一种的抗体)。所述至少一种药学上可接受的赋形剂可以选自包括以下的组：任何药学上可接受的材料、组合物或载体，例如固体或液体填充剂、稀释剂、赋形剂、载体、溶剂或包封材料，其可以参与例如悬浮、维持EV群体的活性或将EV群体从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的一部分(例如从血液到任何相关组织和/或器官和/或身体的一部分)。在进一步的实施例中，药物组合物可以进一步包括至少一种抗体。该组合物可以含有单一抗体种类或若干种抗体种类。

在另一个方面中，本发明涉及根据本发明的EV，用于医学。自然地，当包括外泌体蛋白和泛素连接酶以及一种或多种类型的抗体的EV用于医学时，实际上EV的群体是通常使用的。向患者施用的EV的剂量将取决于例如含有泛素连接酶的E V的数量、与EV结合的相关抗体、待治疗或缓解的疾病或症状、施用途径、治疗蛋白本身的药理作用、EV的固有特性、任何靶向抗体或其他靶向实体的存在以及技术人员已知的各种其他相关参数。

因此，根据本发明的EV及其EV群体可以用于预防和/或治疗目的，例如用于预防和/或治疗和/或减轻各种疾病和紊乱。其中可以应用根据本发明的EV的疾病的非限制性例子包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、结节病、特发性肺纤维化、牛皮癣、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关的周期性综合征(TRAPS)、白细胞介素1受体拮抗剂(DIRA)缺乏、子宫内膜异位、自身免疫性肝炎、硬皮病、肌炎、中风、急性脊髓损伤、血管炎、格林巴利综合征、急性心肌梗死、ARDS、败血症、脑膜炎、脑炎、肝衰竭、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾衰竭、心力衰竭或任何急性或慢性器官衰竭以及相关的病因、移植物抗宿主病、杜氏肌营养不良症和其他肌营养不良、溶酶体贮积病(例如高雪氏病、法布里氏病、MPS I、MPS II(亨特综合征)和MPS III、尼曼-皮克病、庞贝氏病等)、神经退行性疾病(包含阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和其他三核苷酸重复相关疾病、痴呆、ALS)、癌症引起的恶病质、厌食症、2型糖尿病和各种癌症。实际上，所有类型的癌症都是用于本发明的相关疾病靶标，例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关的癌症、AIDS相关的淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、小脑或脑、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑癌、脑肿瘤(小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特氏淋巴瘤、类癌瘤(儿童、胃肠道)、原发性未知癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性骨髓性白血病、慢性骨髓增殖性粒细胞性白血病紊乱、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、增生性小圆形细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌(眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃癌(胃部癌)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(颅外、性腺外或卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤(脑干神经胶质瘤、脑星形细胞瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤)、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌(肝癌)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽喉癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波济肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病((急性淋巴母细胞疾病(也被称为急性淋巴细胞白血病)、急性骨髓性疾病(也被称为急性骨髓性白血病)、慢性淋巴细胞性疾病(也被称为慢性淋巴细胞性白血病)、慢性骨髓性疾病(也被称为慢性骨髓性白血病)、毛细胞白血病))、口唇癌、口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤、AIDS相关的淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成髓细胞瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、具有原发性隐匿性的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/血浆细胞瘤、霉菌病、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病(急性、慢性)、骨髓瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质肿瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、甲状旁腺癌、阴茎尼罗河癌症、咽喉癌、嗜铬细胞瘤、松果星形细胞瘤、松果生殖瘤、松果母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(尤文氏肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤)、塞扎里综合征、皮肤癌(非黑色素瘤、黑色素瘤)、小肠癌、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和/或肾母细胞瘤。

根据本发明的EV可以通过各种不同的给药途径给予人或动物受试者，所述给药途径例如耳(耳部)、颊、结膜、皮肤、牙齿、电渗、宫颈内膜、窦内、气管内、肠内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜内、动脉内、关节内、胆道内、支气管内、法氏囊内、心内、软骨内、尾内、海绵窦内、腔内、脑内、脑池内、角膜内、冠内(牙齿)、冠状动脉内、海绵体内、皮内、椎间盘内、导管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食管内、胃内、牙龈内、回肠内、病灶内、腔内、淋巴管内、髓内、脑膜内、肌内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、窦内、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸腔内、小管内、肿瘤内、鼓室内恐慌、子宫内、血管内、静脉内、静脉推注、静脉滴注、心室内、膀胱内、玻璃体内、离子电渗疗法、冲洗、喉、鼻、鼻胃、闭塞包扎技术、眼、口服、口咽、其他、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、周神经、牙周、直肠、呼吸(吸入)、后球、软组织、蛛网膜下腔、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、透皮、透粘膜、经胎盘、经气管、经鼓膜、输尿管、尿道和/或阴道给药和/或以上给药途径的任意组合，其通常取决于待治疗的疾病和/或抗体或EV群体本身的特征。

应当理解，可以在不脱离本发明的范围的情况下修改上述示例性方面、实施例、替代方案和变型。现在将用所附的示例进一步举例说明本发明，这些示例自然也可以在不脱离本发明的范围和主旨的情况下进行大量修改。

示例1：通过TRIM21-抗GFP-Ab-EV的细胞内摄取和GFP消耗

使用超滤和尺寸排阻色谱法从沃顿果冻来源的MSC的条件培养基中分离出EV(稳定地表达融合的CD81-intein-TRIM21(intein形式起释放机制，在EV装载后将TRIM21与CD81分开)和Fc-结合物CD63-ZZ)。为了装载EV，将4×10^11EV与总共3μg的抗GFP IgG[abcam(ab1218)抗GFP抗体[9F9.F9]]在400μl中孵育16小时(过夜)。为了研究包括TRIM21和Fc结合的EV是否可以用于GFP的细胞内消耗，将表达GFP的Huh7细胞以每孔30,000个细胞接种在48孔板中，并与2.4×10^10EV共同孵育12小时(过夜)。如图2所示，在细胞被胰蛋白酶消化并通过流式细胞术分析之前，将细胞在潮湿的气氛中在37℃和5％CO₂中孵育2小时。数据表明只有EV、TRIM21和抗GFP抗体的组合才能导致GFP信号的明显消耗。

示例2：TRIM21-抗NFkB-Ab-EV对NFkB消耗的剂量响应

类似于示例1，使用超滤和尺寸排阻色谱法从沃顿果冻来源的MSC的条件培养基中分离出EV(稳定地表达融合的CD81-intein-TRIM21和Fc-结合物CD63-ZZ)。为了装载EV，将4×10^11EV与总共3μg的抗NFkB IgG[abcam：(ab32360)抗NFkB p105/p50抗体[E381]]在400μl中孵育16小时(过夜)。为了研究包括TRIM21和Fc结合的EV是否可以以剂量依赖性方式用于NFkB的细胞内消耗，将稳定地表达NFkB-荧光素酶细胞的Ken293的报告细胞系以每孔30,000个细胞接种在48孔板中，并与2.4×10^10 EV和5ng/ml的hTNF-α共孵育。在处理12小时后，测量荧光素酶活性。图3示出了归一化的荧光素酶水平，证明了当抗NFkB-ab与TRIM21EV一起以剂量依赖性方式递送时成功的抑制作用。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种基因工程化的细胞外囊泡(EV)，其包括

TRIM连接酶或其结构域或区域。

2.根据权利要求1所述的EV，其中所述TRIM连接酶或其结构域或区域是TRIM21连接酶或其结构域或区域。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的EV，其中所述TRIM连接酶与外泌体蛋白融合。

4.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述EV进一步包括至少一种抗体。

5.根据权利要求4所述的EV，其中所述抗体包括在与外泌体蛋白的融合蛋白中。

6.根据权利要求4所述的EV，其中所述抗体的Fc结构域通过在所述EV中包括的Fc结合多肽和/或通过所述TRIM连接酶的Fc结合区结合。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的EV，其中所述至少一种抗体的靶蛋白通过所述TRIM连接酶的作用而降解。

8.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述EV进一步包括泛素缀合酶和/或泛素激活酶。

9.一种用于降解靶蛋白的方法，其包括以下步骤：(i)允许抗体结合其抗原，和(ii)借助于EV将泛素连接酶递送到所述抗体的附近。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗体还通过EV，任选地相同的EV递送。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述靶抗原是细胞内靶。

12.一种多肽构建体，其包括外泌体蛋白和TRIM21连接酶。

13.一种多核苷酸构建体，其编码根据权利要求12所述的多肽构建体。

14.一种载体，其包括根据权利要求13所述的多核苷酸构建体。

15.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体选自包括以下的组：线性或环化的多核苷酸、环状DNA或RNA多核苷酸、质粒、小环、病毒、腺相关病毒、无衣壳病毒、mRNA、修饰的mRNA和/或合成的mRNA。

16.一种用于生产根据权利要求1-8中任一项所述的基因工程化的EV的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)将至少一种根据权利要求13所述的多核苷酸构建体引入到EV产生细胞中；

(ii)在所述EV产生细胞中表达由所述至少一种多核苷酸构建体编码的至少一种多肽构建体；和，

(iii)获得由所述EV产生细胞产生的EV。

17.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括在所述EV产生细胞中引入另一多核苷酸构建体并从其表达包括Fc结合多肽的多肽构建体。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述Fc结合多肽结合抗体。

19.根据权利要求18所述的方法，其中将所述抗体在溶液中外源性地添加至所述EV中或由所述EV产生细胞内源性地产生。

20.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-8中任一项所述的基因工程化的EV群体和药学上可接受的赋形剂或稀释剂。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其进一步包括至少一种抗体。

22.根据权利要求1-8中任一项所述的基因工程化的EV或根据权利要求20或根据权利要求21所述的药物组合物，用于医学。

Claims (25)

1.一种基因工程化的EV，其包括泛素连接酶。

2.根据权利要求1所述的EV，其中所述泛素连接酶是E3泛素连接酶。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的EV，其中所述E3泛素连接酶是TRIM连接酶或其结构域或区域，优选地TRIM21连接酶或其结构域或区域。

4.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述泛素连接酶与外泌体蛋白融合。

5.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述EV进一步包括至少一种抗体。

6.根据权利要求5所述的EV，其中所述抗体包括在与外泌体蛋白的融合蛋白中。

7.根据权利要求5所述的EV，其中所述抗体的Fc结构域通过在所述EV中包括的Fc结合多肽和/或通过所述泛素连接酶的Fc结合区结合。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的EV，其中所述至少一种抗体的靶蛋白通过所述泛素连接酶的作用而降解。

9.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述EV进一步包括泛素缀合酶和/或泛素激活酶。

10.一种用于降解靶蛋白的方法，其包括以下步骤：(i)允许抗体结合其抗原，和(ii)借助于EV将泛素连接酶递送到所述抗体的附近。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体还通过EV，任选地相同的EV递送。

12.根据权利要求10-11中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是细胞内靶。

13.一种多肽构建体，其包括外泌体蛋白和泛素连接酶。

14.根据权利要求13所述的多肽构建体，其中所述泛素连接酶是E3泛素连接酶。

15.根据权利要求13-14中任一项所述的多肽构建体，其中所述E3泛素连接酶是TRIM21连接酶。

16.一种多核苷酸构建体，其编码根据权利要求13-15中任一项所述的多肽构建体。

17.一种载体，其包括根据权利要求16所述的多核苷酸构建体。

18.根据权利要求17所述的载体，其中所述载体选自包括以下的组：线性或环化的多核苷酸、环状DNA或RNA多核苷酸、质粒、小环、病毒、腺相关病毒、无衣壳病毒、mRNA、修饰的mRNA和/或合成的mRNA。

19.一种用于生产根据权利要求1-9中任一项所述的基因工程化的EV的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)将至少一种根据权利要求16所述的多核苷酸构建体引入到EV产生细胞中；

(ii)在所述EV产生细胞中表达由所述至少一种多核苷酸构建体编码的至少一种多肽构建体；和，

(iii)获得由所述EV产生细胞产生的EV。

20.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括在所述EV产生细胞中引入另一多核苷酸构建体并从其表达包括Fc结合多肽的多肽构建体。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述Fc结合多肽结合抗体。

22.根据权利要求25所述的方法，其中将至少一种抗体在溶液中外源性地添加至所述EV中或由所述EV产生细胞内源性地产生。

23.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-10中任一项所述的基因工程化的EV群体和药学上可接受的赋形剂或稀释剂。

24.根据权利要求23所述的药物组合物，其进一步包括至少一种抗体。

25.根据权利要求1-10中任一项所述的基因工程化的EV或根据权利要求23-24所述的药物组合物，用于医学。

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