CN116694562B - 一种BMEC释放的sEV、其制备方法、用途及药物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种BMEC释放的sEV、其制备方法、用途及药物。本发明利用脂联素作用脑微血管内皮细胞，制备了miR‑31‑5p表达下调后的小细胞外囊泡，其对心肺复苏后皮质神经元凋亡具有更好的保护作用，因而其在制备用于减轻心肺复苏后皮质神经元凋亡的药物中具有很好的应用前景。

Description

一种BMEC释放的sEV、其制备方法、用途及药物
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种BMEC释放的sEV、其制备方法、用途及药物。
背景技术
缺血/再灌注损伤诱导的神经元凋亡是心脏骤停-心肺复苏-恢复自主循环（cardiac arrest-cardiopulmonary resuscitation- return of spontaneouscirculation,CA-CPR-ROSC）后脑损伤主要的病理表现，也是心脏骤停患者神经功能预后不良的重要原因。采取有效措施减轻CA-CPR-ROSC后神经元凋亡是改善心脏骤停患者神经功能预后的重要策略。
脂联素（Adiponectin，APN）是一种机体天然存在的，具有强效心血管保护作用的脂肪因子，在缺血性心脏疾病和脑卒中等疾病中具有显著的抗细胞凋亡作用。本课题组前期研究发现外源给予APN显著减轻小鼠ROSC后大脑皮质神经元凋亡，编码基因Adipoq敲除小鼠则表现为CA-CPR-ROSC后皮质神经元凋亡加重，但是具体机制仍不清楚。因此，详细分析APN对神经元的保护作用机制，对进一步开发APN的临床应用具有重要的理论支持作用。
脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cell, BMEC）是神经血管单元重要组成部分，除维持血脑屏障外，BMEC还释放小细胞外囊泡（smallextracellular vesicles，sEV）抑制脑缺血/再灌注损伤后的神经元凋亡、减轻脑水肿和改善大脑中动脉闭塞（middlecerebral artery occlusion, MCAO）模型小鼠的神经功能预后。miRNA是sEV的重要内容物，参与细胞增殖和凋亡等病理生理过程，与ROSC患者神经功能预后密切相关。临床研究发现神经功能预后不良患者血液及血浆sEV中miRNA表达水平发生改变，这些异常的miRNA主要参与细胞凋亡和离子通道等过程。然而BMEC sEV中miRNA种类较多，BMEC sEV调控急性脑损伤的机制复杂，目前本领域对其认识仍不够全面。因而，其疗效是否能够进一步提升和优化，这仍然是本领域的重要课题。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供一种BMEC释放的sEV、其制备方法、用途及药物，目的在于通过调控BMEC sEV携带的miRNAs，增强BMEC sEV的神经元保护功能，减轻ROSC后神经元凋亡，缓解脑损伤。
一种BMEC释放的sEV，它是脑微血管内皮细胞受到下调miR-31-5p表达的干预后释放的小细胞外囊泡。
优选的，所述下调miR-31-5p表达的干预为采用脂联素进行干预。
优选的，所述小细胞外囊泡是脑微血管内皮细胞受到5-10 μg/ml 脂联素作用后释放的。
优选的，所述小细胞外囊泡是脑微血管内皮细胞受到10 μg/ml 脂联素作用后释放的。
本发明还提供上述小细胞外囊泡的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，培养脑微血管内皮细胞；
步骤2，对所述脑微血管内皮细胞进行干预，使miR-31-5p表达下调，继续培养；
步骤3，收集培养基上清，分离提取小细胞外囊泡。
优选的，步骤1中，用于培养脑微血管内皮细胞的培养基由如下体积份的组分组成：
Exosome-depleted FBS 5份、
bFGF 0. 05份、
0.1 v/v %的肝素钠 0.1份、
ECGS 1份、
1 wt.%的青霉素/链霉素双抗溶液 1份、
DMEM培养基 94份；
和/或，步骤2中，继续培养的时间为24-48 h。
本发明还提供上述BMEC释放的sEV在制备用于保护神经元的药物中的用途。
优选的，所述药物用于减轻ROSC后皮质神经元凋亡。
本发明还提供一种用于保护神经元的药物，它是以上述BMEC释放的sEV作为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的制剂。
优选的，所述药物用于减轻ROSC后皮质神经元凋亡。
细胞外囊泡按照生成方式可分为外泌体、微囊泡和凋亡小泡等。本发明中，所述“小细胞外囊泡”的定义为：根据国际细胞外囊泡协会2018年制定的行业研究指南MISEVS2018，常规采用下述超速离心法（离心速度>=100000g）联合0.22μm过滤的方法获得的，经NTA检测粒径小于300nm的外泌体和微囊泡统称为小细胞外囊泡（smallextracellular vesicles，sEV）。
本发明通过实验发现，下调BMEC sEV中的miR-31-5p表达，能够显著提升BMEC sEV对小鼠ROSC后神经元凋亡的保护作用。例如，采用APN处理BMEC后，释放的BMEC sEV（BMECsEVAPN）中miR-31-5p表达显著下调，而BMEC sEVAPN相比于正常生理条件下释放的BMEC sEV（BMEC sEVControl）具有更好的小鼠ROSC后皮质神经元的保护作用。
由此，本发明的有益效果在于：
提出了miR-31-5p表达下调后的BMEC sEV及其在制备用于减轻ROSC后皮质神经元凋亡的药物中的新用途，具有很好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为APN上调原代脑微血管内皮细胞P-ERK的表达的实验结果图，a. Westernblot检测p-ERK的表达实验结果图；b.p-ERK的相对表达水平的统计分析实验结果图（n=3，One-way ANOVA）；
图2为BMEC sECAPN的理化性质鉴定实验结果图，其中，a. NTA检测BMEC sEVAPN的数量和直径实验结果图；b. TEM观察BMEC sEVAPN的形态实验结果图；c. Western blot检测BMEC sEVAPN的标志蛋白表达实验结果图。
图3为BMEC sEVControl抑制小鼠ROSC后皮质神经元凋亡实验结果图，其中，a.大脑皮质TUNEL联合NeuN染色实验结果图；b. 大脑皮质神经元凋亡比例统计分析实验结果图（n=5， One-way ANOVA）；c. Western blot检测Cleaved-caspase 3的表达实验结果图；d.Cleaved-caspase 3表达水平的统计分析实验结果图（n=4，One-way ANOVA）；
图4为不同糖氧剥夺时间和复氧复糖时间原代皮质神经元Cleaved-caspase 3的表达变化实验结果图，其中，a.不同糖氧剥夺时间原代皮质神经元形态变化实验结果图；b.Western blot检测不同糖氧剥夺时间Cleaved-caspase 3的表达水平实验结果图；c.不同糖氧剥夺时间Cleaved-caspase3表达水平的统计分析实验结果图（n=5，One-wayANOVA）；d. Western blot检测不同复氧复糖时间Cleaved-caspase 3的表达水平实验结果图；e.不同复氧复糖时间Cleaved-caspase 3表达水平的统计分析实验结果图（n=5， One-way ANOVA）；
图5为BMEC sEVControl抑制OGD/R后原代皮质神经元凋亡实验结果图，其中，a.原代皮质神经元形态变化实验结果图；b. 原代皮质神经元 TUNEL联合MAP2染色实验结果图；c.凋亡率统计分析实验结果图（n=5，One-way ANOVA）；d. Western blot检测Cleaved-caspase 3的表达变化实验结果图；e. Cleaved-caspase 3表达水平的统计分析实验结果图（n=5，One-way ANOVA）；
图6为BMEC sEVAPN抑制小鼠ROSC后皮质神经元凋亡实验结果图，其中，a.大脑皮质TUNEL联合NeuN染色实验结果图；b .大脑皮质神经元凋亡比例统计分析实验结果图（n=5，One-way ANOVA）；c. Western blot检测Cleaved-caspase 3的表达实验结果图；d.Cleaved-caspase表达水平的统计分析实验结果图（n=5，One-way ANOVA）；
图7为BMEC sEVAPN减轻OGD/R后原代皮质神经元凋亡实验结果图，其中，a.原代皮质神经元形态变化实验结果图；b.原代皮质神经元 TUNEL联合MAP2染色实验结果图；c.凋亡率统计分析实验结果图（n=5，One-way ANOVA）；d. WB检测Cleaved-caspase 3 的表达变化实验结果图；e. Cleaved-caspase 3表达的统计分析实验结果图（n=5，One-way ANOVA）；
图8为BMEC sEVAPN促进OGD/R后原代皮质神经元存活，抑制LDH释放的实验结果图，其中，a.CCK8检测原代皮质神经元存活率实验结果图（n=5，One-way ANOVA）；b.原代皮质神经元LDH释放检测实验结果图（n=5，One- way ANOVA）；
图9为韦恩图筛选目标miRNAs集合的结果图；
图10为RT-qPCR筛选BMEC sEV携带受APN调控的miRNAs的结果图(n=3, Unpairedt-test)；
图11为RT-qPCR验证BMEC特异性神经元低表达miRNA实验结果图，其中，a. miR-10a-5p的实验结果图； b. miR-155-5p的实验结果图； c. miR-31-5p的实验结果图（n=3，Unpaired t-test）；
图12为OGD/R后BMEC 3种miRNAs含量的变化实验结果图，其中，a. miR-10a-5p的实验结果图；b. miR-155-5p的实验结果图； c. miR-31-5p的实验结果图（n=3，Unpairedt-test）；
图13为miR-31-5p mimic加重OGD/R原代皮质神经元凋亡实验结果图，其中，a.原代皮质神经元形态变化实验结果图；b.原代皮质神经元TUNEL联合MAP2染色实验结果图；c.凋亡率统计分析实验结果图（n=5, One-way ANOVA）；d. WB检测Cleaved-caspase 3 表达水平实验结果图；e. Cleaved-caspase 3表达水平的统计分析实验结果图（n=4， One-wayANOVA）；
图14为miR-31-5p抑制OGD/R原代皮质神经元存活，促进LDH释放的实验结果图，其中，a. CCK8检测细胞存活率实验结果图 (n=5， One-way ANOVA）；b. LDH释放检测实验结果图（n=3，One-way ANOVA）；
图15为Adipoq -/-小鼠的血浆sEV及BMEC的miR-31-5p含量下降实验结果图，其中，a.血浆sEV miR-31-5p含量实验结果图（n=3, Unpaired t-test）；b. BMEC的miR-31-5p含量实验结果图 (n=3, Unpairedt-test)；横坐标：WT Sham：野生型小鼠，未敲除APN；Adipoq -/- sham：敲除APN的小鼠。
图16 为AAV9-BR1--31-5p sponge减轻Adipoq -/- 小鼠ROSC后皮质神经元凋亡实验结果图，其中，a.Adipoq -/- 小鼠大脑皮质TUNEL联合NeuN免疫荧光染色实验结果图；b.大脑皮质神经元凋亡率统计分析实验结果图（n=5, One-way ANOVA）；c. WB检测Cleaved-caspase3的表达水平实验结果图；d Cleaved-caspase 3表达统计分析实验结果图（n=5，One-way ANOVA）。
注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
具体实施方式
以下实施例和实验例中，为具体说明的试剂和原料均为市售品。
实施例1 APN处理后释放的BMEC sEV的制备
参照Ruck T等（J Vis Exp, 2014, (93): e52204.）报道的两步酶消化法联合密度梯度离心提取小鼠原代BMEC。
待原代BMEC融合度达到90%，PBS缓冲液洗涤，更换为5%无囊泡血清的原代内皮细胞培养基（该培养基制备方法为：将5 ml的Exosome-depleted FBS、50 μlbFGF、100 μl肝素钠（100 μl/ml，0.1%）、1 ml的ECGS和 1 ml的1 wt.%的青霉素/链霉素双抗溶液加入94 ml的DMEM培养基中，混匀之后用0.22 μm孔径的滤器过滤）。随后加入APN，使APN终浓度分别为5 μg/ml和10 μg/ml。继续培养24 h后收集原代BMEC培养基上清。依次300 g离心10 min，2000 g离心10 min，1000 g离心30 min，0.22μm滤器过滤。4 °C 100000 g离心70 min。弃上清，用PBS缓冲液清洗，枪头轻轻吹打混匀。再次100000 g 离心70 min。去除上清，PBS缓冲液重悬沉淀，标记后置于-80 ℃保存。由此，得到2组BMEC sEV。
本实施例制备得到的BMEC sEV在下文中简写为BMEC sEVAPN。
对比例1 正常生理条件下释放的BMEC sEV的制备
参照Ruck T等（J Vis Exp, 2014, (93): e52204.）报道的两步酶消化法联合密度梯度离心提取小鼠原代BMEC。
当原代BMEC密度为80%时，PBS缓冲液清洗，更换为5%无囊泡血清的原代内皮细胞培养基（同实施例1）。继续培养24 h后收集原代BMEC培养基上清。依次300 g离心10 min，2000 g离心10 min，1000 g离心30 min，0.22μm滤器过滤后配平。4 °C 100000 g离心70min。弃上清，用PBS缓冲液清洗，枪头轻轻吹打混匀。再次100000g 离心70 min。去除上清，PBS缓冲液重悬沉淀，标记后置于-80 ℃保存。
制备得到的BMEC sEV在下文中简写为BMEC sEVControl。
下面通过实验对本发明的技术方案做进一步说明，以下实验例中所用的样品为实施例1制备的BMEC sEVAPN（除实验例1的“APN作用BMEC浓度筛选”部分外，其他所有实验例的BMEC sEVAPN均为10 μg/ml APN作用于BMEC后提取得到的）和对比例1制备的BMECsEVControl。
实验例1 APN作用BMEC浓度筛选及BMEC sEVAPN理化性质鉴定
一、实验方法
1、透射电镜（transmission electron microscope， TEM）鉴定
收集刚提取的BMEC sEV，用D-hanks分别稀释1倍、10倍和100倍。从下往上依次放置滤纸、封口膜和载样碳支持膜铜网，在载样碳支持膜铜网上滴加待测样品，使载样碳支持膜铜网置于液滴内部，室温静置5 min，吸除多余样品。在载样碳支持膜铜网上滴入2%磷钨酸，放置3 min，除去多余液体，室温干燥。然后再次在载样碳支持膜铜网上滴加样品，使载样碳支持膜铜网在液滴内部，沉淀2 min后，吸除多余样品，最后在透射电镜下观察并拍照。
2、纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）鉴定
ddH2O冲洗样本池，聚苯乙烯微球（110nm）校准仪器，温度设定为24 ℃；随后，PBS缓冲液清洗样本池，加入PBS缓冲稀释混匀的BMEC sEV溶液，分析BMEC sEV数量及粒径大小。
3、Western blot鉴定BMEC sEVControl标志蛋白
BCA法定量检测BMEC sEV的蛋白浓度，xxug蛋白进行Western blot检测sEV标志蛋白（外泌体标志蛋白CD63、Tsg101和Alix）的表达。
二、实验结果
1、APN作用BMEC浓度筛选
为确定APN作用原代BMEC的最佳浓度，对比实施例1制备的两种BMEC sEVAPN（分别以5 μg/ml和10 μg/ml APN作用于原代BMEC）和对比例1制备的BMEC sEVControl。westernblot检测P-ERK的表达水平。结果显示5 μg/ml、10 ug/ml的APN作用BMEC后的P-ERK表达水平显著升高（相比于BMEC sEVControl提高了2.21倍和2.84倍，P＜0.01，图1），且10 μg/ml组的P-ERK表达水平高于5 μg/ml组（P＜0.01）。P-ERK是APN下游公认的信号转导分子，其表达越高，说明APN对细胞的作用活性越强。
因此，以下实验例中所用的BMEC sEVAPN均为10 μg/ml浓度的APN作用于原代BMEC并提取得到的BMEC sEVAPN。
2、BMEC sEVAPN理化性质鉴定
NTA检测结果显示BMEC sEVAPN直径是147.2±6.64 nm，粒径峰值、均值也在30-150nm范围内（图2）。透射电镜检测发现BMEC sEVAPN形态呈类圆形杯盘状，直径小于150nm。Western blot检测结果显示原代BMEC和BMEC sEVAPN中均含有标志蛋白CD63、Tsg101和Alix，而去除sEV的细胞培养上清液中不表达上述蛋白。
综合上述结果，实施例1提取的BMEC sEVAPN理化性质符合sEV的特征。
实验例2 BMEC sEVControl和BMEC sEVAPN减轻小鼠ROSC后皮质神经元凋亡的效果比较
一、实验方法
1、BMEC sEVControl对小鼠ROSC后皮质神经元凋亡的影响
超速离心提取正常培养条件下的BMEC sEVControl，NTA计数。设置假手术对照组（侧脑室注射与sEV体积相同的PBS，不进行CPR）、CPR+vehicle（侧脑室注射与sEV体积相同的PBS，进行CPR）组和CPR+BMEC sEVControl组（侧脑室注射BMEC来源的sEV，然后进行CPR），经侧脑室注射小鼠体内（Neural Regen Res, 2022, 17(12): 2717-24.）。24小时后进行颈外静脉置管和气管插管，建立CA-CPR-ROSC模型（Mol Med Rep, 2020, 22(2): 870-8.）。ROSC3h后断颈处死小鼠，取出脑组织。Western blot检测Cleaved-caspase 3的表达，TUNEL联合NeuN染色检测各组小鼠皮质神经元凋亡。
2、BMEC sEVControl减轻OGD/R后原代皮质神经元凋亡
提取原代皮质神经元，进行糖氧剥夺和复氧复糖实验，显微镜观察不同糖氧剥夺时间后的神经元形态变化。提取各组神经元蛋白，Western blot检测不同糖氧剥夺时间和复氧复糖时间后Cleaved-caspase3的表达变化。
超速离心获取BMEC sEVControl，NTA计数。设置对照组（正常条件下培养，不进行OGD/R处理）、OGD/R+vehicle组和OGD/R+BMEC sEVControl组，BMEC sEVControl与原代皮质神经元共孵育，并进行OGD/R。显微镜下观察三组神经元形态变化，TUNEL联合MAP2免疫荧光染色，检测原代皮质神经元凋亡率。提取各组神经元蛋白，Western blot检测各组神经元Cleaved-caspase 3的表达水平。
3、BMEC sEVAPN减轻小鼠ROSC后皮质神经元凋亡的作用
实验方法与第1部分“BMEC sEVControl对小鼠ROSC后皮质神经元凋亡的影响”相同，区别在于将BMEC sEVControl替换为BMEC sEVAPN（APN处理BMEC后得到的sEV）。
4、BMEC sEVAPN减轻OGD/R后原代皮质神经元凋亡的作用
CPR+BMEC sEVAPN组：实验方法与第2部分“BMEC sEVControl减轻OGD/R后原代皮质神经元凋亡”相同，区别在于将BMEC sEVControl替换为BMEC sEVAPN。
二、实验结果
1、 BMEC sEVControl减轻小鼠ROSC后皮质神经元凋亡
（1）各组小鼠基线资料比较
本实验拟纳入WT小鼠15只，每组各5只，因心肺复苏死亡5只，采用随机数字表法进行增补，最后共使用WT小鼠20只，心肺复苏成功率为66.67%。4组小鼠的体重、心率和呼吸无统计学差异（P＞0.05，表1），心肺复苏后CPR+vehicle组和CPR+BMEC sEVControl组小鼠的复苏时间和ROSC后心率的差异也无统计学意义（P＞0.05）。
表1 3组小鼠的基线资料无差异
HR: Heart rate，心率；RR: Respiratory rate，呼吸频率； CPR：Cardiopulmonaryresuscitation，心肺复苏；ROSC: Return of spontaneouscirculation，恢复自主循环；Sham假手术对照组。
（2）BMEC sEVControl抑制小鼠ROSC后皮质神经元凋亡
侧脑室脑立体定位注射vehicle、BMEC sEVControl到小鼠体内，建立CA-CPR-ROSC模型。ROSC 3h后取材检测皮质神经元凋亡变化。TUNEL/NeuN染色结果显示，假手术对照组皮质神经元凋亡比例为5.54%，CPR+vehicle组的皮质神经元凋亡比例显著高于假手术对照组（15.91%，P<0.01，图3a-b）。CPR+BMEC sEVControl组小鼠ROSC后神经元源凋亡比例较CPR+vehicle组显著下降（6.05%，P<0.05）。Western blot结果显示Cleaved-caspase 3的表达变化趋势与TUNEL/NeuN染色结果相一致，CPR+vehicle组的表达水平较假手术对照组显著升高（3.46倍，P<0.01，图3c-d），相较于CPR+vehicle组，CPR+BMEC sEVControl组的Cleaved-caspase 3的表达显著下降（40.46%，P<0.01）。
2、BMEC sEVControl减轻OGD/R后原代皮质神经元凋亡
（1）原代皮质神经元OGD/R模型
尽管有不少原代皮质神经元OGD/R的相关报道，但是糖氧剥夺和复氧复糖的时间差异较大，本研究分析不同糖氧剥夺时间和复氧复糖时间原代皮质神经元形态及Cleaved-caspase 3表达水平变化。对照组皮质神经元胞体饱满有立体感，突触多而长，相互连接成网。OGD30 min时，原代皮质神经元形态无明显变化（图4a）。OGD 1h组部分原代皮质神经元胞体缩小，突触断裂。OGD 3h组绝大部分神经元胞体皱缩，大部分突起断裂，少数细胞漂浮（图4a）。OGD 6h组绝大部分细胞死亡漂浮，贴壁的神经元胞体缩小呈圆形或椭圆形（图4a）。WB结果发现，与对照组比较，OGD 30 min组的Cleaved-caspase 3表达水平无改变（P＞0.05，图4b-c）。OGD 1h组、OGD 3h组和OGD 6h组的Cleaved-caspase 3表达水平较对照组明显增加（1.19倍、2.50倍和1.80倍，P＜0.01），其中OGD 3h组的表达量高于其他任一组（P＜0.01）。
确定糖氧剥夺时间后，原代皮质神经元糖氧剥夺3 h复氧复糖0h、1 h、3 h、6 h和12 h检测各组Cleaved-caspase 3的表达水平。WB结果发现OGD 3h+R 1h组的Cleaved-caspase3的表达量较OGD 3h+R 0h组减少（P＜0.01，图4d-e）。而OGD 3h +R 3h组其表达水平显著上升（2.98倍,P＜0.01）。随后随着复氧复糖时间延长，Cleaved-caspase 3表达水平下降，OGD 3h+R 6h组和OGD 3h+R 12h组明显少于OGD3h+R 0h组（P＜0.01）。综合上述结果，本研究确定OGD 3h+R 3h神经元凋亡显著，可将其用于后续的研究。
（2）BMEC sEVControl减轻OGD/R后原代皮质神经元凋亡
分别以vehicle、BMEC sEVControl与原代皮质神经元共孵育并进行OGD/R，显微镜观察细胞形态，TUNEL/MAP2免疫荧光染色和Western blot检测神经元凋亡变化。正常培养条件下原代皮质神经元胞体饱满，含有丰富轴突和树突。OGD/R组神经元胞体缩小呈圆形，突起断裂（图5a）。加入BMECsEVControl部分神经元形态恢复正常，突起数量增多。TUNEL/MAP2染色结果显示，对照组原代皮质神经元凋亡率为4.51%，OGD/R+vehicle组原代皮质神经元的凋亡率较对照组显著增加（27.34%，P＜0.01，图5b-c）。OGD/R+BMEC sEVControl组的原代皮质神经元的凋亡率较OGD/R+vehicle组显著下降（10.93%，P＜0.01）。Western blot结果显示，OGD/R+vehicle组的Cleaved-caspase 3的表达水平较对照组显著升高（3.06倍，P＜0.01，图5d-e）。OGD/R+BMEC sEVControl组的Cleaved-caspase 3的表达量较OGD/R+vehicle组显著下降（48.37%，P＜0.01）。
3、BMEC sEVAPN减轻小鼠ROSC后皮质神经元凋亡的作用更显著
（1）各组小鼠基线资料比较
本实验拟纳入WT小鼠20只，每组各5只。因心肺复苏死亡8只，采用随机数字表法进行增补，最后共使用WT小鼠28只，心肺复苏成功率为65.22%。4组小鼠的体重、心率和呼吸无统计学差异（P＞0.05，表2），心肺复苏后CPR+vehicle组、CPR+BMEC sEVControl组和CPR+BMECsEVAPN组小鼠的复苏时间和复苏后心率的差异也无统计学意义（P＞0.05）。
表2 4组小鼠的基线资料无差异
HR: Heart rate，心率；RR: Respiratory rate，呼吸频率； CPR：Cardiopulmonary
resuscitation，心肺复苏；ROSC: Return of spontaneous circulation，恢复自主循环；Sham假手术对照组。
（2）BMEC sEVAPN减轻小鼠ROSC后皮质神经元凋亡
侧脑室脑立体定位注射vehicle、BMEC sEVControl、BMEC sEVAPN到WT小鼠体内，建立CA-CPR-ROSC模型。ROSC 3 h后取大脑皮质脑组织，采用TUNEL/NeuN免疫荧光染色和WB检测皮质神经元凋亡情况。TUNEL/NeuN染色结果显示：假手术对照组皮质神经元凋亡率为5.99%，CPR+vehicle组的凋亡率明显高于Sham 组（15.76%，P<0.01，图6a-b）。注射BMEC sEV小鼠皮质神经元凋亡率显著下降。其中，CPR+BMEC sEVAPN组的凋亡率低于CPR+ BMECsEVControl组（6.91%，P<0.01）。Cleaved-caspase 3的表达水平与TUNEL/NeuN染色结果相一致，CPR+vehicle组的表达水平较假手术对照组显著增加（3.63倍，P<0.01，图6c-d）。CPR+BMEC sEVControl组和CPR+BMEC sEVAPN组的Cleaved-caspase 3的表达均低于CPR+vehicle组（P<0.01）。与CPR+BMEC sEVControl组相比，CPR+BMEC sEVAPN组的Cleaved-caspase 3的表达水平更低（31.64%，P<0.01）。
4、BMEC sEVAPN减轻OGD/R后原代皮质神经元凋亡的作用更显著
（1）BMEC sEVAPN抑制OGD/R原代皮质神经元凋亡
分别以BMEC sEVControl、BMEC sEVAPN与原代皮质神经元共孵育，OGD/R后显微镜观察细胞形态，TUNEL免疫荧光染色和Western blot检测原代皮质神经元凋亡变化。正常神经元形态饱满而立体感，含有丰富的突起。OGD/R组神经元数量减少，胞体皱缩，突起断裂。OGD/R+BMEC sEVControl和OGD/R+BMEC sEVAPN组的神经元数量增多，形态也基本恢复正常，且突起数量显著增多，以后者最明显（图7a）。
TUNEL结果显示，对照组的原代皮质神经元凋亡率是4.76%，OGD/R+vehicle组原代皮质神经元的凋亡率较对照组显著增加（25.68%，P＜0.01，图7b-c）。OGD/R+BMEC sEVControl组和OGD/R+BMEC sEVAPN组原代皮质神经元凋亡率均低于OGD/R+vehicle组（9.94%和19.78%，P＜0.01）。相较于OGD/R+BMEC sEVControl组，OGD/R+BMEC sEVAPN组的原代皮质神经元凋亡率显著降低（9.86%，P＜0.01）。
WB结果显示，与对照组比较，OGD/R组的Cleaved-caspase 3表达量显著升高（2.97倍，P＜0.01, 图7d-e）。OGD/R+BMEC sEVControl组和OGD/R+BMEC sEVAPN组的Cleaved-caspase 3表达水平较OGD/R组显著降低（47.28%和58.16%，P＜0.01），且OGD/R+BMEC sEVAPN组更显著。
（2）BMEC sEVAPN促进OGD/R原代皮质神经元存活，抑制LDH释放
为明确BMEC sEVAPN对OGD/R后原代皮质神经元活力的影响，分别采用CCK8和ELISA评估BMEC sEVAPN作用后原代皮质神经元的存活率和LDH释放情况。CCK8结果显示，与对照组比较，OGD/R组原代皮质神经元存活率较对照组显著下降（60.87%，P<0.01，图8a）。OGD/R+BMEC sEVControl组和OGD/R+BMEC sEVAPN组的原代皮质神经元存活率较OGD/R组显著升高（15.53%，P<0.05和34.01%，P<0.01），且BMEC sEVAPN显著高于BMEC sEVControl（18.48%，P<0.01）。
与存活率变化趋势相反，BMEC sEV抑制OGD/R后原代皮质神经元LDH释放。OGD/R后原代皮质神经元LDH显著增加（5.20倍，P<0.01，图8b）。OGD/R+BMEC sEVControl组和OGD/R+BMEC sEVAPN组的原代皮质神经元LDH释放量较OGD/R组均显著减少（34.03%，P<0.05和59.62%，P<0.01），且OGD/R+BMEC sEVAPN组的LDH释放量明显少于OGD/R+BMEC sEVControl组（38.78%，P<0.05）。
通过本实验例的比较可以看到，相比于BMEC sEVControl，BMEC sEVAPN减轻小鼠ROSC后皮质神经元凋亡的效果显著提高。
实验例3 APN下调BMEC sEV中miR-31-5p保护神经元
通过实验例2结果发现使用相同数量的BMEC sEVControl和BMEC sEVAPN预处理WT小鼠，相较于BMEC sEVControl，BMEC sEVAPN更能有效的抑制ROSC或OGD/R后的皮质神经元凋亡。而sEV内容物中的miRNA在调控靶细胞病理生理过程具有重要作用，因此，推测BMEC sEVAPN功能的改变可能与其携带促凋亡的miRNA含量改变有关。本实验例采用生物学信息方法筛选并确认受APN调控、BMEC特异性且有促凋亡作用的miRNA。
一、实验方法
1.筛选受APN调控血管内皮细胞特异性具有促凋亡作用的miRNA
miRNA合集从DIANA数据库中mirPathv.3筛选而来。依次选择positiveregulation of apoptotic process（GO：0043065）、Tarbase和human后导出数据，同样导出microT-CDs和TargetScan，采用Venny 2.1.0软件取上述合集。类似筛选出小鼠源性促凋亡miRNA合集，与人源促凋亡数据交集后，得出miRNA集合①。查询血管内皮细胞（BMC MedGenomics, 2011, 4: 78. Pol Arch Med Wewn, 2011, 121(10): 361-6.）、神经元单细胞测序报道（Neuron, 2012, 73(1): 35-48.）和心脏骤停患者miRNA预后的研究（Resuscitation,2016, 106: 96-101.），采用韦恩图在①②④交集中排除神经元高表达③，即得到血管内皮细胞特异性、神经元低表达、促凋亡且与心脏骤停预后负相关的候选miRNA集合。
以APN作用BMEC，提取BMEC sEVControl和BMEC sEVAPN。NTA计数后，提取两组BMECsEV中的miRNA。RT-qPCR检测筛选出BMEC sEV中受APN调控的miRNA。
提取原代BMEC和原代皮质神经元RNA，RT-qPCR检测BMEC特异性、神经元低表达的miRNA。
将原代BMEC组分为对照组和OGD/R组，前者CO2培养箱中常规培养，后者进行OGD/R实验。提取两组BMEC的RNA，RT-qPCR检测两组细胞miRNA表达变化，筛选OGD/R后BMEC上调的miRNA。
2. 过表达miR-31-5p对OGD/R 后原代皮质神经元凋亡的影响
将原代皮质神经元设置Control+NC mimic组、OGD/R+NC mimic组和OGD/R+ miR-31-5p mimic组。前两组转染NC mimic，最后一组转染miR-31-5p mimic。转染miR-31-5pmimic后进行OGD/R实验。显微镜下观察各组神经元形态；TUNEL联合MAP2免疫荧光检测各组神经元凋亡率；WB检测各组细胞的Cleaved-caspase 3表达；CCK8和LDH释放实验检测神经元的存活率。
3、抑制miR-31-5p减轻Adipoq -/-小鼠ROSC后皮质神经元凋亡
提取鼠尾，鉴定小鼠基因型。 提取WT小鼠和Adipoq -/-小鼠的血浆sEV和脑微血管内皮细胞，RT-qPCR检测各组小鼠的血浆sEV和脑微血管内皮细胞中miR-31-5p含量。
AAV9-BR1-miR-31-5p sponge以CV701为载体，NheI/MfeI为克隆位点，
BR1血清型包被，构建AAV9-BR1-miR-31-5p sponge载体，病毒滴度为1E+13 v.g./ml。将Adipoq -/- 小鼠随机分为Sham-NC sponge组、CPR-NC sponge组和CPR-miR-31-5psponge组，每组5只。前两组侧脑室立体定位注射AAV9-BR1-NCsponge, 最后一组注射AAV9-BR1-miR 31-5p sponge。4周后建立CA-CPR-ROSC模型，TUNEL联合NeuN免疫荧光染色检测小鼠ROSC后皮质神经元凋亡变化，Western blot检测Cleaved-caspase 3的表达水平。
二、实验结果
1、筛选BMEC sEV携带的并受APN调控的效应miR-31-5p
（1）筛选人/小鼠同源促凋亡、血管内皮特异性和神经元低表达的miRNA集合
DIANA数据库的生信分析结果显示，人和小鼠同源促凋亡的miRNA有205个。查阅血管内皮细胞和神经元表达谱的研究及综述，并对所有miRNA进行规范命名。血管内皮细胞特异性miRNA共计191个。其中EVmiRNA数据库中报道血管内皮细胞源性sEV特异性miRNA有50个；神经元表达量取前100位的miRNA；心脏骤停预后负相关的miRNA有40个。最后使用Venny2.1软件筛选血管内皮细胞特异性、神经元低表达、促凋亡和心脏骤停预后负相关的miRNA集合，得到7个miRNA。分别是miR-10a-5p、miR-18a-5p、miR-146a-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-25-3p和miR-31-5p（图9）。
（2）APN下调miRNA-31-5p和miR-155-5p表达
BMEC sEVAPN抗凋亡功能增强可能与APN下调促凋亡miRNA或上调抑凋亡miRNA的表达有关，上文已筛选出血管内皮细胞特异性促凋亡的miRNA集合，但是与APN的关系仍不确定。本实验通过RT-qPCR检测BMEC sEVControl和BMEC sEVAPN携带的miRNA，筛选受APN调控的miRNA。结果显示，与BMEC sEVControl比较，BMEC sEVAPN中miR-10a-5p含量显著增加（5.09倍，P<0.01），miR-155-5p和miR-31-5p含量均下降（79.8%和75.2%，P均<0.05， 图10）。
（3）微血管内皮细胞特异性miR-31-5p在神经元低表达
为验证选miR-10a-5p、miR-155-5p和miR-31-5p是BMEC特异性且神经元低表达，分别提取原代BMEC和神经元的RNA，RT-qPCR检测上述3种miRNA含量。结果显示，原代神经元和BMEC的miR-10-5p表达水平无明显差异（1.81倍，P＞0.05，图11）。而原代BMEC的miR-155-5p和miR-31-5p的含量均高于原代皮质神经元的（5.62倍，P<0.05；136.6倍，P<0.01）。因此，miR-155p和miR-31-5p是受APN调控的、BMEC特异性且神经元低表达的miRNA。
（4）OGD/R后原代BMEC的miR-31-5p表达增加
为评估所筛选出的miRNA具有促进BMEC凋亡的功能，提取并检测OGD/R后原代BMEC的miRNA变化。结果显示，与对照组比较，OGD/R组的miR-10a-5p和miR-155-5p的表达含量无明显变化（P＞0.05，图12），但miR-31-5p的含量显著增加（41%，P<0.05）。结合上述结果，本研究初步考虑BMEC sEVAPN的神经元保护作用缘于APN下调BMEC sEV中具有促凋亡作用miR-31-5p的表达。
2、miR-31-5p具有促进OGD/R 后原代皮质神经元凋亡的作用
（1）过表达miR-31-5p促进原代皮质神经元凋亡
分别将NC mimic、miR-31-5p mimic转染原代皮质神经元，OGD/R后检测原代皮质神经元形态和凋亡变化。结果显示，对照组神经元形态饱满，含有丰富的突起。而OGD/R+NCmimic组原代皮质神经元胞体皱缩，神经元突起断裂（图13a）。而OGD/R+miR-31-5p mimic组原代皮质神经元损伤加重，部分细胞漂浮，胞体皱缩，少数神经元可以见到1-2个很短的突起。TUNE/MAP2染色结果发现Control+NC mimic的原代皮质神经元凋亡率为4.94%，OGD/R+NC mimic组的原代皮质神经元凋亡比例显著高于Control+NC mimic组（25.58%，P＜0.01，图13b-c）。而OGD/R+ miR-31-5p mimic组的神经元凋亡比例达到42.91%，显著高于OGD/R+NC mimic组（12.39%，P＜0.01）。WB 结果显示，OGD/R+NC mimic组的Cleaved-caspase 3的表达量较Control+NC mimic组显著增加（2.91倍，P＜0.01，图13d-e）。OGD /R+miR-31-5pmimic组的Cleaved-caspase 3的表达水平显著高于OGD/R+NC mimic组（34.08%，P＜0.01）。
（2）过表达miR-31-5p抑制OGD/R后原代皮质神经元存活率，促进LDH释放
CCK8结果显示，与对照组比较，OGD/R后原代皮质神经元的存活率显著下降（32.60%，P<0.01），LDH释放显著增加（2.82±0.49倍，P<0.01，图14）。OGD/R+miR-31-5pmimic组的原代皮质神经元存活率较OGD/R组显著下降（34.27%，P<0.01），LDH释放量明显增加（70.21%，P<0.01 ）。
3、抑制miR-31-5p减轻Adipoq -/-小鼠ROSC后皮质神经元凋亡
前面研究发现，与BMEC sEVControl比较，BMEC sEVAPN更能显著抑制WT小鼠ROSC后的神经元凋亡，可能缘于APN下调BMEC sEVAPN中具有促凋亡作用的 miR-31-5p表达。发明人课题组前期研究也发现APN 敲除（Adipoq -/- ）小鼠ROSC后皮质神经元凋亡比例高于WT小鼠。据此我们推测Adipoq -/- 小鼠ROSC后的神经元凋亡增加可能是由于BMEC源性miR-31-5p的表达水平增加。因此，本实验将比较WT小鼠、Adipoq -/- 小鼠血浆sEV和BMEC的miR-31-5p表达水平，侧脑室脑立体定位注射AAV9-BR1-miR-31-5p特异性拮抗Adipoq -/-小鼠BMEC的miR-31-5p功能，再检测ROSC后Adipoq -/-小鼠皮质神经元凋亡的变化。
（1）相较于WT小鼠，Adipoq -/-小鼠血浆sEV及BMEC的miR-31-5p表达量增加
血浆 sEV及BMEC的RT-qPCR结果显示，Adipoq -/- sham小鼠血浆sEV携带的miR-31-5p明显高于WT sham小鼠（330.83倍，P<0.05，图15），BMEC的miR-31-5p表达量也高于WTsham小鼠（4.42倍，P<0.05）。因此，我们推测Adipoq -/- 小鼠ROSC后皮质神经元凋亡率较WT小鼠升高可能与miR-31-5p相关，需进一步验证。
（2）内皮细胞特异性AAV9-BR1-miR-31-5p sponge制备
AAV9-BR1-miR-31-5p sponge以CV701为载体，NheI/MfeI为克隆位点，BR1血清型包被，经琼脂糖凝胶电泳和阳性克隆测序确认AAV9-BR1-miR-31-5p sponge制备成功，由吉凯生物公司完成。
（3）特异性拮抗BMEC miR-31-5p功能减轻Adipoq -/-小鼠ROSC后皮质神经元凋亡
（3.1）Adipoq -/- 小鼠各组基线资料无差异
为证实特异性抑制Adipoq -/- 小鼠BMEC中的miR-31-5p的表达能减轻ROSC后皮质神经元凋亡，预先侧脑室立体定位注射AAV9-BR1-miR-31-5p sponge，4周后建立CA-CPR-ROSC模型，3 h后取材评估Adipoq -/- 小鼠皮质神经元凋亡变化。本实验纳入Adipoq -/- 小鼠15只。因侧脑室立体定位注射死亡2只，心肺复苏死亡7只，采用随机数字法进行增补，最后共使用Adipoq -/- 小鼠24只，心肺复苏成功率58.8%。3组小鼠的体重、心率、呼吸差异均无统计学意义（P＞0.05）。心肺复苏后CPR- NC sponge组和CPR- miR-31-5p sponge组的小鼠复苏时间和ROSC后心率差异也无统计学意义（P＞0.05）。
表3 各组Adipoq -/- 小鼠基线资料无差异
HR: Heart rate，心率；RR: Respiratory rate，呼吸频率； CPR：Cardiopulmonary
resuscitation，心肺复苏；ROSC: Return of spontaneous circulation，恢复自主循环
（3.2）特异性拮抗BMEC源性 miR-31-5p减轻Adipoq -/- 小鼠ROSC后皮质神经元凋亡
联合NeuN/TUNEL免疫荧光染色和WB检测3组Adipoq -/- 小鼠ROSC后的皮质神经元凋亡变化。免疫荧光结果显示，CPR-NC sponge组的凋亡率较Sham-NC-sponge组显著增加（15.64%，P＜0.01，图16a-b），CPR-miR-31-5p sponge组的凋亡率显著低于CPR-NC sponge组（6.63%，P＜0.01）。WB结果显示，CPR-NC sponge组小鼠的皮质神经元Cleaved-caspase 3的表达水平较Sham-NC sponge组显著增加（3.78倍，P＜0.01，图16c-d）。而采用AAV9-BR1-miR-31-5p sponge特异性抑制BMEC中miR-31-5p表达后，CPR-miR-31-5p sponge组Cleaved-caspase 3的表达水平显著下降，低于CPR-NC sponge组（P＜0.01）。
综上所述，本实验例筛选并验证了APN是通过下调miR-31-5p进而增强BMEC sEV对ROSC后皮质神经元凋亡的保护作用。因此，可以推断，具有下调BMEC sEV的miR-31-5p表达的物质均有潜力用于作用BMEC，进而制备出对ROSC后皮质神经元凋亡保护作用增强的BMECsEV。
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明制备了miR-31-5p表达下调后的BMECsEV，其对ROSC后皮质神经元凋亡具有更好的保护作用，因而其在制备用于减轻ROSC后皮质神经元凋亡的药物中具有很好的应用前景。

Claims (9)

1.一种脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell，BMEC)释放的小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sEV)，其特征在于：它是脑微血管内皮细胞受到下调miR-31-5p表达的干预后释放的小细胞外囊泡，所述下调miR-31-5p表达的干预为采用脂联素进行干预。
2.按照权利要求1所述的BMEC释放的sEV，其特征在于：所述小细胞外囊泡是脑微血管内皮细胞受到5-10μg/ml脂联素作用后释放的。
3.按照权利要求2所述的BMEC释放的sEV，其特征在于：所述小细胞外囊泡是脑微血管内皮细胞受到10μg/ml脂联素作用后释放的。
4.权利要求1-3任一项所述的BMEC释放的sEV的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，培养脑微血管内皮细胞；
步骤2，对所述脑微血管内皮细胞进行干预，使miR-31-5p表达下调，继续培养；所述下调miR-31-5p表达的干预为采用脂联素进行干预；
步骤3，收集培养基上清，分离提取小细胞外囊泡。
5.按照权利要求4所述的BMEC释放的sEV的制备方法，其特征在于：步骤1中，用于培养脑微血管内皮细胞的培养基由如下体积份的组分组成：
Exosome-depleted FBS 5份、
bFGF 0.05份、
0.1v/v％的肝素钠0.1份、
ECGS1份、
1wt.％的青霉素/链霉素双抗溶液1份、
DMEM培养基94份；
和/或，步骤2中，继续培养的时间为24-48h。
6.权利要求1-3任一项所述的BMEC释放的sEV在制备用于保护神经元的药物中的用途。
7.按照权利要求6所述的用途，其特征在于：所述药物用于减轻心肺复苏后皮质神经元凋亡。
8.一种用于保护神经元的药物，其特征在于：它是以权利要求1-3任一项所述的BMEC释放的sEV作为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的制剂。
9.按照权利要求8所述的用于保护神经元的药物，其特征在于：所述药物用于减轻心肺复苏后皮质神经元凋亡。
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