CN109804070A - 具有改进的细胞渗透性的肽核酸复合物和包含其的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有新颖结构的核酸复合物，其可以将生物活性核酸引入细胞中；一种用于治疗和诊断疾病的组合物，其包含该核酸复合物；和一种使用该核酸复合物调节靶基因表达的方法；并且更具体地，涉及一种包含生物活性核酸的核酸复合物，该生物活性核酸与被修饰为总体带正电荷的载体肽核酸互补地结合；一种用于治疗和诊断疾病的组合物，其包含该核酸复合物；和一种使用该核酸复合物调节靶基因表达的方法。

Description

具有改进的细胞渗透性的肽核酸复合物和包含其的药物组 合物
技术领域
本发明涉及具有新颖结构的核酸复合物，其可以将生物活性核酸引入细胞中；用于治疗和诊断疾病的组合物，其包含该核酸复合物；和使用该核酸复合物调节靶基因表达的方法；并且更具体地，涉及包含生物活性核酸的核酸复合物，该生物活性核酸与被修饰为总体带正电荷的载体肽核酸互补地结合；用于治疗和诊断疾病的组合物，其包含该核酸复合物；和使用该核酸复合物调节靶基因表达的方法。
背景技术
通常，新药的研究是基于通过计算机研究来筛选多种化合物，并且大多数经筛选的化合物靶向蛋白质。
与传统药物不同，核酸药物抑制靶特异性信使RNA(mRNA)的表达，从而有可能解决无法通过靶向蛋白质的常规药物治疗疾病的研究领域(Kole R.等人,Nature Rev.DrugDiscov.2012；11；125-140.，Wilson C.等人,Curr.Opin.Chem.Bio.2006；10:607-614.)。
尽管基于寡核酸的基因表达调节具有优异的效果和多种应用，但在基于核酸的治疗剂的开发中存在许多需要克服的障碍。例如，寡核酸有被核酸酶等损害的风险，并且由于这些寡核酸的电特性(电荷)和大小，寡核酸通过被动扩散而通过细胞膜是不可能的。为了克服这些问题，已经不断努力通过核酸修饰来确保生物稳定性。对于经修饰的人工核酸，可以在不丧失生物活性的情况下增加它们对靶核酸的亲和力。
肽核酸(PNA)(一种经修饰的人工核酸)是一种在其中引入了(2-氨基乙基)-甘氨酸肽骨架的人工核酸，并且具有与RNA和DNA强烈结合的特性，所述RNA和DNA各自具有与其互补的核苷酸序列。特别地，肽核酸对核酸酶具有抗性并且具有高生物稳定性，并且因此已经对基于多种寡核酸的治疗剂进行了研究。然而，肽核酸具有这样的缺点，即它难以引入细胞中，因为它本质上是电中性的(Joergensen M.等人,Oligonucleotides 2011,21；29-37.)。
由于核酸作为药物的性能和优点，使用核酸的多种临床试验正在进行中。尽管基于核酸的治疗酸的应用越来越多，但载体用于细胞内引入的用途非常有限。例如，已经使用这样的策略(方法)进行临床试验，所述策略(方法)通过使用纳米颗粒、阳离子脂质体和聚合物纳米颗粒将基于寡核酸的药物递送到细胞或组织中。然而，大多数这些临床试验不包括递送系统，并且主要依赖于通过肠胃外给予途径(包括肌内注射、眼内给予、皮下注射等)直接引入核酸。
另外，寡核酸本身的细胞膜渗透性相当低，并且特别是DNA或RNA带负电荷。由于这个原因，这些寡核酸不能通过细胞膜的疏水性磷脂双层，并且因此难以通过简单扩散递送到细胞中。使用病毒载体(如逆转录病毒或AAV(腺相关病毒))可以将寡核酸引入细胞中，但是有风险，如非预期的免疫活性和可能的癌基因重组(Couto L.B.等人,Curr.Opin.Pharmacol.2010,5；534-542.)。
由于这个原因，基于具有低细胞毒性和低免疫活性的非病毒寡核酸的核酸载体的开发具有越来越重要的意义。因此，已经开发了使用阳离子脂质、脂质体、稳定核酸脂质颗粒(SNALP)、聚合物和细胞穿透肽引入核酸的技术(Zhi D.等人,Bioconjug.Chem.2013,24；487-519.，Buyens K.等人,J.Control Release,2012,158；362-70.，ROSSI,J.J.等人,GeneTher.2006,13:583-584.，Yousefi A.等人,J.Control Release,2013,170；209-18.，Trabulo S.等人,Curr.Pharm.Des.2013,19；2895-923.)。
这些核酸递送技术通过直接结合(包括复合物形成步骤)具有功能部分，并且具有与脂质体结构的内体逃逸效率、体内毒性等相关的问题。因此，需要改进引入寡核酸的功能并克服与生产程序和副作用相关的问题。
在这种技术背景下，本发明人进行了广泛的努力以开发具有低细胞毒性、允许生物活性核酸渗透到细胞中的能力和增加的调节基因表达的能力的新结构，并且结果发现包含与被修饰为总体带正电荷的载体肽核酸互补地结合的生物活性核酸的核酸复合物具有令人惊讶的增加的细胞渗透性，并且可以使用该核酸复合物非常有效地调节靶基因的表达，从而完成本发明。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，并且本发明的一个目的在于提供一种核酸复合物，其包含与被修饰为总体带正电荷的载体肽核酸互补地结合的生物活性核酸；一种用于治疗和诊断疾病的组合物，其包含该核酸复合物；和一种使用该核酸复合物调节靶基因表达的方法。
本发明的另一个目的在于提供一种用于治疗疾病的方法，其包括向需要治疗的患者给予根据本发明的核酸复合物和/或包含其的药物组合物。
为了实现上述目的，本发明提供了一种具有由以下结构式(1)表示的结构的核酸复合物：
[结构式(1)]
[A≡C(+)]，
其中
A表示具有能够与靶基因或靶基因序列结合的序列的生物活性核酸；
C表示能够与该生物活性核酸结合的载体肽核酸；
“≡”表示该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的互补结合；
由A表示的该生物活性核酸总体带负电荷或是中性的；
C(+)指示该载体肽核酸总体带正电荷；并且
该载体肽核酸包含一个或多个经修饰以使得该载体肽核酸总体带正电荷的肽核酸单体。
可以通过适当地控制该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的电荷平衡来控制由结构式(1)表示的该核酸复合物的粒径。
具体地，随着该载体肽核酸的正电荷增加，该核酸复合物的粒径变小，但是如果该载体肽核酸的正电荷超过一定水平，则该核酸复合物的粒径变大。另外，该核酸复合物的粒径由随该复合物的生物活性肽核酸的电荷的该生物活性核酸和该载体肽核酸之间的适当电荷平衡来决定。
根据本发明的载体肽核酸的正电荷数是1至7(指示包括2至5个带正电荷的单体)、优选2至5、最优选2至3，并且用于电荷平衡的该生物活性核酸的净负电荷数是0至5、优选0至3。
根据本发明的核酸复合物的粒径是5至300nm、优选10至80nm、最优选15至70nm。
因此，本发明还提供了一种控制由结构式(1)表示的核酸复合物的粒径的方法，其包括控制该核酸复合物的电荷平衡。
本发明还提供了一种用于预防和治疗疾病的组合物，其包含由结构式(1)表示的核酸复合物；一种用于诊断疾病的组合物，其包含由结构式(1)表示的核酸复合物；和一种用于调节靶基因表达的组合物，其包含由结构式(1)表示的核酸复合物。
本发明还提供了一种用于诊断疾病的试剂盒，其包含由结构式(1)表示的核酸复合物。
本发明还提供了一种使用复合物调节靶基因表达的方法，该方法包括以下步骤：(a)通过使生物活性核酸与载体肽核酸结合来形成该复合物；并且(b)通过使该复合物与靶细胞接触将该复合物引入该靶细胞中。
本发明还提供了一种用于治疗疾病的方法，其包括向需要治疗的患者给予根据本发明的核酸复合物和/或包含其的药物组合物。
附图说明
图1显示了单链生物活性核酸与由结构式(1)表示的核酸复合物之间的粒径比较，所述核酸复合物包含与载体肽核酸平行结合的生物活性核酸。
(A)：仅生物活性核酸；
(B)：核酸复合物，其包含与载体肽核酸平行结合的生物活性肽核酸。
图2a和2b是SEM照片，显示了随着由结构式(1)表示的核酸复合物的生物活性肽核酸和载体肽核酸的电特性变化的复合颗粒的形态和大小变化的观察结果。
(A)：PNA双链体1(生物活性肽核酸(SEQ ID NO:6)和载体肽核酸(SEQ ID NO:32)的复合物)；
(B)：PNA双链体2(生物活性肽核酸(SEQ ID NO:5)和载体肽核酸(SEQ ID NO:32)的复合物)；
(C)：PNA双链体3(生物活性肽核酸(SEQ ID NO:1)和载体肽核酸(SEQ ID NO:37)的复合物)；
(D)：PNA双链体4(生物活性肽核酸(SEQ ID NO:1)和载体肽核酸(SEQ ID NO:23)的复合物)。
图3a至3c是在共聚焦显微镜下拍摄的照片，用于根据生物活性肽核酸与载体肽核酸之间的结合及其电特性来分析本发明的核酸复合物的细胞渗透性。
(a)：使用包含不带电荷的生物活性肽核酸(SEQ ID NO:13)和载体肽核酸(SEQ IDNO:38)的复合物的情况；
(b)：使用包含带电荷的生物活性肽核酸(SEQ ID NO:13)和载体肽核酸(SEQ IDNO:40)的复合物的情况；以及
(c)：使用包含具有各种电荷的生物活性肽核酸和具有三个正电荷的载体肽核酸(SEQ ID NO:40)的复合物的情况；
(1)：使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:15)和载体肽核酸(SEQ ID NO:40)的复合物的情况；
(2)：使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:16)和载体肽核酸(SEQ ID NO:40)的复合物的情况；
(3)：使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:14)和载体肽核酸(SEQ ID NO:40)的复合物的情况；和
(4)：使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:17)和载体肽核酸(SEQ ID NO:40)的复合物的情况。
图4显示了当PNA用作由结构式(1)表示的核酸复合物中的载体肽核酸时，随着时间的推移细胞内存在或不存在生物活性肽核酸复合物的观察结果。
图5a至5f显示了包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的由结构式(1)表示的核酸复合物是否随着时间的推移在细胞中分离的观察结果。
(a)：对照复合物；
(b)：显示包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:14)和载体肽核酸(SEQ ID NO:39)的复合物在24小时后在细胞中保持复合形式的图；
(c)：显示包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:14)和载体肽核酸(SEQ ID NO:39)的复合物在48小时后在细胞中保持复合形式或分离的图；
(d)：显示包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:14)和载体肽核酸(SEQ ID NO:39)的复合物在72小时后在细胞中分离成载体肽核酸和生物活性核酸的图；
(e)：显示包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:14)和载体肽核酸(SEQ ID NO:39)的复合物在96小时后在细胞中分离成载体肽核酸和生物活性核酸的图；以及
(f)：显示包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:13)和载体肽核酸(SEQ ID NO:39)的复合物在120小时后在细胞中分离成载体肽核酸和生物活性核酸并且然后留在细胞中的图。
图6a至6g显示了进行以检查当单独使用单一siRNA时以及当使用包含单一siRNA和PNA作为载体肽核酸(SEQ ID NO:39)的由结构式(1)表示的复合物时的细胞内渗透效率的共聚焦显微术的结果。
(a)：使用单一siRNA的情况；以及
(b)至(g)：使用包含单一siRNA和载体肽核酸(SEQ ID NO:39)的复
合物的情况。
图7显示由结构式(1)表示的核酸复合物抑制多种癌细胞系中存活蛋白和下游蛋白质的表达，所述核酸复合物包含存活蛋白特异性生物活性肽核酸。
(A)：使用HeLa细胞系的实验结果；
(B)：使用SW480细胞系的实验结果；以及
(C)：使用SK-BR-3细胞系的实验结果。
图8a至8c显示由结构式(1)表示的核酸复合物抑制多种癌细胞系中存活蛋白及其下游蛋白质的表达，所述核酸复合物包含存活蛋白特异性生物活性肽核酸。
(a)：使用包含不带电荷的生物活性肽核酸(SEQ ID NO:1)和具有各种电荷的肽核酸的复合物在SW480细胞系中进行的实验的结果；
(b)：使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:2)和具有各种电荷的肽核酸的复合物在SW480细胞系中进行的实验的结果；
(c)：使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:6)和具有各种电荷的肽核酸的复合物在SW480细胞系中进行的实验的结果；
(d)：使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:12)和具有各种电荷的肽核酸的复合物在SW480细胞系中进行的实验的结果；以及
(e)：使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:12)和具有各种电荷的肽核酸的复合物在SK-BR-3细胞系中进行的实验的结果。
图9a和9b显示了随着由结构式(1)表示的核酸复合物中生物活性肽核酸和载体肽核酸的长度变化的细胞活力的变化。
(a)：随着载体肽核酸的长度变化的细胞活力的变化；以及
(b)：随着生物活性肽核酸的长度变化的细胞活力的变化。
图10a和10b显示了由结构式(1)表示的核酸复合物对人结肠直肠癌细胞系的细胞活力的改变，所述核酸复合物包含存活蛋白特异性生物活性肽核酸，并且显示该核酸复合物抑制该细胞系中存活蛋白及其下游蛋白质的表达。
(a)：细胞活力的变化；以及
(b)：存活蛋白及其下游蛋白质表达的变化。
图11a至11e显示了在移植有人结肠直肠癌细胞系的小鼠中由结构式(1)表示的核酸复合物的肿瘤生长抑制作用的评估结果，所述核酸复合物包含存活蛋白特异性生物活性肽核酸。
(a)：小鼠体重的变化；
(b)：肿瘤体积的变化；
(c)：肿瘤重量的变化；
(d)：肿瘤外观的变化；以及
(e)：肝毒性标记的变化。
图12a至12c显示使用由结构式(1)表示的核酸复合物改变人乳腺癌细胞系和肺癌细胞系的细胞活力，抑制VEGF及其下游蛋白质的表达，并且诱导细胞凋亡，所述核酸复合物包含VEGF特异性生物活性肽核酸。
(a)：细胞活力的变化；
(b)：VEGF及其下游蛋白质表达的变化；以及
(c)：VEGF抑制诱导的细胞凋亡分析。
图13显示了通过使用斑马鱼作为模型评估由结构式(1)表示的核酸复合物的抗癌药理作用的结果，所述核酸复合物包含VEGF特异性生物活性肽核酸。
图14a和14b显示使用由结构式(1)表示的核酸复合物表现出抑制人视网膜色素上皮细胞的细胞活力和抑制细胞中VEGF及其下游蛋白质的表达的作用，所述核酸复合物包含VEGF特异性生物活性肽核酸。
(a)：细胞活力的变化；以及
(b)：VEGF及其下游蛋白质表达的变化。
图15a和15b显示使用由结构式(1)表示的核酸复合物表现出抑制人表皮角质形成细胞的细胞活力和抑制细胞中IFI16及其下游蛋白质的表达的作用，所述核酸复合物包含IFI16特异性生物活性肽核酸。
(a)：细胞活力的变化；以及
(b)：IFI16及其下游蛋白质表达的变化。
图16a至16c显示了评估由结构式(1)表示的核酸复合物对银屑病诱导的小鼠模型的影响的结果，所述核酸复合物包含IFI16特异性生物活性肽核酸。
(a)：显示耳厚度变化的照片和耳厚度的测量结果；
(b)：IFI16及其下游蛋白质表达的变化；以及
(c)：显示耳组织中表皮角质形成细胞的变化的活检结果。
图17显示了评估由结构式(1)表示的核酸复合物对人乳腺癌细胞系中PD-L1及其下游蛋白质的抑制的影响的结果，所述核酸复合物包含PD-L1特异性生物活性肽核酸。
图18显示了进行以检查使用由结构式(1)表示的核酸复合物是否抑制细菌的生长的实验的结果，所述核酸复合物包含acpP特异性生物活性肽核酸。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的那些相同的含义。通常，本文中使用的命名法和将在下文描述的实验方法是本领域众所周知且常用的那些。
在下文中，将详细描述本发明。
本发明涉及具有由以下结构式(1)表示的结构的核酸复合物：
[结构式(1)]
[A≡C(+)]，
其中
A表示具有能够与靶基因或靶基因序列结合的序列的生物活性核酸；
C表示能够与该生物活性核酸结合的载体肽核酸；
“≡”表示该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的互补结合；
由A表示的该生物活性核酸总体带负电荷或是中性的；
C(+)指示该载体肽核酸总体带正电荷；并且
该载体肽核酸包含一个或多个经修饰以使得该载体肽核酸总体带正电荷的肽核酸单体。
如本文所用，术语“生物活性核酸”是指具有能够与其表达降低的靶基因结合的互补序列、特别是能够与此靶基因的mRNA结合的互补序列的核酸，或者包含促进待表达的靶基因表达的序列的核酸。具体地，它是指参与基因表达调节(如抑制或促进感兴趣基因的表达)的核酸。它可以是具有与其表达降低或增加的靶基因互补的序列的核酸，或者可以是具有与单链RNA(如前mRNA、miRNA、mRNA等)的序列互补的序列的核酸。
特别地，本发明中的“生物活性核酸”可以与靶基因或包含其的核苷酸序列在体外或在体内结合，从而激活或抑制靶基因的特征功能(例如，转录物表达或蛋白质表达)或调节前mRNA的剪接(例如，外显子跳跃)，其中核苷酸序列可以是基因调节序列、或基因编码序列、或剪接调节序列。基因调节序列可以选自启动子、转录增强子、5'非翻译区、3'非翻译区、病毒包装序列和选择标记。基因编码序列可以是外显子或内含子，并且基因编码序列可以位于距基因的转录起始位点10、5、3或1kb或者500、300或200bp内。例如，它可以位于起始位点的上游或下游。此外，剪接调节序列可以包含与外显子跳跃、隐蔽剪接、假剪接位点激活、内含子保留或可变剪接失调相关的序列。
如本文所用，术语“载体肽核酸”是指其碱基部分或完全与生物活性核酸互补地结合从而赋予功能性的核酸。可以用于本发明的载体肽核酸不仅包括肽核酸(PNA)，还包括与其类似的经修饰核酸。载体肽核酸优选地是肽核酸，但不限于此。
在本发明中，生物活性核酸和载体肽核酸各自可以包含2至50、优选5至30、更优选10至25、最优选15至17个核酸单体。
此外，生物活性核酸可以由天然核酸碱基和/或经修饰核酸单体组成，并且载体肽核酸可以具有与生物活性核酸部分或完全互补的核苷酸序列。
特别地，载体肽核酸可以包含一个或多个通用碱基，并且载体肽核酸也可以完全由通用碱基组成。
在本发明中，生物活性核酸可以选自DNA、RNA和经修饰核酸，即PNA(肽核酸)、PMO(磷酰二胺吗啉代寡核苷酸)、LNA(锁核酸)、GNA(乙二醇核酸)、TNA(苏糖核酸)、反义寡核苷酸、适体、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)、核酶和DNA酶。优选地，生物活性核酸可以选自DNA、RNA和经修饰核酸，即PNA(肽核酸)、PMO(磷酰二胺吗啉代寡核苷酸)、LNA(锁核酸)、GNA(乙二醇核酸)和TNA(苏糖核酸)。
在本发明中，如果生物活性核酸中使用的单体是PNA，则生物活性核酸被称为生物活性肽核酸，并且如果使用其他单体，则以相同方式称谓生物活性核酸。
在本发明中，生物活性核酸和载体肽核酸可以进一步包含一个或多个选自磷酸二酯、2'O-甲基、2'甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯和硫代磷酸酯的官能团。
在本发明中，核酸复合物的生物活性核酸和载体肽核酸各自在电特性方面总体可以带正电荷(阳离子的)、带负电荷(阴离子的)或是中性的。
如当表达电特性时使用的术语“总体”不是意指各个碱基的电特性，而是意指当从外部观察时生物活性核酸或载体肽核酸的总体电特性。
例如，如果生物活性核酸中带负电荷的单体的数目较大，即使生物活性核酸中的一些单体带正电荷，则当“总体”观察电特性时，生物活性核酸仍带负电荷。
如果载体肽核酸中带正电荷的碱基和/或骨架的数目较大，即使载体肽核酸中的一些碱基和/或骨架带负电荷，则当“总体”观察电特性时，载体肽核酸仍带正电荷。
在这方面，在根据本发明的由结构式(1)表示的核酸复合物中，优选的是当总体观察电特性时生物活性核酸带负电荷或是中性的，并且当总体观察电特性时载体肽核酸带正电荷。
可以使用经修饰肽核酸单体赋予生物活性核酸和载体肽核酸各自的电特性。经修饰肽核酸单体可以包含一个或多个选自赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸(DAB)、鸟氨酸(Orn)和氨基酸类似物的带正电荷的氨基酸作为带正电荷的载体肽核酸。另外，经修饰肽核酸单体可以包含一个或多个选自作为带负电荷的氨基酸的谷氨酸(Glu，E)和氨基酸类似物的带负电荷的氨基酸作为带负电荷的载体肽核酸。
优选地，载体肽核酸可以包含一个或多个γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体，以便总体带正电荷。特别地，γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体可以在其骨架中包含一个或多个选自赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸(DAB)、鸟氨酸(Orn)和氨基酸类似物的带正电荷的氨基酸，以便是电正性的。
除了骨架修饰之外，还可以使用核碱基修饰的肽核酸单体进行用于赋予电荷的肽核酸单体的修饰。
优选地，载体肽核酸可以在其核碱基中包含胺、三唑或咪唑部分以便是电正性的，或者可以在其核碱基中包含羧酸以便是电负性的。
另外，载体肽核酸的经修饰核酸单体可以在骨架或核碱基中进一步包含负电荷，但是经修饰肽核酸单体优选地包含比带负电荷的单体数目更多的带正电荷的单体，使得载体肽核酸总体带正电荷。
优选地，根据本发明的由结构式(1)表示的核酸复合物可以总体带正电荷。
在根据本发明的由结构式(1)表示的核酸复合物中，一种或多种选自疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适体、猝灭剂和荧光/发光标记的物质可以与生物活性核酸和/或载体肽核酸结合。优选地，一种或多种选自疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适体和用于成像的荧光/发光标记的物质可以与载体肽核酸结合。
在本发明中，一种或多种选自疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适体、猝灭剂、荧光标记和发光标记的物质与生物活性核酸和/或载体肽核酸的结合可以通过单个共价键或接头介导的共价键进行，但不限于此(参见表1)。优选地，与核酸载体结合的细胞渗透、溶解度、稳定性、递送和成像相关物质(例如，疏水部分等)独立于调节靶基因表达的生物活性核酸而存在。
在本发明中，核酸的互补结合可以大致分为反平行结合和平行结合。这样配置核酸的互补结合，使得其在生物活性核酸靶向的序列(与生物活性核酸互补的序列)的存在下释放。
根据DNA-DNA或DNA-PNA结合中的5'方向性和3'方向性确定反平行结合和平行结合。反平行结合是一般的DNA-DNA或DNA-PNA结合方法。以根据本发明的结构式(1)的核酸复合物为例，反平行结合意指5'至3'方向的生物活性核酸和3'至5'方向的载体肽核酸彼此结合，并且平行结合显示出比反平行结合稍低的结合亲和力，并且意指生物活性核酸和载体肽核酸在5'至3'方向或3'至5'方向彼此结合。
优选地，在根据本发明的由结构式(1)表示的核酸复合物中，生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度(Tm))可以低于生物活性核酸与生物活性核酸靶向的基因(特别是靶基因的mRNA)之间的结合亲和力。
作为允许生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度(Tm))低于生物活性核酸与生物活性核酸靶向的基因(特别是靶基因的mRNA)之间的结合亲和力的具体例子，生物活性核酸和载体肽核酸可以通过平行结合或部分特异性结合彼此结合，使得生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度(Tm))低于生物活性核酸与生物活性核酸靶向的基因(特别是靶基因的mRNA)之间的结合亲和力，但不限于此。
作为另一个例子，载体肽核酸可以具有接头、通用碱基和至少一个选自不与生物活性核酸的相应碱基互补的肽核碱基的肽核碱基，使得生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度(Tm))低于生物活性核酸与生物活性核酸靶向的基因(特别是靶基因的mRNA)之间的结合亲和力(参见表1)。
可以用于本发明的通用碱基可以是选自天然碱基(包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶)、以及肌苷PNA、吲哚PNA、硝基吲哚PNA和脱碱基中的一种或多种，所述脱碱基是没有选择性地结合并且具有比互补结合亲和力低的结合亲和力的碱基。优选地，肌苷PNA可以用作通用碱基。
表1：生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合的例子
在上表1中，N表示核碱基(ATGC)；*表示与反义核酸序列不互补的序列；$表示通用碱基；＝表示接头；并且5'-和3'-表示核酸(碱基)的方向性。
本发明提供了核酸的结合形式和电特性的组合用于调节核酸复合物的功能，可以通过核酸的结合形式和电特性的组合来控制粒径和作用时间，并且可以增加细胞渗透性、溶解度和特异性。
具体地，可以通过控制生物活性肽核酸和载体肽核酸的电荷来控制核酸复合物的粒径，并且可以通过载体肽核酸的合适数目的正电荷与生物活性肽核酸的电荷之间的适当的电荷平衡来减小核酸复合物的粒径。
同时，可以通过控制载体肽核酸与生物活性肽核酸之间的结合亲和力来控制生物活性肽核酸与靶序列在靶基因的存在下结合的时间点(生物活性核酸与靶序列的链置换的时间、生物活性核酸的靶特异性释放和结合的时间)。
换言之，在根据本发明的结构式(1)的核酸复合物中，生物活性核酸与靶序列的链置换以及生物活性核酸的靶特异性释放和结合的时间可以通过用于复合物的非特异性结合的载体肽核酸的非特异性碱基、通用碱基、接头的存在或不存在以及碱基的数目和位置来控制，并且还可以通过这些条件与作为复合物中的互补结合的平行或反平行结合的组合来控制。
根据本发明的由结构式(1)表示的核酸复合物可以通过使生物活性核酸和载体肽核酸在适当条件下杂交来制备。
如本文所用，术语“杂交”意指互补的单链核酸形成双链核酸。当两条核酸链之间的互补性完全匹配时或当存在一些错配的残基时，可以发生杂交。杂交所必需的互补程度可以根据杂交条件而变化，特别是可以通过结合温度来控制。
根据本发明的生物活性核酸和载体肽核酸可以具有附接至两端的报告分子和荧光猝灭剂。荧光猝灭剂可以猝灭报告分子的荧光。报告分子可以是选自FAM(6-羧基荧光素)、德克萨斯红、HEX(2',4',5',7'-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素)和Cy5中的一种或多种。猝灭剂可以是选自TAMRA(6-羧基四甲基-罗丹明)、BHQ1、BHQ2和Dabcyl中的一种或多种，但不限于此。
在本发明中，载体肽核酸可以与生物活性核酸形成互补氢键并将生物活性核酸递送到细胞中，并且生物活性核酸可以与靶基因结合并调节靶基因的表达。
如本文所用，术语“靶基因”是指待激活、抑制或标记的核酸序列(核苷酸序列)，并且与术语“靶核酸”无异且可互换使用。
如果包含靶基因的靶核酸(核苷酸序列)在体外或在体内接触(结合)复合物，则生物活性核酸与载体肽核酸分离并表现出生物活性。
在另一个方面，本发明涉及用于调节靶基因表达的组合物、用于预防或治疗疾病的组合物和用于诊断疾病的组合物，其包含由结构式(1)表示的核酸复合物。
本发明还涉及用于预防或治疗疾病的方法，其包括向需要治疗或预防的患者给予由结构式(1)表示的核酸复合物。
本发明还涉及调节靶基因表达的方法，其包括使用由结构式(1)表示的核酸复合物。
可以使用由结构式(1)表示的核酸复合物预防、治疗或诊断的疾病可以根据由结构式(1)表示的核酸复合物中的生物活性核酸所结合的靶基因来决定。优选地，疾病是癌症或肿瘤，但不限于此。
术语“用于治疗的组合物”可以与“药物组合物”互换使用，并且组合物包含作为活性成分的核酸复合物，其包含生物活性核酸和与其结合的载体生物活性核酸。
根据标准药学实践，根据本发明的用于治疗的组合物可以配制成口服或肠胃外剂型。除了活性成分之外，此制剂还可以含有添加剂，如药学上可接受的载体、赋形剂、补充剂或稀释剂。
术语“生理学上可接受的”意指不损害化合物的生物活性和物理特性的特性。
术语“载体”定义为促进复合物加入细胞或组织中的化合物。例如，二甲亚砜(DMSO)是一种载体，其通常用于促进许多有机化合物渗透到生物体的细胞或组织中。
术语“稀释剂”不仅定义为稳定目标化合物的生物活性形式的化合物，还定义为在其溶解的水中稀释的化合物。溶解在缓冲溶液中的盐用作相关领域中的稀释剂。常用的缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水溶液，因为它模拟人溶液中盐的状况。由于缓冲盐可以控制低浓度溶液的pH值，缓冲稀释剂很少改变化合物的生物活性。
含有本文所用复合物的化合物可以本身给予人类患者，或者在与其他活性成分(如在联合疗法中)或者合适的载体或赋形剂混合的药物组合物中给予。
适用于本发明的药物组合物包括其中含有有效量的活性成分以实现其预期目的的组合物。更具体地，治疗有效量意指有效预防、稳定、缓解或改善疾病症状或者延长所治疗受试者存活的化合物的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开文本。
如本文所用，术语“预防”或“治疗”是指通过给予(或施用)包含复合物或药学上可接受的盐的药物组合物而表现出抗癌活性并抑制癌症生长或延迟癌症发展的所有作用。如本文所用，术语“治疗(treating或treatment)”是指通过给予(或施用)包含复合物或其药学上可接受的盐的药物组合物而缓解或完全治愈癌症的所有作用。
可以通过包含本发明的核酸复合物的组合物预防或治疗的疾病没有特别限制。疾病的例子可以优选地包括但不限于肿瘤或癌症、炎性疾病、年龄相关性黄斑变性、耳聋和皮肤病。
可以通过包含本发明的核酸复合物的用于治疗的组合物治疗的疾病由核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因决定。核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的用于癌症疗法的靶基因的例子包括存活蛋白、VEGF、雄激素受体、KRAS、丛集素、TGFβR2、ERBB3、转谷氨酰胺酶2、ABCB1、Hsp27、STAT3、PD-L1等。
靶向炎性疾病的基因是DE4B或Pellino-1，靶向罕见疾病和严重疾病的基因是SMN2、ApoB-100、ICAM-1、ApoCIII、TTR、HTT、GHr、SOD1、ANGPTL3、PKK、miR-21、TMPRSS6、FMR1或连接蛋白26，靶向心血管疾病的基因是因子XI、Apo(a)或ApoCIII、AG，靶向代谢疾病的基因是GCGR、ANGPTL3、miR-103/107或DGAT2，并且靶向皮肤病的基因是IFI16、TLR6或TIEG1，但是基因的例子不限于此。
根据本发明的用于治疗的组合物可以通过已知方法单独配制或与如下所述的合适的药学上可接受的载体或赋形剂一起配制成肠胃外或口服剂型。这种制剂的具体例子包括口服制剂，如可注射制剂、软胶囊制剂、硬胶囊制剂、片剂制剂和糖浆制剂；或外用剂。
优选地，可以按肠胃外剂型制备和使用包含根据本发明的核酸复合物的用于治疗的组合物。合适的肠胃外剂型的例子包括但不限于适用于皮下注射、静脉内注射、肌内注射或胸内注射的溶液或冷冻干燥制剂。
在仍另一个方面，根据本发明的核酸复合物可以通过皮肤递送途径来给予。用于皮肤递送的制剂可以选自水溶液、乳膏和软膏，但不限于此，并且可以使用相关领域中已知的所有类型的皮肤递送制剂。
为了以肠胃外剂型配制根据本发明的用于治疗的组合物，组合物包含本发明的核酸复合物，并且可以是选自生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇中的一种及其两种或多种的混合物。如果需要，组合物可以含有其他常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。另外，可以将稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂另外加入到待制备成可注射制剂(如水溶液、悬浮液或乳液)的组合物中。特别地，组合物优选地作为冻干制剂提供。为了制备冻干制剂，可以使用本发明所属技术领域中已知的常规方法，并且还可以加入用于冻干的稳定剂。此外，组合物可以优选地通过本领域已知的合适方法或通过Remington's Pharmaceutical Science,Mack PublishingCompany,Easton PA中披露的方法根据疾病或组分来配制。
另外，根据本发明的用于治疗的组合物可以配制成口服剂型，包括散剂、片剂、胶囊、液体、可注射溶液、软膏和糖浆制剂。在这种情况下，可以将一种或多种药学上可接受的赋形剂加入到组合物中。
在仍另一个方面，本发明涉及用于治疗癌症的组合物，其包含根据本发明的核酸复合物。可以通过根据本发明的组合物治疗的肿瘤或癌症没有特别限制，但是包括实体癌和血癌两者。优选地，肿瘤或癌症包括其中表达靶基因(例如，存活蛋白(一种抗癌疗法的新靶标，Cancer Treat Rev.35(7):553-62,2009))的所有种类的癌症。更优选地，癌症可以选自肝癌、肝细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、结肠癌、子宫颈癌、脑癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、食道癌、胆道癌、睾丸癌、直肠癌、头颈癌、输尿管癌、骨肉瘤、神经细胞瘤、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤。
优选地，根据本发明的用于治疗癌症的核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因可以是选自存活蛋白、VEGF、雄激素受体、KRAS、丛集素、TGFβR2、ERBB3、转谷氨酰胺酶2、ABCB1、Hsp27、STAT3和PD-L中的任何一种或多种，但不限于此。
优选地，根据本发明的用于治疗癌症的组合物包含：存活蛋白特异性生物活性肽核酸，其具有SEQ ID NO:1至18中任一个的序列；和与其互补的载体肽核酸。载体肽核酸可以优选地具有选自SEQ ID NO:19至40的任何一个序列，并且该序列的一部分可以被通用碱基取代。
另外，根据本发明的用于治疗癌症的组合物包含：由SEQ ID NO:41表示的VEGF特异性生物活性肽核酸或由SEQ ID NO:49表示的PD-L1特异性生物活性肽核酸；和与其互补的载体肽核酸。载体肽核酸可以优选地具有SEQ ID NO:42、43(VEGF)或50(PD-L1)的序列，并且该序列的一部分可以被通用碱基取代。
在仍另一个方面，本发明涉及用于治疗年龄相关性黄斑变性的组合物，其包含根据本发明的核酸复合物。用于治疗年龄相关性黄斑变性的核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因可以是VEGF，但不限于此。
优选地，根据本发明的用于治疗年龄相关性黄斑变性的组合物包含：由SEQ IDNO:41表示的VEGF特异性生物活性肽核酸；和与其互补的载体肽核酸。载体肽核酸可以优选地具有SEQ ID NO:42或43的序列，并且该序列的一部分可以被通用碱基取代。
在仍另一个方面，本发明涉及用于预防或治疗皮肤病的组合物，其包含根据本发明的核酸复合物。皮肤病的例子包括但不限于银屑病、色素沉着相关皮肤病和特应性疾病。核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因可以是选自IFI16、TLR6和TIEG1中的任何一种或多种，但不限于此。
优选地，本发明涉及用于治疗银屑病的组合物。根据本发明的用于治疗银屑病的组合物包含：IFI16特异性生物活性肽核酸，其具有SEQ ID NO:44至47中任一个的序列；和与其互补的载体肽核酸。载体肽核酸可以优选地具有SEQ ID NO:48的序列，并且该序列的一部分可以被通用碱基取代。
用于预防或治疗皮肤病的组合物可以制备成诸如水溶液、乳膏、凝胶、糊剂、洗剂和软膏等制剂，但不限于此。
在又另一个方面，本发明涉及用于治疗炎性疾病的组合物，其包含根据本发明的核酸复合物。用于治疗炎性疾病的核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因可以是选自PDE4B和Pellino-1中的任何一种或多种，但不限于此。
在又另一个方面，本发明涉及用于治疗罕见疾病和严重疾病的组合物，其包含根据本发明的核酸复合物。用于治疗罕见疾病和严重疾病的核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因可以是选自SMN2、ApoB-100、ICAM-1、ApoCIII、TTR、HTT、GHr、SOD1、ANGPTL3、PKK、miR-21、TMPRSS6、FMR1和连接蛋白26中的任何一种或多种，但不限于此。
优选地，根据本发明的罕见疾病和严重疾病是耳聋，并且核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因可以是连接蛋白26。
本发明的复合物可以通过载体(如脂质体)给予(或施用)。脂质体可以帮助将复合物靶向特定组织(如淋巴组织)，或者特异性地将复合物靶向感染细胞，并且还可以帮助增加包含复合物的组合物的半衰期。脂质体的例子包括乳液、泡沫、胶团、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、层状层等。在这些制剂中，待递送的复合物作为脂质体的一部分掺入，单独地或和与例如淋巴细胞中普遍存在的受体结合的分子(如与CD45抗原结合的单克隆抗体)或和其他治疗组合物结合。因此，用本发明的所需复合物填充或装饰的脂质体可以被导向淋巴细胞的位点。
用于本发明的脂质体由标准的形成囊泡的脂质形成，所述脂质通常包括中性和带负电荷的磷脂和甾醇(如胆固醇)。通常通过考虑例如脂质体大小、酸不稳定性和血液中脂质体的稳定性来指导脂质的选择。有多种方法可用于制备脂质体。例如，可以使用文献中披露的方法[Szoka等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467,1980，以及美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369]。
在一个实施方案中，本发明提供了通过向受试者给予(或施用)复合物或包含复合物的组合物来治疗和抑制(或缓解)疾病的方法。
可以使用本发明的复合物治疗的疾病根据所用生物活性核酸的特征来决定，并且没有特别限制。
可以使用本发明的复合物治疗的疾病的例子包括癌症、异常的血管生长相关疾病(如黄斑变性)、皮肤病、炎性疾病、自身免疫疾病等，但不限于此。
包含根据本发明的复合物的组合物可以按药学有效量给予(或施用)，以便治疗癌症疾病或抑制(或缓解)癌症症状。本发明的药物组合物的剂量/施用量可以根据多种因素而变化，如色素沉着相关皮肤病的种类、患者的年龄、体重、症状的特征和程度、当前治疗方法的种类、治疗频率、给予(施用)形式和途径等，并且可以由相关领域的普通技术人员容易地确定。本发明的组合物可以与药理学或生理学成分一起给予(施用)，或者顺序给予(施用)。另外，本发明的组合物还可以与常规的其他治疗剂组合给予(施用)，以及与常规治疗剂依次或同时给予(施用)。给予(施用)可以是单剂量给予(施用)或多剂量给予(施用)。
如本文所用，术语“受试者”是指患有可以通过给予(施用)本发明的复合物缓解、抑制或治疗的病症或疾病或者有患上此病症或疾病的风险的哺乳动物。优选地，它指的是人。
另外，本发明化合物对人体的剂量(施用量)可以根据患者的年龄、体重、性别、给予(施用)形式、健康状况和疾病严重程度而变化。基于体重70kg的成年患者，其通常为0.001至1,000mg/天、优选0.01至500mg/天。根据医生或药剂师的判断，可以每天一次或多次以预定的时间间隔给予(施用)。
对于本文所述方法中使用的任何化合物或包含其的混合物，最初可以从细胞培养测定估计治疗有效量或剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量以实现包括如在细胞培养中测定的IC50(半数最大抑制浓度)或EC50(半数最大有效浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可以用于更准确地确定人中的有用剂量。
本文所述的复合物或包含其的混合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中有治疗效果的剂量)。治疗作用与毒性作用之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为比率ED50(或IC50)/LD50。表现出大治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养测定获得的数据可以用于配制用于人的一系列剂量。这些化合物的剂量优选地在包括ED50(或IC50)而几乎没有或没有毒性的一系列循环浓度内。
在又另一个方面，本发明涉及用于诊断癌症或肿瘤的试剂盒，其包含本发明的复合物。
在本发明中，用于诊断癌症或肿瘤的样品可以源自哺乳动物(包括人)的特定组织或器官。组织的代表性例子包括结缔组织、肌肉或神经组织。器官的代表性例子包括眼、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、小肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统以及腺体和内部血管。
样品包括源自生物来源的任何细胞、组织或流体，或者可以通过本发明很好地分析的任何其他介质。样品还包括从供人和/或动物食用的食物中获得的样品。此外，待分析的样品包括体液样品，其包括但不限于血液、血清、血浆、淋巴、母乳、尿液、粪便、眼液、唾液、精液、脑提取物(例如，研磨脑)、脊髓液、阑尾、脾和扁桃体组织提取物。
本发明的试剂盒可以任选地包括进行靶核酸扩增反应(例如，PCR反应)所需的试剂，如缓冲液、DNA聚合酶辅因子和脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸。任选地，试剂盒还可以包括抑制多种多核苷酸分子的活性的抗体、逆转录酶、缓冲液和试剂以及DNA聚合酶。另外，在试剂盒中，已经获得了本文所述的公开文本的本领域技术人员可以容易地确定在特定反应中使用的最佳试剂量。通常，本发明的试剂盒可以制成含有上述成分的单独包装或隔室。
在本发明的一个实施例中，分析了通过结合形成的核酸复合物的粒径。结果，如图1所示，证实了与单链核酸相比，核酸复合物的粒径减小到几十nm(参见实施例2)。
在本发明的另一个实施例中，分析了核酸复合物的细胞渗透性。结果，如图2a和2b所示，证实了细胞内Cy3荧光(标记)由于细胞内引入带电荷的核酸复合物而最高，并且其中未带电荷的生物活性肽核酸和载体肽核酸不形成双链体的复合物显示出低的细胞内渗透性(参见实施例3)。
在本发明的仍另一个实施例中，分析了核酸复合物对肿瘤细胞系中靶基因表达的抑制效率。结果，如图3a至3c所示，对靶蛋白及其下游蛋白质的表达模式的分析指示，用核酸复合物处理的测试组中存活蛋白及其下游蛋白质的表达受到抑制(参见实施例4)。
在本发明的又另一个实施例中，证实了通过控制核酸复合物的结合亲和力来控制靶基因存活蛋白的表达的时间点，并且使用包含存活蛋白和VEGF特异性生物活性核酸的核酸复合物在肿瘤细胞系中进行的实验指示核酸复合物表现出抗癌活性(参见实施例5至8)。
在本发明的仍另一个实施例中，证实了复合物结构的使用可以抑制细菌和真菌的生长(参见实施例12)。
根据本发明的载体肽核酸(即，经修饰载体肽核酸)克服了由常规未经修饰的裸PNA的自聚集特性引起的沉淀问题，并且可以增加细胞渗透性、溶解度和细胞内扩散效果。
因此，在仍另一个方面，本发明涉及使用复合物调节靶基因表达的方法，该方法包括以下步骤：(a)通过使生物活性核酸与载体肽核酸结合来形成复合物；并且(b)通过使复合物与靶细胞接触将复合物引入靶细胞中。
在本发明中，靶细胞可以是上述癌细胞或肿瘤细胞，但不限于此。在本发明中，在步骤(b)中将复合物引入细胞中并移动之后，生物活性核酸可以与具有与其互补的核苷酸序列的靶核酸结合，并且可以与载体肽核酸分离，并且生物活性核酸可以与靶基因结合并调节靶基因的表达。
根据本发明，复合物的生物活性核酸和载体肽核酸在不存在靶核酸(靶序列)的情况下保持其间的互补结合，而在存在与生物活性核酸的核苷酸序列互补的靶核酸的情况下，生物活性核酸与载体肽核酸分离并通过“生物活性核酸与靶序列的链置换”和“靶特异性释放和结合”而与靶核酸结合。可以根据载体肽核酸的核苷酸序列与靶序列的核苷酸序列之间的互补性，通过控制生物活性核酸的核碱基之间的氢键合强度来控制释放和结合的时间。
因此，根据本发明的一个优选实施方案，靶特异性释放和结合可以通过以下方式实现：i)构建“单核苷酸多态性(SNP)”或“比生物活性核酸短的序列”作为具有部分特异性序列的载体肽核酸结构；ii)用通用碱基替换一部分载体肽核酸序列；iii)用接头替换一部分载体肽核酸序列；或vi)提供这样的载体肽核酸结构，其与生物活性核酸平行结合，使得载体肽核酸与生物活性核酸之间的结合亲和力低于靶核酸与生物活性核酸之间的结合亲和力。这些方法能以两种或更多种的组合使用，并且优选使用平行结合方法。
可以用于本发明的通用碱基可以是选自天然碱基(包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶)、以及肌苷PNA、吲哚PNA、硝基吲哚PNA和脱碱基中的一种或多种，所述脱碱基是没有选择性地结合并且具有比互补结合亲和力低的结合亲和力的碱基。优选地，肌苷PNA可以用作通用碱基。
优点在于，生物活性核酸与载体肽核酸之间的分离时间以及生物活性核酸与生物活性核酸的靶基因之间的结合时间可以通过控制生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合亲和力来控制。
实施例
在下文中，将参考实施例进一步详细描述本发明。对本领域普通技术人员应显而易见的是，这些实施例仅用于说明目的而不应被解释为限制或改变本发明的范围。
实施例1：生物活性核酸和载体肽核酸以及使用它们生产复合物
为了验证根据本发明的由结构式(1)表示的核酸复合物的功效，使用存活蛋白作为靶基因。存活蛋白是一种在大多数肿瘤性肿瘤或转基因细胞系中通常表达，迄今为止进行过测试且预计将成为抗癌疗法的重要靶标的蛋白质(存活蛋白：一种抗癌疗法的新靶标，Cancer Treat Rev.35(7):553-62,2009)。
为了抑制存活蛋白，使用反义PNA和RNA作为针对存活蛋白的生物活性核酸。
根据本发明的针对存活蛋白的反义PNA和RNA具有SEQ ID NO:1至18中所示的序列。本实施例中使用的基于肽核酸的生物活性核酸在3'末端用Cy3标记以供成像，并且核苷酸序列、单体修饰及其结构示于下表2中。
使用PANAGENE(韩国)的HPLC纯化方法合成本发明中使用的所有肽核酸。
本发明中用于将存活蛋白基因靶向生物活性核酸递送到细胞中的载体肽核酸具有SEQ ID NO:19至40中所示的序列。本实施例中使用的载体肽核酸的核苷酸序列、单体修饰和结构示于下表2中。
为了分析复合物的粒径、细胞渗透性和靶基因表达抑制效率，使用下表2中所示的生物活性核酸和载体肽核酸的组合来生产复合物。
表2：用于抑制存活蛋白活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
对于单体修饰，构建了使用赖氨酸(Lys，K；由(+)指示)修饰为带正电荷的肽核酸骨架和使用谷氨酸(Glu，E；由(-)指示)修饰为带负电荷的肽骨架。
每种生物活性核酸和每种载体肽核酸在DMSO中彼此杂交，并且结果，合成了各自包含生物活性核酸和载体肽核酸的复合物。
实施例2：生物活性核酸与载体肽核酸的结合和具有各种电特性的复合物的粒径分析
分析了制备成具有上文实施例1中表2所示结构的每种生物活性肽核酸/载体肽核酸复合物的粒径。
实施例2-1：场发射扫描电子显微术(FE-SEM)分析
通过场发射扫描电子显微术分析实施例1中产生的复合物的粒径。对于发射扫描电子显微术，将通过使250nM每种载体肽核酸与250nM每种生物活性核酸杂交产生的3μl每种复合物滴到硅片上，并且然后在-70℃下冷冻1小时，随后冷冻干燥20分钟。将经干燥复合物在锇上涂覆10分钟，并且然后通过场发射扫描电子显微术在5kV至10kV下进行分析。
实施例2-2：具有各种电特性的复合物结构的场发射扫描电子显微术(FE-SEM)分析
根据实施例1的方法生产具有各种电特性的复合物，并且根据实施例2-1的方法分析其粒径。
结果，如图1所示，证实了通过平行结合具有不同电特性的生物活性核酸和载体肽核酸产生的复合物的粒径小于单链生物活性核酸的粒径。此外，如图2a和2b所示，分析了以下PNA双链体(复合物)的粒径：由生物活性肽核酸(SEQ ID NO:6)和载体肽核酸(SEQ IDNO:32)组成的PNA双链体1；由生物活性肽核酸(SEQ ID NO:5)和具有三个正电荷的载体肽核酸(SEQ ID NO:32)组成的PNA双链体2；由生物活性肽核酸(SEQ ID NO:1)和载体肽核酸(SEQ ID NO:37)组成的PNA双链体3；以及由不带电荷生物活性肽核酸(SEQ ID NO:1)和载体肽核酸(SEQ ID NO:23)组成的PNA双链体4。随着载体肽核酸的正电荷数目从2增加到3，粒径减小，但是当正电荷数目超过5时，粒径增加。另外，关于决定粒径的其他因素，证实了复合物的粒径根据载体肽核酸和生物活性肽核酸的适当电特性随复合物的生物活性肽核酸的电荷而变化。
实施例3：根据载体肽核酸的特征分析细胞渗透性
分析了制备成具有上文实施例1中表2所示结构的每种生物活性核酸/载体肽核酸复合物的细胞渗透性。
实施例3-1：细胞培养
将从ATCC(美国典型培养物保藏中心，美国)获得的人子宫癌细胞(HeLa)在含有10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(杜尔贝科改良伊格培养基，Welgene，韩国)中在5％(v/v)CO2下在37℃下进行培养。
实施例3-2：包含生物活性核酸和载体肽核酸的复合物的细胞内引入
将在实施例3-1中培养的HeLa细胞(5x103个细胞/孔)在相同的培养条件下在8孔板中培养24小时，并且然后用500nM通过使生物活性肽核酸与载体肽核酸结合在实施例1中的制备的复合物进行处理。将经处理细胞在5％(v/v)CO2下在37℃下孵育24、48、72和96小时，并且然后测量复合物的细胞内引入。
实施例3-3：包含生物活性核酸和载体肽核酸的复合物的细胞内渗透性分析
通过共聚焦显微术观察细胞内引入包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的程度。将细胞核用DAPI染色，并且将生物活性肽核酸用Cy3标记，以便确认它是否会被引入细胞中。
实施例3-4：生物活性核酸和载体肽核酸的复合物在靶基因的存在下在细胞中是否分离的分析
为了检查生物活性肽核酸和载体肽核酸是否被引入细胞中，与靶基因相遇并彼此分离，通过共聚焦显微术观察用Cy3标记的生物活性核酸的信号是否会与用Alexa488标记的载体肽核酸的信号重叠。
实施例3-5：使用载体肽核酸的单一反义siRNA的细胞内渗透性的分析
通过共聚焦显微术分析细胞内引入包含与载体肽核酸结合的生物活性单一反义siRNA的复合物的程度。将细胞核用DAPI染色，并且将生物活性单一反义siRNA用Cy3标记，以便确认它是否会被引入细胞中。
结果，如图3a至3c所示，证实了由于细胞内引入由带电荷的生物活性肽核酸(SEQID NO:14)和载体肽核酸(SEQ ID NO:32)组成的复合物细胞内Cy3荧光最高，并且当生物活性肽核酸和载体肽核酸不形成双链体或复合物没有电荷时，由生物活性肽核酸(SEQ IDNO:1)和载体肽核酸(SEQ ID NO:19)组成的复合物的细胞内渗透性低。另外，可以看出复合物的细胞内渗透性根据其电特性和复合物的类型而变化。如在图4中可以看到的那样，证实了由显示出生物稳定性的生物活性肽核酸(SEQ ID NO:14)和载体肽核酸(SEQ ID NO:32)组成的复合物显示出高细胞内渗透性并且也存在于细胞中持续很长一段时间。如图5a至5f所示，观察到由具有相同电荷的生物活性核酸(SEQ ID NO:14)和载体肽核酸(SEQ ID NO:39)组成的复合物在细胞内引入之后以结合状态存在，并且然后在48小时后分离。如图6a至6g所示，观察到具有与表2中所示的生物活性核酸相同序列的单一siRNA本身不会渗透细胞，但是由载体肽核酸(SEQ ID NO:39)和单一siRNA组成的复合物以高效率渗透细胞。
实施例4：包含生物活性核酸和载体肽核酸的复合物对靶基因在肿瘤细胞系中的表达的抑制
使用制备成具有上文实施例1中表2所示结构的每种生物活性肽核酸/载体肽核酸复合物，分析复合物对肿瘤细胞系中靶基因表达的抑制效率。
实施例4-1：细胞培养
将从ATCC购买的人结肠直肠癌细胞(SW480)和人乳腺癌细胞(SK-BR-3)在含有10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基(RoswellPark Memorial Institute，Welgene，韩国)中在5％(v/v)CO2下在37℃下进行培养。
实施例4-2：包含生物活性核酸和载体肽核酸的复合物的细胞培养和细胞内引入
人癌细胞的培养条件和用包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物处理细胞的方法如实施例3中所述。然而，将1x105个细胞/孔在6孔板中培养并用复合物处理，并且然后孵育72和96小时，之后检查靶基因的表达的抑制。
实施例4-3：通过蛋白质印迹测定分析基因表达
从在实施例4-2中描述的条件下处理的每种细胞系中，提取总蛋白质并通过BCA(双金鸡宁酸测定)进行定量。在SDS-PAGE凝胶上按大小分离蛋白质，并且将凝胶上分离的蛋白质转移到膜上。将膜与作为第一抗体的抗存活蛋白抗体(Cell Signaling，美国)和抗细胞周期蛋白D1(SantaCruz，美国)兔抗体一起孵育，并且与作为第二抗体的抗兔抗体(SantaCruz，美国)一起孵育。接下来，用ECL(增强化学发光，Amersham，美国)溶液处理膜。在完成抗体处理和洗涤程序后，在LAS下分析膜上存活蛋白及其下游基因细胞周期蛋白D1的蛋白质表达模式。
结果，如图7所示，PNA 1和PNA 2是具有与表2中所示相同的序列但具有不同电特性的生物活性肽核酸和具有相同电特性的载体肽核酸的复合物。具体地，PNA 1是由生物活性肽核酸(SEQ ID NO:3)和载体肽核酸(SEQ ID NO:32)组成的复合物，并且PNA 2是由生物活性肽核酸(SEQ ID NO:6)和载体肽核酸(SEQ ID NO:32)组成的复合物。证实了具有不同电特性的复合物在表达模式分析中抑制存活蛋白及其下游蛋白质的表达，即使基因表达的抑制时间确实根据复合物的电特性而不同。
实施例5：通过控制包含生物活性核酸和载体肽核酸的复合物抑制肿瘤细胞系中的靶基因表达
使用制备成具有上文实施例1中表2所示结构的具有各种电特性的生物活性肽核酸/载体肽核酸复合物的控制，分析每种复合物对肿瘤细胞系中靶基因表达的抑制效率。
实施例5-1：包含生物活性核酸和载体肽核酸的复合物的细胞培养和细胞内引入
SW480和SK-BR-3细胞的培养条件和用包含与载体肽核酸结合的生物活性肽核酸的复合物处理细胞的方法如实施例2中所述。然而，将1x105个细胞/孔在6孔板中培养并用复合物处理，并且然后孵育24、48、72和96小时，之后检查靶基因的表达的抑制。
实施例5-2：通过蛋白质印迹测定分析基因表达
在实施例4-1的条件下进行实验，并且分析通过控制包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物抑制肿瘤细胞系中靶基因表达的效率。
结果，如图8所示，使用具有与上表2中所示相同序列的生物活性肽核酸和载体肽核酸，但是所用的复合物由相同的带正电荷的载体肽核酸和每种具有各种电特性的不同生物活性肽核酸组成。在图8中，A表示包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:1)的复合物；B表示包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO:2)的复合物；并且C和D表示包含生物活性肽核酸(SEQ IDNO:12)的复合物。分析了这些复合物对存活蛋白及其下游蛋白质的表达模式。证实了存活蛋白及其下游蛋白质的表达抑制时间根据具有不同电特性的生物活性肽核酸/载体肽核酸复合物的结构而改变。
实施例6：使用具有各种长度的生物活性肽核酸/载体肽核酸复合物分析肿瘤细胞系中的细胞活力
使用制备成具有上文实施例1中表2所示结构的具有相同电特性和不同长度的多种生物活性肽核酸/载体肽核酸复合物，分析了肿瘤细胞系中细胞活力的抑制效率。
实施例6-1：包含生物活性核酸和载体肽核酸的复合物的细胞培养和细胞内引入
SW480细胞系的培养条件和用包含与载体肽核酸结合的生物活性肽核酸的复合物处理细胞的方法如上文实施例2中所述。然而，将6x 103个细胞/孔在96孔板中培养并用复合物处理，并且然后孵育24、48、72和96小时，之后分析每个孵育时间后的细胞活力。
实施例6-2：通过MTT测定分析肿瘤细胞系中的细胞活力
将在实施例6-1的条件下处理的细胞系用5mg/mL MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)的1X PBS溶液处理，并且将20μL细胞溶液加入到各孔中并孵育4小时，并且然后通过分光光度计测量OD(光密度)并进行分析。
结果，如图9a和9b所示，证实了细胞活力根据包含与每种载体肽核酸(SEQ ID NO:23至36)结合的每种生物活性肽核酸(SEQ ID NO:6至11)的复合物的长度而变化。
实施例7：评估包含存活蛋白基因靶向生物活性肽核酸和载体肽核酸的候选复合物的抗癌功效
使用制备成具有上文实施例1中表2所示结构的各自包含存活蛋白基因靶向生物活性肽和载体肽核酸的候选复合物，分析了通过抑制移植有肿瘤细胞的动物模型中的靶基因表达对肿瘤的抑制。
实施例7-1：包含生物活性核酸和载体肽核酸的复合物的细胞培养和细胞内引入
SW480细胞系的培养条件、用包含与载体肽核酸结合的生物活性肽核酸的复合物处理细胞的方法和实验内容如上文实施例4和5中所述。
实施例7-2：通过MTT测定分析肿瘤细胞系中的细胞活力
将在实施例6-1的条件下处理的细胞系用5mg/mL MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)的1X PBS溶液处理，并且将20μL细胞溶液加入到各孔中并孵育4小时，并且然后通过分光光度计测量OD(光密度)并进行分析。
实施例7-3：通过蛋白质印迹测定分析基因表达
在实施例4-3的实验条件下分析在实施例4-1的条件下处理的细胞系的蛋白质表达模式。
实施例7-4：通过尾静脉给予包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的候选复合物在移植有人结肠直肠癌细胞系(SW480)的小鼠中的抗癌效力的评估
为了评估抗癌功效，培养人结肠直肠癌细胞(SW480)并调节至3×107个细胞/ml的细胞浓度。将0.3ml(9×106个细胞/小鼠)的细胞培养物皮下注射到每只无特定病原体(SPF)BALB/C雌性裸鼠(Nara Biotech Co，韩国)的右侧肩胛骨部分与胸壁之间的腋窝区域。将各自包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的候选复合物样品1、2和3(1和2mg/kg)以及阴性对照(1和2mg/kg)中的每一种以0.1ml的量给予到每只小鼠的尾静脉中，每周两次(第0天、第3天、第7天、第10天、第14天和第17天)。对于所有动物，在注射开始时和在测试期期间给予前立即测量一般状况和体重。在癌细胞移植后，使用游标卡尺测量每只动物的每个肿瘤的三个方向(长×宽×高)，总共9次直至从每组的平均肿瘤体积达到44.1mm3的时间点开始第18天，并且然后使用等式“长×宽×高/2”计算肿瘤体积。在药物给予开始后18天，通过肝素管从眶静脉收集血液并以5000rpm离心5分钟，分离上清液血浆并分配到小瓶中并储存在-70℃下。接下来，用CO2气体使小鼠安乐死，并且然后分离肿瘤并在化学天秤上称重，并且对肿瘤组织成像。
实施例7-5：来自移植有人结肠直肠癌细胞(SW480)的小鼠的血液中的肝毒性标记分析
从收集自用于抗癌功效评估的小鼠的血液中分离血浆，并且在丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(Biovision，美国)的测定溶液中以合适的比率稀释，并且将20μL稀释液加入到每个孔中。另外，还制备了有助于定量血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)量的标准材料，并且将其加入到每个孔中。接下来，根据测定试剂盒中提供的方法制备反应溶液(包含酶/染料剂混合物的测定溶液)，并且将100μL反应溶液加入到每个孔中并充分摇动。接下来，通过分光光度计测量570nm处的OD。
结果，如图10a和10b所示中，证实了使用包含存活蛋白基因靶向生物活性肽核酸和载体肽核酸的候选复合物抑制人结肠直肠癌细胞中的细胞活力并且还抑制靶基因存活蛋白及其下游蛋白质的表达。如图11a至11e所示，在通过尾静脉给予的动物实验中，在移植有人结肠直肠癌细胞的小鼠中，与阴性对照组不同，在从给予后一天到最后一天的测试期期间，在所有样品给予组中未观察到异常的一般状况和统计学上显著的体重减轻。另外，在最后一天(第18天)观察肿瘤体积，与给予1mg/kg阴性对照的组相比，给予1mg/kg样品1、2和3的组分别显示出18.9％(p<0.01)、8.2％和8.9％的肿瘤生长抑制率，并且与给予2mg/kg阴性对照的组相比，给予2mg/kg样品1、2和3的组分别显示出40.1％(p<0.001)、28.0％(p<0.001)和31.7％(p<0.001)的肿瘤生长抑制率。在最后一天的肿瘤重量的情况下，测量在药物给予开始后18天分离的SW480肿瘤的重量，并且结果，可以看出与给予1mg/kg阴性对照的组相比，给予1mg/kg样品1、2和3的组分别显示出18.9％(p<0.01)、8.9％和8.5％的肿瘤重量减少，并且与给予2mg/kg阴性对照的组相比，给予2mg/kg样品1、2和3的组分别显示出40.7％(p<0.001)、28.9％(p<0.001)和32.7％(p<0.001)的肿瘤重量减少。最后，收集用于抗癌功效评估的小鼠的血液，并且分析肝毒性标记在血液中的存在或不存在。结果，在给予样品的所有组中均未检测到特异性肝毒性标记。
实施例8：新颖复合物通过抑制人乳腺癌细胞和肺癌细胞中的血管内皮生长因子的抗癌药理作用的评估
已知在许多种类的癌细胞中显示出高度表达的血管内皮生长因子VEGF在癌细胞中诱导血管生长，评估了新颖复合物通过VEGF抑制的抗癌药理作用。
实施例8-1：细胞培养
将从ATCC(美国典型培养物保藏中心，美国)获得的人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和人肺癌细胞(A549)在含有10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(杜尔贝科改良伊格培养基，Welgene，韩国)中在5％(v/v)CO2下在37℃下进行培养。
实施例8-2：包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的细胞培养和细胞内引入
为了产生用于抑制血管内皮生长因子的新颖复合物，构建了具有与VEGF mRNA(血管生长所必需的基因)互补的序列(SEQ ID NO:41)的生物活性肽核酸，并且构建了与生物活性肽核酸互补的载体肽核酸(SEQ ID NO:42和43)。使生物活性肽核酸与相同量的每种载体肽核酸杂交，从而产生复合物(参见表3)。用包含与载体肽核酸结合的生物活性肽核酸的复合物处理细胞的方法如实施例2中所述。
表3：用于抑制VEGF活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
实施例8-3：人乳腺癌细胞和肺癌细胞中细胞活力的分析
为了分析新颖复合物抑制血管内皮生长因子的程度，将实施例8-1中培养的细胞以6x103个细胞/孔的细胞密度加入到96孔板的每个孔中，用复合物处理,并且然后孵育24、48、72和96小时，之后在实施例6-2的实验条件下分析每个孵育时间后的细胞活力。
实施例8-4：通过蛋白质印迹测定分析基因表达
为了分析新颖复合物抑制血管内皮生长因子的程度，将实施例7-1中培养的细胞以1x105个细胞/孔的细胞密度加入到6孔板的每个孔中，用复合物处理，并且然后孵育24、48、72和96小时。接下来，在实施例4-3的实验条件下，使用抗VEGF抗体(SantaCruz，美国)和抗p-Akt1(Cell signaling，美国)分析蛋白质表达。
实施例8-5：通过流式细胞术(FACS)分析细胞凋亡
为了分析新颖复合物是否通过抑制血管内皮生长因子诱导细胞凋亡，将实施例7-1中培养的细胞以1x105个细胞/孔的细胞密度加入到6孔板的每个孔中并培养72小时。然后，收获细胞并溶解于500μL的FITC膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒(BD，美国)的膜联蛋白V结合缓冲液中，并且然后用5μL每种FITC膜联蛋白V和碘化丙锭染色溶液处理。接下来，将细胞溶液转移到流式细胞术管中，并且然后通过FACS Canto II(BD，美国)进行分析。
实施例8-6：使用斑马鱼评估抗癌功效
使用在孵育箱中孵育2天获得的斑马鱼卵，将实施例8-1中培养的人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)用CellTraceTM CFSE(Thermoscientific，美国)染色30分钟并进行收集。然后，通过显微注射将每条斑马鱼的150个染色的人乳腺癌细胞注射到斑马鱼幼鱼中。将注射有人乳腺癌细胞的斑马鱼分配到含有复合物水溶液的96孔位置中，并且然后在孵育箱中孵育4天。孵育4天后，用0.04％三卡因麻醉斑马鱼，并且然后用荧光显微镜(OLYMPUS，日本)进行分析。
结果，如图12a至12c所示，证实了新颖复合物通过抑制人乳腺癌细胞和肺癌细胞中的血管内皮生长因子来抑制细胞活力，并且还抑制血管内皮生长因子VEGF及其下游基因p-Akt1的蛋白质表达。另外，为了检查是否通过抑制血管内皮生长因子诱导细胞凋亡，进行了流式细胞术。结果，证实了包含生物活性肽核酸和具有不同长度和电荷特性的每种载体肽核酸的复合物分别显示出3.2％和2％的细胞凋亡率。最后，为用作评估抗癌功效的动物模型的斑马鱼移植人乳腺癌细胞，并且然后进行分析。结果，如图13所示，可以看出复合物表现出抑制移植的乳腺癌细胞生长的作用。
实施例9：新颖复合物对人视网膜色素上皮细胞中血管内皮生长因子的抑制的检查
使用针对已知引起年龄相关性黄斑变性的黄斑中的血管内皮生长因子VEGF的新颖复合物，用复合物处理人视网膜色素上皮细胞，并且检查复合物是否会抑制血管形成。
实施例9-1：细胞培养
将从ATCC(美国典型培养物保藏中心，美国)获得的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)在含有10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(杜尔贝科改良伊格培养基/营养素混合物F-12，gibco，韩国)中在5％(v/v)CO2下在37℃下进行培养。
实施例9-2：包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的细胞培养和细胞内引入
以与实施例7-2中相同的方式使用用于抑制血管内皮生长因子的新颖复合物，并且用新颖复合物处理细胞的方法如实施例2中所述。
实施例9-3：人视网膜色素上皮细胞中细胞活力的分析
为了分析新颖复合物抑制血管内皮生长因子的程度，将实施例9-1中培养的细胞以6x103个细胞/孔的细胞密度加入到96孔板的每个孔中，用复合物处理,并且然后孵育24、48、72、96和120小时，之后在实施例6-2的实验条件下分析每个孵育时间后的细胞活力。
实施例9-4：通过蛋白质印迹测定分析基因表达
为了分析新颖复合物抑制血管内皮生长因子的程度，将实施例9-1中培养的细胞以1x105个细胞/孔的细胞密度加入到6孔板的每个孔中，用复合物处理，并且然后孵育24、48、72、96和120小时。接下来，在实施例4-3的实验条件下，使用抗VEGF抗体(SantaCruz，美国)、抗p-Akt1(Cell signaling，美国)和抗p-ERK-1(Cell signaling，美国)分析蛋白质表达。
结果，如图14a和14b所示，证实了用新颖复合物处理抑制人视网膜色素上皮细胞中的细胞活力，并且还抑制VEGF及其下游基因p-Akt-1和p-ERK-1的蛋白质表达。
实施例10：新颖复合物针对银屑病的抗炎药理作用的检查
为了验证新颖复合物对皮肤病银屑病的作用，检查了新颖复合物是否通过抑制靶基因IFI16(干扰素γ诱导蛋白16)表现出抗炎作用。
实施例10-1：细胞培养
将从CLS(Cell Line Service，德国)获得的人表皮角质形成细胞(HaCaT)在含有10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(杜尔贝科改良伊格培养基，Welgene，韩国)中在5％(v/v)CO2下在37℃下进行培养。
实施例10-2：包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的细胞培养和细胞内引入
为了产生用于抑制IFI16的新颖复合物，构建了与IFI16mRNA互补的生物活性肽核酸(SEQ ID NO:44至47)，并且构建了与生物活性肽核酸互补的载体肽核酸(SEQ ID NO:48)。使每种生物活性肽核酸与相同量的载体肽核酸杂交，从而构建复合物(参见表4)。用包含与载体肽核酸结合的生物活性肽核酸的复合物处理细胞的方法如上文实施例2中所述。
表4：用于抑制IFI16活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
实施例10-3：人表皮角质形成细胞中细胞活力的分析
为了分析IFI16的抑制程度，将实施例10-1中培养的细胞在96孔板中以6x103个细胞/孔的密度培养24小时，并且用包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物处理。然后，为了诱导炎性反应，用20ng/mL的IL-17A处理人表皮角质形成细胞并孵育72、96和120小时。接下来，在实施例6-2的实验条件下分析细胞活力。
实施例10-4：通过蛋白质印迹测定分析基因表达
为了分析新颖复合物抑制IFI16的程度，将实施例10-1中培养的细胞以1x105个细胞/孔的细胞密度加入到6孔板的每个孔中，用复合物处理，并且然后孵育72、96、120和144小时。接下来，在实施例4-3的实验条件下，使用抗IFI16抗体(Cell Signaling，美国)和抗p-NF-kB(Cell signaling，美国)分析蛋白质表达。
实施例10-5：通过咪喹莫特诱导Balb/C小鼠银屑病模型和包含生物活性核酸和载体肽核酸的复合物对咪喹莫特银屑病模型的表型改变的分析
每天向6周龄Balb/C雄性小鼠的右耳施用20mg咪喹莫特持续12天以诱导银屑病。对于银屑病诱导的小鼠模型，以2天的间隔施用液体或乳膏形式的新颖复合物持续12天(总共6次)。通过千分尺测量右耳的厚度，并且分析初始银屑病诱导前的右耳厚度以及用新颖复合物处理的组与对照组之间的耳厚度差异。
实施例10-6：新颖复合物对患有咪喹莫特诱导的银屑病的Balb/C小鼠模型中基因表达的抑制
在与实施例10-5中所述相同的条件下施用新颖复合物，并且然后对小鼠右耳进行活检。从活检组织中提取总蛋白质并通过BCA(双金鸡宁酸测定)定量，并且根据实施例10-4的方法分析蛋白质表达。
实施例10-7：在患有咪喹莫特诱导的银屑病的Balb/C小鼠模型中包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物对组织角质形成细胞的异常生长的抑制
在与实施例10-5中所述相同的条件下施用新颖复合物，并且然后对小鼠右耳进行活检，在4％多聚甲醛溶液中固定并包埋在石蜡中。用切片机切片石蜡块并脱石蜡。将经脱石蜡组织固定在载玻片上并用苏木精-伊红染色。
结果，如图15a和15b所示，证实了用靶向靶基因IFI16的新颖复合物处理人表皮角质形成细胞降低了细胞活力，并且还抑制了靶基因IFI16及其下游基因p-NF-kB的蛋白质表达。另外，进行动物实验以证实新颖复合物针对银屑病的抗炎作用。结果，如图16所示，使用咪喹莫特诱导的银屑病的阳性对照组中小鼠右耳的厚度大于没有银屑病的阴性对照组中的小鼠右耳的厚度，并且用靶向IFI16的新颖复合物处理的组中的耳厚度降低至与阴性对照组中的耳厚度类似的水平。另外，在动物实验中活检的组织用于检查靶基因的表达是否受抑制。结果，证实了与其中IFI16表达增加的阳性对照组不同，用新颖复合物处理的组中IFI16的表达降低。最后，用H&E染色小鼠活检组织，并且结果，证实了与阴性对照组相比，阳性对照组中表皮角质形成细胞的增殖增加，并且在给予新颖复合物的组中表皮角质形成细胞的增殖减少。
实施例11：新颖复合物在人乳腺癌细胞中的免疫抗癌作用的检查
已知在许多种类的癌细胞的表面上表达的PD-L1基因通过与T细胞的PD-1结合而不会被免疫细胞杀死，并且继续诱导癌细胞的增殖。因此，检查了在显示出PD-L1的高表达的人乳腺癌细胞中靶向PD-L1的新颖复合物是否通过抑制PD-L1而表现出免疫抗癌作用。
实施例11-1：细胞培养
以与实施例8-1中所述相同的方式培养细胞。
实施例11-2：包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的细胞培养和细胞内引入
为了产生用于抑制PD-L1的新颖复合物，构建了具有与在癌细胞表面上表达的PD-L1mRNA互补的序列(SEQ ID NO:49)的生物活性肽核酸，并且构建了与生物活性肽核酸互补的载体肽核酸(SEQ ID NO:50)。然后，使载体肽核酸与相同量的生物活性肽核酸杂交，从而构建复合物(参见表5)。用包含与载体肽核酸结合的生物活性肽核酸的新颖复合物处理细胞的方法如实施例2中所述。
表5：用于抑制PD-L1活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
实施例11-3：通过蛋白质印迹测定分析基因表达
为了分析新颖复合物抑制PD-L1的程度，将实施例11-1中培养的细胞以1x105个细胞/孔的细胞密度加入到6孔板的每个孔中，用复合物处理，并且然后孵育96、120和144小时。接下来，在实施例4-3的实验条件下，使用抗PD-L1抗体(Abcam，英格兰)分析蛋白质表达。
结果，如图17所示，可以证实与阴性对照组相比，用新颖复合物处理抑制人乳腺癌细胞中靶基因PD-L1的蛋白质表达。
实施例12：新颖复合物对细菌生长的抑制
检查了新颖复合物是否通过靶向已知是细菌生长所必需基因的acpP来抑制细菌生长。
实施例12-1：细菌培养
将大肠杆菌(E.coli)DH5α(Enzynomics，韩国)接种到Luria-Bertani(LB)肉汤中，并且然后在30℃下培养至105CFU。
实施例12-2：用于抑制细菌生长的新颖复合物的构建
为了构建用于抑制细菌生长的新颖复合物，构建了具有与acpP mRNA(细菌生长所必需的基因)互补的序列(SEQ ID NO:51)的生物活性核酸，并且构建了与生物活性核酸互补的载体肽核酸(SEQ ID NO:52)。然后，使载体肽核酸与相同量的生物活性核酸杂交，从而构建复合物(参见表6)。
表6：用于抑制acpP活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
实施例12-3：复合物对细菌生长的抑制的分析
为了分析复合物抑制细菌生长的程度，将实施例12-1中培养的细菌细胞用1μM实施例12-2的复合物处理24小时。然后，将培养物连续稀释，以相同的量滴到固体培养基上，并且然后观察12、24和48小时。结果，如图18所示，证实了与仅用单链生物活性核酸处理的测试组的生长相比，用复合物处理的测试组的生长受到抑制。
工业实用性
根据本发明的由结构式(1)表示的核酸复合物包含生物活性核酸和载体肽核酸，并且可以增加生物活性核酸的稳定性，减少生物活性核酸的损失(如由于自聚集的沉淀)，提高生物活性核酸的细胞内递送效率，并且容易地调节靶基因的表达。
特别地，根据本发明的核酸复合物中的生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合仅在存在生物活性核酸靶向的靶基因的核苷酸序列的情况下才解离。因此，与仅细胞内引入生物活性核酸细胞，细胞内引入核酸复合物对靶基因显示出更高的选择性和特异性。另外，根据本发明，可以使用生物活性核酸和载体肽核酸的各种结构组合制备在生物活性核酸与载体肽核酸之间具有受控结合亲和力的复合物，并且因此优点在于可以控制生物活性核酸的细胞内(或细胞外)作用的时间。
虽然已经参考具体特征详细描述了本发明，但对本领域技术人员应显而易见的是，此描述仅用于优选实施方案，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等效物限定。
文本文件
参见所附序列表。
序列表
<110> 海阳制药
<120> 具有改进的细胞渗透性的肽核酸复合物和包含其的药物组合物
<130> 4240-460
<150> PCT/KR2017/008636
<151> 2017-08-09
<150> KR 10-2016-0101374
<151> 2016-08-09
<160> 49
<170> PatentIn版本3.5
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<223> cp51
<400> 48
gctcatactc ttaaatttcc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cp52
<400> 49
cgagtatgag aatttaaagg 20

Claims (33)

1.一种具有由以下结构式(1)表示的结构的核酸复合物：
[结构式(1)]
[A≡C(+)]，
其中
A表示具有能够与靶基因或靶基因序列结合的序列的生物活性核酸；
C表示能够与该生物活性核酸结合的载体肽核酸；
“≡”表示该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的互补结合；
由A表示的该生物活性核酸总体带负电荷或是中性的；
C(+)指示该载体肽核酸总体带正电荷；并且
该载体肽核酸包含一个或多个经修饰肽核酸单体，使得该载体肽核酸总体带正电荷。
2.权利要求1的核酸复合物，其中该生物活性核酸和该载体肽核酸各自包含2至50个核酸单体。
3.权利要求1的核酸复合物，其中该生物活性核酸包含选自DNA、RNA、LNA、PNA和经修饰肽核酸的核酸单体。
4.权利要求1的核酸复合物，其中该核酸复合物总体带正电荷。
5.权利要求1的核酸复合物，其中该载体肽核酸具有与该生物活性核酸部分或完全互补的核苷酸序列。
6.权利要求5的核酸复合物，其中具有与该生物活性核酸部分互补的核苷酸序列的该载体肽核酸包含一个或多个通用碱基。
7.权利要求1的核酸复合物，其中该载体肽核酸包含一个或多个γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体，以总体带正电荷。
8.权利要求7的核酸复合物，其中该γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体在其骨架中包含一个或多个选自赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸(DAB)、鸟氨酸(Orn)和氨基酸类似物的带正电荷的氨基酸，以是电正性的。
9.权利要求8的核酸复合物，其中该γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体在骨架中包含一个或多个选自谷氨酸(Glu，E)、天冬氨酸(Asp，D)和氨基酸类似物的带负电荷的氨基酸。
10.权利要求8的核酸复合物，其中该γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体包含比具有带负电荷的氨基酸的单体数目更多的具有带正电荷的氨基酸的单体，使得该载体肽核酸总体带正电荷。
11.权利要求1的核酸复合物，其中根据每种核酸的5'方向性和3'方向性，该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的结合是反平行结合或平行结合。
12.权利要求1的核酸复合物，其中该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度(Tm))低于该生物活性核酸与该生物活性核酸靶向的基因之间的结合亲和力。
13.权利要求12的核酸复合物，其中该生物活性核酸和该载体肽核酸通过平行结合或部分特异性结合彼此结合，使得该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度(Tm))低于该生物活性核酸与该生物活性核酸靶向的基因之间的结合亲和力。
14.权利要求12的核酸复合物，其中该载体肽核酸具有接头、通用碱基和至少一个选自不与该生物活性核酸的相应碱基互补的肽核碱基的肽核碱基，使得该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度(Tm))低于该生物活性核酸与该生物活性核酸靶向的基因之间的结合亲和力。
15.权利要求12的核酸复合物，其中该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的分离时间以及该生物活性核酸与该生物活性核酸的靶基因之间的结合时间通过控制该生物活性核酸与该载体肽核酸之间的结合亲和力来控制。
16.权利要求14的核酸复合物，其中该通用碱基是选自天然碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶、以及肌苷PNA、吲哚PNA、硝基吲哚PNA和脱碱基中的一种或多种，所述脱碱基是没有选择性地结合并且具有比互补结合亲和力低的结合亲和力的碱基。
17.权利要求1的核酸复合物，其中该生物活性核酸和/或该载体肽核酸与一种或多种选自疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适体、猝灭剂、荧光标记和发光标记的物质结合。
18.权利要求17的核酸复合物，其中一种或多种选自该疏水部分、该亲水部分、该靶抗原特异性抗体、该适体、该猝灭剂、该荧光标记和该发光标记的物质与该生物活性核酸和/或该载体肽核酸的结合是单个共价键或接头介导的共价键。
19.权利要求1的核酸复合物，其中该核酸复合物的粒径是5至300nm。
20.权利要求19的核酸复合物，其中通过控制该核酸复合物的电荷平衡来控制该核酸复合物的粒径。
21.一种用于调节靶基因表达的组合物，其包含权利要求1至20中任一项的核酸复合物。
22.一种用于预防或治疗疾病的组合物，其包含权利要求1至20中任一项的核酸复合物。
23.权利要求22的组合物，其中该疾病是癌症、炎性疾病、年龄相关性黄斑变性、罕见疾病和严重疾病、心血管疾病、代谢疾病或皮肤病。
24.权利要求23的组合物，其中该核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因是选自存活蛋白、VEGF、雄激素受体、KRAS、丛集素、TGFβR2、ERBB3、转谷氨酰胺酶2、ABCB1、Hsp27、STAT3和PD-L1中的任何一种或多种。
25.权利要求23的组合物，其中该核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因是VEGF。
26.权利要求23的组合物，其中该核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因是选自IFI16、TLR6和TIEG1中的任何一种或多种。
27.权利要求26的组合物，其中该皮肤病选自银屑病、色素沉着相关皮肤病和特应性疾病。
28.权利要求27的组合物，其具有选自水溶液、乳膏、凝胶、糊剂、洗剂和软膏中的任何一种制剂。
29.权利要求23的组合物，其中该核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因是选自PDE4B和Pellino-1中的任何一种或多种。
30.权利要求23的组合物，其中该核酸复合物中包含的生物活性核酸所结合的靶基因是选自SMN2、ApoB-100、ICAM-1、ApoCIII、TTR、HTT、GHr、SOD1、ANGPTL3、PKK、miR-21、TMPRSS6、FMR1和连接蛋白26中的任何一种或多种。
31.一种用于诊断疾病的组合物，其包含权利要求1至20中任一项的核酸复合物。
32.一种用于调节靶基因表达的方法，其包括使用权利要求1至20中任一项的核酸复合物。
33.一种用于控制由结构式(1)表示的核酸复合物的粒径的方法，其包括控制该核酸复合物的电荷平衡。
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