CN106163570A - cGAP‑PNA多价肽核酸配体展示 - Google Patents
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Abstract
本文描述的是由肽核酸链组成的组合物。在一些方面，所述肽核酸链与可以具有一个或多个γ取代基的另一肽核酸链的至少一部分互补，其中PNA链之比为最小1:1。某些γ取代基能够影响PNA链对细胞的附着。本公开还涉及纳米结构平台和疫苗的构建，以及本发明的组合物在抑制哺乳动物中的疾病状态的用途。
Description
对相关申请的交叉引用
本专利申请要求2014年1月21日提交的美国临时专利申请号61/929,893的权益，所述申请通过引用结合。
发明背景
多价(multivalent或polyvalent)相互作用是指分子实体的表面上的多个配体对另一个上的多个受体的同时结合。多价相互作用的强度和特异性依赖于参与该过程的所有配体和所有受体的积累效应。在多价阵列中，单个分离的配体-受体相互作用可能实际上是弱的，但多个配体-受体相互作用的组合作用可能非常强。这样的多价相互作用在整个生物学中发生，并且在很多过程中是重要的，如涉及细胞表面受体的那些。例如，细胞附着、创伤愈合以及免疫应答是其中多价相互作用是重要的基本实例。因此，多价相互作用可能直接与癌症转移、凝血作用、以及从免疫接种产生抗体相关(一般参见，Mammen等人，Angew.Chem.Int.Ed.，37：2754-94(1998))。
在合成的支架上模拟多价相互作用是有挑战的，特别是当需要展示大量配体(如5种以上)时。存在很多已经开发的合成的支架，但仍然存在显著的限制。理想地，用于多价展示配体的支架应该容易操作从而以受控的方式在任意处展示1到多至约200个配体。已经开发了成分确定的合成支架用于展示小量的配体。这样的系统是良好的，因为可以制备单个合成的实体并分离，但这样的系统很少展示多于5种配体。除此之外，制备成分确定的合成支架变得非常具有挑战性。为了研究更大量配体的多价效应，科学家依赖于成分不那么确定而由混合物组成的合成体系。在该领域中，常使用聚合物、树状高分子、蛋白质和合成的纳米结构(如金纳米颗粒)作为合成支架以支持较大量的配体。不幸的是，这些较大系统是异源混合物，其中每个支架上配体的数量不能严格限定。在这些情况下，科学家确定每个支架的平均配体数或报道每个支架的配体范围。异源混合物常常不被FDA标准接受以用作治疗剂。由此，需要改善的支架。
发明概述
本文中描述的是在较长长度仍然可溶的不同类型的PNA。该新类型的PNA称为“cGAP-PNA”。“c”代表互补，因为cGAP-PNA具有与配体修饰的PNA(下文中为“L-PNA”)序列互补的核碱基序列。“GAP”是中断与L-PNA互补的相邻PNA核碱基序列的任何化学基团。在多数情况中，cGAP-PNA中的相邻PNA序列之间的GAP是氨基酸，如N，N-二甲基赖氨酸；然而，可以使用其他氨基酸，以及本文中描述的其他合适的化学基团。
本文中描述的是具有多个连接的肽核酸(PNA)链的大分子，其中各PNA链独立地由多个核碱基亚基构成，并且每个PNA链与至少另一个PNA链经由氨基酸接头(即，“GAP”)共价连接。在一些实施方案中，PNA链将具有2至50个核碱基。在一些实施方案中，所述连接的PNA链可以形成线性排列，以致它们以端到端的方式依次连接。在一个这样的实施方案中，所述连接的PNA链形成开放的单个线性排列(如可由直线代表的)。在另一实施方案中，所述连接的PNA链形成闭合的线性排列(如可由环代表的)。在一些实施方案中，所述连接的PNA链可以以分支排列来排列。PNA链的长度可以不同，甚至在单个排列内。例如，连接在一个排列中的PNA链的长度可以不同，以致一些链比其他的短。相反，在一些实施方案中，描述的组合物可以由相同长度的PNA链制成。
用于形成所述PNA排列的接头可以是氨基酸组合物。在一个实施方案中，接头可以是天然存在的氨基酸。在另一实施方案中，接头可以是合成的氨基酸。在另一实施方案中，氨基酸化合物可以是包括末端氨基和末端羧基的任何化学化合物。所述的接头可以介导两个以上所述的PNA链的连接。在一些实施方案中，接头将仅连接两个PNA链。然而，在其他实施方案中，单个接头可以连接三个、四个、五个、六个、七个或更多个PNA链。单个接头介导PNA链间的缀合的程度通常依赖于所需的产生的cGAP-PNA的结构。
在一些方面，本发明涉及具有结合于L-PNA的连接的PNA(GAP-PNA)的大分子。在一些实施方案中，每个PNA链可以具有2至50个核碱基亚基；L-PNA链将具有一个或多个γ取代基；PNA链与另一个的至少一部分互补，cGAP-PNA链与L-PNA链的比率至少是1∶1。这些大分子可以形成至少部分双链的GAP-PNA-L-PNA大分子，称为L-PNA：PNA(GAP)。某些实施方案可以含有这样的L-PNA，所述L-PNA的骨架具有至少一个环戊基残基。
本发明的一些大分子具有能够结合细胞表面上的受体，结合细胞表面分子或引起免疫应答的γ取代基。在一些实施方案中，cGAP-PNA链与L-PNA链之比是2∶1至10∶1。在某些实施方案中，所述比为3∶1至7∶1或4∶1至6∶1。
在一些实施方案中，L-PNA的γ取代基，独立地包括R-NX1X2，其中：R是C1-C12烷基；X1和X2独立地选自H、生物分子、荧光基团、金属配体、Michael受体、叠氮化物、炔烃和硫醇；其中X1和X2中的至少一个不是H。在某些实施方案中，X1和X2独立地选自H、生物素、荧光素、噻唑橙(thiazole orange)、吖啶、芘、Alexafluor染料(Alexafluor Dyes)、多肽、糖(如甘露糖或乳糖)、核酸衍生物、寡核苷酸、RGD(Arg-Gly-Asp)和环RGD。可以与PNA连接用于多价展示的其他基团和配体包括，但不限于，环糊精、卟啉、含硼的多面体笼形化合物、生物素、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″-四乙酸(DOTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、穴状配体、冠醚(例如12-冠醚-4、15-冠醚-5、18-冠醚-6、二苯并-18-冠醚-6和二氮杂-18-冠醚-6或衍生物)、含吡啶的配体或杯芳烃(如杯[4]芳烃、例如，锥-4-叔丁基杯[4]芳烃四(二乙基酰胺)(cone-4-tert-butylcalix[4]arenetetra(diethylamide))和杯[6]芳烃。在一些实施方案中，可以使用上述X1和X2基团的衍生物和配体。除了γ取代基，本文中描述的化合物的N端PNA残基还可以在N末端的氮上包括取代基(R2和R3)。因此，单个PNA残基可以具有多至3个取代基，一个γ取代基和两个末端取代基。
在一些实施方案中，本文中描述的个体L-PNA残基可以具有一个取代基。在一些情况中，将该取代基与L-PNA残基的γ碳缀合。在一些实施方案中，将该取代基与L-PNA残基的末端氮缀合。在一些实施方案中，该性质的L-PNA残基将是个体残基。然而，其还可以是较大链中的多个PNA中的一个。在一些实施方案中，可以将本文中描述的L-PNA与cGAP-PNA复合以形成L-PNA：PNA(GAP)。
在一些实施方案中，本文中描述的个体L-PNA残基可以具有两个取代基。在一些情况中，将两个取代基中的至少一个与L-PNA残基的γ碳缀合。在一些实施方案中，将两个取代基中的至少一个与末端氮残基缀合。在一些情况中，将两个取代基中的至少一个与L-PNA残基的γ碳缀合，并且将另一个与末端氮残基缀合。在一些实施方案中，该性质的L-PNA残基将是个体残基。然而，其还可以是较大链中的多个PNA中的一个。在一些实施方案中，可以将本文中描述的L-PNA与cGAP-PNA复合形成L-PNA：PNA(GAP)。
在一些实施方案中，本文中描述的个体L-PNA残基可以具有三个取代基。在一些情况中，将取代基中的至少一个与L-PNA残基的γ碳缀合。在一些实施方案中，将两个取代基与末端氮残基缀合。在一些情况中，将取代基中的至少一个与L-PNA残基的γ碳缀合并且将另两个与末端氮残基缀合。在一些实施方案中，该性质的L-PNA残基将是个体残基。然而，其还可以是较大链中的多个PNA中的一个。在一些实施方案中，可以将本文中描述的L-PNA与cGAP-PNA复合形成L-PNA：PNA(GAP)。
本发明还涉及治疗或抑制哺乳动物中疾病状态的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的本文中描述的大分子，其中选择至少一些γ取代基以结合与所述疾病状态相关的细胞表面上的受体，从而阻碍细胞表面分子与可以引发或延长疾病状态的配体相互作用的能力，或引起免疫应答。在一些实施方案中，疾病状态独立地与癌症；HIV、流感、鼻病毒、轮状病毒、大肠杆菌、炭疽病或霍乱引起的感染疾病；糖尿病(2型)，美洲锥虫病(Chagasdisease)，慢性炎性疾病以及自身免疫病相关(一般参见，Hecht等人，Curr.Opin.inChem.Biol.，13：354-59(2009)和Mammen等人)。
在另一方面，本发明涉及通过将cGAP-PNA链与L-PNA链接触形成纳米结构平台的方法，其中L-PNA链具有：
(i)2至50个核碱基亚基，和
(ii)一个或多个γ取代基；
其中L-PNA链与cGAP-PNA链的比率大于1∶1并且所述PNA链与另一个的一部分互补。
附图的若干视图的简述
图1A描绘L-PNA：DNA双链体作为具有以红色突出显示的γ-赖氨酸侧链修饰的化学结构的表示。XAC通过两个微型-PEG(8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)接头与侧链连接。图1B-1D描绘与互补DNA结合的L-PNA 12-碱基寡聚物的表示，每个L-PNA有一个XAC配体(图1B)，两个XAC配体(图1C)和三个XAC配体(图1D)。
图2A描绘L-PNA：DNA多价文库以及结合A2A腺苷受体(“AR”)的相关IC50和β值。图2BA描绘突出显示与不同长度的DNA退火时A、B和C型L-PNA构建体之间的关系的多价状况(landscape)。
图3A描绘二价L-PNA：PNA双链体作为化学结构的表示。L-PNA含有两个相邻的携带配体的侧链，间隔为一个碱基对(bp)，是大约图3B显示产生以确定轴向间隔对受体结合能力的影响的数个二价L-PNA：PNA。连同单价A1P对照，总结四个二价复合体，包括它们的IC50值，配体-侧链之间轴向距离的变化，和与A1P相比复合体的η值。
图4描绘统计模型。该模型假定L-PNA：PNA和受体之间仅存在离散数量的不同结合状态。突出显示单价复合体(图4A)和二价复合体(图4B)的这些状态的子集。使用A1P和B1P复合体的每个可能的配体构型，模型根据二聚状态的蛋白质的特定分数取样全体状态，结果显示在图4C中。然后可以将该信息外推并制成二聚状态(D)的受体的分数相对于理论和实验观察数据之间的误差(ε)的图图，如图4D中所示。最小误差区域设计为“理想区域”。
图5A-5D描绘基于已知的单体的结合拮抗剂的晶体结构建立的提议的A2A二聚体的分子模型。在具有(图5A)和没有(图5B)磷脂双层(细胞膜)的情况下，利用二聚体将B(6，10)1P复合体建模。使用来自统计模型的数据的子集，可能的侧链组织被叠加在B(2，3)1P(图5C)和B(6，10)1P(图5D)复合体的模型上。
图6A和6B显示L-PNA：PNA多价状况。L-PNA：PNA多价文库以及相关的IC50和β值显示在图6A中。还针对A2AAR同系物A1AR(260nM)和A3AR(180nM)筛选复合体B(6，10)4P。突出显示与不同长度的互补PNA退火时A(红色)、B(2，10)、B(6，10)和C型L-PNA构建体之间的关系的多价状况显示在图6B中。
图7显示PNAa的结构表示。
图8显示L-PNAA的结构表示。
图9显示PNAb的结构表示。
图10显示PNA B的结构表示。
图11显示PNAc的结构表示。
图12显示PNA C的结构表示。
图13显示PNAb2，3的结构表示。
图14显示L-PNAB2，3的结构表示。
图15显示PNAb6，10的结构表示。
图16显示L-PNAB6，10的结构表示。
图17显示PNAb1，14的结构表示。
图18显示L-PNAB1，14的结构表示。
图19显示补体PNA1的结构表示，其具有结构Me2Lys-TCA-TCT-AGT-GAC-Ac。
图20显示补体PNA1(1，14)的结构表示，其具有结构Me2Lys-A-TCA-TCT-AGT-GAC-A-Ac。
图21显示补体PNA1(2，3)的结构表示，其具有结构Me2Lys-TCA-TCT-AGT-AAC-Ac.
图22显示补体PNA2的结构表示，其具有结构Me2Lys-TCA-TCT-AGT-GAC-Me2Lys-TCA-TCT-AGT-GAC-Me2Lys-Ac。
图23显示补体PNAm3的结构表示，其具有结构Me2Lys-TCA-TCT-AGT-GAC-Me2Lys-TCA-TCT-AGT-GAC-Me2Lys-TCA-TCT-AGT-GAC-Me2Lys-Ac。
图24显示补体PNA4的结构表示，其具有结构Me2Lys-TCA-TCT-AGT-GAC-Me2Lys-TCA-TCT-AGT-GAC-Me2Lys-TCA-TCT-AGT-GAC-Me2Lys-TCA-TCT-AGT-GAC-Me2Lys-Ac。
图25A显示含有LKγ-PNA侧链的L-PNA：PNA双链体的化学结构。
图25B显示D2R激动剂(±)-PPHT和修饰的赖氨酸残基X的化学结构。
图25C显示结合于互补PNA的L-PNA寡聚物，每个PNA有一个(±)-PPHT配体(A-型)，两个(±)-PPHT配体(B-型)和三个(±)-PPHT配体(C-型)。
图25D显示各L-PNA序列通过其组成部分而被识别；例如，A2复合体含有沿24个残基的cPNA退火的2个A-型L-PNA单元。
图26显示突出显示当与不同长度的DNA退火时A、B和C型L-PHA构建体之间的关系的多价状况。
发明详述
肽核酸(PNA)是维持传统沃森克里克碱基配对的DNA拟似物。PNA和DNA之间的主要差异是骨架：DNA核苷酸通过相邻核糖之间的带负电的磷酸二酯基团连接，而PNA单元经由电中性的酰胺键连接。PNA强烈且具有序列选择性地结合互补DNA、RNA并且甚至PNA从而形成双螺旋结构。特别地，与由DNA或RNA构成的类似双链体相比，PNA-PNA双链体对于变性非常稳定。
可以修饰具有γ-侧链的短PNA片段以展示生物学相关配体。可以将展示一个或多个配体(L-PNA)的PNA退火至可以支持1至15个L-PNA的任意处的互补DNA序列。这些L-PNA：DNA复合体用作支架以组织从L-PNA伸出的配体的多价展示。使用该方法，可以产生L-PNA：DNA复合体的文库并且检测每个以找到用于特定生物效应的最佳多价展示。
然而，L-PNA-DNA体系存在一些缺点。例如，来自磷酸二酯基团的DNA骨架上的负电可能导致非特异结合。此外，DNA可能对酶降解易感。此外，使用已知技术仅可以制备长度多至约20个核碱基的PNA，之后它们变得高度不溶。
如本文使用的，术语“报告分子”理解为意为可通过分析的方式体外和/或体内检测并且将该性质赋予缀合物的任意基团。一些报告分子是具有作为分子浓度的函数的荧光性质的荧光分子。其他报告分子具有可以监测以用于检测的吸收光谱。本领域技术人员知晓很多报告分子并且适于用于本发明。一种优选的报告分子是生物素。
如本文使用的，术语“一个(a)”，“一个(an)”，“那个(the)”等是指单数和复数两种，除非上下文明确另有说明。
术语“氨基酸”要以化学的意义而不是生物学意义宽泛地解释。因此，该术语表示任何具有羧基末端和氨基末端的化学基团。虽然天然存在的和合成的生物学氨基酸组合物落在该术语的范围内，但该定义不这样限制以仅包括这些化学组合物。
术语“交叉反应基团”是指能够反应以形成连接第一和第二PNA的共价键的至少两个基团。
“GAP”是中断与L-PNA互补的相邻PNA核碱基序列的任何化学基团。通常，尽管不总是，GAP是氨基酸。
术语“L-PNA”用于表示具有与其连接的配体的PNA碱基；然而，该术语不应被理解为限于表示与已知作为生理学配体的部分结合的PNA。术语“L-PNA”也可以表示与其他生物分子连接的PNA，所述其他生物分子如受体、抗原分子、病毒或细菌外壳蛋白或其蛋白片段。
本文中提供的技术克服目前的多价支架持续存在的障碍。该技术使用肽核酸(PNA)，其骨架被取代以提供多价支架(L-PNA：PNA(GAP))。优选地，在L-PNA：PNA(GAP)中，在L-PNA骨架的一个或多个γ碳处引入一个或多个侧链。
PNA是具有源自DNA的碱基的合成的分子。类似于DNA，PNA上的碱基序列决定PNA将结合的核酸的互补序列。PNA的γ碳处的侧链可以具有氮原子以促进配体对延伸出骨架的侧链的附着。
如本文使用的，术语“大分子”是指多个连接的肽核酸链。
本文中描述的L-PNA可以与cGAP-PNA的互补核碱基相互作用以形成至少部分双链的L-PNA：PNA(GAP)复合体。在L-PNA的整体与cGAP-PNA整体互补的情况下，整个复合体将具有双链核碱基区段。cGAP-PNA组合物可以被描述为具有多个连接的肽核酸(PNA)链的组合物，其中所述链中的每个独立地由多个核碱基亚基构成，并且每个PNA链经由氨基酸接头共价连接于至少另一个PNA链。在一些方面，L-PNA与cGAP-PNA的比率大于1∶1。cGAP-PNA的实例在下文显示，其中Me2Lys“GAP”用于连接与L-PNA互补的两个PNA(未显示)：
GTC-ACT-AGA-TGA-Me2Lys-GTC-ACT-AGA-TGA
(L-PNA的补体)(GAP)(L-PNA的补体)。
作为实例，cGAP-PNA可以是60个核碱基长并且支持5个携带特异γ配体的互补L-PNA(每个具有12个核碱基)的组合件。在这样的实施方案中，cGAP-PNA在序列内具有4个GAP，并且每个GAP是亲水氨基酸，如N，N-二甲基赖氨酸氨基酸。GAP的存在有助于最终分子的合成和水溶性。利用该改善，赖氨酸GAP克服早期PNA技术中疏水性和差的水溶性的缺点并且拓展了合成非常长的长度的PNA的可能。
所述的cGAP-PNA链由经由氨基酸接头(即，“GAP”)共价连接于至少另一个PNA链的至少一个PNA链构成。在一些实施方案中，PNA链将具有2至50个核碱基。在一些实施方案中连接的PNA链可以形成线性排列，以致它们以端到端(end-to-end)的方式依次连接。在一个这样的实施方案中连接的PNA链形成开放的单个线性排列(如可由直线表示的)。在另一实施方案中，连接的PNA链形成闭合的线性排列(如可由环表示的)。在一些实施方案中，连接的PNA链可以以分支排列来排列。PNA链的长度可以不同，甚至在单个排列内。例如，在一个排列中连接的PNA链可以长度不同，以致一些链比其他的短。相反，在一些实施方案中，所述的大分子可以由长度相同的PNA链制成。此外，可以将所述的GAP-PNA链设计成包括与另一PNA链(如L-PNA)互补的核碱基的区段。在一些实施方案中，GAP-PNA整体将与L-PNA互补。在一些实施方案中，仅GAP-PNA的一部分将与L-PNA互补。例如，cGAP-PNA可以由重复的15个核碱基的区段制成，所述区段各自具有两个与相同L-PNA序列互补的5个碱基的亚区段，其中所述5个碱基的亚区段由不与L-PNA互补的5个碱基分开。这将允许在得到的L-PNA：PNA(GAP)上间隔退火的L-PNA链。
所述的L-PNA：PNA(GAP)允许多个L-PNA组装在单个分子上。以此方式的组装允许cGAP-PNA充当模板以组装多个L-PNA。例如，由12个碱基组成并具有一个与侧链连接的配体的L-PNA，可以通过将这些L-PNA与具有适当的L-PNA的互补序列的120个碱基的cGAP-PNA序列复合来在多价阵列中展示10个所述配体。利用该系统，可以容易地制备具有不同数量的配体的不同实体的文库。例如，从展示10个配体转变为5个通过简单地使用不同的(较短的)L-PNA和相同的cGAP-PNA而容易地实现。利用该系统，不限于每个L-PNA仅一个配体。本发明的化学允许多个侧链连接于原始L-PNA序列，从而在需要的情况下，侧链可以连接在最终L-PNA的每个位置处。在该情况下，如果被组装到具有重复10次的互补序列的120个碱基的cGAP-PNA序列上，则在骨架的每个位置具有携带配体的侧链的12碱基L-PNA可以用于展示120个配体。本发明的系统的多能性和准确性是目前的多价支架不可比的。
本文中描述的cGAP-PNA使用接头化合物(“GAP”)来连接PNA区段。接头或GAP通常是具有末端氨基和末端羧基的氨基酸化合物。在一些实施方案中，接头是天然存在的生物学氨基酸。在一些实施方案中，接头是合成产生的生物学氨基酸。在一些实施方案中，接头是既不是天然存在的也不是合成的生物学氨基酸但是却具有末端氨基和末端羧基的化学化合物。在一些实施方案中，接头是N，N-二甲基-赖氨酸。在一些实施方案中，接头是N，N-二甲基-L-赖氨酸。在一些实施方案中，接头可以具有多于一个氨基和多于一个羧基，以致其可以介导连接多于2个PNA。在一些实施方案中，单个接头可以介导3个PNA的缀合。在一些实施方案中，单个接头可以介导4个PNA的缀合。在一些实施方案中，单个接头可以介导5个PNA的缀合。在一些实施方案中，单个接头可以介导6个PNA的缀合。在一些实施方案中，单个接头可以介导7个PNA的缀合。在一些实施方案中，单个接头可以介导8个PNA的缀合。在一些实施方案中，单个接头可以介导9个PNA的缀合。在一些实施方案中，单个接头可以介导10个以上PNA的缀合。使接头具有连接3个以上PNA的能力允许形成分支的cGAP-PNA结构的能力，所述分支的cGAP-PNA结构可以随后如本文中所述用于形成分支的L-PNA：PNA(GAP)支架。
此外，本文中描述的是自身通过GAP连接的L-PNA区段。该实施方案允许形成延长的单链L-PNA(GAP)，类似于本文中描述的GAP-PNA。此外，还可能产生互补的L-PNA(GAP)，其随后可以与L-PNA退火而形成L-PNA：L-PNA(GAP)复合体。在一些实施方案中，这些复合体的L-PNA区段上存在的配体可以是相同的。备选地，所述的L-PNA(GAP)的L-PNA区段上存在的配体可以不同。此外，在一个实施方案中，L-PNA(GAP)链可以具有第一配体，而相应的L-PNA具有第二配体，其中第一和第二配体不同。本领域技术人员将理解，对于所述的L-PNA：L-PNA(GAP)复合体，多种配体组合是可能的。
所述的L-PNA：PNA(GAP)由结合于互补GAP-PNA的L-PNA构成。存在于个体cGAP-PNA区段上的L-PNA的数目可以根据多种因素改变，如cGAP-PNA的长度或相应的一个或多个L-PNA的长度。尽管如此，各L-PNA：PNA(GAP)将具有L-PNA区段与各个体cGAP-PNA区段的比率。然而，应该理解，该比率在相同L-PNA：PNA(GAP)内可以变化，因为个体cGAP-PNA区段可以与不同数量的L-PNA退火，这取决于PNA与彼此的互补性。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比大于1∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是1∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是2∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是3∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是4∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是5∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是6∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是7∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是8∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是9∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是10∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是11∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是12∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是13∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是14∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是15∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是16∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是17∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是18∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是19∶1。在一些实施方案中，L-PNA与个体cGAP-PNA之比是20∶1。在一些实施方案中L-PNA与个体cGAP-PNA之比大于20∶1。
本文中描述的L-PNA：PNA(GAP)可以用于靶向蛋白质。在一些情况中，靶向的蛋白质将是细胞表面蛋白质。例如，作为靶标的细胞表面蛋白质可以是跨膜蛋白质、脂质锚定蛋白质或外周蛋白质。因此，靶向的蛋白质可以是细胞受体或细胞黏附分子。在一些情况中，细胞表面蛋白质是整联蛋白。在一些实施方案中，整联蛋白可以是α1β1、α2β1、α4β1、α4β7、α5β1、α6β1、αLβ2、αMβ2、αIIbβ3、αVβ3、αVβ5、αVβ6或α6β4。在本文中描述的一些实施方案中，公开的L-PNA：PNA(GAP)可以用于结合，或破坏整联蛋白α6β4的活性。在一些实施方案中，靶向的蛋白质可以是G-偶联表面蛋白质，如受体。在其他实施方案中，细胞表面蛋白质是离子通道连接的受体。在一些实施方案中，靶向的蛋白质可以是酶连接的受体蛋白质。在一些方面，靶向的蛋白质是钙黏着蛋白，如E-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白、钙黏着蛋白12或P-钙黏着蛋白。选择蛋白也可以由本文中描述的L-PNA：PNA(GAP)靶向。例如，E-选择蛋白、P-选择蛋白或L-选择蛋白可以由所述的L-PNA：PNA(GAP)靶向。在一些方面，细胞间黏附分子1(ICAM-1)由本文中描述的L-PNA：PNA(GAP)靶向。在其他实施方案中，可以靶向细胞表面上的唾液酸。C-型凝集素也可以由本文中描述的L-PNA：PNA(GAP)靶向。例如，可以靶向的一些C-型凝集素包括：lecticans、脱唾液酸糖蛋白和DC受体、胶原凝集素(collectins)、NK细胞受体、多-CTLD内吞受体和凝血调节蛋白(thrombomodulin)(仅举出几个)。此外，toll样受体可以由所述的L-PNA：PNA(GAP)靶向。可以靶向的一些toll样受体包括TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12或TLR 13。
本发明的系统的另一优势是，准确知晓每个情况中展示的配体数，因为L-PNA和cGAP-PNA之间的相互作用是明确的。此外，可以通过将非互补序列片段插入cGAP-PNA的L-PNA结合部分之间而容易地改变支架上相邻配体之间的距离。该系统的另一特征是，其允许以受控的、可空间定位(spatially-addressable)的方式展示不同类型的配体。例如，如果2个不同配体(L1和L2)各自需要展示3次，但是是以不同的具体顺序(例如L1-L1-L1-L2-L2-L2相对L1-L2-L1-L2-L1-L2)，这可以利用本系统实现。为此，将制备两种不同的L-PNA核碱基序列(L-PNA1和L-PNA2)并且随后将L1连于L-PNA1的侧链并将L2连于L-PNA2的侧链。对配体的不同顺序的检查可以通过制备合适的cGAP-PNA序列而以所需顺序展示配体来实现。该方法可以扩展至更多的配体。例如，为了展示10个不同取代基(L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10)，将设计十种不同L-PNA，各自具有独特的多核碱基序列，并且将一个配体与各L-PNA连接。十种配体中的每种可以随后以可空间定位的方式组装到cGAP-PNA序列上。该技术独特地允许探索多个取代基的小分子重排。对于10种取代基的实例，该技术允许进行配体排列如：L1-L2-L3-L4-L5-L6-L7-L8-L9-L10或颠倒L1和L2的位置，得到L2-L1-L3-L4-L5-L6-L7-L8-L9-L10。利用制备cGAP-PNA的能力，甚至可以探索10种取代基的所有组合。以该方式探索取代基文库还可以扩展至微阵列技术作为组装取代基文库的方式并且随后对活性和序列信息进行筛选。
本领域技术人员将理解，当有PNA可用于缀合时，可以使用很多不同取代基。因此，使用“10”种取代基来说明由所述的系统提供的位置灵活性的点不应该视为限制性的。例如，本文中描述的L-PNA可以由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个总碱基制成。在一些实施方案中，L-PNA链上的全部取代基都相同。在其他实施方案中，L-PNA链的取代基不同。取代基相对于彼此不同的程度可以改变，以致所有取代基唯一的程度可以为约5％。备选地，约10％的取代基可以是唯一的。在一些实施方案中约15％的取代基是唯一的。在一些实施方案中，约20％的取代基是唯一的。在一些实施方案中，约25％的取代基是唯一的。在一些实施方案中，约30％的取代基是唯一的。在一些实施方案中，约35％的取代基是唯一的。在一些实施方案中，约40％的取代基是唯一的。在一些实施方案中，约45％的取代基是唯一的。在一些实施方案中，约50％的取代基是唯一的。
示例的具有1-5个侧链的PNA构建体在本领域中已知(参见例如，WO 2011/143323A2，其在本文中通过引用结合)。具有结构部分如RGD和糖衍生物(例如甘露糖和乳糖)的各种侧链在WO 2011/143323 A2中举例。此外，在文献(例如，WO 2011/143323 A2)中举例说明的结构可以用于经由侧链上的含有末端氮的官能团连接取代基。在一些实施方案中，L-PNA结构由下式表示。
其中R1是H或并且m是0-48，n是1-5的整数。B是天然(A、T、G、C)或非天然核碱基(如J，异鸟嘌呤，或PPG)。
如本文使用的，“核碱基亚基”由以下结构的基团表示：
PNA包含多个核碱基亚基。
R2和R3的基团范围可以从烷基(如CH3和衍生物如取代的烷基)变化至芳基(如苯基和明显的衍生物)、至酰基(如乙酰氨基)、至更复杂的接头(如PEG和相关的变化形式)，在其末端连接生物分子的配体、荧光基团、金属配体或其他反应性基团(如Michael受体、叠氮化物、炔烃、硫醇)，其可以用作连接其他分子的把手。可以在R2和R3位置连接的一些特定结构部分包括生物素、荧光素、噻唑橙、吖啶、芘、Alexafluor染料、多肽、糖(如乳糖、甘露糖或其他寡糖)、核酸衍生物(如腺苷受体的激动剂或拮抗剂)、寡核苷酸(如G-四倍体)。R2和R3还可以是肽配体如RGD(Arg-Gly-Asp)和环RGD。
合适的生物分子的配体的非限制性实例包括GPCR激动剂、GPCR拮抗剂、结合整联蛋白受体的化合物和结合碳水化合物受体的化合物。合适的整联蛋白受体配体的非限制性实例可以在，例如，Vanderslice，P.等人，Expert Opin.Investig.Drugs，2006，15(1)：1235-1255和Sun，C-C.等人，Anti-Cancer Drugs，2014，25(1)：1107-1121中找到，其公开内容通过引用全部结合于本文。GPCR激动剂和拮抗剂的非限制性实例可以在，例如，Insel，P.A.等人，Biochimica et Biophysica Acta，2007，1768：994-1005中找到，其公开内容通过引用全部结合于本文。合适的结合碳水化合物受体的化合物的非限制性实例可以在，例如，Branson，T.R.等人，Chem.Soc.Rev.，2013，42：4613-4622中找到，其公开内容通过引用全部结合于本文。合适的Michael受体的非限制性实例包括具有乙烯基羰基、乙烯基羧基、1，2-二羰基乙烯或1，2-二羰基乙炔结构部分的基团。
除了上述实例之外，任何可用于所希望的生物相互作用的取代基可以用于本发明。可以将这样的结构部分通过标准化学反应和本文中讨论的方法添加于PNA。可以置于γ位置的取代基的实例包括伯胺、疏水基团、极性基团、亲水基团、芳族基团、肽配体、受体激动剂、糖、成像剂或其混合物。
在本发明的构建体的制备中，γ-取代基可以基于它们在与特定受体或其他生物相互作用位点的相互作用中的功用引入。在特定PNA中，可以利用多于一个取代基。在特定L-PNA：PNA(GAP)支架中，根据靶标结构部分，不同L-PNA可以含有相同或不同取代基。
除了上述PNA之外，可以使用本领域中已知的多种PNA变化形式中的任一种。已知PNA大分子包括由以下结构表示的大分子。
天然和非天然碱基可以用于这些结构并且是本领域技术人员公知的。
方案1描绘合成可以用于制备L-PNA的γ-取代的单体的方法。γ取代基可以充当进一步功能化的点。这些单体可以通过本领域中已知方法转变为L-PNA。参见，例如，Englund，E.A.；Appella，D.H.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2007，46，1414。
方案1
在方案2中，使用FMoc允许在树脂上时的胺的去保护和偶联。可以调整反应条件以容纳碱不稳定的Fmoc基团。通常，通过氢解而不是水解进行酯到酸的转变。参见，例如，Englund，E.A.；Appella，D.H.Org.Lett.2005，7，3465。
方案2
在方案3中，随后将寡聚物从树脂(TfOH)上切下，通过反相HPLC纯化，并通过质谱表征。参见，例如，Koch，T.；等人J.Peptide Res，1997，49，80。
方案3
HBTU和HATU由以下结构限定。
LK(Fmoc)γ-PNA的侧链修饰在方案4中描述。该方案提供对多种功能性的接近。可能通过该方法将一些或全部残基缀合于不同类型的结构部分。
方案4
可以将组装到cGAP-PNA上的相邻PNA交联。可以通过已知技术将交联反应基团结合入这些构建体中。在一些实施方案中，将交联官能团连接在L-PNA的末端位置。
交联可以通过使用交叉反应性官能团来实现。很多交叉反应性官能团是本领域中已知的并且可以用于本发明。在一些实施方案中，交叉反应性官能团可以是式I和II的。基团I与基团II的分子的反应产生式III所示的连接。
一些优选的PNA含有反式-1，2-二氨基环戊烷，其可能潜在地影响宽范围的科学学科。最新的进步改善了反式-1，2-二氨基环戊烷的合成。参见，PCT专利申请号PCT/US2007/020466。这些方法允许利用相同或不同基团容易地衍生化环戊烷二胺的每个氮原子。将反式-1，2-二氨基环戊烷结合入PNA中对GAP序列的识别具有有益作用。可以在Pokorski等人，J.Am.Chem.Soc.2004，126，15067中找到用于PNA和环戊烷-修饰的PNA合成和获得解链温度数据的方法。
本发明的L-PNA：PNA(GAP)支架可以用于药物组合物。该组合物可以通过将有效量的支架组合物加入至合适的药用稀释剂或载体中来制备。所述载体和稀释剂是本领域技术人员公知的。
支架和/或药物组合物可以通过本领域技术人员公知的方法施用。所述方法包括局部和全身施用。在一些实施方案中，施用是局部的。这样的方法包括眼施用和递送至粘膜(包括阴道和直肠递送)、肺(包括吸入粉末或气雾剂；气管内、鼻内、表皮和经皮)、口或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内(包括鞘内或脑室内施用)。
用于局部施用的药物组合物和制剂包括但不限于软膏、洗液、乳霜、经皮贴片、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体和粉剂。常规药物载体、油性基料、水、粉末、增稠剂等的利用可以用于所述制剂中。
药物组合物也可以以片剂、胶囊、凝胶胶囊等施用。
穿透增强剂也可以用于本发明的药物组合物。这样的增强剂包括表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂。这样的增强剂在美国专利号6,287,860中被总体描述，其通过引用结合于本文。
本文中描述的支架可以用于帮助治疗疾病如癌症(例如预防转移)和抑制HIV(例如通过防止对靶细胞表面的附着)。其他疾病包括糖尿病(2型)、美洲锥虫病、慢性炎性疾病(如乳糜泄(celiac disease)、脉管炎(vasculitis)、狼疮(lupus)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)、肠易激综合征(irritable boweldisease)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、关节炎和银屑病(psoriasis))以及自身免疫病(如1型糖尿病、川崎病(Kawasaki disease)、格雷夫病(Graves’disease)、硬皮病(Scleroderma))。
在其他应用中，本发明的支架可以用于产生疫苗。在一个实施方案中，疫苗剂可以连接于PNA以形成类似于L-PNA的PNA，如本文中描述的。疫苗剂可以是类似于引起疾病的微生物的结构部分，如弱化的或杀灭形式的微生物或其毒素。对PNA的附着可以使用标准化学技术在本文中讨论的PNA位置进行。例如，来自炭疽病和霍乱的抗原可以连接于支架，其可以与佐剂组合以刺激抗体产生。本发明的组合物可以用于治疗疾病状态或可以预防性使用。
可以由本发明的组合物生产的疫苗的另一实例将是PrevnarTM(在一些国家也称为)的功能等效物或与其相似。PrevnarTM是由Wyeth生产的疫苗并且由Pfizer销售，其保护人(通常在2、4、5和12-15月龄施用)免于某些可能引起严重疾病如脑膜炎和败血症的肺炎球菌。
PrevnarTM是七价疫苗，意味着其具有来自不同血清型的七种不同碳水化合物。包括在所述疫苗中的肺炎链球菌(S.pneumonia)的七种血清型(株)(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)是在引入该疫苗之前最通常在儿童中引起这些严重疾病的株。可能源自肺炎球菌的这些碳水化合物被连接到载体蛋白以产生疫苗。本技术的一个应用将是用本发明的L-PNA：PNA(GAP)替代所述疫苗的载体蛋白。在一个实施方案中，用于商业疫苗的相同碳水化合物可以被连接到L-PNA：PNA(GAP)的L-PNA链。实践中，可以将不同的碳水化合物容易地连接于不同L-PNA序列。如果希望增加疫苗中代表的株数目，使用本发明的L-PNA，可以将七种或甚至更多不同的碳水化合物连接于L-PNA：PNA(GAP)。
其他疫苗可以类似地通过类似于引起疾病的微生物的试剂，如减弱或杀灭形式的微生物或其毒素附加于PNA制备。常见疫苗包括，但不限于，各种流感疫苗株，各种肝炎疫苗、霍乱疫苗、腺鼠疫(bubonic plague)疫苗、脊髓灰质炎疫苗、黄热病疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、破伤风疫苗(tetanus vaccube)、白喉疫苗、腮腺炎疫苗、伤寒疫苗、肺结核疫苗和狂犬疫苗株。这样的疫苗可以通过以下方式制备：将适当的试剂附加于本发明的PNA，然后将其用于形成L-PNA：PNA(GAP)大分子。其他疾病状态的疫苗可以通过将适当的试剂连接于PNA来生产。此外，针对多种病况的疫苗可以通过将多种试剂连接于PNA(其可以随后用于形成L-PNA：PNA(GAP)大分子)来制备。
本文提供的是治疗或抑制哺乳动物中疾病状态的方法，所述方法是通过向哺乳动物施用治疗有效量的一种或多种所述的具有能够结合细胞表面蛋白质的取代基的L-PNA：PNA(GAP)大分子。在一些实施方案中，细胞表面蛋白质是跨膜蛋白质、脂质锚定蛋白质、外周蛋白质、细胞受体或黏附蛋白。在一些方面，哺乳动物可以是啮齿动物(小鼠或大鼠)、马科动物、猫科动物、犬科动物或灵长类动物。在一些实施方案中，所述的灵长类动物可以是人。
如本文使用的，术语“能够结合细胞表面蛋白质”是指可以作为细胞表面蛋白质的配体的取代基。本身(即，当取代基不结合L-PNA：PNA(GAP)大分子时)可以作为或作为细胞表面蛋白质的配体的任何取代基在本文中被认为是合适的取代基。
在一些实施方案中，所述方法是涉及减少哺乳动物中的转移的治疗方法。在一些实施方案中，这些方法通过向哺乳动物施用治疗有效量的一种或多种所述的具有能够结合细胞表面蛋白质的取代基的L-PNA：PNA(GAP)进行。在特定实施方案中，施用以减少转移的治疗剂是具有15个环-RGDγ取代基的L-PNA：PNA(GAP)。在一些方面，所述哺乳动物可以是啮齿动物(小鼠或大鼠)、马科动物、猫科动物、犬科动物或灵长类动物。在一些实施方案中，所述的灵长类动物可以是小鼠。在一些实施方案中，所述的灵长类动物是人。
还描述的是使用所述的支架检测细胞表面蛋白质的存在的方法。在一些实施方案中，所述的方法可以通过向受试者施用所述的能够结合目标细胞蛋白质靶标的L-PNA：PNA(GAP)并且检测施用的L-PNA：PNA(GAP)来进行。为了促进检测，在一些实施方案中，L-PNA：PNA(GAP)可以用报告分子标记。例如，L-PNA：PNA(GAP)可以被放射性标记，与荧光标记缀合，被生物素化，与DOTA、DTPA缀合，或由放射性核素组成。其他可接受的标记是本领域内广泛已知的。在一些方面，受试者可以是啮齿动物(小鼠或大鼠)、马科动物、猫科动物、犬科动物或灵长类动物。在一些实施方案中，所述的灵长类动物可以是人。
还如本文使用的，一个或多个方法步骤的描述不排除在组合的所述步骤之前或之后存在其他方法步骤。其他步骤也可以介于描述的那些步骤之间。此外，要理解，对方法步骤或成分编字码或排序是鉴别离散的活性或成分的常规方式，并且列举的字码可以以任何合理的顺序排列。
在一些数值存在于本申请中的情况下，要理解，范围包括所有整数及其在陈述的范围界限内的部分。数值范围明确包括小于陈述的端点的数值以及在陈述的范围内中的那些。例如，1-3的范围，包括整数一、二和三以及介于这些整数之间的任何分数。
以下实施例进一步说明本发明，但当然，不应该被认为以任何方式限制其范围。
实施例1
该实施例表明配体修饰的PNA缀合物的初始文库的产生和根据本发明的一个实施方案的缀合物的多价状况。
为了产生配体修饰的PNA缀合物(L-PNA)的多价文库，将高亲和力AR拮抗剂，黄嘌呤胺同类物(XAC)，经由从赖氨酸衍生的γ-侧链(γ-Lys)缀合于PNA寡聚物(图1A)。连接于L-PNA寡聚物内的该侧链的配体不干扰L-PNA通过常规沃森克里克碱基配对结合互补DNA序列的能力。合成一系列PNA寡聚物(各自由12个核碱基组成)，其中将一个、两个或三个γ-Lys侧链被结合入所述序列中(图1B-1D)。在γ-Lys侧链末端的伯胺充当XAC配体的连接点。插入在胺和XAC之间的两个微型-PEG(8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)接头最小化与受体蛋白的空间排斥(图7-18)。以此方式产生三种L-PNA，各自含有1、2或3个XAC配体，分别称为A型、B型和C型(图1B-1D)。将各L-PNA与被设计成结合1至5个L-PNA的互补DNA序列退火，产生多价L-PNA：DNA双链体文库(图2A)。总体上，产生15种复合体(3种不同PNA复合于5种不同DNA)从而系统地横越1至15个XAC配体的配体化合价。各L-PNA：DNA复合体根据其个体成分命名。例如，沿DNA骨架携带3个L-PNA单元的A型构建体称为A3D，其含有3个配体(参见图2A)。
使用已建立的基于A2AAR膜的放射性配体抑制测定对文库的每个成员测试结合亲和力以探索增加配体价和密度对蛋白结合的影响。尽管这样的方案在GPCR行为的研究中成为标准，但多种蛋白质结合状态的存在可能使得膜结合测定数据复杂化。这些结合等温线是这些状态的复合，并且特殊情况可以突出显示多个结合阈值(即IC50或Ki值)。然而，通常将其观察为单相结合等温线。仅观察到单相等温线，这提供各化合物的单个的结合亲和力。这些亲和力显示在图2A和图2B中绘制的多价状况中。
分析来自多价筛选的数据的一种方式是计算文库的各个成员的β-参数(β＝Kd(L-PNA：DNA)/Kd(单体配体))，其中β描述了多价支架相对于单价配体的益处，并且较低的值表明由于多价效应所致的增强的结合。多价文库的各个成员的计算的β值显示在图2A中的IC50值以下。这些值揭示了一些重要特征。与单独配体相比，一个配体与L-PNA：DNA(A1D)支架的连接降低结合亲和力，将更多配体加入支架快速克服任何结合损失。该观察结果表明多价效应。在β值确定文库中最有效地结合剂的同时，亲和力相对整个数据集的改善的模式表明，随着配体数量增加，发生不同类型的多价效应。
因此，开发新的方法来分析来自多价筛选的结果。参数η定义为当将配体价的变化标准化时任意两个L-PNA：DNA复合体之间结合亲和力的变化。在比较两个复合体时，约1的η值表明个体配体结合亲和力大致相同，并且结合的改善仅是由于配体数的整体增加。大于2的η值提示个体配体结合亲和力的统计学显著增加，其超过仅具有更多配体所预期的改善。当以此方式检查时，图2B中的多价状况表明多数η值接近1。然而，当将A1D与A2D(η＝4.7，p＝0.016)或B1D(η＝19.8，p＝0.012)比较时，η值远超过1。多价状况的该分析的主要结论是，当从1价变为2个配体时，出现配体-受体结合的最显著改善。
实施例2
该实施例表明根据本发明的一个实施方案的L-PNA：DNA复合体的结合上的配体间隔。
获得的初始结果表明，携带两个XAC配体的L-PNA：DNA复合体比相应单价复合体显著更好地结合。接着，评估配体间隔的作用。检查一系列二价构建体，其中两个携带XAC配体的γ-Lys侧链沿PNA骨架系统地移位(图3A-3B)。为了最小化负电对DNA磷酸二酯骨架的静电影响，将DNA用序列互补的PNA替代。得到确认的是，PNA：PNA双链体保持双螺旋结构中的常规核碱基配对。实验结果表明，DNA可能对结合具有消极作用，因为A1P比A1D有效8倍(p＝0.0015)。除了添加在末端以促进水溶性的赖氨酸残基之外，得到的L-PNA：PNA双链体呈电荷中性并且不会发生与含有受体的膜上的磷酸根基团的电荷-电荷排斥。总计，产生四种B1P复合体(B2，31P、B6，101P、B2，101P和B1，141P)，配体之间存在各种距离，其中L-PNA骨架上的侧链由1、4、8或13个核碱基分开(图3A)。
二价L-PNA：PNA复合体均以比A1p高的亲和力结合于A2AAR(η＝1.6至2.5，p≥0.007)(图3b)。在该系列的二价构建体中，最窄的(B2，31P)和最宽的(B1，141P)复合体是最弱的结合剂。B6，101P和B2，101P复合体以更高亲和力结合，在此水平从实验上彼此不能分辨(p≥0.05)。尽管与之前的多价筛选相比较不显著，但结合数据和η值表明，该系列的二价复合体中的配体结合强度取决于展示配体的侧链之间的距离和角度。
还进行实验以评价PNA：PNA复合体与PNA：DNA复合体的热稳定性。这些实验在600μL比色皿中在Agilent 8453UV-Vis分光光度计上进行。PNA和DNA的5μM溶液(225μL)在TRIS(100mM)中制备并被加入至比色皿中。在90℃加温5min后，将比色皿以1°/min的速率冷却。将260nm的吸光度相对温度绘图，曲线拟合以获得解链温度。表1中的结果表明，PNA：PNA复合体具有比PNA：DNA复合体高的热稳定性。
表1-核酸复合体的热稳定性
实施例3
该实施例表明根据本发明的一个实施方案的L-PNA：PNA的理论模型和对接(docking)。
基于来自多价筛选的数据，似乎可能的是二价复合体结合A2A受体的同源二聚对。为了更详细研究该可能性，开发粗的统计学力学模型以解释图3B中的实验结合数据，并且提示二聚体相对于单体受体的相对丰度。该模型检测检查单价和二价侧链组合沿L-PNA：PNA骨架的所有78种可能构型结合理论受体的相对能力。连接配体的侧链的接头基团是灵活的，因此将可接近各侧链的构象状态建模为具有自避行走的聚合物。将受体建模为两个同心圆，外部圆表示受体的排除的体积部分，并且内部圆表示其配体结合位点。不同受体密度全体置于代表脂双层膜的二维平面中。分配受体二聚体和单体的离散比，从全部单体至全部二聚体。检查L-PNA：PNA构建体的各侧链构型对受体整体的结合潜能。
通过将固定的能量分配到各个相互作用，仅分散数量的不同结合状态存在于L-PNA：PNA和受体之间。单价(A1P)和二价(B1P)复合体的这些状态的实例在图4A和4B中突出显示。在该模型中，对于其中存在结合事件的各状态，假定配体结合受体的焓相同。因此，在后续计算中仅考虑不同L-PNA：PNA之间的受体结合的熵的变化。该模型确定各可能状态出现的可能性，计算各蛋白整体的状态的密度，并且随后利用表示受体二聚化的可能性的能量术语(基于结合的熵)提供配分函数。最后，计算各L-PNA：PNA构型的整体中的配体结合的受体的分数。在图4C中，为四个不同数据集提供这些数据中的一些。图中的各个数据集(▲、■、●)由以二聚体与单体的离散比(D)与受体相互作用的L-PNA：PNA二价复合体的66种不同组合组成。X表示与受体相互作用的12种可能的单价L-PNA：PNA。
基于在模型中分配的受体二聚体(D)的百分数，预测的二价L-PNA：PNA的结合有明显不同。例如，当仅2％的受体作为二聚体存在(D＝2％)时，在整个66种可能的二价L-PNA：PNA中存在低分数的结合的受体(●)。如果98％的受体是二聚体(D＝98％)，则预测的结合的受体的分数远远更高(▲)。二价L-PNA：PNA存在这些差异。对于12种可能的单价L-PNA：PNA(x)，结合的受体的分数不随二聚体的百分数增加而变化，因为单个配体平等地结合所有状态的受体，而不论其是二聚体还是单体。
将实验数据与理论模型比较以评估受体二聚体的百分数。图4C顶部的红色线条表明此处图3B的实验的二价L-PNA：PNA排列在模型的66种可能的L-PNA：PNA构型中。下一目标是确定哪个数据集(▲、■、●或其他的)与实验值具有最佳拟合。为了进行该评估，将图3B的IC50值之比直接与模型中相同的L-PNA：PNA复合体之比相比。该比率的实例由图4C中的r表示，其是B2，31P与B6，101P的IC50值之比。将实验数据的r与各数据集中所述模型预测的相同比率相比。总计，存在六个与模型的不同数据集中的类似比率比较的源自图3A-3B的实验确定的r比率。实验和理论值之间的差异被分配误差(ε)。实验和理论之间误差的幅度用作分配受体二聚体的最可能的百分数的引导(图4D)。
分析提示，二价L-PNA：PNA结合以二聚体存在的A2A受体。受体主要以单体存在的模型不导致观察到的实验数据(ε≥40％)。实验和理论之间的最佳重叠在80-95％的受体以二聚体存在的范围内(参见图4D中的“理想区域”)并且剩余部分为单体(ε≤20％)。
分子模型进一步表明，二价L-PNA：PNA能够结合A2A蛋白的二聚体，而在支架和蛋白质之间没有过度的拉力或明显的空间冲突。建立二聚的A2AAR蛋白并且建模以与B6，101P相互作用(图5A)。A2AAR单体的结构基于与受体结合的XAC的高分辨率X射线晶体结构(PDB 3REY)(Dore，A.S.等人，Sturcture 19，1283-1293(2011))，并且原体之间可能的接触区域通过蛋白质-蛋白质对接确定。产生PNA：PNA双链体模型，并且通过与在多价文库中使用的接头相同的接头与结合的XAC配体连接。然后将构建体优化至能量最小并且在存在(图5A)或不存在(图5B)膜的情况下展示。分子和统计模型二者都提示，接头的长度足以允许以最佳侧链放置接近两个结合位点。此外，双链体骨架具有足够的空间以停留在蛋白质表面而没有空间排斥。这些模型表示结合的静态快照。与侧链相关的灵活性的更清楚的表示在图5C和5D中显示。建议的A2AAR二聚体的模型用两个二价L-PNA：PNA复合体覆盖。展示来自统计模型的侧链构象的子集。如图5C中所示，B2，31P的侧链不能很好地重叠以同时与建议的A2AAR二聚体的两个结合位点相互作用。在B6，101P(图5D)中，更有利地将侧链布置成同时结合二聚体。这与我们的实验数据匹配；B6，101P以比B2，31P更高的亲和力结合A2AAR(216nM相对324nM的IC50值，图3B)。
实施例4
该实施例表明根据本发明的一个实施方案的L-PNA：PNA多价状况。
L-PNA：DNA和L-PNA：PNA的比较结果表明，DNA可能对以低价结合受体具有有害作用。二价L-PNA：PNA双链体用于检测配体内距离对与A2AAR的结合的影响。该方法扩展至使用较长PNA作为DNA的替代的较高价。因此，开发可以被制成具有48个碱基的长度的修饰的PNA构建体以支持多至四个互补L-PNA的结合(各L-PNA具有一至三个携带XAC配体的侧链)。构建含有16种L-PNA：PNA的第二文库并用于通过确定文库的各个成员的结合亲和力产生多价状况。
L-PNA：PNA的多价文库在图6A中显示，跨1至12个XAC配体的价。还在该文库中探索两种不同二价B型PNA的多价效应。之前，B6，101P和B2，101P表明当作为1∶1L-PNA：PNA复合体被检查时实验上不可区分的对A2A的结合亲和力(图3B)。在更好地理解了A2A受体形成二聚体的可能的情况下，特别有趣的是观察这些构建体是否会在较高价显示增强的结合。
筛选该新L-PNA：PNA文库的结果在图6B中提供。类似于最初的多价筛选，当比较一至两个配体的价时(η＝2.5)，存在配体结合效率的显著增强，并且对于多数部分，结合亲和力的所有其他改善可以归因于配体价的相应增加显著地，在多价状况中存在明显不同的一个数据点：B6，104P的结合亲和力比其任一个周围近邻都显著更好(β＝0.13)。该具体L-PNA：PNA具有八个携带XAC的侧链的价，在结合含有48个碱基的互补PNA序列的4个L-PNA上成对排列。二价B6，10PNA上的配体内间隔应该优化以结合如之前所示的A2A二聚对(图3B)。具有相同大小和价的高度相似复合体(即B2，104P)显著更弱地结合(3倍，β＝0.34)，如其他具有较低或较高价的L-PNA：PNA那样。对B6，10的系列数据的更密切检查表明结合亲和力随结合互补PNA的相继添加而相继改善(关于IC50值，B6，101P＞B6，102P＞B6，103P＞B6，104P)。有趣的是，B2，10的相同系列没有显示在与A2A结合方面的同样的相继改善。利用B6，104P的进一步研究显示，其在功能测定中保留拮抗剂活性，并且其对A2A受体具有选择性(相对A1和A3)，显著超过单价XAC配体(图6A和表2)。这些结果都提示，B6，104P具有合适的尺寸和配体内间隔以同时结合A2A受体的多个二聚对。
表2：
多价的占有者是另外的非选择性配体的选择性的增加。将A2A过表达的膜的中B(6，10)4P的结合亲和力与A1和A3的AR同系物比较。将多价构建体的选择性与最近发表的XAC(其本身对于这些受体没有选择性)的文献值相比较(Kecskes等，Bioconjug Chem 22，1115-1127(2011))。
实施例5
该实施例表明根据本发明的一个实施方案的基于PNA的多价纳米支架的制备和多巴胺D2受体活性。
携带已知D2R激动剂，(±)-PPHT的配体修饰的肽核酸的文库(Soriano，A.等人，J.Med.Chem.2009，52，5590-5602；Hacksell，U.等人，J.Med.Chem.1979，22，1469-1475；Merali，Z.等人，Eur.J..Pharmacol.1990，191，281-293；Bakthavachalam，V.等人，J.Med.Chem 1991，34，3235-3241)(图25B)通过将合成的LKγ单体系统地插入12-残基的PNA寡聚物中产生(图25A)。为了连接配体，使用三种微型-PEG(8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)接头，使结合的LKγ单体的赖氨酸结构部分从主PNA骨架伸出。然后将谷氨酸修饰的(±)-PPHT缀合于微型-PEG N-末端以产生所需的L-PNA。L-PNA的配体价通过分别结合1、2或3个LKγ-PNA单体而从每个L-PNA 1个配体(A-型)变成每个L-PNA 2个(B-型)和3个(C-型)配体(图25C)。在A-型L-PNA构建体中，配体被连接到中间残基，而在B-型中，配体被连接在残基2和6处。C-型构建体含有3个配体，其连接在残基2、6和10处(图25C)。然后根据常规沃森克里克碱基配对将L-PNA与互补PNA寡聚物(cPNA)退火，提供具有限定的价、配体间隔和定向的多价纳米支架文库(图25A)。已经表明，当靶向膜蛋白如GPCR时，L-PNA：PNA双链体相比L-PNA：DNA是优选的。该优选性可能是由于在L-PNA：DNA的情况下阴离子DNA骨架和细胞表面之间存在的电荷斥力的最小化。为了识别文库构建体，根据构成部件来提及各L-PNA序列；例如，与其12个残基的cPNA退火的单个A-型L-PNA称为A1(图25C)。类似地，A2复合体含有沿24个残基的cPNA退火的2个A-型L-PNA单元(图25D)。总计，系统地产生15种独特的L-PNA：PNA复合体并且其跨1-15个配体的价(图26)。
使用全细胞β-抑制蛋白招募测定测试L-PNA：PNA文库的各成员的D2R活性(vanDer Lee，M.M.等人，J.Biomol.Screen 2008，13，986-998；，R.B.等人，Mol.Pharmacol.2014，86，96-105)，并且数据概述在表3和图26中。总体上，复合体高度有效并且表明配体价的增加与改善的EC50值相关。特别有趣的是，当价从1增加至2个配体，特别是从A1至A2以及从A1至B1时，EC50值显著改变。使用η值(近来引入的术语(Dix，A.V.等人，J.Am.Chem.Soc.2014，12296-12303))进一步分析这些数据，以评价当将配体价的改变标准化(即比较顺序的A-型L-PNA：PNA复合体)时相同类型的L-PNA：PNA复合体之间D2R活性的变化。对此，约1的η值表明D2R活性的改善与配体价的增加成比例。备选地，大于2的η值表明结合另外的配体导致D2R激活的增加，所述增加不能仅归因于配体含量的增加。使用η参数来分析D2R活性，对于A1至A2和A1至B1的转变，在从1至2个配体的转变中获得2的η值(图26)。这表明将价从1增加至2个配体显著增强D2R活性。有趣的是，A2和B1构建体中的配体间隔都不影响D2R活性。相对而言，将第三个配体添加至12个残基的L-PNA C1对D2R活化具有稍微有害的影响。这可能是由于空间拥挤所致，其不允许有利的配体-受体相互作用。其余构建体的η值接近1，表明超过两个配体的配体价的增加少量地提高D2R活性。还使用不含有(±)-PPHT配体的乙酰化的A型PNA来检查非特异结合效应。未观察到该构建体的任何非特异结合(数据未显示)。综上，这些数据表明，当配体价从1增加至2时观察到D2R的最显著活化，提示受体二聚体的形成对于D2R活性是重要的。重要的是注意，可能的是PNA构建体的存在驱动二聚体形成，并且受体在不存在配体的情况下不结合。
表3
PNA支架的高度可程序化的和多用途的性质使其自身适于以可预测的方式快速组装多价工具。严格和准确控制PNA支架的配体含量、密度和空间取向的能力代表相对研究GPCR的常规二价和多价方法的明显优势。在该工作中，基于L-PNA：PNA双链体的多价纳米支架系统用于探究多价对D2R活性的作用。制备15种携带已知D2R激动剂(±)-PPHT的独特L-PNA：PNA复合体的文库，并且评价D2R活性。在A1至A2和A1至B1构建体中价从1增加至2个配体时观察到D2R活性的显著增加。使用η值以进一步检查A1至A2或B1变迁，得到的结论是，D2R活性的显著增加是由于不能仅归因于配体价的变化的多价效应。最可能的解释是，A2和B1的两种配体结合D2R的二聚体。在剩余构建体中结合另外的配体与配体的增加成比例地提高活性。这些数据提示，离散的受体二聚体的形成对于D2R活性是重要的，但另外的配体不显著增强信号传导。越来越多的证据表明寡聚的GPCR在疾病病理学中的重要性，L-PNA支架代表重要的药理学工具以探索多价配体展示对GPCR活性的作用。
一般实验步骤和材料
除非有相反陈述，以下步骤和材料用于上述实验。
材料和仪器.除非如所示的，在不进一步纯化的情况下使用商品级试剂和溶剂。Boc-保护的aegPNA单体购自PolyOrg，Inc.(Leominster，MA，USA)。HMBA树脂，100-200目，1％DVB获得自Advanced Chemtech(Louisville，KY，USA)。Boc-mPEG购自PeptidesInternational(Louisville，KY，USA)。LKγ-PNA胸腺嘧啶单体根据公开的步骤合成。放射性配体[3H]CGS21680和[125I]I-AB-MECA购自PerkinElmer(Waltham，MA，USA)，并且[3H]R-PIA购自Moravek Biochemicals(Brea，CA，USA)。所有其他试剂获自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。PNA寡聚物合成在Applied BioSystems 433A自动肽合成仪上进行。PNA寡聚物的纯化使用X-Bridge Prep BEH 130 C18 5μm(10x 250mm)柱在Agilent 1200sHPLC上进行。典型流速是4mL/min。HPLC溶剂由HPLC级乙腈：MilliQ水(9∶1)和0.10％TFA水溶液组成。监测波长220nm，260nm，和315nm。在LC/MSD TOF(Agilent Technologies，SantaClara，CA，USA)上获得高分辨率质谱(HRMS)。DNA寡聚物购自Integrated DNATechnologies，Inc.(Coralville，IA，USA)并且在不进一步纯化的情况下使用。PNA和DNA的UV定量使用Agilent 8453UV-Vis分光光度计进行。
缩写.(ACN)，乙腈；(Boc)，叔丁氧基羰基-；(CGS21680)，2-[对(2-羧基乙基)苯基-乙基氨基]-5′-N-乙基甲酰胺基腺苷；(DMEM)，Dulbecco’s改进的Eagle培养基；(DCM)，二氯甲烷；(DMF)，N，N-二甲基甲酰胺；(DMSO)，二甲亚砜；(ESI-MS)，电喷雾电离质谱；(HPLC)，高效液相色谱；(I-AB-MECA)，4-氨基-3-碘苄基)腺苷-5′-N-甲基-脲酰胺；(MBHA树脂)，4-甲基苯并羟胺树脂；(NMP)，N-甲基-2-吡咯烷酮；(mPEG)，8-氨基-3，6-二氧杂辛酸；(PBS)，磷酸盐缓冲盐水；(R-PIA)，N6-[(R)-苯基异丙基]腺苷；(PNA)，肽核酸；(TEA)，三乙胺；(TFA)，三氟乙酸；(TfOH)，三氟磺酸；(TRIS)，三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐缓冲盐水；(XAC)，黄嘌呤胺同源物；(ZM241385)，4-[2-[7-氨基-2-(2-呋喃基)-1，2，4-三唑并[1，5-a][1，3，5]三嗪-5-基-氨基]乙酚。
PNA寡聚物的制备.通过在DCM中溶胀并下调加载具有Boc保护的N，N-二甲基-L-赖氨酸的树脂至0.1mmol/g容量来制备MBHA树脂(0.3mmol/g)。通过固相肽合成根据公知步骤以5或25μmol规模制备PNA寡聚物。
序列.用于XAC-缀合的PNA的序列：AGT-AGA-TCA-CTG。互补反平行序列：CAG-TGA-TCT-ACT。注意，对于L-PNAs B(2，3)和B(1，14)，分别将缀合的PNA序列修饰为AGT-AGA-TCA-TTG和T-AGT-AGA-TCA-CTG-T。因此调整互补序列。
一般树脂裂解.完成PNA合成或固相偶联后，将PNA-结合的树脂转移至玻璃反应容器中并用DCM洗涤，然后用TFA洗涤。将树脂用TFA溶胀。去除溶剂并且加入间甲酚(150μL)、茴香硫醚(150μL)、TfOH(300μL)和TFA(900μL)的溶液并让其处于树脂上60min。将溶液排入闪烁小瓶。将其重复总共3次洗涤，每次将洗脱液收集入闪烁小瓶。浓缩汇集的溶液，转移至微量离心管，并且以1∶10之比使用二乙醚沉淀。将得到的片状灰白色固体用二乙醚洗涤3次并在真空下干燥。将得到的残基用2∶1水：CAN稀释并进一步在反相HPLC上纯化。
一般缀合步骤.将XAC配体(N-(2-氨基乙基)-2-[4-(2，3，6，7-四氢-2，6-二氧代-1，3-二丙基-1H-卟啉-8-基)苯氧基]-乙酰胺，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)经由方形酸缀合于PNA寡聚物支架上的游离氨基结构部分。这通过两种方法之一进行：
1)将具有游离胺的含有5μmol PNA的树脂在玻璃反应容器中用NMP溶胀1h。这之后，将溶剂排出并用新鲜NMP(500μL)替代。为此，加入三乙胺(300μmol，60当量)和3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮(150μmol，30当量)。将容器密封并且搅拌3h。然后将树脂洗涤(2xNMP，2x DCM，和2x NMP)。将预溶解的含有XAC(100μmol，20当量)，1∶9DMSO∶NMP和TEA(150μmol，30当量)的溶液加入至树脂。将容器密封并且搅拌直到完成。通常，A-型L-PNA反应18h，同时允许B和C L-PNA 36h以偶联。然后如前述将树脂洗涤并随后从树脂裂解缀合的PNA。
2)在2mL离心管中，将冻干的裂解的PNA溶解在最小的2∶1无水DMSO∶乙醇中。为此，加入三乙胺(60当量)和3，4-二乙氧基-3-环丁烯-1，2-二酮(30当量)。将容器用氮冲洗，密封并搅拌3h。浓缩溶液并将残基用二乙醚洗涤(3x 2mL)，并在真空下干燥，获得方形酸-缀合的PNA中间体，为灰白色固体。将XAC(20当量)，2∶1无水DMSO∶乙醇和三乙胺(30当量)的溶液加入至方形酸-缀合的PNA中间体中。将容器用氮冲洗，密封并搅拌直到完成。通常，A-型L-PNA反应18h，同时允许B和C L-PNA 36h以反应。将溶液通过反向HPLC直接纯化。
一般HPLC纯化.PNA和缀合的-PNA残基通过反相HPLC使用10x250mm WatersXBridge制备型BEH130 C18 5μm反相柱在Agilent 1200s HPLC上纯化。监测波长220nm，260nm和315nm。典型的流速是4mL/min。HPLC溶剂由ACN∶水(9∶1)和0.15％TFA水溶液组成。
使用以下方法之一纯化PNA残基：
35℃恒温器。梯度保持在0％ACN 0-2min，10％ACN 5min，20％ACN 20min，然后用100％CAN洗涤5min。
35℃恒温器。梯度保持0％ACN 0-1.9min，10％ACN 2min，35％ACN 25min，然后用100％CAN洗涤5min。
50℃恒温器。梯度保持0％ACN 0-1.9min，10％ACN 2min，40％ACN 35min，然后用100％CAN洗涤5min。
PNA寡聚缀合物的定量.将冻干的PNA寡聚物溶解在水中。在90℃加热样品5min后通过UV-VIS光谱确定等分部分的吸光度。这一式三份进行。使用从Applied Biosystems(Life Technologies，Grand Island，NY)获得的类似DNA寡聚物的消光系数，确定浓度。
用于形成PNA：DNA或PNA：PNA双链体的一般退火条件.将无RNA/DNA酶离心管，PNA，DNA和TRIS缓冲液(pH 7.5)在室温合并。最终TRIS缓冲液浓度是100mM。基于数量或DNA中的重复12聚体序列加入PNA的等效物。例如，为了产生PNA：DNA multi5，使用5∶1摩尔比的PNA∶DNA。将溶液加热至90℃，保持5min，然后经3h的时期让其缓慢冷却至25℃。
L-PNA：PNA双链体的LCMS分析.为了确认L-PNA：PNA复合体是一个物种，并且不是聚集体，使用质谱。分析两种复合体并且通过该方法确认：B2P和B(6，10)4P。
通过反相HPLC使用电喷雾电离质谱法(ESI MS)作为检测方法从单体分离PNA-复合体。HPLC是Waters 1525u，以200μL/min的流速操作。溶剂A是水中1％乙腈，具有0.2％甲酸和0.1％TFA。溶剂B是甲醇，具有20％乙腈以及0.2％甲酸和0.1％TFA。洗脱程序以0％B开始并且在9min内增加至100％B，并且最后在100％B保持3min。HPLC柱是具有2.1mm的内径和150cm长度的Bruker-Michrom PLRP-S柱。
ESI/MS是Waters LCTPremiere，其以阳离子V-模式操作。ESI毛细管电压是3.4KV。多电荷谱用MaxENT1去卷积。
B2P.将成分(B(2，10)L-PNA和补体PNA)分别注射入LC/MS系统，并且记录它们各自的保留时间和多电荷ESI/MS谱。较大PNA(补体)具有8.99min的暴露时间，基峰是在975.9Da的7+离子并且去卷积的分子量是6824。以8.49min的暴露时间洗脱的较小PNA(B(2.10)L-PNA)，基峰是在699.1Da的5+离子并且去卷积的分子量是3490。观察到PNA-复合体暴露时间为9.07min并且在该暴露时间同时观察到个体成分。较低质量成分的ESI/MS在1164.5Da再次显示对于3+带电离子的基峰。较大成分的ESI/MS谱获得与之前观察的相同的分子量，但电荷分布与基峰完全不同，变为在1138.4Da的6+离子。该电荷状态分布的改变与相对于单体形式，在复合体中以根本不同的状态存在的较大PNA一致。
B(6，10)4P.成分(B(6，10)L-PNA和补体PNA)分别注射入LC/MS系统，并且记录它们各自的保留时间和多电荷ESI/MS谱。较大PNA(补体)具有6.4min的暴露时间，基峰是在1719.3Da的8+离子并且去卷积的分子量是13764。以8.6min的暴露时间洗脱的较小单体(B(6，10)L-PNA)，基峰是在1307.6Da的4+离子，并且去卷积的分子量是5226.4。观察到PNA-复合体的暴露时间为10.0min并且在该暴露时间同时观察到个体成分。较低质量成分的ESI/MS在1307.6Da再次显示对于4+带电离子的基峰。较大成分的ESI/MS谱获得与之前观察的相同的分子量，但电荷分布与基峰完全不同，变为在1375.8Da的10+离子。该电荷状态分布的改变与相对于单体形式，在复合体中以根本不同的状态存在的较大PNA一致。
细胞培养和膜制备.稳定表达重组hA1和hA3AR的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，和稳定表达hA2AAR的HEK293细胞在补充有10％胎牛血清，100units/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素和2μmol/mL谷氨酰胺的Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)和F12(1∶1)中培养。此外，将800μg/mL遗传霉素加入至A2A培养基，同时将500μg/mL潮霉素加入至A1和A3培养基。收获后，将细胞均匀并悬浮在PBS中。然后将细胞在240g离心5min，并且将沉淀重悬在含有10mMMgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中。将悬浮液均匀并随后在14,330g在4℃超离心30min。将得到的沉淀重悬在Tris缓冲液中，与腺苷脱氨酶(3单位/mL)在37℃孵育30min。将悬浮也用电动匀浆器匀浆10sec，移液入1mL小瓶中并随后储存在-80℃，直到结合实验。使用来自Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，IL)的BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白浓度。
对A2A受体的竞争性放射性配体结合.进行竞争放射性配体结合实验以确定PNA缀合的结合亲和力。在竞争源自表达A2A的HEK细胞的细胞膜上A2A受体的结合中测试1nM至1000nM的PNA缀合物的浓度范围。4由细胞膜(100μL)，放射性配体(50μL)和PNA缀合物(50μL)构成的结合缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl2)中的测定溶液(200μL)在测试管中制备，将其在震荡水浴中在25℃孵育1h。此外，制备含有结合缓冲液而不是PNA缀合物或40μM腺苷-5’-N-乙基脲酰胺的测定溶液来分别测定总的和对于膜的非特异性放射性配体结合。放射性配体激动剂[3H]CGS21680用于所有A2A实验。[3H]R-PIA和[125I]I-AB-MECA分别用于A1和A3结合实验。孵育后，通过经玻璃滤纸快速过滤终止结合。然后将玻璃滤纸样品通过闪烁计数器(Tri-Carb 2810TR)读值以确定放射性配体结合。绘制每个配体浓度的计数并使用Prism(GraphPad，San Diego，CA，USA)曲线拟合以获得IC50值。各个实验提供过多的数据集比国内且使用7个不同浓度的双链体的L-PNA。将其一式三份重复。
利用流式细胞术(FCM)的荧光配体结合实验.将表达hA2AAR的HEK 293细胞在12-孔板(约200,000细胞/孔)中生长并在5％CO2的存在下在37°C孵育36h。当细胞的汇合达到80％(约4×105细胞/孔)时，将培养基用新鲜培养基替代并且在存在或不存在10μMZM241385的情况下加入B5Df，并将细胞进行FCM。注意使用购自IDT的Alexa FluorTM 488标记的DNA产生B5Df。
将表达A2AAR的HEK 293细胞与范围从1nM至50nM的不同浓度的B5Df孵育30min用于饱和结合实验。为了研究结合动力学，我们将表达A2AAR的HEK293细胞与30nM B5Df孵育5min至3h的不同时间间隔。在10μM ZM241385的存在下测量非特异结合。
在每个时间间隔的最后，去除培养基并将细胞用DPBS洗涤两次。洗涤后，向每孔加入0.5ml 0.2％EDTA溶液，并且将细胞在37℃孵育1min。细胞分离后，向每孔加入0.5ml培养基以中和EDTA。将细胞悬浮液转移至聚苯乙烯圆底BD Falcon管(BD，Franklin Lakes，NJ)并在23℃和400×g离心5min。离心后，弃上清，并将细胞用2ml PBS洗涤并在23℃和400×g再次离心5min。弃去上清后，将细胞悬浮在0.3ml PBS中并通过FCM分析。
通过使用FCM测量各个样品的荧光发射强度。将细胞悬浮液短暂涡旋，之后在Becton和Dickinson FACSCalibur流式细胞仪(BD，Franklin Lakes，NJ)上以488nm的激发分析。分析期间将样品维持在黑暗中以避免光漂白。在FL-1通道中以log模式获得MFI。每个样品分析一万个事件。使用Cell Quest Pro软件(BD，Franklin Lakes，NJ)收集数据。
关联结合结果通过将结合数据与单相关联方程y＝y0+(平台-y0)(1-ekx)拟合来分析，其中y0是当时间(x值)是零时的MESF(y值)，平台是无穷的时间的MESF，并且K是速度常数，以倒数min表达。
饱和结合结果通过将一个位点总的和非特异结合方程与结合数据拟合来分析。总的和非特异结合通过将总的结合数据与方程y＝BmaxX/(X+Kd)+(NS×X)拟合来分析并且y＝NS×X用于非特异结合数据，其中Bmax意为以MESF单位的最大特异结合，Kd是以nM计的平衡结合常数，并且NS是非特异性结合的斜率。
测量的荧光强度利用减去在不存在任何AR配体的情况下的HEK 293细胞的自发荧光值来收集。
环AMP积累测定.将表达A2AAR的CHO细胞种在24-孔板中并且在37℃孵育过夜。次日，去除培养基并用含有50mM HEPES，10μM咯利普兰，3U/mL腺苷脱氨基酶，和增加的浓度的已知激动剂(CGS21680)的DMEM替代。在加入激动剂之前20min加入怀疑的拮抗剂(B(6，10)4P)。去除培养基，并且将细胞用200μL的0.1M HCl裂解。按照试剂盒提供的说明，将100微升的HCl溶液用于Sigma Direct cAMP酶免疫测定。使用BioTek ELx808 Ultra Microplatereader(BioTek，Winooski，VT)在405nm解释结果。
结合于A2AAR同源二聚体的PNA双链体的分子建模。
PNA：PNA双链体：
利用QUANTA(Accelrys)和CHARMM软件程序开发原子规模的，选择的PNA-双链体的计算机模型。螺旋构象源自γ-甲基化的PNA-双链8-聚体的NMR溶液结构(PDB登陆码：2KVJ)。除了含氮碱基外，需要开发拓扑结构用于所有其他分子成分。这些源自利用CHARMM程序提供的“所有27”组拓扑结构和参数。最后，将所有模型用CHARMM能量最小化以排除原子重叠以及优化键长度和角度。
hA2AAR模型：
为了获得更完整的hA2AAR的3D结构，使用在分子操作环境(MOE)套件中执行的同源建模工具和对于该受体亚型可获得的晶体数据建立模型。该模型基于高分辨率hA2AAR晶体结构(PDB ID：4EIY)(Liu，W.等人，Science 337，232-236(2012))，其中对于丢失的IL3的模板(Lys209至Gly218)是另一失活状态hA2AAR晶体结构(PDB ID：3REY)(Dore，A.S.等人，Structure 19，1283-1293(2011))。受体的细胞内C-末端尾(Leu308至Ser412)未建模，因为不存在有用的模板。之前公开的FRET研究表明，C-末端不参与A2AAR同源二聚化，并且因此将其从建模研究中排除是合理的。AMBER99力场用于蛋白建模并且Protonate 3D方法用于质子化状态分配。将最后的模型通过能量最小化改善，直到的RMS梯度。模型的空间化学质量使用MOE套件中执行的多种工具(拉马钱德兰图；骨架键长度、角度和二面角绘图；碰撞接触报告；旋转异构体的应变能报告)检查。
hA2AAR模型处XAC-接头的分子对接：
使用在MOE套件中执行的构建工具构建XAC-接头结构并且使用MMFF94x力场进行能量最小化，直到的RMS梯度。配体在hA2AAR模型处的分子对接通过套件的滑动包装部分的方式进行。使用hA2AAR模型的结合口袋中的关键残基，即Phe(EL2)，Asn(6.55)，Trp(6.48)和His(7.43)限定对接位点，并且在那些残基上集中 盒。配体的对接在严格的结合位点使用SP(标准精度)方案进行。最高的得分对接构象与A2AAR(3REY)处XAC的晶体位姿相当(Dore等人，supra)。尤其是，在黄嘌呤支架和受体之间的晶体中观察到的主要相互作用是保守的，而接头指向空腔外部，使得与EL2中的残基，如Lys150，Lys153和Gln157接触。
hA2AAR同源二聚体模型：
从我们的hA2AAR模型开始并且使用ZDOCK服务器的蛋白-蛋白对接工具(ZDOCK3.0.2)构建同源二聚体。从得到的位姿来看，弃去反平行二聚体或与跨膜蛋白质的性质不相容的位姿(即沿两个单体之间的主轴过度的倾向或改变)。对于选择的二聚体位姿，使用在MOE套件中执行的AMBER99力场，两个单体之间的接触区域通过能量最小化改善，直到 的RMS梯度。
基于单体相对取向，我们能够在由软件返回的数个合理位姿中鉴别两种最占优势的二聚体集群。第一集群收集在TM5，TM6和TM7之间具有界面的二聚体，第二集群二聚体在TM1，TM2和螺旋8之间具有界面。两种界面与通过之前关于A2AAR同源二聚化的文章(Fanelli，F.&Felline，A.Biochim Biophys Acta 1808，1256-1266(2011))中的计算研究提出的一些相当。对于大多数可能的二聚体，两个单体的结合位点之间的距离是考虑到单体之间的距离在不同二聚体之间相当并且功能性相对界面的毫无疑义地坚定非常困难，我们选择了属于第一集群的一个代表性的二聚体作为起始点，用于以下A2AAR同源二聚体-PNA双链体构建体的建模。
A2AAR同源二聚体-PNA双链体构建体：
为了合并hA2AAR同源二聚体的模型和PNA双链体的模型，进行以下步骤。XAC-接头结构置于其在形成二聚体模型的每个hA2AAR单体内拼接的构象中。然后，将PNA双链体模型手动置于二聚体的细胞外侧附近并且将各个XAC-接头结构的末端基团在位置X和Y处连接PNA链。最后，将构建体几何形状使用软件MOE和Amber12：EHT力场通过能量最小化改善，直到的RMS梯度。在最小化其间，保持hA2AAR二聚体和XAC支架固定，接头链自由移动并且将PNA双链体考虑为刚性体。
PNA寡聚物合成.
除非指明，在不进一步纯化的情况下使用商品级试剂和溶剂。通过在CH2Cl2中溶胀并将树脂用N，N-二甲基赖氨酸下调加载至0.1mmolg-1容量来制备树脂(MBHA，100-200目，1％二乙烯基苯，0.3mmol g-1，Advanced Chemtech)。Boc-保护的aegPNA单体购自PolyOrg。以5μmol规模在Applied BioSystems 433A自动肽合成仪上进行PNA寡聚物合成。在合成前将树脂用CH2Cl2溶胀104min。根据公开的步骤合成LKγ-PNA单体。32，35让活化的LKγ-PNA单体偶联90min。进一步处理三氟乙酸脱保护溶液也用于从LKγ-PNA残基去除N-Boc保护基团。LKγ-PNA单体的赖氨酸侧链(Fmoc)不相关地用DMF中的20％哌啶脱保护。当多个LKγ-PNA残基存在于PNA寡聚物中时(PNA-B和PNA-C；图3a)，将侧链上的伯胺脱保护并且串联偶联微型-PEG残基，接着通过偶联于(±)-PPHT。PNA寡聚物的纯化使用XBridge Prep BEH130 C18 5μm(10mm×250mm)柱在Agilent 1100HPLC上进行。在所有情况中，0.05％三氟乙酸水溶液和乙腈用作溶剂。
用于形成L-PNA：PNA双链体的一般退火条件.
在无RNA/DNA酶微量离心管中，将L-PNA，cPNA和PBS缓冲液在室温合并。基于数量或PNA中的重复12-残基序列计算PNA的等效物。例如，为了产生L-PNA：PNAmulti5，使用5∶1摩尔比的L-PNA：cPNA。将溶液加热至90℃，保持5min，然后让其经3h的时期缓慢冷却至25℃。
β-抑制蛋白(arrestin)募集测定.
激动剂-介导的β-抑制蛋白-2的募集使用DiscoveRx PathHunter互补测定确定(DiscoveRx Inc，Fremont，CA)，如之前描述的(Free，R.B.等人，Mol.Pharmacol.2014，86，96-105；Bergman，J.等人，Int.J.Neuropsychopharmacol.2013，16，445-458)。简言之，在384-孔黑色，澄清底部的平板中将稳定表达D2R的CHO-K1细胞以2625细胞/孔的密度种在细胞铺板(CP)培养基(DiscoveRx)中。24h的孵育后，将细胞用含有0.2mM焦亚硫酸钠的PBS缓冲液中的用多个浓度的化合物处理，并且在37℃孵育90min。然后根据制造商的方案将DiscoveRx试剂加入至细胞，接着在室温在暗处孵育60min。在Hamamatsu FDSSμ-细胞读数器(Hamamatsu，Bridgewater，NJ)上测量发光，并且使用FDSS软件收集数据。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，包括在此通过引用以好像分别和具体地指出每个参考文献通过引用结合并且以其整体在本文中陈述的相同程度结合。
术语“一个(a)”和“一个(an)”和“那个(the)”和“至少一个”以及类似的指示物在描述发明的上下文中(特别是在以下权利要求的范畴中)的使用要理解为覆盖单数和复数，除非本文中另有指示或与上下文明显矛盾。术语“至少一个”接着一列一个或多个项目的使用(例如，“A和B中的至少一个”)要理解为意为选自所列项目(A或B)的一种或所列项目(A和B)中的两种或多种的任意组合，除非本文中另有指示或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”要理解为开放的术语(即，意为“包括，但不限于”)除非另有说明。本文中值范围的陈述仅意在用作分别涉及落在该范围内的各个分开的值的速写方法，除非本文中另有说明，并且各个分开的值结合入说明书，就像其分别在本文中陈述一样。本文中描述的所有方法可以以合适的顺序进行，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。本文中提供的任何和所有实施例，或示例性语言(例如，“如”)的使用，仅意在更好地说明本发明并且不指对本发明的范围的限制，除非另有要求。说明书中没有应该被认为表示实践本发明所必需的任何未要求的要素。
本发明的优选的实施方案在本文中描述，包括发明人已知的用于进行本发明的最佳方式。在阅读上述说明书后，那些优选的实施方案的变化形式对于本领域技术人员可以变得显而易见。发明人预期技术人员酌情使用这样的变化形式，并且发明人预期本发明以除本文中具体描述的之外另外实践。因此，本发明包括适用法律允许的本文所述的权利要求陈述的主题的所有改进和等价形式。此外，上述要素以其所有可能变化形式的任意组合包括在本发明中，除非本文中另有指示或与上下文明显矛盾。
Claims (46)
1.包含多个连接的肽核酸(PNA)链的大分子，其中所述链中的每个独立地包含多个核碱基亚基，并且各PNA链与至少另一个PNA链经由氨基酸接头共价连接。
2.权利要求1所述的大分子，其中所述连接的PNA链形成线性排列。
3.权利要求1所述的大分子，其中所述连接的PNA链形成非线性排列。
4.权利要求1或3所述的大分子，其中所述连接的PNA链形成分支排列。
5.权利要求1、3、或4中任一项所述的大分子，其中至少一个氨基酸接头介导多于两个PNA链的连接。
6.在前权利要求中任一项所述的大分子，其中所述连接的PNA链各自独立地包含2至约50个核碱基亚基。
7.权利要求6所述的大分子，其中各连接的PNA链独立地包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核碱基亚基。
8.在前权利要求中任一项所述的大分子，其中所有所述连接的PNA链具有一致的长度。
9.权利要求1至7中任一项所述的大分子，其中至少一个所述连接的PNA链在长度上与至少另一个PNA链不同。
10.在前权利要求中任一项所述的大分子，其中至少一些所述连接的PNA链各自结合于至少一个互补PNA链从而形成双链PNA区段。
11.权利要求10所述的大分子，其中连接的PNA链与互补PNA链之比是：
约2:1至约10:1，
约3:1至约7:1，
约4:1至约6:1，或
1:1。
12.权利要求10或11所述的大分子，其中所述互补PNA链各自独立地包含2至约50个核碱基亚基。
13.权利要求12所述的大分子，其中各互补PNA链独立地包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核碱基亚基。
14.权利要求10至13中任一项所述的大分子，其中所述互补PNA的至少一个核碱基亚基包含一个或多个γ取代基。
15.权利要求14所述的大分子，其中各具有γ取代基的核碱基亚基包含1、2或3个γ取代基。
16.权利要求14至15中任一项所述的大分子，其中所述γ取代基能够结合细胞表面上的蛋白质。
17.权利要求16所述的大分子，其中所述蛋白质是跨膜蛋白质、脂质锚定蛋白质或外周蛋白质。
18.权利要求14所述的大分子，其中所述蛋白质是细胞受体或黏附分子。
19.权利要求14所述的大分子，其中所述蛋白质是整联蛋白、钙黏着蛋白、选择蛋白、地址素、G蛋白偶联受体或toll样受体。
20.权利要求14或15所述的大分子，其中所述γ取代基独立地是
-R-NX1X2，其中：
R是C1-C12烷基，
X1和X2独立地选自H、生物分子的配体、荧光基团、金属配体、Michael受体、叠氮化物、炔烃和硫醇；
其中X1和X2中的至少一个不是H。
21.权利要求20所述的大分子，其中X1和X2独立地选自H、生物素、荧光素、噻唑橙、吖啶、芘、Alexafluor染料、多肽、甘露糖、乳糖、核酸衍生物、寡核苷酸、RGD(Arg-Gly-Asp)和环RGD。
22.权利要求20所述的大分子，其中X1和X2独立地选自H、环糊精、卟啉、含硼的多面体笼形化合物、生物素、DOTA、DTPA、冠醚、穴状配体、含吡啶配体和杯芳烃。
23.药物组合物，其包含权利要求1-22中任一项所述的大分子和药用载体。
24.治疗或抑制哺乳动物中疾病状态的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的在前权利要求中任一项所述的组合物，其中选择至少一些γ取代基以结合细胞表面上的蛋白质。
25.权利要求24所述的方法，其中所述蛋白质是跨膜蛋白质、脂质锚定蛋白质或外周蛋白质。
26.权利要求24所述的方法，其中所述蛋白质是细胞受体或黏附分子。
27.权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物是啮齿动物、猫科动物、犬科动物、牛科动物、马科动物或灵长类动物。
28.权利要求27所述的方法，其中所述灵长类动物是人。
29.权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述疾病状态独立地与癌症、HIV、糖尿病(2型)、美洲锥虫病、慢性炎性疾病和自身免疫病、炭疽病或霍乱相关。
30.权利要求29所述的方法，其中所述疾病状态是癌症。
31.减少哺乳动物中癌细胞的转移的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求14至22中任一项所述的大分子，其中选择至少一些γ取代基以结合细胞表面上的蛋白质。
32.权利要求31所述的方法，其中所述蛋白质是跨膜蛋白质、脂质锚定蛋白质或外周蛋白质。
33.权利要求31所述的方法，其中所述蛋白质是细胞受体或黏附分子。
34.权利要求31所述的方法，其中所述哺乳动物是啮齿动物、猫科动物、犬科动物、牛科动物、马科动物或灵长类动物。
35.权利要求34所述的方法，其中所述灵长类动物是人。
36.权利要求24至35中任一项所述的方法，其中施用的组合物包含RGD(Arg-Gly-Asp)或环RGD的γ取代基。
37.权利要求36所述的方法，其中施用的组合物包含总共15个环RGD的γ取代基。
38.形成纳米结构平台的方法，其包括将第一PNA链与第二PNA链接触，其中所述第一PNA链包含2至50个核碱基亚基并且与氨基酸接头共价连接；并且其中所述第二PNA链包含：
(i)2至50核碱基亚基；和
(ii)一个或多个γ取代基；
其中所述第一PNA链与所述第二PNA链之比是至少1:1并且所述第一PNA链与所述第二PNA链的部分互补。
39.权利要求38所述的方法，其中所述比率为2:1至10:1。
40.权利要求38所述的方法，其中所述比率为4:1至6:1。
41.权利要求38所述的方法，其中所述γ取代基独立地是
-R-NX1X2，其中：
R是C1-C12烷基，
X1和X2独立地选自H、生物分子的配体、荧光基团、金属配体、Michael受体、叠氮化物、炔烃和硫醇；
其中X1和X2中的至少一个不是H。
42.权利要求41所述的方法，其中X1和X2独立地选自H、生物素、荧光素、噻唑橙、吖啶、芘、Alexafluor染料、多肽、甘露糖、乳糖、核酸衍生物、寡核苷酸、RGD(Arg-Gly-Asp)和环RGD。
43.权利要求41所述的方法，其中X1和X2独立地选自H、环糊精、卟啉、含硼的多面体笼形化合物、生物素、DOTA、DTPA、冠醚、穴状配体、含吡啶配体和杯芳烃。
44.疫苗，其包含权利要求14至22中任一项所述的大分子，其中所述γ取代基包含一种或多种细菌或病毒细胞表面蛋白质或其抗原片段。
45.检测受试者中细胞表面蛋白质的存在的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1至22中任一项所述的大分子，其中所述化合物被可检测地标记。
46.权利要求45所述的方法，其中所述可检测标记是荧光标记、放射性标记、生物素、DOTA、DTPA或放射性核素。
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