TW202017940A - Tcr 配體的高通量肽-mhc親和力篩選方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種高通量篩選 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體（包括穩定的肽 MHC 分子）的方法以及所述方法的各自用途。本發明進一步涉及包含穩定 MHC 分子或其肽結合片段或由該穩定 MHC 分子或其肽結合片段組成的多肽、包含所述多肽的藥物組合物、包含所述藥物組合物的疫苗以及所述疫苗在製備藥物及/或預防癌症中的用途。本發明進一步涉及編碼所述多肽的核酸和包含所述核酸的載體。

Description

TCR　配體的高通量肽-MHC親和力篩選方法

本發明涉及一種高通量篩選 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體（包括穩定的肽-MHC 分子）的方法以及所述方法的各自用途。本發明進一步涉及包含穩定 MHC 分子或其肽結合片段或由該穩定 MHC 分子或其肽結合片段組成的多肽、包含所述多肽的藥物組合物、包含所述藥物組合物的疫苗以及所述疫苗在製備藥物及/或預防癌症中的用途。本發明進一步涉及編碼所述多肽的核酸和包含所述核酸的載體。

細胞表面 MHC 分子上提呈肽在病毒感染或癌症的免疫應答中起基礎作用 (1)。MHC I 類分子為三聚體複合體，其由多態性重鏈、β-2 微球蛋白 (β₂ m) 和肽配體組成，通常為 8 至 10 個氨基酸長並源自胞質蛋白的降解。T 細胞可用其克隆特異性 T 細胞受體 (TCR) 辨識特異性肽-MHC 複合體 (pMHC) 並啟動免疫應答。

可溶性pMHC複合體的產生對於科學和臨床領域中以pMHC和 TCR 之間相互作用為主題的許多不同應用很重要。這些複合體於 1992 年使用蛋白質表達和重折疊技術首次產生，並且從那時起已用於多種應用場合，例如，透過流式細胞術或親和力測量 TCR-pMHC相互作用而鑒定抗原特異性 T 細胞 (2-5)。

TCR 對其同源pMHC的親和力對表達 T 細胞的功能性具有重大影響 (6)。因此，在改善低親和力 TCR 的親和力以達到臨床應用最佳水平方面已做出了很多努力 (7)。大量的成熟實驗產生了具有皮摩爾級別親和力的TCR，該級別範圍通常只有抗體能達到。它們（即使呈單體形式）以長相互作用半衰期與靶向pMHC結合，因此，作為雙特異性 T 細胞參與形式中的腫瘤細胞參與組分引起關注 (8, 9)。

WO2013/030620揭示重組 MHC I類分子，其在細菌中產生並以檢測表位特異性 CTL 的不溶性附著體存在。這些分子首先在離液劑溶液中變性。然後在存在所需肽（複性、重折疊）的情況下除去離液劑，並透過凝膠過濾色譜法從未折疊的蛋白質中分離肽 I 類複合體。WO2013/030620提出了一種編碼 MHC I 類分子的基因，所述 MHC I 類分子具有α1 螺旋和α2 螺旋，所述基因被編碼使得 MHC I 類分子中的α1 螺旋和α2 螺旋之間形成一個鍵。因此，可提供一種用於分析 T 細胞頻率的試劑盒。氨基酸 139 被半胱氨酸取代從而提供 Cys-139，氨基酸 84 被半胱氨酸取代從而提供 Cys-84 或氨基酸 85 被半胱氨酸取代從而提供 Cys-85，在 MHC I 類重鏈中的α-1 螺旋和α-2 螺旋之間的 Cys-139 和 Cys-84 之間或 Cys-139 和 Cys-85 之間形成二硫橋鍵。

US 2009-0117153 揭示所謂的二硫鍵陷阱，其包含透過兩個半胱氨酸之間延伸的二硫鍵共價附著至 MHC I 類重鏈分子的抗原肽。在一些構型中，二硫鍵陷阱（例如，二硫鍵陷阱單鏈三聚體 (dtSCT)）可包含單個連續多肽鏈。二硫鍵陷阱在細胞中合成後，在 ER 中適當氧化並可被 T 細胞辨識。在一些構型中，二硫鍵陷阱的肽部分不會被高親和力爭用肽取代，即使該肽與重鏈相對較弱地結合。在各種構型中，二硫鍵陷阱可用於疫苗接種以引發 CD8 T 細胞，以及用於多價 MHC/肽試劑以枚舉和追蹤 T 細胞。還揭示核酸，其包含編碼二硫鍵陷阱的序列。此類核酸（可以是 DNA 載體），可用作疫苗。

Zeynep Hein 等人（在：Peptide-independent stabilizationof MHC class I moleculesbreachescellularqualitycontrol.J Cell Sci 2014 127: 2885-2897 一文中）描述了鼠 MHC-1 同種異型 H-2Kb 的變體，其中α1 和α2 螺旋透過靠近 F 袋的二硫鍵連接，從而限制它們的行動性。C84-C139 二硫鍵允許正常的 PLC 相互作用和抗原提呈，但使 MHC-I 表面表達成為 TAP 和TAP結合素 (tapasin)非依賴性，加速順行運送，並大大降低 MHC-I 內吞作用的速率。

WO2011/101681 揭示二硫鍵穩定的重組 MHC II 類分子，其透過位於所述α鏈的α2 結構域與所述β鏈的β2 結構域中的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連接，其中所述半胱氨酸殘基不存在於天然 MHC II 類α2 和β2 結構域中。

WO 2018/029350 揭示K_on -速率測定法和改進 TCR 配體k_off -速率測定法，其透過與 UV 肽交換技術的新組合實現更廣泛的應用。本案以高通量方式實現K_off -速率 MHC 單體製備，其後可用於在測定法（例如，先前不可行的 TCR 配體K_off -速率測定法）中篩選擴展肽文庫的 TCR 候選物。此外，UV 肽交換搭配K_off -速率 MHC 單體可實現對辨識攜帶半胱氨酸氨基酸的特異性肽的 TCR 候選物的分析，所述半胱氨酸氨基酸先前可能干擾甚或終止k_off -速率測量。

Newell 等人（在：Newell EW, 「Higher Throughput Methods of Identifying T Cell Epitopes for Studying Outcomes of Altered Antigen Processing and Presentation.」 Frontiers in Immunology. 2013; 4:430 一文中）揭示使用質譜流式細胞技術的高含量組合肽-MHC 四聚體染色。

Bakker 等人（在：Bakker AH, Hoppes R, Linnemann C, et al., 「Conditional MHC class I ligands and peptide exchange technology for the human MHC gene products HLA-A1, -A3, -A11, and -B7.」PNAS 2008; 105(10):3825-3830 一文中）揭示暴露於可設計用於人 MHC 分子HLA-A2 的長波紫外光後崩解的條件性配體。據稱，這種肽交換技術可開發成為基於 MHC 高通量應用的一種普遍適用方法，以用於分析細胞毒性 T 細胞免疫。

Cochran and Stern（在：「A diverse set of oligomeric class II MHC-peptide complexes for probing T-cell receptor interactions.」 Chem Biol. 2000 Sep;7(9):683-96 一文中）揭示多種工具，以研究負責啟動 T 細胞中啟動程序的分子機制。透過改變引入的半胱氨酸殘基位置以及新穎和市售交聯試劑上攜帶的巰基反應性基團的數量和間隔，產生大小為二聚體至四聚體不等的拓撲學多樣性人 MHC 蛋白 HLA-DR1 寡聚體集。摻入交聯試劑中的螢光探針有助於測量與 T 細胞表面結合的寡聚體。寡聚 MHC-肽複合體（包括多種 MHC 二聚體、三聚體和四聚體）與 T 細胞結合並以抗原特異性方式啟動 T 細胞啟動程序。

Chong 等人（在：「High-throughput and Sensitive Immunopeptidomics Platform Reveals Profound Interferon-γ-Mediated Remodeling of the Human Leukocyte Antigen (HLA) Ligandome.」Molecular&Cellular Proteomics : MCP . 2018;17(3):533-548 一文中）揭示一種高通量、可重複和靈敏的方法，用於來自板形式中多達 96 個取樣的 HLA-I 和 -II 肽的按次序免疫親和力純化，其適用於細胞系和組織。此方法旨在改善免疫肽組產線中聲稱的最關鍵步驟，即樣品製備，因為其決定了整體肽產率和再現性。

Luimstra等人（在：Luimstra JJ, Garstka MA, Roex MCJ, et al. "A flexible MHC class I multimerloadingsystemfor large-scaledetectionof antigen-specific T cells.」J Exp Med 2018; 215(5):1493-1504 一文中）揭示使用溫度介導肽交換平行產生許多不同 MHC I 類 ( MHC I) 多聚體的一種聲稱簡單、快速、靈活和有效的方法。他們設計了 HLA-A*02:01 和 H-2K^b 的條件性肽，其在低溫下形成穩定肽-MHC I 複合體，但在暴露於所定義的升高溫度時解離。所得的條件性 MHC I 複合體（無論是單獨的，還是製備為即用型多聚體）可以在不需額外處理的情況下在短時間內快速裝載所選擇的肽。

TCR 親和力增強的潛在缺點是引入靶外毒性。由於 TCR 存在固有交叉反應性，這些缺點可透過不知不覺地增加對其他pMHC的親和力而產生 (10)。臨床研究中已報告多個此類病例 (11-13)。

因此，全面篩選不僅對於確保療效是必要的，對確保候選治療劑的特異性和安全性也是必要的 (14)。鑒於目前確立的免疫肽組大小（透過質譜法鑒定了至少150,000 個 MHC I 類配體肽）以及產生pMHC的可用方法，這是一項高度複雜的任務 (15)。

pMHC文庫的大規模產生和隨後的 TCR 高通量結合篩選（例如，產生結合基序或潛在交叉反應性肽的直接鑒定和表徵）仍然難以使用上述的本領域常見技術實現。這種困難會延伸至高品質pMHC複合體的製備，即使對於個體或機構而言數量較少且無產生pMHC的技術上具有挑戰性的必需設施（例如，在臨床環境中時間敏感性依須求生產）也是如此。因此，本發明的一個目的是提供本領域的改進策略。技藝人士在閱讀本發明的以下說明後，本發明的其他目的和方面將變得明瞭。

根據本發明的第一方面，本發明的上述目的透過一種篩選 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體 (pMHC) 的方法解決，其包括以下步驟： a) 提供適當穩定的 MHC 分子，其中所述 MHC 分子在以下氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋： (i) 在 MHC I 的情況下在所述穩定的 MHC 分子的α1 結構域氨基酸和α2 結構域氨基酸之間；及/或 (ii) 在 MHC I 情況下，在所述穩定 MHC 分子 α1 結構域的兩個氨基酸之間；或 (iii) 在 MHC II 情況下，在所述穩定 MHC 分子 α1 結構域的兩個氨基酸或 β1 結構域的兩個氨基酸之間；及/或 (iv) 在 MHC II 情況下，在所述穩定 MHC 分子 α1 結構域的一個氨基酸和 β1 結構域的一個氨基酸之間。 b) 使所述適當穩定的 MHC 分子與其大量肽配體接觸，以形成肽配體/MHC (pMHC) 分子複合體，以及 c) 篩選所述pMHC分子複合體的 TCR 結合。

根據本發明所述的方法為優選，其中所述穩定 MHC 分子透過例如下列而包括兩個氨基酸之間的至少一個人工引入的共價二硫鍵，更優選為 α-螺旋之間的氨基酸之間的至少一個人工引入的共價鍵：(i) 將MHC I 的第 84 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為酪氨酸，參見圖 13）和第 139 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為丙氨酸，參見圖 13）突變為半胱氨酸，及/或 (ii) 使第 22 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為苯丙氨酸，參見圖 13）和第 71 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為絲氨酸，參見圖 13）突變，及/或 (iii) 使第 51 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為色氨酸，參見圖 13）和第 175 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為甘氨酸，參見圖 13）突變或 (iv) 使第 22 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為苯丙氨酸，參見圖 13）和第 71 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為絲氨酸，參見圖 13）突變，以及使第 51 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為色氨酸，參見圖 13）和第 175 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為甘氨酸，參見圖 13）突變（基於 IGMT 編號，但排除前 24 個氨基酸）。此類穩定 MHC 分子可稱為二硫化物修飾的 MHC 分子或二硫化物修飾的 MHC 突變體。TCR 或 MHC 分子可適當地固定於固體表面上，例如晶片、載玻片、生物感測器或珠上，特別是作為高通量篩選形式時。

第二方面，本發明提出了包含穩定 MHC 分子或其肽結合片段或由該穩定 MHC 分子或其肽結合片段組成的多肽，其在以下位置之間包含至少一個人工引入的共價鍵： (i)  MHC I α1 結構域的兩個氨基酸之間；及/或 (ii) MHC I 的 α1 結構域中的一個氨基酸和 MCH I 的 α2 結構域中第 160 至 179 位氨基酸內的一個氨基酸之間；或 (iii) MHC II 的 α1 結構域的兩個氨基酸或 β1 結構域的兩個氨基酸；及/或 (iv) MHC II 的 α1 結構域的一個氨基酸和 MHC II 的 β1 結構域的一個氨基酸之間。

透過例如人工引入半胱氨酸殘基而非天然氨基酸修飾而形成共價鍵的兩個氨基酸位置基於其相對距離選擇。如果 MHC I 或 MHC II 中不透過肽鍵彼此天然相連的兩個氨基酸彼此之間的距離與共價鍵的距離相似，則優選它們被可形成共價鍵的氨基酸（例如，半胱氨酸）所取代。因此，優選情況是，修飾在折疊蛋白質中距離為 3 至 7.5 Å 的兩個氨基酸（在各氨基酸的 α 碳之間決定）。大量 MHC I 和 MHC II 分子的 3D 結構皆已知，並且技藝人士可使用標準軟體來決定折疊分子內兩個給定氨基酸之間的距離。

如果兩個氨基酸在 MHC I 的 α1 結構域中被修飾，則優選一個氨基酸在 MHC I 的 β1 單元中被修飾，另一個在 MHC I 的 α1 單元中被修飾。特別地，β1 單元的合適區域在第 12 至 32 位氨基酸內，優選為在第 17 至 27 位氨基酸內，更優選為在第 20 至 24 位氨基酸內，最佳為在第 22 位氨基酸。特別地，α1 單元的合適區域在第 61 至 81 位氨基酸內，優選為在第 66 至 76 位氨基酸內，更優選為在第 69 至 73 氨基酸內，最佳為在第 71 位氨基酸。在每種情況下，優選為在各別指示的氨基酸區段內選擇在折疊 MHC I 或 MHC II 蛋白質中距離為 3 至 7.5 Å 的兩個氨基酸（在各氨基酸的 α 碳之間決定）。

如果兩個氨基酸在 MHC II 的 α1 結構域中被修飾，則優選一個氨基酸在 MHC II 的 β1 單元中被修飾，另一個在 MHC II 的 α1 單元中被修飾。特別地，β1 單元的合適區域在第 10 至 40 位氨基酸內，優選為在第 13 至 35 位氨基酸內，更優選為在第 22 至 25 位氨基酸內，最佳為在第 22 位氨基酸。特別地，α1 單元的合適區域在第 45 至 78 位氨基酸內，優選為在第 50 至 70 位氨基酸內，更優選為在第 56 至 66 位氨基酸內，最佳為在第 59 位氨基酸。在每種情況下，優選為在各別指示的氨基酸區段內選擇在折疊 MHC I 或 MHC II 蛋白質中距離為 3 至 7.5 Å 的兩個氨基酸（在各氨基酸的 α 碳之間決定）。

如果兩個氨基酸在 MHC II 的 β1 結構域中被修飾，則優選一個氨基酸在 MHC II 的 β3 單元中被修飾，另一個在 MHC II 的 α3 單元中被修飾。特別地，β3 單元的合適區域在第 15 至 53 位氨基酸內，優選為在第 17 至 41 位氨基酸內，更優選為在第 21 至 28 位氨基酸內，最佳為在第 26 位氨基酸。特別地，α3 單元的合適區域在第 52 至 88 位氨基酸內，優選為在第 66 至 76 位氨基酸內，更優選為在第 65 至 80 位氨基酸內，最佳為在第 75 位氨基酸。在每種情況下，優選為在各別指示的氨基酸區段內選擇在折疊 MHC I 或 MHC II 蛋白質中距離為 3 至 7.5 Å 的兩個氨基酸（在各氨基酸的 α 碳之間決定）。

如果一個氨基酸在 MHC I 的 α1 結構域中被修飾而一個氨基酸在 MHC I 的 α2 結構域中第 160 至 179 位氨基酸內被修飾，則優選α1 結構域中的一個氨基酸在α1 單元中被修飾，優選為在第 50 至 70 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 60 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 54 位氨基酸內，最佳為在第 51 位氨基酸。優選α2 結構域中的另一個氨基酸在 α2 單元中被修飾，合適區域在第 165 至 178 位氨基酸內，優選為在第 170 至 177 位氨基酸內，更優選為在第 173 至 176 位氨基酸內，最佳為在第 175 位氨基酸。在每種情況下，優選為在各別指示的氨基酸區段內選擇在折疊 MHC I 蛋白質中距離為 3 至 7.5 Å 的兩個氨基酸。因此，在一特別優選實施方案中，穩定 MHC I 包含第 51 位和第 175 位修飾的氨基酸。

如果一個氨基酸在 MHC II 的 α1 結構域中被修飾而一個氨基酸在 MHC II 的 β1 結構域中被修飾，則優選的一個實施方案為：α1 結構域中的一個氨基酸在 α1 單元中被修飾。在一對被修飾的氨基酸中，第一個被修飾的氨基酸在第 50 至 70 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 60 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 54 位氨基酸內，最佳為在第 51 位氨基酸。β1 結構域內的另一個被修飾的氨基酸優選為在橫跨第 70 至 95 位氨基酸的 α3 單元內，優選為在第 74 至 94 位氨基酸內，優選為在第 83 至 93 位氨基酸內，更優選為在第 87 至 92 位氨基酸內，最佳為在第 89 位氨基酸。在另一對被修飾的氨基酸中，第一個被修飾的氨基酸在第 70 至 90 位氨基酸內，更優選為在第 70 至 85 位氨基酸內，更優選為在第 72 至 79 位氨基酸內，最佳為在第 76 位氨基酸。β1 結構域內的另一個被修飾的氨基酸優選為在橫跨第 50 至 95 位氨基酸的 α3 單元內，優選為在第 50 至 65 位氨基酸內，優選為在第 50 至 60 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 55 位氨基酸內，最佳為在第 53 位氨基酸。在每種情況下，優選為在各別指示的氨基酸區段內選擇在折疊 MHC II 蛋白質中距離為 3 至 7.5 Å 的兩個氨基酸。

進一步優選為在一個 MHC 內包含兩對被修飾的氨基酸。特別地，可組合的優選組合於上述適用 MHC I 之 (i) 和 (ii) 項以及上述適用 MHC II 之 (iii) 和 (iv) 項中指示。因此，優選為第一對被修飾的氨基酸包含 MHC I 的 β1 單元中被修飾的一個氨基酸和 α1 單元中被修飾的一個氨基酸。特別地，β1 單元的合適區域在第 12 至 32 位氨基酸內，優選為在第 17 至 27 位氨基酸內，更優選為在第 20 至 24 位氨基酸內，最佳為在第 22 位氨基酸。特別地，α1 單元的合適區域在第 61 至 81 位氨基酸內，優選為在第 66 至 76 位氨基酸內，更優選為在第 69 至 73 位氨基酸內，最佳為在第 71 位氨基酸。第二對被修飾的氨基酸包含一個在 MHC I 的 α1 結構域中被修飾的一個氨基酸和一個在 MHC I 的 α2 結構域中第 160 至 179 位氨基酸內被修飾的氨基酸。優選為 α1 結構域的一個氨基酸在 α1 單元中被修飾，優選為在第 50 至 70 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 60 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 54 位氨基酸內，最佳為在第 51 位氨基酸。特別地，α2 結構域內修飾另一氨基酸的合適區域在第 165 至 178 位氨基酸內，優選為在第 170 至 177 位氨基酸內，更優選為在第 173 至 176 位氨基酸內，最佳為在第 175 位氨基酸。因此，在一特別優選實施方案中，穩定 MHC I 包含第 22 位和第 71 位第一對被修飾的氨基酸以及第 51 位和第 175 位第二對被修飾的氨基酸。

MHC I 的任何上述修飾物可進一步與一對修飾組合，其中第一個被修飾的氨基酸在第 80 至 90 位氨基酸內，優選為在第 82 至 86 位氨基酸內，更優選為在第 84 位氨基酸，第二個被修飾的氨基酸在第 136 至 146 位氨基酸內，優選為在第 137 至 141 位氨基酸內，更優選為在第 139 位氨基酸。

令人驚訝的是，在 MHC I 和 MHC II 的上述氨基酸區域中以及在各自指出的位置處的氨基酸修飾以及由此在非透過共價鍵天然連接的位置處之氨基酸之間引入共價鍵可產生如下的被修飾 MHC I 和 MHC II 分子：(i) 適當折疊，(ii) 以高親和力與肽結合，以及 (iii) 以高特異性和選擇性被 TCR 分子辨識。

本發明第二方面優選的被修飾 MHC I 和 MHC II 分子也可用於本發明的所有其他方面。

本發明還包含被修飾 MHC I 或 MHC II 分子的肽結合片段。如本領域所知，MHC I 和 MHC II 與肽結合，接著被與 MHC I 或 MHC II 和肽相互作用的 TCR 結合。但是，僅需要部分 MHC I 和 MHC II 分子與「提呈」至 TCR 的肽結合。在 MHC I 中，α1 和 α2 結構域折疊形成與肽結合的結合槽，在 MCH II 中，α1 和 β1 結構域形成與肽結合的結合槽。因此，MHC I 和 MHC II 的肽結合片段分別至少包含 α1 和 α2 結構域或 α1 和 β1 結構域。因此，結合片段可能缺少 MHC I 中的跨膜結構域或另外的 α3 結構域或 MHC II 中的 α2 及/或 β2 結構域。至少缺少跨膜結構域的片段具有可溶性，特別適合用於藥物組合物，特別是疫苗。

本發明的協力廠商面提供了一種用於檢測或產生 TCR 的特定氨基酸結合基序的方法，其包括進行根據本發明第一方面的方法（包含預選 TCR）以及決定和比較檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列的額外步驟，從而鑒定所述預選 TCR 的特定氨基酸結合基序。

本發明的第四方面提供了一種用於檢測或決定 TCR 的交叉反應性的方法，其包括進行根據本發明第二方面的方法以及決定和比較檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列的額外步驟，從而鑒定所述 TCR 的交叉反應性。

本發明的第五方面提供了一種用於檢測或決定 TCR 的交叉反應性的方法，其包括進行根據本發明第一方面的方法（包括預選 TCR）以及決定和比較檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列的額外步驟，從而鑒定所述 TCR 的交叉反應性。

在本發明的第六方面，根據本發明的方法可用於篩選或體外引發(priming)細胞藥物產品。與珠、絲、奈米顆粒或其他載劑結合的穩定的 HLA 複合體可較容易地裝載關注肽以模擬抗原提呈細胞，然後方便地與共刺激分子（例如，抗 CD28、抗 41BB）組合使用，作為「即用型」人工抗原提呈細胞以進行體外引發和擴增。

目前用於大規模產生pMHC文庫的方法（高親和力 TCR 的高通量結合基序測定以及潛在交叉反應性肽的鑒定和表徵）均存在穩定性問題，因此需要多聚體在不需額外處理的情況下在短時間內快速裝載所選擇的肽（如上文Luimstra等人所述），這也使得 UV 交換等技術不合適。

本發明人利用當前技術獲得了優於野生型分子或其他現有交換技術的多個優點：空的單體可在所需實驗之前以批量方式產生，並且除了獲得所需肽和快速肽裝載反應之外，pMHC產生不受任何其他方法限制。本發明人已成功地將空單體在 -80℃ 下儲存至少一年並進行使用，而未檢測到降解或肽接受性受損。本發明人還成功地將所得的pMHC複合體在 4℃下保存至少兩週，然後重新用於親和力測量而未損失信號。除了透過引入修飾而實現的所有這些優點之外，由突變體顯示所產生的pMHC複合體基本上代表了與 TCR 配體結合相關的野生型複合體。

一方面，本發明提供了篩選 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體的 TCR 結合的方法。

所述方法包括使用適當穩定的 MHC 分子，所述適當穩定的 MHC 分子在 MHC I 的情況下在所述穩定的 MHC 分子的 α1 結構域氨基酸和 α2 結構域氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋，及/或在 MHC I 情況下，在所述穩定 MHC 分子 α1 結構域的兩個氨基酸之間含至少一個人工引入的共價橋，或在 MHC II 的情況下在所述穩定的 MHC 分子的 α1 結構域氨基酸和 β1結構域氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋。主要組織相容性複合體 I 類和 II 類共有一個整體上相似的折疊。結合平臺由兩個結構域組成，在 MHC I 類的情況下來源於單個重α鏈 (HC)，在 MHC II 類的情況下來源於兩個鏈（α鏈和β鏈）。所述兩個結構域演變在底部形成稍彎曲的β-折疊片，在頂部形成兩個α-螺旋，它們的距離足夠遠能在其間容納肽鏈。因此，對於兩種 MHC 類別，均可實現根據本發明方法的適當穩定化。

在一實施方案中，本發明涉及使用二硫鍵穩定的、最初為空的 MHC 分子，所述分子可在使用前透過簡單地加入合適的肽來裝載。使用此二硫鍵修飾的 MHC 分子所產生的pMHC代表了未修飾野生型變體，並適合於篩選（例如，高親和力 TCR 的高通量結合基序測定以及潛在交叉反應性肽的鑒定和表徵）。

空的 MHC 在常用的表面（如，玻板）上基本不會降解，當裝載肽時代表未修飾野生型變體並適合於篩選，而且即使固定在表面上也可快速產生pMHC。在本發明的背景下，這透過「適當穩定的」pMHC來實現並理解為「適當穩定的」或「穩定的」pMHC。

在之前使用鼠 MHC I 類分子 H-2K^b 的研究中，透過將第 84 位的酪氨酸和第 139 位的丙氨酸突變為半胱氨酸而在F-袋中的相對殘基之間引入二硫鍵能夠穩定所述複合體。因此，在一實施方案中，例如，透過將 MHC I 的第 84 位的酪氨酸和第 139 位的丙氨酸突變為半胱氨酸而在α-螺旋之間引入氨基酸之間的人工引入共價橋。雖然在某些情況下，沒有任何肽配體可能難以分離單體，但可透過加入低親和力肽來有效克服。

術語「MHC」為短語「主要組織相容性複合體」的縮寫。MHC是一組細胞表面受體，在對脊椎動物中改變的天然或外來蛋白質確立獲得性免疫中起重要作用，這因而決定了組織內的組織相容性。MHC 分子的主要功能為與衍生自改變蛋白質或病原體的抗原結合，並將它們展示於細胞表面上以被適當的T細胞辨識。人 MHC 也稱為 HLA（人白細胞抗原）複合體或 HLA。MHC 基因家族分為三個亞組：I 類、II 類和 III 類。肽和 MHC I 類的複合體由負載適當 TCR 的 CD8 陽性 T 細胞進行辨識，而肽和 MHC II 類分子的複合體由負載適當 TCR 的 CD4 陽性輔助 T 細胞進行辨識。由於 CD8 依賴型和 CD4 依賴型這兩種反應共同並協同地促進抗腫瘤作用，因此，決定和表徵腫瘤相關抗原和相應 TCR 在開發癌症免疫治療（如：疫苗和細胞治療）中非常重要。MHC I 分子由一條 α 鏈（也稱為 MHC I 重鏈）和一條 β 鏈（其構成 β2 微球蛋白分子）組成。在本發明的背景下，可與重鏈互換使用的 α 鏈包含三個 α 結構域，即，α1 結構域、α2 結構域和 α3 結構域。α1 和 α2 結構域主要有助於形成肽袋，以產生肽配體 MHC (pMHC) 複合體。MHC I 的 α1 結構域橫跨第 1 至 90 位氨基酸，且包含橫跨第 1-49 位氨基酸的 　β 折疊片二級結構（本文稱為「β1 單元」），隨後為橫跨第 50-84 位氨基酸的 α-螺旋結構（本文稱為「α1 單元」）。MHC I 的 α2 結構域橫跨第 91 至 182 位氨基酸，且包含橫跨第 91-135 位氨基酸的 β 折疊片二級結構（本文稱為「β2 單元」），隨後為橫跨第 138-179 位氨基酸的 α-螺旋結構（本文稱為「α2 單元」）。MHC II 的 β1 結構域位於單獨的多肽上，並在 MHC II 中實現 MHC I 的 α2 結構域的結構作用。它橫跨第 1 至 95 位氨基酸，且包含橫跨第 1-49 位氨基酸的 β 折疊片二級結構（本文稱為「β3 單元」），隨後為橫跨第 50-95 位氨基酸的 α-螺旋結構（本文稱為「α3 單元」）。在本文以及任一指稱 MHC I 或 MHC II 分子氨基酸位置的情況下，位置基於 IGMT 編號指示，但排除N-末端第一信號肽，其長度通常為 20 至 29 個氨基酸之間。本發明的穩定 MHC II 分子可能在兩個單獨的多肽上包含 α1 和 β1 結構域，或者它們可能在一個多肽中彼此連接以形成單鏈 MHC II，例如，MHC II 的 α1 結構域的C-末端直接或透過肽接頭與 MHC II 的 β1 結構域的 N-末端連接。

HLA 分子的氨基酸序列在不同人之間有所不同。但是，HLA 可以透過國際公認的 HLA 命名法（IMGT 命名法）來辨識。例如，HLA-A 的分類基於給定 HLA 與各 HLA 的正式參考序列（透過序列比對產生）的同一性進行。因此，給定 HLA 序列若與根據 SEQ ID NO:6 的 HLA-A 序列具有最高序列同一性則被歸類為 HLA-A。HLA 正式參考序列以及分類體系的資訊可在以下獲得：www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/nomenclature/alignments.html。此網站提供了有關如何對任何給定 HLA 序列進行分類的如下資訊：「產生的比對檔使用以下命名和編號規範。這些規範基於已發佈的關於人類基因突變的建議。這些建議由命名工作組編寫，以規範如何命名和儲存人類等位元基因變體的序列。這些建議可參見 Antonarakis SE 和《 Nomenclature Working Group Recommendations for a Nomenclature System for Human Gene Mutations 》（命名工作組人類基因突變命名體系建議） Human Mutation (1998) 11 1-3 。 序列比對中只納入 HLA 系統因數 WHO HLA 命名委員會正式認可的等位基因。 如同針對所有人類基因突變的建議，所有比對皆應使用標準參考序列。每個等位基因的參考序列的完整列表可參見下文。 參考序列將始終與同一（原始）登錄號相關，除非此序列顯示為有誤。 所有等位基因均與參考序列比對。 序列的命名基於已發佈的命名規範 SGE Marsh, et al.(2010) Tissue Antigens 2010 75:291-455 。」

對於 MHC I 類蛋白，以下 HLA 參考蛋白質序列於 2019 年 7 月 12 日在網站上顯示，其中各例所示的各 HLA 登錄號不會隨時間推移而改變：MHC I 類蛋白 HLA-A (SEQ ID NO: 6)（登錄號 HLA00001） MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQKMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNMKAHSQTDRANLGTLRGYYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAVHAAEQRRVYLEGRCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPTIPIVGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKGGSYTQAASSDSAQGSDVSLTACKVHLA-B (SEQ ID NO: 7)（登錄號 HLA00132） MLVMAPRTVLLLLSAALALTETWAGSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIYKAQAQTDRESLRNLRGYYNQSEAGSHTLQSMYGCDVGPDGRLLRGHDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGECVEWLRRYLENGKDKLERADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSTVPIVGIVAGLAVLAVVVIGAVVAAVMCRRKSSGGKGGSYSQAACSDSAQGSDVSLTAHLA-C (SEQ ID NO: 8)（登錄號 HLA00401） MRVMAPRTLILLLSGALALTETWACSHSMKYFFTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQWMCGCDLGPDGRLLRGYDQYAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQWDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVMVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEPSSQPTIPIVGIVAGLAVLAVLAVLGAVVAVVMCRRKSSGGKGGSCSQAASSNSAQGSDESLIACKAHLA-E (SEQ ID NO: 9)（登錄號 HLA00934） MVDGTLLLLLSEALALTQTWAGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPDRRFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAEHQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSYSKAEWSDSAQGSESHSLHLA-F (SEQ ID NO: 10)（登錄號 HLA01096） MAPRSLLLLLSGALALTDTWAGSHSLRYFSTAVSRPGRGEPRYIAVEYVDDTQFLRFDSDAAIPRMEPREPWVEQEGPQYWEWTTGYAKANAQTDRVALRNLLRRYNQSEAGSHTLQGMNGCDMGPDGRLLRGYHQHAYDGKDYISLNEDLRSWTAADTVAQITQRFYEAEEYAEEFRTYLEGECLELLRRYLENGKETLQRADPPKAHVAHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEEQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPQPLILRWEQSPQPTIPIVGIVAGLVVLGAVVTGAVVAAVMWRKKSSDRNRGSYSQAAVHLA-G (SEQ ID NO: 11)（登錄號 HLA00939） MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSDHLA-H (SEQ ID NO: 12)（登錄號 HLA02546） MVLMAPRTLLLLLSGALALTQTWARSHSMRYFYTTMSRPGRGEPRFISVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWMEREGPEYWDRNTQICKAQAQTERENLRIALRYYNQSEGGSHTMQVMYGCDVGPDGRFLRGYEQHAYDSKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAARQAEQLRAYLEGEFVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTHTRSSWRPGLQGMEPSRSGRLWWCLLERSRDTPAMCSMRVCQSPSP*DGSHLPSPPSPSWASLLAWFYL*LWSLELWSLL*CGGRRAQIEKEGATLRLQAATVPRALMCLSRRESVXHLA-J (SEQ ID NO: 13)（登錄號 HLA02626） MGSWRPEPSSCCSRGPWPWPRPGRAPTP*GISAPPFPGRAAGSPASLPWATWTTRSSCGSTVTP*V*G*RRGRGGWSRRGRSIGTYRHWAPRPRHRLTE*TCGPCSATTTRARRGITSSRECLAATWGPTGVSSAGMSSMPTTARITSP*TRTCAPGPPRIPRLRLPSASMRRPMWLSKGEPTWRAPAWSGSADTWRTGRRRCSARTPPKTHVTHPPL*T*GITRSWVLGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDMELVETRPTGDGTFQKWAVVVVPSGEEQRYTCHVQHKGLPKPLILRWEPSPQPTIPIVGIIAGLVLLGAVVTGAVVTAVMWRKKSSDRKGGSYSQAASSQSAQGSDVSLTACKV*HLA-K (SEQ ID NO: 14)（登錄號 HLA02654） MGSWRPEPSSCCSWGPWP*PRPGRVPTP*GISAPPCPGRVAGSPGTSQWATWTTRSSCGSTATRRLRGCSRSRRGWSRRDRSIGTGAHGTSGPRTD*QE*TCPCRAATTTRARPGLTPSR*CMAATWGWKGASSAGMNSTPTMARIT*PGTRTCAPGPRRTWRLRSPSASGRQKNLQSRSGPTWRARAWRGSQTPGEREGDAAAHGPLPQTHMIHHSVSDYKATLRCWALGFYPVEITLAWQQDGEDQTRDMELLETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYPCHVQHEGLPKPLTLRWEQSSQPTIPIVGIVAGLVLLGAVVTGAVVSAVMCRKKNSDRVSYSEAASSDHAQGSDVSLTACKV*HLA-L (SEQ ID NO: 15)（登錄號 HLA02655） MGVMAPRTLLLLLLGALALTETWAGSHSLRYFSTAVSQPGRGEPRFIAVGYVDDTEFVRFDSDSVSPRMERRAPWVEQEGLEYWDQETRNAKGHAQIYRVNLRTLLRYYNQSEAGSHTIQRKHGCDVGPTGASSAGMNSSPTMARITSP*TRTCTPGPPRTQRLRSPSTSGKRTNTQSRSGPT*GQVHGVAPQTPGEREGDAAARGSPKGTCDPAPHL*P*GHPEVLGPGPLPCGDHTDLAAGWGGPDPGHGACGDQACRGRNLPEVGGCSGAFRRGAEIHVPCAA*GAARAPHPEMGAVFSAHHPHRGHRCWPVSPWSCGHWSCGCCCDVEEEKLR*NKEELCSGCLQQLCSVL*CIS*YL*SLX

HLA-A 基因位於染色體 6 的短臂上並編碼 HLA-A 的較大 α 鏈成分。HLA-A α 鏈的變異是 HLA 功能的關鍵。這種變異促進了人群中的遺傳多樣性。由於每種 HLA 對某些結構的肽均具有不同的親和力，因此，更多種類的 HLA 意味著在細胞表面上「提呈」更多種類的抗原。每個人最多可以表達兩種各自來自父母的 HLA-A 類型。有些人從父母雙方遺傳相同的 HLA-A，這降低了其個體 HLA 多樣性。但是，大多數人都遺傳兩種不同拷貝的 HLA-A。所有 HLA 組都具有相同的模式。換句話說，每個人只能表達編碼當前 1740 種活性蛋白的 2432 種已知 HLA-A 等位基因中的一種或兩種。HLA-A*02 表示特定的 HLA 等位元元基因，其中字母 A 表示等位元元基因屬於哪個 HLA 基因，而首碼「*02 首碼」表示 A2 血清型。在 MHC I 類依賴性免疫反應中，肽不僅必須能與腫瘤細胞表達的某些 MHC-I 類分子結合，而且它們之後還必須能被負載特異性 TCR 的T 細胞辨識。

在根據本發明優選方法的第二步驟中，使所述適當穩定的 MHC 分子與大量肽配體接觸，以形成肽配體/MHC (pMHC) 分子複合體。由於存在能夠可逆地固定雙特異性 TCR 構建體的多種可再生生物感測器，因此，使用pMHC複合體作為可溶性分析物來替代固定對於快速且具有成本效益的高通量篩選為優選。

在本發明背景中，「接觸」是指肽與空的及/或低親和力肽裝載 MHC 分子接觸，使得大部分肽與所述空的及/或低親和力肽裝載 MHC 分子形成（「裝載」）複合體。一優選實施例為：透過向合適緩衝液中的單體溶液加入和混合至少 100:1 摩爾比的所需肽並在室溫下孵育最少 5 分鐘來裝載 MHC 複合體。

兩個螺旋之間的凹槽可容納肽，依據為 (i) 在所述 MHC 分子的側鏈和所述肽的主鏈之間形成一組保守氫鍵，(ii) 透過肽側鏈佔據所定義的袋（MHC I 類中的錨定殘基 P2 或 P5/6 和 PΩ以及 MHC II 類中的 P1、P4、P6 和 P9）。個別肽側鏈與 MHC 的相互作用類型取決於結合凹槽的幾何形狀、電荷分佈和疏水性。在 MHC I 類中，結合凹槽在兩端透過保守酪氨酸殘基封閉，導致結合肽的大小被限制為通常 8-10 個殘基，且其 C-末端進入F-袋中。相反，MHC II 類蛋白質通常在其開放結合凹槽中容納長度為 13-25 個殘基的肽，且肽 N-末端通常突出 P1 袋。據報告，MHC I 類的 F 袋區和 MHC II 類的 P1 區（包括 P2 位點）的相互作用似乎對穩定pMHC複合體的提呈和對某些肽表位的免疫優勢具有顯著影響。有趣的是，這些袋位於相應 MHC I 類和 MHC II 類結構的結合凹槽的相對端。

大量肽配體可包含至少約 1,500 個不同的 MHC 結合肽，優選為至少約 5,000 個不同的 MHC 結合肽，更優選為至少約 15,000 個不同的 MHC 結合肽，最佳為含有至少約 150,000 個 MHC 結合肽的免疫肽組製劑。所述肽包含對於 MHC I 類蛋白而言長度為 8-10 個殘基的結合基序及對於 MHC II 類蛋白而言長度為 13-25 個殘基的結合基序，且所述肽的長度可以為 8-100、優選為 8-30、更優選為 8 至 16 個殘基。最佳的為由實際結合基序組成的肽。

在本發明背景中所使用的配體肽 可衍生自與癌症相關、感染相關（細菌性或病毒性感染）、甚至免疫（例如，自身免疫）疾病相關的多肽。所述術語還包括適當突變或天然存在的突變配體肽，即，不同於它們在相應多肽中存在的潛在序列。

根據本發明所述的一種方法為優選，其中所述接觸包括在約 4℃至 37℃，優選為約室溫（15°至 25℃，優選為 20℃）下將所述 MHC 結合肽裝載到 MHC 上。

令人驚訝的發現是，裝載的 HLA/肽分子 (pMHC 或 pMHC 複合體) 在約 4℃下非常穩定的時間超過約 1 天，優選為超過 1 週（例如，超過 2 週）。與上述已知方法相比，這允許在更多應用場合中有效、方便地使用。

在本發明的背景中發現以及相比之下上述文件中也有些發現，本方法明顯優於使用 WT pMHC分子的 UV 交換常用方法，可允許在表面（如，晶片或載玻片）上進行（特別是高通量方式）。雖然 UV 介導的肽配體交換可產生大量不同的pMHC複合體，但是交換效率根據肽及其與相應 MHC I 類等位基因結合的親和力而變化，這導致取樣的pMHC濃度不同。這種不決定性對於用作可溶性分析物的pMHC的親和力測量是一個問題，因為需要精確知道濃度才能決定準確的親和力。由於二硫鍵穩定的 MHC 突變體在沒有肽的情況下是穩定的，因此，此限制不適用。如果以足夠高的濃度加入肽以使空的 MHC 複合體飽和，則知道pMHC的有效濃度，這可顯著提高測量的準確性並避免假陰性結果。

在本發明方法的下一步驟中，篩選所述pMHC分子複合體的TCR 結合。這種相互作用的結合和動力學屬性是保護性 T 細胞介導免疫的參數，TCR-pMHC相互作用較強，顯示相互作用半衰期增加，因而比較弱者帶來更優的 T 細胞啟動和反應性。TCR 和pMHC配體之間的相互作用強度通常描述和測量為解離常數K_d ，這是一個平衡常數，是特定相互作用的結合速率常數k_on 和解離速率常數k_off 之間的比率。解離常數 K_d 與特定相互作用的結合強度負相關，因為 K_d 值越小表示結合越強

篩選可包括測量及/或檢測pMHC/TCR 結合的任何合適和已知的方法，例如，結構 TCR-pMHC親和力/親合力測量。一個實施例為：透過生物層干涉測量法 (BLI) 篩選肽-MHC 文庫的 TCR 結合，所述 BLI 是如本文所揭示的一種特殊形式的反射干涉測量法 (RI)，其中檢測到所述 TCR 的結合相互作用強於適合於 K_d 1.0 x 10-5 方法的靈敏度閾值且測得的 K_d 值範圍為 3.7 x 10^-9 至 7.2 x 10^-6 ，或者當弱於靈敏度閾值時檢測不到所述 TCR 的結合相互作用。

其他方法涉及其他形式的RI，如：表面等離子共振 (SPR) 技術或反射干涉光譜 (RIfS) 技術或單色反射計（SCORE，Biametrics，圖賓根，德國），或基於標誌物的測定法，例如，用NTAmers（TCMetrix，埃帕林格斯，瑞士）或pMHC或 TCR 四聚體進行流式細胞術分析，或其他形式的螢光讀數法（如：蛋白質微陣列）。當然，理想的情況是，這些方法可以用高通量方式執行/可以容易地調整為高通量方式。

在本發明的背景中，除非另有說明，否則術語「約」表示包含給定值的 +/-10%。

本發明以一實施例提出了使用二硫鍵穩定的空 HLA-A*02:01 分子，所述分子可在使用前透過簡單地加入肽來裝載。使用此修飾的 MHC 分子所產生的pMHC代表了未修飾野生型變體，因而證明用於高親和力 TCR 的高通量結合基序測定以及潛在交叉反應性肽的鑒定和表徵的合適性。

根據本發明所述的一種方法為優選，其中所述 MHC 分子為HLA，或選自二聚體、三聚體和四聚體組成組的 HLA、MHC I 或 MHC II 的多聚體。篩選中一次使用一種以上 MHC 分子的方法為本領域已知，例如，根據 Altman 等人（在：「Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes.」, Science. 4 Oct 1996: Vol. 274, Issue 5284, pp.94-969 一文中）的方法。類似地，可使用二聚體或三聚體。

所用的 MHC 分子包括氨基酸之間的至少一個人工引入的共價橋。所述橋選自重組引入的二硫橋鍵、引入待交聯的非天然氨基酸、引入光交聯氨基酸和化學方式引入的交聯。本文描述了使用半胱氨酸引入交聯；二聚體交聯劑的實例為 DPDPB 和HBVS，三聚體交聯劑的實例為 TMEA。

根據本發明所述的方法為優選，其中氨基酸之間的所述至少一個人工引入的共價鍵透過例如下列引入 α-螺旋之間：(i) 將 MHC I 第 84 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為酪氨酸，參見圖 13）和第 139 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為丙氨酸，參見圖 13）突變為半胱氨酸，及/或 (ii) 使 MHC I 第 22 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為苯丙氨酸，參見圖 13）和 MHC I 第 71 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為絲氨酸，參見圖 13）突變，及/或 (iii) 使 MHC I 第 51 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為色氨酸，參見圖 13）和 MHC I 第 175 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為甘氨酸，參見圖 13）突變或 (iv) 使 MHC I 第 22 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為苯丙氨酸，參見圖 13）和 MHC I 第 71 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為絲氨酸，參見圖 13）突變，以及使 MHC I 第 51 位的氨基酸（在大多數 HLA 中為色氨酸，參見圖 13）和 MHC I 第 175 位的氨基酸（在MHC I 的大多數 HLA 中為甘氨酸，參見圖 13）突變（基於 IGMT 編號，但排除前 24 個氨基酸）。α₁ 和α₂ 結構域或整個 MHC-I 的分子動力學模擬試驗表明，空的和肽結合的 MHC-I 之間存在一個顯著差異：在沒有肽的情況下，F-袋區域（α₁ 和α₂ 螺旋中分別為殘基 74-85 和殘基 138-149）旁側連接的螺旋部分的行動性顯著更高。結合肽似乎限制了該區域的行動性，並且透過將肽結合袋的不同結構特徵與共價鍵（優選為二硫鍵）連接可能實現類似有利和穩定性構形限制。

為了決定每個給定 HLA 等位基因中對應於上述殘基 22、5、71、74-85、138-149 和 175的位置處的氨基酸，各自序列與上述參考抗體比對。正式 HLA（MHC I 類）參考蛋白序列和鼠 MHC I H2Kb蛋白的多個序列比對的實例，其中突出顯示第 22、51、71、84、85、139、140 和 175 位氨基酸位置（粗體）以及適合引入穩定突變（灰色）的其他區域，如圖 13 所示。圖 13 將使得技藝人士能夠決定每個給定 HLA 等位基因中對應於上述殘基 22、5、71、74-85、138-149 和 175 的位置處的氨基酸。

在一優選實施方案中，用於本發明的 MHC I 分子為 MHC I 類 HLA 蛋白，優選為 HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-L。根據 IMGT 命名的參考序列，這些優選的 HLA 蛋白可分別在其 α₁ 結構域和 α₂ 結構域中突變。優選地，這些 HLA 蛋白的一或多個（優選為一個）氨基酸在第 22 位置內突變；一或多個（優選為一個）氨基酸在第 51 位置內突變；一或多個（優選為一個）氨基酸在第 71 位置內突變；一或多個（優選為一個）氨基酸在第 74-85 位置內突變；一或多個（優選為一個）氨基酸在第 138-149 位置內突變；一或多個（優選為一個）氨基酸在第 175 位置內突變。更優選地，一個氨基酸在第 84 或 85 位突變以及一個氨基酸在第 139 或 140 位置突變。更優選地，一個氨基酸在第 22 位置突變、一個氨基酸在第 71 位置突變。更優選地，一個氨基酸在第 22 位置突變、一個氨基酸在第 71 位置突變、一個氨基酸在第 51 位置突變、一個氨基酸在第 175 位置突變。優選的氨基酸突變是將第 74-85 位置處的一個氨基酸和第 138-149 位置處的一個氨基酸取代為半胱氨酸。更為優選的氨基酸突變是將第 22 位置處的一個氨基酸取代為半胱氨酸。更為優選的氨基酸突變是將第 51 位置處的一個氨基酸取代為半胱氨酸。更為優選的氨基酸突變是將第 71 位置處的一個氨基酸取代為半胱氨酸。更為優選的氨基酸突變是將第 175 位置處的一個氨基酸取代為半胱氨酸。

在另一優選的實施方案中，HLA-A 蛋白選自 HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3 和 HLA-A11 組成的組。根據 IMGT 命名的參考序列，這些優選的 HLA-A 蛋白可分別在其 α₁ 結構域和 α₂ 結構域中突變。優選地，這些 HLA 蛋白可在第 22、51、74-85、138-149 和第 175 氨基酸位置處突變。更優選地，HLA-A 蛋白為 HLA-A*02 蛋白。優選的 HLA-A 等位基因為 HLA-A*02:01；HLA-A*01:01 或 HLA-A*03:01。

在另一優選的實施方案中，HLA-B 蛋白選自 HLA-B*07、HLA-B*08、HLA-B*15、HLA-B*35 或 HLA-B*44組成的組。根據 IMGT 命名的參考序列，這些優選的 HLA-B 蛋白可分別在其 α₁ 結構域和 α₂ 結構域中突變。優選地，這些 HLB 蛋白可在第 74-85 和 138-149 氨基酸位置處突變。優選的 HLA-B 等位基因為 HLA-B*07:02；HLA-B*08:01、HLA-B*15:01、HLA-B*35:01 或 HLA-B*44:05。

在本發明的背景中，術語「TCR 」應包括任何包含 TCR 衍生或 TCR 樣結合結構域的蛋白質分子/構建體，其中所述分子/構建體適合於分析/檢測本文所述的根據本發明的pMHC/TCR 結合。在 TCR 的α-及/或β-鏈的情況下，可能包括兩個鏈仍能夠形成可發揮生物學功能的 T 細胞受體的分子（具有未修飾的α-及/或β-鏈或具有融合蛋白或修飾的α-及/或β-鏈），特別是在肽啟動後與（特異性）pMHC結合及/或功能性信號轉導。根據本發明的方法為優選，其中所述 TCR 選自天然TCR、可溶性 TCR 分子、單鏈 TCR 和包含 TCR 衍生的或 TCR 樣結合結構域（例如，衍生自抗體）的 TCR 樣分子，如：雙特異性 (bs) TCR（例如，如本文所述一樣的 TCR）。

與常用技術（包括 UV 交換相關方法）相比，優選實施方案中根據本發明的方法可平行檢測、分析及/或篩選更多數量的肽配體及/或pMHC。透過 I 類和 II 類人白細胞抗原 (HLA) 分子提呈至細胞表面的一系列肽稱為免疫肽組。2017 年 5 月，報告了 119,073 個高可信度的 HLA I 類肽和 73,465 個高可信度的 HLA II 類肽 (Shao W, Pedrioli PGA, Wolski W, et al. TheSysteMHC Atlas project.NucleicAcids Research .2018;46 (Database issue):D1237-D1247)，因此可以預期，人免疫肽組超過各 150,000 個 I 類和 II 類的 MHC 結合肽。目前的方法每天可分析約 700 個肽，因此需要「真正的」高通量方法，即所分析的大量肽配體包含至少約 1,500 個不同的 MHC 結合肽，優選為至少約 5,000 個不同的 MHC 結合肽，更優選為至少約 15,000 個不同的 MHC 結合肽，最佳為含有至少約 150,000 個 MHC 結合肽的基本完整免疫肽組製劑。

本發明的方法可在一天的短時間內進行全免疫肽組的篩選。

鑒於待檢測/分析的pMHC/TCR 結合的數量，根據本發明的方法為優選，其中所述方法以高通量篩選 (HTS) 形式進行。在 HTS 中，在給定條件下，可對多達數十萬個實驗樣品同時測試pMHC/TCR 結合。所述樣品通常並優選由實驗室機器人處理，即，自動進行樣品製備、處理和數據分析。因此，HTS 可容易且可靠地產生並使用大數據集來解答複雜的生物學問題，例如，如本文所述的pMHC/TCR 結合動力學和生物學功能。

HTS 通常需要以陣列形式製備樣品。如需要，可讓陣列樣品在液體微量滴定板上或固體瓊脂上生長。板密度範圍可以為 96、192、384、768、1,536 或 6,144。所有這些密度都是 96 的倍數，這反映了原始的 96 孔微量滴定板，其以 8 x 12 排列，間距為 9 mm（例如，也可參見Bean GJ, Jaeger PA, Bahr S, Ideker T. 「Development of Ultra-High-Density Screening Tools for Microbial「Omics,」」PLoS ONE.2014 Jan 21;9(1):e85177 一文）。

對於與所檢測/分析的以及如本文所述的pMHC/TCR 結合動力學相關的用途，可使用固體表面（例如，晶片、生物感測器、載玻片或珠），在所述表面可適當固定（例如，斑點化）一些分析試劑（例如，TCR 或 MHC 分子）。對於固定，可使用任何合適的技術，例如，透過生物素-鏈黴抗生物素蛋白相互作用。本文所述實施方案的實例為結合測定法，其涉及至少一種可溶性 TCR 與至少一種固定pMHC的結合，或至少一種固定 TCR 與至少一種可溶性pMHC的結合。

根據本發明所述的一種方法為優選，其中所述 TCR 及/或 MHC 分子未用可檢測標誌物進行標記或適當標記。各標誌物為本領域已知，包括用放射性、螢光或化學基團（例如，染料）直接或間接標記。此外，可使用酶標誌物或抗原標誌物（用於以抗體檢測）以及品質標誌物。另一選項為編碼標誌物（例如，特定核酸）。在沒有標記的情況下，可在複合體形成/結合後使用基於物理狀態的變化而檢測結合來決定結合狀況，例如，品質、電荷或光學性質（例如，透過分析物結合情況判斷生物層光學厚度，從而判斷干涉模式或反射係數）的變化。

檢測結合的方法，特別是檢測pMHC與 TCR 的「特異性」結合方法為本領域已知。在本發明中，根據本發明的方法為優選，其中可測量所述 TCR 的 K_d 值以及k_on 、k_off 值，優選為靈敏度 K_d 為 1 x 10^-10 M 至 1 x 10^-3 M，其中靈敏度可透過分析物濃度提示。

一優選實施例為：使用從 500nM 開始的 1:2 分析物稀釋系列或使用從 500nM 開始的 1/

分析物稀釋系列測量親和力。一優選實施例為：肽配體/MHC 分子複合體用於不同濃度的平行測定反應。

根據本發明方法的再一重要方面，所述方法進一步包括測量 T 細胞啟動的步驟，其包含 TCR 和與所述 TCR 結合的 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體。透過結合檢測此類 T 細胞啟動的方法，特別是檢測pMHC與 TCR 的「特異性」結合方法為本領域已知。本發明的一個實施例為：用肽裝載靶細胞、Jurkat效應細胞和六種不同濃度的 bs-868Z11-CD3進行了共孵育測定，來自位點掃瞄文庫中肽配體所測得的親和力與誘導比背景發光增加 3 倍所需的最低bsTCR濃度之間的相關性作為截止值。

本發明的再一重要方面為檢測或產生 TCR 的特定氨基酸結合基序的方法，其包括進行本文所述的根據本發明的方法，其中選擇預選 TCR以對其進行特定氨基酸結合基序的檢測或產生。所述方法包括 a) 提供適當穩定的 MHC 分子，其中所述 MHC 分子在 MHC I 的情況下在所述穩定的 MHC 分子的α1 結構域氨基酸和α2 結構域氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋，並且在 MHC II 的情況下在所述穩定的 MHC 分子的α1 結構域氨基酸和β1結構域氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋，b) 使所述適當穩定的 MHC 分子與其大量肽配體接觸，以形成肽配體/MHC (pMHC) 分子複合體，以及 c) 使用所述預選 TCR 篩選所述pMHC分子複合體的 TCR 結合。在額外步驟中，對檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列進行測定，並任選和優選進行比較，從而鑒定所述預選 TCR 的特定氨基酸結合基序。

另一實施方案包括在鑒定後對特定氨基酸序列進行誘變，使所述突變肽與適當穩定的 MHC 分子接觸，並用預選的 TCR 篩選所述pMHC分子複合體的 TCR 結合以獲得所述預選 TCR 的氨基酸結合基序。肽誘變可容易地，例如，透過合成突變肽或化學修飾各肽結合物中的現有氨基酸進行。誘變還可涉及向肽添加標誌物或其他基團，以鑒定診斷上有效的結合物。此方面涉及本文所述的根據本發明的方法，其中重複所述方法步驟，其包括由鑒定的所述預選 TCR 的修飾氨基酸序列組成的肽庫。此外，所述修飾可透過一種已知電腦演算法及/或程式引導，以基於氨基酸序列的修飾情況來計算改進的結合參數。

本發明的一個實施例為：透過本文公開的生物層干涉測量法 (BLI) 篩選pMHC複合體文庫（包括所述方式產生的肽）對預選 TCR 的TCR 結合，其中檢測到所述 TCR 的結合相互作用強於適合於 K_d 1.0 x 10^-5 M方法的靈敏度閾值且測得的 K_d 值範圍為 3.7 x 10^-9 M 至 7.2 x 10^-6 M，或者當弱於靈敏度閾值時檢測不到所述 TCR 的結合相互作用。在所述實施方案中，本發明顯示，因為含有適當穩定的 MHC 分子的pMHC複合體的產生可產生可預測量的pMHC，與現有方法相比提高了 K_d 測量準確性，因此，相對於現有方法有特別改進（圖 5）。

在另一實施方案中，大量肽配體主要由來自免疫肽組的已知肽配體組成（例如，透過質譜法決定），其中篩選了預選 TCR 的 TCR 結合以直接鑒定所述 TCR 的現有交叉反應性肽配體。根據本實施方案的方法為優選，其中不同肽的數量包含平行測量的至少約 1,500 個不同 MHC 結合肽，優選為至少約 5,000 個不同 MHC 結合肽。

本發明的再一重要方面為檢測或決定 TCR 的交叉反應性的方法，其包括進行本文所述的檢測或產生 TCR 的特定氨基酸結合基序的方法，以及決定和比較檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列的額外步驟，從而鑒定所述 TCR 的交叉反應性。此方面檢測單個 TCR 辨識的肽的變體。

本發明的再一重要方面為檢測或決定 TCR 的交叉反應性的方法，其包括進行本文所述的根據本發明的篩選 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體的 TCR 結合的方法（包括預選 TCR），以及決定和比較檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列的額外步驟，從而鑒定所述 TCR 的交叉反應性。此方面也檢測單個 TCR 辨識的肽的變體。

其一實施例為：基於氨基酸結合基序鑒定交叉反應性肽配體，所述基序為之前透過用根據本發明的誘變衍生pMHC複合體文庫篩選預選 TCR 的 TCR 結合所決定，並在已知或假定的肽配體數據庫中搜索匹配的肽配體。

本發明的再一重要方面為檢測或決定肽配體/MHC 分子複合體的交叉反應性的方法，其包括進行本文所述的根據本發明的篩選 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體的 TCR 結合的方法（包括預選pMHC），以及鑒定檢測到pMHC結合的那些 TCR 的額外步驟，從而鑒定所述 TCR 的交叉反應性。此方面檢測辨識單個肽的 TCR 的變體。

在這些方面，可以按如前述使用檢測pMHC與預選 TCR 結合的相同方法。但是，由於 TCR 結合不一定需要具有特異性，因此測量和評估結合的截止值和靈敏度不需要是最優的，而應根據相應情況選擇最適合的，這對於技藝人士是可以理解的。

根據本發明方法的另一重要方面，所述方法可進一步包括測量 T 細胞啟動的步驟，其包含 TCR 和與所述 TCR 結合的 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體。透過結合檢測此類 T 細胞啟動的方法，特別是檢測pMHC與 TCR 的「特異性」結合方法為本領域已知。本發明的一個實施例為：用肽裝載靶細胞、Jurkat效應細胞和六種不同濃度的 bs-868Z11-CD3進行了共孵育測定，來自位點掃瞄文庫中肽配體所測得的親和力與誘導比背景發光增加 3 倍所需的最低bsTCR濃度之間的相關性作為截止值。

因此，本發明的另一重要方面涉及一種包含適當穩定的 MHC 分子的藥物組合物，其中所述 MHC 分子在 MHC I 的情況下在所述穩定的 MHC 分子的α1 結構域氨基酸和α2 結構域氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋，及/或在 MHC I 情況下，在所述穩定 MHC 分子 α1 結構域的兩個氨基酸之間含至少一個人工引入的共價橋，及/或在 MHC II 的情況下在所述穩定的 MHC 分子的α1 結構域氨基酸和β1結構域氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋，其中所述穩定的 MHC 分子與珠、絲、奈米顆粒或其他合適載劑結合。

在一優選的實施方案中，藥物組合物包含根據本發明第二方面中所述的穩定 MHC 分子，如本發明第二方面所述。優選地，藥物組合物中包含的穩定 MHC 分子不包含跨膜結構域。

所述藥物組合物還包含合適的緩衝劑及/或賦形劑。優選情況是，根據本發明的所述藥物組合物可進一步包含共刺激分子（例如：抗 CD28 抗體或抗 41BB 抗體）的一或多個的組合及/或這些共刺激分子的時間序列。

因此，本發明的另一重要方面涉及根據本發明的藥物組合物在本文中根據本發明的方法中的用途。

在一實施方案中，藥物組合物包含於一種疫苗。在另一實施方案中，藥物組合物包含於一種疫苗，該疫苗用於製造藥劑。優選地，疫苗用於預防癌症。更優選地，疫苗在給予有需要的受試者後引發或觸發受試者的 T 細胞反應。優選地，疫苗藥物組合物中包含的穩定 MHC 分子不包含跨膜結構域。

因此，本發明的另一重要方面涉及透過用pMHC複合體刺激來改善 T 細胞受體個體化辨識或 T 細胞啟動及/或增殖性疾病（例如，癌症）的 T 細胞治療劑從而為特定患者生產細胞藥物產品的方法。這種刺激可基於裝載肽的pMHC複合體，所述肽的鑒定方法為：獲得/提供所述患者的癌組織及/或癌細胞取樣、獲得/提供所述患者的正常組織及/或細胞取樣、使用 XPRESIDENT® 或類似方法檢測在所述取樣中在 MHC 背景下提呈的肽、並測定至少一種所述肽的序列，任選地檢測所測定所述肽的潛在基因表達、檢測在所述取樣中檢測到的肽的 MHC 提呈水平/數量，任選地比較所述腫瘤和正常組織及/或細胞取樣中檢測到的肽的所述 MHC 提呈水平/數量、篩選最佳化 TCR結合肽配體/MHC 分子複合體（包含根據本發明的方法）。所述 T 細胞包括從所述患者中直接回收的 T 細胞，其可在所述刺激後作為細胞藥物產品再次給藥。所述刺激可包括使用預先產生的刺激框架，該刺激框架的產生是透過將適當穩定的 MHC 分子（優選為在臨床等級條件（例如 GMP）下產生）固定於載劑（例如，絲或珠）上，然後，所述載劑根據需要（例如直接在臨床中心）裝載肽。這些刺激框架還可包括與適當穩定的 MHC 分子一起固定的其他共刺激分子（例如，抗 CD28 抗體、抗 41BB 抗體）。

在上述方法的一優選方面，所述肽（例如，某種癌症類型或其他種類增殖性疾病所特有的肽）透過先前在另一名或多名患者中的鑒定已為執行該程式的實體已知。因此，可替患有相同癌症類型的不同患者快速選擇和生產所述肽，將所述肽裝載於所述刺激框架上，並用於生產細胞藥物產品。

在上述方法的一優選方面，所述啟動直接從所述患者回收的 T 細胞及/或 T 細胞治療劑的程序還包括轉導 T 細胞以表達腫瘤特異性外源性 T 細胞受體 (TCR)和任選地適當地配製所述獲得的 T 細胞治療劑。

術語「T 細胞 」是指本領域所定義的 T 淋巴細胞，且意圖包括重組 T 細胞。本文所用的術語「T 細胞受體」和「TCR」是指在 T 細胞表面上存在的分子，其負責辨識與 MHC 分子結合的抗原，並且通常是指能夠辨識由 MHC 分子所提呈之肽的分子。所述分子為包括α和β鏈（或選擇性地γ和δ鏈）的異二聚體或產生信號的 TCR 構建體。本發明的 TCR 為雜交TCR，其包括衍生自其他物種的序列。例如，由於在人 T 細胞中小鼠 TCR 比人 TCR 更有效地表達，因此 TCR 包括人可變區和鼠恒定區。此術語還包括可溶性 TCR 分子及其衍生物，只要它們包括結合所需的互補決定區 (CDR) 即可。

WO 03/100432、WO 2005/076009 和 WO 2011/128448 等中描述了 XPRESIDENT® 技術，其內容透過引用整體併入本文。

在上述方法的一優選方面，所述開發針對增殖性疾病的改進個體化 T 細胞受體、T 細胞及/或 T 細胞治療劑進一步包括轉導患者的自體（自身）T 細胞以表達腫瘤特異性外源性 T 細胞受體 (TCR)和任選地適當地配製所述獲得的 T 細胞治療劑。

本發明人證實，一實施例中二硫化物修飾的 HLA-A*02:01 分子可以容易地產生作為穩定且空的 MHC 單體，在重折疊後裝載配體肽，並用於產生與使用野生型pMHC複合體收集的數據高度一致的親和力數據。

二硫鍵修飾的 HLA-A*02:01 分子和雙特異性 TCR 均可與基於 BLI 的篩選聯合使用以測量pMHC-bsTCR結合親和力，此平臺的通量比目前在文件中用於這些相互作用的表面等離子共振測量高得多。二硫鍵修飾的 HLA-A*02:01 分子是此平臺的關鍵部分，提供可靠又高通量的pMHC產生。此平臺也可用於分析其他若針對pMHC的生物製劑，如：單克隆抗體或雙特異性抗體（例如，BITE）。當本發明人用功能性雙特異性 T 細胞參與劑進行pMHC-bsTCR結合親和力與細胞測定時，兩種測定具有很好的相關性。就本發明人所知，這是pMHC-bsTCR結合親和力與體外活性之間就廣泛親和力範圍內之關聯的首次深入分析。與細胞篩選相比，親和力篩選平臺更易於使用並且執行速度明顯更快，因此有資格作為早期篩選工具。由於 二硫鍵修飾的 HLA-A*02:01 分子具有可預測性提呈甚至低親和力肽配體作為pMHC複合體的能力，因此，本發明人可在不必考慮外源肽裝載方法中所發生變化的情況下精確測量pMHC-bsTCR結合親和力，因而不丟失可能具有價值的資訊。本發明人相信，所提出的親和力分析平臺的易用性將有助於從早期開始開發基於 T 細胞受體的安全、有效的雙特異性分子。

一實施例為：本發明人證明可以快速產生pMHC-bsTCR結合親和力數據集並從中外推出交叉反應性搜索基序。在本發明人的基於 HLA 肽組學的 XPRESIDENT® 平臺引導下，搜索基序可用於鑒定可能具有交叉反應性的肽配體。在所提出的此策略實施程序中，本發明人能夠鑒定由bsTCR強烈辨識並且能夠誘導 T 細胞啟動的大量肽，與原始靶標相比低至九個位置中之一個的序列一致性。

這種令人興奮的創新技術甚至可導致對整個發現的免疫肽組進行篩選：此類維度的pMHC文庫目前僅透過使用隨機突變單鏈肽 MHC 文庫的酵母展示技術提供 (32,33)。雖然這些技術可用於廣泛的 TCR 分析，但與通常用於抗體開發的肽微陣列相比，它們在使用上更複雜且具有更難以預測的肽配體組成。由於其穩定性和不費力的肽裝載程序，本發明二硫鍵修飾的 HLA-A*02:01 分子可能是未來創立高度複雜pMHC微陣列的理想選擇，例如，透過將空 MHC 的大規模包覆和現代多肽微陣列噴墨印表機的高通量相結合。

主要組織相容性複合體 (MHC) I 類分子在細胞表面上提呈短肽配體以供細胞毒性 CD8+ T 細胞詢問。提呈腫瘤相關肽 (TUMAP) 的 MHC I 類複合體是目前正在開發的癌症免疫治療方法的關鍵靶標，對於療效和安全性篩選非常重要。在沒有肽配體的情況下，MHC I 類複合體不穩定並且快速衰變，使用於分析目的的可溶性單體的產生耗費大量人力。本發明人開發了二硫鍵穩定的 HLA-A*02:01 分子，其在沒有肽的情況下穩定，但可以在數分鐘內與所選擇的配體形成肽-MHC 複合體。本發明人說明瞭工程化突變體和野生型變體在野生型或成熟型高親和力 TCR 的結合親和力方面的一致性。本發明人證實了其在雙特異性 TCR 分子高通量親和力篩選中作為分析物的可能性，並產生了全面的 TCR 結合基序，以鑒定靶外相互作用。

本發明的另一方面涉及編編碼簿發明第二方面的穩定 MHC 分子或其肽結合片段的核酸以及載體。本領域所熟知的是，MHC I 包含所有肽結合結構域（即， α1 結構域和 α2 結構域）在一條多肽鏈上，而 MHC II 天然包含 α1 結構域和 β1 結構域在兩條多肽鏈上。如前述，透過將 β1 結構域與 α1 結構域融合，也可在單個肽上提供功能性 MHC II。因此，編編碼簿發明 MHC I 和II的核酸可編碼一或兩個多肽，或者兩個多肽也可由兩個單獨的核酸編碼。

在本發明背景中，術語「核酸 」係指去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基或兩者的單鏈或雙鏈寡聚物或聚合物。核苷酸單體由核鹼基、五碳糖（諸如，但不限於核糖或 2'-去氧核糖）和一至三個磷酸基團組成。通常情況是，核酸透過各核苷酸單體之間的磷酸二酯鍵形成。在本發明背景中，術語核酸包括但不限於核糖核酸 (RNA) 和去氧核糖核酸 (DNA) 分子，但也包括包含其他連接的合成形式核酸（例如，如Nielsen 等人所描述的肽核酸 (Science 254:1497-1500, 1991)。通常情況是，核酸為單鏈或雙鏈分子，並由天然核苷酸組成。核酸單鏈的描述也定義了（至少部分地定義了）互補鏈的序列。核酸可以為單鏈，也可為雙鏈，或者可包含雙鏈和單鏈序列的部分。典型的雙鏈核酸分子可具有 3' 或 5' 突出端，因此不需要或假設在其整個長度上完全為雙鏈。核酸可透過生物學、生物化學或化學合成方法或本領域已知的任何方法獲得，包括但不限於擴增方法和 RNA 逆轉錄方法。術語核酸包括染色體或染色體片段、載體（例如，表達載體）、表達盒、裸露 DNA 或 RNA 聚合物、引物、探針、cDNA、基因組 DNA、重組 DNA、cRNA、mRNA、tRNA、微 RNA (miRNA) 或小干擾 RNA (siRNA)。核酸可以為：例如，單鏈、雙鏈或三鏈的，並且不限於任何特定長度。除非另有說明，否則除了明確指出的任何序列外，特定核酸序列包含或編碼互補序列。

本發明的另一方面為載體，其包含編編碼簿發明第二方面的穩定 MHC 分子或其肽結合片段的核酸。此類載體可用於疫苗接種策略，其中需要在患者中表達疫苗。在此類情況下，載體可另外編碼免疫反應（優選為 T 細胞反應）所需要的蛋白質或包含其片段的 T 細胞表位。以這種方式可以決定在包含載體的患者細胞中表達的 MHC 分子的肽結合袋負載有正確的肽。或者，MHC 分子可以進行修飾以在融合蛋白中包含含有 T 細胞表位的肽。通常將肽藉由仲介肽接頭融合至 MHC 分子，以允許肽與 MCH 分子的結合槽結合。

在本發明背景中，術語「載體 」係指編碼目的蛋白質的多核苷酸或包含多肽和編碼目的蛋白質的多核苷酸的混合物，其能夠被引入細胞中或能夠將蛋白質及/或其中包含的核酸引入細胞中。載體的實例包括但不限於質粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。載體用於將目的基因產物（例如，外源或異源 DNA）引入宿主細胞。載體可能含有「複製子」多核苷酸序列，其有助於在宿主細胞中自主複製載體。外源 DNA 定義為異源 DNA，其為宿主細胞中非天然存在的 DNA，例如，其複製載體分子、編碼可選擇的或可篩選的標誌物或編碼轉基因。載體一旦進入宿主細胞，可以獨立於宿主染色體 DNA 或與宿主染色體 DNA 同時複製，並且可以產生數個拷貝的載體及其插入的 DNA。此外，載體還可能含有必需的元件，其允許將插入的 DNA 轉錄為 mRNA 分子或以其他方式引起插入的 DNA 複製為多拷貝的 RNA。載體可進一步包括調節目的基因表達的「表達控制序列」。表達控制序列通常為多肽或多核苷酸，諸如啟動子、增強子、沉寂子、絕緣子或抑制子。在包含編碼一或多個目的基因產物的多種多核苷酸的載體中，所述表達可透過一或多個表達控制序列一起或單獨控制。更具體地，載體上包含的每種多核苷酸可透過單獨的表達控制序列控制，或者載體上包含的所有多核苷酸可透過單一表達控制序列控制。單一載體上包含的由單一表達控制序列控制的多核苷酸可形成開放閱讀框。一些表達載體額外含有與插入 DNA 相鄰的序列元件，其增加所表達 mRNA 的半衰期及/或允許 mRNA 轉譯為蛋白質分子。因此可以快速合成由插入 DNA 編碼的 mRNA 和多肽的許多分子。此類載體可包含調節元件，諸如啟動子、增強子、終止子等，以在受試者給藥後引起或引導所述多肽的表達。用於動物細胞的表達載體的啟動子和增強子實例包括 SV40 的早期啟動子和增強子 (Mizukami T. et al. 1987)、Moloney 小鼠白血病病毒的 LTR 啟動子和增強子 (Kuwana Y et al. 1987)、免疫球蛋白 H 鏈的啟動子(Mason JO et al. 1985) 和增強子 (Gillies SD et al. 1983) 等。任何只要可以插入和表達編碼人抗體 C 區的基因之用於動物細胞的表達載體皆可使用。合適的載體實例包括 pAGE107 (Miyaji H et al. 1990)、pAGE103 (Mizukami T et al. 1987)、pHSG274 (Brady G et al. 1984)、pKCR (O'Hare K et al. 1981)、pSG1 β d2-4-(Miyaji H et al. 1990) 等。質粒的其他實例包括複製質粒（其包含複製起點）或整合質粒（例如 pUC、pcDNA、pBR）。

總之，本發明涉及以下項目。

第 1 項。一種篩選 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體的方法，其包括以下步驟：a) 提供適當穩定的 MHC 分子，其中所述 MHC 分子在 MHC I 的情況下在所述穩定的 MHC 分子的α1 結構域氨基酸和α2 結構域氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋，並且在 MHC II 的情況下在所述穩定的 MHC 分子的α1 結構域氨基酸和β1結構域氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋，b) 使所述適當穩定的 MHC 分子與其大量肽配體接觸，以形成肽配體/MHC (pMHC) 分子複合體，以及 c) 篩選所述pMHC分子複合體的 TCR 結合。

第 2 項。根據第 1 項所述的方法，其中所述 MHC 分子為HLA，或選自二聚體、三聚體和四聚體組成組的 HLA、MHC I 或 MHC II 的多聚體。

第 3 項。根據第 1 或第 2 項所述的方法，其中氨基酸之間的所述至少一個人工引入的共價橋選自重組引入的二硫橋鍵、引入待交聯的非天然氨基酸、引入光交聯氨基酸和化學方式引入的交聯。

第 4 項。根據第 1 至第 3 項中任一項所述的方法，其中例如透過將 MHC I 的第 84 位的酪氨酸和第 139 位的丙氨酸突變為半胱氨酸而在α-螺旋之間引入氨基酸之間的所述至少一個人工引入的共價橋。

第 5 項。根據第 1 至第 4 項中任一項所述的方法，其中所述大量肽配體包含至少約 1,500 個不同的 MHC 結合肽，優選為至少約 5,000 個不同的 MHC 結合肽，更優選為至少約 15,000 個不同的 MHC 結合肽，最佳為含有至少約 150,000 個 MHC 結合肽的免疫肽組製劑。

第 6 項。根據第 1 至第 5 項中任一項所述的方法，其中所述接觸包括在約 4℃至 30℃（優選為約室溫）下裝載所述 MHC 結合肽。

第 7 項。根據第 1 至第 6 項中任一項所述的方法，其中所述裝載的 HLA/肽分子在約 4℃下穩定時間超過約 1 天，優選為超過 1 週。

第 8 項。根據第 1 至第 7 項中任一項所述的方法，其中與pMHC複合體結合的 TCR 的親和力篩選靈敏度水平高於約 K_d 1.0 x 10^-9 ，優選為高於約 K_d 1.0 x 10^-6 M，更優選為高於約 K_d 1.0 x 10^-3 M。

第 9 項。根據第 1 至第 8 項中任一項所述的方法，其中所述 TCR 選自天然TCR、可溶性 TCR 分子和 TCR 樣分子，例如bsTCR。

第 10 項。根據第 1 至第 9 項中任一項所述的方法，其中TCR 或 MHC 分子適當地固定於固體表面上，例如晶片、生物感測器、載玻片或珠上。

第 11 項。根據第 1 至第 10 項中任一項所述的方法，其中所述 TCR 及/或 MHC 分子無標記/標誌物。

第 12 項。根據第 1 至第 11 項中任一項所述的方法，其中所述方法以高通量篩選形式進行。

第 13 項。一種用於檢測或產生 TCR 的特定氨基酸結合基序的方法，其包括進行根據第 1 至第 12 項中任一項所述的方法（包含預選 TCR）以及決定和比較檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列的額外步驟，從而鑒定所述預選 TCR 的特定氨基酸結合基序。

第 14 項。根據第 13 項所述的方法，其中所述肽配體/MHC 分子複合體用於不同濃度的平行測定反應。

第 15 項。根據第 13 或第 14 項所述的方法，其中重複所述方法步驟，其包括由鑒定的所述預選 TCR 的修飾氨基酸結合基序組成的肽庫。

第 16 項。一種用於檢測或決定 TCR 的交叉反應性的方法，其包括進行根據第 15 項所述的方法以及決定和比較檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列的額外步驟，從而鑒定所述 TCR 的交叉反應性。

第 17 項。一種用於檢測或決定 TCR 的交叉反應性的方法，其包括進行根據第 1 至第 12 項中任一項所述的方法（包括預選 TCR）以及決定和比較檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列的額外步驟，從而鑒定所述 TCR 的交叉反應性。

第 18 項。根據第 1 至第 17 項中任一項所述的方法，其進一步包括測量 T 細胞啟動的步驟，其包含 TCR 和與所述 TCR 結合的 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體。

第 19 項。一種用攜帶刺激框架的肽配體/MHC 分子複合體啟動及/或刺激及/或擴增細胞群（例如，特異性 T 細胞群）的方法，其中所述框架影響固定於載劑（例如，珠、絲、奈米顆粒或任何能夠攜帶所述複合體的載劑）上的肽配體/MHC 分子複合體，其中適當穩定的 MHC 複合體可固定於載劑上，並且在加入肽配體之前框架以此種狀態儲存較長時間，從而顯著增加此類刺激框架在研究或臨床實踐中模擬抗原提呈細胞的實用性。

第 20 項。一種包含適當穩定的 MHC 分子的藥物組合物，其中所述 MHC 分子在 MHC I 的情況下在所述穩定的 MHC 分子的α1 結構域氨基酸和α2 結構域氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋，並且在 MHC II 的情況下在所述穩定的 MHC 分子的α1 結構域氨基酸和β1結構域氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋，其中所述穩定的 MHC 分子與珠、絲、奈米顆粒或其他合適載劑結合。

第 21 項。根據第 20 項所述的藥物組合物，其進一步包含共刺激分子（例如：抗 CD28 抗體或抗 41BB 抗體）的一或多個的組合及/或這些共刺激分子的時間序列。

第 22 項。根據第 20 或第 21 項所述的藥物組合物，其中所述穩定的 MHC 分子可在加入肽配體之前儲存較長時間（例如，在室溫或 4°C 下或 -80°C 以上儲存）。

第 23 項。根據第 20 至第 22項中任一項所述的藥物組合物在根據第 1 至第 19 項中任一項所述的方法中的用途。

在實施例中將對本發明進一步進行說明，參照隨附圖表，但是無限制於此之意圖。為了本發明之目的，所有引用的參考文件均以完整引用的形式併入本文。

SEQ ID NO 1 至 5 和 16 至 325 顯示了以下實施例中使用的肽序列。實施例 1. 肽合成

使用標準Fmoc化學和Syro II 肽合成儀在內部產生所有肽。肽隨後使用 HPLC 分析，平均純度為 74%。紫外光敏感肽含有一個具有 2-硝基苯基氨基酸殘基的光敏結構單元。二肽 GM 採購自Bachem。使用前，肽在 DMSO（Sigma，Cat. Nr. 41640）、0.5% TFA（Sigma，Cat. Nr. T6508）中溶解，濃度為 2mg/ml 至 10mg/ml，取決於所需的用例。2. 透過重折疊和純化產生 MHC 複合體

含有 C 末端BirA信號序列的重組 HLA-A*02:01 野生型 (WT-A*02:01, SEQ ID NO: 322) 或二硫鍵修飾的 HLA-A*02:01 重鏈和人 β₂ m 輕鏈在大腸桿菌中作為包涵體產生並如前述純化 (2)。如前述但稍加修改以進行 HLA-A*02:01 複合體重折疊反應(Saini et al 2013)。簡言之，WT-A*02:01 或 二硫鍵修飾的 HLA-A*02:01 重鏈、β₂ m 輕鏈和肽用重折疊緩衝液（100 mMTris·Cl pH 8、0.5 M精氨酸、2 mM EDTA、0.5 mM氧化谷胱甘肽、5 mM還原型谷胱甘肽）稀釋，並在 4℃下攪拌孵育 2 至 8 天，然後濃縮。使用HiLoad 26/600 200 pg柱 (GE Healthcare)，在ÄKTAprime系統 (GE Healthcare) 上，透過尺寸排阻色譜 (SEC) 在 20 mMTris-HCl、pH 8/150 mM NaCl 中純化濃縮的蛋白質。峰組分直接濃縮為 2000 μg/ml，等分並在 -80℃下冷凍或透過BirA生物素-蛋白質連接酶 (Avidity) 根據製造商的說明在 4℃下生物素化過夜並進行第二次凝膠過濾，之後終濃度至 2000 μg/ml、等分並在 -80℃下儲存。

為了產生 HLA-A*02:01 野生型肽-MHC 複合體，將 9mer（全長）肽或紫外線光敏感的 9mer 肽（全長）添加至濃度為 30 μM 的重折疊緩衝液中。為了產生空的 Y84C/A139C HLA-A*02:01(SEQ ID NO: 323) 複合體，將二肽 GM 添加至濃度為 10mM 的重折疊緩衝液中。為了產生 F22C/S71C HLA-A*02:01 (SEQ ID NO:324) 複合體，未向重折疊緩衝液中加入肽。為了產生 F22C/S71C W51C/G175C HLA-A*02:01 (SEQ ID NO:325) 複合體，未向重折疊緩衝液中加入肽。

下面的表 1 顯示了不同二硫化物修飾 HLA-A*02:01 分子和 WT-A*02:01 分子的重折疊方法：

表 1：+:蛋白質可重折疊；- 蛋白質不可重疊。3. 使用紫外線介導的肽配體交換或空二硫鍵修飾的 HLA-A*02:01 分子產生肽交換的 HLA-A*02:01 pMHC 複合體

按如前述進行紫外線光可切割肽的肽交換反應。簡言之，將所需的九聚體肽與生物素化的 UV 光敏感pMHC複合體以 100:1 的摩爾比混合，並在366 nmUV光下照射至少 30 分鐘 (Camag)。

透過向所述單體溶液加入和混合至少 100:1 摩爾比的所需肽並在室溫下孵育 5 分鐘來進行空二硫鍵修飾的 HLA-A*02:01 複合體的肽裝載反應。4. 可溶性 TCR 的生產

按如前述生產可溶性 TCR (20)。簡言之，TCR α和 TCR β鏈構建體在大腸桿菌中單獨作為包涵體表達並純化。TCR α鏈透過用半胱氨酸取代蘇氨酸在第 48 位置突變，TCR β鏈透過用半胱氨酸取代絲氨酸在第 57 位置突變以形成鏈間二硫鍵。5.bsTCR 的設計和生產

透過將scTv 868Z11連接至人源化抗 CD3 抗體的F(ab')-結構域的 C 末端產生 bs-868Z11-CD3 分子 (22, 23)。為此，scTv的 V_β 結構域與衍生自人 IgG2 (APPVAG, SEQ ID NO:2) 的上部 CH2 區域直接融合。鉸鏈內的半胱氨酸敲除物 C₂₂₆ S 和 C₂₂₉ S 阻止 F(ab)₂ 分子形成。編碼上述構建體或人源化抗 CD3 抗體輕鏈的 HCMV 驅動表達載體在ExpiCHO細胞 (Thermo) 中被暫態共轉染。12 天後，透過串聯色譜法處理上清液（蛋白質L，然後用製備型尺寸排阻法，GE Biosciences），並在 PBS 中配製高純度單體bsTCR。6. 基於 OctetRED 的生物層干涉測量法動力學親和力測量

使用動力學或穩態結合分析法在OctetRED 384 系統 (PallFortébio) 上測量sTCR或bsTCR分子對不同pMHC複合體的親和力。如果無另外說明，所有分析物或配體在動力學緩衝液 (PBS, 0.1% BSA, 0.05% TWEEN 20) 中稀釋至最終濃度。在使用前，在動力學緩衝液中水合所有生物感測器至少 10 分鐘。在 384 傾斜孔板 (PallFortébio) 中進行裝載和測量，在 3mm 感測器偏移下至少為 40 μl。板溫度設定為 25℃，振盪器速度設定為 1000 rpm。為了允許步驟間校正，在同一孔中進行了結合前基線階段和隨後的解離階段。使用動力學緩衝液作為解離緩衝液，如需要，添加適當濃度的 DMSO 以匹配分析物組成。

在pMHC固定化的情況下，使用浸漬和讀取鏈黴抗生物素蛋白 (SA; PallFortébio Cat. Nr. 18-5021) 生物感測器固定 25 μg/ml假定濃度的生物素化pMHC單體 60 秒，接著如無另外說明為 60 秒基線、60 秒結合和 60 秒解離階段。

在bsTCR固定化的情況下，使用浸漬和讀取抗人Fab-CH1 第 2 代(FAB2G; PallFortébio Cat. Nr. 18-5127) 生物感測器固定 100 μg/ml 濃度的bsTCR分子 60 秒，接著如無另外說明為 15 秒基線、60 秒結合和 60 秒解離階段。透過將裝載的生物感測器在 10 mM甘氨酸 pH1.5 和動力學緩衝液中連續孵育各 5 秒共 3 次，把 FAB2G 生物感測器再生最多 4 次。在首次配體固定之前，也以這種方式預處理 FAB2G。

使用OctetRED軟體「Data Analysis HT」10.0.3.7 版 (PallFortébio) 分析所有傳感圖。將數據對準至基線步驟末端以使原始感測器數據在 Y 軸處對準，並使用步驟間校正將解離的開端與結合階段的末端對準。未應用Savitzky-Golay 過濾。然後使用 1:1 Langmuir 動力學結合模型擬合所得的傳感圖。7. 細胞系

表達 TAP 缺陷型 HLA-A*02:01的細胞系 T2 購自 ATCC (CRL-1992)，並在補充有 10% 熱滅活 FCS (Life Technologies, Cat. Nr. 10270106) 和抗生素青黴素和鏈黴素（Biozym，Cat. Nr. 882082，各 100 µg ml^-1 ）的 RPMI 培養基1640 GlutaMAX^TM (Thermo Fisher, Cat. Nr. 61870010) 中培養，如果需要，培養至第 16 代。GloResponse^TM NFAT-luc2 Jurkat細胞系購自Promega (Cat. Nr. CS1764)，為第 6 代，並在補充有 10% 熱滅活 FCS (Life Technologies, Cat. Nr. 10270106)、1% 丙酮酸鈉 (C.C.Pro, Cat. Nr. Z-20M) 和抗生素潮黴素 B  (Merck Millipore, Cat. Nr. 400052, 200 µg/ml)、青黴素和鏈黴素（Biozym，Cat. Nr. 882082，各 100 μg/ml）的 RPMI 培養基1640 GlutaMAX^TM (Thermo Fisher, Cat. Nr. 61870010) 中培養，如果需要，培養至第 14 代。8.T 細胞啟動測定

使用GloResponse^TM NFAT-luc2 Jurkat細胞和肽裝載 T2 靶細胞的 T 細胞啟動測定根據製造商的說明進行。簡言之，從連續細胞培養物中收穫 T2 細胞，洗滌並以濃度 3.3 x 10⁶ 個細胞/ml重懸在 T2 培養基中，之後轉移至 96 孔圓底板 (Corning costar®, Cat. Nr. 3799)。添加溶解於 DMSO、0.5% TFA 的肽使最終濃度為 100 nM，並將懸浮液在 37°C、5% CO₂ 下孵育 2至 3 個小時。在 PBS 中配製的bsTCR在 T2 培養基中稀釋至所需濃度，並將 25 μl 稀釋液各自分配至白色 96 孔平底板中 (Brand, Cat. Nr. 781965)。從連續細胞培養物中收穫GloResponse^TM NFAT-luc2 Jurkat細胞，洗滌並以濃度 3.0 x 10⁶ 個細胞/ml重懸在 T2 培養基中，之後將 25 μl 細胞懸浮液分配至含有bsTCR稀釋液的白色 96 孔平底板中。

在肽裝載後，重懸 T2 細胞，並將 25 μl分配至含有bsTCR稀釋液和GloResponse^TM NFAT-luc2 Jurkat細胞的白色 96 孔平底板中，使最終效應子與靶標比率為1:1（各 75,000 個細胞）。將完全組裝的板在平板振盪器上在 300 rpm下混合 5 分鐘，之後在 37°C、5% CO₂ 下孵育 18 至 20 個小時。孵育期後，向各孔中加入 75μl 的 Bio-Glo^TM 螢光素酶試劑，將板在避光下在平板振盪器上以 300 rpm孵育數分鐘，然後用 Synergy2 平板讀數器 (Biotek) 以 0.5 秒積分時間讀取發光數值。以相對光單位 (RLU) 測得的發光數值透過將測得的 RLU 除以對照孔的 RLU 而轉換為各孔的誘導倍數。9. 結晶和成像

濃縮 Y84C/A139C HLA-A*02:01–SLLMWITQV 複合體和 1G4 TCR 並以 1:1 的比例混合，以達到用於結晶的 7 mg/ml 濃度。坐滴蒸氣擴散實驗在含有 0.1 M 乙酸銨、0.1 M bis-tris (pH 5.5) 和17% 聚乙二醇 (PEG) 10,000 的母液存在的情況下產生晶體。單晶被轉移至含有 0.1 M 乙酸銨、0.1 M bis-tris (pH 5.5)、20% (w/v) PEG 10,000 和 10% 甘油的冷凍保護劑溶液中。在含有一個 EIGER 16M 檢測器的德國電子同步加速器 (Deutsche Elektronen-Synchrotron) 上以 EMBL P14 光束線在 100 K 安裝和低溫冷卻晶體。收集 x 射線數據集，解析度為 2.5 Å（表 2）。 表 2：數據收集和改進統計 1G4/Y84C/A139C HLA-A*02:01/SLLMWITQV

數據用 XDS 處理並用 AIMLESS 進行縮放 (35,36)。分子置換使用 MOLREP 進行，首先以天然複合體的 TCR 部分為座標，然後以 pMHC [蛋白質數據庫 (PDB) 2BNR] 為座標，並用 REFMAC5 改進結構 (37,38)。改造的二硫鍵用 Coot 手動建立 (39)。結構改進至R 因數為 22.9%（R _free 為 27.3%）。使用 MolProbity 驗證幾何形狀，顯示 93.9%的殘基位於 Ramachandran 圖的允許區域內 [​不允許的區域內有一個甘氨酸殘基 (Gly143)] (40)。10. 潛在交叉反應性肽配體基於基序的鑒定

使用 NCBI 人蛋白質數據庫對搜索基序允許的與潛在組合之一匹配的九聚體肽配體進行搜索。此數據庫涵蓋了所有非冗餘的 GenBank CDS 轉譯以及來自 PDB、SwissProt、PIR 和 PRF 的記錄，但不包括來自全基因組鳥槍專案的環境取樣。此數據庫直接從 NCBI 伺服器獲得。11.Seq2Logo 的產生

視覺化結合基序的 Seq2Log 透過獲取相應相互作用測得的 K_d 值的倒數值並除以 10⁸ 來建立。這些值以位置特異性評分矩陣檔的形式聚集並使用丹麥技術大學生物資訊學系的 Seq2Logo 線上資源上的 PSSM-Logo 類型進行處理 (27)。12. 透過螢光各向異性測得的肽結合情況

肽結合用螢光各向異性測定法評估，使用 300 nM純化重折疊 Y84C/A139C HLA-A*02:01。將 100 nM 螢光標記的高親和力肽 NLVPK_FITC VATV (Genecast) 加入到折疊 Y84C/A139C HLA-A*02:01 中，用 Tecan Infinite M1000 PRO（Tecan，Crailsheim，德國）多模式板讀數器測量各向異性而進行動力學測量（FITC λ_ex = 494 nm、λ_em = 517 nm）。Y84C/A139C HLA-A*02:01 在重折疊後直接使用或在 -80℃  下在儲存緩衝液（10% 甘油，50mM Tris-HCL，pH8.0）中保存指定的時間長度，然後進行測量。動力學測量在室溫 (22‑24°C) 下於 50 mM HEPES 緩衝液 (pH 7.5) 中進行。數據使用 GraphPad Prism v7 繪製。13. 抗 β -2 微球蛋白 ELISA

將 PBS 中終濃度為 2μg/ml 的鏈黴抗生物素蛋白（Molecular Probes，Cat. Nr. S888） 加入 Nunc MAXIsorp 板（Thermo Fisher，Cat.Nr.439454），將密封板在潮濕的環境中於室溫下孵育過夜。次日，應用 ELx405 洗板機 (Biotek) 用洗滌緩衝液（PBS，0.05% TWEEN-20）洗滌板 4 次。向每個孔中加入 300 μl 封閉緩衝液（含有 2% BSA 的 PBS），將密封板在 37℃ 下孵育 1 小時。棄置封閉緩衝液，接著加入100μl 的 1:100 各別 UV 交換 pMHC 製劑於封閉緩衝液中之稀釋液。每個板上含有基於一般重折疊 pMHC 單體的 500 ng/ml 至 15.6 ng/ml 的標準系列。用 300 μl 封閉緩衝液填充邊緣孔以減少邊緣效應，將密封板在 37℃ 下孵育 1 小時。板再洗滌 4 次，然後向每個孔中加入終濃度為 1 μg/ml 的 100 μl 抗-β2微球蛋白HRP 綴合二抗（Acris，Cat. Nr. R1065HRP）。密封板在 37℃ 下孵育 1 小時。用洗滌緩衝液再洗滌板 4 次，然後向每個孔中加入 100 μl 室溫 TMB 底物（Sigma，Cat. Nr. T0440）。室溫下孵育板 5 分鐘，然後透過向每個孔中加入50 μl 的 1N H₂ SO₄ 而終止。透過使用 Synergy2 讀板器讀取 450 nm 處的吸光度 5 秒來立即進行板分析。使用 Synergy2 軟體基於標準曲線擬合  (Log(Y)=A*Log(X)+B) 計算 pMHC 濃度。數據使用 GraphPad Prism v7 繪製。14. 流式細胞術 T2 肽結合測定

表達 TAP 缺陷型 HLA-A*02:01的細胞系 T2 購自 ATCC (CRL-1992)，並在補充有 10% 熱滅活 FCS (Life Technologies, Cat. Nr. 10270106) 和抗生素青黴素和鏈黴素（Biozym，Cat. Nr. 882082，各 100 µg/ml）的 RPMI 培養基1640 GlutaMAX^TM (Thermo Fisher, Cat. Nr. 61870010) 中培養，如果需要，培養至第 16 代。從連續細胞培養物中收穫 T2 細胞，洗滌並在 T2 培養基中以濃度 3.3 x 10⁶ 個細胞/ml重懸，之後轉移至 96 孔圓底板 (Corning costar®, Cat. Nr. 3799)。添加溶解於 DMSO、0.5% TFA 的肽使最終濃度為 10 µM，並將懸浮液在 37°C、5% CO₂ 下孵育 2 個小時。用 PFEA（PBS、2% FCS、2 mM EDTA、0.01% 疊氮化鈉）洗滌板兩次，然後每孔加入 50 μl 用 PFEA 稀釋 1:250 至終濃度為 0.8 μg/ml 的PE 標記的抗人 HLA-A2（Biolegend，Cat. Nr. 343305）。在 4℃ 下孵育板 30 分鐘，然後用 PFEA 洗滌兩次。最後，將細胞重懸於固定溶液（PFEA、1% 甲醛）中並保持於 4℃ 下，然後使用 iQue Screener (Intellicyt) 進行分析。基於 FSC-A/SSC-A 信號門控 T2 細胞，使用 FSC-H/FSC-A 雙聯體排除法除去雙聯體。PE 通道正向門控座標基於未染色的對照物。數據使用 GraphPad Prism v7 繪製。15. 序列比對

多序列比對透過使用 Clustal Omega 多序列比對法 (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) (Madeiraet al . 「The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019」, Nucleic Acids Research, 47: W636-W641, 2019, doi: 10.1093/nar/gkz268) 進行。16. 統計分析

使用第 7 版 GraphPad Prism 軟體繪製所有數據。透過計算 Pearson 相關係數計算 x 和 y 數據集之間的相關性，並使用第 7 版 GraphPad Prism 軟體將其報告為R ² 。用於生物層干涉測量法結合動力學測量值的曲線擬合的R ² 和X ² 值使用 Octet RED384 系統軟體第 10.0.3.7 版本 Data Analysis HT 進行計算。17. 二硫鍵穩定的空 HLA-A*02:01 分子的設計和生產

空的和肽裝載的 MHC I 類分子的分子動力學模擬表明，前者在容納肽配體 C 末端的 F 袋中行動性增加 (16)。在之前使用鼠 MHC I 類分子 H-2K^b 的研究中，透過將第 84 位的酪氨酸和第 139 位的丙氨酸突變為半胱氨酸而在F-袋中的相對殘基之間引入二硫鍵能夠穩定所述複合體。突變體可在沒有全長肽的情況下重折疊，並且能夠進行追溯性肽結合 (17,18)。

本發明人假設相同的概念可應用在人 MHC I 類分子 HLA-A*02:01 上。致使第 84 位酪氨酸和第139位丙氨酸突變為半胱氨酸的修飾引入 HLA-A*02:01 重鏈表達質粒。重鏈在大腸桿菌中作為包涵體產生後，用類似產生的 β₂ m 一起孵育，但在重折疊緩衝液中不含肽。在尺寸排阻色譜 (SEC) 法分析後，與用 9mer 肽重折疊的野生型對照物相比，未觀察到 HLA-A*02:01 結合的單體組分。

在第二種方法中，二肽 GM 被添加至重折疊中：此二肽對 MHC I 類複合體的親和力非常低，可協助重折疊 (19)。SEC 期間，所述二肽透過運行緩衝液的緩衝液交換而快速從結合袋中解離，從而產生純化的空二硫化物穩定 Y84C/A139C HLA-A*02:01。空的野生型 A*02:01 複合體 (WT-A*02:01) 不能以相同的方式產生。WT-A*02:01 複合體可以用二肽產生，但當試圖透過緩衝液交換除去二肽時，產生變性。

本發明人還引入了修飾，使第 22 位的苯丙氨酸和第 71 位的絲氨酸在 HLA-A*02:01 重鏈表達質粒中突變為半胱氨酸。重鏈在大腸桿菌中作為包涵體產生後，用類似產生的 β₂ m 一起孵育，但在重折疊緩衝液中不含肽。SEC 產生純化的空二硫鍵穩定 F22C/S71C HLA-A*02:01 複合體。本發明人還引入了修飾，使第 22 位的苯丙氨酸和第 71 位的絲氨酸以及第 51 位的色氨酸和第 175 位的甘氨酸在 HLA-A*02:01 重鏈表達質粒中突變為半胱氨酸。重鏈在大腸桿菌中作為包涵體產生後，用類似產生的 β₂ m 一起孵育，但在重折疊緩衝液中不含肽。SEC 產生純化的空二硫鍵穩定 F22C/S71C W51C/G175C HLA-A*02:01 複合體。

透過緩衝液交換的熱穩定性分析可顯示純化單體中不存在二肽 GM：空 Y84C/A139C HLA-A*02:01 分子的溫度穩定性低於（即，熔化溫度較低）仍與二肽 GM 複合的相同分子(41)。

所得的分子在 4℃下過夜生物素化，並透過第二次 SEC 運行從過量的生物素分離，或在使用前直接儲存於 -80℃下。18. 使用可溶性 TCR 和野生型或二硫化物修飾的 MHC 進行的肽裝載和親和力測量

接下來，本發明人決定了空二硫鍵修飾的 HLA-A*02:01 分子是否能夠形成肽-MHC 複合體和與 TCR 配體結合。使用重折疊 TCR 1G4 作為可溶性分析物，透過生物層干涉測量法 (BLI) 在OctetRED 384 上進行親和力測量。此 TCR 辨識源自癌症睾丸抗原 NY-ESO-1的 HLA-A*02:01 特異性肽 SLLMWITQC (ESO 9C, SEQ ID NO:3)或其合成變體SLLMWITQV (ESO 9V, SEQ ID NO:4) (20,21)。生物素化 Y84C/A139C HLA-A*02:01 在其空的狀態下直接固定，或用肽 ESO 9V 短暫孵育後固定在鏈黴抗生物素蛋白包覆的生物感測器上（圖 1b）。肽孵育 5 分鐘（組裝後啟動親和力測量所需的最短時間）或更長時間之間未檢測到任何差異。進一步分析表明，當使用高濃度肽時，確實在一至兩分鐘內達到完全交換。在多個 1G4 濃度下測量動力學，並且用 ESO 9V 直接重折疊的野生型 HLA-A*02:01 作為對照。

1G4 TCR 與 Y84C/A139C HLA-A*02:01 9V 或 WT-A*02:01 ESO 9V 的結合在傳感圖和曲線擬合產生的 K_d 方面非常相似（圖 2a 和 2b）。在高濃度 1G4 下，可檢測到空固定單體的弱結合信號（但無解離）（圖 2c）。透過隨後添加 1G4 無法辨識的肽如：SLYNTVATL（圖 2d，SEQ ID NO:5）可以阻止這種結合。空 Y84C/A139C HLA-A*02:01 獲得的弱信號可透過 TCR 與空結合袋的非特異性相互作用來解釋，這是 TCR 在體內通常不會遇到的一種狀態。具有不同特異性的其他 A*02:01 限制性可溶性 TCR 表現相似，表明其不與不相關負載的 Y84C/A139C HLA-A*02:01 pMHC 結合但與功能性空分子結合，儘管反應相對較低（圖 11）。19. 二硫鍵修飾的 HLA-A*02:01 和 WT-A*02:01 對親和力成熟型 TCR 的親和力測量值之間的相關性

本發明人已確立了 Y84C/A139C HLA-A*02:01 分子作為未修飾 TCR 的 WT-A*02:01 配體均等物的可用性，希望將此分析擴展至突變的高親和力 TCR 和更多數量的肽配體。本發明人使用了成熟單鏈 TCR (scTv) 868Z11，這是 TCR 的一種親和力成熟變體，其可辨識 HIV p17 Gag 衍生的 HLA-A*02:01 限制性肽 SLYNTVATL (SL9, SEQ ID NO:5) (8, 22)。

本發明人透過在鏈黴抗生物素蛋白生物感測器上固定空的或 SL9 肽負載二硫化物修飾的HLA-A*02:01 分子進行親和力測量，並測量了可溶性 bs-868Z11-CD3（是與人源化抗 CD3 抗體融合後表達的一種 868Z11 scTv 的 bsTCR 變體）（圖 9）(23)。使用 Y84C/A139C HLA-A*02:01、F22C/S71C HLA-A*02:01 或 F22C/S71C W51C/G175C HLA-A*02:01 之 SL9 二硫化物修飾 HLA-A*02:01pMHC 複合體的結合親和力類似於透過進行 UV 光介導肽配體交換而產生的SL9 WT-A*02:01 pMHC (25)，分別為 2.35 nM 和 3.24 nM（圖 3a，亦見圖 14）。對於此 bsTCR，空 MHC 分子的結合不可測量（圖 3c），在 13.3 μM 的高摩爾濃度下不相關負載 Y84C/A139C HLA-A*02:01 複合體的結合不可測量。

接下來，本發明人基於 SL9 肽序列分析了 bs-868Z11-CD3 位點掃瞄文庫的結合親和力。此文庫的建立方法為：將野生型 SL9 肽一個位置上的氨基酸與剩餘的 18 個蛋白質氨基酸進行交換，同時維持所有其他位置，當在九聚體的所有位置執行時產生 162 個不同的肽（半胱氨酸由於其二聚化傾向而被排除）(24)。本發明人如之前一樣透過添加至Y84C/A139C HLA-A*02:01 分子或透過進行 UV-光介導的肽配體交換而產生pMHC複合體，所述技術用於產生pMHC複合體 (25)。各自的pMHC複合體固定於鏈黴抗生物素蛋白上，並在兩種不同的 bs-868Z11-CD3 濃度下測量動力學。如預期的一樣，使用交替肽配體產生了廣泛的不同K_d ，範圍為在所選擇設置的靈敏度極限內不可檢測至與未修飾 SL9 肽的相互作用相當或甚至更強。。

為了直接比較，選擇在兩個分析物濃度下具有可評估信號和曲線擬合的 R²值至少為 0.9 的所有測量的pMHC複合體，代表信號在選定 K_d 靈敏度範圍內。當對彼此作圖時，所得的 140 個肽配體的 K_d 值在整個親和力範圍內非常相似，相關係數值高支持了這一發現（圖 3d）。超過 90% 的pMHC對的差異在 2 倍範圍內，而差異最大為 6.82 倍。在變化高於 2 倍的組中，可觀察到 Y84C/A139C HLA-A*02:01 分子測量值的解離常數較大的趨勢。

對於來自位置掃瞄文庫的 140 種不同肽配體，由所報告 R_max 值表達的每個生物感測器上固定的功能性 pMHC 量在野生型和二硫化物穩定 pMHC 均相當（相關係數 R² = 0.9459）。

圖 15 顯示了高親和力 TCR 對不同 pMHC 複合體的 K_d 值。在每種情況下，WT-A*02:01 分子或 Y84C/A139C HLA-A*02:01 分子的 K_d 顯示於 X 軸上，兩個不同的二硫化物修飾 HLA-A*02:01 MHC 分子的 K_d 顯示於 y 軸上，每個點表示 MHC 分子中負載的一個不同肽。圖 15 之每一者方塊表示以下肽： A：  HIV-005 WT     (SLYNTVATL, SEQ ID NO:5) B：  HIV-005 6I   (SLYNTIATL, SEQ ID NO:110) C：  HIV-005 8V      (SLYNTVAVL, SEQ ID NO:145) D：  HIV-005 3F   (SLFNTVATL, SEQ ID NO:59) E：  HIV-005 3F6I8V (SLFNTIAVL), SEQ ID NO:318) F：  HIV-005 3F8V   (SLFNTVAVL, SEQ ID NO:319) G：  HIV-005 3F6I   (SLFNTIATL, SEQ ID NO:320) H：  HIV-005 6I8V (SLYNTIAVL, SEQ ID NO:321)

在左上圖中，WT-A*02:01 pMHC 複合體的每個上述肽的 K_d 相對於二硫化物修飾 F22C/S71C HLA-A*02:01 pMHC 複合體的 K_d 進行作圖。對於每種在研肽，二硫化物修飾 F22C/S71C HLA-A*02:01 pMHC 複合體顯示與 WT-A*02:01 pMHC 複合體的 K_D 值幾乎相同。在左下圖中，WT-A*02:01 pMHC 複合體的每個上述肽的 K_d 相對於二硫化物修飾 F22C/S71C W51C/G175C HLA-A*02:01 pMHC 複合體的 K_D 進行作圖，並且顯示與每種在研肽的 WT-A*02:01 pMHC 複合體的 K_d 值也幾乎相同。

在右上圖中，Y84C/A139C HLA-A*02:01 pMHC 複合體的每個上述肽的 K_d 相對於二硫化物修飾 F22C/S71C HLA-A*02:01 pMHC 複合體的 K_d 進行作圖。在右下圖中，Y84C/A139C HLA-A*02:01 pMHC 複合體的每個上述肽的 K_d 相對於二硫化物修飾 F22C/S71C W51C/G175C HLA-A*02:01 pMHC 複合體的 K_d 進行作圖。對於每種在研肽，F22C/S71C 和 F22C/S71C W51C/G175C 突變體的二硫化物修飾 pMHC 複合體與Y84C/A139C HLA-A*02:01 pMHC 的 K_d 值幾乎相同。因此，可以得出結論：負載不同肽並形成 pMHC 複合體的二硫化物修飾 HLA-A*02:01 分子與 WT HLA-A*02:01 pMHC 複合體可相比地透過各自親和力成熟 TCR 辨識。因此，負載肽的二硫化物修飾 HLA-A*02:01 分子（pMHC 複合體）的功能不受 HLA-A*02:01 分子中所引入之穩定氨基酸突變的影響。

圖 15 中顯示的結果使技藝人士相信：負載肽配體並形成二硫化物修飾pMHC複合體的根據本發明的二硫化物修飾 HLA-A*02:01 分子在與其各自 TCR 結合時可引發 T 細胞反應。20. 用於結合基序產生的高通量動力學篩選

快速靈活地產生 pMHC 有助於收集多種不同 pMHC 的結合親和力大數據集。此類數據集的一個實例是篩選位置掃瞄文庫以產生 pMHC-bsTCR 結合基序，其可以作為 bsTCR 安全性篩選方法中的一個組成部分。為了進行此類測量，理想的情況是，所述 pMHC 應用作可溶性分析物，因為這可提供多種優勢。首先，重複固定具有已知活性的相同配體（例如，bsTCR）可更好地解讀擬合結果，尤其是所報告的 R_max 值。其次，由於存在能夠可逆地固定雙特異性 TCR 構建體的多種可再生生物感測器，因此，使用 pMHC 複合體作為可溶性分析物來替代固定對於快速且具有成本效益的高通量篩選為優選。這些生物感測器通常包覆有抗體，可用於動力學測量至少 20 次而不會降低讀數品質。第三，當 bsTCR 或抗體具有多個 pMHC 結合部分時，固定 bsTCR 是可用於測量單價親和力的唯一方向，因為若是固定 pMHC，則僅可測量親合力。

雖然 UV 介導的肽配體交換可產生大量不同的pMHC複合體，但是交換效率根據肽及其與相應 MHC I 類等位基因結合的親和力而變化，這導致取樣的pMHC濃度不同（圖 10）。這種不決定性對於用作可溶性分析物的pMHC的親和力測量是一個問題，因為需要精確知道濃度才能決定準確的親和力。由於二硫鍵穩定的 Y84C/A139C HLA-A*02:01 突變體在沒有任何肽的情況下是穩定的，因此，此限制不適用。如果以足夠高的濃度加入肽以使空的 MHC 複合體飽和，則知道pMHC的有效濃度，這可顯著提高測量的準確性並避免假陰性結果。這種行為的實例可在位置掃瞄庫中可檢測到這種行為的實例，與使用 Y84C/A139C HLA-A*02:01 肽負載相比，當使用 UV 交換製劑時，這可導致擬合數據差和親和力計算錯誤（圖5、6、10）(26)。準確測量 bsTCR 對此類肽的親和力對於產生結合基序可能很重要，因為當與其他位置的取代組合時，這些取代可導致相關的 MHC 結合物。因此，應在全面的結合基序中正確反映 bsTCR 對氨基酸的耐受性。

透過固定bs-868Z11-CD3 bsTCR，本發明人能夠在無人值守的測量時間的4小時內以降低 20 倍的價格標籤分析每種肽配體在四種不同可溶性 PMHC 濃度下的位點掃瞄文庫，範圍為 500 至15.8 nM。達到至少 0.05 nm信號水平的所有曲線均納入擬合中，從而產生全面的 TCR 結合基序（圖 4a、8，表 3）。

表 3：bs-868Z11-CD3 對 SV9 肽 SLYNTVATL (SEQ ID NO:5) 和來自位置掃瞄文庫的肽 (SEQ ID NO:16-177) 的結合親和力。表中包括使用 Fortébio Data Analysis HT 10.0.3.7 軟體按 1:1 Langmuir 結合模型透過曲線擬合決定的K_D 、k_on 和 k_off 值。根據模型報告了各自的誤差以及擬合的準確性。報告為「無擬合」的肽在任何濃度下均無至少達到 0.05 nm峰值信號的可評估曲線。

表 4：基於使用位置掃瞄文庫測得的親和力的 bs-868Z11-CD3 交叉反應性肽配體搜索基序。為了達到搜索基序，移除每個位置所研究的 19 種蛋白原氨基酸中增加 bsTCR 相應親和力至 50 nM 以上的所有氨基酸。

可溶性 Y84C/A139C HLA-A*02:01 pMHC 製劑可在 4°C 下儲存至少 2 週而不會降低品質並可用於多次分析（圖 12；第 1 天：K_D = 1.35E^-09 M，R² = 0.9992；第 14 天：K_D = 1.08E^-09 M，R² = 0.9991）。

868Z11 TCR 顯示預期的辨識模式：第 3 至第 7 位置氨基酸的變化對bsTCR結合親和力的影響最大。有趣的是，與野生型肽的相互作用相比，僅有一個氨基酸變化導致 bs-868Z11-CD3 的結合親和力增加，這表明 TCR 在其親和力成熟狀態下對靶標具有明顯的親和力。當將結合基序視覺化為 Seq2Logo 圖（圖 4b）時，也可以圖形方式說明這種行為 (27)。21. 與 bs-868Z11-CD3 交叉反應的肽配體的鑒定

本發明人欲進一步探索他們是否能夠使用產生的結合基序來鑒定來自人基因組的交叉反應性肽配體。本發明人透過引入 50 nM的代表性 K_d 閾值根據親和數據集建立了肽配體搜索基序：從所述基序中排除所有增加bs-868Z11-CD3 K_d 高於此閾值的單個氨基酸取代（圖 4）。根據此基序，本發明人在 NCBI 人非冗餘蛋白質序列數據庫中進行了搜索，以尋找與基序允許的組合相匹配的九聚體序列。所述搜索在人基因組內鑒定了超過 400 個命中，與野生型序列 SLYNTVATL 具有 1 至 6 個相同位置的序列同一性。選擇 140 個肽、取樣代表較大組中的序列同一性分佈、合成並用於親和力測量（表 5；SEQ ID NOS: 178-317）。本發明人能夠檢測到，這些肽中有 91 個具有單位數 μM K_d 或更高的結合親和力。

表5：bs-868Z11-CD3 對基於 bs-868Z11-CD3 結合基序決定的選定肽配體的結合親和力。報告根據 NCBI 數據庫的肽序列和相關基因，並按照 K_d s 降冪排列肽。表中包括使用 Fortébio Data Analysis HT 10.0.3.7 軟體按 1:1 Langmuir 結合模型透過曲線擬合決定的K_D 、k_on 和 k_off 值。根據模型報告了各自的誤差以及擬合的準確性。報告為「無擬合」的肽在任何濃度下均無至少達到 0.05 nm峰值信號的可評估曲線。

其中之一為 ALYNVLAKV (SEQ ID NO:1)，值得特別注意。將其選擇為理論肽，但根據 XPRESIDENT® 免疫肽組數據庫另外在組織取樣和細胞系中發現。此數據庫合併了基於 LC-MS 分析的定量 HLA 肽組學以及健康組織和腫瘤組織RNAseq提供的定量轉錄組學數據，以鑒定僅在腫瘤組織上或主要在腫瘤組織上提呈的肽 (28, 29)。ALYNVLAKV 是來自中間絲家族孤稀 1 或 2 (IFFO1/2) 蛋白的抗原，在多種健康組織和腫瘤組織（從頭頸部、脾臟或腎臟至非小細胞肺癌或腎細胞癌）取樣中檢測到。所測得的pMHC-bsTCR結合親和力為 65.9 nM的 K_D （圖 4c）。本發明人能夠鑒定第二種 LC-MS 檢測的肽 KTFNLIPAV (SEQ ID NO:226)，在三種腫瘤組織取樣上檢測到的 K_d 較低，為 413 nM。22.bsTCR 親和力與 T 細胞啟動的相關性

可使用此高通量篩選平臺測量pMHC-bsTCR結合親和力，但應與體外活性一致，這是因為功能性 T 細胞參與bsTCR甚至更有用。通常來說，靶細胞和效應細胞的體外共孵育結果與適當的讀數相結合可用於表徵這些構建體。GloResponse^TM NFAT-luc2 Jurkat效應細胞（一種表達由 NFAT 反應元件驅動的螢光素酶報告子基因的細胞系）以及肽裝載 T2 靶細胞（一種 TAP 缺陷型 A*02:01 細胞系，其透過外源性肽裝載可恢復pMHC提呈）在存在 bs-868Z11-CD3 的情況下孵育，以證實在此背景下動力學篩選的意義。將T2 細胞分別裝載濃度 100 nM 的來自位點掃瞄文庫的各別肽，隨後用Jurkat細胞和不同的bsTCR濃度共孵育 18 小時，然後進行讀數。如所預期的一樣，本發明人遇到了廣泛的結果，範圍從在任何bsTCR濃度下無檢測到 T 細胞啟動到從低濃度開始出現例如對野生型肽的強烈反應（圖 5a）。由於對於選定bsTCR濃度範圍內的許多相互作用無法測定 EC50 值，因此，本發明人透過 T 細胞啟動的啟動對個別肽進行分類，定義為能夠誘導上述信號增加 3 倍的最低bsTCR濃度。將起始值對分別測得的 K_D 作圖（圖 5b）。

整體來說，本發明人檢測到測定的 K_d 值和 T 細胞啟動之間存在良好的相關性，其中一組明顯離群值具有強pMHC-bsTCR結合親和力，但是 T 細胞啟動起始延遲或完全無啟動。本發明人能夠鑒定這些肽與其NetMHC預測的對 MHC 的結合強度之間存在直接關聯（圖 5c）(26)。這提供了潛在的解釋，因為不同肽結合親和力可在外源負載後在靶細胞上形成不同提呈水平的各 pMHC。這些水平接著可能影響 pMHC-bsTCR 複合體的數量，及最終 Jurkat 效應子（T 細胞）的啟動。為了證實假設，本發明人使用抗 HLA-A2 抗體進行了流式細胞術 T2 肽結合測定，對於較低結合親和力的肽，在肽負載後，可檢測出 HLA-A2 表面水平升高較少，尤其是NetMHC 等級為 2 及以上，這支持了最初的假設。NetMHC等級 0.05 和 2 之間的肽配體之pMHC-bsTCR結合親和力與 T 細胞啟動起始具有很好的相關性，而高於此閾值時， T 細胞啟動隨著NetMHC等級進一步增加而降低，且與pMHC-bsTCR結合親和力多半無關。

本發明人還對透過結合基序搜索選擇的 140 個肽配體進行了 T 細胞啟動測定，其中 24 個能夠在至少一個提供的bsTCR濃度下誘導 3 倍背景值的 T 細胞啟動（圖 5d）。測得的 K_d 與 T 細胞啟動起始具有相關性，類似於透過位點掃瞄文庫獲得的結果。先前強調的 IFFO1 抗原 ALYNVLAKV (SEQ ID NO:1) 在報告子測定中也具有反應性（圖 5e）。

發明人的結果顯示 pMHC-bsTCR 結合親和力是與抗 CD3 T 細胞銜接器 (anti-CD3 T cell engager) 耦合的 scTv 868Z11 體外功能的良好指標。這強調了 pMHC-bsTCR 結合動力學篩選平臺的價值，因為它可使得在這些分子的開發早期快速而又充分地表徵 bsTCR。23.1G4 Y84C/A139C HLA-A*02:01:01 ESO 9V TCR-pMHC 的晶體結構

為了進一步證實 1G4 TCR 辨識 ESO 9V Y84C/A139C HLA-A*02:01 與 ESO 9V WT-A*02:01 為沒有區別的，將 TCR 和 ESO 9V 重折疊的二硫化物穩定 MHC 進行共結晶（如之前野生型 ESO 9V HLA-A*02:01 分子所報告的一樣）並透過 x 射線晶體學進行分析（表 2）(21)。晶體結構的比較顯示兩種複合體的結構高度重疊。HLA-A*02:01 分子的骨架幾乎完美地排列，其均方根偏差 (RMSD) 值為 1.14 Å，用 Cα（T 細胞受體 α 鏈恒定部分；圖 7A）算得。這對於兩種結合肽均是如此，包括其側鏈，用所有原子算得的 RMSD 值為 1.27 Å，即便與二硫鍵很近時也如此（圖 7B）。對於與 1G4 TCR 的相互作用，可得出類似結論。WT-A*02:01 1G4 與 Y84C/A139C HLA-A*02:01 1G4 晶體結構比較時，與肽和 MHC 骨架相互作用的互補決定區 (CDR) 環區確實顯示介面有輕微偏差，對接角發生 4.13° 的較小變化。重複進行結晶時，這種偏移仍在同一複合體的預期偏差範圍內（圖 7，C 和 D）。總之，決定的結合親和力和晶體結構展現了 Y84C/A139C HLA-A*02:01 pMHC 複合體與野生型複合體相比就 TCR 結合而言具有肽接受性和類似性質。1G4 Y84C/A139C HLA-A*02:01 ESO 9V 複合體的晶體結構以登錄號 6Q3S 保存於 PDB 中。24. 討論

本文中，本發明人提出了二硫化物穩定的和功能上空的 HLA-A*02:01 分子，其可在不使用通常需要高親和力肽（例如，二肽 GM）的情況下進行重折疊和純化。在一步負載程式法中加入肽後，所得單體可形成 pMHC。雖然二硫鍵增強了 MHC 分子的穩定性，但與野生型相比，引入不會抑制或顯著改變 TCR 與二硫化物修飾 HLA*02:01 pMHC 複合體的結合。此技術是一種很好工具的代表，可快速產生適合親和力測量的大型 pMHC 文庫。二硫化物修飾HLA*02:01 產生的 pMHC 複合體文庫與基於生物層干涉測定法的分析結合可形成能夠進行高通量 pMHC-bsTCR 結合動力學篩選的平臺。此設置也可用於分析靶向作用於 pMHC 複合體的其他生物製劑，如：單克隆抗體或雙特異性抗體（諸如，雙特異性 T 細胞銜接器）。在此平臺的一種應用中，本發明人能夠快速收集 HIV 特異性 bsTCRbs-868Z11-CD3 的 pMHC-bsTCR 結合親和力數據集。與所提呈的 T 細胞銜接器耦合並且在細胞報告測定中進行測試時，bsTCR 對各 pMHC 的結合親和力提示體外活性，因而使這些數據集可用於 bsTCR 表徵。在廣泛的 pMHC-bsTCR 親和力範圍內分析結合親和力與 bsTCR 介導細胞啟動之間的關係有困難，因此，可作為有限的工具以可行地收集此類數據集。

所收集的結合基序顯示出與野生型 TCR 868 的結合基序的相似性。868-SV9晶體結構的分析以及Cole 等人 (34) 的伴隨丙氨酸掃瞄顯示，CDR3α 區與 SLYNTVATL 的氨基酸 4N 和 5T 之間存在明顯相互作用。即使 CDR3α 的重要部分在 868Z11 構建體中發生突變，這種行為似乎仍被保留。透過使用結合基序和模型搜索策略，本發明人能夠鑒定來自人蛋白質組的多個肽，其表現出與 bsTCR 之間的高親和力相互作用並可能在提呈於靶細胞上時誘導 bsTCR 介導的 Jurkat 效應子啟動。

請注意，源自單個氨基酸取代文庫的 TCR 結合基序可能仍不能反映特定 TCR (sTCR) 可辨識的所有可能的肽，這是因為多個氨基酸的同時交換可能與單獨交換具有不同的作用。替代方法包括，例如，透過高度多樣性肽庫（各肽在除了一個以外的所有位置隨機化）負載的靶細胞篩選更複雜的文庫，或篩選針對在酵母表面上提呈為 pMHC 複合體的隨機肽文庫 (10, 32, 33)。需要進一步進行研究，直接比較這些方法，以更深入瞭解各自的優勢和劣勢。最終，對臨床候選物的安全篩查應始終由多種方法組成，例如，透過將結合基序引導的分析與大系列健康組織衍生細胞系的細胞篩選相結合，從而使風險降到最低。本文提出的結果強調了此方法與 pMHC-bsTCR 結合動力學篩選平臺結合能夠鑒定潛在的相關脫靶相互作用。由於可快速分析複雜 pMHC 文庫，因此，可用於開發程序早期，以選擇有希望的候選物，從而使已確立的方法更完善。此平臺還可促進對晚期候選物的更大和更全面的篩選，可能針對覆蓋已知免疫肽組的質譜數據驅動的組織特異性 pMHC 文庫。由於二硫化物修飾 HLA*02:01 分子穩定和肽負載程式容易進行，因此，可能實現更高通量的平臺。由於這些特性，因此，非常適用於透過例如將二硫化物修飾 HLA*02:01 分子的量產塗層與現代高通量肽微陣列噴墨印表機相結合，以建立具有數千種不同 pMHC 複合體的高複雜性 pMHC 微陣列。 引用的參考文件 1.  Rammensee, H. G., Falk, K. & Rötzschke, O. Peptides naturally presented by MHC class I molecules.Annu. Rev. Immunol. 11, 213–44 (1993). 2.  Garboczi, D. N.et al. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429–3433 (1992). 3.  Altman, J. D.et al. 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無

圖 1 顯示了二硫鍵穩定的 HLA-A*02:01 生產和用於親和力測量的概述。(a) 將重鏈和β₂ m 的表達質粒轉染至大腸桿菌且關注蛋白以包涵體表達。使用尺寸排阻法純化 HLA 單體。(b) 空的 二硫鍵修飾 HLA-A*02:01 分子可透過在室溫下孵育來裝載肽配體。對於親和力測量，將這些分子固定於功能化生物感測器上（例如，透過生物素鏈黴抗生物素蛋白相互作用），並用於記錄 TCR 或 TCR 樣分子的結合和解離情況。。

圖 2 顯示了1G4 TCR 與不同 MHC 單體的結合和解離行為。原始數據用顯示於圖 2(a) 和 2(b)，曲線擬合圖顯示於圖 2(c) 和 2(d)。所有測量均以 1:2 分析物稀釋系列進行，從 24 μM 開始。(a) 1G4 TCR 與固定的 ESO 9V Y84C/A139C HLA-A*02:01 pMHC的結合曲線。(b) 1G4 TCR 與固定的 ESO 9V WT-A*02:01 pMHC的結合曲線。(c) 1G4 TCR 與固定的空 Y84C/A139C HLA-A*02:01 的結合曲線。(d) 1G4 TCR 與固定的 SL9 Y84C/A139C HLA-A*02:01 pMHC的結合曲線。

圖 3 顯示了 SL9 特異性 bs-868Z11-CD3 bsTCR與不同 MHC 單體和肽配體的親和力。(a) bs-868Z11-CD3 與固定的 SL9 Y84C/A139C HLA-A*02:01 pMHC的結合曲線。原始數據顯示於圖 3(a) 和 3(b)；曲線擬合圖顯示於圖 3(c) 和 3(d)。測量以 1:2 分析物稀釋系列進行，從 500 nM 開始。(b) bs-868Z11-CD3 與固定的 SL9 WT-A*02:01 pMHC的結合曲線。原始數據用黑色顯示，曲線擬合圖為紅色。測量以 1:2 分析物稀釋系列進行，從 500 nM 開始。(c) bs-868Z11-CD3 與固定的空 Y84C/A139C HLA-A*02:01 的結合曲線。測量以 1:2 分析物稀釋系列進行，從 500 nM 開始。(d) 使用 UV-交換產生的 Y84C/A139C HLA-A*02:01 pMHC或 WT-A*02:01 pMHC複合體所測得的親和力之間的相關性。對於使用兩種方法產生並在連續實驗期間測得的 140 種不同肽配體繪製了K_d ，曲線擬合良好。K_d 使用 500 nM 和 158 nM 分析物濃度擬合。R²是算得的相關係數，虛線表示最佳比率。

圖 4 顯示了使用 Y84C/A139C HLA-A*02:01 產生的突變氨基酸序列文庫作為可溶性分析物和固定bsTCR而產生的 bs-868Z11-CD3 的結合基序。K_d 使用來自本發明人的至少一個和更多分析物濃度的曲線進行擬合，納入的曲線至少有一個 0.05 nm的峰值信號。無可擬合曲線的位置指定 K_d 為 5 x 10^-6 M。使用 1/

分析物稀釋系列測量，從 500 nM 開始。(a) 根據引入氨基酸和肽序列中交換位置的親和力熱圖。白色方塊表示野生型肽氨基酸。(b) 結合基序視覺化為 seq2logo 圖。個別字母的大小反向代表在此位置處對各個氨基酸測得的親和力，使用倒數 K_d 值除以 10⁸ 和 PSSM-Logo 演算法算得。(c) bs-868Z11-CD3 bsTCR與裝載 ALYNVLAKV (SEQ ID NO:1) 的 Y84C/A139C HLA-A*02:01 pMHC的結合曲線。測量以 1/

分析物稀釋系列進行，從 500 nM 開始。

圖 5 顯示了用肽裝載靶細胞、Jurkat效應細胞和六種不同濃度的 bs-868Z11-CD3 共孵育測定的結果。(a) 存在 SL9 野生型肽裝載 T2 靶細胞的情況下，以不同濃度 bs-868Z11-CD3 刺激的Jurkat細胞高於背景的測得誘導倍數。(b) 來自位點掃瞄文庫中肽配體所測得的親和力與誘導比背景發光增加 3 倍所需的最低bsTCR濃度之間的相關性。肽根據野生型序列中交換位置被分為 9 個不同的組。(c) 來自位點掃瞄文庫中肽配體所測得的親和力與其NetMHC預測的pMHC結合等級之間的相關性。肽根據誘導比背景發光增加 3 倍所需的最低bsTCR濃度被分為6個不同的組。(d) 交叉反應性肽配體候選物所測得的親和力與誘導比背景發光增加 3 倍所需的最低bsTCR濃度之間的相關性。(e) 存在 ALYNVLAKV (SEQ ID NO:1) 肽裝載 T2 靶細胞的情況下，以不同濃度 bs-868Z11-CD3 刺激的Jurkat細胞高於背景的測得誘導倍數。誤差柱代表生物學三次重複。

圖 6 顯示了 Y84C/A139C HLA-A*02:01 或UV交換產生的 WT-A*02:01 pMHC複合體的比較，彼等作為對固定的 bs-868Z11-CD3 之親和力測量中的可溶性分析物。Y84C/A139C HLA-A*02:01 複合體（左），WT-A*02:01 複合體（右）。所有測量均使用 1:2 分析物稀釋系列進行，從 500 nM 開始。

圖 7 顯示與 1G4 複合的 ESO 9V Y84C/A139C HLA-A*02:01 和 ESO 9V WT-A*02:01 的晶體結構。(a)  WT 和 Y84C/A139C HLA-A*02:01 結構重疊，重點為肽和氨基酸側鏈的方向。(b) F 袋與 α1 和 α2 之間引入的二硫鍵的特寫圖片。(c) 與肽和 MHC 骨架相互作用的 1G4 CDR 環重疊。(d) 兩種晶體結構重疊的側面視圖。誤差柱代表生物學三次重複。

圖 8 顯示了使用 Y84C/A139C HLA-A*02:01 產生的位置掃瞄文庫作為可溶性分析物和固定 bsTCR 而產生的 bs-868Z11-CD3 的結合基序。測量使用四種可溶性分析物濃度進行。無可擬合曲線的位置指定 K_d 為 5 x 10^-6 M。可溶性分析物濃度範圍由 1/分析物稀釋系列產生，以 500 nM 開始。根據引入氨基酸和肽序列中交換位置的親和力熱圖。。

圖 9 顯示了 bsTCR bs-868Z11-CD3 構建體的圖示。868Z11 結構域基於 SLYNTVATL 反應性 TCR 868 並在 Varela-Rohena 等人決定的 CDR2β（YYEEEE 至 YVRG EE）和 CDR3α 區域（CAVRTNSGYALN 至 CAVRGAHD YALN）中摻入增強親和力的突變 (8)。親和力增強 TCR 的 Vβ 和 Vα 結構域透過單鏈接頭 (GSADDAKKDAAKKDGKS) 連接，並進一步用 Vα2 區域中賦予表面穩定性的突變 (F49S) 進行修飾，以允許 Aggen 等人所述的可溶性表達 (22)。為了產生 bs-868Z11-CD3 分子，此 868Z11 scTv 結構域透過含有兩個半胱氨酸敲除物（C₂₂₆ S 和 C₂₂₉ S）的 IgG2 衍生 CH2 鉸鏈結構域 (APPVAG) 與人源化抗 CD3 抗體的 F(ab') 重鏈部分融合，該兩個半胱氨酸敲除物的摻入是為了防止在表達時形成 F(ab’)₂ 同型二聚體。

圖 10 顯示了基於位置掃瞄文庫選自 SLYNTVATL 的 28 種不同肽的 UV 交換效率和 Octet 測量結果分析。(a) 左軸：與 25000ng/ml UV 敏感性 pMHC 單體進行 UV 交換後使用抗 β2m ELISA法測定的 pMHC 濃度。虛線表示基於無肽 UV 交換的 ELISA/UV 交換背景信號。誤差柱代表技術三次重複。右軸：Octet RED384 系統上可溶性 pMHC 分析物與固定 bs-868Z11-CD3 的結合反應比。pMHC 使用 UV 交換或透過 Y84C/A139C HLA-A*02:01 肽負載製備。比率計算方法為：UV-A*02:01 反應除以與類似負載 抗F(ab) 生物感測器結合 60s 後的 Y84C/A139C HLA-A*02:01 反應。(b) 含 NetMHC 的四種肽的詳細曲線擬合等級為 15 和更大。Y84C/A139C HLA-A*02:01 複合體（左），WT-A*02:01 複合體（右）。所有的測量均以 1:2 分析物稀釋系列進行，從 500 nM 開始。

圖 11 顯示了多種不同可溶性 TCR 和 bsTCR bs-868Z11-CD3 與未負載 Y84C/A139C HLA-A*02:01 或負載不相關肽的 Y84C/A139C HLA-A*02:01 結合情況。(a) 三種不同 HLA-A*02:01 限制性可溶性 TCR 以及 bs-868Z11-CD3 與功能上空的 Y84C/A139C HLA-A*02:01 結合情況。將 Y84C/A139C HLA-A*02:01 固定至鏈黴抗生物素蛋白感測器上，各 TCR 以 1 mg/ml供應（可溶性 TCR 為 20μM，bsTCR 為13.3 μM）。(b) 相同的TCR 與負載不相關肽的 Y84C/A139C HLA-A*02:01 結合情況。

圖 12 顯示了在交換後和在 4℃ 下儲存 2 週後，Y84C/A139C HLA-A*02:01 SLYNTVATL pMHC 與固定 bs-868Z11-CD3 的 Octet 親和力測量。兩次測量均使用 1:2 分析物稀釋系列（從 277.8 nM 開始）進行。

圖 13 顯示了各種 HLA 等位基因和一個鼠等位基因的多序列比對。在序列比對中，突出顯示引入穩定氨基酸取代的區域。此比對為技藝人士提供了在每個給定 HLA 等位基因中決定待取代的氨基酸以穩定 MHC 分子的基礎。

圖 14 顯示了 SL9 特異性 bs-868Z11-CD3 bsTCR 對採用不同二硫化物修飾 HLA-A*02:01 複合體產生的 SL9 pMHC 的親和力。結合曲線顯示了 bs-868Z11-CD3 對固定的 SL9 pMHC 的結合和解離情況。測量以 1:2 分析物稀釋系列（從 500 nM 開始）進行。bs-868Z11-CD3 bsTCR對固定 SL9 WT-HLA*02:01 pMHC 的結合曲線（左上圖）。bs-868Z11-CD3 bsTCR對固定 SL9 Y84C/A139C HLA*02:01 pMHC 的結合曲線（右上圖）。bs-868Z11-CD3 bsTCR對固定 SL9 F22C/S71C HLA*02:01 的結合曲線（左下圖）。bs-868Z11-CD3 bsTCR對固定 SL9 F22C/S71CW51C/G175C HLA-A*02:01 pMHC 的結合曲線（右下圖）。

圖 15 顯示了高親和力 TCR 對不同 pMHC 複合體的 K_d 值。在每種情況下，WT-A*02:01 分子的 K_d 均顯示於 X 軸上，兩個不同的二硫化物修飾 HLA-A*02:01 MHC 分子的 K_d 顯示於 y 軸上，每個點表示 MHC 分子中負載的一個不同肽。

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Claims (24)

1. 一種篩選 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體 (pMHC) 的方法，其包括以下步驟： a) 提供適當穩定的 MHC 分子，其中所述 MHC 分子在以下氨基酸之間包含至少一個人工引入的共價橋：(i)  在 MHC I 情況下，在所述穩定 MHC 分子 α1 結構域的一個氨基酸和 α2 結構域的一個氨基酸之間；及/或(ii) 在 MHC I 情況下，在所述穩定 MHC 分子 α1 結構域的兩個氨基酸之間；或(iii) 在 MHC II 情況下，在所述穩定 MHC 分子 α1 結構域或 β1 結構域的兩個氨基酸之間；及/或(iv) 在 MHC II 情況下，在所述穩定 MHC 分子 α1 結構域的一個氨基酸和 β1 結構域的一個氨基酸之間；b) 使所述適當穩定的 MHC 分子與其大量肽配體接觸，以形成肽配體/MHC (pMHC) 分子複合體，以及c) 篩選所述pMHC分子複合體的 TCR 結合。
2. 根據請求項 1 所述的方法，其中所述 MHC 分子為HLA，或選自二聚體、三聚體和四聚體組成組的 HLA、MHC I 或 MHC II 的多聚體。
3. 根據請求項 1 或 2 所述的方法，其中氨基酸之間所述至少一個人工引入的共價橋選自重組引入的二硫橋鍵、引入待交聯的非天然氨基酸、引入光交聯氨基酸和化學方式引入的交聯。
4. 根據請求項 1至3 中任一項所述的方法，其中氨基酸之間的所述至少一個人工引入的共價鍵被引入： (i)  α-螺旋之間，優選透過將 MHC I 第 84 位的氨基酸和第 139 位的氨基酸突變為半胱氨酸；(ii) MHC I α1 結構域的 α-螺旋和 β折疊片之間，優選透過將 MHC I 第 71 位的氨基酸和 MHC I 第 22 位的氨基酸突變為半胱氨酸；(iii) α-螺旋之間，優選透過將 MHC I 第 51 位的氨基酸和 MHC I 第 175 位的氨基酸突變為半胱氨酸；或(iv) α-螺旋和 β折疊片之間，優選透過將 MHC I 第 71 位的氨基酸和 MHC I 第 22 位的氨基酸突變為半胱氨酸；及α-螺旋之間，優選透過將 MHC I 第 51 位的氨基酸和 MHC I 第 175 位的氨基酸突變為半胱氨酸。
5. 根據請求項 1 至 4 中任一項所述的方法，其中所述裝載的 HLA/肽分子在約 4℃下穩定時間超過約 1 天，優選為超過 1 週。
6. 根據請求項 1 至 5 中任一項所述的方法，其中與pMHC複合體結合的 TCR 的親和力篩選靈敏度水平高於約 K_d 1.0 x 10^-9 ，優選為高於約 K_d 1.0 x 10^-6 ，更優選為高於約 K_d 1.0 x 10^-3 。
7. 根據請求項 1 至 6 中任一項所述的方法，其中TCR 或 MHC 分子適當地固定於固體表面上，選自晶片、生物感測器、載玻片或珠組成的組。
8. 根據請求項 1 至 7 中任一項所述的方法，其中所述方法以高通量篩選形式進行。
9. 一種包含穩定 MHC 分子或其肽結合片段或由該穩定 MHC 分子或其肽結合片段組成的多肽，其中所述 MHC 分子在以下之間包含至少一個人工引入的共價鍵： (i)  MHC I α1 結構域的兩個氨基酸；及/或(ii) MHC I 的 α1 結構域中的一個氨基酸和 MCH I 的 α2 結構域中第 160 至 179 位氨基酸內的一個氨基酸；或(iii) MHC II 的 α1 結構域的兩個氨基酸或 β1 結構域的兩個氨基酸；及/或(iv) MHC II 的 α1 結構域的一個氨基酸和 MHC II 的 β1 結構域的一個氨基酸。
10. 根據請求項 9 所述的多肽，其中 (i)  一個氨基酸在 MHC I α1 結構域的 β1 單元中被修飾而另一個氨基酸在 MHC I α1 結構域的 α1 單元中被修飾，優選為在β1 單元內的第 12 至 32 位氨基酸內，優選為在第 17 至 27 位氨基酸內，更優選為在第 20 至 24 位氨基酸內，最佳為在第 22 位氨基酸以及在α1 單元內的第 61 至 81 位氨基酸內，優選為在第 66 至 76 位氨基酸內，更優選為在第 69 至 73 位氨基酸內，最佳為在第 71 位氨基酸；及/或(ii) 一個氨基酸在 α1 結構域的α1 單元中被修飾，優選為在第 50 至 70 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 60 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 54 位氨基酸內，最佳為在第 51 位氨基酸，另一個在 α2 結構域內被修飾的氨基酸在第 165 至 178 位氨基酸內，優選為在第 170 至 177 位氨基酸內，更優選為在第 173 至 176 位氨基酸內，最佳為在第 175 位氨基酸；或(iii) 一個氨基酸在 MHC II α1 結構域的 β1 單元中被修飾而另一個氨基酸在 MHC II α1 結構域的 α1 單元中被修飾，優選為在β1 單元內的第 10 至 40 位氨基酸內，優選為在第 13 至 35 位氨基酸內，更優選為在第 22 至 25 位氨基酸內，最佳為在第 22 位氨基酸以及在α1 單元內的第 45 至 78 位氨基酸內，優選為在第 50 至 70 位氨基酸內，更優選為在第 56 至 66 位氨基酸內，最佳為在第 59 位氨基酸；及/或(iv) 一個氨基酸在 MHC II β1 結構域的 β3 單元中被修飾而另一個氨基酸在 MHC II β1 結構域的 α3 單元中被修飾，優選為在β3 單元內的第 5 至 53 位氨基酸內，優選為在第 17 至 41 位氨基酸內，更優選為在第 21 至 28 位氨基酸內，最佳為在第 26 位氨基酸以及在α3 單元內的第 52 至 88 位氨基酸內，優選為在第 66 至 76 位氨基酸內，更優選為在第 65 至 80 位氨基酸內，最佳為在第 75 位氨基酸；及/或(v)  一個氨基酸在 MHC II β1 結構域的 α3 單元中被修飾而另一個在 MHC II α1 結構域的 α1 單元中被修飾，優選為在α3 單元內的第 70 至 95 位氨基酸內，優選為在第 74 至 94 位氨基酸內，優選為在第 83 至 93 位氨基酸內，更優選為在第 87 至 92 位氨基酸內，最佳為在第 89 位氨基酸以及在α1 單元內的第 50 至 70 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 60 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 54 位氨基酸內，最佳為在第 51 位氨基酸。
11. 根據請求項 9 或 10 所述的多肽，其進一步透過將 MHC I 的第 74-84 位氨基酸（優選為第 84 位氨基酸）以及第 138-149 位氨基酸（優選為第 139 位氨基酸）突變為半胱氨酸而包含α1 結構域和 α2 結構域氨基酸之間的至少一個人工共價鍵。
12. 一種用於檢測或產生 TCR 的特定氨基酸結合基序的方法，其包括 a) 進行根據請求項 1 至 8 中任一項所述的方法（包含預選 TCR）以及b) 決定和比較檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列的額外步驟，從而鑒定所述預選 TCR 的特定氨基酸結合基序。
13. 根據請求項 12 所述的方法，其中所述肽配體/MHC 分子複合體用於不同濃度的平行測定反應，優選為其中重複所述方法步驟，其包括由鑒定的所述預選 TCR 的修飾氨基酸結合基序組成的肽庫。
14. 一種用於檢測或決定 TCR 的交叉反應性的方法，其包括 a) 進行根據請求項 12 或 13 所述的方法以及b) 決定和比較檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列的額外步驟，從而鑒定所述 TCR 的交叉反應性。
15. 一種用於檢測或決定 TCR 的交叉反應性的方法，其包括 a) 進行根據請求項 1 至 8 中任一項所述的方法（包括預選 TCR）以及b) 決定和比較檢測到 TCR 結合的所述肽配體/MHC 分子複合體中那些肽配體的氨基酸序列的額外步驟，從而鑒定所述 TCR 的交叉反應性。
16. 根據請求項 1 至 8 或 12 至 15 中任一項所述的方法，其進一步包括測量 T 細胞啟動的步驟，其包含 TCR 和與所述 TCR 結合的 TCR 結合肽配體/MHC 分子複合體。
17. 一種包含多肽的藥物組合物，該多肽包含穩定 MHC 分子或其肽結合片段或由該穩定 MHC 分子或其肽結合片段組成，其中所述 MHC 分子至少包含 (i)  MHC I α1 結構域的兩個氨基酸；及/或(ii) MHC I 的 α1 結構域中的一個氨基酸和 MCH I 的 α2 結構域中第 160 至 179 位氨基酸內的一個氨基酸；或(iii) MHC II 的 α1 結構域的兩個氨基酸或 β1 結構域的兩個氨基酸；及/或(iv) MHC II 的 α1 結構域的一個氨基酸和 MHC II 的 β1 結構域的一個氨基酸；其中所述穩定 MHC 分子與珠、絲、奈米顆粒或其他合適載劑結合，並任選地負載肽配體。
18. 一種藥物組合物，其包含根據請求項 17 所述的多肽，其中 (i)  一個氨基酸在 MHC I α1 結構域的 β1 單元中被修飾而另一個氨基酸在 MHC I α1 結構域的 α1 單元中被修飾，優選為在β1 單元內的第 12 至 32 位氨基酸內，優選為在第 17 至 27 位氨基酸內，更優選為在第 20 至 24 位氨基酸內，最佳為在第 22 位氨基酸以及在α1 單元內的第 61 至 81 位氨基酸內，優選為在第 66 至 76 位氨基酸內，更優選為在第 69 至 73 位氨基酸內，最佳為在第 71 位氨基酸；及/或(ii) 一個氨基酸在 α1 結構域的α1 單元中被修飾，優選為在第 50 至 70 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 60 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 54 位氨基酸內，最佳為在第 51 位氨基酸，另一個在 α2 結構域內被修飾的氨基酸在第 165 至 178 位氨基酸內，優選為在第 170 至 177 位氨基酸內，更優選為在第 173 至 176 位氨基酸內，最佳為在第 175 位氨基酸；或(iii) 一個氨基酸在 MHC II α1 結構域的 β1 單元中被修飾而另一個氨基酸在 MHC II α1 結構域的 α1 單元中被修飾，優選為在β1 單元內的第 10 至 40 位氨基酸內，優選為在第 13 至 35 位氨基酸內，更優選為在第 22 至 25 位氨基酸內，最佳為在第 22 位氨基酸以及在α1 單元內的第 45 至 78 位氨基酸內，優選為在第 50 至 70 位氨基酸內，更優選為在第 56 至 66 位氨基酸內，最佳為在第 59 位氨基酸；及/或(iv) 一個氨基酸在 MHC II β1 結構域的 β3 單元中被修飾而另一個氨基酸在 MHC II β1 結構域的 α3 單元中被修飾，優選為在β3 單元內的第 5 至 53 位氨基酸內，優選為在第 17 至 41 位氨基酸內，更優選為在第 21 至 28 位氨基酸內，最佳為在第 26 位氨基酸以及在α3 單元內的第 52 至 88 位氨基酸內，優選為在第 66 至 76 位氨基酸內，更優選為在第 65 至 80 位氨基酸內，最佳為在第 75 位氨基酸；及/或(v)  一個氨基酸在 MHC II β1 結構域的 α3 單元中被修飾而另一個在 MHC II α1 結構域的 α1 單元中被修飾，優選為在α3 單元內的第 70 至 95 位氨基酸內，優選為在第 74 至 94 位氨基酸內，優選為在第 83 至 93 位氨基酸內，更優選為在第 87 至 92 位氨基酸內，最佳為在第 89 位氨基酸以及在α1 單元內的第 50 至 70 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 60 位氨基酸內，更優選為在第 50 至 54 位氨基酸內，最佳為在第 51 位氨基酸。
19. 根據請求項 17 至 18 所述的藥物組合物，其進一步包含共刺激分子（例如：抗 CD28 抗體或抗 41BB 抗體）的一種或組合及/或這些共刺激分子的時間序列。
20. 一種疫苗，其包含根據請求項 17-19 所述的藥物組合物。
21. 根據請求項 20 中所述的疫苗，用於製造藥劑。
22. 根據請求項 20 或 21 所述的疫苗，用於預防癌症，優選透過觸發受試者的 T 細胞反應。
23. 一種核酸分子，其編碼根據請求項 9-11 任一項中所述的多肽。
24. 一種載體，其包含根據請求項 23 中所述的至少一種核酸分子。

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