JP7528058B2 - Ｔｃｒリガンドの高スループットペプチド－ｍｈｃ親和性スクリーニングのための方法 - Google Patents

Ｔｃｒリガンドの高スループットペプチド－ｍｈｃ親和性スクリーニングのための方法 Download PDF

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Description

本発明は、安定化されたペプチド－ＭＨＣ分子を含んでなるＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体の高スループットスクリーニングのための方法、および前記方法のそれぞれの使用に関する。本発明は、安定化されたＭＨＣ分子またはそのペプチド結合断片を含んでなるまたはそれからなるポリペプチド、前記ポリペプチドを含んでなる医薬組成物、前記医薬組成物を含んでなるワクチン、および薬剤の製造および／またはがんの予防のための前記ワクチンの使用にさらに関する。本発明は、前記ポリペプチドをコード化する核酸、および前記核酸を含んでなるベクターにさらに関する。
細胞表面のＭＨＣ分子でのペプチドの提示は、ウイルス感染またはがんに対する免疫応答の基本的役割を果たす（１）。ＭＨＣクラスＩ分子は、多型重鎖、β－２ミクログロブリン（β２ｍ）、およびペプチドリガンドからなる三量体複合体であり、典型的には８～１０アミノ酸の長さであり、細胞質ゾルタンパク質の分解に由来する。Ｔ細胞は、それらのクローン特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）で特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）を認識し、免疫応答を開始し得る。
可溶性ｐＭＨＣ複合体の生成は、ｐＭＨＣとＴＣＲとの相互作用を中心とした、科学的および臨床的分野での多くの異なる用途にとって重要である。それらは１９９２年にタンパク質発現および再折りたたみ技術を使用して最初に生成され、それ以来、例えば、フローサイトメトリーまたはＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用の親和性測定を通じた抗原特異的Ｔ細胞の同定などの多くの用途で使用されている（２～５）。
同族のｐＭＨＣに対するＴＣＲの親和性は、発現しているＴ細胞の機能に大きな影響を及ぼす（６）。したがって、低親和性ＴＣＲの親和性を改善し、臨床用途に最適なレベルに到達させる努力がなされてきた（７）。大規模な成熟実験により、通常は抗体に制限される範囲であるピコモル濃度親和性を有するＴＣＲが生成されている。それらは、モノマーの形態であっても、長い相互作用半減期で標的ｐＭＨＣに結合することから、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー形式の腫瘍細胞に係合する成分として注目されている（８、９）。
国際公開第２０１３／０３０６２０号パンフレットは、細菌中で産生され、エピトープ特異的ＣＴＬの検出のために不溶性の付着体として存在する、組換えＭＨＣクラスＩ分子を開示している。これらは最初に、カオトロピック剤の溶液中で変性される。次に、カオトロープが所望のペプチドの存在下で除去され（復元、再折りたたみ）、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、ペプチドクラスＩ複合体が、折りたたまれていないタンパク質から分離される。国際公開第２０１３／０３０６２０号パンフレットは、ＭＨＣクラスＩ分子をコード化するための遺伝子を提示し、ＭＨＣクラスＩ分子はα１らせんおよびα２らせんを有し、遺伝子はＭＨＣクラスＩ分子中のα１らせんおよびα２らせんの間に結合が形成されるようにコード化されている。したがって、Ｔ細胞頻度の分析のためのキットが提供され得る。アミノ酸１３９はＣｙｓ－１３９を提供するようにシステインで置換され、アミノ酸８４はＣｙｓ－８４を提供するようにシステインで置換され、またはアミノ酸８５はＣｙｓ－８５を提供するようにシステインで置換され、ジスルフィド架橋は、Ｃｙｓ－１３９とＣｙｓ－８４の間、またはＣｙｓ－１３９とＣｙｓ－８５の間のＭＨＣクラスＩ重鎖のα１らせんおよびα２らせんの間に形成される。
米国特許第２００９－０１７１５３号明細書は、２つのシステイン間に延びるジスルフィド結合によってＭＨＣクラスＩ重鎖分子に共有結合した抗原ペプチドを含んでなる、いわゆるジスルフィドトラップを開示している。いくつかの構成では、ジスルフィドトラップ一本鎖三量体（ｄｔＳＣＴ）などのジスルフィドトラップは、単一の連続ポリペプチド鎖を含んでなり得る。細胞内で合成されると、ジスルフィドトラップはＥＲで適切に酸化され、Ｔ細胞によって認識され得る。いくつかの構成では、たとえペプチドが重鎖に比較的弱く結合している場合でも、ジスルフィドトラップのペプチド部分は、高親和性の競合ペプチドによって置換されない。様々な構成において、ジスルフィドトラップは、ワクチン接種、ＣＤ８Ｔ細胞の惹起、およびＴ細胞の数え上げと追跡のための多価ＭＨＣ／ペプチド試薬で使用され得る。ジスルフィドトラップをコード化する配列を含んでなる核酸もまた、開示されている。ＤＮＡベクターであり得るこのような核酸は、ワクチンとして使用され得る。
Ｚｅｙｎｅｐ Ｈｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．（ｉｎ：Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｒｅａｃｈｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ ２０１４ １２７：２８８５－２８９７）は、α１らせんおよびα２らせんがＦポケットの近くのジスルフィド結合によって連結され、それらの可動性が制限されている、マウスＭＨＣ－ＩアロタイプＨ－２Ｋｂの変種を記載している。Ｃ８４－Ｃ１３９ジスルフィド結合は、正常なＰＬＣ相互作用および抗原提示を可能にするが、ＭＨＣ－Ｉ表面発現をＴＡＰおよびタパシン非依存性にして、順行性輸送を加速し、ＭＨＣ－Ｉエンドサイトーシスの速度を大幅に低下させる。
国際公開第２０１１／１０１６８１号パンフレットは、前記α鎖のα２ドメインと前記β鎖のβ２ドメインに位置するシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結された、ジスルフィド結合安定化組換えＭＨＣクラスＩＩ分子を開示しており、ここで前記システイン残基は、天然ＭＨＣクラスＩＩ α２およびβ２ドメインには存在しない。
国際公開第２０１８／０２９３５０は、Ｋｏｎ率アッセイおよび改善されたＴＣＲリガンドｋｏｆｆ率アッセイを開示しており、これはＵＶペプチド交換技術との新規組み合わせを通じたより広範な適用を可能にする。本開示は、高スループット様式で、Ｋｏｆｆ率ＭＨＣモノマーを調製することを可能にし、これは、次に、以前は実現不可能であったＴＣＲリガンドＫｏｆｆ率アッセイなどのアッセイにおいて、拡張ペプチドライブラリのためのＴＣＲ候補をスクリーニングするために用いられ得る。さらに、Ｋｏｆｆ率ＭＨＣモノマーとのＵＶペプチド交換は、以前はｋｏｆｆ率ＭＨＣ測定に干渉するかまたは無効にさせ得た、アミノ酸システインを担持する特定のペプチドを認識するＴＣＲ候補の分析を可能にする。
Ｎｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ：Ｎｅｗｅｌｌ ＥＷ，”Ｈｉｇｈｅｒ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ Ａｌｔｅｒｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３；４：４３０）は、マスサイトメトリーを用いた高含量コンビナトリアルペプチド－ＭＨＣ四量体の染色を開示している。
Ｂａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ：Ｂａｋｋｅｒ ＡＨ，Ｈｏｐｐｅｓ Ｒ，Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，”Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＨＬＡ－Ａ１，－Ａ３，－Ａ１１，ａｎｄ －Ｂ７．”ＰＮＡＳ ２００８；１０５（１０）：３８２５－３８３０）は、ヒトＭＨＣ分子ＨＬＡ－Ａ２のために設計され得る、長波長ＵＶ光への曝露時に崩壊する条件付きリガンドを開示している。このペプチド交換技術は、細胞傷害性Ｔ細胞免疫の分析のための高スループットＭＨＣベースの用途に、一般に適用可能なアプローチに発展され得るとされる。
Ｃｏｃｈｒａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｒｎ（ｉｎ：”Ａ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｅｔ ｏｆ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｃｌａｓｓ ＩＩ ＭＨＣ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｂｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０００ Ｓｅｐ；７（９）：６８３－９６）は、Ｔ細胞における活性化過程の開始に関与する分子機序を研究するためのツールを開示している。二量体から四量体までサイズが様々なヒトＭＨＣタンパク質ＨＬＡ－ＤＲ１のトポロジー的に多様なオリゴマーのセットは、システイン残基の位置と、新規および市販の架橋剤上に担持されるスルフヒドリル反応基の数と間隔を変化させることによって、導入された。架橋剤に組み込まれた蛍光プローブは、Ｔ細胞表面へのオリゴマー結合の測定を容易にした。様々なＭＨＣ二量体、三量体、および四量体をはじめとするオリゴマーＭＨＣ－ペプチド複合体は、Ｔ細胞に結合し、抗原特異的様式でＴ細胞活性化過程を開始した。
Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ：”Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｐｅｐｔｉｄｏｍｉｃｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｐｒｏｆｏｕｎｄ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）Ｌｉｇａｎｄｏｍｅ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ．２０１８；１７（３）：５３３－５４８）は、細胞株と組織の双方に適した、プレート形式での最大９６のサンプルからのＨＬＡ－Ｉおよび－ＩＩペプチドの連続免疫親和性精製のための、高スループットで再現性のある高感度の方法を開示している。この方法は、全体的なペプチド収量と再現性を決定することから、免疫ペプチドミクスパイプラインの最も重要なステップとされる、サンプル調製を改善することを目的とする。
Ｌｕｉｍｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ：Ｌｕｉｍｓｔｒａ ＪＪ，Ｇａｒｓｔｋａ ＭＡ，Ｒｏｅｘ ＭＣＪ，ｅｔ ａｌ．”Ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｌｏａｄｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ．”Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０１８；２１５（５）：１４９３－１５０４）は、温度媒介ペプチド交換を用いて、多くの異なるＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）多量体を並行して生成するための、単純、高速、柔軟、かつ効率的とされる方法を開示している。彼らは、低温では安定なペプチド－ＭＨＣ Ｉ複合体を形成するが、規定の高温に曝されると解離するＨＬＡ－Ａ＊０２：０１およびＨ－２Ｋｂのための条件付きペプチドを設計した。単独で、または即時使用可能な多量体として調製された、得られた条件付きＭＨＣ Ｉ複合体には、追加的な処理なしに短い時間枠内で、選択されたペプチドが迅速に負荷され得る。
ＴＣＲ親和性増強の潜在的な欠点は、オフターゲット毒性の導入である。ＴＣＲの固有の交差反応性のために、これらはその他のｐＭＨＣに対する親和性も気づかれずに増加させることによって生じ得る（１０）。これらのような複数の症例は、臨床研究で既に報告されている（１１～１３）。
したがって、治療薬候補の有効性だけでなく、特異性と安全性を確保するためにも、包括的なスクリーニングが必要である（１４）。これは、質量分析によって同定された少なくとも１５０，０００のＭＨＣクラスＩリガンドペプチドを含む免疫ペプチドームのサイズが現在確立されていること、およびｐＭＨＣ生成のために利用可能な方法を考えると、非常に複雑な課題である（１５）。
ｐＭＨＣライブラリの大規模な生成、そして例えば、結合モチーフ生成または潜在的に交差反応性のペプチドの直接同定および特性評価などの引き続くＴＣＲの高スループット結合スクリーニングは、上記のような当該技術分野の一般的な技術を用いて達成することは依然として困難である。この困難さは、例えば、臨床状況での時間的制約のあるオンデマンド製造のためなど、ｐＭＨＣを製造するのに必要な高度な技術を要する設備がない、個人または施設向けに、より少数であっても高品質のｐＭＨＣ複合体を調製することにも及んでいる。したがって、本発明の目的は、この分野における改善されたストラテジーを提供することである。本発明のその他の目的および態様は、以下の本発明の説明を読むことで、当業者には明らかになるであろう。
その第１の態様によれば、本発明の上記の目的は、
ａ）（ｉ）ＭＨＣ Ｉの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのアミノ酸とα２ドメインのアミノ酸との間に；および／または
（ｉｉ）ＭＨＣ Ｉの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインの２つのアミノ酸の間に；または
（ｉｉｉ）ＭＨＣ ＩＩの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインの２つのアミノ酸またはβ１ドメインの２つのアミノ酸の間に；および／または
（ｉｖ）ＭＨＣ ＩＩの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインの１つのアミノ酸とβ１ドメインの１つのアミノ酸との間に、
少なくとも１つの人為的に導入された共有結合架橋を含んでなる、適切に安定化されたＭＨＣ分子を提供するステップと、
ｂ）前記適切に安定化されたＭＨＣ分子をその多数のペプチドリガンドに接触させて、ペプチドリガンド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）分子複合体を形成するステップと、
ｃ）前記ｐＭＨＣ分子複合体をＴＣＲ結合についてスクリーニングするステップと
を含んでなる、ＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体（ｐＭＨＣ）をスクリーニングするための方法によって解決される。
好ましいのは、本発明による方法であり、ここで前記安定化されたＭＨＣ分子は、例えば、ＭＨＣ Ｉ（最初の２４アミノ酸を除くＩＧＭＴ番号付けに基づく）の（ｉ）大部分のＨＬＡではチロシンである８４位のアミノ酸（図１３を参照されたい）、および大部分のＨＬＡではアラニンである１３９位のアミノ酸（図１３を参照されたい）をシステインに変異させること、および／または（ｉｉ）大部分のＨＬＡではフェニルアラニンである２２位のアミノ酸（図１３を参照されたい）、および大部分のＨＬＡではセリンである７１位のアミノ酸（図１３を参照されたい）を変異させること、および／または（ｉｉｉ）大部分のＨＬＡではトリプトファンである５１位のアミノ酸（図１３を参照されたい）、および大部分のＨＬＡではグリシンである１７５位のアミノ酸（図１３を参照されたい）を変異させること、または（ｉｖ）大部分のＨＬＡではフェニルアラニンである２２位のアミノ酸（図１３を参照されたい）、および大部分のＨＬＡではセリンである７１位のアミノ酸（図１３を参照されたい）を変異させること、および大部分のＨＬＡではトリプトファンである５１位のアミノ酸（図１３を参照されたい）、および大部分のＨＬＡではグリシンである１７５位のアミノ酸（図１３を参照されたい）を変異させることによる、２つのアミノ酸間の少なくとも１つの人為的に導入された共有結合ジスルフィド架橋より好ましくはαらせん間のアミノ酸の間の少なくとも１つの人為的に導入された共有結合架橋を包含する。このような安定化されたＭＨＣ分子は、ジスルフィド修飾ＭＨＣ分子またはジスルフィド修飾ＭＨＣ変異体と称されてもよい。ＴＣＲまたはＭＨＣ分子はどちらも、特に高スループットスクリーニング形式で、チップ、スライドガラス、バイオセンサーまたはビーズなどの固体表面上に適切に固定化され得る。
第２の態様において、本発明は、安定化されたＭＨＣ分子またはそのペプチド結合断片を含んでなるまたはそれからなるポリペプチドを提供し、これは、
（ｉ）ＭＨＣ Ｉのα１ドメイン内の２つのアミノ酸の間；および／または
（ｉｉ）アミノ酸１６０～１７９位内のＭＨＣ Ｉのα１ドメイン内の１つのアミノ酸とＭＣＨ Ｉのα２ドメイン内の１つのアミノ酸との間；または
（ｉｉｉ）ＭＨＣ ＩＩのα１ドメイン内の２つのアミノ酸またはβ１ドメイン内の２つのアミノ酸；および／または
（ｉｖ）ＭＨＣ ＩＩのα１ドメイン内の１つのアミノ酸とβ１ドメイン内の１つのアミノ酸との間
に、少なくとも１つの人為的に導入された共有結合架橋を含んでなる。
例えば、天然アミノ酸の代わりにシステイン残基を人為的に導入することによって修飾され、共有結合橋を形成する２つのアミノ酸の位置は、それらの相対的な距離に基づいて選択される。ペプチド結合によって相互に連結されていないＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ中の２つのアミノ酸が、共有結合の距離と同様の距離を相互に自然に有する場合、例えばシステインなどの共有結合を形成し得るアミノ酸で、それらを置換することが好ましい。したがって、好ましくは、折りたたまれたタンパク質中で、３～７．５Ａの距離（それぞれのアミノ酸のα炭素間で判定される）を有する２つのアミノ酸が修飾される。多数のＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ分子の３Ｄ構造が知られており、当業者は標準的なソフトウエアを使用して、折りたたまれた分子内の２つの特定のアミノ酸間の距離を判定し得る。
ＭＨＣ Ｉのα１ドメイン内で２つのアミノ酸が修飾されている場合、１つのアミノ酸はＭＨＣ Ｉのβ１ユニット内で修飾され、１つはα１ユニット内で修飾されていることが好ましい。特に、β１ユニット内の適切な領域は、アミノ酸１２～３２位内、好ましくはアミノ酸１７～２７位内、より好ましくはアミノ酸２０～２４位内、最も好ましくはアミノ酸２２位である。特に、α１ユニット内の適切な領域は、アミノ酸６１～８１位内、好ましくはアミノ酸６６～７６位内、より好ましくはアミノ酸６９～７３位内、最も好ましくはアミノ酸７１位である。いずれの場合も、２つのアミノ酸は、好ましくは、折りたたまれたＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩタンパク質中で、３～７．５Ａの距離（それぞれのアミノ酸のα炭素間で判定される）を有するように、それぞれ示されたアミノ酸の一連の配列内で選択される。
ＭＨＣ ＩＩのα１ドメイン内で２つのアミノ酸が修飾されている場合、１つのアミノ酸はＭＨＣ ＩＩのβ１ユニット内で修飾され、１つはα１ユニット内で修飾されていることが好ましい。特に、β１ユニット内の適切な領域は、アミノ酸１０～４０位内、好ましくはアミノ酸１３～３５位内、より好ましくはアミノ酸２２～２５位内、最も好ましくはアミノ酸２２位である。特に、α１ユニット内の適切な領域は、アミノ酸４５～７８位内、好ましくはアミノ酸５０～７０位内、より好ましくはアミノ酸５６～６６位内、最も好ましくはアミノ酸５９位である。いずれの場合も、２つのアミノ酸は、好ましくは、折りたたまれたＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩタンパク質中で、３～７．５Ａの距離（それぞれのアミノ酸のα炭素間で判定される）を有するように、それぞれ示されたアミノ酸の一連の配列内で選択される。
ＭＨＣ ＩＩのβ１ドメイン内で２つのアミノ酸が修飾されている場合、１つのアミノ酸はＭＨＣ ＩＩのβ３ユニット内で修飾され、１つはα３ユニット内で修飾されていることが好ましい。特に、β３ユニット内の適切な領域は、アミノ酸１５～５３位内、好ましくはアミノ酸１７～４１位内、より好ましくはアミノ酸２１～２８位内、最も好ましくはアミノ酸２６位である。特に、α３ユニット内の適切な領域は、アミノ酸５２～８８位内、好ましくはアミノ酸６６～７６位内、より好ましくはアミノ酸６５～８０位内、最も好ましくはアミノ酸７５位である。いずれの場合も、２つのアミノ酸は、好ましくは、折りたたまれたＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩタンパク質中で、３～７．５Ａの距離（それぞれのアミノ酸のα炭素間で判定される）を有するように、それぞれ示されたアミノ酸の一連の配列内で選択される。
アミノ酸１６０～１７９位内で、ＭＨＣＨ Ｉのα１ドメイン内の１つのアミノ酸が修飾され、ＭＨＣＨ Ｉのα２ドメイン内の１つのアミノ酸が修飾されている場合、α１ドメイン内の１つのアミノ酸は、α１ユニット内で、好ましくはアミノ酸５０～７０位内で、より好ましくはアミノ酸５０～６０位内で、より好ましくはアミノ酸５０～５４位内で、最も好ましくはアミノ酸５１位で、修飾されていることが好ましい。α２ドメイン内のその他のアミノ酸は、α２ユニット内で修飾されていることが好ましく、適切な領域は、アミノ酸１６５～１７８位内、より好ましくはアミノ酸１７０～１７７位内、より好ましくはアミノ酸１７３～１７６位内、最も好ましくはアミノ酸１７５位である。いずれの場合も、２つのアミノ酸は、好ましくは、折りたたまれたＭＨＣ Ｉタンパク質中で、３～７．５Ａの間の距離を有するように、それぞれ示されたアミノ酸の一連の配列内で選択される。したがって、特に好ましい実施形態では、安定化されたＭＨＣ Ｉは、５１位および１７５位に修飾アミノ酸を含んでなる。
ＭＨＣ ＩＩのα１ドメイン内の１つのアミノ酸が修飾され、ＭＨＣ ＩＩのβ１ドメイン内の１つのアミノ酸が修飾されている場合、一実施形態では、α１ドメイン内の１つのアミノ酸はα１ユニット内で修飾されていることが好ましい。１対の修飾アミノ酸中で、第１の修飾アミノ酸は、アミノ酸５０～７０位内、より好ましくはアミノ酸５０～６０位内、より好ましくはアミノ酸５０～５４位内にあり、最も好ましくはアミノ酸５１位にある。β１ドメイン内のその他の修飾アミノ酸は、好ましくはアミノ酸７０～９５位内、より好ましくはアミノ酸７４～９４位内、より好ましくはアミノ酸８３～９３位内、より好ましくはアミノ酸８７～９２位内、最も好ましくはアミノ酸８９位に広がる、α３ユニット内にある。別の対において、第１の修飾アミノ酸は、アミノ酸７０～９０位内にあり、より好ましくはアミノ酸７０～８５位内にあり、より好ましくはアミノ酸７２～７９位内にあり、最も好ましくはアミノ酸７６位にある。β１ドメイン内のその他の修飾アミノ酸は、好ましくはアミノ酸５０～９５位内、より好ましくはアミノ酸５０～６５位内、より好ましくはアミノ酸５０～６０位内、より好ましくはアミノ酸５０～５５位内、最も好ましくはアミノ酸５３位に広がる、α３ユニット内にある。いずれの場合も、２つのアミノ酸は、好ましくは、折りたたまれたＭＨＣ ＩＩタンパク質中で、３～７．５Ａの間の距離を有するように、それぞれ示されたアミノ酸の一連の配列内で選択される。
１つのＭＨＣ内に２対の修飾アミノ酸を含んでなることが、さらに好ましい。特に、組み合わせられてもよい好ましい組み合わせは、ＭＨＣ Ｉについては上記（ｉ）および（ｉｉ）の下に、ＭＨＣ ＩＩについては上記（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の下に示されている。したがって、第１の修飾アミノ酸対は、β１ユニット内で修飾されたアミノ酸と、ＭＨＣ Ｉのα１ユニット内で修飾されたアミノ酸とを含んでなることが好ましい。特に、β１ユニット内の適切な領域は、アミノ酸１２～３２位内、好ましくはアミノ酸１７～２７位内、より好ましくはアミノ酸２０～２４位内、最も好ましくはアミノ酸２２位である。特に、α１ユニット内の適切な領域は、アミノ酸６１～８１位内、好ましくはアミノ酸６６～７６位内、より好ましくはアミノ酸６９～７３位内、最も好ましくはアミノ酸７１位である。第２の修飾アミノ酸対は、アミノ酸１６０～１７９位内のＭＨＣ Ｉのα１ドメイン内で修飾された１つのアミノ酸と、ＭＣＨ Ｉのα２ドメイン内で修飾された１つのアミノ酸とを含んでなる。α１ドメイン内の１つのアミノ酸は、α１ユニット内で、より好ましくはアミノ酸５０～７０位内、より好ましくはアミノ酸５０～６０位内、より好ましくはアミノ酸５０～５４位内、最も好ましくはアミノ酸５１位で修飾されていることが好ましい。特に、α２ドメイン内のその他のアミノ酸を修飾するのに適した領域は、アミノ酸１６５～１７８位内、好ましくはアミノ酸１７０～１７７位内、より好ましくはアミノ酸１７３～１７６位内、最も好ましくはアミノ酸１７５位である。したがって、特に好ましい実施形態では、安定化されたＭＨＣ Ｉは、第１の修飾アミノ酸対を２２および７１位に、第２の修飾アミノ酸対を５１および１７５位に含んでなる。
ＭＨＣ Ｉの上記修飾のいずれでも、第１の修飾アミノ酸は、アミノ酸８０～９０位内、好ましくはアミノ酸８２～８６位内、より好ましくはアミノ酸８４位にあり、第２の修飾アミノ酸が、アミノ酸１３６～１４６位内、好ましくはアミノ酸１３７～１４１位内、より好ましくはアミノ酸１３９位にある１対の修飾とさらに組み合わされてもよい。
驚くべきことに、上述のＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩのアミノ酸領域のアミノ酸の修飾、およびそれぞれ示された位置でのアミノ酸の修飾、ひいては共有結合によって自然に連結されていない位置へのアミノ酸間の共有結合の導入は、以下のような修飾ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ分子の生成を可能にする：（ｉ）適切に折りたたまれ、（ｉｉ）高い親和性でペプチドに結合し、（ｉｉｉ）高い特異性と選択性でＴＣＲ分子によって認識される。
第２の態様の好ましい修飾ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ分子はまた、本発明のその他の全ての態様でも使用され得る。
本発明はまた、修飾されたＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ分子のペプチド結合断片を含んでなる。当該技術分野で公知のように、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩはペプチドに結合し、続いてＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩおよびペプチドの双方と相互作用するＴＣＲによって結合される。しかし、ＴＣＲに「提示」されるペプチドへの結合には、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ分子の一部のみが必要である。ＭＨＣ Ｉでは、α１およびα２ドメインが折りたたまれてペプチドに結合する結合溝を形成し、ＭＣＨ ＩＩでは、α１およびβ１ドメインがペプチドに結合する結合溝を形成します。したがって、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩのペプチド結合断片は、それぞれ、少なくともα１およびα２ドメイン、またはα１およびβ１ドメインを含んでなる。したがって、結合断片は、膜貫通ドメイン、またはそれに加えてＭＨＣ Ｉのα３ドメイン、またはＭＨＣ ＩＩのα２および／またはβ２ドメインを欠いていてもよい。少なくとも膜貫通ドメインを欠く断片は可溶性であり、医薬組成物、特にワクチンでの使用に特に適している。
その第３の態様において、本発明は、事前選択されたＴＣＲを含んでなるその第１の態様による方法を実施するステップと、ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列を決定および比較し、それによって、前記事前選択されたＴＣＲの特定のアミノ酸結合モチーフを同定する、追加的なステップとを含んでなる、ＴＣＲの特定のアミノ酸結合モチーフを検出または生成するための方法を提供する。
その第４の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による方法を実施するステップと、ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列を判定および比較し、それによって前記ＴＣＲの交差反応性を同定する追加的なステップとを含んでなる、ＴＣＲの交差反応性を検出または判定するための方法を提供する。
その第５の態様において、本発明は、事前選択されたＴＣＲを含んでなる本発明の第１の態様による方法を実施するステップと、ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列を判定および比較し、それによって前記ＴＣＲの交差反応性を同定する追加的なステップとを含んでなる、ＴＣＲの交差反応性を検出または判定するための方法を提供する。
その第６の態様において、本発明による方法は、細胞性医薬品のスクリーニングまたは生体外プライミングに用られ得る。ビーズ、フィラメント、ナノ粒子またはその他の担体に結合した安定化されたＨＬＡ複合体は、抗原提示細胞を模倣するビーズペプチドで容易に負荷され得て、その後好都合には、共刺激分子（例えば、抗ＣＤ２８、抗４１ＢＢ）と組み合わされて、生体外プライミングおよび増殖のための「即時使用可能」人工抗原提示細胞として使用される。
ｐＭＨＣライブラリの大規模作成、高親和性ＴＣＲの高スループット結合モチーフ決定、および潜在的に交差反応性のペプチドの同定と特性評価のための現在の方法は、安定性の問題を抱えており、追加的な処理なしで、短い時間枠内で（上記のＬｕｉｍｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，のように）、多量体に選択されたペプチドを迅速に負荷する必要があり、これもまたＵＶ交換などの技術を不適切なものにする。
本技術により、本発明者らは、野生型分子またはその他の既存の交換技術に優る複数の利点を得る：空モノマーは、所望の実験に先立ってバルクで生成され得て、ｐＭＨＣの生成は、所望のペプチドの調達と迅速なペプチド負荷反応以外のその他のいかなる方法によっても制限されない。本発明者らは、空モノマーを－８０℃で少なくとも１年間保存し、劣化またはペプチド受容性の損傷が検出されない状態で成功裏に使用した。本発明者らはまた、得られたｐＭＨＣ複合体を４℃で少なくとも２週間保存し、シグナルを失うことなく親和性測定に成功裏に再利用した。修飾を導入することによって達成されるこれら全ての利点に加えて、変異体によって提示されるｐＭＨＣ複合体は、ＴＣＲリガンド結合に関して野生型複合体に実質的に相当する。
一態様では、本発明は、ＴＣＲ結合についてのＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体をスクリーニングするための方法を提供する。
方法は、ＭＨＣ Ｉの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのアミノ酸とα２ドメインのアミノ酸との間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋、および／またはＭＨＣ Ｉの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインの２つのアミノ酸間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋、またはＭＨＣ ＩＩの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのアミノ酸とβ１ドメインのアミノ酸との間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋を含んでなる、適切に安定化されたＭＨＣ分子の使用を含んでなる。主要組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩは、全体的に同様の折りたたみを共有する。結合プラットフォームは、ＭＨＣクラスＩの場合には１本の重α鎖（ＨＣ）に由来し、ＭＨＣクラスＩＩの場合には２本の鎖（α鎖およびβ鎖）に由来する、２つのドメインからなる。２つのドメインは進化して、ベースとしてわずかに湾曲したβシートを形成し、上部に２つのαヘリックスを形成し、これらは、間にペプチド鎖を収容するのに十分離れている。それ故、本発明による方法の適切な安定化は、双方のＭＨＣクラスについて達成され得る。
一実施形態では、本発明は、その使用前に適切なペプチドを単に添加することによって負荷され得る、ジスルフィド安定化された、最初は空のＭＨＣ分子の使用を伴う。このジスルフィド修飾ＭＨＣ分子を使用して生成されたｐＭＨＣは、非修飾野生型変種に相当するものであり、例えば、高親和性ＴＣＲの高スループット結合モチーフの判定、ならびに潜在的に交差反応性のペプチドの同定と特性評価などのスクリーニングに適する。
空のＭＨＣは、ガラスプレートなどの一般に使用される表面上では実質的に分解せず、ペプチドで負荷された場合の非修飾野生型変種に相当するものであり、スクリーニングに適しており、表面上に固定化されている場合であっても、ｐＭＨＣを迅速に生成できるようにする。本発明の文脈において、これは、「適切に安定化された」または「安定化された」ｐＭＨＣによって達成されるものと理解される。
マウスＭＨＣクラスＩ分子Ｈ－２Ｋｂに関する先行研究では、８４位のチロシンと１３９位のアラニンをシステインに変異させることで、Ｆポケット内の対向する残基間にジスルフィド結合を導入することで、複合体を安定化できた。したがって、一実施形態では、アミノ酸間に人為的に導入された共有結合架橋が、例えば、ＭＨＣ Ｉの８４位のチロシンおよび１３９位のアラニンをシステインに変異させることによって、αらせん間に導入された。場合によっては、いかなるペプチドリガンドもなしにモノマーを単離することは難しくあってもよいが、これは低親和性ペプチドを添加することによって効率的に克服され得る。「ＭＨＣ」という用語は、「主要組織適合性複合体」という語句の略語である。ＭＨＣは細胞表面受容体の組であり、脊椎動物の変性天然または外来タンパク質に対する獲得免疫を確立する上で必須の役割を有し、それは次に組織内の組織適合性を決定する。ＭＨＣ分子の主な機能は、変性タンパク質または病原体に由来する抗原に結合し、それらを細胞表面上に提示して適切なＴ細胞に認識させることである。ヒトＭＨＣは、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体またはＨＬＡとも称される。ＭＨＣ遺伝子ファミリーは、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩの３つのサブグループに分けられる。ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴＣＲを有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。ＣＤ８依存性およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答が、抗腫瘍効果と共同して相乗的に寄与するので、腫瘍関連抗原および対応するＴＣＲの同定および特性評価は、ワクチンおよび細胞療法などのがん免疫療法の開発において重要である。ＭＨＣ Ｉ分子は、ＭＨＣ Ｉ重鎖とも称されるα鎖と、β２ミクログロブリン分子を構成するβ鎖とからなる。本発明の文脈において重鎖と同義的に使用されるα鎖は、３つのαメイン、すなわち、α１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含んでなる。α１およびα２ドメインは、主にペプチドポケットの形成に寄与して、ペプチドリガンドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体を生成する。ＭＨＣ Ｉのα１ドメインは、アミノ酸１～９０位に広がり、二次構造として、アミノ酸１～４９位に広がるβシート（本明細書では「β１ユニット」と称される）と、それに続くアミノ酸５０～８４位に広がるαらせん構造（本明細書では「α１ユニット」と称される）とを含んでなる。ＭＨＣ Ｉのα２ドメインは、アミノ酸９１～１８２位に広がり、二次構造として、アミノ酸９１～１３５位に広がるβシート（本明細書では「β２ユニット」と称される）と、それに続くアミノ酸１３８～１７９位に広がるαらせん構造（本明細書では「α２ユニット」と称される）とを含んでなる。ＭＨＣ ＩＩのβ１ドメインは別のポリペプチド上にあり、ＭＨＣ ＩＩ内で、ＭＨＣ Ｉのα２ドメインの構造的役割を果たす。それはアミノ酸１～９５位に広がり、二次構造として、アミノ酸１～４９位のβシート（本明細書では「β３ユニット」と称される）と、それに続くアミノ酸５０～９５位のαらせん構造（本明細書では「α３ユニット」と称される）とを含んでなる。本明細書では、そしてＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ分子中のアミノ酸位置に言及する場合は、位置は、Ｎ末端の第１シグナルペプチドを除いたＩＧＭＴ番号付けに基づいて示されており、典型的には２０～２９アミノ酸の間で長さが変動する。本発明の安定化されたＭＨＣ ＩＩ分子は、２つの別個のポリペプチド上にα１およびβ１ドメインを含んでなってもよく、またはそれらは、１つのポリペプチド内で相互に連結されて、一本鎖ＭＨＣ ＩＩを形成してもよく、例えば、ＭＨＣ ＩＩのα１ドメインのＣ末端は、ＭＨＣ ＩＩのβ１ドメインのＮ末端に、直接またはペプチドリンカーを介して連結される。
ＨＬＡは、ヒトによってアミノ酸配列が異なる分子である。しかし、ＨＬＡは、ＨＬＡの国際的に合意された命名法であるＩＭＧＴ命名法によって同定され得る。例えば、ＨＬＡ－Ａへの分類は、配列アラインメントによって作成された各ＨＬＡの公式参照配列に対する所与のＨＬＡの同一性に基づいている。したがって、配列番号６に記載のＨＬＡ－Ａ配列に対して最も高い配列同一性を有する所与のＨＬＡ配列は、ＨＬＡ－Ａとして分類される。公式のＨＬＡ参照配列ならびに分類システムの情報は、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．ｈｔｍｌで利用できる。このウェブサイトでは、特定の任意のＨＬＡ配列を分類する方法に関する以下の情報を提供している：
「作成されたアライメントファイルは、以下の命名法および番号付け規則を使用している。これらの規約は、ヒト遺伝子変異のため公開された推奨事項に基づいている。これらは、ヒトの対立遺伝子変異の配列をどのように命名し保存するかを検討している命名法作業グループによって作成された。これらの推奨事項は、Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ ＳＥ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（１９９８）１１ １－３に記載されている。
－ＨＬＡシステムの要因に関するＷＨＯ命名委員会によって公式に認められた対立遺伝子のみが配列アラインメントに含まれる。
－全てのヒト遺伝子変異について推奨されているように、アラインメントに標準的な参照配列を使用する必要がある。各対立遺伝子の参照配列の完全なリストを以下に示す。
－参照配列は、この配列に誤りがない限り、常に同じ（元の）受入れ番号に関連付けられる。
－全ての対立遺伝子は、参照配列に配列されている。
－配列の命名は、公開されている命名規則ＳＧＥ Ｍａｒｓｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ２０１０ ７５：２９１－４５５に基づいている」。
ＭＨＣクラスＩタンパク質については、いずれの場合も以下のＨＬＡ参照タンパク質配列が２０１９年７月１２日にウェブサイト上で示され、各ＨＬＡについて受入れ番号が経時的に変化しないことが示される：
ＭＨＣクラスＩタンパク質
ＨＬＡ－Ａ（配列番号６）（受入番号ＨＬＡ００００１）
ＭＡＶＭＡＰＲＴＬＬＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＳＨＳＭＲＹＦＦＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＡＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＱＫＭＥＰＲＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷＤＱＥＴＲＮＭＫＡＨＳＱＴＤＲＡＮＬＧＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＤＧＳＨＴＩＱＩＭＹＧＣＤＶＧＰＤＧＲＦＬＲＧＹＲＱＤＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＭＡＡＱＩＴＫＲＫＷＥＡＶＨＡＡＥＱＲＲＶＹＬＥＧＲＣＶＤＧＬＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬＱＲＴＤＰＰＫＴＨＭＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＥＬＳＳＱＰＴＩＰＩＶＧＩＩＡＧＬＶＬＬＧＡＶＩＴＧＡＶＶＡＡＶＭＷＲＲＫＳＳＤＲＫＧＧＳＹＴＱＡＡＳＳＤＳＡＱＧＳＤＶＳＬＴＡＣＫＶ
ＨＬＡ－Ｂ（配列番号７）（受入番号ＨＬＡ００１３２）
ＭＬＶＭＡＰＲＴＶＬＬＬＬＳＡＡＬＡＬＴＥＴＷＡＧＳＨＳＭＲＹＦＹＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＰＲＥＥＰＲＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷＤＲＮＴＱＩＹＫＡＱＡＱＴＤＲＥＳＬＲＮＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＬＱＳＭＹＧＣＤＶＧＰＤＧＲＬＬＲＧＨＤＱＹＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＴＱＲＫＷＥＡＡＲＥＡＥＱＲＲＡＹＬＥＧＥＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＤＫＬＥＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＲＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＥＰＳＳＱＳＴＶＰＩＶＧＩＶＡＧＬＡＶＬＡＶＶＶＩＧＡＶＶＡＡＶＭＣＲＲＫＳＳＧＧＫＧＧＳＹＳＱＡＡＣＳＤＳＡＱＧＳＤＶＳＬＴＡ
ＨＬＡ－Ｃ（配列番号８）（受入番号ＨＬＡ００４０１）
ＭＲＶＭＡＰＲＴＬＩＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＥＴＷＡＣＳＨＳＭＫＹＦＦＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＰＲＧＥＰＲＡＰＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷＤＲＥＴＱＫＹＫＲＱＡＱＴＤＲＶＳＬＲＮＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＬＱＷＭＣＧＣＤＬＧＰＤＧＲＬＬＲＧＹＤＱＹＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＴＱＲＫＷＥＡＡＲＥＡＥＱＲＲＡＹＬＥＧＴＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬＱＲＡＥＨＰＫＴＨＶＴＨＨＰＶＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＷＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＭＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＥＰＬＴＬＲＷＥＰＳＳＱＰＴＩＰＩＶＧＩＶＡＧＬＡＶＬＡＶＬＡＶＬＧＡＶＶＡＶＶＭＣＲＲＫＳＳＧＧＫＧＧＳＣＳＱＡＡＳＳＮＳＡＱＧＳＤＥＳＬＩＡＣＫＡ
ＨＬＡ－Ｅ（配列番号９）（受入番号ＨＬＡ００９３４）
ＭＶＤＧＴＬＬＬＬＬＳＥＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＳＨＳＬＫＹＦＨＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＮＤＡＡＳＰＲＭＶＰＲＡＰＷＭＥＱＥＧＳＥＹＷＤＲＥＴＲＳＡＲＤＴＡＱＩＦＲＶＮＬＲＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＬＱＷＭＨＧＣＥＬＧＰＤＲＲＦＬＲＧＹＥＱＦＡＹＤＧＫＤＹＬＴＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＶＤＴＡＡＱＩＳＥＱＫＳＮＤＡＳＥＡＥＨＱＲＡＹＬＥＤＴＣＶＥＷＬＨＫＹＬＥＫＧＫＥＴＬＬＨＬＥＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＱＤＧＥＧＨＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＥＰＶＴＬＲＷＫＰＡＳＱＰＴＩＰＩＶＧＩＩＡＧＬＶＬＬＧＳＶＶＳＧＡＶＶＡＡＶＩＷＲＫＫＳＳＧＧＫＧＧＳＹＳＫＡＥＷＳＤＳＡＱＧＳＥＳＨＳＬ
ＨＬＡ－Ｆ（配列番号１０）（受入番号ＨＬＡ０１０９６）
ＭＡＰＲＳＬＬＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＤＴＷＡＧＳＨＳＬＲＹＦＳＴＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＹＩＡＶＥＹＶＤＤＴＱＦＬＲＦＤＳＤＡＡＩＰＲＭＥＰＲＥＰＷＶＥＱＥＧＰＱＹＷＥＷＴＴＧＹＡＫＡＮＡＱＴＤＲＶＡＬＲＮＬＬＲＲＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＬＱＧＭＮＧＣＤＭＧＰＤＧＲＬＬＲＧＹＨＱＨＡＹＤＧＫＤＹＩＳＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＶＡＱＩＴＱＲＦＹＥＡＥＥＹＡＥＥＦＲＴＹＬＥＧＥＣＬＥＬＬＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬＱＲＡＤＰＰＫＡＨＶＡＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＥＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＱＰＬＩＬＲＷＥＱＳＰＱＰＴＩＰＩＶＧＩＶＡＧＬＶＶＬＧＡＶＶＴＧＡＶＶＡＡＶＭＷＲＫＫＳＳＤＲＮＲＧＳＹＳＱＡＡＶ
ＨＬＡ－Ｇ（配列番号１１）（受入番号ＨＬＡ００９３９）
ＭＶＶＭＡＰＲＴＬＦＬＬＬＳＧＡＬＴＬＴＥＴＷＡＧＳＨＳＭＲＹＦＳＡＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＡＭＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＳＡＣＰＲＭＥＰＲＡＰＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＳＳＨＴＬＱＷＭＩＧＣＤＬＧＳＤＧＲＬＬＲＧＹＥＱＹＡＹＤＧＫＤＹＬＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＳＫＲＫＣＥＡＡＮＶＡＥＱＲＲＡＹＬＥＧＴＣＶＥＷＬＨＲＹＬＥＮＧＫＥＭＬＱＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＩＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＶＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＥＰＬＭＬＲＷＫＱＳＳＬＰＴＩＰＩＭＧＩＶＡＧＬＶＶＬＡＡＶＶＴＧＡＡＶＡＡＶＬＷＲＫＫＳＳＤ
ＨＬＡ－Ｈ（配列番号１２）（受入番号ＨＬＡ０２５４６）
ＭＶＬＭＡＰＲＴＬＬＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＲＳＨＳＭＲＹＦＹＴＴＭＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＱＲＭＥＰＲＡＰＷＭＥＲＥＧＰＥＹＷＤＲＮＴＱＩＣＫＡＱＡＱＴＥＲＥＮＬＲＩＡＬＲＹＹＮＱＳＥＧＧＳＨＴＭＱＶＭＹＧＣＤＶＧＰＤＧＲＦＬＲＧＹＥＱＨＡＹＤＳＫＤＹＩＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＭＡＡＱＩＴＫＲＫＷＥＡＡＲＱＡＥＱＬＲＡＹＬＥＧＥＦＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬＱＲＡＤＰＰＫＴＨＭＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＨＴＲＳＳＷＲＰＧＬＱＧＭＥＰＳＲＳＧＲＬＷＷＣＬＬＥＲＳＲＤＴＰＡＭＣＳＭＲＶＣＱＳＰＳＰ＊ＤＧＳＨＬＰＳＰＰＳＰＳＷＡＳＬＬＡＷＦＹＬ＊ＬＷＳＬＥＬＷＳＬＬ＊ＣＧＧＲＲＡＱＩＥＫＥＧＡＴＬＲＬＱＡＡＴＶＰＲＡＬＭＣＬＳＲＲＥＳＶＸ
ＨＬＡ－Ｊ（配列番号１３）（受入番号ＨＬＡ０２６２６）
ＭＧＳＷＲＰＥＰＳＳＣＣＳＲＧＰＷＰＷＰＲＰＧＲＡＰＴＰ＊ＧＩＳＡＰＰＦＰＧＲＡＡＧＳＰＡＳＬＰＷＡＴＷＴＴＲＳＳＣＧＳＴＶＴＰ＊Ｖ＊Ｇ＊ＲＲＧＲＧＧＷＳＲＲＧＲＳＩＧＴＹＲＨＷＡＰＲＰＲＨＲＬＴＥ＊ＴＣＧＰＣＳＡＴＴＴＲＡＲＲＧＩＴＳＳＲＥＣＬＡＡＴＷＧＰＴＧＶＳＳＡＧＭＳＳＭＰＴＴＡＲＩＴＳＰ＊ＴＲＴＣＡＰＧＰＰＲＩＰＲＬＲＬＰＳＡＳＭＲＲＰＭＷＬＳＫＧＥＰＴＷＲＡＰＡＷＳＧＳＡＤＴＷＲＴＧＲＲＲＣＳＡＲＴＰＰＫＴＨＶＴＨＰＰＬ＊Ｔ＊ＧＩＴＲＳＷＶＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＭＥＬＶＥＴＲＰＴＧＤＧＴＦＱＫＷＡＶＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＫＧＬＰＫＰＬＩＬＲＷＥＰＳＰＱＰＴＩＰＩＶＧＩＩＡＧＬＶＬＬＧＡＶＶＴＧＡＶＶＴＡＶＭＷＲＫＫＳＳＤＲＫＧＧＳＹＳＱＡＡＳＳＱＳＡＱＧＳＤＶＳＬＴＡＣＫＶ＊
ＨＬＡ－Ｋ（配列番号１４）（受入番号ＨＬＡ０２６５４）
ＭＧＳＷＲＰＥＰＳＳＣＣＳＷＧＰＷＰ＊ＰＲＰＧＲＶＰＴＰ＊ＧＩＳＡＰＰＣＰＧＲＶＡＧＳＰＧＴＳＱＷＡＴＷＴＴＲＳＳＣＧＳＴＡＴＲＲＬＲＧＣＳＲＳＲＲＧＷＳＲＲＤＲＳＩＧＴＧＡＨＧＴＳＧＰＲＴＤ＊ＱＥ＊ＴＣＰＣＲＡＡＴＴＴＲＡＲＰＧＬＴＰＳＲ＊ＣＭＡＡＴＷＧＷＫＧＡＳＳＡＧＭＮＳＴＰＴＭＡＲＩＴ＊ＰＧＴＲＴＣＡＰＧＰＲＲＴＷＲＬＲＳＰＳＡＳＧＲＱＫＮＬＱＳＲＳＧＰＴＷＲＡＲＡＷＲＧＳＱＴＰＧＥＲＥＧＤＡＡＡＨＧＰＬＰＱＴＨＭＩＨＨＳＶＳＤＹＫＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＶＥＩＴＬＡＷＱＱＤＧＥＤＱＴＲＤＭＥＬＬＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＰＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＥＱＳＳＱＰＴＩＰＩＶＧＩＶＡＧＬＶＬＬＧＡＶＶＴＧＡＶＶＳＡＶＭＣＲＫＫＮＳＤＲＶＳＹＳＥＡＡＳＳＤＨＡＱＧＳＤＶＳＬＴＡＣＫＶ＊
ＨＬＡ－Ｌ（配列番号１５）（受入番号ＨＬＡ０２６５５）
ＭＧＶＭＡＰＲＴＬＬＬＬＬＬＧＡＬＡＬＴＥＴＷＡＧＳＨＳＬＲＹＦＳＴＡＶＳＱＰＧＲＧＥＰＲＦＩＡＶＧＹＶＤＤＴＥＦＶＲＦＤＳＤＳＶＳＰＲＭＥＲＲＡＰＷＶＥＱＥＧＬＥＹＷＤＱＥＴＲＮＡＫＧＨＡＱＩＹＲＶＮＬＲＴＬＬＲＹＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＩＱＲＫＨＧＣＤＶＧＰＴＧＡＳＳＡＧＭＮＳＳＰＴＭＡＲＩＴＳＰ＊ＴＲＴＣＴＰＧＰＰＲＴＱＲＬＲＳＰＳＴＳＧＫＲＴＮＴＱＳＲＳＧＰＴ＊ＧＱＶＨＧＶＡＰＱＴＰＧＥＲＥＧＤＡＡＡＲＧＳＰＫＧＴＣＤＰＡＰＨＬ＊Ｐ＊ＧＨＰＥＶＬＧＰＧＰＬＰＣＧＤＨＴＤＬＡＡＧＷＧＧＰＤＰＧＨＧＡＣＧＤＱＡＣＲＧＲＮＬＰＥＶＧＧＣＳＧＡＦＲＲＧＡＥＩＨＶＰＣＡＡ＊ＧＡＡＲＡＰＨＰＥＭＧＡＶＦＳＡＨＨＰＨＲＧＨＲＣＷＰＶＳＰＷＳＣＧＨＷＳＣＧＣＣＣＤＶＥＥＥＫＬＲ＊ＮＫＥＥＬＣＳＧＣＬＱＱＬＣＳＶＬ＊ＣＩＳ＊ＹＬ＊ＳＬＸ
ＨＬＡ－Ａ遺伝子は第６染色体の短腕上に位置し、ＨＬＡ－Ａのより大きなα鎖の構成物をコード化する。ＨＬＡ－Ａα鎖の多様性は、ＨＬＡ機能の鍵である。この多様性は、集団の遺伝的多様性を促進する。各ＨＬＡは特定の構造のペプチドに対して異なる親和性を有することから、ＨＬＡの種類が多いほど、細胞表面に「提示」される抗原の種類も多くなる。各個人は、それぞれの親から１種類ずつ、最大２種類のＨＬＡ－Ａを発現し得る。一部の個人は、両親から同じＨＬＡ－Ａを継承し、個々のＨＬＡの多様性を減少させる。しかし、大多数の個人は、ＨＬＡ－Ａの２つの異なるコピーを受け継ぐ。全てのＨＬＡ群が、同じパターンに従う。換言すれば、全ての人は、現在１７４０の活性タンパク質をコードする２４３２の既知のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子のうち、１つまたは２つだけを発現する。ＨＬＡ－Ａ＊０２は特定のＨＬＡ対立遺伝子を表し、ここで文字Ａは対立遺伝子が属するＨＬＡ遺伝子を表わし、接頭辞「＊０２接頭辞」はＡ２血清型を示す。ＭＨＣクラスＩ依存性免疫反応では、ペプチドは、腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できる必要があるだけでなく、特定のＴＣＲを有するＴ細胞によって認識される必要もある。
本発明による好ましい方法の第２のステップでは、ペプチドリガンド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）分子複合体を形成させるために、適切に安定化されたＭＨＣ分子を多数のペプチドリガンドに接触させる。二重特異性ＴＣＲコンストラクトを可逆的に固定化できる多種多様な再生可能なバイオセンサーが存在することから、固定化の代わりに可溶性分析物としてｐＭＨＣ複合体を使用することは、迅速で費用効果の高い高スループットスクリーニングにのために好ましい。
本発明の文脈における「接触」とは、ペプチドのかなりの部分が空のおよび／または低親和性のペプチド負荷ＭＨＣ分子と複合体を形成する（「負荷される」）ように、ペプチドが空のおよび／または低親和性のペプチド負荷ＭＨＣ分子に接触されることを意味するものとする。好ましい一例として、ＭＨＣ複合体の負荷は、適切な緩衝液中のモノマー溶液に対して少なくとも１００対１のモル比の所望のペプチドを添加および混合し、室温で最低５分間インキュベートすることによって実施された。
２つのらせんの間の溝は、（ｉ）ＭＨＣ分子の側鎖とペプチドの主鎖との間の保存された水素結合の組の形成、および（ｉｉ）ペプチド側鎖（ＭＨＣクラスＩ中のアンカー残基Ｐ２またはＰ５／６およびＰΩ、およびＭＨＣクラスＩＩ中のＰ１、Ｐ４、Ｐ６、およびＰ９）によって画定されたポケットの占有に基づいて、ペプチドを収容する。個々のペプチド側鎖とＭＨＣとの相互作用のタイプは、結合溝の幾何配置、電荷分布、および疎水性に左右される。ＭＨＣクラスＩでは、結合溝は保存されたチロシン残基によって両端で閉じられており、結合ペプチドのサイズは通常８～１０残基に制限され、そのＣ末端はＦポケット内にドッキングしている。対照的に、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、通常、ペプチドのＮ末端が通常Ｐ１ポケットから押し出された状態で、１３～２５残基の長さのペプチドをそれらの開放結合溝に収容している。ＭＨＣクラスＩ内のＦポケット領域とＭＨＣクラスＩＩ内のＰ１領域（Ｐ２部位を含む）における相互作用は、安定なｐＭＨＣ複合体の提示と特定のペプチド性エピトープの免疫優位性に、支配的な影響を及ぼすように見えることが報告されている。興味深いことに、これらのポケットは、それぞれのＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ構造の結合溝の反対側の端に位置する。
多数のペプチドリガンドは、少なくとも約１，５００の異なるＭＨＣ結合ペプチド、好ましくは少なくとも約５，０００の異なるＭＨＣ結合ペプチド、より好ましくは少なくとも約１５，０００の異なるＭＨＣ結合ペプチド、最も好ましくは少なくとも約１５０，０００のＭＨＣ結合ペプチドを有する免疫ペプチドーム調製物を含んでなり得る。前記ペプチドは、ＭＨＣクラスＩタンパク質では８～１０残基の長さ、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質では１３～２５残基の長さの結合モチーフを含んでなり、８～１００、好ましくは８～３０、より好ましくは８～１６残基の長さであり得る。最も好ましいのは、実際の結合モチーフからなるペプチドである。
本発明の文脈で使用されるリガンドペプチドは、がん関連、感染関連（細菌またはウイルス）、さらには免疫（例えば、自己免疫）疾患関連のポリペプチドに由来し得る。用語にはまた、適切に変異した、または天然に存在する変異した、すなわち、それぞれのポリペプチドに存在するそれらの基礎となる配列とは異なる、リガンドペプチドが含まれる。
好ましいのは本発明による方法であり、前記接触は、約４℃～３７℃、好ましくはほぼ室温（１５～２５℃、好ましくは２０℃）で、前記ＭＨＣ結合ペプチドをＭＨＣに負荷することを含んでなる。
驚くべきことに、負荷されたＨＬＡ／ペプチド分子（ｐＭＨＣまたはｐＭＨＣ複合体）は、約４℃で、約１日を超えて、好ましくは１週間を超えて（例えば、２週間を超えて）非常に安定していることが見いだされた。これにより、上記の既知の方法よりもさらに多くの用途における、効果的かつ便利な使用が可能になる。
また、本発明の文脈において、上記の文献とはいくらか対照的に、本方法は、ＷＴのｐＭＨＣ分子を使用するＵＶ交換の一般的な方法よりも明らかに優れており、チップまたはスライドガラスのような表面上で（特に、高スループット形式で）それを実施できようにすることが判明した。ＵＶ媒介ペプチドリガンド交換は、多数の異なるｐＭＨＣ複合体を生成し得る一方で、交換効率は、ペプチドと、そのそれぞれのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子への結合に対する親和性次第で変動し、サンプル中に異なるｐＭＨＣ濃度が生じる。正確な親和性を判定するためには濃度の正確な知識が必要とされるので、可溶性分析物として使用されるｐＭＨＣを用いた親和性測定では、この不確実性が問題となる。ジスルフィド安定化ＭＨＣ変異体はペプチドなしで安定であるため、この制限は当てはまらない。空のＭＨＣ複合体を飽和させるのに十分高い濃度でペプチドが添加されると、ｐＭＨＣの有効濃度が分かり、測定の精度が大幅に向上し、偽陰性が回避される。
本発明の方法の次のステップでは、前記ｐＭＨＣ分子複合体がＴＣＲ結合についてスクリーニングされる。この相互作用の結合および動態属性は、保護的Ｔ細胞媒介免疫のパラメータであり、より強いＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用は相互作用半減期の増加を示し、したがって弱い相互作用よりも優れたＴ細胞活性化と応答性をもたらす。ＴＣＲとｐＭＨＣリガンドの間の相互作用の強さは、典型的には、特定の相互作用のオンレート定数ｋｏｎとオフレート定数ｋｏｆｆの比である、解離定数Ｋｄとして記述され測定される。より小さなＫｄ値はより強い結合を表すので、解離定数Ｋｄは特定の相互作用の結合強度と逆相関する。
スクリーニングは、例えば、構造的ＴＣＲ－ｐＭＨＣ親和性／結合力測定など、ｐＭＨＣ／ＴＣＲ結合を測定および／または検出するための任意の適切な既知の方法を含んでなり得る。一例は、本明細書で開示されるように、特殊な形態の反射干渉法（ＲＩ）であるバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）による、ＴＣＲ結合についてのペプチド－ＭＨＣライブラリのスクリーニングであり、前記ＴＣＲに対する結合相互作用は、方法に適する感度閾値Ｋｄ１．０×１０－５より強く検出され、測定されたＫｄの値は、３．７×１０－９～７．２×１０－６の範囲であり、または感度閾値よりも弱い場合には、前記ＴＣＲに対する結合相互作用は検出されなかった。
その他の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、または反射型干渉分光法（ＲＩｆＳ）、または単色反射法（ＳＣＯＲＥ、Ｂｉａｍｅｔｒｉｃｓ、独国チュービンゲン）のような、ＲＩのその他の形態；または例えば、ＮＴＡｍｅｒ（ＴＣＭｅｔｒｉｘ，スイス国エパランジュ）またはｐＭＨＣまたはＴＣＲ四量体を使用したフローサイトメトリー分析などのマーカーベースのアッセイ；またはタンパク質マイクロアレイのようなその他の形態の蛍光読み出しを伴う。もちろん、理想的にはこれらの方法は、高スループット形式で実施され得て、またはそのために容易に調節され得る。
本発明の文脈において、「約」という用語は、特に明記されない限り、所与の値の±１０％を含むことを意味するものとする。
本発明は一例として、使用前にペプチドを単に添加するだけで負荷され得る、ジスルフィド安定化された空のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子の使用を提示する。この修飾ＭＨＣ分子を使用して生成されたｐＭＨＣは、非修飾野生型変種に相当するものであり、したがって高親和性ＴＣＲの結合モチーフの高スループット判定、並びに潜在的に交差反応性のペプチドの同定と特性評価に適していることが実証される。
好ましいのは本発明による方法であり、ここで前記ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ、または二量体、三量体、および四量体からなる群から選択される、ＨＬＡ、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩの多量体である。スクリーニングで一度に２つ以上のＭＨＣ分子を使用する方法は、例えば、Ａｌｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｉｎ：”Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．”，Ｓｃｉｅｎｃｅ．４ Ｏｃｔ １９９６：Ｖｏｌ．２７４，Ｉｓｓｕｅ ５２８４，ｐｐ．９４－９６９からなど、当該技術分野で公知である。同様に、二量体または三量体が使用され得る。
使用されるＭＨＣ分子は、アミノ酸間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋を含む。この架橋は、組換え的に導入されたジスルフィド架橋、架橋されるべき非天然アミノ酸の導入、光架橋アミノ酸の導入、および化学的に導入された架橋から選択される。システインを使用した架橋の導入は、本明細書に記載されており；二量体架橋試薬の例はＤＰＤＰＢおよびＨＢＶＳであり、三量体架橋剤の例はＴＭＥＡである。
好ましいのは本発明による方法であり、ここでアミノ酸間の前記少なくとも１つの人為的に導入された共有結合架橋は、例えば、（ｉ）大部分のＨＬＡではチロシンであるＭＨＣ Ｉの８４位のアミノ酸（図１３を参照されたい）、および大部分のＨＬＡではアラニンである１３９位のアミノ酸（図１３を参照されたい）をシステインに変異させること、および／または（ｉｉ）大部分のＨＬＡではフェニルアラニンであるＭＨＣ Ｉの２２位のアミノ酸（図１３を参照されたい）、および大部分のＨＬＡではセリンであるＭＨＣ Ｉの７１位のアミノ酸（図１３を参照されたい）を変異させること、および／または（ｉｉｉ）大部分のＨＬＡではトリプトファンであるＭＨＣ Ｉの５１位のアミノ酸（図１３を参照されたい）、および大部分のＨＬＡではグリシンであるＭＨＣ Ｉの１７５位のアミノ酸（図１３を参照されたい）を変異させること、または（ｉｖ）大部分のＨＬＡではフェニルアラニンであるＭＨＣ Ｉの２２位のアミノ酸（図１３を参照されたい）、および大部分のＨＬＡではセリンであるＭＨＣ Ｉの７１位のアミノ酸（図１３を参照されたい）を変異させること、および大多数のＨＬＡではトリプトファンであるＭＨＣ Ｉの５１位のアミノ酸（図１３を参照されたい）、および大多数のＨＬＡではグリシンであるＭＨＣ Ｉの１７５位のアミノ酸（図１３を参照）を変異させること（最初の２４アミノ酸を除くＩＧＭＴ番号付けに基づく）によってαらせん間に導入される。α１およびα２ドメイン、またはＭＨＣ－Ｉ全体の分子動力学シミュレーションは、空のＭＨＣ－Ｉとペプチド結合ＭＨＣ－Ｉとの顕著な違いを示唆しており、ペプチドの非存在下では、Ｆポケット領域を挟むらせんセクション（それぞれ、α１およびα２らせんの残基７４～８５および１３８～１４９）は、可動性が著しくより高い。結合ペプチドはこの領域の可動性を制限し、ペプチド結合ポケットの異なる構造的特徴を好ましくはジスルフィド結合である共有結合と連結することによって、同様の有利な安定化高次構造的制限が達成されるように見える。
所与の各ＨＬＡ対立遺伝子中の上記残基２２、５１、７１、７４～８５、１３８～１４９、および１７５に対応する位置のアミノ酸を判定するために、それぞれの配列は上記の参照抗体と整列される。公式ＨＬＡ（ＭＨＣクラスＩ）参照タンパク質配列と、マウスＭＨＣ Ｉ Ｈ２Ｋｂタンパク質の複数の配列とのアラインメントの一例；アミノ酸２２、５１、７１、８４、８５、１３９、１４０、および１７５（太字）、および安定化変異の導入に適したさらなる領域（灰色）が強調されて、図１３に示される。図１３は、当業者が、所与の各ＨＬＡ対立遺伝子中の上記残基２２、５１、７１、７４～８５、１３８～１４９、および１７５に対応する位置のアミノ酸を同定することを可能にするであろう。
好ましい一実施形態では、本発明で使用されるＭＨＣ Ｉ分子は、好ましくは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｋ、ＨＬＡ－Ｌである、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡタンパク質である。これらの好ましいＨＬＡタンパク質は、ＩＭＧＴ命名法の参照配列に従って、それぞれ、それらのα１ドメインおよびα２ドメインで変異され得る。好ましくは、これらのＨＬＡタンパク質は、２２位内の１つまたは複数の好ましくは１つのアミノ酸、５１位内の１つまたは複数の好ましくは１つのアミノ酸、７１位内の１つまたは複数の好ましくは１つのアミノ酸、７４～８５位内の１つまたは複数の好ましくは１つのアミノ酸、１３８～１４９位内の１つまたは複数の好ましくは１つのアミノ酸、１７５位内の１つまたは複数の好ましくは１つのアミノ酸が、変異している。さらにより好ましくは、８４または８５位の１つのアミノ酸が変異しており、１３９または１４０位で１つのアミノ酸が変異している。さらにより好ましくは、１つのアミノ酸は２２位で変異し、１つのアミノ酸は７１位で変異している。さらにより好ましくは、１つのアミノ酸は２２位で変異し、１つのアミノ酸は７１位で変異し、１つのアミノ酸は５１位で変異し、１つのアミノ酸は１７５位で変異している。好ましいアミノ酸変異は、７４～８５位の１つのアミノ酸、および１３８～１４９位の１つのアミノ酸のシステインへの置換である。なおもより好ましいアミノ酸変異は、２２位の１つのアミノ酸のシステインへの置換である。なおもより好ましいアミノ酸変異は、５１位の１つのアミノ酸のシステインへの置換である。なおもより好ましいアミノ酸変異は、７１位の１つのアミノ酸のシステインへの置換である。なおもより好ましいアミノ酸変異は、１７５位の１つのアミノ酸のシステインへの置換である。
別の好ましい実施形態では、ＨＬＡ－Ａタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ３、およびＨＬＡ－Ａ１１からなる群から選択される。これらの好ましいＨＬＡ－Ａタンパク質は、ＩＭＧＴ命名法の参照配列に従って、それぞれ、それらのα１ドメインおよびα２ドメインで変異され得る。好ましくはこれらのＨＬＡタンパク質は、アミノ酸２２、５１、７４～８５、１３８～１４９位、およびアミノ酸１７５位で変異され得る。なおもより好ましくは、ＨＬＡ－Ａタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質である。好ましいＨＬＡ－Ａ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１；ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１またはＨＬＡ－Ａ＊０３：０１である。
別の好ましい実施形態では、ＨＬＡ－Ｂタンパク質はＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５またはＨＬＡ－Ｂ＊４４からなる群から選択される。これらの好ましいＨＬＡ－Ｂタンパク質は、ＩＭＧＴ命名法の参照配列に従って、それぞれ、それらのα１ドメインおよびα２ドメインで変異され得る。好ましくはこれらのＨＬＢタンパク質、アミノ酸７４～８５位およびアミノ酸１３８～１４９位で変異され得る。好ましいＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２；ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１またはＨＬＡ－Ｂ＊４４：０５である。
本発明の文脈において、「ＴＣＲ」という用語は、ＴＣＲ由来のまたはＴＣＲ様結合ドメインを含んでなる任意のタンパク質性分子／コンストラクトを含むものとし、ここで分子／コンテクストは、本明細書に記載されるように本発明によるｐＭＨＣ／ＴＣＲ結合の分析／検出に適する。ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖の場合、これは分子を含んでもよく、ここで、双方の鎖は（非修飾α鎖および／またはβ鎖、または融合タンパク質または修飾α鎖および／またはβ鎖のいずれかで）Ｔ細胞受容体を形成でき、これは、特に（特異的な）ｐＭＨＣへの結合、および／またはペプチドの活性化に伴う機能的シグナル伝達などのその生物学的機能を発揮する。好ましいのは本発明による方法であり、ここで前記ＴＣＲは、天然ＴＣＲと、可溶性ＴＣＲ分子と、一本鎖ＴＣＲと、例えば、本明細書に記載されるような二重特異性（ｂｓ）ＴＣＲなどのＴＣＲ由来またはＴＣＲ様結合ドメイン（例えば、抗体に由来する）を含んでなるＴＣＲ様分子とから選択される。
好ましい実施形態における本発明による方法は、ＵＶ交換関連方法をはじめとする一般的な技術と比較して、はるかにより多くのペプチドリガンドおよび／またはｐＭＨＣの並行検出、分析、および／またはスクリーニングを可能にする。クラスＩおよびクラスＩＩのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子によって細胞表面に提示されるペプチドの集まりは、免疫ペプチドームと称される。２０１７年５月には、既に１１９，０７３の高信頼性ＨＬＡクラスＩペプチド、および７３，４６５の高信頼性ＨＬＡクラスＩＩペプチドが報告されており（Ｓｈａｏ Ｗ，Ｐｅｄｒｉｏｌｉ ＰＧＡ，Ｗｏｌｓｋｉ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＳｙｓｔｅＭＨＣ Ａｔｌａｓ ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１８；４６（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１２３７－Ｄ１２４７）、したがって、ヒト免疫ペプチドームは、クラスＩおよびＩＩのそれぞれについて、１５０，０００のＭＨＣ結合ペプチドを超えることが予測され得る。現在の方法は、１日に約７００のペプチドを分析し得て、そのため「真の」高スループット法、すなわち、少なくとも約１，５００の異なるＭＨＣ結合ペプチド、好ましくは少なくとも約５，０００の異なるＭＨＣ結合ペプチド、より好ましくは少なくとも約１５，０００の異なるＭＨＣ結合ペプチド、最も好ましくは少なくとも約１５０，０００のＭＨＣ結合ペプチドを有する実質的に完全な免疫ペプチドーム調製物を含んでなる、多数のペプチドリガンドの分析が求められている。
本発明の方法は、免疫ペプチドーム全体のスクリーニングを１日以内という短い期間で可能にする。
検出／分析されるｐＭＨＣ／ＴＣＲ結合の数を考慮すると、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）形式として実施される、本発明による方法が好ましい。ＨＴＳでは、最大数十万個の実験サンプルを所与の条件下で、ｐＭＨＣ／ＴＣＲ結合の同時試験に供し得る。サンプルは通常、好ましくは、サンプルの調製、処理、およびデータ分析を自動化する検査室ロボット工学によって処理される。したがって、ＨＴＳは、大規模なデータセットを容易かつ確実に生成し使用して、例えば、本明細書に記載されるような、ｐＭＨＣ／ＴＣＲ結合動態および本明細書に記載の生物学的機能などの複雑な生物学的質問に回答する。
ＨＴＳでは古典的に、サンプルを配列形式で準備する必要がある。必要ならば、配列されたサンプルは、液体中のマイクロタイタープレートまたは固体寒天上で増殖させ得る。プレートの密度は、９６、１９２、３８４、７６８、１，５３６、または６，１４４の範囲であり得る。これらの密度は全て９６の倍数であり、９ｍｍ間隔で８×１２に配置された元の９６ウェルマイクロタイタープレートを反映する。（例えば、Ｂｅａｎ ＧＪ，Ｊａｅｇｅｒ ＰＡ，Ｂａｈｒ Ｓ，Ｉｄｅｋｅｒ Ｔ．”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｌｔｒａ－Ｈｉｇｈ－Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ”Ｏｍｉｃｓ．””ＰＬｏＳ ＯＮＥ．２０１４ Ｊａｎ ２１；９（１）：ｅ８５１７７もまた参照されたい）。
本明細書に記載されるように、検出／分析されたｐＭＨＣ／ＴＣＲ結合動態に関連する用途のために、チップ、バイオセンサー、スライドガラスまたはビーズなどの固体表面が使用され得て、その上にいくつかの分析試薬（例えば、ＴＣＲまたはＭＨＣ分子のどちらか）が、例えばスポットされるなど、適切に固定化され得る。固定化のために、例えば、ビオチンストレプトアビジン相互作用などの任意の適切な技術が用いられ得る。本明細書に記載されるような実施形態の例は、少なくとも１つの固定化されたｐＭＨＣに対する少なくとも１つの可溶性ＴＣＲの結合、または少なくとも１つの可溶性ｐＭＨＣに対する少なくとも１つの固定化ＴＣＲの結合が関与する、結合アッセイである。
好ましいのは本発明による方法であり、ここで前記ＴＣＲおよび／またはＭＨＣ分子は、検出可能なマーカーで標識されていないか、または適切に標識されていない。それぞれのマーカーは当該技術分野で公知であり、放射性、蛍光または化学基（例えば、色素）による直接的または間接的な標識が挙げられる。また、酵素マーカーまたは抗原マーカー（抗体による検出用）、および質量マーカーも使用され得る。別の選択肢は、マーカー（例えば、特定の核酸）をコードすることである。標識がない場合、結合を同定するために、質量変化、電荷変化、または例えば、分析物の結合によるバイオレイヤーの光学的厚さ、ひいては干渉パターンまたは反射係数などの光学特性の変化などの、複合体形成／結合時の物理的状態の変化に基づく結合の検出が用いられ得る。
結合、特にｐＭＨＣとＴＣＲとの「特異的」結合を検出する方法は、当該技術分野で公知である。本発明において好ましいのは本発明による方法であり、ここでＫｄ値ならびにｋｏｎおよびｋｏｆｆ値は、前記ＴＣＲについて、好ましくは１×１０－１０Ｍ～１×１０－３ＭのＫｄｓの感度で測定され得て、感度は分析対象物の濃度によって決まる。
好ましい一例として、親和性は、５００ｎＭで始まる１：２の分析物希釈系列を使用して、または５００ｎＭで始まる１／√１０分析物希釈系列を使用して測定される。好ましい一例として、ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体は、異なる濃度を有する並行アッセイ反応で使用される。
本発明による方法のなおも別の重要な態様では、前記方法は、ＴＣＲと、前記ＴＣＲに結合するＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体とを含んでなる、Ｔ細胞活性化を測定するステップをさらに含んでなる。結合、特にｐＭＨＣのＴＣＲへの「特異的」結合を通じて、このようなＴ細胞活性化を検出する方法は、当該技術分野で公知である。本発明では、一例として、ペプチドが負荷された標的細胞、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞、および６つの異なる濃度のｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３の同時インキュベーションアッセイが実施され、位置スキャニングライブラリからのペプチドリガンドに対する測定された親和性と、バックグラウンドの３倍のルミネセンス増加を誘導するのに必要な最低ｂｓＴＣＲ濃度との相関が、カットオフとして採用された。
本発明のさらに別の重要な態様は、本明細書に記載されるような本発明による方法を実施するステップを含んでなる、事前選択されたＴＣＲが選択され、それに対して特定のアミノ酸結合モチーフが検出または生成される、ＴＣＲの特定のアミノ酸結合モチーフを検出または生成するための方法である。方法は、ａ）適切に安定化されたＭＨＣ分子を提供するステップと、ｂ）前記適切に安定化されたＭＨＣ分子をその多数のペプチドリガンドに接触させて、ペプチドリガンド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）分子複合体を形成するステップと、ｃ）前記事前に選択されたＴＣＲを使用して、前記ｐＭＨＣ分子複合体をＴＣＲ結合についてスクリーニングするステップとを含んでなり、前記ＭＨＣ分子は、ＭＨＣ Ｉの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのアミノ酸とα２ドメインのアミノ酸との間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋、およびＭＨＣ ＩＩの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのアミノ酸とβ１ドメインのアミノ酸との間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋を含んでなる。追加的なステップでは、ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列が決定され、任意選択的にそして好ましくは比較され、前記事前選択されたＴＣＲの特定のアミノ酸結合モチーフの同定がもたらされる。
追加的な一実施形態は、同定後に特定のアミノ酸配列を変異誘発するステップと、前記変異ペプチドを適切に安定化されたＭＨＣ分子に接触させるステップと、前記ｐＭＨＣ分子複合体を、事前選択されたＴＣＲとのＴＣＲ結合についてスクリーニングし、前記事前選択されたＴＣＲのアミノ酸結合モチーフを得るステップとを含んでなる。ペプチドの変異誘発は、例えば、変異ペプチドを合成することによって、またはそれぞれのペプチドバインダー中の既存のアミノ酸を化学的に修飾することによって、容易に実施され得る。変異誘発はまた、診断的に有効なバインダーを同定するために、ペプチドにマーカーまたはその他の基を添加することを伴い得る。この態様は、本明細書に記載されるような本発明による方法に関し、前記方法ステップは、同定された前記事前選択されたＴＣＲの修飾アミノ酸配列からなるペプチドのプールを含んでなるように繰り返される。修飾は、アミノ酸配列の修飾に基づいて改善された結合パラメーターを計算するために用いられる、既知のコンピューターアルゴリズムおよび／またはプログラムの１つによってさらに導かれ得る。
その一例は、本明細書で開示されるようなバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によるＴＣＲ結合のために事前選択されたＴＣＲに対して、前記様式で作製されたペプチドを含んでなるｐＭＨＣ複合体ライブラリのスクリーニングであり、前記ＴＣＲに対する結合相互作用は、方法に適する感度閾値Ｋｄ１．０×１０－５Ｍより強く検出され、測定されたＫｄの値は、３．７×１０－９Ｍ～７．２×１０－６Ｍの範囲であり、または感度閾値よりも弱い場合には、前記ＴＣＲに対する結合相互作用は検出されなかった。前記実施形態では、適切に安定化されたＭＨＣ分子とのｐＭＨＣ複合体の生成は予測可能な量のｐＭＨＣを生成し、ひいては既存の方法と比較してＫｄ測定精度を高めるので、本発明は既存の方法に対して特定の改善を示す（図５）。
１つの追加的な実施形態において、ペプチドリガンドの多数は、例えば、質量分析によって同定されるように、免疫ペプチドームからの既知のペプチドリガンドから大部分が構成され、ここで事前選択されたＴＣＲは、ＴＣＲ結合についてスクリーニングされて、前記ＴＣＲに対する既存の交差反応性ペプチドリガンドが直接同定される。好ましいのは、異なるペプチドの数が、並行して測定される、少なくとも約１５００の異なるＭＨＣ結合ペプチド、好ましくは少なくとも約５０００の異なるＭＨＣ結合ペプチドを含んでなる、この実施形態による方法である。
本発明のなおも別の重要な態様は、本明細書に記載されるようなＴＣＲの特定のアミノ酸結合モチーフを検出または生成するための方法を実施するステップと、ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列を判定および比較し、それによって前記ＴＣＲの交差反応性を同定する追加的なステップとを含んでなる、ＴＣＲの交差反応性を検出または判定するための方法である。この態様は、単一のＴＣＲによって認識されるペプチドの変異型を検出する。
本発明のなおも別の重要な態様は、事前選択されたＴＣＲを含んでなる、本明細書に記載されるような本発明による、ＴＣＲ結合のためのＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体をスクリーニングするための方法を実施するステップと、ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列を判定および比較し、それによって前記ＴＣＲの交差反応性を同定する追加的なステップとを含んでなる、ＴＣＲの交差反応性を検出または判定するための方法である。この態様もまた、単一のＴＣＲによって認識されるペプチドの変異型を検出する。
その一例は、本発明による変異誘発由来のｐＭＨＣ複合体ライブラリを用いてＴＣＲ結合について事前選択されたＴＣＲをスクリーニングすることによって、以前に判定されたアミノ酸結合モチーフに基づく交差反応性ペプチドリガンドを同定し、既知のまたは想定されるペプチドリガンドのデータベース内で一致するペプチドリガンドを検索することである。
本発明のなおも別の重要な態様は、事前選択されたｐＭＨＣを含んでなる、本明細書に記載されるような本発明による、ＴＣＲ結合のためのＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体をスクリーニングするための方法を実施するステップと、それについてｐＭＨＣ結合が検出されたＴＣＲを同定し、それによって前記ＴＣＲの交差反応性を特定する追加的なステップとを含んでなる、ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体の交差反応性を検出または判定するための方法である。この態様は、単一のペプチドを認識するＴＣＲの変異型を検出する。
これらの態様では、上記のように、ｐＭＨＣと事前選択されたＴＣＲとの結合を検出するための同一方法が使用され得る。それにもかかわらず、ＴＣＲ結合は必ずしも特異的である必要はないので、結合を測定し評価するためのカットオフ値および感度は最適である必要はなく、当業者であれば理解できるように、それぞれの状況下で最適なものが選択されるべきである。
本発明による方法の別の重要な態様では、前記方法は、ＴＣＲと、前記ＴＣＲに結合するＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体とを含んでなるＴ細胞活性化を測定するステップをさらに含んでなり得る。結合、特にｐＭＨＣのＴＣＲへの「特異的」結合を通じて、このようなＴ細胞活性化を検出する方法は、当該技術分野で公知である。本発明では、一例として、ペプチドが負荷された標的細胞、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞、および６つの異なる濃度のｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３の同時インキュベーションアッセイが実施され、位置スキャニングライブラリからのペプチドリガンドに対する測定された親和性と、バックグラウンドの３倍のルミネセンス増加を誘導するのに必要な最低ｂｓＴＣＲ濃度との相関が、カットオフとして採用された。
本発明の別の重要な態様は、次に、適切に安定化されたＭＨＣ分子を含んでなる医薬組成物に関し、ここで前記ＭＨＣ分子は、ＭＨＣ Ｉの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのアミノ酸とα２ドメインのアミノ酸との間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋、および／またはＭＨＣ Ｉの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインの２つのアミノ酸間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋、および／またはＭＨＣ ＩＩの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのアミノ酸とβ１ドメインのアミノ酸との間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋を含んでなり、ここで前記安定化されたＭＨＣ分子は、ビーズ、フィラメント、ナノ粒子またはその他の適切な担体に結合している。
好ましい実施形態では、医薬組成物は、本発明の第２の態様で上述したように、本発明の第２の態様による安定化されたＭＨＣ分子を含んでなる。好ましくは、医薬組成物に含まれる安定化されたＭＨＣ分子は、膜貫通ドメインを含まない。
医薬組成物は、適切な緩衝剤および／または賦形剤をさらに含んでなる。好ましくは、本発明による前記医薬組成物は、抗ＣＤ２８または抗４１ＢＢ抗体など、これらの共刺激分子の１つおよび／または時系列配列の組み合わせをさらに含んでなり得る。
本発明の別の重要な態様は、次に、本明細書の本発明による方法における、本発明による医薬組成物の使用に関する。
一実施形態では、医薬組成物は、ワクチンに含まれる。別の実施形態では、医薬組成物は、薬剤の製造で使用するためのワクチンに含まれる。好ましくは、ワクチンは、がんの予防に使用される。さらにより好ましくは、ワクチンは、それを必要とする対象に投与された後、対象のＴ細胞応答を惹起または誘発する。好ましくは、ワクチン中の医薬組成物に含まれる安定化されたＭＨＣ分子は、膜貫通ドメインを含まない。
本発明の別の重要な態様は、次に、ｐＭＨＣ複合体で刺激して特定の患者のための細胞医薬品を生成することによる、Ｔ細胞受容体の個別化同定、またはＴ細胞の活性化、および／またはがんなどの増殖性疾患に対するＴ細胞治療薬の改善のための方法に関する。このような刺激は、本発明による方法を含んでなる、前記患者からがん組織および／またはがん細胞のサンプルを入手／提供するステップと、前記患者から正常組織および／または細胞のサンプルを入手／提供することを提供するステップと、ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）または同等の方法を使用して、前記サンプル中のＭＨＣの文脈で提示されたペプチドを検出するステップと、前記ペプチドの少なくとも１つの配列を決定するステップと、任意選択的に、決定された前記ペプチドの基礎となる遺伝子の発現を検出するステップと、前記サンプル中で検出されたペプチドのＭＨＣ提示レベル／数を検出するステップと、任意選択的に、前記腫瘍および正常組織および／または細胞サンプル中で検出されたペプチドの前記ＭＨＣ提示レベル／数を比較するステップと、最適化されたＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体をスクリーニングするステップとによって同定された、ペプチドが負荷されたｐＭＨＣ複合体に基づき得る。前記Ｔ細胞は、前記患者から直接回収されたものを含み、前記刺激の後に細胞医薬品として再投与され得る。前記刺激は、好ましくは臨床グレードの条件（例えば、ＧＭＰ）の下で製造された適切に安定化されたＭＨＣ分子を例えばフィラメントまたはビーズなどの担体に固定化することによって製造され、次に、それにオンデマンドで例えば臨床現場で直接、ペプチドが負荷され得る、事前に作成された刺激フレームワークの使用を含み得る。これらの刺激フレームワークは、適切に安定化されたＭＨＣ分子と共に固定化されたその他の共刺激分子（例えば、抗ＣＤ２８抗体、抗４１ＢＢ抗体）もまた含み得る。
上記方法の好ましい態様では、前記ペプチド、例えば、特定のタイプのがんまたはその他の種類の増殖性疾患に特異的なペプチドは、別の患者における以前の同定を通じて、処置を行う当業者には既に知られている。したがって、前記ペプチドは、同一タイプのがんを有する異なる患者のために迅速に選択および生成され、前記刺激フレームワーク上に負荷されて、細胞医薬品を製造するために使用され得る。
上記方法の好ましい態様では、前記Ｔ細胞活性化のプロセス、および／または前記患者から直接回収されたＴ細胞治療薬は、腫瘍特異的外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するようにＴ細胞を導入するステップと、任意選択的に、前記得られたＴ細胞治療薬を適切に配合するステップともまた含んでなる。
「Ｔ細胞」という用語は、当該技術分野で定義されているＴリンパ球を指し、組換えＴ細胞を含むことが意図される。本明細書の用法では、「Ｔ細胞受容体」および「ＴＣＲ」という用語は、ＭＨＣ分子に結合する抗原の認識に関与するＴ細胞の表面上に見られる分子を指し、習慣的に、ＭＨＣ分子によって提示された際にペプチドを認識できる分子を指す。分子は、α鎖およびβ鎖（または選択的にγ鎖およびδ鎖）を含むヘテロ二量体、またはシグナルを発生するＴＣＲコンストラクトである。本発明のＴＣＲは、その他の種に由来する配列を含むハイブリッドＴＣＲである。例えば、マウスＴＣＲはヒトＴ細胞においてヒトＴＣＲよりも効果的に発現されるので、ＴＣＲはヒト可変領域およびマウス定常領域を含む。この用語は、結合に必要な相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む限り、可溶性ＴＣＲ分子およびその誘導体もまた含む。
ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）技術は、とりわけ、それらの全体が参照により援用される、国際公開第０３／１００４３２号パンフレット、国際公開第２００５／０７６００９号パンフレット、および国際公開第２０１１／１２８４４８号パンフレットに記載されている。
上記方法の好ましい態様では、増殖性疾患に対する改善された個別化Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞、および／またはＴ細胞治療薬の前記開発は、腫瘍特異的外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように患者の自己由来の（自身の）Ｔ細胞を形質導入するステップと、任意選択的に、前記得られたＴ細胞治療薬を適切に配合するステップとをさらに含んでなる。
本発明者らは、例としてのジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子が、安定した空のＭＨＣモノマーとして容易に生成され、再折りたたみ後にリガンドペプチドが負荷され、野生型ｐＭＨＣ複合体を使用して収集されたデータと良好に一致する、親和性データを生成するために使用され得ることを実証している。
ジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子と二重特異性ＴＣＲの双方をＢＬＩベースのスクリーニングと併用して、現在、文献でこれらの相互作用のために現在使用されている表面プラズモン共鳴測定よりもはるかにより高いスループットを有するプラットフォームである、ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲの結合親和性が測定され得る。ジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子はこのプラットフォームの一部であり、信頼性が高く、なおも高スループットのｐＭＨＣ生成を提供する。このプラットフォームは、モノクローナル抗体または二重特異性物質（例えば、ＢＩＴＥ）などのｐＭＨＣを標的化する場合、その他の生物製剤の分析にも役立ち得る。ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合親和性は、本発明者らが、機能的な二重特異性物質Ｔ細胞エンゲージャーを用いて双方を実施した場合に、細胞アッセイと良好に相関した。本発明者らの知る限りでは、これは、幅広い親和性にわたる、ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合親和性と生体外活性の関係の最初の詳細な分析である。細胞スクリーニングと比較して、親和性スクリーニングプラットフォームはより使いやすく、顕著に迅速に機能し、そのため早期スクリーニングツールとして適任である。ジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子が、低親和性ペプチドリガンドでさえｐＭＨＣ複合体として予測通りに提示する能力により、本発明者らは、外因性ペプチド負荷アプローチにおいて遭遇する変動を考慮する必要なしに、ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合親和性を正確に測定し得て、その結果、潜在的に価値のある情報が失われることはない。本発明者らは、提示された親和性解析プラットフォームの使いやすさが、安全かつ効果的なＴ細胞受容体ベースの二重特異性物質分子の開発を早期段階から支援すると考えている。
一例として、本発明者らは、ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合親和性データセットを迅速に生成し、それらから交差反応性検索モチーフを外挿することが可能であることを示している。本発明者のＨＬＡペプチドミクスベースのＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）プラットフォームによって導かれ、検索モチーフを使用して、潜在的に交差反応性のペプチドリガンドが同定され得る。提示されたこのストラテジーの実施において、本発明者らは、ｂｓＴＣＲによって強く認識され、Ｔ細胞活性化を誘導できる多数のペプチドを同定し得て、元の標的と比較して、配列コンセンサスは、９つの位置のうち１つという低さであった。
この刺激的で革新的な技術は、発見された免疫ペプチドーム全体のスクリーニングをもたらし得て；このような次元のｐＭＨＣライブラリは、現在、ランダムに変異した一本鎖ペプチドＭＨＣライブラリ（３２、３３）を用いた、酵母ディスプレイによってのみ利用可能である。それらは、広範なＴＣＲ解析のためには有用であるが、抗体開発で典型的に使用されるペプチドマイクロアレイと比較して、使用がはるかにより複雑であり、ペプチドリガンド組成の予測が困難である。本発明のジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子は、その安定性と低労力のペプチド負荷プロセスのために、例えば、空のＭＨＣの大規模コーティングと近代的ペプチドマイクロアレイインクジェットプリンタの高スループットを組み合わせることによって、将来的に非常に複雑なｐＭＨＣマイクロアレイの作成に理想的に適合してもよい。
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞による照合のために、細胞表面上に短いペプチドリガンドを提示する。腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を提示するＭＨＣクラスＩ複合体は、現在開発中のがん免疫療法アプローチの重要な標的であり、有効性ならびに安全性全性のスクリーニングにとって重要である。ペプチドリガンドなしでは、ＭＨＣクラスＩ複合体は不安定で急速に崩壊するため、分析目的での可溶性モノマーの製造のためには労働集約的である。本発明者らは、ペプチドなしで安定であるが、選択されたリガンドと数分以内にペプチド－ＭＨＣ複合体を形成し得る、ジスルフィド結合安定化ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を開発した。本発明者らは、野生型または成熟高親和性ＴＣＲの結合親和性に関して、操作された変異体と野生型変異型との間の一致を例示する。本発明者らは、二重特異性ＴＣＲ分子の高スループット親和性スクリーニングにおける分析物としてのそれらの可能性を実証し、オフターゲット相互作用を同定するための包括的なＴＣＲ結合モチーフを生成する。
本発明の別の態様は、本発明の第２の態様の安定化ＭＨＣ分子またはそのペプチド結合断片をコード化する核酸およびベクターに関する。ＭＨＣ Ｉが全てのペプチド結合ドメイン、すなわち１つのポリペプチド鎖上のα１ドメインおよびα２ドメインを含んでなる一方で、ＭＨＣ ＩＩが２つのポリペプチド鎖上のα１ドメインおよびβ１ドメインを自然に含んでなることは、当該技術分野で周知である。前述したように、機能的なＭＨＣ ＩＩはまた、β１ドメインをα１ドメインに融合させることによって、単一のペプチド上に提供され得る。したがって、本発明のＭＨＣ ＩおよびＩＩをコード化する核酸は、１つまたは２つのポリペプチドをコード化してもよく、または２つのポリペプチドはまた、２つの別個の核酸によってコード化されてもよい。
「核酸」という用語は、本発明の文脈において、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基、またはその双方の一本鎖または二本鎖オリゴまたはポリマーを指す。ヌクレオチドモノマーは、核酸塩基、五炭糖（リボースまたは２’－デオキシリボースなどであるがこれらに限定されるものではない）、および１～３つのリン酸基からなる。典型的には、核酸は、個々のヌクレオチドモノマー間のリン酸ジエステル結合を通じて形成されるが、本発明の文脈において、核酸という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含むがこれらに限定されず、その他の連結体からなる核酸の合成形態も含む（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７－１５００，１９９１）に記載されるようなペプチド核酸）。典型的には、核酸は一本鎖または二本鎖分子であり、天然に存在するヌクレオチドからなる。核酸の一本鎖の描写はまた、（少なくとも部分的に）相補鎖の配列を画定する。核酸は一本鎖または二本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖配列の双方の部分を含有してもよい。例示された二本鎖核酸分子は、３’または５’のオーバーハングを有し得て、したがって、それらの全長にわたって完全に二本鎖である必要はなく、または想定もされない。本発明の核酸は、生物学的、生化学的、化学的合成法によって、または増幅法、およびＲＮＡの逆転写法をはじめとするがこれらに限定されるものではない、当技術分野で知られている方法のいずれかによって得られてもよい。核酸という用語は、染色体または染色体のセグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡまたはＲＮＡポリマー、プライマー、プローブ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含んでなる。核酸は、例えば、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であり得て、その長さは特に限定されない。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された任意の配列に加えて、相補的な配列を含んでなりまたはそれをコード化する。
本発明の別の態様は、本発明の第２の態様の安定化たＭＨＣ分子またはそのペプチド結合断片をコード化する核酸を含んでなる、ベクターである。このようなベクターは、患者におけるワクチンの発現が望ましいワクチン接種ストラテジーで使用されてもよい。このような場合、ベクターは、それに対する免疫応答、好ましくはＴ細胞応答が所望される、タンパク質、またはその断片を含んでなるＴ細胞エピトープをさらにコード化してもよい。このようにして、ベクターを含んでなる患者の細胞で発現されたＭＨＣ分子のペプチド結合ポケットに、正しいペプチドが負荷されていることが、確認されてもよい。代案としては、ＭＨＣ分子は、融合タンパク質中にＴ細胞エピトープを含んでなるペプチドを含んでなるように、修飾されてもよい。典型的には、ペプチドは、介在するペプチドリンカーによってＭＨＣ分子に融合され、ペプチドがＭＨＣ分子の結合溝によって結合されることを可能にする。
本発明の文脈において、「ベクター」という用語は、関心のあるタンパク質をコード化するポリヌクレオチド、またはポリペプチドと関心のあるタンパク質をコード化するポリヌクレオチドとを含んでなる混合物を指し、この混合物は、細胞内に導入されることができ、またはそれが含んでなるタンパク質および／または核酸を細胞内に導入できる。ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、または人工染色体が挙げられるが、これらに限定されるものではないい。ベクターを使用して、例えば、外来性または異種ＤＮＡなどの関心のある遺伝子産物が宿主細胞に導入される。ベクターは、宿主細胞におけるベクターの自律複製を容易にする「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含有してもよい。外来性ＤＮＡは異種ＤＮＡとして定義され、これはベクター分子を複製し、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーをコード化し、または導入遺伝子をコード化する、宿主細胞内で天然に見られないＤＮＡである。宿主細胞に入ると、ベクターは宿主染色体ＤＮＡとは独立してまたは同時に自己複製し得て、ベクターおよびその挿入ＤＮＡの複数のコピーが生成され得る。さらに、ベクターは、挿入されたＤＮＡのｍＲＮＡ分子への転写を可能にするのに、さもなければ挿入されたＤＮＡをＲＮＡの複数のコピーに複製させるのに、必要な要素もまた含み得る。ベクターは、関心のある遺伝子の発現を調節する「発現制御配列」をさらに包含してもよい。典型的には、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、またはリプレッサーなどのポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。関心のある１つまたは複数の遺伝子産物をコード化する２つ以上のポリヌクレオチドを含んでなるベクターにおいて、発現は、１つまたは複数の発現制御配列によって一緒にまたは別々に制御されてもよい。より具体的には、ベクターに含まれる各ポリヌクレオチドは、別個の発現制御配列によって制御されてもよく、またはベクターに含まれる全てのポリヌクレオチドは、単一の発現制御配列によって制御されてもよい。単一の発現制御配列によって制御される単一のベクターに含まれるポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームを形成してもよい。一部の発現ベクターは、挿入されたＤＮＡに隣接する配列要素をさらに含有し、それは発現されたｍＲＮＡの半減期を延長し、および／またはｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳ができるようにする。したがって、挿入されたＤＮＡによってコード化されるｍＲＮＡおよびポリペプチドの多数の分子が、迅速に合成され得る。このようなベクターは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの調節エレメントを含んでなり、対象への投与時に前記ポリペプチドの発現を引き起こしまたは指示してもよい。動物細胞のための発現ベクターで使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ Ｙ ｅｔ ａｌ．１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖などのプロモーター（Ｍａｓｏｎ ＪＯ ｅｔ ａｌ．１９８５）およびエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ ｅｔ ａｌ．１９８３）が挙げられる。ヒト抗体Ｃ領域をコード化する遺伝子を挿入して発現させることができる限り、動物細胞のための任意の発現ベクターが使用され得る。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ Ｇ ｅｔ ａｌ．１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．１９８１）、ｐＳＧ１ β ｄ２－４－（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．１９９０）などが挙げられる。プラスミドのその他の例としては、複製起点を含んでなる自己複製プラスミド、または例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの統合プラスミドが挙げられるる。
要約すると、本発明は以下の項目に関する。
項目１．ａ）適切に安定化されたＭＨＣ分子を提供するステップと、ｂ）前記適切に安定化されたＭＨＣ分子をその多数のペプチドリガンドに接触させて、ペプチドリガンド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）分子複合体を形成するステップと、ｃ）前記ｐＭＨＣ分子複合体をＴＣＲ結合についてスクリーニングするステップとを含んでなり、前記ＭＨＣ分子が、ＭＨＣ Ｉの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのアミノ酸とα２ドメインのアミノ酸との間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋、およびＭＨＣ ＩＩの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのアミノ酸とβ１ドメインのアミノ酸との間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋を含んでなる、ＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体をスクリーニングする方法。
項目２．前記ＭＨＣ分子が、ＨＬＡ、二量体、三量体、および四量体からなる群から選択される、ＨＬＡ、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ多量体である、項目１に記載の方法。
項目３．アミノ酸間の前記人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋が、組換え的に導入されたジスルフィド橋、架橋されるべき非天然アミノ酸の導入、光架橋アミノ酸の導入、および化学的に導入された架橋から選択される、項目１または２に記載の方法。
項目４．アミノ酸間の前記少なくとも１つの人為的に導入された共有結合架橋が、例えば、ＭＨＣ Ｉの８４位のチロシンおよび１３９位のアラニンをシステインに変異させることによって、αらせん間に導入される、項目１～３のいずれか１つに記載の方法。
項目５．前記多数のペプチドリガンドは、少なくとも約１，５００の異なるＭＨＣ結合ペプチド、好ましくは少なくとも約５，０００の異なるＭＨＣ結合ペプチド、より好ましくは少なくとも約１５，０００の異なるＭＨＣ結合ペプチド、最も好ましくは少なくとも約１５０，０００ＭＨＣ結合ペプチドを有する免疫ペプチドーム調製物を含んでなる、項目１～４のいずれか１つに記載の方法。
項目６．前記接触が、前記ＭＨＣ結合ペプチドを約４℃～約３０℃で、好ましくはほぼ室温で負荷するステップを含んでなる、項目１～５のいずれか１つに記載の方法。
項目７．前記負荷されたＨＬＡ／ペプチド分子が、約４℃で、約１日以上、好ましくは、約１週間以上安定である、項目１～６のいずれか１つに記載の方法。
項目８．ｐＭＨＣ複合体への結合についてのＴＣＲの親和性スクリーニングの感度レベルが、約Ｋｄ１．０×１０－９よりも高く、好ましくは約Ｋｄ１．０×１０－６Ｍよりも高く、より好ましくは約Ｋｄ１．０×１０－３Ｍよりも高い、項目１～７のいずれか１つに記載の方法。
項目９．前記ＴＣＲが、天然ＴＣＲ、可溶性ＴＣＲ分子、およびｂｓＴＣＲなどのＴＣＲ様分子から選択される、項目１～８のいずれか１つに記載の方法。
項目１０．ＴＣＲまたはＭＨＣ分子のどちらかが、チップ、バイオセンサー、スライドガラスまたはビーズなどの固体表面上に適切に固定化される、項目１～９のいずれか１つに記載の方法。
項目１１．前記ＴＣＲおよび／またはＭＨＣ分子が標識および／またはマーカーを含まない、項目１～１０のいずれか１つに記載の方法。
項目１２．前記方法が、高スループットスクリーニング形式で実施される、項目１～１１のいずれか１つに記載の方法。
項目１３．事前選択されたＴＣＲを含んでなる項目１～１２のいずれか１つに記載のを実施するステップと、ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列を決定および比較し、それによって、前記事前選択されたＴＣＲの特定のアミノ酸結合モチーフを同定する、追加的なステップとを含んでなる、ＴＣＲの特定のアミノ酸結合モチーフを検出または生成するための方法。
項目１４．前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体が、異なる濃度を有する並行アッセイ反応で使用される、項目１３に記載の方法。
項目１５．同定された前記事前選択されたＴＣＲのための修飾アミノ酸結合モチーフからなるペプチドのプールを含んでなる、前記方法ステップが繰り返される、項目１３または１４に記載の方法。
項目１６．項目１５に記載の方法を実施するステップと、ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列を判定および比較し、それによって前記ＴＣＲの交差反応性を同定する追加的なステップとを含んでなる、ＴＣＲの交差反応性を検出または判定するための方法。
項目１７．事前選択されたＴＣＲを含んでなる項目１～１２のいずれか１つに記載のを実施するステップと、ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列を判定および比較し、それによって前記ＴＣＲの交差反応性を同定する追加的なステップとを含んでなる、ＴＣＲの交差反応性を検出または判定するための方法。
項目１８．ＴＣＲと、前記ＴＣＲに結合するＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体とを含んでなるＴ細胞活性化を測定するステップをさらに含んでなる、項目１～１７のいずれか１つに記載の方法。
項目１９．刺激フレームワークを担持するペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体を用いて、細胞集団（例えば、特異的Ｔ細胞集団）を活性化および／または刺激および／または増殖させるための方法であって、前記フレームワークが、例えばビーズ、フィラメント、ナノ粒子などの担体、または前記複合体を担持できる任意の担体上に固定化されたペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体を危うくし、適切に安定化されたＭＨＣ複合体が担体上に固定化され、ペプチドリガンドの添加前にフレームワークがこのような状態で長期間保存され得て、ひいては、研究または臨床診療において抗原提示細胞を模倣するこのような刺激フレームワークの実用性が大幅に向上される、方法。
項目２０．ＭＨＣ Ｉの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのアミノ酸とα２ドメインのアミノ酸との間に人為的的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋、およびＭＨＣ ＩＩの場合、前記安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのアミノ酸とβ１ドメインのアミノ酸との間に人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋を含んでなる、適切に安定化されたＭＨＣ分子を含んでなり、前記安定化されたＭＨＣ分子が、ビーズ、フィラメント、ナノ粒子またはその他の適切な担体に結合している、医薬組成物。
項目２１．例えば、抗ＣＤ２８抗体または抗４１ＢＢ抗体などのより多くの共刺激分子および／またはこれらの共刺激分子の時系列配列の１つまたは組み合わせをさらに含んでなる、項目２０に記載の医薬組成物。
項目２２．前記安定化ＭＨＣ分子が、ペプチドリガンドの添加前に、例えば、室温または４℃または約－８０℃で、長期間保存され得る、項目２０または２１に記載の医薬組成物。
項目２３．項目１～１９のいずれか１つに記載の方法における、項目２０～２２のいずれか１つに記載の医薬組成物の使用。
ここで、本発明を添付の図面を参照して実施例でさらに説明するが、それでもなお、それに限定されることは望まない。本発明の目的で、引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。
ジスルフィド安定化されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の生成、および親和性測定のための使用の概要を示す。（ａ）重鎖およびβ２ｍの発現プラスミドが大腸菌に形質移入され、関心のあるタンパク質が封入小体中で発現される。ＨＬＡモノマーは、サイズ排除を用いて精製される。（ｂ）空のジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子には、室温でのインキュベーションによって、ペプチドリガンドが負荷され得る。親和性測定では、それらは、例えば、ビオチンストレプトアビジン相互作用によって、機能化されたバイオセンサー上に固定化され、ＴＣＲまたはＴＣＲ様分子の結合および解離を記録するために使用される。 １Ｇ４ ＴＣＲと様々なＭＨＣモノマーとの結合および解離挙動を示す。生データは図２（ａ）および図２（ｂ）に示され、曲線適合は図２（ｃ）および図２（ｄ）に示される。全ての測定は、２４μＭから開始する１：２分析物希釈系列として実施された。（ａ）固定化されたＥＳＯ ９Ｖ Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣに対する、１Ｇ４ ＴＣＲの結合曲線。（ｂ）固定化されたＥＳＯ ９Ｖ ＷＴ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣに対する、１Ｇ４ ＴＣＲの結合曲線。（ｃ）固定化された空のＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する、１Ｇ４ ＴＣＲの結合曲線。（ｄ）固定化されたＳＬ９ Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣに対する、１Ｇ４ ＴＣＲの結合曲線。 ＳＬ９特異的ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３ ｂｓＴＣＲと、様々なＭＨＣモノマーおよびペプチドリガンドとの親和性を示す。（ａ）固定化されたＳＬ９ Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣに対する、ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３の結合曲線。生データは図３（ａ）および図３（ｂ）に示され、曲線適合は図３（ｃ）および図３（ｄ）に示される。５００ｎＭから開始する１：２分析物希釈系列を使用して測定された。（ｂ）固定化されたＳＬ９ ＷＴ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣに対する、ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３の結合曲線。生データは黒で示され、曲線適合は赤で示される。５００ｎＭから開始する１：２分析物希釈系列を使用して測定された。（ｃ）固定化された空のＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する、ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３の結合曲線。５００ｎＭから開始する１：２分析物希釈系列を使用して測定された。（ｄ）ＵＶ交換を使用して生成されたＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ｐＭＨＣまたはＷＴ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体を使用して測定された、親和性間の相関。Ｋｄｓは、双方の方法を使用して生成された１４０の異なるペプチドリガンドについてプロットされ、良好な曲線適合で連続した実験中に測定された。Ｋｄｓは、５００ｎＭおよび１５８ｎＭの分析物濃度を用いて適合された。Ｒ２は計算された相関係数であり、破線は最適な比率を表す。 可溶化分析物としてのＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１生成変異アミノ酸配列ライブラリと固定化されたｂｓＴＣＲとを使用して生成された、ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３の結合モチーフを示す。Ｋｄｓは、本発明者らの分析物濃度のうち、少なくとも１つからの曲線を用いて、含まれるべき曲線に対して０．０５ｎｍのピークシグナルを有する曲線を用いて適合させた。適合可能な曲線のない位置には、５×１０－６ＭのＫｄ＞が割り当てられた。５００ｎＭから開始する１／√１０分析物希釈系列を使用して測定された。（ａ）導入されたアミノ酸およびペプチド配列内の交換された位置に応じた、親和性のヒートマップ。白い四角は、野生型ペプチドアミノ酸を示ます。（ｂ）ｓｅｑ２ｌｏｇｏグラフとしての結合モチーフの視覚化。個々の文字のサイズは、この位置で測定された各アミノ酸の親和性を反比例して表し、逆Ｋｄ値を１０８で除した値およびＰＳＳＭ－Ｌｏｇｏアルゴリズムを用いて計算される。（ｃ）ＡＬＹＮＶＬＡＫＶ（配列番号１）が負荷されたＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣに対する、ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３ ｂｓＴＣＲの結合曲線。５００ｎＭから開始する１／√１０分析物希釈系列を使用して測定された。 ペプチドが負荷された標的細胞、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞、および６つの異なる濃度のｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３の同時インキュベーションアッセイの結果を示す。（ａ）ＳＬ９野生型ペプチドが負荷されたＴ２標的細胞の存在下で、異なる濃度のｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３で刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞のバックグラウンドを超える測定された倍数誘導。（ｂ）位置スキャンライブラリからのペプチドリガンドに対する測定された親和性と、バックグラウンドの３倍のルミネセンス増加を誘導するために必要な最低のｂｓＴＣＲ濃度との相関。ペプチドは、野生型配列における交換の位置に応じて、９つの異なるグループにグループ化される。（ｃ）位置スキャニングライブラリからのペプチドリガンドに対する測定された親和性と、それらのＮｅｔＭＨＣ予測ｐＭＨＣ結合ランクとの相関。ペプチドは、バックグラウンドの３倍のルミネセンス増加を誘導するために必要な最低ｂｓＴＣＲ濃度に応じて、６つの異なるグループにグループ化される。（ｄ）交差反応性ペプチドリガンド候補について測定された親和性と、バックグラウンドの３倍のルミネセンス増加を誘導するために必要な最低のｂｓＴＣＲ濃度との相関。（ｅ）ＡＬＹＮＶＬＡＫＶ（配列番号１）ペプチドが負荷されたＴ２標的細胞の存在下で、異なる濃度のｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３で刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞のバックグラウンドを超える測定された倍数誘導。誤差棒は生物学的三連に相当する。 固定化されたｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３を使用した親和性測定のための可溶性分析物としての、Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１またはＵＶ交換で生成されたＷＴ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体の比較を示す。Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体は左、ＷＴ－Ａ＊０２：０１複合体は右にある。全ての測定は、５００ｎＭから開始する１：２分析物希釈系列を使用して実施された。 １Ｇ４と複合体形成した、ＥＳＯ９ＶＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１およびＥＳＯ ９Ｖ ＷＴ－Ａ＊０２：０１の結晶構造を示す。（ａ）ペプチドおよびアミノ酸側鎖配向に焦点を当てた、ＷＴおよびＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１構造のオーバーレイ。（ｂ）Ｆポケット、およびα１とα２の間に導入されたジスルフィド結合のクローズアップ。（ｃ）ペプチドおよびＭＨＣ主鎖と相互作用する、１Ｇ４ ＣＤＲループのオーバーレイ。（ｄ）側面から見た双方の結晶構造のオーバーレイ。誤差棒は生物学的三連に相当する。 可溶性分析物としてのＹ８４Ｃ／Ａ１３９ＣＨＬＡ－Ａ＊０２：０１生成位置スキャニングライブラリと固定化されたｂｓＴＣＲとを使用して生成された、ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３との結合モチーフを示す。測定は、４つの可溶性分析物濃度を使用して実施された。適合可能な曲線のない位置には、５×１０－６ＭのＫｄ＞が割り当てられた。５００ｎＭから開始する１／分析物希釈系列によって生成された、可溶性分析物濃度範囲。導入されたアミノ酸およびペプチド配列内の交換された位置に応じた、親和性のヒートマップ。 ｂｓＴＣＲｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３コンストラクトの図を示す。８６８Ｚ１１ドメインはＳＬＹＮＴＶＡＴＬ反応性ＴＣＲ８６８をベースにしており、Ｖａｒｅｌａ－Ｒｏｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（８）によって同定された、ＣＤＲ２β（ＹＹＥＥＥＥ～ＹＶＲＧＥＥ）およびＣＤＲ３α領域（ＣＡＶＲＴＮＳＧＹＡＬＮ～ＣＡＶＲＧＡＨＤＹＡＬＮ）における親和性増強変異が組み込まれている。親和性増強ＴＣＲのＶβおよびＶαドメインは、一本鎖リンカー（ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ）を介して連結され、Ｖα２領域（Ｆ４９Ｓ）の表面安定性付与変異でさらに修飾されて、Ａｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２２）による可溶性発現が可能になる。ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３分子を作製するために、この８６８Ｚ１１ ｓｃＴｖドメインは、２つのシステインノックアウト（Ｃ２２６ＳおよびＣ２２９Ｓ）を有するＩｇＧ２由来のＣＨ２ヒンジドメイン（ＡＰＰＶＡＧ）を介して、ヒト化抗ＣＤ３抗体のＦ（ａｂ’）重鎖部分に融合され、発現時にＦ（ａｂ’） ２ホモ二量体が形成されるのを防ぐために組み込まれた。 ＳＬＹＮＴＶＡＴＬベースの位置スキャニングライブラリリから選択された２８の異なるペプチドのＵＶ交換効率、およびＯｃｔｅｔ測定結果の分析を示す。（ａ）左軸：抗β２ｍ ＥＬＩＳＡを用いて判定された、ＵＶ感光性ｐＭＨＣモノマー２５０００ｎｇ／ｍｌを用いたＵＶ交換後のｐＭＨＣ濃度。点線は、ペプチドを含まないＵＶ交換に基づくＥＬＩＳＡ／ＵＶ交換バックグラウンドシグナルを表す。誤差棒は技術的三連に相当する。右軸：ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４システム上で固定化されたｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３に対する可溶性ｐＭＨＣ分析物の結合応答の比率。ｐＭＨＣは、ＵＶ交換を使用して、またはＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ペプチド負荷によって調製された。同様に負荷された抗Ｆ（ａｂ）バイオセンサーとの６０秒間の結合後のＵＶ－Ａ＊０２：０１応答をＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１応答で除して、計算された比率。（ｂ）ＮｅｔＭＨＣランク１５以上の４つのペプチドの詳細な曲線適合。Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体は左、ＷＴ－Ａ＊０２：０１複合体は右にある。全ての測定は、５００ｎＭから開始する１：２分析物希釈系列を使用して実施された。 複数の異なる可溶性ＴＣＲおよびｂｓＴＣＲｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３の、非負荷Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９ＣＨＬＡ－Ａ＊ ０２：０１または無関係のペプチドが負荷されたＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合を示す。（ａ）３つの異なるＨＬＡ－Ａ＊０２：０１拘束性可溶性ＴＣＲおよびｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３の、機能的に空のＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１への結合。Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１はストレプトアビジンセンサー上に固定化され、各ＴＣＲは１ｍｇ／ｍｌ（可溶性ＴＣＲは２０μＭ、ｂｓＴＣＲは１３．３μＭ）で提供された。（ｂ）同一ＴＣＲの、無関係のペプチドが負荷されたＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１への結合。 交換直後および４℃で２週間保管した後の、固定化されたｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３を使用したＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ ｐＭＨＣのｏｃｔｅｔ親和性測定を示す。どちらの測定も、２７７．８ｎＭから開始する１：２分析物希釈系列を使用して実施された。 様々なＨＬＡ対立遺伝子と１つのマウス対立遺伝子の多重配列アラインメントを示す。配列アラインメントでは、安定化アミノ酸置換を導入するための領域が強調表示されている。このアラインメントは、当業者に、所与の各ＨＬＡ対立遺伝子において、ＭＨＣ分子を安定化するために置換されるアミノ酸を決定するための基礎を提供する。 同上 異なるジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を用いて生成されたＳＬ９ｐ ＭＨＣに対する、ＳＬ９特異的ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３ｂｓＴＣＲの親和性を示す。結合曲線は、固定化されたＳＬ９ ｐＭＨＣに対するｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３の結合と解離を示す。５００ｎＭから開始する１：２分析物希釈系列を使用して測定された。固定化されたＳＬ９ＷＴ－ＨＬＡ＊０２：０１ ｐＭＨＣに対する、ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３ ｂｓＴＣＲの結合曲線（左上図）。固定化されたＳＬ９Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ＊０２：０１ ｐＭＨＣに対する、ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３ ｂｓＴＣＲの結合曲線（右上の図）。固定化されたＳＬ９Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ ＨＬＡ＊０２：０１に対する、ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３ ｂｓＴＣＲの結合曲線（左下図）。固定化されたＳＬ９ Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ Ｗ５１Ｃ／Ｇ１７５Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣに対する、ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３ ｂｓＴＣＲの結合曲線（右下図）。 異なるｐＭＨＣ複合体に対する、高親和性ＴＣＲのＫｄ値を示す。いずれの場合も、ＷＴ－Ａ＊０２：０１分子のＫｄがＸ軸上に示され、２つの異なるジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣ分子のＫｄがｙ軸上に示され、各ドットはＭＨＣ分子上に負荷された異なるペプチドの１つを表す。配列番号１～５および１６～３２５は、以下の実施例で使用されたペプチド配列を示す。
１．ペプチド合成
全てのペプチドは、標準的なＦｍｏｃ化学を使用して、Ｓｙｒｏ ＩＩペプチド合成装置を用いて施設内で生成した。引き続いて、ＨＰＬＣを使用してペプチドを分析し、平均純度は７４％であった。ＵＶ感光性ペプチドは、２－ニトロフェニルアミノ酸残基を有する感光性構成要素を含有した。ジペプチドＧＭは、Ｂａｃｈｅｍから調達した。使用前に、ペプチドをＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４１６４０）、０．５％ＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ６５０８）で、所望の使用例に応じて２ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で溶解した。
２．再折りたたみおよび精製によるＭＨＣ複合体の生成
組換えＨＬＡ－Ａ＊０２：０１野生型（ＷＴ－Ａ＊０２：０１、配列番号３２２）、またはＣ末端ＢｉｒＡシグナル配列とヒトβ２ｍ軽鎖とを有するジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１重鎖を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中の封入小体として生成し、既述のように精製した（２）。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体の再折りたたみ反応は、わずかな修正を加えて既述のように実施した（Ｓａｉｎｉ ｅｔ ａｌ ２０１３）。手短に述べると、ＷＴ－Ａ＊０２：０１またはジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１重鎖、β２ｍ軽鎖、およびペプチドを再折りたたみ緩衝液（１００ｍＭトリス・Ｃｌ、ｐＨ８、０．５Ｍのアルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、５ｍＭの還元グルタチオン）で希釈し、濃縮前に、撹拌しながら４℃で２～８日間インキュベートした。濃縮されたタンパク質は、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８／１５０ｍＭのＮａＣｌ中でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。ピーク画分を２０００μｇ／ｍｌに直接濃縮し、分注して－８０℃で凍結し、または製造業者の取扱い説明書に従って４℃で一晩ＢｉｒＡビオチン－タンパク質リガーゼ（Ａｖｉｄｉｔｙ）によってビオチン化し、２０００μｇ／ｍｌに最終濃縮する前に第２のゲル濾過に供し、分注して－８０℃で保存した。
ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１野生型ペプチド－ＭＨＣ複合体を生成するために、９ｍｅｒ（全長）ペプチドまたはＵＶ感光性９ｍｅｒペプチド（全長）を、３０μＭの濃度で再折りたたみ緩衝液に入れた。空のＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１（配列番号３２３）複合体を生成するために、ジペプチドＧＭを１０ｍＭの濃度で再折りたたみ緩衝液に入れた。Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１（配列番号３２４）複合体体を生成するために、再折りたたみ緩衝液にペプチドは添加しなかった。Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１ＣＷ５１Ｃ／Ｇ１７５Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１（配列番号３２５）複合体体を生成するために、再折りたたみ緩衝液にペプチドは添加しなかった。
以下の表1は、異なるジスルフィド修飾HLA-A*02:01分子およびWT-A*02:01分子の再折りたたみ方法を示す。














表１：＋：タンパク質は再折りたたみ可能；－タンパク質は再折りたたみ不可能。
３．ＵＶ媒介ペプチドリガンド交換または空のジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を使用したペプチド交換ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体の生成
ＵＶ光切断可能ペプチドとのペプチド交換反応は、既述のように実施された。要約すると、所望の九量体ペプチドをビオチン化されたＵＶ感光性ｐＭＨＣ複合体と１００対１のモル比で混合し、３６６ｎｍのＵＶ光（Ｃａｍａｇ）に少なくとも３０分間曝した。
空のジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣ複合体とのペプチド負荷反応は、所望のペプチドをモノマー溶液に少なくとも１００対１のモル比で添加して混合し、室温で５分間インキュベートして実施した。
４．可溶性ＴＣＲ生成
可溶性ＴＣＲは、既述のように生成した（２０）。要約すると、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖コンストラクトを大腸菌中の封入小体として別々に発現させ精製した。ＴＣＲα鎖はスレオニンをシステインに置き換えることによって４８位で変異させ、ＴＣＲβ鎖はセリンをシステインに置き換えることによって５７位で変異させ、鎖間ジスルフィド結合を形成させる。
５．ｂｓＴＣＲの設計と生成
ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３分子は、ｓｃＴｖ ８６８Ｚ１１をヒト化抗ＣＤ３抗体のＦ（ａｂ’）ドメインのＣ末端に結合することによって生成した（２２、２３）。この目的を達成するために、ｓｃＴｖのＶβドメインをヒトＩｇＧ２（ＡＰＰＶＡＧ、配列番号２）に由来する上部ＣＨ２領域に直接融合させた。ヒンジ内のシステインノックアウトＣ２２６ＳおよびＣ２２９Ｓは、Ｆ（ａｂ） ２分子の形成を防ぐ。記のコンストラクトまたはヒト化抗ＣＤ３抗体の軽鎖のどちらかをコード化するＨＣＭＶ駆動発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ）に一過性に同時形質移入した。１２日後、上清をタンデムクロマトグラフィー（プロテインＬとそれに続く分取サイズ排除、ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理し、高純度のモノマーｂｓＴＣＲをＰＢＳ中で調合した。
６．ＯｃｔｅｔＲＥＤベースのバイオレイヤー干渉法の動態親和性測定
異なるｐＭＨＣ複合体に対するｓＴＣＲまたはｂｓＴＣＲ分子の親和性は、動態または定常状態の結合分析を使用して、ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４システム（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）上で測定した。全ての分析物またはリガンドは、特に指定されていない場合は、動態緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ツィーン２０）でそれらの最終濃度に希釈した。全てのバイオセンサーは、使用前に動態緩衝液で少なくとも１０分間水和させた。負荷および測定は、３ｍｍのセンサーオフセットで、少なくとも４０μｌの３８４傾斜ウェルプレート（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）内で実施した。プレート温度は２５℃、振盪機速度は１０００ｒｐｍに設定した。ステップ間の補正ベースラインを可能にするために、結合期の前と次の解離期を同じウェル内で実施した。必要に応じて、動態緩衝液を適切な濃度でＤＭＳＯが添加された解離緩衝液として使用し、分析物の組成を一致させた。
ｐＭＨＣ固定化浸漬および読み取りの場合は、ストレプトアビジン（ＳＡ；Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏカタログ番号１８－５０２１）バイオセンサーを使用して、ビオチン化されたｐＭＨＣモノマーを２５μｇ／ｍｌの推定濃度で６０秒間固定化し、６０秒間のベースラインと、特に指定されていない場合には、それぞれ６０秒間の結合期および解離期がそれに続いた。
ｂｓＴＣＲ固定化浸漬および読み取りの場合は、抗ヒトＦａｂ－ＣＨ１第２世代（ＦＡＢ２Ｇ；Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏカタログ番号１８－５１２７）バイオセンサーを使用して、ｂｓＴＣＲ分子を１００μｇ／ｍｌの濃度で６０秒間固定化し、１５秒間のベースラインと、特に指定されていない場合には、それぞれ６０秒間の結合期および解離期がそれに続いた。ＦＡＢ２Ｇバイオセンサーは、負荷されたバイオセンサーを１０ｍＭグリシンｐＨ１．５および動力学緩衝液中でそれぞれ５秒間連続して３回インキュベートすることによって、最大４回再生させた。ＦＡＢ２Ｇもまた、最初のリガンド固定化の前にそのように事前調節した。
全てのセンサーグラムは、ＯｃｔｅｔＲＥＤソフトウエア「Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ」バージョン１０．０．３．７（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を使用して分析した。データをベースラインステップの終了点に整列させることによって、生のセンサーデータをＹ軸で整列させ、ステップ間補正を使用して、解離の開始を結合期の終了に整列させた。Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングは、適用しなかった。次に、得られたセンサーグラムを１：１のラングミュア動態結合モデルを使用して適合させた。
７．細胞株
ＴＡＰ欠損ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１発現細胞株Ｔ２をＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１９９２）から調達し、１０％熱不活化ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０２７０１０６）および抗生物質ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｂｉｏｚｙｍ、カタログ番号８８２０８２、各１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ培地１６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号６１８７００１０）中で、必要に応じて継代数１６まで培養した。ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦＡＴ－ｌｕｃ２ Ｊｕｒｋａｔ細胞株をＰｒｏｍｅｇａ（カタログ番号ＣＳ１７６４）から継代数６で調達し、１０％熱不活化ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０２７０１０６）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｃ．Ｃ．Ｐｒｏ、カタログ番号Ｚ－２０Ｍ）および抗生物質ハイグロマイシンＢ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１０２７０１０６）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｃ．Ｃ．Ｐｒｏ、カタログ番号Ｚ－２０Ｍ）および抗生物質ハイグロマイシンＢ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号４０００５２、２００μｇ／ｍｌ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｂｉｏｚｙｍ、カタログ番号８８２０８２、各１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ培地１６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号６１８７００１０）中で培養し、必要に応じて継代数１４まで培養した。
８．Ｔ細胞活性化アッセイ
ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦＡＴ－ｌｕｃ２ Ｊｕｒｋａｔ細胞およびペプチドを負荷したＴ２標的細胞を使用したＴ細胞活性化アッセイは、製造業者の取扱い説明書に従って実施した。要約すると、連続細胞培養からＴ２細胞を採取し、Ｔ２培地中で洗浄して３．３×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、カタログ番号３７９９）に移した。ＤＭＳＯ、０．５％ＴＦＡ中のペプチドを１００ｎＭの最終濃度で添加し、懸濁液を３７℃、５％ＣＯ２で２～３時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳ中で調合したｂｓＴＣＲをＴ２培養培地中で所望の濃度に希釈し、それぞれの希釈液の２５μｌを白色９６ウェル平底プレート（Ｂｒａｎｄ、カタログ番号７８１９６５）に分配した。ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦＡＴ－ｌｕｃ２ Ｊｕｒｋａｔ細胞を連続細胞培養から採取して洗浄し、３．０×１０６細胞ｍｌ－１の濃度でＴ２培地に再懸濁し、細胞懸濁液の２５μｌをｂｓＴＣＲ希釈液と共に白色９６ウェル平底プレートに分配した。
ペプチド負荷後、Ｔ２細胞を再懸濁し、１：１の最終的なエフェクター対標的比で（各７５，０００の細胞）、２５μｌをｂｓＴＣＲ希釈液およびＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦＡＴ－ｌｕｃ２ Ｊｕｒｋａｔ細胞と共に、白色９６ウェル平底プレートに分配した。完全に組み立てられたプレートをプレート振盪機上で３００ｒｐｍで５分間混合し、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２０時間インキュベートした。インキュベーション時間後、７５μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬を各ウェルに添加し、プレートを暗所でプレート振盪機上で３００ｒｐｍで数分間インキュベートしてから、Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて０．５秒間の積分時間でルミネセンスを読み取った。相対光単位（ＲＬＵ）で測定されたルミネセンスは、測定されたＲＬＵを対照ウェルのＲＬＵで除して、各ウェルの倍数誘導に変換した。
９．結晶化およびイメージング
Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ複合体と１Ｇ４ＴＣＲを濃縮して１：１の比率で混合し、結晶化のために７ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。シッティングドロップ蒸気拡散実験は、０．１Ｍ酢酸アンモニウム、０．１Ｍビストリス（ｐＨ５．５）、および１７％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１０，０００を含有する母液の存在下で、結晶をもたらした。単結晶は、０．１Ｍ酢酸アンモニウム、０．１Ｍビストリス（ｐＨ５．５）、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ１０，０００、および１０％グリセロールを含有する凍結防止剤溶液に移した。結晶は、ＥＩＧＥＲ１６Ｍ検出器を収容するドイツ電子シンクロトロンで、ＥＭＢＬ Ｐ１４ビームライン上に載せて、１００Ｋで極低温冷却させた。Ｘ線データセットは、２．５Ａの分解能で収集した（表２）。
表2:データ収集および精緻化統計1G4/Y84C/A139C HLA-A*02:01/SLLMWITQV
データをＸＤＳで処理し、ＡＩＭＬＥＳＳ（３５、３６）でスケーリングした。分子置換は、最初に天然複合体のＴＣＲ部分の座標を有するＭＯＬＲＥＰを使用して行い、ｐＭＨＣ［ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）２ＢＮＲ］がそれに続き、構造はＲＥＦＭＡＣ５（３７、３８）で精緻化した。操作されたジスルフィド結合は、Ｃｏｏｔ（３９）を用いて手動で構築した。構造を精緻化し、Ｒ因子２２．９％（２７．３％のＲｆｒｅｅ）とした。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを用いて幾何配置を検証したところ、９３．９％の残基がラマチャンドランプロットの許容領域内にあることが示された［１つのグリシン残基（Ｇｌｙ１４３）が非許容領域内にある］（４０）。
１０．潜在的に交差反応性のペプチドリガンドのモチーフに基づく同定
検索モチーフによって許容される潜在的な組み合わせの１つに一致する九量体ペプチドリガンドの検索は、ＮＣＢＩヒトタンパク質データベースを使用して実施した。このデータベースは、全ての非冗長ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳物、ならびにＰＤＢ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、およびＰＲＦからの記録をカバーするが、全ゲノムショットガンプロジェクトからの環境サンプルは除外されている。データベースは、ＮＣＢＩサーバーから直接取得した。
１１．Ｓｅｑ２Ｌｏｇｏ生成
結合モチーフを可視化したＳｅｑ２Ｌｏｇｏｓは、それぞれの相互作用のＫｄ値の逆数を取り、１０８で除して作成した。これらの値は、位置特異的重み行列ファイル形式で組み立て、デンマーク工科大学バイオインフォマティクス部門のＳｅｑ２Ｌｏｇｏオンラインリソース（２７）のＰＳＳＭ－Ｌｏｇｏタイプを用いて処理した。
１２．蛍光異方性によって測定されたペプチド結合
ペプチド結合は、３００ｎＭの精製された再折りたたみＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を用いた蛍光異方性アッセイにおいて評価した。１００ｎＭの蛍光標識された高親和性ペプチドＮＬＶＰＫＦＩＴＣＶＡＴＶ（Ｇｅｎｅｃａｓｔ）を折りたたまれたＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に添加し、動態測定は、異方性（ＦＩＴＣλｅｘ＝４９４ｎｍ、λｅｍ＝５１７ｎｍ）を測定する、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ、独国クライルスハイム）マルチモードプレートリーダーを用いて実施した。Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１は、再折りたたみ後に直接使用するか、または測定前に示された時間にわたり保存緩衝液（１０％グリセロール、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＬ、ｐＨ８．０）中で－８０℃で保存した。動態測定は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５で室温（２２～２４℃）で実施した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を使用してプロットした。
１３．抗β－２ミクログロブリンＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｓ８８８）をＰＢＳ中の最終濃度２μｇ／ｍｌでＮｕｎｃ ＭＡＸＩｓｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号４３９４５４）に添加し、密閉プレートを湿った環境下で室温で一晩インキュベートした。翌日、ＥＬｘ４０５プレート洗浄機（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して、プレートを洗浄緩衝液洗浄（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン－２０）で４回洗浄した。３００μｌのブロック緩衝液（２％ＢＳＡ添加ＰＢＳ）を各ウェルに添加し、密封プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ブロック緩衝液は、それぞれのＵＶ交換ｐＭＨＣ調製物のブロック緩衝液中の１：１００希釈の１００μｌを添加する前に廃棄した。従来の再折りたたみｐＭＨＣモノマーに基づく５００ｎｇ／ｍｌ～１５．６ｎｇ／ｍｌの標準系列が、各プレートに含まれていた。エッジ効果を低減するために、縁部ウェルを３００μｌのブロック緩衝液で充填し、密封プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを再度４回洗浄した後、１００μｌの抗β２ミクログロブリンＨＲＰ結合二次抗体（Ａｃｒｉｓ、カタログ番号Ｒ１０６５ＨＲＰ）を最終濃度１μｇ／ｍｌで各ウェルに添加した。密封プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で再度４回洗浄した後、１００μｌの室温ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０４４０）を各ウェルに添加した。プレートを室温で５分間インキュベートした後、各ウェルに５０μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して、停止させた。Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで５秒間にわたり吸光度を読み取ることにより、プレートを即座に分析した。ｐＭＨＣ濃度は、Ｓｙｎｅｒｇｙ２ソフトウエアを用いた標準曲線適合（Ｌｏｇ（Ｙ）＝Ａ＊Ｌｏｇ（Ｘ）＋Ｂ）に基づいて算出した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を使用してプロットした。
１４．フローサイトメトリーＴ２ペプチド結合アッセイ
ＴＡＰ欠損ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１発現細胞株Ｔ２をＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１９９２）から調達し、１０％熱不活化ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０２７０１０６）および抗生物質ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｂｉｏｚｙｍ、カタログ番号８８２０８２、各１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ培地１６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号６１８７００１０）中で、必要に応じて継代数１６まで培養した。連続細胞培養からＴ２細胞を採取し、Ｔ２培地中で洗浄して３．３×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、カタログ番号３７９９）に移した。ＤＭＳＯ、０．５％ＴＦＡ中のペプチドを１０μＭの最終濃度で添加し、懸濁液を３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。プレートをＰＦＥＡ（ＰＢＳ、２％ＦＣＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）で２回洗浄した後、ＰＦＥＡで１：２５０に希釈したウェルあたり５０μｌのＰＥ標識抗ヒトＨＬＡ－Ａ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４３３０５）を最終濃度０．８μｇ／ｍｌに添加した。プレートを４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＦＥＡで２回洗浄した。最後に、細胞を固定化溶液（ＰＦＥＡ、１％ホルムアルデヒド）に再懸濁して４℃で保存した後、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を用いて分析した。Ｔ２細胞をＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－Ａシグナルに基づいてゲートし、ＦＳＣ－Ｈ／ＦＳＣ－Ａダブレット排除を使用してダブレットを除去した。ＰＥチャネルの正ゲート座標は、未染色対照に基づいていた。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を使用してプロットした。
１５．配列アライメント
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａの多重配列アラインメントを使用して、多配列アラインメントを実施した。（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）（Ｍａｄｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．”Ｔｈｅ ＥＭＢＬ－ＥＢＩ ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ ＡＰＩｓ ｉｎ ２０１９”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４７：Ｗ６３６－Ｗ６４１，２０１９，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｚ２６８）。
１６．統計解析
全てのデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアバージョン７を使用してプロットした。ｘデータセットとｙデータセット間の相関は、ピアソン相関係数を算出することによって計算され、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン７を使用してＲ２として報告した。バイオレイヤー干渉結合動態測定の曲線適合のためのＲ２およびＸ２値は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システムソフトウエアＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ ＨＴバージョン１０．０．３．７を使用して計算した。
１７．ジスルフィド安定化された空のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子の設計と生成
空のＭＨＣクラスＩ分子とペプチド負荷ＭＨＣクラスＩ分子の分子動力学シミュレーションは、前者がペプチドリガンドのＣ末端を収容するＦポケット内での可動性が増加していることを示している（１６）。マウスＭＨＣクラスＩ分子Ｈ－２Ｋｂに関する先行研究では、８４位のチロシンと１３９位のアラニンをシステインに変異させることで、Ｆポケット内の対向する残基間にジスルフィド結合を導入することで、複合体を安定化できた。この変異体は、全長ペプチドなしで再折りたたみができ、遡及的なペプチド結合が可能であった（１７、１８）。
本発明者らは、同一概念が、ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に適用され得ると仮説を立てた。８４位のチロシンと１３９位のアラニンのシステインへの変異をもたらす修飾をＨＬＡ－Ａ＊０２：０１重鎖発現プラスミドに導入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の封入小体として生成した後、重鎖を同様に生成されたβ２ｍと共にインキュベートしたが、再折りたたみ緩衝液にペプチドは含まれなかった。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後、９ｍｅｒペプチドで再折りたたみされた野生型対照と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１関連モノマー画分は観察されなかった。
第２のアプローチでは、ジペプチドＧＭを再折りたたみに添加した；このジペプチドは、ＭＨＣクラスＩ複合体に対する親和性が非常に低く、再折りたたみを支援する（１９）。それはＳＥＣ中に、泳動用緩衝液に対する緩衝液交換によって、結合ポケットから迅速に解離し、精製された空のジスルフィド安定化Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１が生成する。空の野生型Ａ＊０２：０１複合体（ＷＴ－Ａ＊０２：０１）は、同一様式では生成できなかった。ＷＴ－Ａ＊０２：０１複合体は、ジペプチドと共に生成し得るが、緩衝液交換によってジペプチドを除去する試みに際して変性する。
本発明者らはまた、２２位のフェニルアラニンおよび７１位のセリンのシステインへの変異をもたらす改変をＨＬＡ－Ａ＊０２：０１重鎖発現プラスミドに導入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の封入小体として生成した後、重鎖を同様に生成されたβ２ｍと共にインキュベートしたが、再折りたたみ緩衝液にペプチドは含まれなかった。ＳＥＣは、精製された空のジスルフィド安定化Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１ＣＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体をもたらした。本発明者らはまた、２２位のフェニルアラニンおよび７１位のセリン、ならびに５１位のトリプトファンおよび１７５位のグリシンのシステインへの変異をもたらす改変をＨＬＡ－Ａ＊０２：０１重鎖発現プラスミドに導入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の封入小体として生成した後、重鎖を同様に生成されたβ２ｍと共にインキュベートしたが、再折りたたみ緩衝液にペプチドは含まれなかった。ＳＥＣは、精製された空のジスルフィド安定化Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ Ｗ５１Ｃ／Ｇ１７５Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体をもたらした。
精製モノマー中にジペプチドＧＭが存在しないことは、緩衝液交換による熱安定性分析によって示し得て；空のＹ８４Ｃ／Ａ１３９ＣＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子は、未だにジペプチドＧＭと複合体化している同じ分子よりも温度安定性が低かった（すなわち、融解温度が低かった）。
得られた分子を４℃で一晩ビオチン化し、２回目のＳＥＣ実行によって過剰なビオチンから分離し、または使用前に－８０℃で直接保存した。
１８．可溶性ＴＣＲおよび野生型またはジスルフィド修飾ＭＨＣを使用したペプチド負荷および親和性測定
次に、本発明者らは、ジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子が、ペプチド－ＭＨＣ複合体形成およびＴＣＲリガンド結合できるかどうかを判定した。親和性測定は、可溶性分析物として再折りたたみＴＣＲ１Ｇ４を用いて、ＯｃｔｅｔＲＥＤ ３８４上でバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって実施した。このＴＣＲは、がん精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１またはその合成変異型ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（ＥＳＯ ９Ｖ、配列番号４）に由来するＨＬＡ－Ａ＊０２：０１特異的ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（ＥＳＯ ９Ｃ、配列番号３）を認識する（２０，２１）。ビオチン化されたＹ８４Ｃ／Ａ１３９ＣＨＬＡ－Ａ＊０２：０１は、その空の状態で直接固定化し、またはストレプトアビジン被覆されたバイオセンサー上でペプチドＥＳＯ ９Ｖと短時間インキュベートした後に固定化した（図１ｂ）。組立後に親和性測定を開始するのに必要な最短時間である５分間のペプチドインキュベーションと、より長い時間との間に差は検出されなかった。さらなる分析では、高濃度のペプチドを使用した場合、１～２分以内に完全な交換が実際に達成されたことが示された。動態を複数の１Ｇ４濃度にわたって測定し、野生型ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１がＥＳＯ ９Ｖで直接再折りたたみされたものを対照として使用した。
Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ９ＶまたはＷＴ－Ａ＊０２：０１ ＥＳＯ ９Ｖのどちらかへの１Ｇ４ ＴＣＲ結合は、曲線適合から得られるセンサーグラムおよびＫｄｓに関して非常に類似していた（図２ａおよび２ｂ）。１Ｇ４の高濃度では、空の固定化モノマーに対して弱い結合シグナルが検出された（しかし、解離は検出されなかった）（図２ｃ）。この結合は、ＳＬＹＮＴＶＡＴＬのような１Ｇ４によって認識されないペプチドをその後に添加することによって、防止し得る（図２ｄ、配列番号５）。空のＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１で得られた弱いシグナルは、生体内のＴＣＲが典型的には遭遇しない状態である、ＴＣＲと空の結合ポケットとの非特異的な相互作用によって説明できるかもしれない。様々な特異性を有するその他のＡ＊０２：０１拘束性可溶性ＴＣＲは同様に挙動し、無関係に負荷されたＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣには結合しないが、機能的に空の分子には相対的に低い応答ではあるが結合することが示された（図１１）。
１９．親和性成熟ＴＣＲに対するジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１とＷＴ－Ａ＊０２：０１親和性測定値間の相関
未修飾ＴＣＲに対するＷＴ－Ａ＊０２：０１と同等のリガンドとしてのＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子の有用性が確立されたことから、本発明者らは、この解析を変異した高親和性ＴＣＲおよびより多くのペプチドリガンドに向けて拡張したいと考えた。本発明者らは、ＨＩＶ ｐ１７ Ｇａｇ由来ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１拘束性ペプチドＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（ＳＬ９、配列番号５）を認識するＴＣＲの親和性成熟変異型である成熟一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ）８６８Ｚ１１を使用した（８、２２）。
本発明者らは、空のまたはＳＬ９ペプチド負荷ジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子をストレプトアビジンバイオセンサー上に固定化することによって、そしてヒト化抗ＣＤ３抗体との融合で発現した８６８Ｚ１１ ｓｃＴｖのｂｓＴＣＲ変異型である、可溶性ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３に対する測定によって、親和性測定を実施した（図９）（２３）。Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１またはＦ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ Ｗ５１Ｃ／Ｇ１７５Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１のいずれかを使用した、ＳＬ９ジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体に対する結合親和性は、２．３５ｎＭおよび３．２４ｎＭで、それぞれＵＶ光媒介ペプチドリガンド交換（２５）を実施することによって生成された、ＳＬ９ ＷＴ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣと同様であった（図３ａならびに図１４）。このｂｓＴＣＲの空のＭＨＣ分子（図３ｃ）、および１３．３μＭの高モル濃度の無関係に負荷されたＹ８４Ｃ／Ａ１３９ＣＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体では、結合は測定不能であった。
次に、本発明者らは、ＳＬ９ペプチド配列に基づく位置スキャニングライブラリに対するｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３結合親和性を分析した。このライブラリは、野生型ＳＬ９ペプチドの１つの位置にあるアミノ酸を、残りの１８のタンパク質構成アミノ酸と交換することによって作成され、九量体の全ての位置で実施すると、１６２の異なるペプチドが得られた（システインは二量体化する傾向があるので除外された）（２４）。本発明者らは、前述したのと同様にＹ８４Ｃ／Ａ１３９ＣＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子への添加によって、またはｐＭＨＣ複合体の生成に用いられる技術であるＵＶ光媒介ペプチドリガンド交換を実施することによって、ｐＭＨＣ複合体を生成した（２５）。それぞれのｐＭＨＣ複合体をストレプトアビジン上に固定化し、２つの異なるｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３濃度で動態を測定した。予測通り、交互のペプチドリガンドを使用して、選択された設定の感度の限界内で検出できないものから、未修飾ＳＬ９ペプチドとの相互作用に匹敵する、またはそれ以上に強力でさえある、広範な異なるＫｄｓがもたらされた。
直接比較のために、分析物濃度および少なくとも０．９のＲ２値を有する曲線適合の双方で評価可能なシグナルを有し、選択されたＫｄ感度範囲内のシグナルに相当する、全ての測定されたｐＭＨＣ複合体を選択した。得られた１４０のペプチドリガンドのＫｄ値は、互いにプロットしたときに、全親和性範囲にわたって非常に類似しており、高い相関係数値によって支持される所見であった（図３ｄ）。不一致は、ｐＭＨＣ対の９０％以上で２倍の範囲内であり、最大で６．８２倍の違いであった。変化が２倍を超えるグループ内では、Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を使用した測定で、解離定数がより大きくなる傾向が観察された。
位置スキャニングライブラリからの１４０の異なるペプチドリガンドについて報告されたＲｍａｘ値によって表される、各バイオセンサー上に固定化された機能性ｐＭＨＣの量は、野生型およびジスルフィド安定化ｐＭＨＣの双方で同等であった（相関係数Ｒ２＝０．９４５９）。
図１５は、異なるｐＭＨＣ複合体に対する、高親和性ＴＣＲのＫｄ値を示す。いずれの場合も、ＷＴ－Ａ＊０２：０１分子またはＹ８４Ｃ／Ａ１３９ＣＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子のＫｄがＸ軸に示され、２つの異なるジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＭＨＣ分子のＫｄがｙ軸に示され、各ドットはＭＨＣ分子に負荷された異なるペプチドの１つを表す。図１５の各四角には、次のペプチドが示されている：
Ａ：ＨＩＶ－００５ ＷＴ（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ、配列番号５）
Ｂ：ＨＩＶ－００５ ６Ｉ（ＳＬＹＮＴＩＡＴＬ、配列番号１１０）
Ｃ：ＨＩＶ－００５ ８Ｖ（ＳＬＹＮＴＶＡＶＬ、配列番号１４５）
Ｄ：ＨＩＶ－００５ ３Ｆ（ＳＬＦＮＴＶＡＴＬ、配列番号５９）
Ｅ：ＨＩＶ－００５ ３Ｆ６Ｉ８Ｖ（ＳＬＦＮＴＩＡＶＬ）、配列番号３１８）
Ｆ：ＨＩＶ－００５ ３Ｆ８Ｖ（ＳＬＦＮＴＶＡＶＬ、配列番号３１９）
Ｇ：ＨＩＶ－００５ ３Ｆ６Ｉ（ＳＬＦＮＴＩＡＴＬ、配列番号３２０）
Ｈ：ＨＩＶ－００５ ６Ｉ８Ｖ（ＳＬＹＮＴＩＡＶＬ、配列番号３２１）
左上のパネルでは、ＷＴ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体の上記の各ペプチドのＫｄが、ジスルフィド修飾Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体のＫｄに対してプロットされる。ジスルフィド修飾Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体は、調査された各ペプチドについてＷＴ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体とほぼ同一のＫＤ値を示す。左下のパネルでは、ＷＴ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体の上記の各ペプチドのＫｄが、ジスルフィド修飾Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ Ｗ５１Ｃ／Ｇ１７５Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体のＫＤに対してプロットされ、調査された各ペプチドについてもＷＴ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体とほぼ同じＫｄ値が示される。
右上のパネルでは、Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９ＣＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体の上記の各ペプチドのＫｄが、ジスルフィド修飾Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体のＫｄに対してプロットされる。右下のパネルでは、Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９ＣＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体の上記の各ペプチドのＫｄが、ジスルフィド修飾Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ Ｗ５１Ｃ／Ｇ１７５Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体のＫｄに対してプロットされる。Ｆ２２Ｃ／Ｓ７１ＣおよびＦ２２Ｃ／Ｓ７１Ｃ Ｗ５１Ｃ／Ｇ１７５Ｃ変異体のジスルフィド修飾ｐＭＨＣ複合体は、調査された各ペプチドについて、Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体と比較して、ほぼ同一のＫｄ値を有する。したがって、異なるペプチドが負荷されてｐＭＨＣ複合体を形成するジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子は、ＷＴＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体に対するそれぞれの親和性成熟ＴＣＲによって、同等に認識されると結論付け得る。したがって、ペプチド（ｐＭＨＣ複合体）が負荷されたジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子の機能は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子への安定化アミノ酸変異の導入による影響を受けない。
図１５に示された結果は、ペプチドリガンドが負荷されてジスルフィド修飾ｐＭＨＣ複合体を形成する本発明に従ったジスルフィド修飾ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子が、それぞれのＴＣＲに結合した際に、Ｔ細胞応答を惹起することを当業者にとって信ずるに足るものにする。
２０．結合モチーフ生成のための高スループット動態スクリーニング
ｐＭＨＣの迅速かつ柔軟な生成は、多くの異なるｐＭＨＣに対する大規模な結合親和性データセットの収集を容易にする。このようなデータセットの一例は、位置スキャンライブラリをスクリーニングしてｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合モチーフを生成することであり、これは、ｂｓＴＣＲ安全性スクリーニングアプローチの１つの構成要素の役割を果たし得る。このような測定を実施するためには、ｐＭＨＣは理想的には可溶性分析物として使用されるべきであり、これは複数の利点を提供するためである。第一に、例えば、ｂｓＴＣＲなどの既知の活性を有する同一リガンドを繰り返し固定化することにより、適合結果、特に報告されたＲｍａｘ値をより良く解釈することができる。第二に、二重特異性ＴＣＲコンストラクトを可逆的に固定化できる多種多様な再生可能なバイオセンサーが存在することから、固定化の代わりに可溶性分析物としてｐＭＨＣ複合体を使用することは、迅速で費用効果の高い高スループットスクリーニングにのために好ましい。これらのバイオセンサーは通常、抗体で被覆されており、読み取り品質を損なうことなく、動態測定に少なくとも２０回使用できる。第三に、ｂｓＴＣＲを固定化することは、ｂｓＴＣＲまたは抗体が複数のｐＭＨＣ結合部位を有する場合、一価親和性を測定するために利用可能な唯一の方向性であるが、これは、固定化されたｐＭＨＣでは、結合力しか測定できないためである。
ＵＶ媒介ペプチドリガンド交換は、多数の異なるｐＭＨＣ複合体を生成し得る一方で、交換効率は、ペプチドと、そのそれぞれのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子への結合に対する親和性次第で変動し、その結果、サンプル中に異なるｐＭＨＣ濃度が生じる（図１０）。正確な親和性を判定するためには濃度の正確な知識が所望されるので、可溶性分析物として使用されるｐＭＨＣを用いた親和性測定では、この不確実性が問題となる。ジスルフィド安定化されたＹ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１変異体はペプチドなしで安定であるので、この制限は当てはまらない。空のＭＨＣ複合体を飽和させるのに十分高い濃度でペプチドが添加されると、ｐＭＨＣの有効濃度が分かり、測定の精度が大幅に向上し、偽陰性が回避される。この挙動の例は、位置スキャニングライブラリにおいて検出され得て、その結果、Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ペプチド負荷（図５、６、１０）と比較して、ＵＶ交換調製物が使用されたときに、不良な適合データおよび親和性の計算違いが生じた（２６）（図５、６、１０）。このようなペプチドのｂｓＴＣＲ親和性を正確に測定することは、結合モチーフの生成のコンテキストで重要であり得るが、これは、これらの置換がその他の位置の置換と組み合わされると、関連するＭＨＣバインダーをもたらしてもよいためである。したがって、ｂｓＴＣＲによるアミノ酸の耐性は、包括的結合モチーフに正しく反映されなければならない。
ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３ ｂｓＴＣＲを固定化することによって、本発明者らは、２０分の１の値下げ価格で４時間の無人測定時間以内に、５００～１５．８ｎＭの範囲の各ペプチドリガンドの４つの異なる可溶性ｐＭＨＣ濃度で、位置スキャニングライブラリを分析できた。少なくとも０．０５ｎｍのシグナルレベルに達する全ての曲線が適合に含まれ、包括的ＴＣＲ結合モチーフが得られた（図４ａ、８、表３）。
表3:SV9ペプチト゛SLYNTVATL(配列番号5)および位置スキャニングライブラリからのペプチド(配列番号16～177)に対するbs-868Z11-CD3結合親和性。表は、Fortebio Data Analysis HT 10.0.3.７ソフトウェアを使用して、1:1ラングミュア結合モデルに従った曲線適合によって判定された、KD、kon、およびkoff値を含む。モデルに応じたそれぞれの誤差、ならびに精度が報告されている。「適合なし」として報告されたペプチドは、いずれの濃度においても、少なくとも0.05nmのピークシグナルに達する評価可能な曲線を有していなかった。








表4:位置スキャンライブラリを用いて測定された親和性に基づくbs-868Z11-CD3の交差反応性ペプチドリガンド検索モチーフ。各位置で調査された19のタンパク質構成アミノ酸のうち、bsTCRのそれぞれの親和性を50nMを超えて増加させたアミノ酸を除去して、検索モチーフに到達した。
可溶性Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ調製物は、品質を損なうことなく４℃で少なくとも２週間保存し得て、複数の分析に使用される（図１２；１日目：ＫＤ＝１．３５Ｅ－０９Ｍ、Ｒ２＝０．９９９２；１４日目：ＫＤ＝１．０８Ｅ－０９Ｍ、Ｒ２＝０．９９９１）。
８６８Ｚ１１ ＴＣＲは予測された認識パターンを示し；３～７位のアミノ酸の変化が、ｂｓＴＣＲの結合親和性に最も大きな影響を及ぼした。興味深いことに、たった１つのアミノ酸の変化が、野生型ペプチドとの相互作用と比較してｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３による結合親和性の増加をもたらし、ＴＣＲがその親和性成熟状態の標的に対して有する顕著な親和性が示される。この挙動はまた、結合モチーフをＳｅｑ２Ｌｏｇｏグラフ（図４ｂ）として可視化すると、図示され得る（図４ｂ）（２７）。
２１．ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３と交差反応するペプチドリガンドの同定
本発明者らはさらに、生成された結合モチーフを用いて、ヒトゲノムから交差反応性ペプチドリガンドを同定し得るかどうか探求したいと考えた。本発明者らは、５０ｎＭの例示的なＫｄ閾値を導入することによって、親和性データセットからペプチドリガンド検索モチーフを作成し；その閾値を超えてｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３Ｋｄを増加させる全ての単一アミノ酸置換は、モチーフから除外した（表４）。このモチーフに基づいて、本発明者らは、ＮＣＢＩヒト非冗長タンパク質配列データベースにおいて、モチーフによって許容される組み合わせに一致する九量体配列を検索した。この検索は、ヒトゲノム内で４００を超えるヒットを同定し、野生型配列ＳＬＹＮＴＶＡＴＬとの配列同一性は、１～６位の同一位置に及んだ。１４０のペプチドを選択し、より大きなグループの配列同一性分布に相当するようにサンプリングし、合成して親和性測定のために使用した。（表５；配列番号１７８－３１７）。本発明者らは、これらのペプチドのうちの９１について、１桁のＫｄｓ以上の結合親和性を検出できた。
表5:bs-868Z11-CD3結合モチーフに基づいて同定された選択されたペプチドリガンドに対するbs-868Z11-CD3結合親和性。NCBIデータベースに準拠したペプチド配列と関連遺伝子が報告されており、ペプチドはKdsの降順でソートされている。表は、Fortebio Data Analysis HT 10.0.3.7ソフトウェアを使用して、1:1ラングミュア結合モデルに従った曲線適合によって判定された、KD、kon、およびkoff値を含む。モデルに応じたそれぞれの誤差、ならびに精度が報告されている。「適合なし」として報告されたペプチドは、いずれの濃度においても、少なくとも0.05nmのピークシグナルに達する評価可能な曲線を有していなかった。





それらのうちの１つ、ＡＬＹＮＶＬＡＫＶ（配列番号１）は特筆すべき価値があった。それは、理論的ペプチドとして選択されたが、ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）免疫ペプチドミクスデータベースによると、さらに組織サンプルおよび細胞株からも発見された。このデータベースは、ＬＣ－ＭＳ分析に基づく定量的ＨＬＡペプチドミクスと、健常組織および腫瘍組織からのＲＮＡｓｅｑによって提供される定量的トランスクリプトミクスを組み合わせて、腫瘍組織上に排他的または優勢に発現するペプチドを同定する（２８、２９）。中間径フィラメントファミリーオーファン１または２（ＩＦＦＯ１／２）からの抗原であるＡＬＹＮＶＬＡＫＶは、頭頸部がん、脾臓がん、腎臓がんから、非小細胞肺がんまたは腎細胞がんに至る、複数の健常組織および腫瘍組織サンプル上で検出された。ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合親和性は、６５．９ｎＭのＫＤで測定した（図４ｃ）。本発明者らは、第２のＬＣ－ＭＳ検出ペプチド、ＫＴＦＮＬＩＰＡＶ（配列番号２２６）を同定でき、３つの腫瘍組織サンプルでより低い４１３ｎＭのＫｄが検出された。
２２．ｂｓＴＣＲ親和性とＴ細胞活性化の相関
ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲの結合親和性は、この抗スループットスクリーニングプラットフォームを使用して測定され得るが、さらにより有用であるためには、機能性Ｔ細胞係合ｂｓＴＣＲとしての生体外活性と一貫性がなくてはならない。一般に、適切な読み取りと連動する標的細胞とエフェクター細胞の生体外同時インキュベーションを使用して、これらのコンストラクトを特性評価する。ＮＦＡＴ応答エレメントによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する細胞株であるＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦＡＴ－ｌｕｃ２ Ｊｕｒｋａｔエフェクター細細胞、および外因性ペプチド負荷を通じた復元可能なｐＭＨＣ提示を有するＴＡＰ欠損Ａ＊０２：０１細胞株であるペプチド負荷Ｔ２標的細胞をｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３の存在下でインキュベートし、この文脈での動態スクリーニングの有意性を裏付けた。Ｔ２細胞に１００ｎＭの濃度で位置スキャニングライブラリからのそれぞれのペプチドを別々に負荷し、引き続いて読み取りの前に、Ｊｕｒｋａｔｓおよび異なるｂｓＴＣＲ濃度と共に１８時間にわたり同時インキュベートした。予測通り、本発明者らは、いかなるｂｓＴＣＲ濃度でも検出可能なＴ細胞活性化がないものから、例えば野生型ペプチド（図５ａ）のように低濃度から始まる強い応答に至るまで、幅広いスペクトルの結果に遭遇した。選択されたｂｓＴＣＲ濃度範囲の多くの相互作用についてＥＣ５０値を判定できなかったので、本発明者らは、３倍を超えるシグナルを誘導することができる最低のｂｓＴＣＲ濃度として定義される、Ｔ細胞活性化の開始によって、個々のペプチドを分類した。開始値をそれぞれ、測定されたＫＤｓに対してプロットした（図５ｂ）。
全体的に、本発明者らは、判定されたＫｄ値とＴ細胞活性化との間の良好な相関を検出したが、強いｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合親和性を有しながらＴ細胞活性化の発現が遅く、または活性化が全くない、１つの顕著な外れ値のグループがあった。本発明者らは、これらのペプチドと、それらのＮｅｔＭＨＣ予測されたＭＨＣに対する結合強度との間の直接的な関係を特定できた（図５ｃ）（２６）。異なるペプチド結合親和性は、外因性負荷後の標的細胞上のそれぞれのｐＭＨＣの異なる提示レベルをもたらし得るので、これは可能な説明を提供した。これらのレベルは、次に、ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ複合体の数、最終的にはＪｕｒｋａｔエフェクター（Ｔ細胞）の活性化に影響を及ぼすかもしれない。仮説を裏付けるために、本発明者らは、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を使用してフローサイトメトリーＴ２ペプチド結合アッセイを実施し、より低い結合親和性を有するペプチド、特にＮｅｔＭＨＣランクが２以上のペプチドについては、ペプチド負荷後にＨＬＡ－Ａ２表面レベルの上昇が低いことを検出でき、初期仮説が支持された。ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲの結合親和性は、０．０５～２のＮｅｔＭＨＣランクではペプチドリガンドのＴ細胞活性化の開始と良好に相関した一方で、この閾値を超えると、ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲの結合親和性とはほとんどかかわりなく、ＮｅｔＭＨＣランクのさらなる上昇と共にＴ細胞活性化が低下した。
本発明者らはまた、結合モチーフ検索によって選択された１４０のペプチドリガンドについてＴ細胞活性化アッセイを実施し、２４のペプチドリガンドは、供給されたｂｓＴＣＲ濃度の少なくとも１つで、バックグラウンドの３倍のＴ細胞活性化を誘導できた（図５ｄ）。測定されたＫｄｓは、位置スキャニングライブラリで得られた結果と同様に、Ｔ細胞活性化の開始と相関した。以前に強調表示されたＩＦＦＯ１抗原ＡＬＹＮＶＬＡＫＶ（配列番号１）もまた、レポーターアッセイにおいて反応性であった（図５ｅ）。
本発明者らは、ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合親和性が、抗ＣＤ３Ｔ細胞エンゲージャーと共役したｓｃＴｖ８６８Ｚ１１の生体外機能の良好な指標であることを示した。これは、ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合動態スクリーニングプラットフォームの価値を協調するが、それは、このような分子の開発の早い段階でｂｓＴＣＲの迅速かつ適切な特性評価を可能にするためである。
２３．１Ｇ４ Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１ ＥＳＯ ９Ｖ ＴＣＲ－ｐＭＨＣの結晶構造
１Ｇ４ＴＣＲがＥＳＯ９ＶＹ８４Ｃ／Ａ１３９ＣＨＬＡ－Ａ＊０２：０１をＥＳＯ９ＶＷＴ－Ａ＊０２：０１と区別なく認識することをさらに確認する。野生型ＥＳＯ９Ｖ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子について以前に報告されたように、ＴＣＲと、ＥＳＯ ９Ｖで再折りたたみされたジスルフィド安定化ＭＨＣとを共結晶化し、Ｘ線結晶学で分析した（表２）（２１）。結晶構造の比較は、双方の複合体間の高度の構造的重複を明らかにした。双方のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子の主鎖は、Ｃα（Ｔ細胞受容体のα鎖の定常部分；図７Ａ）に対して計算された、１．１４Ａの二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）値でほぼ完全に整列していた。同じことは、ジスルフィド結合に近接している場合でさえも、全ての原子にわたって計算された１．２７ＡのＲＭＳＤ値で、それらの側鎖を含めた双方の結合ペプチドに当てはまった（図７Ｂ）。１Ｇ４ ＴＣＲとの相互作用についても、同様の結論を下し得た。ＷＴ－Ａ＊０２：０１ １Ｇ４とＹ８４Ｃ／Ａ１３９ＣＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ １Ｇ４の結晶構造を比較すると、ペプチドおよびＭＨＣ主鎖と相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ領域は、境界面のわずかな偏差と４．１３°の小さなドッキング角の変化を示した。このシフトは、繰り返し結晶化した場合でも、同一複合体の予測偏差の範囲内であった（図７、ＣおよびＤ）。総合して、判定された結合親和性および結晶構造は、ＴＣＲ結合に関して、野生型複合体と比較して、Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体のペプチド受容性および同様の特性を示す。１Ｇ４ Ｙ８４Ｃ／Ａ１３９Ｃ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＥＳＯ ９Ｖ複合体の結晶構造は、受入れ番号６Ｑ３ＳでＰＤＢに寄託されている。
２４．考察
本明細書において、本発明者らは、ジスルフィド安定化された機能的に空のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を提示しており、これは、例えばジペプチドＧＭなどの典型的に必要とされる高親和性ペプチドを使用することなく、再折りたたみおよび精製され得る。得られたモノマーは、一段階の負荷手順でペプチドを添加した後に、ｐＭＨＣを形成し得る。ジスルフィド橋はＭＨＣ分子の安定性を高めるが、導入は野生型と比較して、ジスルフィド修飾ＨＬＡ＊０２：０１ ｐＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合を阻害せずまたは有意に変化させない。この技術は、親和性測定に適した大規模なｐＭＨＣライブラリを迅速に作成するための優れたツールである。ジスルフィド修飾ＨＬＡ＊０２：０１で生成されたｐＭＨＣ複合体ライブラリをバイオレイヤー干渉法に基づく分析と組み合わせることで、高スループットｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合動態スクリーニングが可能なプラットフォームがもたらされる。この設定は、モノクローナル抗体または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの二重特異性物質のような、ｐＭＨＣ複合体を標的化するその他の生物製剤の分析にも役立ち得る。このプラットフォームの１つの適用において、本発明者らは、ＨＩＶ特異的ｂｓＴＣＲ ｂｓ－８６８Ｚ１１－ＣＤ３についてのｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合親和性データセットを迅速に収集できた。それぞれのｐＭＨＣに対するｂｓＴＣＲ結合親和性は、提示されたＴ細胞エンゲージャーと連動して細胞レポーターアッセイで試験した場合の生体外活性の指標であり、これらのデータセットはｂｓＴＣＲの特性評価のために有益である。広範囲のｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ親和性にわたる、結合親和性とｂｓＴＣＲ媒介細胞活性化との関係の分析は、このようなデータセットを実行可能に収集するために利用できるツールが限られていることから、これまで困難であった。
収集された結合モチーフは、野生型ＴＣＲ８６８の結合モチーフとの類似性を明らかにした。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．による８６８－ＳＶ９結晶構造の分析、ならびに付属するアラニンスキャン（３４）は、ＣＤＲ３α領域と、ＳＬＹＮＴＶＡＴＬのアミノ酸４Ｎおよび５Ｔとの間の顕著な相互作用を明らかにした。この挙動は保存されているようであるが、８６８Ｚ１１コンストラクト中ではＣＤＲ３αのかなりの部分が変異している。結合モチーフおよびモデル検索ストラテジーを用いて、本発明者らは、ヒトプロテオームから複数のペプチドを同定できたが、これは、ｂｓＴＣＲとの高親和性、および標的細胞に提示されるとｂｓＴＣＲ媒介Ｊｕｒｋａｔエフェクター活性化を誘導する可能性を実証した。
複数のアミノ酸の同時交換は、孤立した交換とは異なる効果をもたらすかもしれないので、単一アミノ酸置換ライブラリに由来するＴＣＲ結合モチーフは、特異的ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）が認識できる全てのペプチドを反映していない可能性があることに留意されたい。代替アプローチとしては、例えば、それぞれがペプチドの１つの位置以外の全ての位置でランダム化されている高度多様性ペプチドプールを用いた標的細胞の負荷を通じた、または酵母表面にｐＭＨＣ複合体として提示されたランダム化ペプチドライブラリに対するスクリーニングを通じた、より複雑なライブラリのスクリーニングが挙げられる（１０、３２、３３）。それぞれの長所と短所をより深く理解するには、これらのアプローチを直接比較するさらなる研究が必要である。究極的に、臨床用候補の安全性スクリーニングは、リスクを最小限に抑えるために、例えば、結合モチーフ誘導分析と健常組織由来細胞株の大きなパネルの細胞スクリーニングを組み合わせることにより、常に複数のアプローチから構成されなければならない。本明細書に提示された結果は、ｐＭＨＣ－ｂｓＴＣＲ結合動態スクリーニングプラットフォームと組み合わせて、潜在的に関連するオフターゲット相互作用を同定するためのこのアプローチの能力を強調する。それは、複雑なｐＭＨＣライブラリの迅速な解析を提供するので、それは、開発過程の早い段階で有望な候補を選択するために使用し得て、確立された方法を補完する。このプラットフォームはまた、既知の免疫ペプチドームをカバーする質量分析データ駆動型組織特異的ｐＭＨＣライブラリに対して、後期候補のより大規模で包括的なスクリーニングを容易にし得る。その安定性および低労力のペプチド負荷手順により、ジスルフィド修飾ＨＬＡ＊０２：０１分子は、潜在的にさらに高スループットのプラットフォームを可能にし得る。これらの特性のおかげで、これらは、例えば、ジスルフィド修飾ＨＬＡ＊０２：０１分子の大規模コーティングと最新の近代的高スループットペプチドマイクロアレイインクジェットプリンタを組み合わせることで、数千の異なるｐＭＨＣ複合体を含む高度に複雑なｐＭＨＣマイクロアレイの作成に完璧に適し得る。
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Claims (43)

  1. ａ）ＭＨＣ Ｉの場合、安定化されたＭＨＣ分子のα１ドメインのαらせんとβシートの間に、少なくとも１つの人為的に導入された共有結合架橋を含んでなる、適切に安定化されたＭＨＣ分子を提供するステップと、
    ｂ）前記適切に安定化されたＭＨＣ分子をその多数のペプチドリガンドに接触させて、ペプチドリガンド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）分子複合体を形成するステップと、
    ｃ）前記ｐＭＨＣ分子複合体をＴＣＲ結合についてスクリーニングするステップと
    を含んでなる、ＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体（ｐＭＨＣ）をスクリーニングする方法。
  2. 前記ＭＨＣ分子が、ＨＬＡ、二量体、三量体、および四量体からなる群から選択される、ＨＬＡ多量体またはＭＨＣ Ｉ多量体である、請求項１に記載の方法。
  3. アミノ酸間の前記人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋が、組換え的に導入されたジスルフィド橋、架橋されるべき非天然アミノ酸の導入、光架橋アミノ酸の導入、および化学的に導入された架橋から選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. アミノ酸間の前記人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋が、
    （ｉ）ＭＨＣ Ｉの７１位のアミノ酸およびＭＨＣ Ｉの２２位のアミノ酸をシステインに変異させることによって；または
    （ｉｉ）αらせんとβシートの間に；およびαらせん間に、
    導入される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. アミノ酸間の前記人為的に導入された少なくとも１つの共有結合架橋が、ＭＨＣ Ｉの７１位のアミノ酸およびＭＨＣ Ｉの２２位のアミノ酸をシステインに変異させることによって、αらせんとβシートの間に；およびＭＨＣ Ｉの５１位のアミノ酸およびＭＨＣ Ｉの１７５位のアミノ酸をシステインに変異させることによって、αらせん間に導入される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ｐＭＨＣ分子複合体が、約４℃で、約１日以上安定である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ｐＭＨＣ分子複合体が、約４℃で、約１週間以上安定である、請求項６に記載の方法。
  8. ｐＭＨＣ複合体への結合についてのＴＣＲの親和性スクリーニングの感度レベルが、約Ｋｄ１．０×１０－９よりも高い、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ｐＭＨＣ複合体への結合についてのＴＣＲの親和性スクリーニングの感度レベルが、約Ｋｄ１．０×１０ －６ よりも高い、請求項８に記載の方法。
  10. ｐＭＨＣ複合体への結合についてのＴＣＲの親和性スクリーニングの感度レベルが、約Ｋｄ１．０×１０ －３ よりも高い、請求項８に記載の方法。
  11. 前記ＴＣＲまたは前記ＭＨＣ分子のどちらかが、チップ、バイオセンサー、スライドガラスまたはビーズからなる群から選択される固体表面上に適切に固定化されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記方法が、高スループットスクリーニング形式で実施される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ＭＨＣ分子が、ＭＨＣ Ｉのα１ドメイン内の２つのアミノ酸の間に、少なくとも１つの人為的に導入された共有結合架橋を含んでなる、安定化されたＭＨＣ分子またはそのペプチド結合断片を含んでなるまたはそれからなる、ポリペプチドであって、１つのアミノ酸はＭＨＣ Ｉのα１ドメインのβ１ユニットで修飾され、もう１つのアミノ酸はＭＨＣ Ｉのα１ ドメインのα１ユニットで修飾される、ポリペプチド。
  14. アミノ酸１２～３２位内のβ１ユニット内で、１つのアミノ酸が修飾され；アミノ酸６１～８１位内のα１ユニット内で別のアミノ酸が修飾される、請求項１３に記載のポリペプチド。
  15. アミノ酸１７～２７位内のβ１ユニット内で、１つのアミノ酸が修飾され；アミノ酸６６～７６位内のα１ユニット内で別のアミノ酸が修飾される、請求項１４に記載のポリペプチド。
  16. アミノ酸２０～２４位内のβ１ユニット内で、１つのアミノ酸が修飾され；アミノ酸６９～７３位内のα１ユニット内で別のアミノ酸が修飾される、請求項１４に記載のポリペプチド。
  17. アミノ酸２２位のβ１ユニット内で、１つのアミノ酸が修飾され；アミノ酸７１位のα１ユニット内で別のアミノ酸が修飾される、請求項１４に記載のポリペプチド。
  18. ＭＨＣ Ｉの７４～８４位のアミノ酸と１３８～１４９位のアミノ酸をシステインに変異させることによる、α１ドメインのアミノ酸とα２ドメインのアミノ酸との間の少なくとも１つの人為的共有結合架橋をさらに含んでなる、請求項１３～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  19. ＭＨＣ Ｉの８４位のアミノ酸と１３９位のアミノ酸をシステインに変異させることによる、α１ドメインのアミノ酸とα２ドメインのアミノ酸との間の少なくとも１つの人為的共有結合架橋をさらに含んでなる、請求項１８に記載のポリペプチド。
  20. （ｉ）１つのアミノ酸がＭＨＣ Ｉのα１ドメインのβ１ユニットの２２位で修飾され、１つのアミノ酸がＭＨＣ Ｉのα１ドメインのα１ユニットの７１位で修飾される；または
    （ｉｉ）１つのアミノ酸がＭＨＣ Ｉのα１ドメインのβ１ユニットの２２位で修飾され、１つのアミノ酸がＭＨＣ Ｉのα１ドメインのα１ユニットの７１位で修飾され、１つのアミノ酸がＭＨＣ Ｉのα１ドメインのα１ユニットの５１位で修飾され、１つのアミノ酸がＭＨＣ Ｉのα２ドメインのα１ユニットの１７５位で修飾される、
    請求項１３～１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. ＭＨＣ Ｉ分子が、アミノ酸２２位とアミノ酸７１位との間に人為的に導入された１つの共有結合架橋を含む、安定化されたＭＨＣ Ｉ分子またはそのペプチド結合断片を含んでなるまたはそれからなるポリペプチド。
  22. ＭＨＣ Ｉ分子が
    （ｉ）アミノ酸２２位とアミノ酸７１位との間に人為的に導入された１つの共有結合架橋；および
    （ｉｉ）アミノ酸５１位とアミノ酸１７５位の間に人為的に導入された１つの共有結合架橋
    を含む、安定化されたＭＨＣ Ｉ分子またはそのペプチド結合断片を含んでなるまたはそれからなるポリペプチド。
  23. 請求項１３～２２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む複合体。
  24. 前記ポリペプチドが、ビーズ、フィラメント、ナノ粒子または他の担体に結合している、請求項２３に記載の複合体。
  25. 前記ポリペプチドにペプチドが負荷されている、請求項２３または２４に記載の複合体。
  26. （ａ）事前選択されたＴＣＲを含んでなる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を実施するステップと、
    （ｂ）ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列を判定および比較し、それによって前記事前選択されたＴＣＲの特定のアミノ酸結合モチーフを同定する追加的なステップと
    を含んでなる、ＴＣＲの特定のアミノ酸結合モチーフを検出または生成するための方法。
  27. 前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体が、異なる濃度を有する並行アッセイ反応で使用される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ステップ（ａ）および（ｂ）が、同定された前記事前選択されたＴＣＲのための修飾アミノ酸結合モチーフからなるペプチドのプールを含んでなるように繰り返される、請求項２７に記載の方法。
  29. ａ）請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法を実施するステップと、
    ｂ）ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列を判定および比較し、それによって前記ＴＣＲの交差反応性を同定する追加的なステップと
    を含んでなる、ＴＣＲの交差反応性を検出または判定するための方法。
  30. ａ）事前選択されたＴＣＲを含んでなる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を実施するステップと
    ｂ）ＴＣＲ結合が検出された前記ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体中のそれらのペプチドリガンドのアミノ酸配列を判定および比較し、それによって前記ＴＣＲの交差反応性を同定する追加的なステップと
    を含んでなる、ＴＣＲの交差反応性を検出または判定するための方法。
  31. ＴＣＲと、前記ＴＣＲに結合するＴＣＲ結合ペプチドリガンド／ＭＨＣ分子複合体とを含んでなる、Ｔ細胞活性化を測定するステップをさらに含んでなる、請求項１～１２または２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 請求項１３～１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含んでなる、医薬組成物。
  33. 共刺激分子および／またはこれらの共刺激分子の時系列配列の１つまたは組み合わせをさらに含んでなる、請求項３２に記載の医薬組成物。
  34. 抗ＣＤ２８抗体または抗４１ＢＢ抗体をさらに含んでなる、請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 請求項３２に記載の医薬組成物を含んでなる、ワクチン。
  36. 薬剤として使用するための請求項３５に記載のワクチン。
  37. がんの予防に使用するための請求項３５または３６に記載のワクチン。
  38. 対象のＴ細胞応答を誘発することによる、がんの予防に使用するための請求項３７に記載のワクチン。
  39. 医薬品を製造するための、請求項３５に記載のワクチンの使用。
  40. がんの予防用の医薬品を製造するための、請求項３５に記載のワクチンの使用。
  41. 対象のＴ細胞応答を誘発することによる、がんの予防用の医薬品を製造するための、請求項４０に記載のワクチンの使用。
  42. 請求項１３～１７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコード化する核酸分子。
  43. 請求項４２に記載の核酸分子の少なくとも１つを含んでなる、ベクター。
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