CN113316459B - 包含皮肤穿透核酸复合物作为有效成分的用于预防或治疗特应性皮炎的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防或治疗皮肤病的组合物，其包含作为有效组分的皮肤穿透核酸复合物，更具体地，涉及用于预防、缓解或治疗特应性皮炎的药物组合物或化妆品组合物，其包含皮肤穿透核酸复合物，其中载体肽核酸和靶向TLR2或IL‑4Rα的生物活性核酸通过互补结合连接。根据本发明的皮肤穿透核酸复合物具有高皮肤渗透性和皮肤保持力，因此可用于预防、缓解或治疗皮肤病诸如特应性皮炎，在所述皮肤穿透核酸复合物中载体肽核酸与靶向TLR2或IL‑4Rα的生物活性核酸通过互补结合连接。

Description

包含皮肤穿透核酸复合物作为有效成分的用于预防或治疗特 应性皮炎的组合物
【技术领域】
本发明涉及用于预防或治疗皮肤病的组合物，其包含能够渗入皮肤的核酸复合物作为活性成分。更具体地，本发明涉及用于预防、改善或治疗特应性皮炎的药物组合物，其包含能够渗透皮肤的核酸复合物，其中靶向TLR2或IL-4Rα的生物活性核酸与载体肽核酸相互互补结合。
【背景技术】
与常规药物不同，核酸药物抑制靶特异性信使RNA(mRNA)的表达。因此，对核酸药物在无法用靶向蛋白质的常规药物治疗的领域中的应用的研究正在进行中Kole R.等人Nature Rev.Drug Discov.2012；11；125-140.,Wilson C.等人Curr.Opin.Chem.Bio.2006；10:607-614.)。
尽管基于寡核酸的基因表达调节具有优异的效果和广泛的应用，但是为了开发基于核酸的治疗剂，还有许多障碍需要克服。例如，寡核苷酸可被核酸酶等破坏，或者可能由于其电特性(电荷)和大小而不能通过被动扩散渗透细胞膜。为了解决上述问题，人们努力通过核酸的修饰来确保生物稳定性。经修饰的人工核酸能够增加与靶核酸的亲和力，而不丧失生物活性。肽核酸(PNA)是一种类型的经修饰的人工核酸，是用(2-氨基乙基)-甘氨酸肽骨架引入的人工核酸，具有与具有互补核苷酸序列的RNA和DNA强结合的性质。特别地，肽核酸具有对核酸酶的抗性和高生物稳定性。因此，与基于各种寡核酸的治疗剂相关的研究正在进行中。然而，肽核酸由于其电中性而难以引入细胞(Joergensen M.等人Oligonucleotides 2011,21；29-37.)。寡核苷酸渗透细胞膜的能力相当低。特别是DNA或RNA带负电荷，因此不能通过细胞的疏水磷脂双层，很难通过简单的扩散传递送至细胞。诸如逆转录病毒或AAV病毒(腺相关病毒)等病毒载体的使用使得能够将寡核苷酸引入细胞。然而，存在非预期免疫活性的风险、癌基因重组的可能性等(Couto L.B.等人Curr.Opin.Pharmacol.2010,5；534-542.)。
为此，开发基于具有低细胞毒性和低免疫活性的非病毒寡核苷酸的核酸载体越来越重要。因此，正在开发利用阳离子脂质、脂质体、稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)、聚合物和细胞穿透肽来引入核酸的方法(Zhi D.等人Bioconjug.Chem.2013,24；487-519.,BuyensK.等人J.Control Release,2012,158；362-70.,ROSSI,J.J.等人Gene Ther.2006,13:583-584.,Yousefi A.等人J.Control Release,2013,170；209-18.,Trabulo S.等人Curr.Pharm.Des.2013,19；2895-923.)。这种核酸递送方法包括形成具有基于直接结合的功能部分的复合物的步骤，并且具有与脂质体结构的内体逃逸效力和生物毒性相关的问题。因此，需要改善将寡核酸引入细胞的功能，并解决与制备过程和副作用相关的问题。
同时，皮肤是人体内表面积最大的器官，并且当使用适当的方法时，皮肤用作可通过其有效递送药物的通道。因此，通过皮肤施用生理活性剂诸如治疗药物(通常称为“透皮递送”)，由于诸如相对简单的药物施用方案等特征而受到了极大关注。在结构上，皮肤由两个主要部分(即，较薄的最外层，称为“表皮(表皮层)”，和较厚的内层，称为“真皮(真皮层)”)组成。特别是表皮的最外层，称为“角质层”，由充满角蛋白的扁平死亡细胞组成。角质层的扁平死亡细胞之间的区域由形成层状相的脂质组成，这有助于皮肤的天然屏障特性。存在于皮肤最外层区域中的角质层等起着天然屏障的作用，因此大大降低了外来物质诸如治疗性药物的皮肤渗透性，并使其难以递送具有高分子量的亲水性物质。
为了克服将治疗性药物输送到皮肤时皮肤屏障对外来物质的防御机制，已经进行了各种皮肤渗透性方法的研究。然而，基于化学物质的性质，在不物理损伤或刺激皮肤的情况下递送药物被认为是非常困难的，并且由于可以从克服困难的材料中预期的各种有利方面，存在对持续发展的需求。针对这一需求，已有大量研究报道了能够有效递送大分子量药物的皮肤穿透递送材料，诸如脂质体、纳米颗粒和肽配体[Lademan等人，2007(Eur J PharmBiopharm.2007May；66(2):159-64.),Chen等人，2006a(J Pharmacol Exp Ther.2006年11月；319(2):765-75.)，Chen等人，2006b(Nat Biotechnol.2006年4月；24(4):455-60.)]。尽管通过这种方式开发到实际应用阶段的成本增加，但不能保证要递送的药物的功效和稳定性，因此需要开发同时具有皮肤渗透性功能和体内功效的材料。为了实现应用于皮肤表面的外部处理材料的有效性，由于穿过表皮和真皮的技术难度，需要大量的努力。
在这方面，令人惊讶的是，本发明人发现含有生物活性核酸和被修饰成具有总正电荷的载体肽核酸(所述生物活性核酸与所述载体肽核酸相互互补地结合)的核酸复合物改善了细胞渗透性，并且使用该核酸复合物非常高效地调节了靶基因的表达，因此提交了关于具有低细胞毒性和改善的细胞渗透性以及生物活性核酸的基因表达调节能力的新型构建物的专利申请(PCT/KR2017/008636)。
作为连续进行的关于改善构建体和治疗性药物的皮肤渗透性和细胞递送功能的研究的结果，本发明人发现，包含生物活性核酸和被修饰成具有总正电荷的载体肽核酸(所述生物活性核酸与所述载体肽核酸相互互补地结合)的核酸复合物具有非常高效地穿过皮肤(优选角质层和/或表皮层)的性质，因此具有优异的皮肤渗透性。
因此，作为将具有优异皮肤渗透性的核酸复合物应用于皮肤病治疗的广泛努力的结果，本发明人证明了含有靶向TLR2或IL-4Rα的生物活性核酸和载体(所述生物活性核酸与所述载体相互互补地结合)的能够渗透皮肤的核酸复合物显示出优异的预防或治疗特应性皮炎的效果。基于这一发现，完成了本发明。
【公开内容】
本发明的目的是提供用于预防、改善或治疗皮肤病的药物组合物，所述组合物包含能够渗透皮肤的核酸复合物作为活性成分，所述核酸复合物具有高皮肤渗透性、高皮肤保持力(skin retention)和对特应性皮炎的优异预防或治疗效果并且包含靶向TLR2或IL-4Rα的生物活性核酸和载体，所述载体与所述生物活性核酸互补结合。
根据本发明的方面，上述和其它目的可以通过提供用于预防、改善或治疗皮肤病的药物来实现，所述组合物包含：能够渗透皮肤的核酸复合物，所述核酸复合物包含具有能够与TLR2或IL-4Rα基因结合的序列的生物活性核酸；和载体肽核酸，所述载体肽核酸与作为活性成分的所述生物活性核酸互补结合。
在本发明的另一方面，提供了包含该组合物的制剂。
在本发明的另一方面，提供了预防或治疗皮肤病的方法，所述方法包括施用能够渗透皮肤的核酸复合物，所述核酸复合物包含具有能够与TLR2或IL-4Rα基因结合的序列的生物活性核酸和载体肽核酸，所述载体肽核酸与所述生物活性核酸互补结合。
在本发明的另一方面，提供了能够渗透皮肤的核酸复合物用于预防或治疗皮肤病的用途，所述核酸复合物包含具有能够与TLR2或IL-4Rα基因结合的序列的生物活性核酸和载体肽核酸，所述载体肽核酸与所述生物活性核酸互补结合。
在本发明的另一方面，提供了能够渗透皮肤的核酸复合物在制备用于预防或治疗皮肤病的药物中的用途，所述核酸复合物包含具有能够结合TLR2或IL-4Rα基因的序列的生物活性核酸和载体肽核酸，所述载体肽核酸与所述生物活性核酸互补结合。
【附图说明】
图1a至图1c示意性地说明了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的一种类型的结构在特应性皮炎样细胞模型中的效果。
图1a显示了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用屋尘螨提取物(粉尘螨)提取物诱发了特应性皮炎的人来源的角蛋白细胞系中的细胞活力。
图1b显示了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用屋尘螨提取物(欧洲室尘蟎)提取物诱发了特应性皮炎的人来源的角蛋白细胞系中的细胞活力。
图1c显示了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用引起病屋综合症的化学物质(2-二硝基氯苯，DNCB)诱发了特应性皮炎的人来源的角蛋白细胞系中的细胞活力。
图2a至图2c示意性地说明了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在特应性皮炎样细胞模型中的效果。
图2a显示了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用粉尘螨提取物诱发了特应性皮炎的人来源的角蛋白细胞系中对靶基因TLR2的表达以及对下游基因表达的影响。
图2b显示了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用欧洲室尘蟎提取物诱发了特应性皮炎的人来源的角蛋白细胞系中对靶基因TLR2的表达以及对下游基因表达的影响。
图2c显示了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用引起病屋综合症的化学物质(2-二硝基氯苯，DNCB)诱发了特应性皮炎的人来源的角蛋白细胞系中对靶基因TLR2的表达以及对下游基因表达的影响。
图3a至图3h显示了靶向TLR2基因的核酸复合物在特应性皮炎诱导的动物模型中的治疗效果。
图3a是显示NC/Nga小鼠中由于核酸复合物而导致的小鼠特应性皮炎表型减少的图像。
图3b表明，在使用屋尘螨提取物诱发了特应性皮炎的NC/Nga小鼠中，核酸复合物降低了血清中IgE的浓度。
图3c显示在使用屋尘螨提取物诱发了特应性皮炎的NC/Nga小鼠中由于核酸复合物而导致的血清中TARC浓度的降低。
图3d显示了在使用屋尘螨提取物诱发了特应性皮炎的NC/Nga小鼠的皮肤组织中由于核酸复合物而导致的靶基因TLR2和下游基因表达的减少。
图3e显示在使用屋尘螨提取物诱发了特应性皮炎的NC/Nga小鼠的皮肤组织中由于核酸复合物而导致的透皮厚度的减少。
图3f显示了在使用屋尘螨提取物诱发了特应性皮炎的NC/Nga小鼠的皮肤组织中由于核酸复合物而导致的炎症标志物CD3的减少。
图3g显示了在使用屋尘螨提取物诱发了特应性皮炎的NC/Nga小鼠的皮肤组织中由于核酸复合物而导致的炎症标志物CD11c的减少。
图3h显示在使用屋尘螨提取物诱发了特应性皮炎的NC/Nga小鼠的皮肤组织中由于核酸复合物而导致的炎症标志物CD3/CD11c的减少。
图4a至图4b示意性地说明了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在特应性皮炎样细胞模型中的效果。
图4a显示了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用IL-4诱发了特应性皮炎的人来源的角蛋白细胞系中的细胞活力。
图4b显示了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用IL-13诱发了特应性皮炎的人来源的角蛋白细胞系中的细胞活力。
图5a至图5b示意性地说明了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在特应性皮炎样细胞模型中的效果。
图5a显示了其中生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用IL-4诱发了特应性皮炎的人来源的角蛋白细胞系中对靶基因IL-4Rα的表达以及对下游基因表达的影响。
图5b显示了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用IL-13诱发了特应性皮炎的人来源的角蛋白细胞系中对靶基因IL-4Rα的表达以及对下游基因表达的影响。
图6a至图6b示意性地说明了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在特应性皮炎样细胞模型中的效果。
图6a显示了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用IL-4诱发了特应性皮炎的源自人的T淋巴细胞中对靶基因IL-4Rα的表达以及对下游基因表达的影响。
图6b显示了生物活性核酸与载体肽核酸相互结合的结构类型在使用IL-4、PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯)和离子霉素诱发了特应性皮炎的源自人的T淋巴细胞中对靶基因IL-4Rα的表达以及对下游基因表达的影响。
图7a至图7b显示了使用细胞模型选择的与生物活性核酸与载体肽核酸的组合对特应性皮炎的治疗效果以及对组织中蛋白质表达的抑制作用相关的组织表型，所述细胞模型与使用DNCB诱发了特应性皮炎的NC/Nga小鼠模型相似。
图7a显示了使用DNCB诱发了特应性皮炎的动物模型中由于核酸复合物而导致的皮肤表型的改善。
图7b显示了使用DNCB诱发了特应性皮炎的动物模型中由于核酸复合物而导致的特应性皮炎诱导的皮肤组织中IL-4Rα(一种靶基因)表达的降低。
图8a至图8b显示了ELISA和SCORAD(特应性皮炎行为评估、瘙痒和红斑)分析的结果，该结果显示了使用细胞模型选择的生物活性核酸与载体肽核酸的组合对特应性皮炎的治疗效果，所述细胞模型与使用DNCB诱发了特应性皮炎的NC/Nga小鼠模型相似。
图8a显示使用DNCB诱发了特应性皮炎的动物模型中由于核酸复合物而导致的血清中IgE、TARC和IL-4的量的减少。
图8b显示使用DNCB诱发了特应性皮炎的动物模型中由于核酸复合物而导致的瘙痒和红斑的改善。
图9a至图9b显示了特应性皮炎皮肤组织的H&E染色和免疫染色的结果，所述结果显示了使用细胞模型选择的生物活性核酸与载体肽核酸的组合对特应性皮炎的治疗效果，所述细胞模型与使用DNCB诱发了特应性皮炎的NC/Nga小鼠模型相似。
图9a显示了皮肤组织的H&E染色结果，所述结果显示在使用DNCB诱发了特应性皮炎的动物模型中由于核酸复合物而导致的经皮组织的厚度的减小、炎性细胞的表达的减少。
图9b显示了皮肤组织的免疫染色结果，该结果显示在使用DNCB诱发了特应性皮炎的动物模型中由于核酸复合物而导致的皮肤组织中作为树突细胞和巨噬细胞标志物的CD3和CD11c的表达的降低。
【最佳模式】
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的相同的含义。一般而言，本文使用的术语在本领域中是公知的，并且是通常使用的。
本发明基于这样的发现，即含有相互互补结合的生物活性核酸与载体肽核酸的核酸复合物具有高皮肤渗透性和高皮肤保持力，特别地，含有相互互补结合的靶向TLR2或IL-4Rα的生物活性核酸和载体肽核酸的核酸复合物可通过施加于皮肤表面来用于治疗皮肤病诸如特应性皮炎。
一方面，本发明涉及用于预防、改善或治疗皮肤病的药物，其包含：能够渗透皮肤的核酸复合物，所述核酸复合物包含具有能够与TLR2或IL-4Rα基因结合的序列的生物活性核酸；和载体肽核酸，所述载体肽核酸与作为活性成分的所述生物活性核酸互补结合。
在本发明中，其中生物活性核酸与载体肽相互互补结合的核酸复合物具有下式(1)的结构：
式(1)
[A≡C(+)]
其中
A为具有能够结合靶基因的序列的生物活性核酸，
C为能够与所述生物活性核酸结合的载体肽核酸，
'≡’意指生物活性核酸与载体肽核酸之间的互补结合，
其中由A表示的生物活性核酸总体上带负电荷或为中性，并且
C(+)意指载体肽核酸整体带正电荷。
载体肽核酸包含至少一种被修饰成总体带正电荷的肽核酸单体。
根据本发明的核酸复合物中生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合可以是反向平行或平行结合。
如本文中所用，术语“生物活性核酸”是指具有能够与作为表达抑制的靶标的基因结合的互补序列的核酸，特别是具有能够与作为表达抑制的靶标的基因的mRNA结合的互补序列的核酸，意指参与基因表达调节诸如抑制相应基因的表达的核酸，并且可以是具有与作为表达抑制的靶标的基因互补的序列的核酸。
具体而言，如本文中所用，术语“生物活性核酸”在体外或体内与靶基因和包括所述靶基因的核苷酸序列结合，并用于抑制相应基因的固有功能(转录物表达或蛋白质表达)。
因此，本发明中的“生物活性核酸”优选为作为特应性皮炎的靶基因的TLR2(toll样受体2)和IL-4Rα(白介素-14受体α)的反义肽核酸，并且更优选由选自包含SEQ ID NO:1至4的组的氨基酸序列表示，但不限于此。
另外，能够与TLR2基因结合的生物活性核酸优选由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示，并且能够与IL-4Rα基因结合的生物活性核酸优选由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示，但不限于此。
如本文中所用，术语“载体肽核酸”是指其碱基部分或全部与生物活性核酸互补结合以赋予其功能性的核酸，并且本文所用的载体肽核酸可以是肽核酸(PNA)或与其相似的经修饰的核酸，优选为肽核酸，但不限于此。
特别地，本文所用的载体肽核酸优选由选自包含SEQ ID NO:5至18的组的氨基酸序列表示，但不限于此。
如本文中所用，术语“能够渗透皮肤的核酸复合物”是指当与皮肤接触时能够使生物活性物质渗透到体内并最终渗透到细胞中的复合物。具体而言，能够渗透皮肤的核酸复合物使生物活性物质能够穿过角质层和/或表皮层(其为皮肤的最外层)，并被递送至表皮层或真皮层，或者使其能够穿过真皮层并被递送至体内。
生物活性物质可以保留在角质层、表皮层或真皮层中，或者也可以穿过真皮层并被递送至身体内，这取决于根据本发明的能够渗透皮肤的核酸复合物中的总净电荷和/或核酸复合物中生物活性核酸和/或载体肽核酸的数量。
因此，在本发明中，核酸复合物可以具有皮肤保持力。
在本发明中，在能够渗透皮肤的核酸复合物中，生物活性核酸本身可以用作治疗剂；也就是说，复合物本身既可以作为能够渗透皮肤的载体，也可以作为治疗剂。
特别地，根据本发明的能够渗透皮肤的核酸复合物可以通过皮肤透皮递送到体内，然后可被递送到期望的细胞，并且可以以包含核酸复合物的任何形式使用。
在本发明中，能够渗透皮肤的核酸复合物优选包含由SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列表示的生物活性核酸和由选自包含SEQ ID NO:5至18的组的任一氨基酸序列表示的载体肽核酸，但不限于此。
另外，能够与TLR2或IL-4Rα基因结合的生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合力(解链温度，Tm)低于生物活性核酸与被所述生物活性核酸靶向的TLR2或IL-4Rα基因之间的结合力。
在本发明中，生物活性核酸或载体肽核酸可以进一步与促进内体逃逸到每个核酸的5’末端或3’末端的物质结合。也就是说，生物活性核酸或载体肽核酸可以进一步包含促进生物活性核酸和载体肽核酸的内体逃逸的物质，以形成下式(2)的结构。
式(2)
[mA≡mC(+)]
在结构式(2)中，
“m”意指促进生物活性核酸和载体肽核酸的内体逃逸的物质。
在本发明中，“促进内体逃逸的物质”可以通过增加内体中的渗透压或使内体膜去稳定来促进生物活性核酸从内体中逃逸。这意味着“促进内体逃逸的物质”使生物活性核酸能够更高效和更快速地移动到细胞核或细胞质中，并与靶基因相遇和起作用(D.W.Pack,A.S.Hoffman,S.Pun,P.S.Stayton,“Design and development of polymers for genedelivery,”Nat.Rev.Drug.Discov.,4,581-593(2005))。
在本发明中，促进内体逃逸的物质包括选自包含肽、脂质纳米颗粒、多聚体纳米颗粒(polyplex nanoparticles)、聚合物纳米球、无机纳米颗粒、基于阳离子脂质的纳米颗粒、阳离子聚合物和pH敏感性聚合物的组中的至少一种。
在本发明中，作为促进内体逃逸的物质，具有如GLFDIIKKIAESF(SEQ ID NO:19)的序列肽可通过接头结合至生物活性核酸，组氨酸(10)可通过接头结合至载体肽核酸，但是本发明不限于此。
在本发明中，脂质纳米粒可选自包含脂质、磷脂、棕榈酸鲸蜡酯、泊洛沙姆18、Tween85、三硬脂酸甘油酯和Tween 80的组。
在本发明中，多聚体纳米颗粒可以是聚(酰胺胺)或聚乙烯亚胺(PEI)。
在本发明中，聚合物纳米球可选自包含聚己内酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(d,l-丙交酯)、壳聚糖和PLGA-聚乙二醇的组。
在本发明中，无机纳米颗粒可以选自包含Fe2O3、Fe3O4、WO3和WO2.9的组。
在本发明中，基于阳离子脂质的纳米颗粒可选自包含1-(氨基乙基)亚氨基双[N-(油烯基半胱氨酰-1-氨基-乙基)丙酰胺]、PTA的N-烷基化衍生物和3,5-双十二烷基氧基苄脒的组。
在本发明中，阳离子聚合物可选自包含乙烯基吡咯烷酮-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸共聚物硫酸二乙酯、聚异丁烯和聚(N-乙烯基咔唑)的组。
在本发明中，对pH敏感的聚合物可以选自包含多元酸、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)和水解的聚丙烯酰胺的组。
在本发明中，生物活性核酸和载体肽核酸中的每一种包含2至50个，优选5至30个，更优选10至25个，最优选15至17个核酸单体。
生物活性核酸可包含天然核酸碱基和/或经修饰的核酸单体。
在本发明中，在用于生物活性核酸的单体是PNA的情况下，所述单体被称为“生物活性肽核酸”。在使用其它单体的情况下，以与上述相同的方式称呼它们。
在本发明中，生物活性核酸和载体肽核酸可以进一步包含至少一种选自包含磷酸二酯、2'-0甲基、2'-甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯和硫代磷酸酯的组的官能团。
在本发明中，载体肽核酸可具有与生物活性核酸部分或完全互补的核苷酸序列。具体而言，载体肽核酸可包括至少一个通用碱基，并且载体肽核酸可以完全由通用碱基组成。
在本发明中，关于电性质，能够渗透皮肤的核酸复合物中的生物活性核酸和载体肽核酸中的每一种可具有总正电荷(正的)、总负电荷(负的)或无电荷(中性的)。
术语“总体”在电学性质的表达中意指从外部观察的生物活性核酸或载体肽核酸各自电荷的总体电性质，而不是单个碱基的电性质。例如，即使生物活性核酸中的一些单体是正的，当带负电荷的单体的数量大于带正电荷的单体的数量时，所述生物活性核酸在“总体”电性质方面是带负电荷的。当带正电荷的碱基和/或骨架的数量大于带负电荷的碱基和/或骨架的数量时，即使载体肽核酸中的一些碱基和/或骨架成分带负电荷，就其“总体”电性质而言，载体肽核酸被认为是带正电荷的。
从这个角度来看，本发明的核酸复合物可以被认为总体上是带正电荷的。在核酸复合物中，优选地，生物活性核酸在总体电特性方面带负电荷或中性，载体肽核酸在总体电特性方面带正电荷，但不限于此。
在本发明中，经修饰的肽核酸单体可用于赋予生物活性核酸和载体肽核酸电性质，并且经修饰的肽核酸单体包括至少一个选自包含赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸(DAB)、鸟氨酸(Orn)和氨基酸类似物的组的带正电荷的核酸作为带正电荷的载体肽核酸，并且包括作为带负电荷的氨基酸的谷氨酸(Glu，E)或氨基酸类似物的带负电荷的氨基酸作为带负电荷的载体肽核酸。
在本发明中，为了使载体肽核酸具有总正电荷，载体肽核酸可包含至少一种γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体。
γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体在其骨架中包含至少一个带正电荷的氨基酸，所述氨基酸选自包含赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸、鸟氨酸(Orn)和氨基酸类似物的组，以便载体肽核酸具有总正电荷。
在本发明中，除了骨架修饰之外，具有经修饰的核碱基的肽核酸单体可用于肽核酸单体的修饰，从而赋予其电荷。优选地，可在核碱基中包含胺、三唑或咪唑部分以赋予其正电荷，或者可在碱基中包含羧酸以赋予其负电荷。
在本发明中，载体肽核酸的经修饰的肽核酸单体可以进一步在骨架或核碱基中包含负电荷。然而，优选地，经修饰的肽核酸单体包含比带负电荷的单体更多的带正电荷的单体，因此载体肽核酸带正电荷。
优选地，根据本发明的核酸复合物总体上带正电荷。
在根据本发明的核酸复合物中，将至少一种选自包含疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适体和荧光/发光标记物的组的材料结合至生物活性核酸和/或载体肽核酸。优选地，至少一种选自包含疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适体和用于成像的荧光/发光标记物的组的材料可以结合至载体肽核酸。
在本发明中，选自包含疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适体、淬灭剂、荧光标记物和发光标记物的组的至少一种材料与生物活性核酸和/或载体肽核酸的结合可以是简单的共价键或由接头介导的共价键，但不限于此。优选地，与核酸载体结合的细胞渗透、溶解性、稳定性、运输和成像相关物质(例如，疏水残基等)独立于调节靶基因表达的生物活性核酸而存在。
在本发明中，如上所述，生物活性核酸与载体肽核酸的互补结合通常是反向平行结合或平行结合。互补结合形成在生物活性核酸的靶序列(与生物活性核酸互补的序列)存在下分离的结构。
反向平行结合和平行结合根据DNA-DNA或DNA-PNA的结合模式中的5’-方向和3’-方向而确定。反向平行结合是DNA-DNA或DNA-PNA的一般结合模式。例如，在根据本发明的核酸复合物中，5’至3’方向的生物活性核酸与3’至5’方向的载体肽核酸结合。平行结合的结合力比反向平行结合的结合力稍小，生物活性核酸与载体肽核酸以同一方向，即5’至3’方向或3’至5’方向相互结合。
在根据本发明的核酸复合物中，优选地，生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合力小于生物活性核酸与被所述生物活性核酸靶向的靶基因，特别是靶基因的mRNA之间的结合力。结合力由解链温度(Tm)决定。
用于降低生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合力(解链温度，Tm)而不是生物活性核酸与被生物活性核酸靶向的靶基因，特别是靶基因的mRNA之间的结合力的特定方法的实例，包括生物活性核酸与载体肽核酸之间的平行结合或部分特异性结合，但不限于此。
作为另一个实例，载体肽核酸具有至少一个选自包含接头、通用碱基和肽核酸碱基的组的肽核酸碱基，所述肽核酸碱基包括与生物活性核酸的相应碱基不互补的碱基，但不限于此。
在本发明中，通用碱基非选择性地结合至诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶等天然碱基，并且可包括至少一种选自包含肌苷PNA、吲哚PNA、硝基吲哚PNA和脱碱基(abasic)的组的碱基作为结合力低于互补结合力的碱基，优选为肌苷PNA。
本发明提供了用于控制核酸复合物的功能的核酸的结合模式和电特性的组合，并使用核酸的结合模式和电性质的组合来控制粒度和作用时间，以及改善细胞渗透性、溶解性和特异性。
在本发明中，通过控制生物活性肽核酸与载体肽核酸之间的结合力，可以在靶基因存在的情况下控制生物活性肽核酸结合至靶序列的时间点(诸如生物活性核酸被靶序列取代的时间点，以及发生靶特异性释放和结合的时间点)。
在根据本发明的核酸复合物中，生物活性核酸被靶基因取代(链置换)的时间点和靶特异性释放和结合的时间点可能受用于复合物的非特异性结合的载体核酸的非特异性碱基、通用碱基和接头的存在、数量和位置控制。由于上述因素与平行或反向平行结合(其为肽复合物的互补结合模式)的组合，控制是可能的。
在本发明中，核酸复合物的颗粒的尺寸可为5nm至300nm，优选10nm至80nm，最优选15nm至70nm。
在本发明中，核酸复合物的粒度可通过调节生物活性肽核酸与载体肽核酸之间的电荷平衡来控制。具体地，当载体肽核酸的正电荷增加时，颗粒的尺寸减小，然而当载体肽核酸的正电荷超过一定水平时，颗粒的尺寸增加。另外，作为决定粒度的另一个重要因素，根据形成复合物的生物活性肽核酸的电荷的与总体载体肽核酸的适当电荷平衡决定粒度。
根据本发明的载体肽核酸的正电荷数为1至7(意味着包括1至7个带正电荷的单体)，优选为2至5个，最优选为2至3个，并且作为净电荷平衡，生物活性核酸具有0至5个负电荷，优选0至3个负电荷。
在本发明中，核酸复合物可通过在合适的条件下将生物活性核酸与载体肽核酸杂交来制备。
如本文中所用，术语“杂交”意指互补的单链核酸形成双链核酸。当两条核酸链之间的互补性完全匹配或存在一些错配的碱基时，就可能发生杂交。杂交所需的互补性程度可以根据杂交条件而变化，特别是可由结合温度来控制。
如本文中所用，术语“靶基因”意指被激活、抑制或标记的核酸序列(碱基序列)，与术语“靶核酸”没有区别，这两个术语在本说明书中可互换使用。
在本发明中，当含有靶基因的靶核酸(碱基序列)在体外或体内与复合物接触(结合)时，生物活性核酸从载体肽核酸中释放出来，从而具有生物活性。
在本发明中，可使用核酸复合物预防和治疗的疾病可以根据核酸复合物中的生物活性核酸所结合的靶基因来确定。在本发明中，生物活性核酸所结合的靶基因是TLR2或IL-4Rα。
因此，在本发明中，可使用核酸复合物预防和治疗的疾病优选用于皮肤病(例如，银屑病、包括特应性皮炎在内的特应性疾病和诸如黑色素瘤的皮肤癌、瘢痕疙瘩疾病、诸如皮肤损伤和色素沉着等疾病)、肿瘤或癌症、炎性疾病、老年黄斑变性、糖尿病性视网膜病、罕见和严重的疾病、心血管疾病、代谢疾病等的治疗，但不限于此。
同时，在本发明中，术语“治疗性组合物”可以与“药物组合物”互换使用，并且表示包含核酸复合物(其包含生物活性核酸和与根据本发明的核酸结合的载体肽核酸)作为活性成分的组合物，并且可以进一步包含与核酸复合物结合的用于治疗期望的疾病的治疗性药物。
根据标准制药实践，本发明的治疗性组合物可被配制成可通过皮肤递送的形式。除了活性成分之外，这些制剂还可包含添加剂，诸如载体、赋形剂、佐剂或稀释剂，所述添加剂适合于呈药学上可接受的，特别适用于皮肤的形式的制剂。
优选地，可以以水溶液、凝胶、软膏、霜剂、洗剂、糊剂、涂剂(smear)或贴剂的形式配制根据本发明的组合物。
最优选地，可以以水溶液的形式配制组合物，水溶液可呈蒸馏水和缓冲溶液的形式。
术语“生理上可接受的”是指不损害化合物的生物活性和物理性质的性质。
术语“载体”被定义为促进核酸复合物运输到细胞或组织中的化合物。例如，二甲基亚砜(DMSO)是常用的载体，其有助于将许多有机化合物掺入到生物体的细胞或组织中。
术语“稀释剂”被定义为稳定靶化合物的生物活性形式并在溶解靶化合物的水中稀释的化合物。溶解在缓冲溶液中的盐在本领域中用作稀释剂。一种常用的缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水，因为其模拟了人体体液的盐度。因为缓冲盐可以在低浓度下控制溶液的pH，所以缓冲稀释剂很少改变化合物的生物活性。
可将本发明中含有核酸复合物的物质单独地或作为与其它活性成分或合适的载体或赋形剂混合的药物组合物(即，在组合疗法中)向患者施用。
适用于本发明的药物组合物包括以有效达到其预期目的的量包含活性成分的组合物。更具体地说，治疗有效量意指有效延长待治疗受试者的生存期或预防、缓解或减轻疾病症状的化合物的量。本领域技术人员可以确定治疗有效量，特别是考虑到本文提供的详细描述的情况下确定治疗有效量。
如本文中所用，术语“预防”意指通过施用(或施加)含有能够渗透皮肤的核酸复合物的治疗性组合物来预防疾病发作或抑制其进展的任何作用。
如本文中所用，术语“缓解”是指通过施用(或施加)含有能够渗透皮肤的核酸复合物的治疗性组合物，至少降低与待治疗的疾患相关的参数(例如症状的严重度)的程度的任何作用。
另外，如本文中所用，术语“治疗”是指其中通过施用(或施加)含有能够渗透皮肤的核酸复合物的治疗性组合物来缓解或消除疾病症状的任何作用。
在本发明中，能够渗透皮肤的核酸复合物可以使用载体诸如脂质体来施用(或施加)。脂质体可使复合物能够靶向特定组织诸如淋巴组织，或者选择性靶向感染细胞，并且还可促进含有复合物的组合物的半衰期延长。脂质体包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、薄层等。可将待递送的复合物作为脂质体的一部分，单独地或与结合某些细胞、淋巴细胞中的主要受体的分子(诸如结合CD45抗原的单克隆抗体)组合地或与其它治疗性组合物组合地并入此类制剂中。因此，用本发明的预定复合物填充或修饰的脂质体(其递送核酸复合物组合物)可被导向淋巴细胞的部位。
根据本发明使用的脂质体通常由标准囊泡形成脂质形成，所述标准囊泡形成脂质包括中性和带负电荷的磷脂和诸如胆固醇的甾醇类。一般而言，例如，在考虑脂质体在血流中的稳定性、酸不稳定性和脂质体的大小的情况下选择脂质。脂质体的制备可采用多种方法。例如，可使用以下文献中描述的方法[Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467,1980)和美国专利第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号和第5,019,369号]。
另一方面，本发明涉及预防或治疗皮肤病的方法，所述方法包括向受试者施用能够渗透皮肤的核酸复合物，所述核酸复合物包含具有能够与TLR2或IL-4Rα结合的序列的生物活性核酸和载体肽核酸，所述生物活性核酸与所述载体肽核酸相互互补结合。
可将含有根据本发明的核酸复合物的组合物以药学有效量施用于皮肤，以治疗皮肤病或抑制(或缓解)皮肤病症状。药学有效量可根据诸如皮肤病的类型、患者的年龄和体重、症状的特征和程度、当前疗法的类型、进行的治疗的次数以及施用形式和途径等各种因素而变化，并且可以由本领域的专家容易地确定。本发明的组合物可以与上述药理学或生理学组分组合，同时或依次施用，并且可以与另外的常规治疗剂组合，依次或同时施用。施用可以以一次或多次进行。
如本文中所用，术语“受试者”是指患有可通过向其施用(施加)根据本发明的能够渗透皮肤的核酸复合物来缓解、抑制或治疗的疾患或疾病或有患所述疾患或疾病的风险的哺乳动物，优选人。
另外，施用(施加)到人体的本发明化合物的量可根据患者的年龄、体重和性别、施用(施加)形式、健康状况和疾病的严重程度而变化，并且基于体重70kg的成年患者通常为0.001至1000mg/天，优选0.01至500mg/天，并且可以根据医生或药剂师的处方以规则的时间间隔一天一次或者一天数次以多个剂量(以分份的方式)施用(施加)。
例如，通过在细胞培养物或实验室动物中进行标准制药程序以确定LD50(对群体的50％致死的剂量)、ED50(对群体的50％提供治疗效果的剂量)和IC50(对群体的50％提供治疗和抑制效果的剂量)来评估含有本文所述的能够渗透皮肤的核酸复合物的组合物的毒性和治疗功效。某一剂量的毒性与治疗效果之比称为治疗指数，可表示为LD50与ED50(或IC50)的比率。具有高治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养测定中获得的数据可用于估计用于人应用的剂量范围。这种化合物的施用或施加量(剂量)优选在包括ED50(或IC50)的循环浓度范围内，且几乎没有或没有毒性。
如本文中所用，术语“施用”是指通过任何合适的方法将本发明的药物组合物引入受试者体内的行为，并且可通过任何不同的途径进行施用，无论是口服还是肠胃外施用，只要其能够使组合物到达靶组织即可。
本发明的药物组合物可通过能够使组合物到达靶组织的任何常规途径施用。根据需要，可将本发明的药物组合物腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、鼻内、肺部或直肠施用，但不限于此。另外，所述组合物可通过能够将活性物质递送至靶细胞的任何装置施用。
可以以药学有效量施用本发明的药物组合物。本文使用的术语“药学有效量”是指用于以适用于医学治疗或预防的合理受益/风险比治疗或预防疾病的足够量。有效量的确定取决于多种因素，包括疾病的严重程度、药物的活性、患者的年龄、体重、健康和性别、患者对药物的敏感性、施用时间、施用途径以及所用的本发明组合物的排泄速率和治疗期、与本发明组合物组合或同时使用的药物，以及药学领域熟知的其它因素。
本发明的药物组合物可以作为单一治疗剂或与其它治疗剂组合，依次地或同时施用。本发明的药物组合物可以以单剂量或多剂量施用。考虑到这些因素，重要的是以足以实现最大功效而无副作用的最小量施用组合物。
另外，根据本发明的药物组合物的剂量(施用量)可由本领域技术人员考虑使用目的、疾病的严重程度、患者的年龄、体重、性别和病史或用作活性成分的物质来确定。例如，可以以10mg/kg至100mg/kg，更优选10mg/kg至30mg/kg的日剂量向成人施用药物组合物。本发明组合物的施用频率没有特别限制，并且该组合物可以一天施用1至3次，或者可以分成多个剂量并全天施用。
另一方面，本发明涉及能够渗透皮肤的核酸复合物用于预防或治疗皮肤病中的用途，所述核酸复合物包含具有能够与TLR2或IL-4Rα结合的序列的生物活性核酸和载体肽核酸，所述生物活性核酸与所述载体肽核酸相互互补结合。
另一方面，本发明涉及能够渗透皮肤的核酸复合物用于制备用于预防或治疗皮肤病的药物的用途，所述核酸复合物包含具有能够与TLR2或IL-4Rα结合的序列的生物活性核酸和载体肽核酸，所述生物活性核酸与所述载体肽核酸相互互补结合。
本发明的化妆品组合物可用于任何施加到皮肤上的制剂。更具体地，化妆品组合物可被制备成选自以下物质的制剂：化妆品产品，诸如皮肤洗剂、皮肤软化剂、皮肤调色剂、收敛剂、洗剂、乳液、保湿洗剂、营养洗剂、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素(essence)、营养精华素(nutrition essence)、喷雾剂和包装，以及肥皂、清洁泡沫、清洁洗剂、清洁霜、身体洗剂、身体霜、身体油、身体清洁剂、香波、软膏、贴剂(水凝胶减肥贴剂)等，但不限于此。另外，化妆品组合物可被制备为与皮肤接触的皮肤接触材料，诸如化妆品、去垢剂或纤维。
可以根据目的适当选择本发明的化妆品组合物。
当本发明的制剂是糊剂、面霜或凝胶时，其载体组分可以是动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等。
当本发明的制剂是粉末或喷雾剂时，其载体组分可以是乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末。特别地，当本发明的制剂是喷雾剂时，其还可包含推进剂，诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
当本发明的制剂是溶液或乳液时，其载体组分可以是溶剂、增溶剂或乳化剂。载体组分的实例包括水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯。
当本发明的制剂是悬浮液时，其载体组分可以是液体稀释剂诸如水、乙醇或丙二醇，助悬剂诸如乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯或聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。
当本发明的制剂是含表面活性剂的清洁剂时，其载体组分可以是脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸酯、咪唑啉鎓衍生物(imidazoliniumderivative)、甲基牛磺酸酯、肌氨酸酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化的甘油脂肪酸酯。
另外，可通过将除了上述组分之外，还有预定量的各种已知成分与施加到皮肤或粘膜上的化妆品成分或外用药物或准药物混合来制备本发明的皮肤外用制剂。
具体而言，本发明的化妆品组合物可以根据每个配方中的需要通过与通常掺混在化妆品中的其它成分混合来制备。可以添加的掺混成分包括：抗氧化剂(例如，羧酸，诸如抗坏血酸和柠檬酸；或酚类诸如生育酚和二丁基羟基甲苯)、湿润剂(例如，二醇诸如甘油、丙二醇、二丙二醇和1,3-丁二醇；有机盐，诸如透明质酸；酰胺诸如尿素)、增稠剂(例如，聚合物化合物诸如聚乙二醇和；纤维素诸如羧甲基纤维素钠和羧丙基纤维素)、缓冲剂(例如，有机酸诸如柠檬酸、乳酸和酒石酸；无机酸，诸如盐酸和硼酸；盐，诸如磷酸二氢钠和柠檬酸钠；有机碱，诸如三乙醇胺；和无机碱诸如氢氧化钠和氢氧化钾)、吸附剂(例如，水合硅酸铝诸如高岭土和膨润土；和无机盐，诸如氢氧化镁铝和氢氧化铝)、碱(例如，有机物质，诸如白凡士林、Tween60、Tween80、液体石蜡、蜂蜡、凡士林、蓖麻油、硅酮油、氢化蓖麻油、天然橡胶、棕榈油脂肪酸二乙醇酰胺、聚氧乙烯氢化蓖麻油、天然橡胶胶乳和1，3-戊二烯共聚物树脂；聚合物化合物，诸如聚丁烯、合成橡胶(SBR)、聚乙二醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯乙二醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基十六烷基醚、硅酮、淀粉丙烯酸酯300、聚丙烯酸钠、甲基丙烯酸正丁酯·丙烯酸酯共聚物和羧基乙烯基聚合物；脂肪酸，诸如硬脂酸；醇，诸如鲸蜡醇和肉豆蔻醇；脂肪酸酯诸如肉豆蔻酸十八烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯和辛酸十六烷基酯、溶剂(例如，乙醇、异丙醇、1,3-丁二醇、正十八醇、克罗米通和碳水化合物诸如三(辛酸·癸酸)甘油)、稳定剂(例如无机盐诸如偏磷酸钠、氧化锌和氧化钛；有机盐诸如聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠和月桂基硫酸钠)、粘结剂(例如，聚合物化合物诸如聚丙烯酸钠和二丙二醇)、乳化剂(例如，碳水化合物诸如脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、D-山梨醇、聚甘油单月桂酸酯和聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠)、表面活性剂(例如，聚合物化合物诸如聚甘油单月桂酸酯和聚氧乙烯油醇醚)、芳香剂、着色剂(染料、色素)、金属阻断剂、除臭剂、涂料、紫外线吸收剂、紫外线散射剂、维生素等。
根据需要施加的皮肤区域，可以以适当的量将本发明的化妆品组合物施加于皮肤，并且可以根据需要每天重复使用一次至数次。可根据受试者的皮肤状况、制剂、待施用的受试者的年龄、性别、体重和反应敏感性、施用期等，按需要适当地增加或减少施用量和施用次数。
本领域技术人员可以适当地选择对期望效果有效的剂量。所述组合物的制剂可以是单剂量或多剂量制剂，并且每日有效量可以任选地以多个剂量多次施用。
可通过诸如离子电渗疗法、超声波电渗疗法、电穿孔、微电极贴片、机械压力、渗透压梯度、封闭疗法或显微注射疗法或其组合的方法向皮肤施加本发明的药物或化妆品组合物，以提高活性成分的渗透性。
实施例
在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员来说，很明显，以下实施例仅用于说明本发明，不应理解为限制基于本发明的主题的本发明的范围。
实施例1：生物活性核酸和载体肽核酸以及使用它们制备复合物
为了验证本发明的核酸复合物对特应性皮炎的效果，将特应性皮炎靶向基因，即TLR2(Toll样受体2)和IL-4Rα(白细胞介素-14受体α)用作靶基因。TLR2，一种当过敏原或细菌渗入皮肤时表达的基因，在特应性皮炎患者中过表达，从而由于皮肤中炎性细胞因子引起的炎症增强而使特应性皮炎恶化。因此，TLR2被预测为特应性皮炎的一个重要靶标。
已知IL-4Rα的突变(其为特应性皮炎患者的突变特征)是通过破坏T细胞的分化中分化为T辅助1/2型的稳态而诱发特应性皮炎的因素。
为了确定对特应性皮炎的治疗效果，使用反义肽核酸(反义PNA)作为针对TLR2和IL-4Rα的生物活性核酸。
用作本发明对照的生物活性核酸(反义PNA)具有由SEQ ID NO:1和3表示的序列，并且用于确定对特应性皮炎的治疗效果的生物活性核酸(反义PNA)具有由SEQ ID NO:2和4表示的序列。
本实施例中使用的基于肽-核酸的生物活性核酸将作为促进内体逃逸的肽的GLFDIIKKIAESF(SEQ ID NO:19)结合至其5’末端，其核苷酸序列、单体修饰和其结构示于下表1中。下表1显示了用作对照的生物活性核酸和载体肽核酸的序列信息，以及用于确定作为靶向TLR2和IL-4R的特应性皮炎治疗剂的效果的生物活性核酸和载体肽核酸的序列信息。SEQ ID NO:1和2的生物活性核酸以及SEQ ID NO:5至13的载体核酸靶向TLR2，并且SEQID NO:3和4的生物活性核酸以及SEQ ID NO:14到18的载体核酸靶向IL-4Rα。
本发明中使用的所有肽核酸均是在PANAGENE(Korea)通过HPLC纯化合成的。根据本发明实施方案的所有载体肽核酸中的一些将用于促进内体逃逸的肽诸如组氨酸(10)结合至其5’或3’末端，并且具有由SEQ ID NO:5至18表示的序列(表1)。
[表1]
用于验证对特应性皮炎的治疗效果的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
/>
为了赋予电性质，单体的修饰被设计成使得肽核酸骨架含有赖氨酸(Lys,K(+))作为正电荷，以及经修饰的肽核酸骨架含有谷氨酸(Glu,E(-))作为负电荷。
各自的生物活性核酸和载体肽核酸的组合在DMSO存在的情况下杂交，产生含有生物活性核酸和载体肽核酸的复合物。
实施例2：在特应性皮炎样细胞模型中使用能够渗透皮肤的核酸复合物的疗效的分析
根据实施例1，使用含有以TLR2作为靶基因的生物活性肽核酸和载体肽核酸的能够渗透皮肤的核酸复合物分析对特应性皮炎的疗效，所述生物活性肽核酸和载体肽核酸被制备成具有下表2的结构。
[表2]
用于抑制TLR2活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
/>
实施例2-1：细胞培养
在5％(v/v)CO2存在的情况下，将从CLS(CLS Cell Lines Service,Germany)获得的人角质形成细胞(HaCaT)在37℃下于补充有10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(Dulbecco改良Eagle培养基，Wellgene,Korea)中孵育。为了构建特应性皮炎样细胞模型，用5ng/mL的屋尘螨提取物和5μM的DNCB(2-二硝基氯苯)处理细胞，并孵育24小时。
实施例2-2：使用MTT测定分析角蛋白细胞系的细胞活力
在与实施例2-1相同的实验条件下，将人来源的角蛋白细胞系以6×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中，孵育24小时，然后用含有生物活性核酸和载体肽核酸的复合物处理，制备成具有表2的结构。所得细胞系用5mg/mL的于1X PBS中的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)溶液以20μL/孔处理4小时。孵育后，用分光光度计测量并分析OD(光密度)。
本实施例中使用的核酸复合物组合示于下表3中。
[表3]
用于在角蛋白细胞系中进行细胞活力分析的核酸复合物的组合
项 核酸复合物
1 SEQ ID NOS:2和6
2 SEQ ID NOS:2和7
3 SEQ ID NOS:2和8
4 SEQ ID NOS:2和9
5 SEQ ID NOS:2和10
6 SEQ ID NOS:2和11
7 SEQ ID NOS:2和12
8 SEQ ID NOS:2和13
结果，如可从图1a至图1c看到的，在使用屋尘螨提取物或DNCB诱导的特应性皮炎样细胞模型中，细胞活力由于核酸复合物而以浓度依赖性方式降低。
实施例2-3：使用蛋白质印迹法分析基因表达
在与实施例2-1相同的条件下，将人来源的角蛋白细胞系以1×105个细胞/孔的密度接种在6孔板中，孵育24小时，用含有生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物处理，并孵育24小时、48小时和72小时。向每个孔中加入30μL RIPA缓冲液以获得蛋白质裂解物。蛋白质裂解物中的蛋白质使用BCA测定试剂盒(Thermo Fisher,USA)进行分析，并使用电泳根据大小分离30μg蛋白质。转移到PVDF膜后，用TLR2(Santa Cruz Biotech.,USA)、p-NFkB(CellSignaling Technology,USA)、MyD88(Cell Signaling Technology,USA)和TARC(Abcam,USA)作为一级抗体以1:1000处理所述蛋白质，使其在4℃下放置一天。结果用1X TBS-T洗涤，以1:2000用山羊抗兔和山羊抗小鼠二级抗体(Santa Cruz Biotech.,USA)处理，并使其在室温下放置2小时。结果用SupersignalTM West Femto最大灵敏度底物(Thermo Fisher,USA)处理，使用Image600(Amersham,Germany)仪器分析角蛋白细胞系中靶基因表达的抑制效率。
在该实施例中，选择了通过实施例2-2发现具有效果的核酸组合，并分析了使用屋尘螨和引起病屋综合征的化学物质诱发的特应性皮炎样细胞模型中的TLR2和下游基因表达的变化。核酸组合示于下表4中。
[表4]
用于角质形成细胞系中TLR2和下游基因表达分析的核酸复合物的组合
对于表4中核酸复合物的组合，分析了特应性皮炎样细胞模型中TLR2蛋白和下游基因的表达模式。
结果，如可从图2a至图2c所看到的，随着时间的推移，靶基因的表达和下游基因的表达被SEQ ID NO:2至7的核酸复合物组合以浓度依赖的方式最大程度地抑制。
实施例3：在特应性皮炎动物模型中使用能够渗透皮肤的核酸复合物的疗效的分析
实施例3-1：在使用屋尘螨提取物诱发了特应性皮炎的动物模型中分析特应性皮 炎的表型效应
对NC/Nga小鼠的背部进行脱毛，并且在总共3周的时间内每周两次向其施加100mgAD霜(屋尘螨提取物霜，Biostir,Japan)，以构建使用屋尘螨诱发了特应性皮炎的动物模型。动物模型每周用霜剂型核酸复合物总共处理两次，对特应性皮炎动物模型的表型进行成像，并用ImageJ测量背部毛发生长的程度。
在该实施例中，选择通过实施例2-2发现具有效果的核酸组合，并在使用屋尘螨提取物诱发的特应性皮炎样动物模型中分析表型和组织学发现以及TLR2和下游基因表达的变化。核酸复合物组合如下表5所示。
[表5]
用于在特应性皮炎动物模型分析治疗效果的核酸复合物的组合
项 核酸复合物
PNA SEQ ID NOS:2和12
结果表明，在核酸复合物组中，特应性皮炎表型减少(图3a)，并且与诱发有特应性皮炎的动物组相比，施用了核酸复合物的组中由于皮肤损伤导致的脱发减少(在图3a中，“霜剂对照”是包含霜剂制剂但不包含核酸复合物的组，“阳性对照”是包含地塞米松(一种常规治疗剂)的霜剂制剂)。
实施例3-2：血清中IgE和TARC浓度的变化分析
在与实施例3-1相同的条件下进行的动物实验中，在最后一天通过眼眶采血收集小鼠血液，并使血液在室温下放置2小时或更长时间，使用离心机(14,000rpm,15min)收集血清。使用IgE ELISA试剂盒(Koma Biotech,Korea)和TARC ELISA试剂盒(R&D system,USA)提供的实验方法，测量收集的血清以确定血清中IgE和TARC的浓度。
结果，如可从图3b和图3c所看到的，与诱发有特应性皮炎的对照组相比，在用核酸复合物治疗的组中，IgE和TARC的浓度降低到与阴性对照组的水平相似的水平。
实施例3-3：使用蛋白质印迹法分析基因表达
在与实施例3-1相同的条件下进行实验，以获得活检小鼠背部组织的一部分，并向每个孔中加入200μL RIPA缓冲液以获得蛋白质裂解物。蛋白质裂解物中的蛋白质使用BCA测定试剂盒(Thermo Fisher,USA)进行分析，并使用电泳根据大小分离30μg蛋白质。转移到PVDF膜后，用TLR2(Santa Cruz Biotech.,USA)、p-NFkB(Cell Signaling Technology,USA)和MyD88(Cell Signaling Technology,USA)作为一级抗体以1:1000处理所述蛋白质，使其在4℃下放置一天。结果用1X TBS-T洗涤，以1:2000用山羊抗兔和山羊抗小鼠二级抗体(Santa Cruz Biotech.,USA)处理，并使其在室温下放置2小时。结果用SupersignalTM WestFemto最大灵敏度底物(Thermo Fisher,USA)处理，使用Image600(Amersham,Germany)仪器分析角蛋白细胞系中靶基因表达的抑制效率。
如可从图3d中所看到的，在用核酸复合物处理的特应性皮炎样动物模型组织的组中，TLR2的表达和下游基因的表达减少。
实施例3-4：使用H&E染色在诱发了特应性皮炎的动物模型中进行表型分析
在与实施例3-1相同的条件下进行实验，在实验的最后一天对小鼠背部组织进行活组织检查，并将所述背部组织在4％福尔马林溶液中固定一天，将固定的组织包埋在石蜡中，切成5μm的切片，并将其安装在载玻片上。用苏木精:伊红染色溶液将安装好的组织染色一定的时间段，用1X PBS洗涤，并在显微镜下进行分析。
结果，如可从图3e中所看到的，与诱发有特应性皮炎的对照组相比，用核酸复合物治疗的组中透皮组织的厚度和炎性细胞的数量减少。
实施例3-5：使用免疫染色对诱发有特应性皮炎的动物模型中的组织中的炎症标 志物的分析
在与实施例3-1相同的条件下进行实验，在实验的最后一天对小鼠背部组织进行活组织检查，并在4％福尔马林溶液中固定一天，将固定的组织包埋在石蜡中，切成5μm切片，并将所述切片安装在载玻片上。将安装好的组织在0.5％BSA溶液中封闭1小时，并用CD3和CD11c一级抗体溶液处理1天。随后，除去初级抗体溶液，用1X PBS洗涤，用二级抗体溶液处理，使其在室温下放置2小时，并通过DAB染色进行分析。
结果，如可从图3f至图3g中所看到的，与诱发有特应性皮炎的对照组相比，在核酸复合物组中作为组织中炎症标志物的CD3和CD11c减少，并且当比较时还观察到数值较低(图3h)。
实施例4：使用能够渗透皮肤的核酸复合物对特应性皮炎的疗效的分析
根据实施例1，使用含有以IL-4Rα作为靶基因的生物活性肽核酸和载体肽核酸的能够渗透皮肤的核酸复合物分析对特应性皮炎的疗效，所述生物活性肽核酸和载体肽核酸被制备成具有下表6的结构。
[表6]
用于抑制IL-4Rα活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
实施例4-1：细胞培养
在5％(v/v)CO2存在的情况下，将从CLS(CLS Cell Lines Service,Germany)获得的人角质形成细胞(HaCaT)在37℃下于补充有10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(Dulbecco改良Eagle培养基，Wellgene,Korea)中孵育。为了构建特应性皮炎样细胞模型，用10ng/mL的IL-4和10ng/mL的IL-13处理细胞，并孵育24小时。
实施例4-2：使用MTT测定分析角蛋白细胞系的细胞活力
在实施例4-1的实验条件下，将人来源的角蛋白细胞系以6×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中，孵育24小时，然后用含有生物活性核酸和载体肽核酸的复合物处理，制备成具有表5的结构。以20μL/孔的量用5mg/mL的于1X PBS中的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)溶液处理所得细胞系，并孵育4小时。用分光光度计测量并分析OD(光密度)。
本实施例中使用的核酸复合物组合如下表7所示。
[表7]
用于角蛋白细胞系中细胞活力分析的核酸复合物的组合
项 核酸复合物
1 SEQ ID NOS:4和15
2 SEQ ID NOS:4和16
3 SEQ ID NOS:4和17
4 SEQ ID NOS:4和18
结果，如可从图4a至图4b中所看到的，在由IL-4或IL-13诱导的特应性皮炎样细胞模型中，细胞活力由于核酸复合物而以浓度依赖性方式降低。
实施例4-3：使用蛋白质印迹法分析基因表达
在与实施例4-1相同的条件下，将人来源的角蛋白细胞系以1×105个细胞/孔的密度接种在6孔板中，孵育24小时，用含有生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物处理，并各自孵育24小时、48小时和72小时。向每个孔中加入30μL RIPA缓冲液以获得蛋白质裂解物。蛋白质裂解物中的蛋白质使用BCA测定试剂盒(Thermo Fisher,USA)进行分析，并使用电泳根据大小分离30μg蛋白质。转移到PVDF膜后，用一级抗体IL-4Rα(Santa Cruz Biotech.,USA)、p-JAK3(Cell Signaling Technology,USA)和p-stat6(Cell SignalingTechnology,USA)以1:1000处理所述蛋白质，使其在4℃下放置一天。结果用1X TBS-T洗涤，以1:2000用山羊抗兔和山羊抗小鼠二级抗体(Santa Cruz Biotech.,USA)处理，并使其在室温下放置2小时。结果用SupersignalTM West Femto最大灵敏度底物(Thermo Fisher,USA)处理，使用Image600(Amersham,Germany)仪器分析角蛋白细胞系中靶基因表达的抑制效率。
分析了使用IL-4和IL-13的特应性皮炎样细胞模型中IL-4Rα和下游基因表达的变化，所使用的核酸复合物组合显示在下表8中。
[表8]
用于在角蛋白细胞系中进行细胞活力分析的核酸复合物的组合
/>
结果，如可从图5a至图5b所看到的，SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:15的核酸复合物组合以及SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:16的核酸复合物组合在特应性皮炎样细胞模型中抑制IL-4Rα和下游基因表达。
实施例5：使用能够渗透皮肤的核酸复合物对CD4阳性T淋巴细胞的2型辅助性T细胞的分化抑制作用的分析
根据实施例1，使用含有以IL-4Rα作为靶基因的生物活性肽核酸和载体肽核酸的能够渗透皮肤的核酸复合物分析抑制T辅助细胞的分化的效果，所述生物活性肽核酸和载体肽核酸被制备成具有下表5的结构。
实施例5-1：细胞培养
在5％(v/v)CO2存在的情况下，将获自ATCC(美国典型培养物保藏中心，USA)的原初T细胞(Jurkat，CD4+原初T细胞)在37℃下于补充有10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的RPMI-1640培养基(ATCC,USA)中进行孵育。为了促进向2型辅助性T细胞的分化，用10ng/mL的IL-4(图6a)和10ng/mL的IL-4+PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯)+离子霉素(图6b)处理细胞，并各自孵育24小时、48小时和72小时。
实施例5-2：使用蛋白质印迹法分析基因表达
在与实施例5-1相同的条件下，将原初T细胞(Jurkat，CD4+原初T细胞)以2×105个细胞/孔的密度接种在6孔板中，孵育24小时，用含有生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物处理，并各自孵育24小时、48小时和72小时。向每个孔中加入30μL RIPA缓冲液以获得蛋白质裂解物。蛋白质裂解物中的蛋白质使用BCA测定试剂盒(Thermo Fisher,USA)进行分析，并使用电泳根据大小分离30μg蛋白质。转移至PVDF膜后，用一级抗体IL-4Rα(SantaCruz Biotech.,USA)和p-stat6(Cell Signaling Technology,USA)以1:1000处理所述蛋白质，使其在4℃下放置一天。结果用1X TBS-T洗涤，以1:2000用山羊抗兔和山羊抗小鼠二级抗体(Santa Cruz Biotech.,USA)处理，并使其在室温下放置2小时。结果用SupersignalTM West Femto最大灵敏度底物(Thermo Fisher,USA)处理，使用Image600(Amersham,Germany)仪器分析角蛋白细胞系中靶基因表达的抑制效率。
分析了使用IL-4和IL-4+PMA的2型辅助性T细胞分化模型中IL-4Rα和下游基因表达的变化，所使用的核酸复合物组合与下表8中显示的相同。
作为结果，如可从图6a至图6b所看到的，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:15的核酸复合物的组合在特应性皮炎样细胞模型中最高效地抑制IL-4Rα和下游基因的表达。
实施例6：在用2-二硝基氯苯(DNCB)诱发了特应性皮炎的动物模型中使用能够渗透皮肤的核酸复合物对特应性皮炎的疗效的分析
实施例6-1：使用DNCB(2-二硝基氯苯)诱发了特应性皮炎的动物模型中特应性皮 炎的表型效应的分析
使NC/Nga小鼠适应一周，并对其背部进行脱毛，并施用1％DNCB溶液(丙酮:橄榄油＝2:1)以诱发原发性特应性皮炎。然后，在总共4周的时间内每周2次连续加入0.4％DNCB溶液，以构建特应性皮炎诱导的动物模型。在2周的时间内每周用霜剂型核酸复合物处理诱导了特应性皮炎的动物模型2次，用0.4％DNCB溶液处理，并使其静置预定的时期。用霜剂型核酸复合物处理后，对特应性皮炎动物模型的表型进行成像。
在该实施例中，选择通过实施例4和5发现具有效果的核酸复合物，并分析了使用DNCB诱发了特应性皮炎的动物模型中的表型和组织学发现以及IL-4Rα靶基因表达的变化。组合示于下表9中。
[表9]
用于在特应性皮炎动物模型分析治疗效果的核酸复合物的组合
项 核酸复合物
PNA SEQ ID NOS:4和16
结果表明，在核酸复合物组中，特应性皮炎表型减少(图7a)。
实施例6-2：使用蛋白质印迹法分析基因表达
在与实施例6-1相同的条件下进行实验，以获得活检小鼠背部组织的一部分，并向每个孔中加入200μL RIPA缓冲液，以获得蛋白质裂解物。使用BCA测定试剂盒(ThermoFisher,USA)测定了蛋白质裂解物中的蛋白质，并使用电泳根据大小分离30μg蛋白质。转移至PVDF膜后，用一级抗体IL-4Rα(Santa Cruz Biotech.,USA)以1:1000处理所述蛋白质，并使其在4℃下放置一天。结果用1X TBS-T洗涤，以1:2000用山羊抗兔和山羊抗小鼠二级抗体(Santa Cruz Biotech.,USA)处理，并使其在室温下放置2小时。结果用SupersignalTM WestFemto最大灵敏度底物(Thermo Fisher,USA)处理，使用Image600(Amersham,Germany)仪器分析角蛋白细胞系中靶基因表达的抑制效率。
如可从图7b中所看到的，在用核酸复合物处理的组的皮肤组织中，IL-4Rα的表达减少。
实施例6-3：血清中IgE、TARC和IL-4的浓度变化的分析
在与实施例6-1相同的条件下进行的动物实验中，在实验的最后一天通过眼眶采血收集小鼠血液，并将其在室温下放置2小时或更长时间，使用离心机(14,000rpm,15min)收集血清。使用根据IgE和IL-4ELISA试剂盒(Koma Biotech,Korea)和TARC ELISA试剂盒(R&D system,USA)的实验方法测量收集的血清以确定血清中IgE、TARC和IL-4的浓度。
结果，如可从图8a中所看到的，与诱发有特应性皮炎的对照组不同，在用核酸复合物处理的组中，IgE、TARC和IL-4的浓度降低至与阴性对照组相似的水平。
实施例6-4：通过动物行为分析对诱发了特应性皮炎的动物模型中改善瘙痒和红 斑的效果的分析
为了确定改善瘙痒(其是诱发特应性皮炎时出现的典型症状)的效果，在与实施例6-1相同的条件下进行的动物实验中，在诱发特应性皮炎后的第一周进行组间小鼠的行为评价，在最后一周向小鼠施用核酸复合物，并且进行组间小鼠的比较行为评价以确定改善瘙痒的效果。另外，为了确定诱发特应性皮炎时皮肤上出现的红斑症状是否得到改善，在诱发特应性皮炎期间观察到红斑症状的表达，并且在诱发特应性皮炎完成时和施用核酸复合物时观察到改善红斑症状的效果。
结果，如可从图8b中所看到的，与诱发有特应性皮炎的对照组相比，在用核酸复合物处理的组中瘙痒和红斑症状得到显著改善。
实施例6-5：使用H&E染色在诱发了特应性皮炎的动物模型中进行表型分析
在与实施例6-1相同的条件下进行实验，在实验的最后一天对小鼠背部组织进行活组织检查，并将所述背部组织在4％福尔马林溶液中固定一天，将固定的组织包埋在石蜡中，切成5μm的切片，并将其安装在载玻片上。用苏木精:伊红染色溶液将安装好的组织染色一定的时间段，用1X PBS洗涤，并在显微镜下进行分析。
结果，如可从图9a中所看到的，与诱发有特应性皮炎的对照组不同，在用核酸复合物处理的组中，透皮组织的厚度和炎性细胞的数量减少。
实施例6-6：使用免疫染色在诱发了特应性皮炎的动物模型中的组织中分析炎症 标志物
在与实施例6-1相同的条件下进行实验，在实验的最后一天对小鼠背部组织进行活组织检查，并将所述背部组织在4％福尔马林溶液中固定一天，将固定的组织包埋在石蜡中，切成5μm的切片，并将其安装在载玻片上。将安装好的组织在0.5％BSA溶液中封闭1小时，并用CD3和CD11c一级抗体溶液处理1天。随后，除去初级抗体溶液，用1X PBS洗涤，用二级抗体溶液处理，使其在室温下放置2小时，并通过DAB染色进行分析。
结果，如可从图9b中所看到的，与诱发有特应性皮炎的对照组相比，在核酸复合物组中CD3和CD11c(其为组织中的炎症标志物)减少，并且当比较时，还观察到其数值较低。
【工业适用性】
根据本发明的包含靶向TLR2或IL-4Rα的生物活性核酸和载体肽核酸(所述生物活性核酸与所述载体肽核酸相互互补结合)的能够渗透皮肤的核酸复合物，显示出高皮肤渗透性和皮肤保持力(持久性)，因此可用于预防、改善或治疗皮肤病诸如特应性皮炎。
虽然已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域的技术人员将会理解，提供该描述是为了阐述用于说明目的的优选实施方案，并且不应该被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求书及其等同物来限定。
【无序列文本】
附上电子文件。

Claims (10)

1.包含能够渗透皮肤的核酸复合物的药物组合物在制备用于预防、改善或治疗皮肤病的药物中的用途，所述核酸复合物包含具有能够与IL-4Rα基因结合的序列的生物活性核酸；和载体肽核酸，所述载体肽核酸与作为活性成分的所述生物活性核酸互补结合；
其中所述生物活性核酸，其由5'-GLFDIIKKIAESF-O-AAG(-)CC(+)ACC(-)CC(+)ATT(-)GG-O-K的序列表示；其中所述载体肽核酸由选自包含SEQ ID NO：15-18的序列表示，其中，所述生物活性核酸为肽核酸，所述生物活性核酸总体上带负电荷或为中性，所述载体肽核酸整体带正电荷；所述皮肤病为特应性皮炎。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物活性核酸或所述载体肽核酸具有进一步结合至促进内体逃逸的物质的5’末端或3’末端。
3.根据权利要求2所述的用途，其中促进内体逃逸的所述物质包括选自包含肽、脂质纳米颗粒、多聚体纳米颗粒、聚合物纳米球、无机纳米颗粒、基于阳离子脂质的纳米颗粒、阳离子聚合物和pH敏感性聚合物的组中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述肽是GLFDIIKKIAESF(SEQ ID NO:19)或聚组氨酸10。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述载体肽核酸包含至少一种γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体，以便所述载体肽核酸总体上具有正电荷。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述γ-或α-骨架修饰的肽核酸单体包含的含有带正电荷的氨基酸的单体比包含的含有带负电荷的氨基酸的单体多，以便所述载体肽核酸总体上具有正电荷。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述带正电荷的氨基酸包括至少一个选自包含赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸(DAB)和鸟氨酸(Orn)的组中带正电荷的氨基酸。
8.根据权利要求6所述的用途，其中所述带负电荷的氨基酸是谷氨酸(Glu，E)或天冬氨酸(Asp，D)。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述核酸复合物的总电荷为正。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述核酸复合物具有皮肤保持力和皮肤渗透性。
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