CN108623694A - 血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽f56的衍生物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物及应用，本发明的血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物是在血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的结构基础上连接MIPA‑AEEA‑基团而构成的一种肽衍生物。该肽衍生物除保持F56的拮抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)与其受体1(VEGFR1)结合作用、具有抗血管生成和抗肿瘤活性外，其作用时间较多肽F56具有明显延长，可用于抗血管生成及抗肿瘤治疗。

Description

血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物及应用
技术领域
本发明是关于一种血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物及应用，具体地说，本发明是关于一种血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物、该衍生物的制备方法、以及该衍生物在抗血管生成及抗肿瘤治疗领域中的应用。
背景技术
恶性肿瘤的生长和转移有赖于新生血管的形成，如果没有血管的生成，肿瘤将长期处于直径小于1.5～2mm的“休眠”状态。而针对抗血管生成的治疗策略具有抗瘤谱广、不易产生耐药及药物易于到达靶部位等特点，故这一策略已被认为是肿瘤治疗的最有前景的手段之一。抗血管生成药物如VEGF抗体Avastin等已成功用于对肿瘤的治疗。目前在美国已有数十种不同类型的血管生成阻断剂处于不同的临床试验期；国内在该领域的研究与国外有较大差距，进入临床试验且具自主知识产权的血管生成阻断剂也极为有限，急需加强该领域的自主开发研究。
在众多促血管生成因子当中，血管内皮细胞生长因子(Vascular EndothelialGrowth Factor,VEGF)是公认的主要的诱导血管生成的物质，它能强烈促进血管内皮细胞的有丝分裂和新生血管形成，是肿瘤血管生成的最有效刺激因子，与肿瘤的生长发展密切相关。VEGF不但可通过表达于血管内皮细胞膜上VEGF受体VEGFR1(Flt1)和VEGFR2的结合促进内皮细胞的增殖和血管的生成，进而促进肿瘤的生长和转移，同时也可以作用于肿瘤细胞的VEGF受体，直接促进肿瘤细胞的增殖和侵袭转移因此，VEGF及其受体也成为抗血管生成的最重要靶点。
本案发明人所在课题组在前期工作中利用VEGF受体VEGFR1筛选噬菌体肽库，获得了一个具有中和VEGF活性及抑制荷瘤小鼠肿瘤生长的含12个氨基酸的多肽F56，该多肽可以通过抑血管生成而发挥抗肿瘤生长和转移作用，有潜在的临床应用前景，相关研究结果已发表在Int.J.Cancer等杂志，并已获得北京市科技进步二等奖(肿瘤细胞的VEGF自分泌及噬菌体肽库中VEGF受体阻断剂的筛选，2004)；作为成果的一部分，在2012年也获得了国家科学技术进步奖一等奖(肿瘤血管生成机制及其在抗血管生成治疗中的应用)。关于多肽F56的应用已分别获得中国发明专利权(作为VEGF受体Flt-1拮抗剂的肽，发明专利号：ZL01823615.4)及美国发明专利权(Antagonist peptides to VEGF receptor Flt-1,发明专利号：US 7,250,395B2)。
然而，虽然多肽F56在体内外实验中表现出良好的抗血管生成及抑制肿瘤生长和转移的作用，但其半衰期过短，这是将其推向临床应用所面临的重要问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物，其作用时间较多肽F56具有显著延长。
本发明的另一目的在于提供所述F56的衍生物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述F56的衍生物的应用。
一方面，本发明提供了一种血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物。该衍生物是在血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的基础上连接MIPA-AEEA-基团而构成的肽衍生物，本发明中亦称其为F56修饰肽或F56修饰多肽。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，是利用MIPA-AEEA-基团中的AEEA-基团(2-amino-ethoxy-2-ethoxyacetic acid)与多肽F56连接，而MIPA-基团(maleimidopropionic acid)在体内正常生理条件下即可与位于白蛋白34位的半胱氨酸进行偶联，形成位置特异的白蛋白修饰肽。
根据本发明的具体实施方案，本发明的F56修饰肽，其中，MIPA-AEEA-基团是连接于多肽F56的氨基端、羧基端或中间区域。
在本发明的一些具体实施方案中，MIPA-AEEA-基团连接于多肽F56的氨基端，构成修饰肽F56-AM，其具体结构为MIPA-AEEA-WHSDMEWWYLLG；在本发明的另一些具体实施方案中，MIPA-AEEA-基团连接于多肽F56的氨基酸序列的中间区域，构成修饰肽F56-BM，其具体结构为WHSDMEWK(-AEEA-MIPA)YLLG；在本发明的另一些具体实施方案中，MIPA-AEEA-基团连接于多肽F56的羧基端，构成修饰肽F56-CM，其具体结构为WHSDMEWWYLLGK-AEEA-MIPA。
其中，MIPA-AEEA结构式为：
根据本发明的具体实施方案，本发明的F56修饰肽具有如下式(1)、式(2)或式(3)所示结构：
另一方面，本发明还提供了制备所述F56修饰肽的方法。该方法包括：
按照从C端到N端的顺序合成所述F56修饰肽结构中的氨基酸序列，并链接Fmoc-NH-PEG2-CH2-COOH和MIPA，制备得到所述F56修饰肽。
另一方面，本发明还提供了所述F56修饰肽的应用。本发明中主要是关于该修饰肽在抗血管生成及抗肿瘤治疗领域中的应用。
本发明的F56修饰肽，除保持F56的拮抗血管内皮细胞生长因子(以下简称VEGF)与其受体1(以下简称VEGFR1)结合作用、具有抗血管生成和抗肿瘤活性外，其作用时间较多肽F56具有显著延长，可用于抗血管生成和/或抗肿瘤治疗。从而，本发明提供了所述的F56修饰肽在制备用于抗血管生成和/或抗肿瘤治疗的制剂中的应用。
本发明的F56修饰肽，可以在体外温和条件下与人血清白蛋白(HSA)偶联形成复合物，偶联产物经质谱检测可以看到明显的特征峰。三种修饰肽中F56-AM及F56-CM与HSA结合效果更好。此外，发明人的研究结果还表明，当F56修饰肽F56-CM与HSA以不同分子比进行体外偶联反应时，偶联产物峰面积也有所不同，当F56-CM过量时，体外反应后存在游离的F56-CM修饰肽。而当F56-CM与HSA以1:1的比例进行反应或HSA过量时，未检测到游离的F56-CM，其与HSA形成稳定的共价复合物。从而，本发明还提供了所述的F56修饰肽在制备用于与人血清白蛋白(HSA)偶联形成复合物的制剂中的应用。本发明还提供了所述的F56修饰肽与人血清白蛋白(HSA)偶联形成的复合物(或称F56修饰肽与人血清白蛋白的结合物)。
本发明的F56修饰肽，具有抑制VEGF引起的内皮细胞促管状形成的能力。从而，本发明还提供了所述的F56修饰肽在制备用于抑制内皮细胞管状结构形成的制剂中的应用。
本发明的F56修饰肽，具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的能力。从而，本发明还提供了所述的F56修饰肽在制备用于抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的制剂中的应用。
本发明的F56修饰肽，可以抑制肿瘤的生长。从而，本发明还提供了所述的F56修饰肽在制备用于抑制肿瘤生长的制剂中的应用。
本发明的F56修饰肽，具有抑制肿瘤细胞转移效果。从而，本发明还提供了所述的F56修饰肽在制备用于抑制肿瘤细胞转移的制剂中的应用。
本发明的F56修饰肽或其与人血清白蛋白的结合物，均具有显著的抑制内皮细胞迁移活性。从而，本发明还提供了所述的F56修饰肽或其与人血清白蛋白的结合物在制备用于抑制内皮细胞迁移的制剂中的应用。
本发明的F56修饰肽或其与人血清白蛋白的结合物，均可以抑制VEGF引起的VEGFR1/PI3K磷酸化增强，具有拮抗VEGF与VEGFR1相互作用的活性，能够通过拮抗该通路发挥抗血管生成及抑制肿瘤生长的作用。从而，本发明还提供了所述的F56修饰肽或其与人血清白蛋白的结合物在制备用于拮抗VEGF与VEGFR1相互作用的制剂中的应用。
综上所述，本发明的管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物，除保持F56的拮抗血管内皮细胞生长因子(以下简称VEGF)与其受体1(以下简称VEGFR1)结合作用、具有抗血管生成和抗肿瘤活性外，其作用时间较多肽F56具有显著延长，稳定性更好，取得了本领域技术人员预料不到的技术效果，可用于抗血管生成及抗肿瘤治疗。
附图说明
图1为本发明的修饰肽F56-AM的结构示意图。
图2为本发明的修饰肽F56-BM的结构示意图。
图3为本发明的修饰肽F56-CM的结构示意图。
图4A、图4B显示F56-CM修饰肽的鉴定结果。
图5显示F56修饰肽与HSA体外偶联质谱检测结果。其中，每组图上图为F56修饰肽与人白蛋白偶联物的质谱，下图为人白蛋白的质谱检测。
图6显示不同比例F56修饰肽与HSA体外偶联质谱检测结果。其中，左侧图片为检测m/z 1800-2400区间F56-CM图谱，右侧图片为检测m/z 30000-100000之间HSA及F56-CM-HSA图谱。
图7显示不同位点F56修饰肽抑制VEGF引起的内皮细胞促管状形成作用实验结果。
图8显示不同位点F56修饰肽抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验结果。
图9显示F56修饰肽抑制BGC-823荷瘤裸鼠肿瘤生长实验结果。其中，CTX为环磷酰胺，是常用抗肿瘤实验阳性对照药，Avastin为已上市的抗VEGF抗体药物，作为同类对照药。
图10显示F56修饰肽F56-CM及其与白蛋白结合产物抑制内皮细胞管腔样结构形成(图片A)及迁移(图片B)实验结果。
图11显示F56及修饰肽F56-CM抑制斑马鱼肠下丛血管生成(Avastin为同类药阳性对照、Vehicle为空白对照)实验结果。
图12显示Western blot检测F56及修饰肽F56-CM对VEGFR1信号通路影响实验结果。
图13显示F56修饰肽抑制HT-29荷瘤裸鼠肿瘤生长实验结果。
图14显示F56及修饰肽F56-CM抑制HT-29荷瘤裸鼠肿瘤生长(不同间隔时间给药)实验结果。
图15显示F56及修饰肽抑制黑色素瘤B16细胞肺转移实验结果。
图16A、图16B显示F56修饰肽F56-CM与白蛋白体内结合Western鉴定实验结果。
图17A至图17C显示同位素标记F56及修饰肽F56-CM体内分布及血药浓度放射性检测实验结果。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，下面通过具体实施例并配合附图进一步详细说明本发明，但本发明并不因此而受到任何限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、F56修饰肽的制备与鉴定
本实施例中，制备得到多肽F56、F56氨基端修饰肽F56-AM(图1)、中间区域修饰肽F56-BM(图2)及羧基端修饰肽F56-CM(图3)。
修饰肽合成原料及相关试剂、仪器：
1、树脂：取代度为1.03mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin(天津市南开合成科技有限公司)；
2、氨基酸：Fmoc-Gly-OH(成都诚诺，>99％)，Fmoc-Leu-OH(成都诚诺，>99％)，Fmoc-Tyr(Tbu)-OH(成都诚诺，>99％),Fmoc-Trp(Boc)-OH(成都诚诺，>99％),Fmoc-Glu(OtBu)-OH(成都诚诺，>99％),Fmoc-Met-OH(成都诚诺，>99％),Fmoc-Asp(OtBu)-OH(成都诚诺，>99％),Fmoc-Ser(tBu)-OH(成都诚诺，>99％),Fmoc-His(Trt)-OH(成都诚诺，>99％)；
3、原料：Fmoc-Lys(Dde)-OH(博美生物，99％)，3-马来酰亚氨基丙酸(阿拉丁，>99.0％)，Fmoc-NH-PEG2-CH2-COOH(阿拉丁，>99.0％)；
4、合成试剂：DMF(原产地韩国)，DCM(原产地韩国)，MEOH(原产地日本)，DIEA(新德化工，99％)，HBTU(昊帆生物科技，99％)；
5、脱保护试剂：哌啶(国药集团上海化学试剂公司，99％)；
6、检测试剂：苯酚试剂，吡啶试剂，茚三酮试剂；
7、裂解试剂：95％切割液：TFA(J.T.Baker，99％)，TIS(上海达瑞精细化工，98％)，EDT(上海达瑞精细化工，98％)，无水乙醚(上海实验，实测99.7％)；
8、氮气：(新联气体)；
9、仪器：
(1).十二通道半自动多肽合成仪：上海强耀生物科技有限公司自主设计并申请专利的半自动多肽合成仪，专利号为201020226529.2；
(2).SHIMADZU高效液相色谱仪(型号：制备型，分析型，软件：Class-VP.SevialSystem，厂商：SHIMADZU)；
(3).LABCONCO冻干机(型号：Freezone.Plus.6，厂商：LABCONCO)；
(4).离心机(上海安亭科学仪器厂，型号：TDL-40B)。
多肽F56合成步骤如下：
合成顺序：从C端到N端。
(1)树脂溶涨：将2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min。
(2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Lys(Dde)-OH，加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA，振荡60min。用甲醇封闭。
(3)脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。
(4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。
(5)洗：DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
(6)缩合：保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量.反应30min。
(7)检测：取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃～110℃加热5min，无色为阴性反应。
(8)洗：DMF(10ml/g)一次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
(9)重复三至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸，完成多肽F56合成。
多肽F56-AM合成步骤如下：
合成顺序：从C端到N端。F56-AM:MIPA-AEEA-WHSDMEWWYLLG
(1)树脂溶涨：将2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min。
(2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Gly-OH，加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA，振荡60min。用甲醇封闭。
(3)脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。
(4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。
(5)洗：DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
(6)缩合：保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量.反应30min。
(7)检测：取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃～110℃加热5min，无色为阴性反应。
(8)洗：DMF(10ml/g)一次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
(9)重复三至八步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。最后Fmoc-Trp(Boc)-OH接上树脂后，重复步骤三到五裸露氨基，链接Fmoc-NH-PEG2-CH2-COOH和MIPA。
(10)Fmoc-NH-PEG2-CH2-COOH和缩合剂HBTU均三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量。反应30min，去掉反应溶液，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，抽干再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min.裸露NH2。同上面方法再与MIPA缩合反应：MIPA和缩合剂HBTU均三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量。反应30min.去掉反应溶液，用DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃－110℃加热5min，无色为阴性反应。
(11)抽干，按照下列方法洗树脂：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min。
(12)从树脂上切割多肽：配制切割液(10/g)TFA 95％；水1％；EDT 2％；TIS 2％；切割时间：120min。
(13)吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。
(14)分析提纯：用高效液相色谱将粗品提纯。
(15)冻干收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
(16)将多肽送到质检部确认合格，确认其结构式为：
多肽F56-BM合成步骤如下：
合成顺序：从C端到N端。F56-BM:WHSDMEWK(-AEEA-MIPA)YLLG
(1)树脂溶涨：将2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min。
(2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Gly-OH，加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA，振荡60min。用甲醇封闭。
(3)脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。
(4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。
(5)洗：DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
(6)缩合：保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量.反应30min。
(7)检测：取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃～110℃加热5min，无色为阴性反应。
(8)洗：DMF(10ml/g)一次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
(9)重复三至八步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。从右到左依次连接序列中的氨基酸(其中K，是指Fmoc-Lys(Dde)-OH，当一般氨基酸反应，无别)。最后的氨基酸Fmoc-Trp(Boc)-OH，脱掉Fmoc保护基团后，需要将此裸露的NH2封掉，方法是：3倍过量的Boc酸酐溶解于10mL无水DMF溶液中，加入树脂反应30min，同样方法反应2遍，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃－110℃加热5min，无色为阴性反应，证明NH2完全反应掉。
(10)接着利用水合肼混合DMF溶液去除Fmoc-Lys(Dde)-OH上Dde保护基，裸露氨基，方法是：常温条件下，用含2％水合肼的DMF(2％Hydrazine in DMF/DCM)(10mg/g)浸泡带Dde保护的挂在多肽树脂3分钟，抽干树脂，滤掉脱保护液，重复上步操作2遍，用DMF清洗部分保护的多肽树脂几遍，裸露氨基。
(11)链接Fmoc-NH-PEG2-CH2-COOH和MIPA：Fmoc-NH-PEG2-CH2-COOH和缩合剂HBTU均三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量。反应30min，去掉反应溶液，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，抽干再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min.裸露NH2。同上面方法再与MIPA缩合反应：MIPA和缩合剂HBTU均三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量。反应30min，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量。反应30min.然后用DMF(10ml/g)一次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，抽干树脂10min。
(12)抽干，按照下列方法洗树脂：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，
DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min。
(13)从树脂上切割多肽：配制切割液(10/g)TFA 95％；水1％；EDT 2％；TIS 2％；切割时间：120min。
(14)吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。
(15)分析提纯：用高效液相色谱将粗品提纯。
(16)冻干收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
(17)将多肽送到质检部确认合格，确认其结构式为：
修饰肽F56-CM合成步骤如下：
合成顺序：从C端到N端。F56-CM:WHSDMEWWYLLGK-AEEA-MIPA
(1)树脂溶涨：将2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min。
(2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Lys(Dde)-OH，加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA，振荡60min。用甲醇封闭。
(3)脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。
(4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。
(5)洗：DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
(6)缩合：保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量.反应30min。
(7)检测：取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃～110℃加热5min，无色为阴性反应。
(8)洗：DMF(10ml/g)一次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
(9)重复三至八步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。最后的氨基酸Fmoc-Trp(Boc)-OH，脱掉Fmoc保护基团后，需要将此裸露的NH2封掉，方法是：3倍过量的Boc酸酐溶解于10mL无水DMF溶液中，加入树脂反应30min，同样方法反应2遍，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃－110℃加热5min，无色为阴性反应，证明NH2完全反应掉。
(10)接着利用水合肼混合DMF溶液去除Fmoc-Lys(Dde)-OH上Dde保护基，裸露氨基，方法是：常温条件下，用含2％水合肼的DMF(2％Hydrazine in DMF/DCM)(10mg/g)浸泡带Dde保护的挂在多肽树脂3分钟，抽干树脂，滤掉脱保护液，重复上步操作2遍，用DMF清洗部分保护的多肽树脂几遍，裸露氨基。
(11)链接Fmoc-NH-PEG2-CH2-COOH和MIPA：Fmoc-NH-PEG2-CH2-COOH和缩合剂HBTU均三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量。反应30min，去掉反应溶液，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，抽干再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min.裸露NH2。同上面方法再与MIPA缩合反应：MIPA和缩合剂HBTU均三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量。反应30min，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量。反应30min.然后用DMF(10ml/g)一次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，抽干树脂10min。
(12)抽干，按照下列方法洗树脂：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，
DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min。
(13)从树脂上切割多肽：配制切割液(10/g)TFA 95％；水1％；EDT 2％；TIS 2％；切割时间：120min。
(14)吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。
(15)分析提纯：用高效液相色谱将粗品提纯。
(16)冻干收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
(17)将多肽送到质检部确认合格，确认其结构式为：
F56-CM修饰肽的鉴定结果参见图4A、图4B。
实施例2、F56修饰肽体外可以与人血清白蛋白结合
本实施例中，通过体外实验证实了按照实施例1的方法所制备得到的本发明的F56-AM、F56-BM、F56-CM可以与人血清白蛋白结合。
实验步骤：
(1)配制25％人血清白蛋白(3.79mM)溶液：称0.25g人血清白蛋白至一个1.5mL无菌Eppendorf管，加入750μL灭菌磷酸缓冲液(100mM NaH2PO4/Na2HPO4，pH＝7.4)，涡旋混匀，定容于1.0mL。不做超声处理。
(2)配制10mM多肽F56-AM/F56-BM/F56-CM-二甲基亚砜(DMSO)溶液：用DMSO溶解上述多肽至10mM。
(3)配制多肽反应溶液：将上述两种溶液以体积比9:1(人血清白蛋白：修饰肽)进行混合，以获得对应摩尔比3:1的反应液。
(4)于37℃水浴3小时。
(5)蛋白样品送质谱鉴定。
实验结果可参见图5，其中每组图上图为F56修饰肽与人白蛋白偶联物的质谱，下图为人白蛋白的质谱检测。结果显示，三种F56修饰肽均可以在体外温和条件下与人血清白蛋白(HSA)偶联形成复合物，偶联产物经质谱检测可以看到明显的特征峰(以F56-CM为例：对比可见分子量为68233的明显的偶联产物峰，且产物单一)。但三种修饰肽中F56-AM及F56-CM与HSA结合效果更好。
本实施例中，还进一步考察了修饰肽F56-CM与HSA以不同分子比进行体外偶联反应的情况。具体实验步骤如下：
(1)配制25％人血清白蛋白(3.79mM)溶液：称0.25g人血清白蛋白至一个1.5mL无菌Eppendorf管，加入750μL灭菌磷酸缓冲液(100mM NaH2PO4/Na2HPO4，pH＝7.4)，涡旋混匀，定容于1.0mL。不做超声处理。
(2)配制10mM多肽F56-CM-二甲基亚砜(DMSO)溶液：用DMSO溶解多肽F56-CM至10mM。
(3)配制多肽F56-CM-HSA溶液：将上述两种溶液以不同体积混合，以获得对应摩尔比的反应液；
(4)于37℃水浴3小时。
(5)蛋白样品送质谱鉴定。
上述实验的研究结果可参见图6，其中左侧图片为检测m/z 1800-2400区间F56-CM图谱，右侧图片为检测m/z 30000-100000之间HSA及F56-CM-HSA图谱。结果表明，当F56修饰肽F56-CM与HSA以不同分子比进行体外偶联反应时，偶联产物峰面积也有所不同。当F56-CM过量时，体外反应后存在游离的F56-CM修饰肽。而当F56-CM与HSA以1:1的比例进行反应或HSA过量时，未检测到游离的F56-CM，其与HSA形成稳定的共价复合物。
实施例3、F56不同位点修饰肽的活性研究
1、内皮细胞管状结构形成(Tubule Formation)实验
本实施例中，使用Matrigel体外模拟哺乳动物细胞基底膜，观察不同处理的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在细胞外基质上三维管状结构形成的差异。
内皮细胞管状结构形成实验步骤：
(1)4℃冰上预先融化Growth Factor Reduced Matrigel(BD公司货号：356230)，同时在4℃预冷96孔板及枪头。
(2)将96孔板置于冰上，每孔铺50μl Matrigel，37℃孵育30分钟。
(3)消化HUVEC原代细胞，计数，使用无血清培养基稀释至10000个细胞/100μl，加入终浓度0.1％BSA及20ng/ml VEGF。
(4)实验组分别加入F56-AM、F56-BM、F56-CM至终浓度50μM，对照组加入等体积PBS溶液。
(5)每孔铺10000个细胞，37℃孵育2h后开始观察管状形成情况(拍照记录)。
实验结果请参见图7。结果表明，在对F56的氨基端(F56-AM)、羧基端(F56-CM)及中间部位(F56-BM)进行修饰的不同修饰肽中，羧基端修饰肽F56-CM具有相对最好的抑制VEGF引起的促内皮细胞管状结构形成的能力。
2、鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验
本实施例中，进一步在鸡胚绒毛尿囊膜血管处通过微滤膜给予多肽F56及不同修饰肽处理，考察不同位点F56修饰肽对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响。具体实验步骤如下：
(1)将0天的种鸡蛋在38℃的0.1％新洁尔灭消毒液中浸泡3-5分钟，消毒后用干净纱布擦干种鸡蛋表面的液体，置于温箱中孵育，37.5℃，60-70％湿度，每天180°翻转三次，以免鸡蛋贴壳，孵化3天。
(2)第四天，在超净台内，首先用含有75％医用酒精的棉签消毒鸡蛋的蛋壳切口处，用牙科钻在种鸡蛋的中上1/3处均匀切割蛋壳，形成2-3cm长度的切口。(注意：切勿损伤卵壳下方的白色壳膜，以免造成卵黄囊膜破坏，导致鸡胚死亡。)缓慢打开蛋壳以及壳膜，使鸡胚落入预先放置于鸡蛋下方直径为10cm的细胞培养平皿中，使卵黄囊面向上方。以利于其血管的发育，继续培养48h。
(3)孵化至第六天时，将直径为3mm滴加浓度1mg/ml F56-AM、F56-BM、F56-CM的消毒玻璃纤维滤纸片放置在已经形成的尿囊膜远心端新生血管处，24h后可再次滴加相同浓度药物20μl。
(4)用解剖显微镜随时观察药物对血管形成的效应并拍照进行分析。
给药24小时后不同位点F56修饰肽对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制情况请参见图8。从图中可见，修饰肽F56-BM及F56-CM处理组与多肽F56实验组作用效果近似，毛细血管分支变细减少。与F56-BM及F56-AM相比，F56-CM在抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管中有较好的生物学活性。
3、体内检测F56-CM抗肿瘤生长作用
本实施例中，进一步在小鼠体内检测了F56-CM抗肿瘤生长作用。采用人胃癌BGC-823细胞接种Nu/Nu荷瘤小鼠，待肿瘤体积增长至100mm3后静脉注射给药，每天给药一次，给药两周后停药一周，动物安乐死后称取瘤重。具体实验步骤如下：
(1)扩大培养细胞。
(2)收细胞、接种nu/nu裸鼠。
(3)一周成瘤后、将可见成瘤的小鼠随机分组，每组6只小鼠、开始进行给药。给药14天。其中CTX(环磷酰胺)作为抗肿瘤实验阳性对照药，Avastin为已上市的抗VEGF抗体药物，作为同类对照药。
(4)结束给药后，观察一周，断颈处死小鼠，解剖取瘤，称重。
实验结果请参见图9。结果表明：F56-CM同F56一样，可以显著抑制BGC-823荷瘤小鼠的肿瘤生长。
综合本实施例的以上实验结果，虽然在F56多肽的不同位点都可以进行修饰，通过引入-MIPA-AEEA基团后均能与HSA结合，但在三种不同的修饰方案中，与氨基端(F56-AM)和中间位的(F56-BM)的修饰产物相比，在羧基末端修饰获得的F56-CM在多种体内外评价体系中均具有相对最好的抗血管生成及抑制肿瘤增长活性。
实施例4、F56-CM的抗血管生成作用
1、内皮细胞管状结构形成实验
本实施例中，采用内皮细胞管状结构形成实验(实验步骤参见实施例3)，设置了不同实验对照组，进一步考察F56-CM及F56-CM与HSA(白蛋白)的结合物的抑制管状结构形成活性。
本实施例的内皮细胞管状结构形成实验结果参见图10中的图片A，F56修饰肽F56-CM及其与白蛋白结合产物能抑制内皮细胞管腔样结构形成。
2、抑制内皮细胞迁移活性实验
本实施例中，还采用Transwell实验，进一步考察F56-CM及其与白蛋白结合物对内皮细胞迁移活性的影响。具体实验步骤如下：
(1)消化HUVEC细胞，计数；
(2)上室：50000个细胞/well无血清培养基；
下室：500μl无血清培养基(含1％FBS和20ng/ml VEGF)+药物(药物终浓度如图9-B所示)；
(3)37℃孵育5h；
(4)弃去上室培养液，将小室轻轻取出，用湿棉签擦去小室内部膜表面未侵袭的细胞。
(5)冰甲醇室温固定30min。
(6)结晶紫染色30min，清水漂洗2次，室温干燥。
(7)滴一滴中性树胶，盖上盖玻片，封片保存。
(8)拍照统计。
本实施例的Transwell实验结果参见图10中的图片B，进一步证明了F56-CM及其与白蛋白结合物均具有显著的抑制内皮细胞迁移活性。
3、体内抗血管生成活性实验
在上述体外实验进一步证明F56修饰肽F56-CM具有显著抑制管状结构形成和内皮细胞迁移活性的基础上，发明人选用转基因荧光斑马鱼模型检测了F56-CM的体内抗血管生成活性。具体实验步骤如下：
(1)正常血管荧光转基因斑马鱼，分别静脉注射给予F56(3pmoL/尾、10pmoL/尾和30pmoL/尾)，F56-CM(3pmoL/尾、10pmoL/尾和30pmoL/尾)；阳性药Avastin 3.4pmoL/尾剂量，注射体积均为10nL/尾；同时用注射10nL/尾PBS的斑马鱼作为溶剂对照组(Vehicle)，注射10nL/尾的HSA作为阴性对照组，不作任何处理斑马鱼作为正常对照组(Control)。每个实验组均为30尾斑马鱼。
(2)受试物均通过显微注射的方式注射到转基因血管荧光斑马鱼的血液循环内。
(3)给药24h后，每组随机选取10尾斑马鱼在显微镜下观察、拍照并保存图片。
(4)用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼血管荧光信号(S)，进行定量分析，统计学处理结果用±SE表示；受试物对血管形成的抑制率计算公式如下：
(5)用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异。
实验结果参见图11。结果显示，F56-CM在较低浓度下(3pmol)即拥有较好的抗血管生成活性。
实施例5、F56-CM的作用靶点及信号通路
F56多肽为利用噬菌体肽库筛选得到的具有拮抗VEGF与其受体VEGFR1相互作用的多肽。为了检测修饰后的F56-CM多肽是否仍通过作用于VEGFR1靶点及该信号通路发挥抗血管生成活性，本实施例中，利用Western Blot实验检测了VEGF刺激条件下F56及F56-CM对VEGFR1和下游信号通路蛋白PI3K磷酸化的影响。具体实验步骤如下：
(1)原代培养的内皮细胞HUVEC换无血清培养基培养过夜；
(2)按图示分别加入VEGF 10ng/ml及50μM F56/F56-CM/F56-CM-HSA，37℃孵育10min。
(3)收集细胞，用SDS裂解后提取总蛋白进行Western Blot检测。
实验结果参见图12。结果显示，多肽F56、修饰肽F56-CM及F56-CM与HSA的结合产物均可以抑制VEGF引起的VEGFR1/PI3K磷酸化增强，表明修饰肽F56-CM仍保留有拮抗VEGF与VEGFR1相互作用的活性，并通过拮抗该通路发挥抗血管生成及抑制肿瘤生长的作用。
实施例6、F56修饰肽F56-CM的抗肿瘤生长和转移活性
本实施例中，采用了人结肠癌HT-29细胞接种的Nu/Nu荷瘤小鼠模型，在小鼠皮下接种HT-29细胞待肿瘤体积增长至100mm3时静脉注射给药，每天给药一次，给药两周后停药一周，动物安乐死后称取瘤重，以考察对于F56修饰肽F56-CM的抗肿瘤活性。具体实验步骤如下：
(1)扩大培养细胞；
(2)收细胞、接种nu/nu裸鼠。
(3)一周成瘤后、将可见成瘤的小鼠随机分组，每组5-6只小鼠、开始进行给药。给药14天。
(4)结束给药后，观察一周，断颈处死小鼠，解剖取瘤，称重。
实验结果参见图13。结果表明：F56修饰肽F56-CM可以显著抑制肿瘤增长，且抑瘤效果好于未修饰肽F56。
本实施例中，还利用HT-29荷瘤裸鼠模型检测了不同给药间隔实验条件下，F56及F56-CM的抗肿瘤作用效果。实验结果参见图14。由实验结果可以看出，F56-CM修饰肽抑制肿瘤生长的活性仍与前述结果一致，且明显高于F56多肽抑瘤效果。与每日给药相比，在四日给药一次的时候，修饰肽F56-CM仍然保持有较好的抑瘤效果，表明F56-CM能够减少给药频率。
由于F56-CM具有抗血管生成活性，提示该修饰肽可能具有抑制肿瘤细胞转移效果。本实施例中，进一步通过在C57小鼠尾静脉接种黑色素瘤B16细胞，观察其在给药F56或F56-CM后肺部转移灶形成情况。具体实验步骤如下：
(1)培养B16细胞。
(2)收B16细胞、内眦静脉注射C57鼠：B16细胞EDTA消化后PBS吹起计数，PBS稀释至2×106，0.1ml每只注射C57小鼠。
(3)次日将所有小鼠随机分组，每组8只小鼠、开始进行给药。给药14天。
(4)结束给药后，断颈处死小鼠，解剖取肺，观察统计肺部转移瘤数量，比较各组差异。
实验结果参见图15。结果显示，F56-CM修饰肽具有与未修饰的F56多肽近似的抑制肿瘤细胞转移作用效果。
实施例7、F56修饰肽F56-CM在体内与白蛋白的结合及稳定性检测
为了确认F56修饰肽F56-CM在体内与白蛋白(HSA)的结合及稳定情况，本实施例中采用F56小肽特异性抗体(编号9G10)在体外通过蛋白凝胶电泳-Western blot实验进行了分析。
体外蛋白凝胶电泳-Western Blot实验步骤如下：
(1)制备F56-CM与人血清白蛋白反应储液(方法见实施例2)。
(2)分别取浓度为1μg/μl的F56-CM、HSA、F56-CM-HSA反应液加入等体积2×SDS吹打混匀，煮样，-80℃保存。
(3)蛋白经10％SDS-PAGE电泳分离，上样量1μg。
(4)用湿式法将蛋白电转至硝酸纤维素膜上(恒流150mA，1小时)。
(5)用封闭液室温封闭膜2小时(中间换一次封闭液)。
(6)加适量滴度的一抗(抗F56鼠单抗9G10：1:100；抗白蛋白的兔抗体:1:500)，4℃轻摇过夜。
(7)用TBS-T漂洗膜5分钟×3次。
(8)加适量滴度的二抗(HRP标记的羊抗兔1:2000；HRP标记的羊抗鼠1：2000)室温轻摇1小时。
(9)TBS-T漂洗5分钟×3次。
(10)用Western Blotting Luminol Reagent(Thermo)化学发光法曝光显影。
研究结果请参见图16A。结果表明，HSA、修饰肽与白蛋白的结合物F56-CM-HSA分别用抗人白蛋白抗体(HSA-Ab)和抗多肽F56抗体9G10检测，9G10可识别结合形式的F56-CM-HSA，但不识别HSA；而HSA-Ab既可识别F56-CM-HSA，也可以识别HSA，表明修饰肽F56-CM在体外可与白蛋白结合形成单一复合物。
为了进一步证明F56-CM能够在体内与白蛋白结合，本实施例中选用BALB/c小鼠通过内眦静脉给予400μg F56-CM，并于给药前、给药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h后尾静脉取血，离心获取血清，然后采用蛋白凝胶电泳及Western-Blot，分别用标记有辣根过氧化物酶的抗F56抗体9G10和抗小鼠白蛋白抗体进行检测。具体实验步骤如下：
(1)正常雌性Balb/c小鼠(7-8周龄，体重约20g，购自维通利华实验动物中心)，通过内眦静脉法注射F56-CM 400μg(2mg/mL，200μl)。
(2)分别于注射前、注射后5min,10min,15min,30min,1hour,2hour,4hour,6hour,8hour,12hour,24hour,48hour取尾血10μl转移至40μl无菌PBS中，3,000rpm离心10分钟，取上清，加入等体积2×SDS吹打混匀，煮样，-80℃保存。
(3)等体积蛋白经8％-15％SDS-PAGE电泳分离。
(4)用湿式法将蛋白电转至硝酸纤维素膜上(恒流300mA 1小时)。
(5)用封闭液室温封闭膜2小时(中间换一次封闭液)。
(6)加适量滴度的一抗(抗F56鼠单抗9G10：1:100；抗白蛋白的兔抗体:1:500),4℃轻摇过夜。
(7)用TBS-T漂洗膜5分钟×3次。
(8)加适量滴度的二抗(HRP标记的羊抗兔1:2000；HRP标记的羊抗鼠1：2000)室温轻摇1小时。
(9)TBS-T漂洗5分钟×3次。
(10)用Western Blotting Luminol Reagent(Thermo)化学发光法曝光显影。
实验结果参见图16B。结果表明，给药前小鼠血清中检测不到F56与白蛋白的结合物，而在注射F56-CM后5分钟取样的血清中，可以检测到高丰度的F56-CM和血清白蛋白的结合物(F56-CM-HSA)，该丰度一直可以维持到给药后8h，给药12小时后F56-CM-HSA的丰度有明显降低，这与小鼠血清白蛋白体内的自身半衰期为12小时有关。在给药24h及48小时后，血清中仍可检测到F56-CM-HSA。上述实验结果既表明修饰肽F56-CM在体内能够自发与白蛋白结合，同时表明其结合物有较好的稳定性。
实施例8、同位素标记F56及修饰肽F56-CM体内分布及血药浓度放射性检测
本实施例中，制备了同位素标记的F56及F56-CM多肽，用于进一步确认F56修饰肽F56-CM在体内的稳定性。具体实验步骤如下：
(1)正常雌性nu/nu小鼠(7-8周龄，体重约20g，购自维通利华实验动物中心)，接种BGC-823细胞，约1周后成瘤进行实验.
(2)SD大鼠购自维通利华实验动物中心进行血药浓度实验。
(3)F56及F56-CM修饰肽进行DOTA基团标记后用于同位素连接。
(4)将68Ga或64Cu同位素通过DOTA基团连接到F56或F56-CM上。
(5)每只小鼠注射150μci同位素标记多肽，注射4h后进行PET成像及代谢分布研究(γ-counter仪器计量)。
(6)每只大鼠注射350μci同位素标记多肽，在不同时间点取血，使用γ-counter进行计量。
体内研究结果参见图17A至图17C。结果表明，同位素64Cu标记F56及F56-CM多肽在注射入荷瘤小鼠体内后，F56-CM在肿瘤部位及血液中浓度明显高于F56小肽组(图17A)。此外，使用68Ga标记F56及F56-CM多肽，在注射入小鼠体内4小时后进行成像分析，实验结果也显示F56-CM在体内浓度明显高于F56实验组(图17B)。在大鼠体内进行的血药浓度放射性检测结果也表明，F56-CM较F56多肽在大鼠体内具有更高的血药浓度，显示出F56-CM较F56多肽在体内具有更好的稳定性(图17C)。

Claims (10)

1.一种血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物，该衍生物是在血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的结构基础上连接MIPA-AEEA-基团而构成的肽衍生物。
2.根据权利要求1所述的血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物，其中，MIPA-AEEA-基团连接于多肽F56的氨基端、羧基端或中间区域。
3.根据权利要求1所述的血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物，其具有如下式(1)、式(2)或式(3)所示结构：
4.一种制备权利要求1～3任一项所述的血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物的方法，该方法包括：
按照从C端到N端的顺序合成所述F56修饰肽结构中的氨基酸序列，并链接Fmoc-NH-PEG2-CH2-COOH和MIPA，制备得到所述F56修饰肽。
5.权利要求1～3任一项所述的血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物在制备用于抗血管生成和/或抗肿瘤治疗的制剂中的应用。
6.权利要求1～3任一项所述的血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物在制备用于抑制内皮细胞管状结构形成和/或抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的制剂中的应用。
7.权利要求1～3任一项所述的血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物在制备用于抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞转移的制剂中的应用。
8.一种F56修饰肽与人血清白蛋白的结合物，其是将权利要求1～3任一项所述的血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物与人血清白蛋白(HSA)偶联形成的复合物。
9.权利要求1～3任一项所述的血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物、或权利要求8所述的结合物在制备用于抑制内皮细胞迁移的制剂中的应用。
10.权利要求1～3任一项所述的血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽F56的衍生物、或权利要求8所述的结合物在制备用于拮抗VEGF与VEGFR1相互作用的制剂中的应用。
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