CN116162595A - 工程化迁移体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了工程化迁移体及其制备方法和用途，还公开了包含迁移体和直接或间接连接至迁移体膜的荷载的递送系统及其制备方法。

Description

工程化迁移体及其制备方法和用途

本申请要求2021年11月25日提交的中国专利申请CN202111412950.1的优先权，其出于所有目的通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及工程化迁移体、制备工程化迁移体的方法、包含工程化迁移体的递送系统及其制备方法。

背景技术

药物递送系统(Drug Delivery System，DDS)是用于控制药物的释放、靶向、以及体内吸收的材料或装置。药物递送系统拥有多种分类方式。例如，根据Samir Mitragotri等人(Vargason,A.M.,Anselmo,A.C.&Mitragotri,S.The evolution of commercial drugdelivery technologies.Nat Biomed Eng(2021))，药物递送系统可分为口服型(如传统的片剂、胶囊等剂型)、皮肤局部给药型(如软膏、贴片等)、吸入型(如喷雾)、注射型(如静脉、皮下、鞘内注射等)；或者按照药物递送系统的作用机理可分为药物改造(如官能团、氨基酸或核酸骨架改造)和微环境修饰(如pH调控、缓释系统、内体逃逸等)。

在诸多药物递送方式中，传统剂型(如片剂、胶囊等)和部分物理给药装置(如植入式缓释装置)大多用于控制药物的释放位置及释放时间。新一代药物递送系统旨在解决不同细胞种类的靶向给药、克服复杂生物屏障(如血脑屏障)以及提高复杂药物(如核酸)递送效率。目前较为有潜力的新一代药物递送系统包括药物偶联递送系统(如配体偶联、多肽或抗体偶联)和纳米颗粒(<100纳米)及微颗粒(100纳米-1000微米)递送系统(Debacker,A.J.,Voutila,J.,Catley,M.,Blakey,D.,&Habib,N.(2020).Delivery ofOligonucleotides to the Liver with GalNAc:From Research to RegisteredTherapeutic Drug.Molecular therapy:the journal of the American Society ofGene Therapy,28(8),1759–1771；He,R.,Finan,B.,Mayer,J.P.,&DiMarchi,R.D.(2019).Peptide Conjugates with Small Molecules Designed to Enhance Efficacy andSafety.Molecules(Basel,Switzerland),24(10),1855；Khongorzul,P.,Ling,C.J.,Khan,F.U.,Ihsan,A.U.,&Zhang,J.(2020).Antibody-Drug Conjugates:A ComprehensiveReview.Molecular cancer research:MCR,18(1),3–19)。

多种药物偶联递送系统已在临床获得验证，如抗体药物偶联物(ADC)以及N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)药物偶联物等。这类递送系统大多通过将有效但无选择性的药物(如微管抑制剂、siRNA等)与拥有靶向性和促进细胞内吞的导向物进行偶联，利用抗体-抗原结合或配体-受体结合的方式将有效药物递送至靶细胞，或利用导向物(如细胞穿透肽，CPP)的穿膜作用将较难进入细胞的药物递送至细胞(Guidotti,G.,Brambilla,L.,&Rossi,D.(2017).Cell-Penetrating Peptides:From Basic Research to Clinics.Trends inpharmacological sciences,38(4),406–424)。药物偶联递送的优点在于高效的靶向性及较高的细胞内吞效果，但其缺点在于技术复杂，例如药物本身设计、接头设计、以及靶向用的抗体/配体设计的复杂性；可选择的具有内吞效果的靶点有限；内吞后释放效率不高；以及可递送的药物种类有限，大多为小分子或小核酸。

纳米颗粒及微颗粒递送系统可依据生产模式和材料分为非生物来源和生物来源，两种来源的递送系统均有独特的优点和缺点(Mitchell,M.J.,Billingsley,M.M.,Haley,R.M.,Wechsler,M.E.,Peppas,N.A.,&Langer,R.(2021).Engineering precisionnanoparticles for drug delivery.Nature reviews.Drug discovery,20(2),101–124)。

非生物来源的纳米颗粒及微颗粒递送系统包括无机金属颗粒(如金、铂等)、聚合物、脂质纳米粒(LNP)、脂质聚合物纳米粒(LPP)等，其优点在于合成时无需生物原料，合成步骤相对生物来源的递送系统较少，可控性更高，从而能得到更为均一的产品；其缺点在于生物兼容性不足，且靶向性修饰较为困难。

聚合物可由其独特的结构促进细胞吸收、胞内释放或延长药物半衰期。例如，聚乙二醇(PEG)等聚合物已经在临床获得大量应用(D'souza,A.A.,&Shegokar,R.(2016).Polyethylene glycol(PEG):a versatile polymer for pharmaceuticalapplications.Expert opinion on drug delivery,13(9),1257–1275)。聚合物的缺点在于其生物兼容性较差，容易引起不良免疫反应。

脂质纳米粒可以保护包含在其内部的药物，合成容易(例如可依据电荷自组装)并具有一定的生物兼容性。例如，脂质纳米粒可用于递送mRNA疫苗(Polack,F.P.,Thomas,S.J.,Kitchin,N.,Absalon,J.,Gurtman,A.,Lockhart,S.,Perez,J.L.,Pérez Marc,G.,Moreira,E.D.,Zerbini,C.,Bailey,R.,Swanson,K.A.,Roychoudhury,S.,Koury,K.,Li,P.,Kalina,W.V.,Cooper,D.,Frenck,R.W.,Jr,Hammitt,L.L.,Türeci,

C4591001Clinical Trial Group(2020).Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNACovid-19 Vaccine.The New England journal of medicine,383(27),2603–2615)。脂质纳米粒的缺点在于其稳定性不高、仍具有一定毒性、内体逃脱效率不足，且较难进行靶向性修饰，在靶向性递送药物方面仍有待改进。

脂质聚合物纳米粒作为脂质纳米粒和聚合物的复合体，可通过聚合物更紧密包裹RNA并提升内体逃脱效率，但其合成难度比脂质纳米粒更大，且靶向性修饰仍较为困难(Mukherjee,A.,Waters,A.K.,Kalyan,P.,Achrol,A.S.,Kesari,S.,&Yenugonda,V.M.(2019).Lipid-polymer hybrid nanoparticles as a next-generation drug deliveryplatform:state of the art,emerging technologies,andperspectives.International journal of nanomedicine,14,1937–1952)。

生物来源的纳米颗粒及微颗粒递送系统中开发较为领先的几种递送系统包括：1)工程化的外泌体(Kamerkar S,LeBleu VS,Sugimoto H,Yang S,Ruivo CF,Melo SA,LeeJJ,Kalluri R.Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS inpancreatic cancer.Nature.2017 Jun 22；546(7659):498-503.doi:10.1038/nature22341)；2)工程化改造的红细胞(Usman WM,Pham TC,Kwok YY,Vu LT,Ma V,Peng B,Chan YS,Wei L,Chin SM,Azad A,He AB,Leung AYH,Yang M,Shyh-Chang N,Cho WC,ShiJ,Le MTN.Efficient RNA drug delivery using red blood cell extracellularvesicles.Nat Commun.2018 Jun 15；9(1):2359.doi:10.1038/s41467-018-04791-8；JangSC,Kim OY,Yoon CM,Choi DS,Roh TY,Park J,Nilsson J,

J,Kim YK,GhoYS.Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery ofchemotherapeutics to malignant tumors.ACS Nano.2013 Sep 24；7(9):7698-710)；3)膜修饰的纳米颗粒(Fang RH,Hu CM,Luk BT,Gao W,Copp JA,Tai Y,O'Connor DE,ZhangL.Cancer cell membrane-coated nanoparticles for anticancer vaccination anddrug delivery.Nano Lett.2014；14(4):2181-8；Hu CM,Zhang L,Aryal S,Cheung C,FangRH,Zhang L.Erythrocyte membrane-camouflaged polymeric nanoparticles as abiomimetic delivery platform.Proc Natl Acad Sci U S A.2011 Jul 5；108(27):10980-5)；4)病毒及类病毒颗粒(VLP)(Hill,B.D.,Zak,A.,Khera,E.,&Wen,F.(2018).Engineering Virus-like Particles for Antigen and Drug Delivery.Currentprotein&peptide science,19(1),112–127)。生物来源的纳米颗粒及微颗粒递送系统拥有较高的生物兼容性及相对较好的靶向性，但生产均较为困难。

工程化的外泌体的优点主要包括：天然生物膜来源，毒性低；低免疫原性，不易被免疫系统清除，因而在体内循环时间更长；性质稳定，能够在-80℃长期储存。但其也存在明显的局限性，例如，产量低；纯化过程依赖超高速离心机；内容物主要为后期装载的核酸等。

工程化改造的红细胞主要的优点包括：能够避免核酸污染(红细胞没有细胞核)；可以用患者自体红细胞实现个体化囊泡制作；产量相对较高。其缺点包括例如，红细胞无法在体外实现持续的培养、增殖，因而每次制备都需要血液样品；红细胞也同样存在装载物限制性强的问题，装载物主要为核酸。

膜修饰的纳米颗粒用生物膜包裹纳米颗粒，可实现纳米颗粒的靶向性并提高生物兼容性。但纳米颗粒难以被人体正常代谢清除，可能在体内积累，具有潜在的毒性。

病毒和类病毒颗粒的优势在于极高的靶向性以及较高的递送效率，但由于其大小限制，可递送的药物基本局限于核酸和小分子量的蛋白。此外，病毒和类病毒颗粒的生产及纯化过程较为困难、成本较高，修饰较为困难。

因此，本领域需要能够克服现有的药物递送系统所存在的一种或多种缺陷的新型递送系统。

发明内容

本发明人发现，迁移体(migrasome)作为生物来源囊泡，可用于递送如蛋白质、肽、核酸和小分子等多种药物类型。对细胞进行人工诱导可产生工程化迁移体(E-migrasome)，其制备方法简单，产量较高，具有高生物兼容性，易于进行改造和修饰，能够递送多种药物类型，因此是一种理想的递送载体。

相应地，在一方面，本发明涉及制备工程化迁移体的方法，其包括：

(a)对细胞进行以下一项或多项处理以诱导所述细胞产生工程化迁移体：

(1)低渗透压处理；

(2)破坏所述细胞的细胞骨架；

(3)抑制所述细胞的细胞体积调节功能；和

(4)使所述细胞过表达选自Tetraspanin家族成员的一种或多种蛋白；以及

(b)分离和/或纯化所述工程化迁移体。

在本发明工程化迁移体制备方法的一些实施方案中，在步骤(a)中，进行(1)-(4)中的至少2种处理，至少3种处理，或者进行全部四种处理。

在一些实施方案中，步骤(a)包括对细胞进行低渗透压处理。在一些实施方案中，通过将细胞置于低渗缓冲溶液中，从而进行低渗透压处理，所述低渗缓冲溶液的渗透压为30.5-274.5mOsmol，例如30.5-150mOsmol。在另一些实施方案中，通过将细胞置于缓冲溶液中，并将所述缓冲溶液的渗透压降低至30.5-274.5mOsmol，例如30.5-150mOsmol，从而进行低渗透压处理。在一些实施方案中，降低所述缓冲溶液的渗透压包括线性降低或阶梯式逐步降低。

在一些实施方案中，步骤(a)包括破坏所述细胞的细胞骨架。在一些实施方案中，通过使所述细胞与破坏细胞骨架的试剂接触，从而破坏所述细胞的细胞骨架。在一些实施方案中，所述破坏细胞骨架的试剂包括微丝解聚剂，例如选自Latrunculin A、LatrunculinB、细胞松弛素A、细胞松弛素B、细胞松弛素C、细胞松弛素D和细胞松弛素E。

在另一些实施方案中，步骤(a)包括抑制所述细胞的细胞体积调节功能。在一些实施方案中，通过抑制所述细胞的调节细胞体积的蛋白的表达或活性，从而抑制所述细胞的细胞体积调节功能。例如，所述调节细胞体积的蛋白选自离子通道和转运蛋白。在一些实施方案中，所述调节细胞体积的蛋白选自体积调节的阴离子通道(VRAC)，例如SWELL 1；体积调节的阳离子通道(VRCC)，例如TRPV4和TRPM3；和协同转运蛋白，例如KCC1、KCC3和KCC4。

在其他实施方案中，通过将所述细胞置于包含具有减弱的调节细胞体积变化能力的阳离子或阴离子的缓冲溶液中，从而抑制所述细胞的细胞体积调节功能。在一些实施方案中，所述阳离子选自钾离子、铯离子和胆碱离子中的一种或多种。在一些实施方案中，所述阴离子选自溴离子和碘离子中的一种或多种。

在一些实施方案中，步骤(a)包括使所述细胞过表达选自Tetraspanin家族成员的一种或多种蛋白。例如，所述Tetraspanin家族成员包括Tspan1、Tspan2、Tspan3、Tspan4、Tspan5、Tspan6、Tspan7、Tspan8、Tspan9、Tspan10、Tspan11、Tspan12、Tspan13、Tspan14、Tspan15、Tspan16、Tspan17、Tspan18、Tspan19、Tspan20(UPK1B)、Tspan21(UPK1A)、Tspan22(PRPH2)、Tspan23(ROM1)、Tspan24(CD151)、Tspan25(CD53)、Tspan26(CD37)、Tspan27(CD82)、Tspan28(CD81)、Tspan29(CD9)、Tspan30(CD63)、Tspan31、Tspan32和Tspan33。在一些实施方案中，步骤(a)包括使所述细胞过表达Tspan4。

在一些实施方案中，所述方法还包括减小工程化迁移体的尺寸。在一些实施方案中，通过使用特定孔径的过滤器挤压工程化迁移体从而减小工程化迁移体的尺寸。在一些实施方案中，减小的工程化迁移体的尺寸为纳米级，例如50-200nm。

在本发明工程化迁移体制备方法的一些实施方案中，所述细胞为正常细胞或癌细胞。

在另一方面，本发明涉及由本文公开的工程化迁移体制备方法所制备的工程化迁移体。

在又一方面，本发明涉及递送系统，其包含分离或纯化的迁移体和荷载，所述荷载直接或间接连接至所述迁移体的膜。

在本发明递送系统的一些实施方案中，所述迁移体选自天然产生的迁移体和经人工诱导产生的工程化迁移体。在一些实施方案中，所述工程化迁移体由本文公开的工程化迁移体制备方法产生。

在一些实施方案中，所述荷载选自蛋白质例如膜蛋白和可溶性蛋白、肽、核酸例如DNA和RNA、和小分子化合物。

在另一些实施方案中，所述载荷选自治疗性蛋白、免疫原性蛋白、细胞因子、酶、siRNA、microRNA、反义寡核苷酸(ASO)、mRNA、CRISPR系统、细胞毒性剂、治疗性小分子和靶向分子。在一些实施方案中，所述靶向分子选自抗体或其抗原结合片段；整合素；找到我/吃我信号(find-me/eat me signal)，例如PAMP和DAMP；和不要吃我信号(don’t-eat-mesignal)，例如CD47和CD24。

在一些实施方案中，所述荷载通过物理吸附或化学连接而连接至迁移体的膜。

在其他实施方案中，所述荷载通过选自以下的方式连接至所述迁移体的膜：

(1)与迁移体的膜组分例如膜蛋白或胆固醇连接；

(2)与连接至迁移体膜的蛋白或肽连接，优选所述蛋白或肽通过点击化学连接至迁移体的膜；和

(3)与结合对的第一成员连接，其中所述迁移体的膜包含所述结合对的第二成员，所述荷载通过所述第一成员和第二成员的结合连接至迁移体的膜。

在一些实施方案中，所述结合对包括受体-配体结合对。例如，所述结合对为HaloTag及其配体，或CP05和CD63。

在一些实施方案中，所述荷载为mRNA，并且所述迁移体的膜包含mRNA结合蛋白，所述mRNA通过其3’-UTR的蛋白结合位点与所述mRNA结合蛋白的结合连接至迁移体的膜。

在一些实施方案中，所述荷载作为膜蛋白表达在迁移体膜的表面。

在另一些实施方案中，所述荷载作为与膜蛋白或其部分融合的融合蛋白表达在迁移体膜的表面。

在另一方面，本发明涉及产生递送系统的方法，所述递送系统包含分离或纯化的迁移体和荷载，所述荷载选自蛋白质、肽、核酸(例如DNA和RNA)和小分子化合物，其中所述方法包括：

从细胞分离或纯化迁移体，所述迁移体是天然产生的迁移体或经人工诱导产生的工程化迁移体；和

将所述荷载直接或间接连接至所述迁移体的膜，从而产生所述递送系统。

在本发明递送系统产生方法的一些实施方案中，将所述荷载通过物理吸附或化学连接而连接至迁移体的膜。

在本发明递送系统产生方法的另一些实施方案中，将所述荷载通过选自以下的方式连接至所述迁移体的膜：(1)将所述荷载与迁移体的膜组分例如膜蛋白或胆固醇连接；和(2)将所述荷载与连接至迁移体膜的蛋白或肽连接，优选所述蛋白或肽通过点击化学连接至迁移体的膜。

在另一方面，本发明涉及产生递送系统的方法，所述递送系统包含工程化迁移体和荷载，所述荷载选自蛋白质、肽、核酸(例如DNA和RNA)和小分子化合物，其中所述荷载与结合对的第一成员连接，并且所述迁移体的膜包含所述结合对的第二成员，其中所述方法包括：

使所述细胞在细胞膜上表达所述结合对的第二成员；

由所述细胞产生在膜上包含所述结合对的第二成员的工程化迁移体；和

将所述荷载与所述结合对的第一成员的复合物与所述工程化迁移体接触，从而通过所述第一成员与第二成员的结合产生所述递送系统。

在本发明递送系统产生方法的一些实施方案中，所述结合对包括受体-配体结合对。在一些实施方案中，所述结合对为HaloTag及其配体，或CP05和CD63。

在又一方面，本发明涉及产生递送系统的方法，所述递送系统包含工程化迁移体和荷载，所述荷载为mRNA，并且所述迁移体的膜包含mRNA结合蛋白，所述mRNA通过其3’-UTR的蛋白结合位点与所述mRNA结合蛋白结合，其中所述方法包括：

使所述细胞表达所述mRNA；

在上述步骤之前、之后或同时，使所述细胞在细胞膜上表达所述mRNA结合蛋白；和

由所述细胞产生包含工程化迁移体和mRNA的递送系统，其中所述mRNA通过与所述mRNA结合蛋白的结合连接至所述工程化迁移体的膜。

在另一方面，本发明涉及产生递送系统的方法，所述递送系统包含工程化迁移体和荷载，所述荷载为蛋白质并且表达在工程化迁移体膜的表面，其中所述方法包括：

使所述细胞在细胞膜上表达所述蛋白质；和

由所述细胞产生包含工程化迁移体和表达在工程化迁移体膜的表面的蛋白质的递送系统。

在一些实施方案中，所述蛋白质为膜蛋白。在另一些实施方案中，所述蛋白质为可溶性蛋白，并且作为与膜蛋白或其部分融合的融合蛋白表达在迁移体膜的表面。

在本发明递送系统产生方法的一些实施方案中，所述工程化迁移体由本文公开的工程化迁移体制备方法产生。

附图说明

图1：低渗透压刺激对工程化迁移体形成的影响。a.76.3mOsmol渗透压刺激下，不同时间点工程化迁移体的形成；b.工程化迁移体用四甲基罗丹明标记的WGA染色的结果(标尺5μm)；c.不同渗透压下工程化迁移体的形成；d.c中的工程化迁移体的直径的统计结果。

图2：不同浓度latrunculin A处理对工程化迁移体形成的影响。a.不同latrunculin A浓度下工程化迁移体的形成；b.a中的工程化迁移体数量的统计结果。

图3：细胞中SWELL1编码基因Lrrc8a的敲低对工程化迁移体形成的影响。a.通过qPCR确定的细胞中Lrrc8a的敲低效率；b.通过激光共聚焦显微镜观察到的Lrrc8a被敲低的细胞在逐步低渗透压刺激下产生的工程化迁移体；c.b中的工程化迁移体的直径的统计结果。

图4：细胞中SWELL1编码基因Lrrc8a的敲除对工程化迁移体形成的影响。a.通过蛋白质免疫印迹确定的细胞中Lrrc8a的敲除；b.通过激光共聚焦显微镜观察到的Lrrc8a被敲除的细胞在逐步低渗透压刺激下产生的工程化迁移体。

图5：不同阳离子处理对工程化迁移体形成的影响。a.不同阳离子下工程化迁移体的形成；b.a中的工程化迁移体的直径的统计结果。

图6：过表达Tspan4对工程化迁移体数量的影响。a.过表达Tspan4导致的工程化迁移体的形成；b.a中的工程化迁移体数量的统计结果。

图7：在不同细胞系中诱导产生的工程化迁移体。a.不同细胞系经诱导产生的工程化迁移体；b.工程化迁移体用四甲基罗丹明标记的WGA染色的结果(标尺5μm)。

图8：由过表达Tspan4的NRK细胞诱导产生的工程化迁移体的分离纯化流程示意图。

图9：由过表达Tspan4的NRK细胞诱导产生的工程化迁移体的形态观察。a.工程化迁移体的激光共聚焦显微镜图像；b.工程化迁移体的冷冻电镜照片；c.工程化迁移体的负染透射电镜照片。

图10：分离纯化的工程化迁移体的蛋白质印迹。

图11：通过激光共聚焦显微镜观察的工程化迁移体对Cy5和右旋糖苷-TMR随时间变化的通透性。a.工程化迁移体的激光共聚焦显微镜观察结果；b.工程化迁移体室温放置1.5h、6h、12h、24h、48h后对右旋糖苷-TMR通透比例的统计结果。

图12：工程化迁移体的稳定性。a.通过激光共聚焦显微镜观察的工程化迁移体在第0、1、2、3、5和7天的形态结果；b.工程化迁移体的流式细胞术分析；c.通过流式细胞术分析得到的工程化迁移体数目的统计结果。

图13：通过激光共聚焦显微镜观察的胆固醇抽提试剂MβCD对工程化迁移体稳定性的影响。

图14：工程化迁移体上膜蛋白、可溶性蛋白及小分子的装载流程示意图。

图15：通过激光共聚焦显微镜观察到的各种膜蛋白在工程化迁移体上的定位。

图16：通过激光共聚焦显微镜观察到的S蛋白在工程化迁移体上的定位。

图17：载体pB-Hygro-GFP的图谱。

图18：载体pmcherry-N1的图谱。

图19：载体pB-Hygro-mcherry的图谱。

图20：通过激光共聚焦显微镜观察到的t-STX2-OVA融合蛋白在工程化迁移体上的定位。

图21：通过激光共聚焦显微镜观察到的Tspan4-HaloTag-GFP和HaloTag配体-TMR在工程化迁移体上的共定位。

图22：经装载SARS-CoV-2刺突蛋白的工程化迁移体免疫的小鼠体内诱导的S蛋白特异性免疫应答。a.动物实验设计示意图；b.接受不同方法免疫后小鼠血清中的S蛋白特异性IgG的滴度；c.S-eMig中S1蛋白的蛋白免疫印迹，NC-eMig组和纯化的S1蛋白作为对照。

具体实施方式

除非另有限定，否则本文所使用的全部技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同。例如，本文所使用的术语如“Amultilingual glossary ofbiotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和

H.编辑(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland中所述的定义。

应当注意，如本文中及所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。因此，术语“一个”、“一种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以互换使用。类似地，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。

在本文中及所附权利要求书中使用术语“包含”时，其不排除其它元素。为了本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包括或包含至少一定数量的实施方案，则还应被理解为公开了优选仅由这些实施方案组成的组。

如本文使用的术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此，如在短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如在短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

在本文中列举的范围应理解为所述范围内的所有值(包括所列举的端点值)。例如，范围1至100应理解为包括1至100之间的任何数值、数值组合或子范围。

与药物偶联递送系统及非生物来源的药物递送系统相比，本发明的迁移体递送系统具有更高的生物兼容性，递送药物种类更多且更容易进行膜改造增加靶向性。与工程化外泌体和工程化改造的红细胞相比，迁移体递送系统保留了高生物兼容性以及易改造特性，并且比传统小囊泡(如外泌体)体积更大，可以更加有效地递送药物，尤其是大分子量的蛋白以及核酸。同时，迁移体递送系统的可改造性很高，迁移体的尺寸、膜上装载的物质都可按需要递送的药物和需要靶向的细胞进行调整。迁移体还具有低毒性的优点，更容易实现膜组分的改造和修饰。另外，工程化迁移体的制备不需要超高速离心，也不需要每次提取血液样品，大幅降低了制备时间和成本。

因此，相比现有的药物递送系统，本发明的迁移体递送系统兼具毒性低、载量高、易改造、生产快、成本低的特性，且具有独特的抗原呈递作用，可用作疫苗递送平台。

本发明人发现，通过对细胞进行以下一项或多项处理：低渗透压处理、破坏细胞的细胞骨架、抑制细胞的细胞体积调节功能和使细胞过表达Tetraspanin家族成员，可以诱导细胞产生工程化迁移体。

因此，在一方面，本发明涉及制备工程化迁移体的方法，其包括：

(a)对细胞进行以下一项或多项处理以诱导所述细胞产生工程化迁移体：

(1)低渗透压处理；

(2)破坏所述细胞的细胞骨架；

(3)抑制所述细胞的细胞体积调节功能；和

(4)使所述细胞过表达选自Tetraspanin家族成员的一种或多种蛋白；以及

(b)分离和/或纯化所述工程化迁移体。

在本发明工程化迁移体制备方法的一些实施方案中，在步骤(a)中，可以进行(1)-(4)中的至少2种处理，至少3种处理，或者进行全部四种处理。例如，i)可以对细胞进行低渗透压处理并破坏所述细胞的细胞骨架；ii)可以对细胞进行低渗透压处理并抑制所述细胞的细胞体积调节功能；iii)可以对细胞进行低渗透压处理并使所述细胞过表达选自Tetraspanin家族成员的一种或多种蛋白；或iv)可以对细胞进行低渗透压处理、破坏所述细胞的细胞骨架、抑制所述细胞的细胞体积调节功能、并使所述细胞过表达选自Tetraspanin家族成员的一种或多种蛋白。

如本文所用的术语“迁移体(Migrasome)”是一种新型细胞器，其是在细胞迁移过程中，在细胞尾部留下的收缩丝的尖端或交叉部位产生的直径为0.5-3μm的单层膜囊泡结构。在细胞迁移过程中，胞体持续地向迁移体运输胞内物质。随后，收缩丝断裂，迁移体被释放，继而被细胞外空间或周围的细胞所摄取。这暗示迁移体可能参与胞内物质在细胞之间的传递，从而介导细胞间通讯(Liang Ma et.al.,Discovery of the migrasome,anorganelle mediating release of cytoplasmic contents druing cell migration,Cell Res(2015)25:24-38)。

研究表明迁移体在胚胎发育、机体免疫应答、肿瘤转移等细胞迁移活跃的过程中发挥重要的信号传递作用。通过迁移体在斑马鱼胚胎发育中的研究发现，迁移体作为信号分子的膜包被载体，决定信号分子的时空分布，从而发挥调控器官发育的功能(Jiang Det.at.,Migrasomes provide regional cues for organ morphogenesis duringzebrafish gastrulation,Nat Cell Biol,2019,21(8):966-977)。迁移体可以介导细胞间的mRNA传递，通过迁移体将mRNA转移到受体细胞，从而改变受体细胞的生命活动(Zhu Met.al.,Lateral transfer of mRNA and protein by migrasomes modifies therecipient cells,Cell Res,2020,doi；10.1038/s41422-020-00415-3)。迁移体可以调控线粒体的质量，通过将受损的线粒体清理出去，从而维持细胞内线粒体的稳态(Jiang Het.al.,Mitocytosis,a migrasome-mediated mitochondrial quality controlprocess,Cell Press,doi:10.1016/j.cell.2021.04.027)。迁移体对肿瘤微环境中的癌细胞具有调控作用，如在胰腺癌细胞中迁移体可诱导抑制性免疫微环境从而促进肿瘤生长(张荣华，胰腺癌细胞迁移体对肿瘤微环境中癌细胞与相关免疫细胞表型及功能的相互调控作用研究，2020)。

虽然迁移体具有囊泡结构，但其不同于细胞外囊泡和外泌体。迁移体不属于严格意义上的细胞外囊泡。虽然脱离细胞的迁移体是一种胞外囊泡，但是迁移体的许多功能是在他们脱离细胞体之前完成的。这就是为何将迁移体视为细胞器而不是一种细胞外囊泡的原因。产生细胞外囊泡(脱离的迁移体)只是迁移体的众多功能之一。

脱离的迁移体是一种胞外囊泡，但其与外泌体存在众多差异。例如，1)两者结构不同：迁移体在被释放之前附着在收缩丝上并呈现大囊泡内包含小囊泡的结构；而外泌体不存在这种结构；2)两者的大小不同：外泌体的直径为约50-60nm，而迁移体的直径为约0.5-3μm；3)两者的蛋白质组成明显不同：在迁移体和外泌体之间只有27％的蛋白质组成是相同的，例如NDST1(双功能硫酸乙酰肝素N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶1)、PIGK(磷脂酰肌醇聚糖锚定生物合成类K)、CPQ(羧肽酶Q)和EOGT(EGF结构域特异性O-连接的N-乙酰葡糖胺转移酶)富集在迁移体上，而不存在于外泌体中(Zhao X,Lei Y,Zheng J,Peng J,Li Y,Yu L,Chen Y.Identification of markers for migrasome detection.Cell Discov.2019 May21；5:27)；4)两者受不同的遗传途径调控，生物发生过程完全不同：外泌体首先作为多泡体(MVB)的囊泡产生，当MVB与质膜融合时释放外泌体；而迁移体是由质膜上大结构域组装形成的(Huang Y,Zucker B,Zhang S,Elias S,Zhu Y,Chen H,Ding T,Li Y,Sun Y,Lou J,Kozlov MM*,Yu L*.Migrasome formation is mediated by assembly of micron-scaletetraspanin macrodomains.Nat Cell Biol.2019 Aug；21(8):991-1002)。

如本文所用的术语“工程化迁移体”是指对细胞进行人工诱导所产生的迁移体。应当注意，“工程化”仅意指并非由细胞天然释放的迁移体。因此，“工程化迁移体”并不暗示其是合成的，其仍是细胞来源的。

本发明的工程化迁移体不同于本领域已知的“低渗透压诱导的囊泡”(例如，CohenS,Ushiro H,Stoscheck C,Chinkers MA native 170 000 epidermal growth factorreceptor-kinase complex from shed plasma membrane vesicles.J Biol Chem 257:1523-1531中的图1所示的囊泡)，它们存在至少以下区别：1)囊泡产生位点不同：工程化迁移体产生于细胞周围的收缩丝上；而Cohen等人的囊泡产生于细胞上表面；2)囊泡尺寸不同：工程化迁移体的尺寸为微米级，直径很少超过5μm；而Cohen等人利用低渗透压诱导的囊泡可大至20μm。

除非另有明确说明，否则本文中的迁移体包括天然产生的迁移体和人工诱导产生的工程化迁移体。

如本文所用的术语“低渗透压”是指比细胞的等渗溶液的渗透压更低的渗透压。等渗溶液是指渗透压相当于血浆渗透压的溶液。正常血浆渗透压为约280-320mOsmol，与此渗透压近似相等的溶液为等渗溶液。本文中“等渗溶液”和“等渗缓冲溶液”可互换使用。低渗透压例如是细胞等渗溶液渗透压的10％-90％。哺乳动物细胞培养液(即等渗溶液)的渗透压约为305mOsmol。对于哺乳动物细胞而言，低渗透压例如是30.5mOsmol-274.5mOsmol。

如本文所用的术语“细胞骨架”是指是指细胞中的蛋白纤维网架体系，例如由微管、微丝和中间纤维组成的体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和胞外基质所形成的网络体系。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。

Tetraspanin是四跨膜蛋白超家族，其包含四个跨膜结构域。这些蛋白可以形成所谓的四跨膜蛋白富集的微结构域(TEM)(Rubinstein,E.(2011).The complexity oftetraspanins.Biochem Soc Trans 39,501-505.)。TEM尺寸为约100纳米，富含一系列蛋白和脂阀类脂质，如胆固醇等。在迁移体形成过程中，很多小的TEM会聚集形成微米级别的宏结构域，称为四跨膜蛋白富集的宏结构域(TEMA)。研究表明，TEMA的形成与迁移体在收缩丝上的生长有关。

Tetraspanin家族包含33个成员，包括Tspan1、Tspan2、Tspan3、Tspan4、Tspan5、Tspan6、Tspan7、Tspan8、Tspan9、Tspan10、Tspan11、Tspan12、Tspan13、Tspan14、Tspan15、Tspan16、Tspan17、Tspan18、Tspan19、Tspan20(UPK1B)、Tspan21(UPK1A)、Tspan22(PRPH2)、Tspan23(ROM1)、Tspan24(CD151)、Tspan25(CD53)、Tspan26(CD37)、Tspan27(CD82)、Tspan28(CD81)、Tspan29(CD9)、Tspan30(CD63)、Tspan31、Tspan32和Tspan33。来自生化研究和基因敲除小鼠的数据表明这些Tetraspanin家族成员在膜生物学中发挥着重要作用。

如本文所用的术语“分离”和“纯化”可互换使用，并且是指从其产生环境的组分中鉴别、分离和/或回收，使得该“分离或纯化的”迁移体不含或基本上不含来自其产生环境的、可能干扰其治疗或诊断用途的其它污染物组分。污染物组分可包括非生物物质(包括化学物质)或生物物质，例如细胞器、核酸、蛋白质(例如可溶性蛋白)、脂质或代谢物。因此，可以通过至少一个移除或基本上移除这些污染物组分的纯化步骤制备“分离或纯化的”迁移体。

在一些实施方案中，分离或纯化的迁移体没有可检测的污染物组分，或者污染物组分的水平或量等于或低于可接受的水平或量。

在一些实施方案中，可以通过离心来分离和/或纯化工程化迁移体。例如，可以通过在300-17000xg下离心来分离和/或纯化工程化迁移体。在一些实施方案中，可以通过过滤来分离和/或纯化工程化迁移体。

本发明人发现，对细胞进行低渗压处理能够诱导大量的微米级囊泡在细胞的收缩丝上快速形成，这种微米级囊泡即人工诱导产生的工程化迁移体。因此，在本发明工程化迁移体制备方法的一些实施方案中，步骤(a)的诱导细胞产生工程化迁移体可以包括对细胞进行低渗透压处理。

在一些实施方案中，可以通过将细胞置于低渗缓冲溶液中，从而进行低渗透压处理，所述低渗缓冲溶液的渗透压为等渗缓冲溶液的10％-90％，例如15％-85％、20％-80％、25％-75％、30％-70％、35％-65％、40％-60％、50％-55％或其间的任何数值或子范围，例如10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。

在一些实施方案中，可以通过将细胞置于低渗缓冲溶液中，从而进行低渗透压处理，所述低渗缓冲溶液的渗透压为30.5-274.5mOsmol，例如30.5-150mOsmol。

在另一些实施方案中，可以通过将细胞置于缓冲溶液中，并将缓冲溶液的渗透压降低至30.5-274.5mOsmol，例如30.5-150mOsmol，从而进行低渗透压处理。在一些实施方案中，降低缓冲溶液的渗透压包括线性降低或阶梯式逐步降低。例如，在一些实施方案中，可以以预定的时间间隔，逐步降低缓冲溶液的盐浓度。例如，可以逐步降低缓冲溶液的盐浓度至少3次(例如3-5次)，每次降低1/6-1/2的盐浓度。

在一些实施方案中，低渗缓冲溶液的渗透压为或降低缓冲溶液的渗透压至例如35-250mOsmol、40-230mOsmol、45-210mOsmol、50-190mOsmol、55-170mOsmol、60-150mOsmol、70-130mOsmol、80-100mOsmol或其间的任何数值或子范围，例如35mOsmol、45mOsmol、55mOsmol、65mOsmol、75mOsmol、85mOsmol、95mOsmol、105mOsmol、115mOsmol、125mOsmol、135mOsmol、145mOsmol、155mOsmol、165mOsmol、175mOsmol、185mOsmol、195mOsmol、205mOsmol、215mOsmol、225mOsmol、235mOsmol、245mOsmol、255mOsmol、265mOsmol。

在一些实施方案中，低渗透压处理可以在杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中进行。也可以使用任何其他合适的细胞培养液进行低渗透压处理，例如MEM、DMEM、F-12、F-12K、F-10、BME、RPMI-1640、McCoy’s 5A。

本发明人还发现，通过破坏细胞骨架使细胞收缩，收缩会导致细胞边缘向中心回缩，同时细胞通过粘着斑粘附在培养板底部的各个点，从而使质膜在原位粘附，作为膜系绳生成的锚点。细胞的收缩会导致在收缩前被细胞占据的区域上形成大量的膜系绳，这些新形成的膜系绳导致工程化迁移体的形成显著增强。因此，在一些实施方案中，步骤(a)的诱导细胞产生工程化迁移体可以包括破坏所述细胞的细胞骨架。

在一些实施方案中，可以通过使细胞与破坏细胞骨架的试剂接触，从而破坏所述细胞的细胞骨架。在一些实施方案中，破坏细胞骨架的试剂包括例如微丝解聚剂，例如选自Latrunculin A、Latrunculin B、细胞松弛素A、细胞松弛素B、细胞松弛素C、细胞松弛素D和细胞松弛素E。在一些实施方案中，破坏细胞骨架的试剂为Latrunculin A。

在一些实施方案中，破坏细胞骨架的试剂的浓度可以是任何合适的浓度。例如，微丝解聚剂的浓度可以是至少0.5μM、至少1μM、至少2μM、至少3μM、至少4μM、至少5μM、至少6μM、至少7μM、至少8μM、至少9μM、至少10μM。

细胞可以通过受调节的体积变化来对抗渗透压的变化。因此，抑制细胞体积调节功能可以促进工程化迁移体的形成。在一些实施方案中，步骤(a)的诱导细胞产生工程化迁移体可以包括抑制所述细胞的细胞体积调节功能。

在一些实施方案中，可以通过抑制细胞的调节细胞体积的蛋白的表达或活性，从而抑制所述细胞的细胞体积调节功能。例如，调节细胞体积的蛋白可以选自离子通道和转运蛋白。在一些实施方案中，调节细胞体积的蛋白可以选自体积调节的阴离子通道(VRAC)，例如SWELL 1；体积调节的阳离子通道(VRCC)，例如TRPV4和TRPM3；和协同转运蛋白，例如KCC1、KCC3和KCC4。可以通过本领域已知的任何方法或试剂来抑制蛋白质的表达或活性，例如破坏编码蛋白质的基因序列、RNAi、蛋白活性抑制剂等。

已知阳离子和阴离子可以调节细胞体积，但不同的离子调节细胞体积变化的能力是不同的。因此，调节细胞体积变化能力较弱的离子对抗渗透压变化的能力也较弱，从而能够促进迁移体的形成。因此，在一些实施方案中，可以通过将细胞置于包含具有减弱的调节细胞体积变化能力的阳离子或阴离子的缓冲溶液中，从而抑制所述细胞的细胞体积调节功能。如本文所用的术语“减弱的调节细胞体积变化能力”是相对于使细胞具有正常的细胞体积调节能力的阳离子(例如钠离子)或阴离子而言的。

在一些实施方案中，具有减弱的调节细胞体积变化能力的阳离子可以选自钾离子、铯离子和胆碱离子中的一种或多种。在一些实施方案中，具有减弱的调节细胞体积变化能力的阴离子可以选自溴离子和碘离子中的一种或多种。

在一些实施方案中，步骤(a)的诱导细胞产生工程化迁移体可以包括使所述细胞过表达选自Tetraspanin家族成员的一种或多种蛋白。例如，Tetraspanin家族成员可以包括Tspan1、Tspan2、Tspan3、Tspan4、Tspan5、Tspan6、Tspan7、Tspan8、Tspan9、Tspan10、Tspan11、Tspan12、Tspan13、Tspan14、Tspan15、Tspan16、Tspan17、Tspan18、Tspan19、Tspan20(UPK1B)、Tspan21(UPK1A)、Tspan22(PRPH2)、Tspan23(ROM1)、Tspan24(CD151)、Tspan25(CD53)、Tspan26(CD37)、Tspan27(CD82)、Tspan28(CD81)、Tspan29(CD9)、Tspan30(CD63)、Tspan31、Tspan32和Tspan33。在一些实施方案中，可以通过使细胞过表达Tspan4，从而诱导细胞产生工程化迁移体。

在一些实施方案中，本发明的工程化迁移体的制备方法还包括包括减小工程化迁移体的尺寸。可以通过本领域已知的任何方式来减小工程化迁移体的尺寸，例如通过使用特定孔径的过滤器挤压工程化迁移体从而减小工程化迁移体的尺寸。在一些实施方案中，可以通过使用含有特定孔径滤膜的挤出机对工程化迁移体进行处理，从而减小工程化迁移体的尺寸。在一些实施方案中，滤膜的孔径可以为1-500nm，例如10-400nm、20-300nm、30-200nm、40-100nm、50-80nm或其间的任何数值或子范围。在一些实施方案中，减小的工程化迁移体的尺寸可以为纳米级，例如1-500nm、10-400nm、20-300nm、30-200nm、40-100nm、50-80nm或其间的任何数值或子范围。

在本文中，用于产生工程化迁移体的细胞可以是任何细胞，例如体外培养的细胞或体内的细胞；正常细胞或癌细胞。此外，用于产生工程化迁移体的细胞可源自适合于体外增殖、修饰并表达外源分子并产生工程化迁移体的任何细胞系。在一些实施方案中，所述细胞可以是动物细胞，特别是哺乳动物细胞，包括鼠和人的细胞。合适的细胞的实例包括但不限于正常大鼠肾细胞(NRK细胞)、4T1细胞、MC38细胞、人胚胎肾(HEK)细胞如HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、间充质干细胞(MSC)、成纤维细胞如NIH3T3小鼠成纤维细胞、或任何其他合适的细胞。

在另一方面，本发明涉及由本文公开的工程化迁移体制备方法所制备的工程化迁移体。

在又一方面，本发明涉及递送系统，其包含分离或纯化的迁移体和荷载，所述荷载直接或间接连接至所述迁移体的膜。

在本发明递送系统的一些实施方案中，迁移体选自天然产生的迁移体和经人工诱导产生的工程化迁移体。工程化迁移体仅意指并非由细胞天然释放的迁移体。因此，工程化迁移体并不暗示其是合成的，其仍是细胞来源的。在一些实施方案中，工程化迁移体由本文公开的工程化迁移体制备方法产生。

如本文所用的术语“载荷”是指能够装载在迁移体上从而被有效递送的任何物质。例如，荷载可以通过迁移体的表面分子与靶细胞相互作用而被递送至靶细胞。

本发明的荷载中的一种或多种可以在工程化迁移体形成期间或形成之后装载到工程化迁移体的膜上，也可以直接装载到天然产生的迁移体的膜上。

载荷的实例包括但不限于治疗剂，例如合成生物活性化合物、天然生物活性化合物、抗菌化合物、抗病毒化合物、蛋白质或肽(例如酶或抗体)、核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素的核苷酸或破坏转录的核苷酸)、核酸(例如，编码多肽如酶DNA或mRNA分子，或具有调节功能的RNA分子如microRNA、dsDNA、反义寡核苷酸(ASO)、lncRNA和siRNA)、基因组编辑系统、脂质、碳水化合物、小分子(例如，小分子药物和毒素)和靶向分子或其任意组合。

在一些实施方案中，荷载可以是microRNA或siRNA，例如特异性地结合到编码突变型或非突变型致癌基因的转录物中的microRNA或siRNA。microRNA或siRNA的结合可以抑制致癌基因的mRNA译码和蛋白质合成。此类致癌基因包括但不限于ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES。在一些实施方案中，致癌基因是突变型KRAS，例如KRAS G12D、KRAS G12C或KRAS G12V。在另一些实施方案中，致癌基因是Myc，如N-Myc、c-Myc或L-Myc。

在一些实施方案中，荷载可以是基因组编辑系统。基因组编辑系统包括但不限于大范围核酸酶系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)系统和规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)系统。在一些实施方案中，荷载可以是CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统可以是CRISPR-Cas9系统。CRISPR-Cas9系统包含编码Cas9蛋白质的核苷酸序列、编码与靶序列(crRNA)杂交的CRISPR RNA的核苷酸序列、和编码反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的核苷酸序列。crRNA和tracrRNA可以融合成向导RNA。CRISPR-Cas9系统可以进一步包含核定位信号(NLS)。装载有CRISPR-Cas9系统的迁移体可以用于改变疾病处理、再生医学和组织工程的基因表达和功能。

在一些实施方案中，荷载可以是治疗性蛋白或其片段，例如抗体或其片段。在一些实施方案中，荷载可以是免疫原性蛋白或其片段，例如SARS-Cov-2的刺突蛋白。

在一些实施方案中，荷载可以是靶向分子。

如本文所用的术语“靶向分子”是指能够特异性结合另一分子(靶分子)的分子。例如，靶向分子可用于将在表面上呈递靶向分子的迁移体特异性定位至某一实体，例如表达靶分子的组织或细胞，从而提高递送系统的靶向性。

在一些实施方案中，本发明的递送系统可包含至少两种不同的靶向分子，从而进一步提高靶向特异性或以其他方式改善对靶细胞或靶组织的靶向性。

例如，靶向分子可以特异性结合癌细胞上过表达的表面蛋白，例如抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，靶向分子可以选自抗体或其抗原结合片段；整合素；找到我/吃我信号(find-me/eat me signal)，例如PAMP和DAMP；和不要吃我信号(don’t-eat-mesignal)，例如CD47和CD24。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以通过结合其相应的抗原，将装载有抗体或其抗原结合片段的迁移体递送至表达相应抗原的靶细胞。

在一些实施方案中，整合素可以通过与组织特异的细胞外基质配对，从而实现装载有整合素的迁移体对特定器官的靶向性。

如本文所用的术语“找到我/吃我信号(find-me/eat me signal)”是指由凋亡细胞暴露或释放以引发吞噬性摄取的信号，这种吞噬性摄取转而激活耐受性途径以防止针对自身抗原的免疫应答。在本文中，将找到我/吃我信号装载在迁移体上，该找到我/吃我信号能被巨噬细胞等识别，从而使迁移体被特定细胞吞噬。示例性的找到我/吃我信号包括例如病原体相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP)。

“病原体相关分子模式(PAMP)”是指病原微生物表面存在的一些人体宿主所没有的，但可为许多相关微生物所共享、结构恒定且进化保守的分子结构。先天性免疫识别的PAMP，往往是病原体赖以生存，因而变化较少的主要部分，如病毒的双链RNA和细菌的脂多糖，对此，病原体很难产生突变而逃脱先天性免疫的作用。PAMP可以表达在病原体表面或游离于免疫细胞之外，也可以出现在免疫细胞的胞质溶胶，以及溶胶中各种携带病原体的胞内区室，如内体和吞噬溶酶体内。

PAMP主要包括两类。第一类是以糖类和脂类为主的细菌胞壁成分，例如如脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露糖、类脂、脂阿拉伯甘露聚糖、脂蛋白和鞭毛素等。其中最为常见且具有代表性的包括革兰阴性菌产生的脂多糖(LPS)；革兰阳性菌产生的肽聚糖(proteoglycan)；分枝杆菌产生的糖脂(glicolipid)和酵母菌产生的甘露糖。第一类是病毒产物及细菌胞核成分，例如非甲基化寡核苷酸CpGDNA、单链RNA、双链RNA。

“损伤相关分子模式(DAMP)”是组织或细胞受到损伤、缺氧、应激等因素刺激后释放到细胞间隙或血液循环中的一类物质，其可通过Toll样受体、RIG-1样受体或NOD样受体等模式识别受体诱导自身免疫或免疫耐受，在关节炎、动脉粥样硬化、肿瘤、系统性红斑狼疮等疾病发生和发展过程中发挥重要作用。

DAMP存在于细胞核、细胞质(例如，高速泳动族蛋白盒(HMGB)1、S100蛋白)、细胞外基质(例如透明质酸)和血浆中(例如补体C3a、C4a、C5a)或作为外来体(例如热休克蛋白)。非蛋白形式的DAMP包括腺苷三磷酸、尿酸、硫酸肝素、RNA和DNA。这些蛋白质和非蛋白质在健康情况下被限制在细胞内，当细胞破坏时则被释放到细胞外。

如本文所用的术语“不要吃我信号(don’t-eat-me signal)”是指肿瘤细胞在其表面表达的用于与免疫细胞表面的配体结合从而抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用的信号。示例性的不要吃我信号包括例如CD47和CD24。在本文中，通过将不要吃我信号装载在迁移体上，使得迁移体逃避免疫系统的清除，从而延长在血液中的循环时间，实现更好的组织浸润。

迁移体具有单层膜结构，其膜来源为细胞膜和细胞胞内囊泡。与细胞膜相比，迁移体的膜特异地富集了一些蛋白(如Tetraspanin)和脂质(如胆固醇、鞘磷脂)。

本发明的荷载可以通过本领域已知的任何方式直接或间接连接至迁移体的膜。

在一些实施方案中，荷载可以通过物理吸附或化学连接而连接至迁移体的膜。

在其他实施方案中，荷载可以通过选自以下的方式连接至所述迁移体的膜：

(1)与迁移体的膜组分例如膜蛋白或胆固醇连接；

(2)与连接至迁移体膜的蛋白或肽连接，优选所述蛋白或肽通过点击化学连接至迁移体的膜；和

(3)与结合对的第一成员连接，其中所述迁移体的膜包含所述结合对的第二成员，所述荷载通过所述第一成员和第二成员的结合连接至迁移体的膜。

在一些实施方案中，荷载通过与迁移体的膜组分例如膜蛋白或脂质连接而连接至迁移体的膜。在一些实施方案中，荷载通过与迁移体的膜蛋白例如Tetraspanin连接而连接至迁移体的膜。在一些实施方案中，荷载通过与Tspan4连接而连接至迁移体的膜。在一些实施方案中，荷载通过与迁移体膜脂质(例如胆固醇和鞘磷脂)连接而连接至迁移体的膜。

在一些实施方案中，结合对包括受体-配体结合对。例如，所述结合对为HaloTag及其配体，或CP05和CD63。

在一些实施方案中，荷载为mRNA，并且迁移体的膜包含mRNA结合蛋白，所述mRNA通过其3’-UTR的蛋白结合位点与所述mRNA结合蛋白的结合连接至迁移体的膜。mRNA结合蛋白及其3’-UTR的蛋白结合位点可以是本领域已知的那些。例如，在一些实施方案中，mRNA结合蛋白为L7Ae，蛋白结合位点为C/D Box。在另一些实施方案中，mRNA结合蛋白为MS2BP，蛋白结合位点为MS2茎环(MS2SL)。

在一些实施方案中，荷载可以作为膜蛋白表达在迁移体膜的表面。

在另一些实施方案中，荷载可以作为与膜蛋白或其部分融合的融合蛋白表达在迁移体膜的表面。本领域已知的任何膜蛋白都可用作与可溶性蛋白融合的膜锚定蛋白。作为可溶性蛋白融合的膜蛋白的实例包括但不限于细胞受体、离子通道、转运蛋白等，例如Tspan-4、CD81、CD9、CD63、PDGFR、Lamp2b、突触融合蛋白2(STX2)等。

在一些实施方案中，作为可溶性蛋白融合的膜蛋白可以是STX2。在一些实施方案中，作为可溶性蛋白融合的膜蛋白可以是截短的STX2(t-STX2)。例如，可以对STX2的N端进行改造，去除其胞内端功能，以得到t-STX2。然后可以将可溶性蛋白连接到t-STX2处于胞外的C端，以形成可溶蛋白-t-STX2融合蛋白，从而使可溶性蛋白作为人造的质膜定位融合蛋白在迁移体膜上表达。

在另一方面，本发明涉及产生递送系统的方法，所述递送系统包含分离或纯化的迁移体和荷载，所述荷载选自蛋白质、肽、核酸(例如DNA和RNA)和小分子化合物，其中所述方法包括：

从细胞分离或纯化迁移体，所述迁移体是天然产生的迁移体或经人工诱导产生的工程化迁移体；和

将所述荷载直接或间接连接至所述迁移体的膜，从而产生所述递送系统。

在本发明递送系统产生方法的一些实施方案中，将所述荷载通过物理吸附或化学连接而连接至迁移体的膜。

在本发明递送系统产生方法的另一些实施方案中，将所述荷载通过选自以下的方式连接至所述迁移体的膜：(1)将所述荷载与迁移体的膜组分例如膜蛋白或胆固醇连接；和(2)将所述荷载与连接至迁移体膜的蛋白或肽连接，优选所述蛋白或肽通过点击化学连接至迁移体的膜。

在一些实施方案中，天然产生的迁移体可以通过本领域已知的方法从细胞分离或纯化。在一些实施方案中，经人工诱导产生的工程化迁移体由本文公开的工程化迁移体的制备方法产生。在一些实施方案中，荷载可以是本文其他地方所述的荷载的一种或多种。

在另一方面，本发明涉及产生递送系统的方法，所述递送系统包含工程化迁移体和荷载，所述荷载选自蛋白质、肽、核酸(例如DNA和RNA)和小分子化合物，其中所述荷载与结合对的第一成员连接，并且所述迁移体的膜包含所述结合对的第二成员，其中所述方法包括：

使所述细胞在细胞膜上表达所述结合对的第二成员；

由所述细胞产生在膜上包含所述结合对的第二成员的工程化迁移体；和

将所述荷载与所述结合对的第一成员的复合物与所述工程化迁移体接触，从而通过所述第一成员与第二成员的结合产生所述递送系统。

在本发明递送系统产生方法的一些实施方案中，所述方法包括向细胞引入包含结合对的第二成员的编码序列的核苷酸序列，以使所述细胞在细胞膜上表达结合对的第二成员。在一些实施方案中，所述方法包括向细胞引入包含结合对的第二成员的编码序列的核苷酸序列，并在允许所述细胞表达结合对的第二成员的条件下培养所述细胞，以使所述细胞在细胞膜上表达结合对的第二成员。

在一些实施方案中，所述方法包括：

a)向细胞引入包含结合对的第二成员的编码序列的核苷酸序列；

b)在允许所述细胞表达所述结合对的第二成员的条件下培养所述细胞；

c)由所述细胞产生在膜上包含所述结合对的第二成员的工程化迁移体；

d)将所述荷载与结合对的第一成员连接以形成复合物；和

e)使所述工程化迁移体与所述复合物接触从而产生所述递送系统。

在一些实施方案中，上述步骤d)在步骤a)之前、之后或同时进行。

在一些实施方案中，结合对的第二成员为膜蛋白或可溶性蛋白。在一些实施方案中，结合对的第二成员为膜蛋白并且表达在工程化迁移体膜的表面。在一些实施方案中，结合对的第二成员为可溶性蛋白，并且作为与膜蛋白或其部分融合的融合蛋白表达在工程化迁移体膜的表面。

在一些实施方案中，所述结合对包括受体-配体结合对。在一些实施方案中，所述结合对为HaloTag及其配体，或CP05和CD63。

在一些实施方案中，工程化迁移体由本文公开的工程化迁移体的制备方法产生。在一些实施方案中，荷载可以是本文其他地方所述的荷载的一种或多种。

在又一方面，本发明涉及产生递送系统的方法，所述递送系统包含工程化迁移体和荷载，所述荷载为mRNA，并且所述迁移体的膜包含mRNA结合蛋白，所述mRNA通过其3’-UTR的蛋白结合位点与所述mRNA结合蛋白结合，其中所述方法包括：

使所述细胞表达所述mRNA；

在上述步骤之前、之后或同时，使所述细胞在细胞膜上表达所述mRNA结合蛋白；和

由所述细胞产生包含工程化迁移体和mRNA的递送系统，其中所述mRNA通过与所述mRNA结合蛋白的结合连接至所述工程化迁移体的膜。

在本发明递送系统产生方法的一些实施方案中，所述方法包括向细胞引入在3’-UTR包含蛋白结合位点的mRNA的编码序列，以使所述细胞表达所述mRNA。

在一些实施方案中，所述方法包括向细胞引入包含mRNA结合蛋白的编码序列的核苷酸序列，以使所述细胞在细胞膜上表达所述mRNA结合蛋白。

在一些实施方案中，所述方法包括向细胞引入在3’-UTR包含蛋白结合位点的mRNA的编码序列和包含mRNA结合蛋白的编码序列的核苷酸序列，以使所述细胞表达所述mRNA和所述mRNA结合蛋白。

在一些实施方案中，mRNA结合蛋白为膜蛋白或可溶性蛋白。在一些实施方案中，mRNA结合蛋白为膜蛋白并且表达在工程化迁移体膜的表面。在一些实施方案中，mRNA结合蛋白为可溶性蛋白，并且作为与膜蛋白或其部分融合的融合蛋白表达在工程化迁移体膜的表面。

mRNA结合蛋白及其3’-UTR的蛋白结合位点可以是本领域已知的那些。例如，在一些实施方案中，mRNA结合蛋白为L7Ae，蛋白结合位点为C/DBox。在另一些实施方案中，mRNA结合蛋白为MS2BP，蛋白结合位点为MS2茎环(MS2SL)。

在一些实施方案中，工程化迁移体由本文公开的工程化迁移体的制备方法产生。

在另一方面，本发明涉及产生递送系统的方法，所述递送系统包含工程化迁移体和荷载，所述荷载为蛋白质并且表达在工程化迁移体膜的表面，其中所述方法包括：使所述细胞在细胞膜上表达所述蛋白质；和由所述细胞产生包含工程化迁移体和表达在工程化迁移体膜的表面的蛋白质的递送系统。

在一些实施方案中，所述方法包括向细胞引入包含蛋白质编码序列的核苷酸序列，以使所述细胞在细胞膜上表达所述蛋白质。在一些实施方案中，所述方法包括向细胞引入包含蛋白质编码序列的核苷酸序列，并在允许所述细胞表达所述蛋白质的条件下培养细胞，以使所述细胞在细胞膜上表达所述蛋白质。

在一些实施方案中，所述方法包括：向细胞引入包含目的蛋白编码序列的核苷酸序列；在允许所述细胞表达目的蛋白的条件下培养所述细胞；和

由所述细胞产生包含工程化迁移体和表达在工程化迁移体膜的表面的蛋白质的递送系统。

在一些实施方案中，所述蛋白质为膜蛋白。在另一些实施方案中，所述蛋白质为可溶性蛋白，并且作为与膜蛋白或其部分融合的融合蛋白表达在迁移体膜的表面。

作为可溶性蛋白融合的膜蛋白的实例如上文所述，包括但不限于细胞受体、离子通道、转运蛋白等，例如Tspan-4、CD81、CD9、CD63、PDGFR、Lamp2b、突触融合蛋白2(STX2)等。

在一些实施方案中，工程化迁移体由本文公开的工程化迁移体制备方法产生。

实施例

通过下面的具体实施例进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通过按照本领域的常规条件，例如，Sambrook和Russeii等人，分子克隆：实验室手册(第三版)(2001)，CSHL出版社中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另有说明，否则以下实施例中所用的实验材料和试剂均可商购获得。

试剂

ddH2O(solarbio)、KCl(sigma)、KH2PO4(sangon)、Na2HPO4-7H2O(sangon)、BSA(VWR)、Latrunculin A(cayman)、人纤连蛋白(invitrogen或sigma)、PBS(Gibco)、RPMI1640(Gibco)、FBS(BI)、WGA-AF488/AF594/AF647(invitrogen)、BCA试剂盒(invitrogen)。

10xKDPBS(500ml)的配制：

组分	含量(g)	浓度(mM)
			KCl	52.4	1405.7
KH2PO4	1	14.7
			Na2HPO4-7H2O	10.8	80.6
ddH2O	至500ml

100xBSA(50ml)的配制：称取5g BSA，加入ddH2O至50ml，用0.45um滤膜过滤。

实施例1.通过低渗透压处理产生工程化迁移体

发明人发现对细胞进行低渗压处理导致细胞胞体膨胀、底面收缩并产生大量丝状结构(收缩丝)，在收缩丝上生长出迁移体样结构。为了直观地观察工程化迁移体，建立了稳定表达Tspan4-GFP的NRK细胞系，并通过迁移体的标志物之一Tspan4的信号来观察工程化迁移体的形成。将过表达Tspan4-GFP的NRK细胞用25％DPBS(对应渗透压76.3mOsmol)处理，结果以热图形式显示于图1a中。结果显示，低渗透压处理后30秒，Tspan4-GFP信号开始在收缩丝上富集，然后形成微米级囊泡；在达到其峰值强度后，Tspan4-GFP信号开始从囊泡扩散，同时伴随着囊泡的缩小；低渗透压处理后460秒，大部分由低渗透压诱导产生的囊泡结构消失。这些微米级囊泡的产生过程以及在收缩丝上的附着类似于天然的迁移体。

为了进一步确认低渗透压诱导产生的囊泡结构是否为工程化迁移体。用荧光标记的小麦胚芽凝集素(WGA)对细胞进行染色。WGA是与唾液酸和N-乙酰-D-葡糖胺特异性结合的凝集素。荧光标记的WGA能够用于标记细胞中的迁移体，是用于检测迁移体的特异性探针(Chen et.al.,WGA is a probe for migrosomes,Cell Discovery(2019)5:13)。

对过表达Tspan4-GFP的NRK细胞分别进行等渗处理(100％DPBS，305mOsmol)和25％DPBS的低渗透压处理(76.3mOsmol)，然后用四甲基罗丹明标记的WGA对细胞进行染色，并进行激光共聚焦显微镜观察，结果如图1b所示。结果显示，过表达Tspan4的NRK细胞经诱导产生的囊泡结构被WGA特异性染色，表明所产生的囊泡结构是工程化迁移体。

为了确定渗透压的大小对工程化迁移体形成的影响，对表达Tspan4-GFP的NRK细胞进行等渗透压(100％DPBS，305mOsmol)或不同强度低渗透压(50％、25％和17％DPBS，分别对应渗透压152.5、76.3和50.8mOsmol)处理，热图结果如图1c所示，工程化迁移体直径的统计结果如图1d所示。可以发现渗透压的高低与工程化迁移体的尺寸呈负相关，渗透压越低，诱导产生的工程化迁移体尺寸越大。

基于上述结果，发明人建立了逐步降低渗透压的方案，并且发现逐步应用低渗透压显著增加了工程化迁移体的持续时间，在经历5步低渗处理的细胞中，诱导产生的工程化迁移体在低渗透压处理20分钟后仍然存在。

实施例2.通过latrunculin A处理产生工程化迁移体

由于低渗透压诱导产生的工程化迁移体的数量取决于收缩丝的数量，并且作为工程化迁移体膜来源的大部分质膜位于细胞体上，因此推测如果通过破坏细胞骨架使细胞收缩，收缩会导致细胞边缘向中心回缩，同时细胞通过粘着斑粘附在培养板底部的各个点，从而使质膜在原位粘附，作为膜系绳生成的锚点。如果事实却是如此，细胞的收缩会以类似于迁移过程中收缩丝形成的方式产生大量的膜管。

为了验证这一假设，用含不同浓度的微丝解聚剂latrunculin A(0、0.25、0.5和1μM)的等渗缓冲溶液DPBS孵育表达Tspan4-GFP的NRK细胞10min，然后通过逐步加水以每间隔2min降低1/6盐浓度的方式对细胞进行三次连续的低渗透压刺激。经过分步低渗透压处理后的热图结果如图2a所示，每个细胞产生的工程化迁移体数量的统计结果如图2b所示。

正如预期的那样，发现用latrunculin A处理细胞会导致细胞收缩，并且还观察到在收缩前被细胞占据的区域上形成大量的膜系绳，这些新形成的膜系绳导致工程化迁移体的形成显著增强。因此，Latrunculin A能够显著促进工程化迁移体数量的增加，并且这种促进作用具有剂量依赖性。这提示了通过破坏细胞骨架能够促进工程化迁移体的形成。

实施例3.通过抑制细胞体积调节功能产生工程化迁移体

细胞可以通过受调节的体积变化来对抗渗透压的变化。为了测试受调节的体积变化是否会影响工程化迁移体的形成，对体积调节阴离子通道的关键组分SWELL 1(其通过响应渗透压的变化维持恒定的细胞体积)进行了敲低和敲除。

敲低表达Tspan4-GFP的NRK细胞中编码SWELL 1的基因Lrrc8a，通过qPCR对细胞中Lrrc8a的敲低效率进行验证，结果表明SWELL 1的编码基因Lrrc8a被成功敲低至野生型细胞的约15％(图3a)。将Lrrc8a基因被敲低的细胞(Lrrc8a-KD)和未敲低的对照细胞(NC)分别置于DPBS中，通过逐步加水以每间隔2min降低1/3盐浓度的方式对细胞进行连续三次的低渗透压刺激，然后用激光共聚焦显微镜进行观察，结果如图3b所示；工程化迁移体尺寸的统计结果如图3c所示。

敲除表达Tspan4-GFP的NRK细胞中编码SWELL 1的基因Lrrc8a，通过蛋白质免疫印迹对细胞中Lrrc8a的敲除进行验证，在敲除的细胞(Lrrc8a-KO)中未观察到SWELL 1的表达，表明SWELL 1的编码基因Lrrc8a被成功敲除(图4a)。将Lrrc8a-KO细胞(KO14#细胞系和KO18#细胞系)和未敲除的对照细胞(WT)分别置于DPBS中，通过逐步加水以每间隔1min降低1/6盐浓度的方式对细胞进行连续五次的低渗透压刺激，然后用激光共聚焦显微镜进行观察，结果如图4b所示。

结果显示，低渗透压处理后，Lrrc8a-KD细胞所产生的工程化迁移体尺寸显著大于未敲低细胞(图3b和3c)；Lrrc8a-KO细胞所产生的工程化迁移体尺寸也显著大于未敲除细胞(图4b)。这表明敲低或敲除SWELL 1显著增强了工程化迁移体的形成，提示了可以通过降低细胞在渗透压变化期间调节其体积的能力来增强工程化迁移体的形成。

已知阳离子可以调节细胞体积。如果不同阳离子在渗透压变化期间调节细胞体积的能力不同，则可以通过阳离子置换来减弱受调节的细胞体积变化，从而促进工程化迁移体的形成。接下来，测试了不同阳离子对工程化迁移体形成的影响。将DPBS中的NaCl置换成等摩尔浓度的KCl、CsCl或氯化胆碱以配制成含有不同阳离子的等渗缓冲液，用这些等渗缓冲液分别孵育细胞，在相应的缓冲液中通过逐步加水以每间隔2min降低1/6盐浓度的方式对细胞进行连续五次的低渗透压刺激。经过逐步低渗透压处理后的热图结果如图5a所示，工程化迁移体尺寸的统计结果如图5b所示。

结果显示不同的阳离子具有不同的促进工程化迁移体形成的能力，在所测试的阳离子中，钠离子促进工程化迁移体形成的能力相对较弱，而钾离子、铯离子和胆碱离子促进迁移体样结构形成的能力明显更强。

实施例4.通过使细胞过表达Tspan4产生工程化迁移体

Tspan4是促进迁移体形成的关键蛋白，为了测试Tspan4是否能促进工程化迁移体的形成，对仅过表达mcherry-Kras的NRK细胞或过表达Tspan4-GFP与mcherry-Kras两者的NRK细胞进行逐步低渗透压刺激。将NRK细胞在含2uM latrunculin A的KDPBS中孵育10min后，以每间隔2min降低1/6盐浓度的方式进行三次连续的低渗透压刺激，然后通过DIC观察工程化迁移体的形成。经过逐步低渗透压处理后的热图结果如图6a所示，每个细胞产生的工程化迁移体数量的统计结果如图6b所示。

结果显示Tspan4的过表达对于工程化迁移体的数量具有显著的促进作用。

实施例5.在多种细胞系中产生工程化迁移体

为了测试在不同种属与遗传背景的细胞系中是否能够诱导产生工程化迁移体，针对过表达Tspan4的三种不同的细胞系(正常大鼠肾细胞(NRK)、小鼠乳腺癌细胞系(4T1)和小鼠结肠癌细胞系(MC38))进行了低渗透压诱导。将NRK细胞在含2uM latrunculin A的K-DPBS中孵育10min后，以每间隔2min降低1/6盐浓度的方式进行三次连续的低渗透压刺激；将4T1细胞在含2uM latrunculin A的K-DPBS中孵育20min后，以每间隔2min降低1/4盐浓度的方式进行三次连续的低渗透压刺激；将MC38细胞在含2uM latrunculin A的K-DPBS中孵育45min后，以每间隔2min降低1/4盐浓度的方式进行三次连续的低渗透压刺激。结果如图7a所示。可以看出，在不同的细胞系中均产生了囊泡结构。

进一步用迁移体的特异性探针四甲基罗丹明标记的WGA对经上述低渗处理的NRK细胞进行染色，然后进行激光共聚焦显微镜观察，结果如图7b所示。结果显示，NRK细胞经诱导产生的囊泡结构被迁移体的特异性探针WGA染色，表明了工程化迁移体的产生。

图7a和7b的结果表明，在不同的细胞系中均可通过低渗透压诱导产生工程化迁移体。

实施例6.工程化迁移体的分离纯化及表征

I.包被培养瓶、铺细胞

用PBS配制2ug/ml人纤连蛋白，在37℃下对培养瓶底面进行包被一小时以上，然后按照1x 107个细胞/T175培养瓶的密度铺细胞。

II.诱导工程化迁移体的产生

1.细胞培养14-16h后，弃掉培养基，用PBS洗一遍；

2.加入含2uM latrunculinA的K-DPBS，37度孵育(具体孵育时间根据细胞系对LatrunculinA的敏感程度作调整,例如对于NRK细胞处理10min，对于MC38细胞处理45-60min；处理完成后细胞应呈现皱缩的状态，胞体周围有大量类似于收缩丝的网状结构)；

3.将培养瓶置于细胞培养箱中的水平摇床上，40rpm转速，每三分钟加一次水，共操作三次(每一步加水的体积由低渗诱导梯度以及培养瓶中液体的初始体积决定；低渗诱导梯度因细胞系而异，对于MC38细胞，每一步降低1/4盐浓度,初始体积为15ml,三次加水体积分别为5ml、6.5ml和8.5ml；对于NRK细胞，初始体积为15ml，三次加水体积为3ml、3.6ml和4.4ml)；

4.将转速调至60rpm，摇5min。

III.分离纯化工程化迁移体

1.弃上清，用低渗KDPBS(h-KDPBS；其盐浓度与低渗诱导完成时溶液体系中的盐浓度相近；对于MC38细胞，h-KDPBS为40％KDPBS；对于NRK细胞，h-KDPBS为60％KDPBS)，将细胞洗两遍；

2.加入含1mg/ml BSA的h-KDPBS(h-KDPBS-BSA),130rpm摇3min；

3.将上清液收集至50ml离心管中；

4.加入h-KDPBS-BSA,用移液器轻柔吹打培养瓶底面，将所收集的液体与第3步的上清液合并；

5. 4℃、300x g离心10min,保留上清；

6. 4℃、500x g离心10min,保留上清；

7.用8um孔径的parylene滤膜过滤上清至50ml低吸附管中；

8. 4℃、17000x g离心45-60min,弃上清；

9.用h-KDPBS-BSA重悬沉淀，转移至EP管中(离心管1)，加入等体积PBS-BSA；此时取一小部分液体(约总体积的1/50)于另一个离心管(离心管2)，用于测量蛋白浓度；

10. 4℃、17000x g离心15-20min，弃上清后加PBS，于注射前重悬沉淀，得到重悬于PBS中的工程化迁移体。

IV.工程化迁移体的表征

1.总蛋白的测定

离心管2中的液体4℃、17000x g离心5min，弃上清后用PBS洗一遍沉淀，弃上清，用30ul 2％SDS裂解沉淀，于95℃金属浴煮样。用BCA法测定蛋白浓度，可换算出离心管1中的总蛋白量，并按照注射剂量换算出相应的重悬体积。

2.形态观察

取1ul步骤III得到的工程化迁移体样品，稀释至10ul后(为观察小泡的形态和膜表面相分离情况，可按照1:500-1:1000的比例在稀释液中加入WGA染料)滴加在预先用10ug/ml纤连蛋白包被的共聚焦小皿上，室温静置1h以上，在激光共聚焦显微镜下观察，结果如图9a所示。

另外，将步骤III得到的工程化迁移体用冷冻电镜和负染透射电镜观察，结果分别如图9b和9c所示。

3.流式计数

于步骤III-9或10时取1ul液体，稀释至100ul。如小泡呈现双色荧光，可直接用PBS稀释；如小泡只有单色荧光，可用1：500WGA染料进行染色，以提高分群的效果。

4.蛋白免疫印迹

于步骤III-1上清中取少量液体，100x g离心后沉淀用2％SDS裂解，作为细胞胞体样品；步骤IV-1得到的样品作为工程化迁移体样品。将细胞胞体(cell)样品与工程化迁移体(eMig)样品等蛋白量上样，进行western-blot，对多种细胞器的经典标志物进行检测：细胞核(组蛋白H3)，线粒体(Tim23)，内质网(钙联蛋白)，溶酶体(Lamp2)，细胞质(GAPDH)，细胞膜(Na+-K+-ATP酶)，细胞膜黏着斑(整合素a5)，Tspan4-GFP(GFP)，结果如图10所示。

结果显示，分离纯化得到的工程化迁移体上高度富集了Tspan4、整合素a5、Na+-K+-ATP酶等细胞膜蛋白，而几乎没有来自胞内细胞器与可溶性蛋白的污染。

5.通透性评估

将分离纯化得到的工程化迁移体滴加在共聚焦小皿中，并在缓冲液中加入Cy5(一种无法通过完整膜的荧光染料)和右旋糖苷-TMR(Dex-TMR)以指示囊泡的通透性。运用激光共聚焦显微镜对液滴进行长时程拍摄，结果如图11a所示。可观察到在室温下工程化迁移体对Cy5(MW<1kDa)在一开始就几乎完全通透，对分子量更大的右旋糖苷-TMR(MW＝40kDa)则表现出缓慢通透的性质，工程化迁移体室温放置1.5h、6h、12h、24h、48h后对右旋糖苷-TMR通透比例的统计结果如图11b所示。

6.稳定性评估

为探究工程迁移体在室温下的稳定性，将分离纯化得到的工程化迁移体滴加在共聚焦小皿中，分别在第0、1、2、3、5和7天进行形态观察，结果如图12a所示。将平行保留的6份样品分别在第0、1、2、3、5、7天用WGA-AF594染色，然后按照图12b的设门策略用流式微颗粒分析系统进行计数,计数结果如图12c所示。

结果显示工程化迁移体在室温放置七天的时间内，数目缓慢下降，剩余的囊泡形态完好，这表明工程化迁移体非常稳定。

7.胆固醇对工程化迁移体稳定性的影响

先前报道过胆固醇对迁移体的形成至关重要(Huang Y,Zucker B,Zhang S,EliasS,Zhu Y,Chen H,Ding T,Li Y,Sun Y,Lou J,Kozlov MM,Yu L.Migrasome formation ismediated by assembly of micron-scale tetraspanin macrodomains.Nat CellBiol.2019 Aug；21(8):991-1002)。为了探究胆固醇对工程化迁移体形成的影响，用可选择性地从质膜中提取胆固醇的甲基-β-环糊精(MβCD)处理分离纯化的工程化迁移体。在液滴中加入胆固醇抽提试剂MβCD(10mM)，然后进行激光共聚焦显微镜检查，结果如图13所示。发现大部分工程化迁移体在10min内就发生严重的形变与损坏，这说明胆固醇对于工程化迁移体的稳定性具有至关重要的作用。

实施例7.膜蛋白在工程化迁移体上的装载

工程化迁移体的制备过程中可以将部分细胞膜转化为迁移体膜，因此，膜蛋白的递送可通过直接在生产细胞中转入编码目的基因及Tspan4的质粒来实现(图14a)。Tspan4的过表达配合工程化迁移体制备的其他步骤可大幅增加工程化迁移体的生产效率，而过表达的膜蛋白将大量富集在产生的工程化迁移体上，从而实现膜蛋白在工程化迁移体上的装载。可装载的膜蛋白包括各种细胞受体(如各种GPCR、PD-1、VEGFR等)、细胞外酶(如CD36、CD73)、离子通道、转运蛋白以及各种抗原(如S蛋白)等。

作为示例，验证了三种典型的质膜蛋白DAG1、Tgfbr1和PDCD1、一种膜结合蛋白Kras(图15)以及SARS-COV-2的刺突蛋白S蛋白(图16)在工程化迁移体上的装载。

对于膜蛋白DAG1、Tgfbr1、PDCD1和Kras，向生产细胞NRK细胞中转染含有Tspan4-GFP和目的基因序列的质粒，为方便观察目的蛋白的亚细胞定位与表达量，通过接头将目的基因片段融合至mcherry标签。各融合蛋白的氨基酸序列和载体信息如下所示。

Tspan4-接头-GFP(载体：pB-Hygro-GFP(载体图谱如图17所示)，插入位点BsrGI+BamHI)：

Tspan4的氨基酸序列以下划线表示；GFP的氨基酸序列以加粗的斜体表示；Tspan4和GFP之间的氨基酸序列为接头序列(PG；SEQ IN NO:2)。

DAG1-接头-mcherry(载体：pmcherry-N1(载体图谱如图18所示)，插入位点：EcoRI+KpnI)：

/>

DAG1的氨基酸序列以下划线表示；mcherry的氨基酸序列以加粗的斜体表示；DAG1和mcherry之间的氨基酸序列为接头序列(GDPPVAT；SEQ IN NO:4)。

PDCD1-接头-mcherry(载体：pB-Hygro-mcherry(载体图谱如图19所示)，插入位点：BsrGI+MluI)：

PDCD1的氨基酸序列以下划线表示；mcherry的氨基酸序列以加粗的斜体表示；PDCD1和mcherry之间的氨基酸序列为接头序列(TVPRARDPPVAT；SEQ IN NO:6)。

Tgfbr1-接头-mcherry(载体：pmcherry-N1(载体图谱如图18所示)，插入位点：EcoRI+KpnI)：

Tgfbr1的氨基酸序列以下划线表示；mcherry的氨基酸序列以加粗的斜体表示；Tgfbr1和mcherry之间的氨基酸序列为接头序列(TVPRARDPPVAT；SEQ IN NO:6)。

mcherry-接头-Kras(载体：pB-Hygro-mcherry(载体图谱如图19所示)，插入位点：BsrGI+MluI)：

mcherry的氨基酸序列以下划线表示；Kras的氨基酸序列以加粗的斜体表示；mcherry和Kras之间的氨基酸序列为接头序列(SGLRSRG；SEQ IN NO:9)。

转染后针对质粒上所带的抗性对细胞进行药杀筛选，建立稳定表达各种经mcherry标记的膜蛋白的细胞系。然后用实施例5中针对NRK细胞的低渗处理条件诱导细胞系产生已转载相应膜蛋白的工程化迁移体，然后进行激光共聚焦显微镜观察。结果显示，四种目的膜蛋白都在工程化迁移体上正确定位(图15)，表明膜蛋白可以整合到工程化迁移体上。

对于S蛋白，向生产细胞MC38细胞中转染含有Tspan4-GFP和目的基因序列的质粒，为方便观察目的蛋白的亚细胞定位与表达量，在目的基因片段后融合mcherry标签。转染后针对质粒上所带的抗性对细胞进行药杀筛选，建立稳定表达mCherry标记的S蛋白的细胞系。然后用实施例5中针对MC38细胞的低渗处理条件诱导细胞系产生已转载S蛋白的工程化迁移体，然后进行激光共聚焦显微镜观察。结果显示，S蛋白在工程化迁移体上正确定位(图16)，表明S蛋白可以有效整合到工程化迁移体上。

实施例8.可溶性蛋白在工程化迁移体上的装载

由于工程化迁移体是渗漏的，因此其不能直接递送胞质可溶性蛋白。为了实现可溶性蛋白的递送，可通过使生产细胞表达目的蛋白-膜蛋白的融合蛋白将可溶性蛋白锚定在膜上，从而防止可溶性蛋白的渗漏(图14a及图14b)。例如，可对膜蛋白突触融合蛋白(syntaxin-2，STX2)的N端进行改造，去除其胞内端功能，以得到截短的STX2(t-STX2)。然后将可溶性蛋白连接到t-STX2处于胞外的C端，以形成可溶蛋白-t-STX2融合蛋白(图14b)，从而使可溶性蛋白作为人造的质膜定位融合蛋白进行表达。t-STX2自身的拓扑学使得可溶性目的蛋白最终悬挂在细胞膜外侧，从而例如更利于该蛋白作为完整抗原被免疫系统识别。

除STX2之外，多种其他膜蛋白也常被用做膜锚定蛋白，例如Tetraspanin-4，CD81,CD9,CD63,PDGFR,Lamp2b等。

作为示例，验证了可溶性蛋白OVA在工程化迁移体上的装载。向生产细胞MC38细胞中转染含有Tspan4-GFP和t-STX2-OVA-mcherry编码序列的质粒。t-STX2和OVA的融合蛋白的氨基酸序列和载体信息如下所示。

t-STX2-接头-OVA-接头-mcherry(载体pmcherry-N1(载体图谱如图18所示)，插入位点：HindIII+BamHI)：

t-STX2的氨基酸序列以粗体表示；OVA的氨基酸序列以下划线表示；mcherry的氨基酸序列以加粗的斜体表示。

转染后针对质粒上所带的抗性对细胞进行药杀筛选，建立稳定表达mCherry标记的t-STX2-OVA融合蛋白的细胞系。然后用实施例5中针对MC38细胞的低渗处理条件诱导细胞系产生已转载t-STX2-OVA融合蛋白的工程化迁移体，然后进行激光共聚焦显微镜观察，结果如图20所示。

结果显示，t-STX2-OVA融合蛋白在工程化迁移体上正确定位，表明可溶性蛋白OVA成功装载到工程化迁移体上。

实施例9.其他目的分子在工程化迁移体上的装载

小分子药物、小核酸药物、肽端等目的分子在工程化迁移体中的装载可通过受体-配体结合系统对目的分子和生产细胞的改造来实现(图14a)。例如，可利用HaloTag与其人工合成配体的受体-配体相互作用(Los,G.V.,Encell,L.P.,McDougall,M.G.,Hartzell,D.D.,Karassina,N.,Zimprich,C.,Wood,M.G.,Learish,R.,Ohana,R.F.,Urh,M.,Simpson,D.,Mendez,J.,Zimmerman,K.,Otto,P.,Vidugiris,G.,Zhu,J.,Darzins,A.,Klaubert,D.H.,Bulleit,R.F.,&Wood,K.V.(2008).HaloTag:a novel protein labelingtechnology for cell imaging and protein analysis.ACS chemical biology,3(6),373–382.)来实现目的分子在工程化迁移体上的装载。首先，构建编码膜蛋白Tspan4和受体蛋白HaloTag的融合蛋白Tspan4-HaloTag的质粒。然后，将该质粒转染到工程化迁移体生产细胞中，以实现对生产细胞的改造。改造后的生产细胞经诱导产生工程化迁移体，分离纯化后的工程化迁移体在膜上包含受体蛋白HaloTag。通过将目的分子与HaloTag的配体进行偶联，形成目的分子-配体偶联物，从而实现对目的分子的改造。然后，将目的分子-配体偶联物与在膜上包含HaloTag的工程化迁移体在体外共孵育，通过HaloTag与其配体的相互作用将目的分子固定到工程化迁移体的膜上。HaloTag与其配体的共价结合特异、高效且不可逆。

除了Tspan4之外，其他膜蛋白，例如本文其他地方所述的膜蛋白也可以作为膜锚定蛋白用于目的分子在工程化迁移体上的装载。除了HaloTag及其配体，其他受体-配体结合系统也可用于目的分子在工程化迁移体上的装载，例如CP05与CD63结合系统(X.Gao,N.Ran,X.Dong,B.Zuo,R.Yang,Q.Zhou,H.M.Moulton,Y.Seow,H.Yin,Anchor peptidecaptures,targets,and loads exosomes of diverse origins for diagnostics andtherapy,Sci.Transl.Med.10(2018))，先将受体CD63加载到工程化迁移体膜上，然后利用CD63与其配体CP05的结合，将目的分子-CP05偶联物装载到含有CD63的工程化迁移体膜上。选择受体-配体结合系统时需尽量避免使用拥有大量体内自然配体的受体(例如PD-1)。

为了对该装载方法进行概念性验证，向生产细胞NRK细胞中转染含有Tspan4-HaloTag-GFP编码序列的质粒，转染含有Tspan4-GFP编码序列的质粒作为对照。Tspan4和HaloTag的融合蛋白的氨基酸序列和载体信息如下所示。

Tspan4-接头-GFP-接头-Halo(载体：pB-Hygro-GFP(载体图谱如图17所示)，插入位点：BsrGI+MluI)：

/>

Tspan4的氨基酸序列以粗体表示；GFP的氨基酸序列以下划线表示；Halo的氨基酸序列以加粗的斜体表示。

转染后针对质粒上所带的抗性对细胞进行药杀筛选，建立稳定表达的细胞系。然后用实施例5中针对NRK细胞的低渗处理条件诱导细胞系产生工程化迁移体。向工程化迁移体添加带荧光的HaloTag配体-TMR染料，室温共孵育15min后用不含染料的缓冲液洗两遍，滴加于共聚焦小皿中室温静置5h后进行激光共聚焦显微镜观察，结果如图21所示。

结果显示，HaloTag配体-TMR与Tspan4-HaloTag-GFP共定位在工程化迁移体上，表明目的分子可以通过HaloTag及其配体的相互作用装载到工程化迁移体上，并且这种装载高效、特异且不可逆。

小核酸药物除了可以通过上述受体-配体偶联方式装载到工程化迁移体之外，还可通过多种其他修饰方式装载到工程化迁移体膜上。例如，可以将化学修饰后的siRNA或反义寡核苷酸(ASO)与胆固醇偶联，通过胆固醇与细胞膜的相容性将小核酸药物装载到工程化迁移体的膜上(S.S.Yerneni,S.Lathwal,P.Shrestha,H.Shirwan,K.Matyjaszewski,L.Weiss,E.S.Yolcu,P.G.Campbell,S.R.Das,Rapid on-demand extracellular vesicleaugmentation with versatile oligonucleotide tethers,ACS Nano 13(2019)10555–10565)。该方式不需要对迁移体进行额外修饰，是一种快速经济的装载方式。还可以通过点击化学的方式将siRNA偶联物固定到膜上(T.Tian,H.X.Zhang,C.P.He,S.Fan,Y.L.Zhu,C.Qi,N.P.Huang,Z.D.Xiao,Z.H.Lu,B.A.Tannous,J.Gao,Surface functionalizedexosomes as targeted drug delivery vehicles for cerebral ischemia therapy,Biomaterials 150(2018)137–149)。该方式需要先将siRNA与肽段偶联，再通过点击化学的方式将肽段偶联到膜上。

mRNA药物在工程化迁移体中的装载可以通过mRNA结合蛋白来实现。常用的mRNA结合蛋白有L7Ae(Kojima,R.,Bojar,D.,Rizzi,G.,Hamri,G.C.,El-Baba,M.D.,Saxena,P.,

S.,Tan,K.R.,&Fussenegger,M.(2018).Designer exosomes produced byimplanted cells intracerebrally deliver therapeutic cargo for Parkinson'sdisease treatment.Nature communications,9(1),1305；Zhitnyuk,Y.,Gee,P.,Lung,M.,Sasakawa,N.,Xu,H.,Saito,H.,&Hotta,A.(2018).Efficient mRNA delivery systemutilizing chimeric VSVG-L7Ae virus-like particles.Biochemical and biophysicalresearch communications,505(4),1097–1102)和MS2BP(Prel,A.,Caval,V.,Gayon,R.,Ravassard,P.,Duthoit,C.,Payen,E.,Maouche-Chretien,L.,Creneguy,A.,Nguyen,T.H.,Martin,N.,Piver,E.,Sevrain,R.,Lamouroux,L.,Leboulch,P.,Deschaseaux,F.,Bouillé,P.,Sensébé,L.,&Pagès,J.C.,Highly efficient in vitro and in vivo delivery offunctional RNAs using new versatile MS2-chimeric retrovirus-like particles,Mol.Ther.-Meth.Clin.Dev.2(2015),15039)。首先，构建编码膜蛋白-mRNA结合蛋白融合蛋白的质粒，例如Tspan4-L7Ae或Tspan4-MS2。接下来，构建mRNA表达质粒，其3’非编码区(3’-UTR)包含蛋白结合位点，L7Ae的蛋白结合位点为C/D Box，MS2BP蛋白结合位点为MS2 StemLoop(MS2SL)。然后，将融合蛋白质粒和mRNA质粒共同转入生产细胞，诱导生产细胞产生工程化迁移体，分离纯化后的迁移体在其膜上包含目的mRNA分子。

实施例10.装载SARS-CoV-2刺突蛋白的工程化迁移体在小鼠体内诱导免疫应答

实验动物为C57BL/6品系的8周龄雌鼠，每组5只。具体分组为：

I.50ug S1重组蛋白(SinoBiological)+铝佐剂(thermo scientific)，腹腔注射(i.p.)；

II.10ug S1重组蛋白，尾静脉注射(i.v.)；

III.总蛋白20ug的仅表达Tspan4-GFP的工程化迁移体(NC-eMig)，尾静脉注射，作为阴性对照；

IV.总蛋白20ug的共表达Tspan4-GFP与S蛋白-mcherry的工程化迁移体(S-eMig)，尾静脉注射。

小鼠在第0天接受1次免疫，在第14天被处死后取外周血，用ELISA检测血清中S蛋白特异性IgG抗体的滴度，结果如图22b所示。发现S1蛋白+铝佐剂组(第I组)与S-eMig组(第IV组)都能有效地促进抗体产生；单独注射S1蛋白组(第II组)和NC-eMig阴性对照组(第III组)都无法促进抗体产生。这证明了单独的S蛋白抗原无法产生有效的免疫防护，通过工程化迁移体装载的S蛋白能够有效促进小鼠体内的免疫应答。

为了进一步比较铝佐剂组和S-eMig组的免疫效果，利用蛋白免疫印迹对S-eMig组中S1蛋白含量进行半定量分析。左起前6个泳道分别为1、2、5、10、20和50ng的S1重组蛋白，第7-10泳道分别为总蛋白量1ug的NC-eMig或S-eMig(eMig-1和eMig-2代表两次独立实验的样品)。对比各泳道条带亮度，可以换算出一剂(20ug)S-eMig中S1蛋白为约100ng，远小于铝佐剂组所用的S1重组蛋白量(50ug)，但两者的免疫效果却大致相似。这表明与传统的佐剂加免疫原性蛋白的免疫方式相比，工程化迁移体是更为高效的递送载体，能够有效地促进免疫应答。

本申请参考了各种发行的专利、公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，将所有这些引入本申请作为参考。若任何引入的参考文献和本说明书有冲突，则以本说明书为准。此外，落入现有技术范围的本发明的任何具体实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。因为所述实施方案被认为是本领域技术人员已知的，它们可以被排除，即使所述排除没有在本申请中明确列出。本发明的任何具体实施方案可从任何权利要求中以任何理由排除，不管是否与现有技术的存在有关。

虽然已经参考其特定实施方案描述本发明，本领域的技术人员应当理解可以进行各种改变且可以替换等同物而不脱离本发明的真正的精神和范围。另外，可作出许多修改以使特定的情况，材料，组合物，方法，方法步骤适于本发明的目的，精神和范围。所有这些修改都旨在权利要求的范围内。

序列表

<110> 清华大学

<120> 工程化迁移体及其制备方法和用途

<130> C22P2126

<150> CN202111412950.1

<151> 2021-11-25

<160> 11

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 479

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Tspan4-接头-GFP

<400> 1

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<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 2

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1

<210> 3

<211> 1136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DAG1-接头-mcherry

<400> 3

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Leu Leu Leu Leu Ser Val Ala Val Ala Gln Ala His Trp Pro Ser Glu

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<210> 4

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<212> PRT

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<220>

<223> 接头

<400> 4

Gly Asp Pro Pro Val Ala Thr

1 5

<210> 5

<211> 536

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDCD1-接头-mcherry

<400> 5

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1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

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Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala

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Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

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Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

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Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys

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<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 6

Thr Val Pro Arg Ala Arg Asp Pro Pro Val Ala Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 751

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Tgfbr1-接头-mcherry

<400> 7

Met Glu Ala Ala Ala Ala Ala Pro Arg Arg Pro Gln Leu Leu Ile Val

1 5 10 15

Leu Val Ala Ala Ala Thr Leu Leu Pro Gly Ala Lys Ala Leu Gln Cys

20 25 30

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35 40 45

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165 170 175

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Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln

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210 215 220

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260 265 270

Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu

275 280 285

Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys

290 295 300

Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile

305 310 315 320

Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser

325 330 335

Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu

340 345 350

Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala

355 360 365

Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu

370 375 380

Asp Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp

385 390 395 400

Ile Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser

405 410 415

Ile Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val

420 425 430

Pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln

435 440 445

Lys Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu

450 455 460

Arg Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala

465 470 475 480

Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser

485 490 495

Gln Gln Glu Gly Ile Lys Met Thr Val Pro Arg Ala Arg Asp Pro Pro

500 505 510

Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile

515 520 525

Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly

530 535 540

His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly

545 550 555 560

Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe

565 570 575

Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr

580 585 590

Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro

595 600 605

Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val

610 615 620

Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr

625 630 635 640

Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met

645 650 655

Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro

660 665 670

Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys

675 680 685

Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys

690 695 700

Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp

705 710 715 720

Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg

725 730 735

Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

740 745 750

<210> 8

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mcherry-接头-Kras

<400> 8

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

20 25 30

Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe

85 90 95

Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

100 105 110

Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys

115 120 125

Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

130 135 140

Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly

145 150 155 160

Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly

165 170 175

His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val

180 185 190

Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

195 200 205

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly

210 215 220

Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Gly Leu Arg

225 230 235 240

Ser Arg Gly Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly

245 250 255

Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val

260 265 270

Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val

275 280 285

Ile Asp Gly Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln

290 295 300

Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly

305 310 315 320

Phe Leu Cys Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile

325 330 335

His His Tyr Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val

340 345 350

Pro Met Val Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val

355 360 365

Asp Thr Lys Gln Ala Gln Glu Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe

370 375 380

Ile Glu Thr Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr

385 390 395 400

Thr Leu Val Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp

405 410 415

Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Arg Thr Arg Cys Ile Val Met

420 425 430

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 9

Ser Gly Leu Arg Ser Arg Gly

1 5

<210> 10

<211> 670

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> t-STX2-接头-OVA-接头-mcherry

<400> 10

Met Lys Lys Ala Ile Lys Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Trp

1 5 10 15

Ile Ile Ala Ala Val Ala Val Ala Val Ile Ala Val Leu Ala Leu Ile

20 25 30

Ile Gly Leu Ser Val Gly Lys Gly Ser Met Gly Ser Ile Gly Ala Ala

35 40 45

Ser Met Glu Phe Cys Phe Asp Val Phe Lys Glu Leu Lys Val His His

50 55 60

Ala Asn Glu Asn Ile Phe Tyr Cys Pro Ile Ala Ile Met Ser Ala Leu

65 70 75 80

Ala Met Val Tyr Leu Gly Ala Lys Asp Ser Thr Arg Thr Gln Ile Asn

85 90 95

Lys Val Val Arg Phe Asp Lys Leu Pro Gly Phe Gly Asp Ser Ile Glu

100 105 110

Ala Gln Cys Gly Thr Ser Val Asn Val His Ser Ser Leu Arg Asp Ile

115 120 125

Leu Asn Gln Ile Thr Lys Pro Asn Asp Val Tyr Ser Phe Ser Leu Ala

130 135 140

Ser Arg Leu Tyr Ala Glu Glu Arg Tyr Pro Ile Leu Pro Glu Tyr Leu

145 150 155 160

Gln Cys Val Lys Glu Leu Tyr Arg Gly Gly Leu Glu Pro Ile Asn Phe

165 170 175

Gln Thr Ala Ala Asp Gln Ala Arg Glu Leu Ile Asn Ser Trp Val Glu

180 185 190

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195 200 205

Asp Ser Gln Thr Ala Met Val Leu Val Asn Ala Ile Val Phe Lys Gly

210 215 220

Leu Trp Glu Lys Ala Phe Lys Asp Glu Asp Thr Gln Ala Met Pro Phe

225 230 235 240

Arg Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Pro Val Gln Met Met Tyr Gln Ile

245 250 255

Gly Leu Phe Arg Val Ala Ser Met Ala Ser Glu Lys Met Lys Ile Leu

260 265 270

Glu Leu Pro Phe Ala Ser Gly Thr Met Ser Met Leu Val Leu Leu Pro

275 280 285

Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu

290 295 300

Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg Lys Ile

305 310 315 320

Lys Val Tyr Leu Pro Arg Met Lys Met Glu Glu Lys Tyr Asn Leu Thr

325 330 335

Ser Val Leu Met Ala Met Gly Ile Thr Asp Val Phe Ser Ser Ser Ala

340 345 350

Asn Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala

355 360 365

Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val

370 375 380

Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala Ala Ser Val Ser Glu Glu Phe

385 390 395 400

Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys Ile Lys His Ile Ala Thr Asn

405 410 415

Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys Val Ser Pro Gly Asp Pro Pro Val

420 425 430

Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys

435 440 445

Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His

450 455 460

Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr

465 470 475 480

Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala

485 490 495

Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val

500 505 510

Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu

515 520 525

Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val

530 535 540

Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys

545 550 555 560

Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln

565 570 575

Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu

580 585 590

Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp

595 600 605

Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys

610 615 620

Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile

625 630 635 640

Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala

645 650 655

Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

660 665 670

<210> 11

<211> 778

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Tspan4-接头-GFP-接头-Halo

<400> 11

Met Ala Arg Gly Cys Leu Gln Gly Val Lys Tyr Leu Met Phe Ala Phe

1 5 10 15

Asn Leu Leu Phe Trp Leu Gly Gly Cys Gly Val Leu Gly Val Gly Ile

20 25 30

Trp Leu Ala Ala Thr Gln Gly Asn Phe Ala Thr Leu Ser Ser Ser Phe

35 40 45

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50 55 60

Met Ala Ile Gly Phe Val Gly Cys Ile Gly Ala Leu Lys Glu Asn Lys

65 70 75 80

Cys Leu Leu Leu Thr Phe Phe Val Leu Leu Leu Leu Val Phe Leu Leu

85 90 95

Glu Ala Thr Ile Ala Val Leu Phe Phe Ala Tyr Ser Asp Lys Ile Asp

100 105 110

Ser Tyr Ala Gln Gln Asp Leu Lys Lys Gly Leu His Leu Tyr Gly Thr

115 120 125

Gln Gly Asn Val Gly Leu Thr Asn Ala Trp Ser Ile Ile Gln Thr Asp

130 135 140

Phe Arg Cys Cys Gly Val Ser Asn Tyr Thr Asp Trp Phe Glu Val Tyr

145 150 155 160

Asn Ala Thr Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Leu Glu Phe Ser Asp Ser

165 170 175

Cys Gly Leu His Glu Pro Gly Thr Trp Trp Lys Ser Pro Cys Tyr Glu

180 185 190

Thr Val Lys Ala Trp Leu Gln Glu Asn Leu Leu Ala Val Gly Ile Phe

195 200 205

Gly Leu Cys Thr Ala Leu Val Gln Ile Leu Gly Leu Thr Phe Ala Met

210 215 220

Thr Met Tyr Cys Gln Val Val Lys Ala Asp Thr Tyr Cys Ala Pro Gly

225 230 235 240

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

245 250 255

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

260 265 270

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

275 280 285

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

290 295 300

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

305 310 315 320

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

325 330 335

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

340 345 350

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

355 360 365

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

370 375 380

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

385 390 395 400

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

405 410 415

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

420 425 430

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

435 440 445

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

450 455 460

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly

465 470 475 480

Ser Met Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val

485 490 495

Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp

500 505 510

Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val

515 520 525

Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala

530 535 540

Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr

545 550 555 560

Phe Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu

565 570 575

Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu

580 585 590

Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala

595 600 605

Phe Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu

610 615 620

Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg

625 630 635 640

Lys Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met

645 650 655

Gly Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu

660 665 670

Pro Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn

675 680 685

Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu

690 695 700

Glu Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe

705 710 715 720

Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu

725 730 735

Ala Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu

740 745 750

Asn Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala

755 760 765

Arg Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly

770 775

Claims (47)

1.制备工程化迁移体的方法，其包括

(a)对细胞进行以下一项或多项处理以诱导所述细胞产生工程化迁移体：

(1)低渗透压处理；

(2)破坏所述细胞的细胞骨架；

(3)抑制所述细胞的细胞体积调节功能；和

(4)使所述细胞过表达选自Tetraspanin家族成员的一种或多种蛋白；以及

(b)分离和/或纯化所述工程化迁移体。

2.根据权利要求1的方法，其中在步骤(a)中，进行(1)-(4)中的至少2种处理，至少3种处理，或者进行全部四种处理。

3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤(a)包括对细胞进行低渗透压处理。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中通过将细胞置于低渗缓冲溶液中，从而进行低渗透压处理，所述低渗缓冲溶液的渗透压为30.5-274.5mOsmol，例如30.5-150mOsmol。

5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中通过将细胞置于缓冲溶液中，并将所述缓冲溶液的渗透压降低至30.5-274.5mOsmol，例如30.5-150mOsmol，从而进行低渗透压处理。

6.根据权利要求5的方法，其中降低所述缓冲溶液的渗透压包括线性降低或阶梯式逐步降低。

7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤(a)包括破坏所述细胞的细胞骨架。

8.根据权利要求7的方法，其中通过使所述细胞与破坏细胞骨架的试剂接触，从而破坏所述细胞的细胞骨架。

9.根据权利要求8的方法，其中所述破坏细胞骨架的试剂包括微丝解聚剂，例如选自Latrunculin A、Latrunculin B、细胞松弛素A、细胞松弛素B、细胞松弛素C、细胞松弛素D和细胞松弛素E。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤(a)包括抑制所述细胞的细胞体积调节功能。

11.根据权利要求10的方法，其中通过抑制所述细胞的调节细胞体积的蛋白的表达或活性，从而抑制所述细胞的细胞体积调节功能。

12.根据权利要求11的方法，其中所述调节细胞体积的蛋白选自离子通道和转运蛋白。

13.根据权利要求12的方法，其中所述调节细胞体积的蛋白选自体积调节的阴离子通道(VRAC)，例如SWELL 1；体积调节的阳离子通道(VRCC)，例如TRPV4和TRPM3；和协同转运蛋白，例如KCC1、KCC3和KCC4。

14.根据权利要求10的方法，其中通过将所述细胞置于包含具有减弱的调节细胞体积变化能力的阳离子或阴离子的缓冲溶液中，从而抑制所述细胞的细胞体积调节功能。

15.根据权利要求14的方法，其中所述阳离子选自钾离子、铯离子和胆碱离子中的一种或多种。

16.根据权利要求14的方法，其中所述阴离子选自溴离子和碘离子中的一种或多种。

17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中步骤(a)包括使所述细胞过表达选自Tetraspanin家族成员的一种或多种蛋白。

18.根据权利要求17的方法，其中所述Tetraspanin家族成员包括Tspan1、Tspan2、Tspan3、Tspan4、Tspan5、Tspan6、Tspan7、Tspan8、Tspan9、Tspan10、Tspan11、Tspan12、Tspan13、Tspan14、Tspan15、Tspan16、Tspan17、Tspan18、Tspan19、Tspan20(UPK1B)、Tspan21(UPK1A)、Tspan22(PRPH2)、Tspan23(ROM1)、Tspan24(CD151)、Tspan25(CD53)、Tspan26(CD37)、Tspan27(CD82)、Tspan28(CD81)、Tspan29(CD9)、Tspan30(CD63)、Tspan31、Tspan32和Tspan33。

19.根据权利要求17的方法，其中步骤(a)包括使所述细胞过表达Tspan4。

20.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中所述方法进一步包括减小工程化迁移体的尺寸。

21.根据权利要求20的方法，其中通过使用特定孔径的过滤器挤压工程化迁移体从而减小工程化迁移体的尺寸；

任选地，减小的工程化迁移体的尺寸为纳米级，例如50-200nm。

22.根据权利要求1-21中任一项的方法，其中所述细胞为正常细胞或癌细胞。

23.由权利要求1-22中任一项的方法制备的工程化迁移体。

24.递送系统，其包含分离或纯化的迁移体和荷载，所述荷载直接或间接连接至所述迁移体的膜。

25.根据权利要求24的递送系统，其中所述迁移体选自天然产生的迁移体和经人工诱导产生的工程化迁移体。

26.根据权利要求25的递送系统，其中所述工程化迁移体由权利要求1-22中任一项的方法产生。

27.根据权利要求24-26中任一项的递送系统，其中所述荷载选自蛋白质例如膜蛋白和可溶性蛋白、肽、核酸例如DNA和RNA、和小分子化合物。

28.根据权利要求24-26中任一项的递送系统，其中所述载荷选自治疗性蛋白、免疫原性蛋白、细胞因子、酶、siRNA、microRNA、反义寡核苷酸(ASO)、mRNA、CRISPR系统、细胞毒性剂、治疗性小分子和靶向分子。

29.根据权利要求28的递送系统，其中所述靶向分子选自抗体或其抗原结合片段；整合素；找到我/吃我信号(find-me/eat me signal)，例如PAMP和DAMP；和不要吃我信号(don’t-eat-me signal)，例如CD47和CD24。

30.根据权利要求24-29中任一项的递送系统，其中所述荷载通过物理吸附或化学连接而连接至迁移体的膜。

31.根据权利要求22-29中任一项的递送系统，其中所述荷载通过选自以下的方式连接至所述迁移体的膜：

(1)与迁移体的膜组分例如膜蛋白或胆固醇连接；

(2)与连接至迁移体膜的蛋白或肽连接，优选所述蛋白或肽通过点击化学连接至迁移体的膜；和

(3)与结合对的第一成员连接，其中所述迁移体的膜包含所述结合对的第二成员，所述荷载通过所述第一成员和第二成员的结合连接至迁移体的膜。

32.根据权利要求31的递送系统，其中所述结合对包括受体-配体结合对。

33.根据权利要求32的递送系统，其中所述结合对为HaloTag及其配体，或CP05和CD63。

34.根据权利要求31的递送系统，其中所述荷载为mRNA，并且所述迁移体的膜包含mRNA结合蛋白，所述mRNA通过其3’-UTR的蛋白结合位点与所述mRNA结合蛋白的结合连接至迁移体的膜。

35.根据权利要求24-29中任一项的递送系统，其中所述荷载作为膜蛋白表达在迁移体膜的表面。

36.根据权利要求24-29中任一项的递送系统，其中所述荷载作为与膜蛋白或其部分融合的融合蛋白表达在迁移体膜的表面。

37.产生递送系统的方法，所述递送系统包含分离或纯化的迁移体和荷载，所述荷载选自蛋白质、肽、核酸(例如DNA和RNA)和小分子化合物，其中所述方法包括：

从细胞分离或纯化迁移体，所述迁移体是天然产生的迁移体或经人工诱导产生的工程化迁移体；和

将所述荷载直接或间接连接至所述迁移体的膜，从而产生所述递送系统。

38.根据权利要求37的方法，其中将所述荷载通过物理吸附或化学连接而连接至迁移体的膜。

39.根据权利要求37的方法，其中将所述荷载通过选自以下的方式连接至所述迁移体的膜：

(1)将所述荷载与迁移体的膜组分例如膜蛋白或胆固醇连接；

(2)将所述荷载与连接至迁移体膜的蛋白或肽连接，优选所述蛋白或肽通过点击化学连接至迁移体的膜。

40.产生递送系统的方法，所述递送系统包含工程化迁移体和荷载，所述荷载选自蛋白质、肽、核酸(例如DNA和RNA)和小分子化合物，其中所述荷载与结合对的第一成员连接，并且所述迁移体的膜包含所述结合对的第二成员，其中所述方法包括：

使所述细胞在细胞膜上表达所述结合对的第二成员；

由所述细胞产生在膜上包含所述结合对的第二成员的工程化迁移体；和

将所述荷载与所述结合对的第一成员的复合物与所述工程化迁移体接触，从而通过所述第一成员与第二成员的结合产生所述递送系统。

41.根据权利要求40的方法，其中所述结合对包括受体-配体结合对。

42.根据权利要求41的方法，其中所述结合对为HaloTag及其配体，或CP05和CD63。

43.产生递送系统的方法，所述递送系统包含工程化迁移体和荷载，所述荷载为mRNA，并且所述迁移体的膜包含mRNA结合蛋白，所述mRNA通过其3’-UTR的蛋白结合位点与所述mRNA结合蛋白结合，其中所述方法包括：

使所述细胞表达所述mRNA，

在上述步骤之前、之后或同时，使所述细胞在细胞膜上表达所述mRNA结合蛋白；和

由所述细胞产生包含工程化迁移体和mRNA的递送系统，其中所述mRNA通过与所述mRNA结合蛋白的结合连接至所述工程化迁移体的膜。

44.产生递送系统的方法，所述递送系统包含工程化迁移体和荷载，所述荷载为蛋白质并且表达在工程化迁移体膜的表面，其中所述方法包括：

使所述细胞在细胞膜上表达所述蛋白质；和

由所述细胞产生包含工程化迁移体和表达在工程化迁移体膜的表面的蛋白质的递送系统。

45.根据权利要求44的方法，其中所述蛋白质为膜蛋白。

46.根据权利要求44的方法，其中所述蛋白质为可溶性蛋白，并且作为与膜蛋白或其部分融合的融合蛋白表达在迁移体膜的表面。

47.根据权利要求37-46中任一项的方法，其中所述工程化迁移体由权利要求1-22中任一项的方法产生。

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