CN101301478A - 以低氧诱导因子1-α(HIF1α)作为靶标的G-四合体寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗和/或预防癌症的特殊G－四合体寡核苷酸。在特定情况下，所述G－四合体寡核苷酸抑制HIF－1α。

Description

以低氧诱导因子1-α(HIF1α)作为靶标的G-四合体寡核苷酸
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是使用来自国立卫生研究院(National Institutes of Health)资金号NIH R01 grant CA104035的联邦基金来完成的。美国政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本发明总地来说至少涉及分子生物学、细胞生物学和医学领域，尤其是癌症领域。具体地，本发明涉及治疗和/或预防癌症的方法和/或组合物。
背景技术
血管生成
正在生长的肿瘤细胞团必须募集自己的血液供应以维持氧气和营养物，这称为肿瘤血管生成(Duffy等人，2003)。在肿瘤中，O2和营养物的可获得性受限于活跃增殖的细胞之间的竞争，而代谢产物的扩散被高胞间压力抑制(Duffy等人，2003)。为了对肿瘤内的低氧状态作出响应，肿瘤细胞产生的血管生成刺激因子诱导从已有血管系统形成新的血液供应，这对于在恶劣微环境中肿瘤细胞的存活和增殖非常重要(Folkman，1971；Zhong等人，1999；Niedergethmann等人，2000)。因此，低氧在生理和病理性血管生成中作为关键性因素。
肿瘤变成低氧状态的原因还不清楚，但多种机制可能促成它的形成。这至少包括以下机制：i)肿瘤细胞不受限制的生长和加速的氧气消耗；ii)肿瘤的弱的淋巴引流导致高胞间压力、血管萎陷(collapse)和低pH；和/或iii)通过不成熟血管系统的富氧血液的肿瘤内分流。而且，肿瘤血管生成也许不必等同于肿瘤血液供应(Ikeda等人，1999)。实验数据显示在低氧条件下肿瘤细胞与血管的距离为300-400μm，这表明低氧条件通常建立在直径只有0.5mm的肿瘤中(Khan等人，2002)。
作为癌症治疗的重要分子靶标的HIF-1α
低氧是许多人类癌症进展和治疗抗性中的重要过程。低氧诱导因子-1(HIF-1)通过上调与新陈代谢、血管生成、细胞存活、细胞侵入和药物抗性相关的其靶基因而在肿瘤增长中起着重要作用(Powis和Kirkpatrick，2002；Hirota和Semenza，2006)。作为核因子，HIF-1在低氧细胞中被诱导，并与位于人EPO基因3′-侧翼区中的顺式作用低氧应答元件(HER)结合(Gatenby等人，1998；Brahimi-Horn等人，2001)。HIF-1是由HIF-1α亚基和HIF-1β亚基组成的异源二聚体转录因子(图2)(Brahimi-Horn等人，2001)。两个HIF-1亚基均属于转录因子的包含碱性螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，bHLH)的PER-ARNT-SIM(PAS)-结构域家族(Semenza和Wang，1992)。到目前为止，已发现超过60个公认的低氧可诱导的基因直接受HIF-1调节。HIF-1α是关键的蛋白质，它决定HIF-1的存在和低氧可诱导的基因的转录(Kowis和Kirkpatrick，1992)。在常氧条件下，HIF-1α的细胞半衰期是5分钟左右，因为该蛋白质被泛素-蛋白酶体系统快速降解(Wang和Semenza，1995；Wang等人，1995；Huang等人，1998)。在低氧条件下，HIF-1α分子上P564残基缺乏翻译后羟基化使HIF-1α蛋白质被稳定(Huang等人，1998)。低氯条件导致HIF-1α稳定化并转运到细胞核中，与HIF-1β二聚体化以形成HIF-1复合物，和通过HIF-1与靶序列中特异HREs的结合而激活转录(Salceda和Caro，1997)。已经证明，在许多人类癌症，包括结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌和胰腺癌中，HIF-1α都被过表达(Salceda和Caro，1997；Semenza，2003)。在人类癌症中HIF-1α的过表达导致肿瘤内低氧以及遗传改变，这伴随着治疗失败和增加的患者死亡率(Semenza，2003)。在许多人类癌症样本中HIF-1αmRNA的表达被显著上调。临床上，HIF-1α过表达已显示出是高侵袭性疾病的标志，并且在大量癌症，包括胰腺癌、前列腺癌及其他癌症中与差的预后和治疗失败相关联(Powis和Kirkpatrick，2004；Hirota和Semenza，2006)。已证明，HIF-1α在肿瘤中介导了低氧诱导的VEGF表达，导致高侵袭性肿瘤生长(Semenza，2003)。因此，对人类癌症来说靶向HIF-1α是有用的治疗和/或预防靶标。
HIF-1α蛋白的调节
图1和2显示了HIF-1α蛋白的调节：(i)生长因子(GF)，例如IGFR、EGFR、IL-1和HER2，与同源的受体酪氨酸激酶(RTK)结合从而激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径；和(ii)当在RTK中连接生长因子时，PI-3K被活化。PI-3K磷酸化并激活其下游信号传导途径，例如丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)。然后，Akt激活雷帕霉素的哺乳动物靶(mammaliantarget of rapamycin，mTOR)从而增加HIF-1α的合成。这个途径被PTEN肿瘤阻抑蛋白负调节，它使PI-3K的产物去磷酸化。在(iii)中，在MAPK途径中，上游MAP/ERK激酶(MEK)激活受细胞外信号调节的激酶(ERK)。接着，ERK激活MNK从而增加细胞中包括HIF-1αmRNA在内的mRNA翻译为蛋白的速率。(iv)在常氧条件下，HIF-1脯氨酰羟化酶(PHD)使氨基酸P402和P564处的脯氨酰残基羟基化，然后被VHL识别，并被靶向泛素蛋白酶体途径。K532的乙酰化也可促进VHL的结合。HIF-1α中N803的O2依赖性羟基化需要酶FIH-1(抑制HIF-1的因子)。常氧期间N803的羟基化阻断p300和CBP与HIF-1α结合，因此抑制了HIF-1介导的基因转录。(v)在低氧条件下，因为不能获得双氧这一主要底物，所以HIF-1α不被羟基化。未修饰的蛋白质逃脱了与VHL的结合、泛素化及降解，然后二聚体化HIF-1α并刺激其靶基因的转录。当N803未被天冬酰胺酰-羟基化的时候，p300和CBP能够结合HIF-1α，从而允许HIF-1靶基因的转录活化，这涉及许多细胞过程：血管生成、抗凋亡、新陈代谢、转移及其他(Semenza，2003；Shi和Fang，2004)。
发明概述
本发明旨在用于个体癌症治疗和/或预防的系统、组合物和方法。在特殊情形下，本发明涉及向具有任何类型癌症的个体提供癌症治疗和/或预防的寡核苷酸。在特定实施方案中，本发明对例如前列腺、胰腺、肺、脑、乳腺、肝、结肠、子宫、子宫颈、睾丸、皮肤、骨、脾、甲状腺、胃、肛门、胆囊或食道的癌症是有效的。在特定实施方案中，个体是哺乳动物，例如人、狗、猫、马、猪、绵羊或山羊。
在一些实施例中，本发明涉及用于患有癌症、患有转移性癌症、怀疑患有癌症或对于形成癌症来说处于高风险的个体的组合物和方法。本发明的疗法可以在患有癌症的任何时间点用于个体，在特定实施方案中，个体还接受了其他癌症疗法。在特殊情形下，个体在使用本发明治疗/预防组合物/方法前，使用本发明治疗/预防组合物/方法后，和/或使用本发明治疗/预防组合物/方法期间接受其他疗法。
本发明的寡核苷酸可以由特定序列组成，或在本发明的其他方面，在寡核苷酸上还有其他序列。在特定实施方案中，寡核苷酸由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，或SEQ ID NO：13组成。在其他实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，或SEQ ID NO：13。在另外的实施方案中，寡核苷酸基本上由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，或SEQ ID NO：13组成。在特定实施方案中，寡核苷酸被分离。在特定方面，寡核苷酸抑制HIF-1α表达和/或活性。在进一步的实施方案中，抗癌剂包括一种或多种本发明的寡核苷酸。
本发明的另一个实施方案包括抑制过度增生性细胞生长的方法，该方法包括给细胞施用有效量的富含G的寡核苷酸组合物，其中该组合物调节HIF1α，从而抑制过度增生性细胞生长。在特定实施方案中，过度增生性细胞是癌细胞，例如肿瘤细胞。例如，癌细胞是黑色素瘤细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、睾丸癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、淋巴癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、骨癌细胞或软组织癌细胞。
本发明的另一个实施方案是治疗过度增生疾病如癌症的方法，包括以对于治疗过度增生疾病来说有效的量给患者施用有效量的富含G的寡核苷酸。此外，所述富含G的组合物可与化疗、免疫疗法、手术或放疗组合使用。该组合物包含脂质-寡核苷酸复合物。
在特定情形下，G-四合体(quartet)寡核苷酸抑制HIF-1α，并在特殊情形下抑制HIF-1α的活性、功能和/或表达。在特定实施方案中，HIF-1α的抑制是直接抑制或间接抑制。
在本发明的一个实施方案中，涉及治疗和/或预防个体中过度增生疾病的方法，该方法包括向所述个体递送治疗有效量的一种或多种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含G四合体并且抑制HIF1α。在特定实施方案中，所述寡核苷酸被进一步定义为包含选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13及其组合的序列。在另外的特定实施方案中，所述寡核苷酸被进一步定义为基本上由选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13的序列组成。在其他的特定实施方案中，所述寡核苷酸被进一步定义为由选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13及其组合的序列组成。
在本发明的一些实施方案中，个体还接受其他癌症疗法，例如包括化疗、免疫疗法、放疗、手术或其组合。在特定实施方案中，癌症是胰腺癌或前列腺癌。
在本发明的其他实施方案中，涉及选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13及其组合的分离的寡核苷酸。
在本发明的其他实施方案中，涉及试剂盒，其包含一种或多种选自SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13及其组合的寡核苷酸。在特定实施方案中，该试剂盒还可以包含其他的抗癌剂。
在本发明的其他实施方案中，涉及胞内递送富含G的寡核苷酸的方法，其包括下列步骤：将所述寡核苷酸变性，其中所述寡核苷酸选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13及其组合；将所述寡核苷酸与脂质混合以形成寡核苷酸-脂质复合物；和将所述寡核苷酸-脂质复合物与细胞一起孵育，其中所述寡核苷酸被内化入细胞中。在特定方面，内化的寡核苷酸被诱导而形成G-四合体结构。在进一步的特定方面，G-四合体进入细胞核。在另外的特定方面，G-四合体结构抑制HIF1α表达和/或活性。
在本发明的一个实施例中，涉及SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13及其组合的分离的寡核苷酸。
以上描述相当宽泛地概述了本发明的特征和技术优势，以便可以更好地理解以下关于本发明的详细描述。下文将描述本发明的其他特征和优势，它们构成了本发明权利要求所要求保护的主题。本领域技术人员应意识到，所公开的概念和特定实施方案可以很容易地用作为了达到相同的本发明目的而改造或设计其他结构的基础。本领域技术人员还应该认识到，这种等同的构建不脱离在所附的权利要求中阐明的本发明的精神和范围。从下面的描述并结合附图可以更好地理解在关于本发明的组织和操作方法方面被认为是本发明的特点的新特征，以及其他的目标和优势。但应该清楚地了解，每幅图只是为了解释说明和描述，而不是为了对本发明进行限定。
附图简述
为了更全面的理解本发明，现结合附图进行下列描述。
图1显示了HIF-1α的合成和调节的示例性途径。
图2显示了HIF-1α和HIF-1β的分子结构。
图3显示了T40214，JG243，JG244，T40231和T40232的示例性G-四合体结构。
图4提供了G-四合体碱基的示例性氢键形成的图示。
图5展示了T40214和JG243的分子结构。
图6显示了示例性JG-ODNs的电泳图。
图7提供了显示了JG-ODNs的药物活性的Western印迹。N：常氧条件，在该条件下HIF-1α不活化。在低氧条件下JG-ODNs在细胞中抑制HIF-1α活化的表达。作为对照ODN的T40214对HIF-1α无活性。β-肌动蛋白用作蛋白相等上样的对照。
图8A展示了直方图，显示JG244和HIF-1α的C-末端结构域间形成的氢键的分布。根据1000个对接复合物(docking complex)，47.8％的氢键分布于残基796到806的区域，该区域被鉴定为JG-ODN的结合位点。图8B显示了复合物的NMR结构：左图是CBP结合入HIF1α的C-末端结构域中的复合物(Dames等人，2002)，和右图是JG244结合入HIF1α的C-末端结构域中的复保物的对接(docking)结构。所述复合物显示出，JG244阻断CPB和HIF-1α的结合相互作用，因为它们都有相同的结合位点。
图9显示了JG243和JG244阻断HIF1α及其下游蛋白VEGF的表达。粘着斑蛋白用作相等蛋白上样的对照。
图10A显示了未处理的细胞；用PEI(载体)、非特异性G-ODN/PEI和JG244/PEI处理的细胞。在图10B和10C中，细胞周期结果显示，在胰腺癌细胞(PANC1)和前列腺癌细胞(PC3)中JG243和JG244显著诱导细胞凋亡，因为SG1相应于核中的受损的DNA。(10B)：PANC1中细胞周期的直方图；(10C)：每次处理的SG1的％的图。
图11A-11D是显示了24(B)、48(C)和72(D)小时后裸鼠头部和颈部肿瘤中标记的G-四合体ODN分布的荧光显微照片，。对照图(A)显示未进行药物注射的肿瘤(Jing等人，Mol.Can.Ther.5：279(2006))。
图12A-12C显示了分别用PEI(安慰剂)，JG243和JG244治疗22天的前列腺肿瘤。与安慰剂组的肿瘤生长相比，示例性的JG243和JG244在异种移植模型中显著抑制前列腺肿瘤生长。
图13A-13B显示了肿瘤体积对药物治疗天数的图(13A)和RTV对药物治疗天数的图(13B)。
图14A-14C显示了分别用PEI(安慰剂)、JG243和JG244治疗14天的胰腺癌肿瘤。与安慰剂组的肿瘤生长相比，示例性的JG243和JG244在异种移植模型中显著抑制胰腺肿瘤生长。
图15A-15B显示了PANC-1中肿瘤体积对药物治疗天数的图(15A)和PANC-1中RTV对药物治疗天数的图(15B)。
图16显示了JG-ODNs抑制HIF-1α活化和转录的示例性机制。HRE是低氧应答元件。
图17显示了T40231中的示例性的G四合体。
图18显示了在患NSCLC肿瘤(A549)的裸鼠中肿瘤体积的增加倍数对药物治疗天数的图。
图19提供了在患NSCLC肿瘤(A549)的裸鼠中个体相对肿瘤体积(RTV)对药物治疗天数的图。
图20显示了与HIF-1α的结合能(kcarl)对JG-ODNs抑制HIF-1α活化的IC50(μM)的示例性图。
发明详述
对本领域技术人员显而易见的是，对于本申请公开的发明可以有各种不同的实施方案和修改而不脱离本发明的范围和精神。
本申请在此完整引入美国专利号7,199,078作为参考。
I.定义
在此处使用时，单词“a”或“an”当在句子和/或说明书中与术语“包含”联用时可能表示“一”，但其还有“一或多”、“至少一”和“一或多于一”的意思。本发明的一些实施方案可能由或基本上由本发明的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成。考虑了，此处所描述的任何方法或组合物可以参照此处所描述的其他方法或组合物来实施。
此处使用的术语“碱基”包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。使用以下缩写。“A”指腺嘌呤及其脱氧核糖衍生物，“T”指胸腺嘧啶，“U”指尿嘧啶，“G”指鸟嘌呤及其脱氧核糖衍生物，“C”指胞嘧啶及其脱氧核糖衍生物。普通技术人员很容易认识到这些碱基可以被修饰或衍生以优化本发明的方法。此外，碱基还可以指用于代替A、C、T或G的非天然(合成)碱基。
此处使用的术语“有效量”定义为足以可检测地改善、降低、最小化或限制疾病或至少一种其征状的程度的试剂(例如寡核苷酸或寡核苷酸与其他试剂的组合)的量。在一些高度优选的实施方案中，它还包括消除、根除或治愈疾病。
此处使用的术语“癌症”定义为细胞的过度增生，它的独特性状即正常控制的丧失导致不受调节的生长、缺少分化、局部组织侵袭和/或转移。例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌和肺癌。
术语“过度增生疾病”定义为由于细胞过度增生产生的疾病。示例性的过度增生疾病包括但不限于癌症或自身免疫疾病。其他的过度增生疾病包括血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化或炎性肠病。
此处使用的术语“寡核苷酸”定义为由两个或更多个，优选多于10个的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子。它确切的大小依赖于许多因素，包括所述寡核苷酸对各种不同病毒的特异性和抗病毒活性。此外，碱基还可以指用于代替A、C、T或G的非天然(合成)碱基。
此处使用的术语“治疗有效量”定义为对于改善至少一种与疾病相关的症状所需的分子或化合物的量。例如，在治疗癌症中，可以减轻、预防、延迟或阻止癌症的任何症状的分子或化合物是治疗有效的。并不要求分子或化合物的治疗有效量一定能够治愈疾病，只要能提供对疾病的治疗就可以。如果所施用的量是生理上显著的，那么就是以治疗有效量施用分子或化合物。如果分子或化合物的存在导致受者个体生理上的技术改变，那么它就是生理上显著的。
此处使用的术语“治疗”定义为通过医药学或手术方法控制个体的医学状况(例如过度增生疾病，包括例如癌症)。治疗能够改善或减轻至少一种医学状况或疾病的症状，并且不要求能够提供治愈。
此处使用的术语“样品”表示包含至少一个癌细胞(包括至少一个肿瘤细胞)的患者样品。组织或细胞样品可取自身体的几乎任何部分。获得样品最合适的方法依赖于被怀疑或诊断的癌症类型。活组织检查方法例如包括针、内窥镜和切除。
使用本发明的治疗组合物可实施此处所述的任何方法，反之亦然。考虑了，关于本发明某一方面所讨论的任何实施方案可以在本发明的其他方面实施或应用。
II.寡核苷酸
一般来说，在特定实施方案中，本发明的寡核苷酸可含有任何百分比的允许四元体(tetrad)形成的鸟苷碱基。在特定实施方案中，本发明的寡核苷酸包含一定百分比的鸟苷碱基。在特定方面，鸟苷对于形成可以稳定寡核苷酸的三维结构的四元体是很重要的。因此，本发明的寡核苷酸可以包含或含有两个或更多个的两个或更多个鸟苷碱基的片段，和总体较高的G百分比，以使寡核苷酸形成至少一个鸟苷四元体。在特定实施方案中，G四合体寡核苷酸(GQ-ODNs)的残基的范围从14-聚体(例如JG-ODNs)到24-聚体(例如T40216)。在14-聚体GQ-ODNs中，至少有8个G残基(例如8到11个)(57％-79％)，但是，在24-聚体(T40216)中有20个G-残基(83％)。在本发明的特定实施方案中，G-四合体ODN在其结构中部包含至少两个G-四合体(8个G残基)片。例如，在其结构中部，14-聚体只有两个G-四合体片，而T40216有4个G-四合体片。T40214是示例性的16-聚体，其在中部有两个G-四合体，在环区域中有4个G，所以它包含12个G残基(75％)。
在本发明的特定实施方案中，寡核苷酸具有不少于8个核苷酸，例如，不少于9，不少于10，不少于11，不少于12，不少于13，不少于14，不少于15，不少于16，不少于17，不少于18，不少于19，不少于20个核苷酸。在本发明的其他特定实施方案中，寡核苷酸具有，例如，不多于8个核苷酸，不多于9个核苷酸，不多于10，不多于11，不多于12，不多于13，不多于14，不多于15，不多于16，不多于17，不多于18，不多于19，不多于20，不多于21，不多于22，不多于23，不多于24，不多于25，不多于26，不多于27，不多于28，不多于29，或不多于30个核苷酸。在一些方面，寡核苷酸具有例如从11到19个核苷酸，从12到14个核苷酸，从12到15个核苷酸，从12到16个核苷酸，从12到17个核苷酸，从13到14个核苷酸，从13到15个核苷酸，从13到16个核苷酸，从13到17个核苷酸，从14到15个核苷酸，从14到16个核苷酸，从14到17个核苷酸，从14到18个核苷酸，从14到19个核苷酸，从15到16个核苷酸，从15到17个核苷酸，从15到18个核苷酸，从15到19个核苷酸，从16到17个核苷酸，从16到18个核苷酸，或从16到19个核苷酸。
在特定实施方案中，寡核苷酸包含但不限于下列序列中的至少一种或多种：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13。在一些方面，寡核苷酸在试剂中提供给个体，所述试剂在本发明的一些实施方案中可以是药物载体。
III.胞内递送系统
本发明在一些方面涉及将富含G的寡核苷酸递送入细胞，特别是递送入细胞核中的方法。本发明的新的胞内递送系统基于钾诱导的G-四合体结构形成这种性质。还考虑了，富含G的寡核苷酸可用作治疗剂来治疗过度增生疾病，例如癌症。设计富含G的寡核苷酸以通过结合相互作用来抑制至少一种靶蛋白的功能，这不同于反义寡核苷酸，例如其通过杂交而作为模板以靶向特定mRNA或DNA，从而在转录或翻译水平上抑制基因表达。
本发明的一个特定实施方案是胞内递送富含G的寡核苷酸的方法，包括以下步骤：将所述寡核苷酸变性；将所述寡核苷酸与脂质混合以形成寡核苷酸-脂质复合物；和将所述寡核苷酸-脂质复合物与细胞一起孵育，其中所述寡核苷酸被内化入细胞中。在特定实施方案中，内化的寡核苷酸被诱导而形成G-四合体结构。在另一实施方案中，G-四合体结构进入细胞核。所述G-四合体结构抑制HIF1α。更特别地，G-四合体是或包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：13。
在一些实施方案中，在K+离子存在的条件下富含G的寡核苷酸形成宽约15
Figure A20071014212800141
长约15
Figure A20071014212800142
的稳定且对称的分子内G-四合体结构(Jing和Hogan，1998)。该结构看上去像一个圆筒，里面带正电荷，表面带负电荷。生理条件下复合物上的净电荷最有可能接近于中性的两性离子。
本发明提供了胞内递送富含G的寡核苷酸的方法。该方法包括将所述寡核苷酸变性；将所述寡核苷酸与脂质混合以形成寡核苷酸-脂质复合物；和将所述寡核苷酸-脂质复合物与细胞一起孵育，其中所述寡核苷酸被内化入细胞中。
考虑了，将寡核苷酸与脂质混合以形成脂质-oligo或脂质-DNA复合物。本领域技术人员知道寡核苷酸和DNA是可以互换的。将关于这里所使用的脂质组合物、脂质施用的冗长讨论引入该部分中作为参考。
在本发明中，递送系统基于依赖于钾的G-四合体结构形成这种性质。细胞内和细胞外的K+浓度的差异用于诱导富含G的寡核苷酸分子在细胞内和细胞外形成不同的结构。本领域技术人员熟知且了解，胞外K+离子浓度是4mM，胞内是140mM。因此，将G-四合体涉及成在4mM K+中是未折叠的结构，而在包含140mM K+的环境中折叠。
根据本发明，利用DNA-脂质复合物来胞内递送G-四合体寡核苷酸可分为3个步骤：(1)细胞对于DNA的结合和内化，(2)DNA逃逸入细胞质，和(3)DNAoligos进入细胞核。脂质-DNA复合物与细胞膜结合的主要驱动力是静电(Maurer等人，1999；Chesnoy和Huang，2000)。
考虑了，脂质-DNA的内化主要通过胞吞作用来实现。DNA寡核苷酸释放入细胞质十分可能是阳离子脂质和膜上的阴离子分子之间相互作用而引起的。因此，投料配比、孵育时间或脂质组成的改变可以增加DNA寡核苷酸从脂质-DNA复合物中释放的百分比和速度。
更进一步地，本发明的G-四合体寡核苷酸进入细胞核。认为重折叠的G-四合体分子能进入细胞核的主要原因是由于它们的结构特征。在寡核苷酸分子从脂质-DNA复合物中释放并进入细胞质后，它们由于细胞内K+离子浓度的影响而再次折叠形成G-四合体。高度稳定且致密的G-四合体结构显著增强了所述寡核苷酸抵抗核酸酶消化的能力(Jing，2000)。因此，重新形成的G-四合体结构具有更强的通过核孔进入细胞核的能力。
A.使用其他药物-载体来表征用于JG-ODN递送的除PEI以外的其他载体
基于G-四合体ODNs及其递送系统的物理特性来设计该方法(Jing等人，2002)。具有特异的特性(低聚集能力和总体中性)的G-四合体寡核苷酸与脂质体整合的趋势较弱。G-四合体ODNs也不能通过细胞膜直接进入细胞。因此，我们开发了一种新的用于G-四合体ODNs的胞内递送系统(Jing等人，2002；Jing等人，2003)。最近，聚合物纳米颗粒被认为是抗癌剂的具有前途的载体，因为纳米颗粒能够提供更有效并且损害性更小的药物递送。因此，在特定实施方案中，纳米聚合物被用作药物载体，例如聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)及其类似物，例如PLGA-pDNA(Mittal等人，2007；Cohen等人，2000)。
已经建立了用于鉴定有效的药物载体的方法(Jing等人，2002；Jing等人，2003)。简单地说，包括以下几个步骤：
(1)JG-ODNs与药物载体整合。(i)将使用32p-标记的ODNs和不同药物载体，包括PEI(聚合物，25,000)、PLGA(纳米颗粒，45,000或85,000)或PLGA类似物(例如PLGA-pDNA)，以不同的载体/ODN比例获得的载体-ODN复合物进行非变性凝胶电泳。凝胶显示两个条带：一个由载体-ODN复合物(迁移慢)组成，另一个是未与载体整合的游离ODN(迁移快)(Jing等人，2002)。(ii)分析载体-ODN复合物和游离ODN的条带的强度，以评估ODNs和载体之间的整合比例并确定用于药物递送的最佳比例。
(2)测量细胞中每种载体-ODN复合物的递送效率。(i)首先，向癌细胞中加入指定比例的载体/32P-ODN。(ii)培养3小时后，细胞用新鲜培养基洗涤两次以除去游离的载体/ODN复合物，并将细胞继续孵育24小时。(iii)然后，从裂解的细胞中提提取32P-标记的ODNs，并在非变性凝胶上进行电泳。(iv)凝胶显示两个条带：一个是和载体在一起的未释放的ODNs(迁移慢)，另一个是细胞质中释放的ODNs(迁移快)。从裂解的细胞中获得的ODNs的条带强度显示出受测试的载体的递送效率(Jing等人，2002；Jing等人，2003)。
(3)显微镜观察。(i)将5′-荧光标记的JG-ODNs与PEI(或PLGA)在室温下以指定比例孵育1小时，然后向细胞平板中加入700ng PEI/ODN复合物。(ii)在为了递送而培养3小时后，用新鲜培养基洗涤细胞孔3次以除去游离的ODNs和游离的PEI/ODN复合物，从而只有递送的复合物于37℃继续在细胞内孵育24小时。(iii)除去细胞培养基，并用PBS再次洗涤平板3次。然后，通过加入0.5％Triton来裂解细胞2分钟，并用3.7％甲醛将裂解的细胞固定于载玻片上15分钟。(iv)细胞用PBS洗涤3次以消除游离的荧光。在显微镜下鉴定标记的JG-ODNs(400×放大倍数)(Jing等人，2003)。(v)综合从步骤(1)到(3)中获得的结果，可以鉴定用于ODNs的有效的药物载体。
B.确定用于体内施用JG-ODN的最佳ODN/载体比例
体内药物施用的效率是药物优化的重要因素。体内的低的药物活性在特定情况下可能是因为药物递送效率低。为增强在异种移植肿瘤中的药物活性，可进行体内递送试验以确定体内递送JG-ODNs时ODN/载体(PEI或纳米载体)的最佳比例。
确定体内递送JG-ODNs时合适的ODN/PEI比例。理论上，ODN/PEI复合物的胞内递送可分为三个步骤：
(1)DNA寡核苷酸与细胞结合。PEI-DNA复合物与细胞膜结合的主要驱动力是静电(Maurer等人，1999；Chesnoy等人，2000)。PEI-DNA的内化主要通过胞吞作用来实现。在特定方面，不同载体和DNA的结合效率的主要差异与它们的物理性质，例如稳定性、大小和电荷密度有关。阳离子的PEI和DNA之间的投料配比及孵育时间是递送效率的参数。通常，在一些实施方案中，投料配比和孵育时间的增加将导致更高的递送效率。
(2)DNA寡核苷酸逃逸入细胞质。在特定实施方案中，DNA通过内体膜的破坏而释放入细胞质中，这是阳离子的PEI和存在于膜上的阴离子的ODNs相互作用引起的。在特定方面，内体膜的破坏是由于阳离子PEI的疏水部分的结构而引起的。ODN/PEI比例的改变可以增加从ODN/PEI复合物中释放DNA寡核苷酸的百分比和速度。
(3)G-四合体ODNs进入细胞核。这是个有用的方面，因为JG-ODNs对HIF-1α基因转录的抑制发生在细胞核中。在富含G的寡核苷酸释放到细胞质中后，细胞内K+离子的高浓度诱导ODNs形成G-四合体结构。我们先前的结果已经显示，释放入细胞质中的G-四合体ODNs能够容易地通过核孔进入细胞核(Jing等人，2002；Jing等人，2003；Jing等人，2004)。
体内递送的评估按以下方式进行：JG-ODNs在5′-端用荧光标签(FITC)标记，溶于H2O，90℃加热15分钟，逐渐冷却至室温，然后以不同的ODN/PEI比例与PEI混合(起始于2∶1，1∶1，1∶2，1∶4，1∶6，1∶8)。通过IP注射给具有肿瘤异种移植物的裸鼠施用ODN/PEI制备物。在注射后至少24小时，处死小鼠，取出组织和肿瘤异种移植物并冷冻。为测试胞内递送效率并确定组织内JG-ODNs的分布，对经冷冻的组织样品进行切片，制片，并例如以200×或400×的放大倍数在荧光显微镜下分析。显微照片显示出以指定的JG-ODN/PEI比例递送的在肿瘤中的JG-ODNs的强度。通过比较来自不同ODN/PEI比例的结果，可以鉴定与体内递送的最优效率对应的ODN/PEI比例。
确定在体内对于JG-ODNs有用的ODN和纳米载体的比例。但是，如果按上述方法鉴定了递送JG-ODNs的更好载体(例如纳米颗粒)，可利用鉴定的新载体重复上述研究方法以确定对于JG-ODN体内施用来说最佳的载体-ODN比例。此外，还可利用PEI和新的药物载体来进行体内药物测试以确定新载体是否提高了在体内JG-ODNs的药物效率。
IV.脂质组合物
在一些实施例中，本发明涉及新的富含G的寡核苷酸组合物，包含SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13中的一种或多种，例如，包含一种或多种与本发明相关的脂质。与脂质联合的富含G的寡核苷酸可在含有脂质的溶液中分散，溶解于脂质，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，与脂质共价连接，作为悬浮液包含在脂质中，包含于或与微团或脂质体相复合，或者与脂质或脂质结构相联合。本发明的脂质或脂质/富含G的寡核苷酸联合组合物不限于任何特定结构。例如，它们还可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状上不均匀的聚集体。在另一个例子中，它们可以是双层结构，如微团，或具有“萎陷的”结构。在另一个非限制性例子中，还考虑了lipofectamine(GibcoBRL)-富含G的寡核苷酸或Superfect(Qiagen)-富含G的寡核苷酸复合物。
在一些实施方案中，组合物的脂质组分是不带电荷或基本不带电荷的。在一个实施方案中，组合物的脂质组分包含一种或多种中性的脂质。在另一方面，组合物的脂质组分基本上不含阴离子或阳离子型脂质，例如某些磷脂(例如磷脂酰胆碱)和胆固醇。在一些方面，不带电荷或基本不带电荷的脂质组合物的脂质组分包含约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，或100％的不带电荷的脂质，基本上不带电荷的脂质，和/或带等量的正和负电荷的脂质混合物。
在其他实施方案中，脂质可以是带电荷的。例如，带电荷的磷脂可用于制备根据本发明的脂质组合物，并且可带净的正电荷或净的负电荷。在一个实施例中，带电荷的脂质可以是“聚阳离子型聚合物”，在此处使用时其被定义为水溶性的带正电荷的化合物。聚阳离子型聚合物中和核酸的负电荷，从而使核酸可以紧密接近带负电荷的细胞膜。示例性的聚阳离子型聚合物包括但不限于，聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚组氨酸、鱼精蛋白、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、聚甲基丙烯酸酯和聚鸟氨酸。
C.乳浊液
脂质可以包含在乳浊液中。脂质乳浊液是通常不互溶的两种或更多种脂质的基本上长期异质的脂质复合物，其通过机械搅拌或通过少量另外的称为乳化剂的物质而制备。用于制备脂质乳浊液和添加另外组分的方法是本领域公知的(例如Modern Pharmaceutics，1990，在此引入作为参考)。
例如，向乙醇或氯仿或任何其他合适的有机溶剂中加入一种或多种脂质，并通过手工或机械技术搅拌。然后将溶剂从混合物中蒸发，留下脂质的干燥物。将脂质重悬于水性介质例如磷酸盐缓冲盐水中，形成乳浊液。为得到乳化的脂质的更均一的大小分布，可用传统超声波技术对混合物进行超声波处理，采用微流化(例如使用Microfluidizer，Newton，Mass.)进一步乳化，和/或使用Extruder Device(Lipex Biomembranes，Vancouver，Canada)在高压(例如，600psi)下挤出。
D.微团
脂质可以包含在微团中。微团是脂质化合物的群集体或聚集体，通常是脂质单层形式，并且其可以通过本领域技术人员已知的任何产生微团的方案来制备(例如Canfield等人，1990；El-Gorab等人，1973，在此引入作为参考)。例如，通常，将一种或多种脂质悬浮在有机溶剂中，蒸发溶剂，将脂质重悬于水性介质中，超声波处理，然后离心。
V.脂质体
在特定实施方案中，脂质包含在脂质体中。“脂质体”是一个通称，包括各种单层和多层的脂质载体，它们通过封闭的脂双层或聚集体的产生而形成。脂质体的特征可以在于具有泡状结构，其具有通常包含磷脂的双层膜和通常包含水性组成的内部介质。
多层脂质体具有被水性介质分隔的多个脂质层。当将包含磷脂的脂质悬浮于过量的水溶液中时，它们可自发形成。脂质组分在形成闭合结构前进行自我重排，并包载脂双层间的水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。亲脂分子或具有亲脂区域的分子也可以溶解在脂双层中或与脂双层相结合。
在特定实施方案中，脂质和/或富含G的寡核苷酸，可以例如包囊入脂质体的水性内部，散布于脂质体的脂双层中，通过与脂质体和富含G的寡核苷酸都联合的连接分子与脂质体相连，包载入脂质体中，与脂质体复合，等等。
根据本发明所使用的脂质体可以用不同方法制备，这些方法是本领域技术人员已知的。当分散于水中时，根据脂质与水的摩尔比，磷脂可形成除脂质体以外的多种结构。在低比例时脂质体是优选的结构。
例如，将磷脂(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)，如中性磷脂二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，溶解于叔丁醇。然后将脂质与富含G的寡核苷酸和/或其他组分混合。将Tween 20加到脂质混合物中，从而使Tween 20约是组合物重量的5％。向该复合物中加入过量叔丁醇，从而使叔丁醇的体积为至少95％。涡旋振荡混合物，在干冰/丙酮浴中冷冻，并冻干过夜。冻干的制备物保存于-20℃，可在三个月内使用。当需要时，可将冻干的脂质体在0.9％盐水中重构。通过使用Tween 20包囊富含G的寡核苷酸而获得的平均颗粒直径为约0.7到约1.0μm。
可选择地，可通过在容器例如梨形玻璃烧瓶中将脂质在溶剂中进行混合来制备脂质体。容器的容积应该比所期望的质脂体悬浮液的体积大10倍。使用旋转蒸发仪，于大约40℃，在负压下去除溶剂。根据所需的脂质体体积，溶剂通常在约5分钟到2小时内被除去。组合物可以在真空下在干燥器中进一步干燥。干燥的脂质通常在约1周后弃用，因为它有随时间变质的趋势。
通过进行振荡直至重悬所有脂质薄膜，干燥的脂质可以在无菌、无热原的水中以约25-50mM的磷脂进行水化。然后可以将含水的脂质体等分，分装到小瓶中，冻干，并在真空下密封。
在其他可选择的方法中，可根据其他已知的实验室方法来制备脂质体(例如参见Bangham等人，1965；Gregoriadis，1979；Deamer和Uster，1983；Szoka和Papahadjopoulos，1978，均在此引入相关部分作为参考)。这些方法的区别在于它们各自的包载水性物质的能力和它们各自的水性空间：脂质(aqueousspace-to-lipid)比例。
根据以上描述制备的干燥的脂质或冻干的脂质体可以脱水，并在抑制性肽的溶液中重构，和用合适的溶剂如DPBS稀释到适当的浓度。然后将混合物在涡旋振荡混合器上剧烈振荡。未包囊的另外材料，例如包括但不限于激素、药物、核酸构建物等的试剂，通过在29,000g下离心而去除，并洗涤脂质体沉淀物。将经洗涤的脂质体以合适的总磷脂浓度，如约50-200mM进行重悬。可根据标准方法测定包囊的另外材料或活性试剂的量。在测定在脂质体制备物中包囊的另外材料或活性试剂的量后，可将脂质体稀释到合适浓度，并保存于4℃直至使用。包含脂质体的药物组合物通常包括无菌的药学上可接受的载体或稀释剂，例如水或盐水溶液。
脂质体的大小随合成方法而变化。本发明中的脂质体可以有不同大小。在一些实施方案中，脂质体较小，例如外径小于约100nm，约90nm，约80nm，约70nm，约60nm，或小于约50nm。在制备这样的脂质体中，可利用此处描述的或本领域技术人员已知的任何方案。制备脂质体的其他非限制性例子描述于美国专利号4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706；国际申请PCT/US85/01161和PCT/US89/05040；英国专利申请GB2193095A；和Liposome Technology，1984，均在此引入作为参考。
悬浮于水性溶液中的脂质体通常是球状囊泡的形状，有一个或多个脂双层分子同心层。每层由以式XY表示的平行的分子阵列组成，其中X是亲水部分，Y是疏水部分。在水性悬浮液中，同心层的排列使亲水部分倾向于保持与水相接触，而疏水区域倾向于自我联合。例如，当脂质体内外都存在水相时，脂质分子可形成称为片层(lamella)的双层，排列方式为XY-YX。当多于一个的脂质分子的亲水和疏水部分互相连接时就可以形成脂质聚集体。这些聚集体的大小和形状取决于许多不同的变量，例如溶剂的性质和溶液中其他化合物的存在。
脂质制剂的产生通常是通过在(I)反相蒸发，(II)脱水-再水化，(III)去污剂透析和(IV)薄膜水化后对脂质体混合物进行超声波处理或系列挤出来实现的。一方面，在一些实施方案中所考虑的用于制备脂质体的方法是加热超声波处理，和通过孔径不断减小的过滤器或膜对脂质进行连续挤出，由此导致形成小而稳定的脂质体结构。这种制备方法产生只具有合适且均一的大小的脂质体/富含G的寡核苷酸或脂质体，它们结构稳定并产生最大活性。这种技术是本领域技术人员公知的(例如参见Martin，1990)。
一旦制备后，脂质结构可用来包囊当在循环中时有毒(例如化疗药物)或不稳定(例如核酸)的化合物。脂质体的物理特性依赖于pH、离子强度和/或二价阳离子的存在。脂质体可以对离子型和/或极性物质显示出低的渗透性，但在升高的温度下会发生显著改变它们的渗透性的相变。相变涉及从称为凝胶状态的紧密压缩且有序的结构向称为流体状态的松散压缩且较无序的结构的变化。这发生在特征性的相变温度下和/或导致对离子、糖和/或药物的渗透性增加。对这些化合物来说脂质体包囊会导致更低的毒性和更长的血清半衰期(Gabizon等人，1990)。
脂质体通过四种不同的机制与细胞相互作用以递送试剂：通过诸如巨噬细胞和/或嗜中性粒细胞的网状内皮系统的吞噬细胞的胞吞作用；通过非特异性的弱的疏水和/或静电力，和/或通过与细胞表面组分的特异性相互作用而吸附到细胞表面；通过脂质体的脂双层插入质膜而与浆细胞膜(plasma cell membrane)融合，同时将脂质体内容物释放入细胞质中；和/或将脂质体脂质转移到细胞和/或亚细胞的膜，和/或反之亦然，与脂质体内容物没有任何关联。改变脂质体的配制可以改变起作用的机制，尽管多种机制可同时起作用。
在治疗过度增生疾病的特殊疗法中，多种疾病治疗利用了基于脂质的基因转移策略来增强传统疗法或建立新的疗法。在脂质体制剂方面的进展提高了体内基因转移的效率(Templeton等人，1997)，并考虑了使用这些方法来制备脂质体。还描述了可选择的制备用于递送核酸的基于脂质的制剂的方法(WO99/18933)。
在另一种脂质体制剂中，一种称为溶剂稀释微载体(SDMC)的两亲性载体使特定分子可以整合入脂质载体的双层中(美国专利5,879,703)。SDMCs可用于递送脂多糖类、多肽、核酸等。当然，熟练技术人员可用任何其他脂质体制备方法来获得在本发明中需要的脂质体制剂。
A.脂质体靶向
富含G的寡核苷酸与脂质体的结合可以改善富含G的寡核苷酸的生物分布和其他性质。例如，脂质体介导的核酸递送和体外外源DNA表达非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987)。已经在培养的鸡胚、HeLa和肝癌细胞中证实了脂质体介导的外源DNA递送和表达的可行性(Wong等人，1980)。还已经在静脉内注射后在大鼠中获得成功的脂质体介导的基因转移(Nicolau等人，1987)。
考虑了，脂质体/富含G的寡核苷酸组合物可以包含递送到组织中的其他材料。例如，在本发明的一些实施方案中，脂质或脂质体可以与血凝病毒(HVJ)相结合。已经显示这有助于与细胞膜的融合，并促进了脂质体包囊的DNA进入细胞(Kaneda等人，1989)。在另一个例子中，脂质或脂质体可与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)相复合或联合使用(Kato等人，1991)。在其他实施方案中，脂质可以与HVJ和HMG-1相复合或联合使用。
靶向递送可通过添加配体来实现，这不损害这些脂质体递送大量富含G的寡核苷酸的能力。考虑了，这将使得能够递送到特定的细胞、组织和器官。基于配体的递送系统的靶向特异性基于不同细胞类型上配体受体的分布。靶向性配体可与脂质复合物非共价或共价连接，并可通过多种方法与脂质体缀合。
B.交联剂
双官能交联试剂已被广泛应用于各种目的，包括制备亲和基质，修饰和稳定不同结构，鉴定配体和受体结合位点，以及对结构进行研究。带有两个相同官能团的同双官能试剂被证实可高效诱导相同和不同大分子或大分子亚单位之间的交联，以及多肽配体与它们的特异结合位点的连接。杂双官能试剂含有两个不同的官能团。考虑到两个不同官能团的不同反应性的优点，可控制交联的选择性和顺序性。双官能交联试剂可根据其官能团的特异性进行分类，例如氨基、巯基、胍基、吲哚、羧基特异性基团。在这些试剂中，针对游离氨基基团的试剂尤其受欢迎，因为它们可商购获得，合成容易，和使用时反应条件温和。大部分杂双官能交联试剂包含伯胺反应性基团和巯基反应性基团。
用于将配体与脂质体交联的示例性方法描述于美国专利5,603,872和美国专利5,401,511(均在此完整引入作为参考)。多种配体可通过胺残基的交联而共价结合于脂质体表面。已经通过既定的方法制备了脂质体，特别是多层囊泡(MLV)或单层囊泡例如微乳化的脂质体(MEL)和大单层脂质体(LUVET)，每种都含磷脂酰乙醇胺(PE)。在脂质体中包含PE就在脂质体表面上提供了用于交联的活性官能残基，伯胺。配体，例如表皮生长因子(EGF)已经成功与PE-脂质体连接。配体与脂质体表面上的分散位点共价结合。这些位点的数目和表面密度将取决于脂质体配制和脂质体类型。脂质体表面还有用于非共价接合的位点。对交联试剂进行了效率和生物相容性的研究以形成配体和脂质体的共价缀合物。交联试剂包括戊二醛(GAD)，双官能环氧乙烷(OXR)，乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)，和水溶性碳二亚胺，优选1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。通过交联的复杂化学作用，建立了识别性物质的胺残基与脂质体的连接。
在另一个例子中描述了杂双官能交联试剂和使用这些交联试剂的方法(美国专利5,899,155，特在此完整引入作为参考)。所述交联试剂可将新核的酰肼残基与亲电子的马来酰亚胺残基相组合，在一个实例中这容许醛与游离的巯基偶联。可对交联试剂进行修饰以交联各种不同的官能团，从而可用于交联多肽和糖。
C.靶向性配体
靶向性配体可锚定于复合物的疏水部分中，或结合于复合物的亲水部分的反应性末端基团上。靶向性配体还可通过与例如亲水聚合物远端的反应性基团的连接而结合到脂质体上。优选的反应性基团包括氨基、羧基、酰肼基团和巯基。靶向性配体与亲水聚合物的偶联可采用本领域技术人员已知的有机化学标准方法来进行。在一些实施方案中，靶向性配体的总浓度从约0.01到约10％mol。
靶向性配体是对于靶区域的特征性组分来说特异的任何配体。优选的靶向性配体包括蛋白质，例如多克隆或单克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体，酶，或激素，或糖例如单糖、寡糖和多糖(参见Heath等人，Chem.Phys.Lipids40：347(1986))。例如，双唾液酸神经节苷脂GD2是神经外胚层起源的肿瘤，例如神经母细胞瘤、黑素瘤、小细胞肺癌、神经胶质瘤和某些肉瘤的已经鉴定的肿瘤抗原(Mujoo等人，1986)。包含抗双唾液酸神经节苷脂GD2单克隆抗体的脂质体已用于辅助将脂质体靶向到表达该肿瘤抗原的细胞上(Pagnan等人，1999)。在另一个非限制性例子中，乳腺癌和妇科癌症抗原特异性抗体描述于美国专利号5,939,277中，在此引入作为参考。在另一个非限制性例子中，前列腺癌特异性抗体公开于美国专利号6,107,090中，在此引入作为参考。因此，可考虑到，此处描述的或本领域技术人员已知的抗体可用于与本发明的组合物和方法相组合地靶向特定的组织和细胞类型。在本发明的一些实施方案中，所考虑的靶向性配体与整联蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、受体或转运蛋白相互作用。合适的配体包括对于靶器官的细胞或对于由于局部病变例如肿瘤而暴露于循环中的靶器官的结构来说特异的任何配体。
在本发明的一些实施方案中，为了增强细胞的转导，增加靶细胞的转导，或限制不希望的细胞的转导，将抗体或环肽靶向性部分(配体)与脂质复合物相结合。这样的方法是本领域已知的。例如，还进一步描述了特异地靶向哺乳动物中枢神经系统细胞的脂质体(美国专利5,786,214，在此引入作为参考)。该脂质体主要由N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇和油酸组成，其中将神经胶质特异性单克隆抗体与脂质体相缀合。考虑了，单克隆抗体或抗体片段可用于向动物中特定细胞、组织或器官例如脑、心、肺、肝等的靶向递送。
此外，富含G的寡核苷酸可通过受体介导的递送和/或包含脂质或脂质体的靶向性载体而被递送到靶细胞。这利用了发生在靶细胞中的受体介导的胞吞作用对大分子的选择性摄取。考虑到各种不同受体的细胞类型特异性分布，这种递送方法给本发明增加了又一程度的特异性。
因此，在本发明的一些方面中，选择对应于在靶细胞群上特异表达的受体的配体。细胞特异的富含G的寡核苷酸的递送和/或靶向性载体可以包含与脂质体相组合的特异的结合性配体。待递送的富含G的寡核苷酸位于脂质体内，特异的结合性配体被功能性地整合到脂质体膜中。脂质体因此可以特异地结合到靶细胞的受体上，从而将内容物递送给细胞。这样的系统被证明是有效的，例如在该系统中，表皮生长因子(EGF)用于将核酸以受体介导的方式递送给显示出EGF受体上调的细胞。
在一些实施方案中，受体介导的递送和/或靶向性载体包含细胞受体特异性配体和结合富含G的寡核苷酸的试剂。其他则包含已经可操作地与待递送的富含G的寡核苷酸相连接的细胞受体特异性配体。例如，几种配体已被用于受体介导的基因转移(Wu和Wu，1987；Wagner等人，1990；Perales等人，1994；Myers，EPO 0273085)，其建立了该技术的可操作性。在另一个例子中，描述了在另一种哺乳动物细胞类型中的特异性递送(Wu和Wu，1993；在此引入作为参考)。
在其他实施方案中，特异的结合性配体可包括一种或多种指导细胞特异性结合的脂质或糖蛋白。例如乳糖苷神经酰胺，具有半乳糖末端的脱唾液酸神经节苷脂，已被整合到脂质体中，并观察到肝细胞对胰岛素基因摄入的增加(Nicolau等人，1987)。还已经证明，脱唾液酸糖蛋白，包含末端半乳糖残基的脱唾液酸胎球蛋白，可以将脂质体靶向到肝脏(Spanjer和Scherphof，1983；Hara等人，1996)。当偶联到多肽骨架上时，甘露糖基、岩藻糖基或N-乙酰基葡糖胺可结合高亲合力甘露糖受体(美国专利5,432,260，特在此完整引入作为参考)。考虑了，本发明的细胞或组织特异性转化构建体可以以相同的方式特异性地递送到靶细胞或组织中。
在另一个例子中，乳糖苷神经酰胺，和靶向LDL受体相关蛋白的肽例如载脂蛋白E3(“Apo E”)，可用于将脂质体靶向肝脏(Spanjer和Scherphof，1983；WO 98/0748)。
还已经描述了叶酸和叶酸受体可用于细胞的靶向(美国专利5,871,727)。在这个例子中，将维生素叶酸偶联至复合物。叶酸受体对于其配体具有高亲合力，并在几种恶性细胞系(包括肺、乳腺和脑肿瘤)的表面上过表达。诸如甲氨蝶呤的抗叶酸物也可用作靶向性配体。转铁蛋白介导的递送系统靶向广泛的表达转铁蛋白受体的正在复制的细胞。
VI.脂质施用
施用给患者的脂质组合物(例如脂质体-富含G的寡核苷酸)的实际剂量可以由身体和生理因素例如体重、状况的严重程度、患者的自发病和施用途径来决定。考虑这些以后就可以容易地确定对于特定受试者和/或治疗过程的脂质组合物剂量。
本发明的施用方式可以是静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、损伤区内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠、局部、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、囊内、粘膜、心包内、口服、局部、局域和/或使用气雾剂、注射、输注、连续输注、直接或通过导管的局域性灌注浸浴靶细胞(localized perfusion bathing target cells)和/或灌洗。
VII.癌症的治疗和/或预防
在一些实施方案中，通过给受试者施用有效量的富含G的寡核苷酸来治疗和/或预防癌症。受试者可以是哺乳动物，例如人。
本发明的寡核苷酸可含有任何百分比的容许四元体形成的鸟嘌呤碱基，只要所述寡核苷酸显示抗癌活性。
在特定实施方案中，癌症是黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、白血病、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈癌、舌癌、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌、肉瘤或膀胱癌。
癌症可以包括由肿瘤细胞组成的肿瘤。例如，肿瘤细胞包括但不限于黑素瘤细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、睾丸癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、淋巴癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、骨癌细胞或软组织癌细胞。
在本发明的一个特定实施方案中，施用有效量的富含G的寡核苷酸以降低、减少、抑制或中止肿瘤的生长。在本发明的特定实施方案中，富含G的寡核苷酸抑制HIF1α。所述寡核苷酸可以抑制HIF1α的功能和/或活化和/或表达。
常常依据肿瘤类型、肿瘤位置、疾病进展及病人的健康状况和年龄，治疗方案也可发生变化。显然，一些类型的肿瘤需要更激烈的治疗，但同时，一些病人不能承受更繁重的治疗方案。临床医师最适合根据治疗制剂的已知效果和毒性(如果有)来作出这种决定。
在一些实施方案中，待治疗的患者需要有足够的骨髓功能(定义为外周绝对粒细胞数＞2,000/mm3和血小板数100,000/mm3)、足够的肝功能(胆红素＜1.5mg/dl)和足够的肾功(肌酐＜1.5mg/dl)。
为了利用本发明的方法和组合物来杀死细胞，抑制细胞生长，减小肿瘤或组织大小以及要么逆转或缓解肿瘤细胞的恶性表型，可通常将过度增生细胞与富含G的寡核苷酸接触。施用途径自然会随着损伤的位置和性质而不同，包括例如皮内、透皮、肠胃外、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、肿瘤内、灌注、灌洗、直接注射和口服施用和制剂。
在手术介入的情况下，本发明可在术前使用以使得不宜动手术的肿瘤受试者进行切除术。可选择地，本发明还可在手术时和/或手术后使用，以治疗残留或转移的病灶。例如，切除的瘤床可注射或灌注包含富含G的寡核苷酸的制剂。切除后可继续灌注，例如通过保留在手术位置处植入的导管来进行灌注。还想到了周期性的术后治疗方法。
合适的情况下也可以连续施用，例如当肿瘤被切除并对瘤床进行处理以去除残留的微小病灶。优选通过注射器或导管递送。治疗开始后，这种连续灌注可持续约1-2小时，约2-6小时，约6-12小时，约12-24小时，约1-2天，约1-2周或更长。通常，通过连续灌注的治疗组合物的剂量与通过单次或多次注射而给予的剂量相同，在灌注进行的一段时间期间进行调整。还考虑了，可将四肢灌注用于施用本发明的治疗组合物，尤其在黑素瘤和肉瘤的治疗中。
在一些实施方案中，接受治疗的肿瘤可能至少在开始时是不可切除的。用治疗性抗体治疗可增加肿瘤的可切除性，这是由于边缘收缩或去除了某些特别侵入性的部分。治疗后，切除成为可能。切除后的其他治疗用来清除肿瘤位置处的微小的残留病灶。
VIII.联合治疗
在其中采用本发明的富含G的寡核苷酸的特定实施方案中，可以希望将本发明的寡核苷酸与诸如抗癌剂的可有效治疗过度增生疾病的其他试剂联用。“抗癌”剂能够负地影响受试者中的癌症，例如杀死癌细胞，诱导癌细胞凋亡，减慢癌细胞的生长速率，减少转移的发生或数量，减小肿瘤体积，抑制肿瘤生长，减少对肿瘤或癌细胞的血液供应，促进对抗癌细胞或肿瘤的免疫应答，防止或抑制癌症的进展，和/或延长癌症受试者的寿命。抗癌剂包括生物试剂(生物疗法)、化疗试剂、免疫疗法试剂、手术和放疗试剂。更一般地，这些其他组合物以对于杀死细胞或抑制细胞增殖来说有效的组合剂量提供。这一过程可涉及让细胞与本发明的抗体和所述试剂或多因子同时接触。通过让细胞与包括两种试剂的单一组合物或药理学制剂接触，或者通过让细胞与两种不同组合物或制剂(其中一种组合物包含所述的寡核苷酸，另一种包含第二试剂)同时接触，可以实现这一点。
可选择地，本发明的寡核苷酸可在其他抗癌剂治疗之前或之后以几分钟到几周的间隔进行施用。在其中其他抗癌剂和寡核苷酸分开地施用于个体或其细胞的实施方案中，通常要确保每次递送之间的时间不超过有意义的时间段，这样的话所述试剂和寡核苷酸才能够对细胞发挥有利的联合作用。在这样的情况下，考虑了可以以彼此间隔在约12-24小时内，更优选地，彼此间隔在约6-12小时内，采用两种方式接触细胞。但是，在一些情况下，当每次施用的间隔是几天(例如2，3，4，5，6或7)到几周(例如1，2，3，4，5，6，7或8)时，可能希望显著延长治疗的时间。
A.化疗
癌症疗法还包括各种基于化学品的治疗。化疗试剂的一些例子包括抗生素化疗试剂，例如多柔比星、柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素(也称为突变霉素和/或丝裂霉素-C)、放线菌素D(更生霉素)、博来霉素、普卡霉素，植物生物碱，例如紫杉醇、长春新碱、长春碱，其他类别的试剂，例如顺铂(CDDP)、依托泊苷(VP16)、肿瘤坏死因子，和烷化试剂，例如卡莫司汀、美法仑(也称为爱克兰、L-苯丙氨酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、L-PAM或L-溶肉瘤素，其是氮芥的苯丙氨酸衍生物)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安(也称为马利兰)、洛莫司汀。
其他试剂的例子包括但不限于卡铂、丙卡巴肼、双氯乙基甲胺、喜树碱、异环磷酰胺、亚硝基脲、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、艾多昔芬、屈洛昔芬、TAT-59、秦哚昔芬、曲沃昔芬、ICI 182，780、EM-800、雌激素受体结合试剂、吉西他滨、诺维本、法呢酰基-蛋白转移酶抑制剂、反铂(Transplatinum)、5-氟尿嘧啶、过氧化氢、和甲氨蝶呤、Temazolomide(DTIC的含水形式)、Mylotarg、多拉司他汀-10、苔藓抑素，或上述物质的任何类似物或衍生变体。
B.放疗试剂
放疗试剂和因子包括诱导DNA损伤的辐射和波，例如γ-辐照、X-射线、UV-辐照、微波、电子发射、放射性同位素，等等。可通过用上述形式的辐射照射局域性的肿瘤位置来进行治疗。极有可能，所有这些因子造成大范围的DNA损伤，包括影响DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持。
X-射线剂量范围从在用于较长疗程(3至4周)时50-200伦琴的日剂量到2000-6000伦琴的单次剂量。同位素的剂量范围差别很大，取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型以及赘生细胞的摄入。
C.手术
大约60％的癌症患者要进行一些类型的手术，包括预防性、诊断性或肿瘤分类性、治疗性和缓解性的手术。治疗性的手术是一种癌症治疗方法，其可与其他疗法，例如本发明的治疗方法、化疗、放疗、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或其他疗法联用。
治疗性手术包括切除，其中全部或部分癌组织被物理移除、切掉和或/摧毁。肿瘤切除指至少部分肿瘤的物理移除。除了肿瘤切除外，手术治疗包括激光手术、低温手术、电手术和采用显微术控制的手术(Mohs’手术)。考虑了，本发明可与浅层癌、初期癌或伴随量的正常组织的去除相联用。
当切除所有癌细胞、组织或肿瘤的其中一部分时，会在体内形成空腔。通过在该区域用其他抗癌疗法进行灌注、直接注射或局部施用可完成治疗。这种治疗可重复，例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗方法也可采用不同剂量。
D.基因疗法
在另一个实施方案中，考虑了与使用本发明所述的寡核苷酸化合物的组合疗法相联用的基因疗法。可作为与本发明联用的一些形式的基因疗法的靶标的各种基因包括但不限于生长因子，受体酪氨酸激酶，非受体酪氨酸激酶，SER/THR蛋白激酶，细胞表面蛋白，细胞信号传导蛋白，鸟嘌呤核苷酸交换因子和结合蛋白，或核蛋白，或核转录因子。
E.其他试剂
考虑了，其他试剂可与本发明联用以增强治疗的疗效。与化疗联用的疗法的一种形式包括过热疗法，其为其中将患者组织暴露于高温(直至106°F)的方法。外部或内部加热装置可用于局部、区域或全身过热的施加。局部过热疗法涉及将热施加于小的区域，例如肿瘤。热量可由来源于体外装置的靶向肿瘤的高频波在外部产生。内部热量可涉及无菌探针，包括细的加热的金属丝或充满温水的中空管，植入的微波天线，或射频电极。
加热患者的器官或四肢以进行区域性治疗，这是通过使用产生高能的装置例如磁体来实现的。可选择地，可将患者的一些血液取出，并在被灌注到将被内部加热的区域中之前加热。还可在癌症扩散到全身的情况下实施全身加热。温水毯、热蜡、感应线圈和热箱(thermal chambers)可用于实现该目的。
激素疗法也可与本发明联用。激素的使用可用于治疗某些癌症如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫颈癌，以降低某些激素例如睾酮或雌激素的水平或者阻断它们的作用，这经常会降低转移的风险。
佐剂疗法也可与本发明联用。使用的佐剂或免疫调节剂包括但不限于肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES，和其他趋化因子。
F.疫苗
考虑了，用于治疗癌症的疫苗可与本发明联用以增强治疗的疗效。这样的疫苗包括肽疫苗或树突状细胞疫苗。肽疫苗可以包括可被溶细胞性T淋巴细胞识别的任何肿瘤特异性抗原。此外，本领域技术人员会认识到，树突状细胞疫苗包含经肽或抗原激动的树突状细胞，并将经激动的树突状细胞施用给患者。
在黑素瘤中作为疫苗使用的肿瘤特异性抗原的例子包括但不限于例如gp100或MAGE-3。这些抗原可作为肽疫苗和/或作为树突状细胞疫苗进行施用。
IX.药用组合物
在本发明的一些方面，存在治疗患者癌症的个体和/或在个体中预防癌症的方法，包括施用治疗有效量的本发明的寡核苷酸。在这样的情况下，寡核苷酸可以包含药学上可接受的载体。
A.药学上可接受的载体
本发明的水性组合物包含溶解和/或分散于药学上可接受的载体和/或水性介质中的治疗有效量(此处可与术语“有效量”互换使用)的寡核苷酸。
短语“药学上和/或药理学上可接受的”是指这样的分子实体和/或组合物，其在适当地施用给动物和/或人时不产生有害的、过敏性的和/或其他不利的反应。
此处使用的“药学上可接受的载体”包括任何和/或所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和/或抗真菌试剂、等渗和/或吸收延迟试剂和/或类似物质。将这样的介质和/或试剂用于药学活性物质是本领域公知的。除了与活性成分不相容的任何传统介质和/或试剂外，考虑了其在治疗组合物中的应用。补充的活性组分也可整合到组合物中。为了施用给人，制备物应满足FDA生物制剂标准所要求的无菌性、热原性、一般安全性和/或纯度标准。
如果使用生物材料，应当广泛地进行透析以除去不需要的小分子量分子，和/或进行冻干以便在合适时更容易配制入所需的载体中。活性化合物通常可被配制成用于肠胃外施用，例如配制成用于通过静脉内、肌肉内、皮下、损伤区内和/或甚至腹膜内途径进行注射。含有有效量的作为活性组分和/或成分的寡核苷酸的水性组合物的制备是本领域技术人员根据本发明公开的内容能够得知的。通常，这样的组合物可制备成注射剂，如液体溶液和/或悬浮液；还可制备适合于用于在注射前通过添加液体来制备溶液和/或悬浮液的固体形式；和/或还可乳化制备物。
适合于注射用途的药物形式包括无菌水溶液和/或分散体；包括芝麻油、花生油和/或含水丙二醇的制剂；和/或用于无菌注射溶液和/或分散体的即时制备的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的和/或其流动性必须能够使注射顺利进行。在制备和/或贮存的条件下它必须是稳定的，和/或其必须能够防止受到诸如细菌和/或真菌的微生物的污染作用。
可在水中通过与诸如羟丙基纤维素的表面活性剂进行适当混合来制备作为游离碱基和/或药理学上可接受盐的活性化合物的溶液。还可在甘油、液态聚乙二醇和/或其混合物和/或在油中制备分散体。在常规的贮存和/或使用条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物生长。
本发明的寡核苷酸可以用任何合适的方式配制。载体还可以是溶剂和/或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和/或液体聚乙二醇，和/或类似物质)，及其合适的混合物，和/或植物油。例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散体情况下保持所需的颗粒大小，和/或通过使用表面活性剂，可保持适宜的流动性。通过各种抗细菌和/或抗真菌试剂，例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞，和/或类似物质，可防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗试剂，例如糖和/或氯化钠。通过在组合物中使用诸如单硬脂酸铝和/或明胶的延迟吸收的试剂，可实现注射组合物的延长吸收。
通过在合适的溶剂中加入所需量的活性化合物，如果需要还可加入上面列举的各种其他成分，然后过滤除菌，可制成无菌注射液。通常，通过在包含基本分散介质和/或所需的来自上面列举的那些成分中的其他成分的无菌载体中加入各种经灭菌的活性成分，可制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和/或冷冻干燥技术，这样就可得到来自其先前无菌过滤的溶液的具有活性成分加上任何其他所需成分的粉末。还考虑了用于直接注射的较浓的和/或高度浓缩的溶液的制备，其中考虑使用DMSO作为溶剂以导致非常快速的渗入，从而可将高浓度的活性剂递送到小的肿瘤区域。
配制好后，可将溶液以与剂量制剂相适合的方式和/或以治疗有效的量进行施用。所述制剂可以以多种剂型例如上述注射液的形式方便地进行施用，但也可使用药物释放胶囊和/或类似物质。
对于在水溶液中的肠胃外施用，例如如果需要应该对溶液进行适当地缓冲和/或用足够的盐水和/或葡萄糖首先将液体稀释剂调为等渗。这些特殊的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和/或腹膜内施用。就此而论，根据本发明公开的内容，能够使用的无菌水性介质对本领域技术人员来说是已知的。例如，可将一个剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中和/或加入至1000ml皮下输液流体中和/或注射在预定输注位点(参见例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”15th版，1035-1038页和/或1570-1580页)。需根据接受治疗的受试者的情况对剂量作一些改变。在任何情况下，负责施用的人将决定给个体受试者的合适剂量。
除了配制成用于肠胃外施用的化合物例如静脉内和/或肌肉内注射剂外，其他药学上可接受的形式包括，例如片剂和/或其他用于口服施用的固体；脂质体制剂；时间释放胶囊；和/或任何其他常用形式，包括乳膏。
在本发明中也可使用鼻腔溶液和/或喷雾剂、气雾剂和/或吸入剂。鼻腔溶液通常是用于以滴剂和/或喷雾剂形式施用至鼻通道的水溶液。将鼻腔溶液制备成在许多方面与鼻分泌物相似，这样的话可以保持正常的纤毛功能。因此，水性鼻腔溶液通常是等渗的和/或被轻微缓冲以保持pH5.5到6.5。此外，如果需要的话，在制剂中还可包括与用于眼制剂的那些相似的抗微生物防腐剂，和/或合适的药物稳定剂。已知有许多商品化的鼻制剂，和/或它们包括，例如抗生素和/或抗组胺剂，和/或它们用于哮喘预防。
适于其他施用模式的其他剂型包括阴道栓剂和/或阴道塞剂(pessary)。也可使用直肠塞剂和/或栓剂。栓剂是用于插入直肠、阴道和/或尿道的、通常加入了药的、具有不同重量和/或形状的固体剂型。插入后，栓剂软化、熔化和/或溶解在腔液中。通常，对于栓剂来说，传统的粘合剂和/或载体包括，例如聚亚烷基二醇和/或甘油三酯；可从包含范围在0.5％到10％，优选1％到2％的活性成分的混合物制备这样的栓剂。
口服制剂包含通常使用的赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁和/或类似物质。这些组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂和/或粉末形式。在一些阐明的实施方案中，口服药物组合物包含惰性稀释剂和/或可同化的能食用的载体，和/或它们可包封在硬和/或软壳明胶胶囊中，和/或它们可被压缩成片剂，和/或它们可与日常饮食的食物直接相整合。对于口服治疗施用，活性化合物可与赋形剂相整合和/或以摄取片、口腔片、含片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。这样的组合物和/或制备物应包含至少0.1％的活性化合物。当然，组合物和/或制备物的百分比可以变化，和/或可方便地在约2到约75％的单位重量之间，和/或优选地在25-60％之间变化。在这样的治疗上有用的组合物中的活性化合物的量使得能够获得合适剂量。
片剂、含片、丸剂、胶囊和/或类似形式还可包含以下物质：粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉和/或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸和/或类似物质；润滑剂，例如硬脂酸镁；和/或甜味剂，例如蔗糖、乳糖和/或糖精，和/或矫味剂，例如欧薄荷、冬青油和/或樱桃调味剂。当单位剂量形式是胶囊时，除以上类型的材料外，它还可包含液体载体。各种其他材料可作为包衣和/或为了改变剂量单位的物理形式而存在。例如，片剂、丸剂和/或胶囊可用虫胶、糖和/或两者进行包衣。酏剂的浆状物可包含活性化合物和作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯、染料和/或调味剂，例如樱桃和/或橙调味剂。
B.脂质制剂和/或纳米胶囊
在一些实施方案中，为将寡核苷酸引入宿主细胞中而考虑使用脂质制剂/或纳米胶囊。脂质体通过四种不同的机制与细胞相互作用：通过诸如巨噬细胞和/或嗜中性粒细胞的网状内皮系统的吞噬细胞的胞吞作用；通过非特异性的弱的疏水和/或静电力，和/或通过与细胞表面组分的特异性相互作用而吸附到细胞表面；通过脂质体的脂双层插人质膜而与浆细胞膜融合，同时将脂质体内容物释放入细胞质中；和/或将脂质体脂质转移到细胞和/或亚细胞的膜，和/或反之亦然，与脂质体内容物没有任何关联。改变脂质体的配制可以改变起作用的机制，尽管多种机制可同时起作用。
纳米胶囊通常可以以稳定和/或可重复的方式包载化合物。为防止由于细胞内聚合物过载而产生的副作用，这样的超细颗粒(大小约0.1μm)应被设计成使用能在体内降解的聚合物。考虑了将符合这些要求的生物可降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒用于本发明，和/或这种颗粒可以容易地制备。
在本发明的特定实施方案中，寡核苷酸可与脂质相联合。与脂质联合的寡核苷酸可包囊入脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂双层中，通过与脂质体和寡核苷酸都联合的连接分子与脂质体相连，包载入脂质体中，与脂质体复合，分散于包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含于脂质中，包含于微团或与微团复合，或者与脂质相联合。本发明的脂质或脂质/寡核苷酸组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可能以与微团相似的双层结构存在，或具有“萎陷的”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小和形状不均一的聚集体。
脂质是可以为天然产生或合成脂类的脂肪物质。例如，脂质包括天然出现在细胞质中的脂肪小滴以及本领域技术人员公知的那一类化合物，包括长链脂肪族烃及其衍生物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
磷脂可用于制备本发明的脂质体，并可带净的正、负或中性电荷。磷酸二鲸蜡酯可用于将负电荷给予脂质体，而硬脂胺可用于将正电荷给予脂质体。脂质体可由一种或多种磷脂组成。来自天然来源的磷脂，例如蛋或大豆磷脂酰胆碱、脑磷脂酸、脑或植物磷脂酰肌醇、心脏心磷脂和植物或细菌磷脂酰乙醇胺，优选不作为主要磷脂，即构成总磷脂成分的50％或更多，因为这会导致所得到的脂质体不稳定和渗漏。
电中性的脂质可包括不带电荷的脂质、基本上不带电荷的脂质或带等量正和负电荷的脂质混合物。合适的磷脂包括磷脂酰胆碱和其他本领域技术人员公知的磷脂。
适于本发明使用的脂质可从商业来源获得。例如，二豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma Chemical Co.获得，磷酸二鲸蜡酯(dicetyl phosphate)(“DCP”)购自K & K Laboratories(Plainview，NY)；胆固醇(“Chol”)从Calbiochem Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可购自Avanti Polar Lipids，Inc.(Brimingham，Ala.)。在氯仿或氯仿/甲醇中的脂质贮液可保存在约20℃。优选地，氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更易蒸发。
“脂质体”是一个通称，包括各种单层或多层的脂质载体，它们通过封闭的脂双层或聚集体的产生而形成。脂质体的特征可以在于具有有着磷脂双层膜和内部水性介质的泡状结构。多层脂质体具有被水性介质分隔的多个脂质层。当将磷脂悬浮于过量的水溶液中时，它们可自发形成。脂质组分在形成闭合结构前会进行自我重排，并包载脂双层间的水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。但是，本发明还包括在溶液中具有与正常泡状结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现微团结构或仅仅以脂质分子的不均一聚集体存在。还考虑了lipofectamine核酸复合物。
根据脂质相对于水的摩尔比，当分散于水中时，磷脂可形成除脂质体以外的多种结构。在低比例下脂质体是优选的结构。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和/或二价阳离子的存在。脂质体可以对离子型和/或极性物质显示出低的渗透性，但在升高的温度下会发生显著改变它们的渗透性的相变。相变涉及从称为凝胶状态的紧密压缩且有序的结构向称为流体状态的松散压缩且较无序的结构的变化。这发生在特征性的相变温度下和/或导致对离子、糖和/或药物的渗透性增加。
根据本发明使用的脂质体可用不同方法制备。脂质体的大小随合成方法而变化。悬浮在水性溶液中的脂质体通常是球状囊泡的形状，有一个或多个脂双层分子同心层。每层由以式XY表示的平行的分子阵列组成，其中X是亲水部分，Y是疏水部分。在水性悬浮液中，同心层的排列使亲水部分倾向于保持与水相接触，而疏水区域倾向于自我联合。例如，当脂质体内外都存在水相时，脂质分子可形成称为片层的双层，排列方式为XY-YX。当多于一个的脂质分子的亲水和疏水部分互相连接时就可以形成脂质聚集体。这些聚集体的大小和形状取决于许多不同的变量，例如溶剂的性质和溶液中其他化合物的存在。
本发明范围内的脂质体可用已知的实验室技术制备。在一个优选实施方案中，可通过在容器例如梨形玻璃烧瓶中将脂质体脂质在溶剂中进行混合来制备脂质体。容器的容积应该比所期望的脂质体悬浮液的体积大10倍。使用旋转蒸发仪，于大约40℃，在负压下去除溶剂。根据所需的脂质体体积，溶剂通常在约5分钟到2小时内被去除。组合物可以在真空下在干燥器中进一步干燥。干燥的脂质通常在约1周后弃用，因为它有随时间变质的趋势。
通过进行振荡直至重悬所有脂质薄膜，干燥的脂质可以在无菌、无热原的水中以约25-50mM的磷脂进行水化。然后可以将含水的脂质体等分，分装到小瓶中，冻干，并在真空下密封。
可选择地，可根据其他已知的实验室方法来制备脂质体：Bangham等人的方法(1965)，其内容在此引入作为参考；Gregoriadis的方法，描述在DRUGCARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE，G.Gregoriadis编，(1979)第287-341页，其内容在此引入作为参考；Deamer和Uster的方法(1983)，其内容在此引入作为参考；Szoka和Papahadjopoulos描述的反相蒸发方法(1978)。前述方法的区别在于它们各自的包载水性物质的能力和它们各自的水性空间：脂质(aqueous space-to-lipid)比例。
根据以上描述制备的干燥的脂质或冻干的脂质体可以脱水，并在抑制性肽的溶液中重构，和用合适的溶剂如DPBS稀释到适当的浓度。然后将混合物在涡旋振荡混合器上剧烈振荡。未包囊的核酸通过在29,000g下离心而去除，并洗涤脂质体沉淀物。将经洗涤的脂质体以合适的总磷脂浓度，如约50-200mM进行重悬。可根据标准方法测定包囊的核酸的量。在测定脂质体制备物中包囊的核酸的量后，可将脂质体稀释到合适浓度，并保存于4℃直至使用。
包含脂质体的药物组合物通常包括无菌的药学上可接受的载体或稀释剂，例如水或盐水溶液。
C.剂量
可通过任何在脊椎动物体内产生活性成分与试剂作用位点接触的方法来配制和施用本发明的化合物(活性成分)以治疗癌症患者，尤其是内分泌疗法抗性癌症患者。它们可通过任何适合与药物联用的常规方法施用，或者作为单个的治疗活性成分或者以治疗活性成分的组合形式。它们可单独施用，但通常是与根据所选施用途径和标准药学实践而选择的药物载体一起施用。
所施用的剂量是活性成分的治疗有效量，当然这会依据已知因素而变化，例如特定活性成分的药效动力学特性及其施用模式和途径；接受者的年龄、性别、健康状况和体重；症状的性质和程度；同时进行的治疗的类型、治疗频率和需要的疗效。本发明的活性成分包括AIB1拮抗剂和/或内分泌疗法，例如佐剂。
活性成分可以以固体剂型例如胶囊、片剂和粉剂，或液体剂型例如酏剂、糖浆剂、乳剂和悬浮液进行口服施用。活性成分还可配制成用于通过注射、快速输注、鼻咽吸收或皮肤吸收进行肠胃外施用。试剂还可肌肉内、静脉内、皮下、透皮或作为栓剂施用。在施用化合物时，可全身性地给予化合物。对需要避免全身效应的化合物来说，优选的实施方案是鞘内施用。在一个优选实施方案中，可关节间施用本发明的化合物以治疗关节炎。
明胶胶囊包括活性成分和粉末状载体，例如乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。相似的稀释剂可用于制备压缩片剂。片剂和胶囊可制成缓释产品，以在数小时的时间内持续释放药物。压缩片剂可以是用糖包衣或用薄膜包衣的以掩盖任何令人不快的味道并隔绝空气，或是用肠溶性物质包衣的以选择性地在胃肠道中崩解。
通常，水、合适的油、盐水、含水的右旋糖(葡萄糖)和相关的糖溶液以及二醇类例如丙二醇或聚乙二醇都是肠胃外溶液的合适载体。用于肠胃外施用的溶液优选包含活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂，如果需要，还包含缓冲物质。抗氧化剂例如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸，单独或联合使用，都是合适的稳定剂。也使用柠檬酸及其盐和乙二胺四乙酸钠(EDTA)。此外，肠胃外溶液还可包含防腐剂，例如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和三氯叔丁醇。合适的药物载体描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences，这是本领域的标准参考书。
此外，标准药物学方法可用于控制作用的持续时间。这些方法是本领域公知的，包括控制释放制剂，和可包括合适的大分子，例如聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白。可调节大分子的浓度以及掺合方法以控制释放。此外，AIB1拮抗剂和/或本发明的佐剂可掺合入聚合物材料的颗粒中，例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。除进行掺合外，这些试剂也可被用于将化合物包载在微胶囊中。
下面举例说明用于本发明化合物的施用的有用药物剂型。利用本领域公知方法，技术人员可以确定活性成分的药理学范围。AIB1多肽的拮抗剂和/或佐剂的示例性范围包括每剂约0.0001到1.0毫克，和/或约0.001到0.1毫克，和/或约0.1到1.0毫克和/或甚至约10毫克和/或等等。可施用多剂。可选择地，以每小时、每天、每周或每月及其组合来施用单剂。可选择地，以每小时、每天、每周或每月及其组合来施用多剂。下面提供了示例性的制剂，这是非限制性的或示范性的本发明的制剂：
胶囊：通过用粉末状活性成分、175毫克乳糖、24毫克滑石粉和6毫克硬脂酸镁填充每个标准的两件式硬明胶囊来制备胶囊。
片剂：通过传统方法来制备片剂，从而剂量单位含有所示量的活性物质，0.2毫克胶体二氧化硅，5毫克硬脂酸镁，275毫克微晶纤维素，11毫克玉米淀粉和98.8毫克乳糖。可施加合适的包衣以增加适口性或延迟吸收。
注射剂：通过在10体积％丙二醇和水中搅拌1.5重量％活性成分来制备适于注射施用的肠胃外组合物。溶液用氯化钠调节至等渗，并进行灭菌。
悬浮液：制备水性悬浮液用于口服施用，从而每5ml包含所示量的细分的活性成分，200毫克羧甲基纤维素钠，5毫克苯甲酸钠，1.0克U.S.P.山梨醇溶液和0.025毫升香草醛。
因此，本发明的药物组合物可通过各种不同的途径递送，并可递送到动物体中的各种不同部位以获得特定效果。本领域技术人员将会认识到，尽管有多种途径可用于施用，但特定途径可提供比其他途径更快捷和更有效的反应。可通过包括下列方式的施用来实现局部或全身递送：将制剂施加或滴注到体腔中，吸入或吹入气雾剂，或者肠胃外引入，包括肌肉内、静脉内、腹膜、皮下、皮内以及局部施用。
可以以单位剂量形式提供本发明的组合物，其中每个剂量单位，例如一茶匙量、片剂、溶液或栓剂，包括预定量的单独或与其他活性试剂适当组合的组合物。此处使用的术语“单位剂量形式”指适合作为用于人和动物受试者的单位剂量的物理分隔的单位，每个单位包含预定量的单独或与其他活性试剂组合的本发明组合物，它们的量足以产生所需效果，合适的时候可与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂相联合。本发明的单位剂量形式的规格依赖于待达到的效果和在特定宿主中与药物组合物相关的特定药效动力学。
此处描述的这些方法决不是包括一切的，适于特定用途的其他方法对本领域技术人员来说将是显而易见的。此外，通过与已知可发挥所需效果的化合物的类比可进一步估算组合物的有效量。
X.本发明的试剂盒
本发明包括可用于癌症的治疗和/或预防的试剂盒。在特定实施方案中，试剂盒和其中的所有组分放置在一个合适的容器中。在特定实施方案中，试剂盒包含一种或多种寡核苷酸，包括SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，和/或SEQ IDNO：13中的一种或多种。
在本发明的特定实施方案中，试剂盒和/或其中的试剂放置在一个或多个合适的容器中。在特定方面，试剂盒包括其他试剂，例如药学上可接受的载体、其他抗癌剂等等。在其他实施方案中，试剂盒包括一种或多种用于从个体获取样品的试剂或装置，例如解剖刀、镊子、注射器、压舌板、针头、牙签等等。
实施例
以下实施例用于阐明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应了解，在下面的实施例中所公开的技术代表了本发明者发现在实现本发明中作用良好的技术，因此可被认为构成了实现本发明的优选模式。但是，本领域技术人员按照此处公开的内容应该知道，可对公开的特定实施方案作许多改变，并仍可得到相近或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
实施例1
用于抑制HIF1α的示例性方法和试剂
此处提供用于抑制HIF1α的方法和组合物的示例性实施方案。
作为有效的HIF-1α抑制剂的富含G的寡核苷酸的设计
越来越多的证据显示HIF-1α是人类癌症治疗的非常重要的分子靶标。因此，HIF-1α抑制剂的开发是建立人类癌症治疗新策略的关键步骤。最近，设计了10种新的富含G的寡脱氧核苷酸(ODN)(JG240-JG249)作为HIF-1α的抑制剂，它们形成分子内四重式DNA结构(称为G-四合体)，富含G的ODN的序列显示在表1中。
表1.所设计的富含G的oligos对HIF-1α活化的抑制
  Oligos   序列   IC50(μM)
  T40214   GGGCGGGCGGGCGGGC(SEQ ID NO：1)   N/A
  T40231   GGTGGGTGGGTGGG(SEQ ID NO：2)   N/A
  T40232   GGCGGGCGGGCGGG(SEQ ID NO：3)   N/A
  T40233   GGCGGGTGGGCGGG(SEQ ID NO：4)   N/A
  JG240   GGTGGGCGGGTGGG(SEQ ID NO：5)   4.55
  JG241   GGTGGGCAGGTGGG(SEQ ID NO：6)   2.46
  JG242   GGTGGGTAGGTGGG(SEQ ID NO：7)   2.56
  JG243   GGCGGGCAGGCGGG(SEQ ID NO：8)   1.56
  JG244   GGCGGGTAGGCGGG(SEQ ID NO：9)   2.07
  JG246   GGTAGGTGGGTAGG(SEQ ID NO：10)   2.76
  JG247   GGTAGGCGGGTAGG(SEQ ID NO：11)   N/A
  JG248   GGTAGGCAGGTAGG(SEQ ID NO：12)   4.46
  JG249   GGTAGGTAGGTAGG(SEQ ID NO：13)   5.72
T40214用作对照，它是Stat3抑制剂(Jing等人，2003；Jing等人，2004；Jing等人，2005；Jing等人，2006)。此外，富含G的寡核苷酸先前还被开发用作HIV整合酶的抑制剂(Jing等人，1997；Jing和Hogan，1998；Jing等人，2000a和2000b；Jing等人，2002)。
所设计的JG-ODNs的分子结构
(i)JG-ODNs的结构。预期所设计的具有14个残基的富含G的oligos会形成分子内G-四合体结构，它由在中部的两个G-四合体组成，一个X-Y-X-Y环在底部，一个Y-X环在顶部(X代表：胸腺嘧啶或胞嘧啶；Y代表：腺嘌呤或鸟嘌呤)(图3、4和17)。经NMR、CD、UV和建模确定T40214形成G-四合体结构(Jing和Hogan，1998；Jing等人，2000)。通过修饰T30923(T40214类似物)的NMR结构确定了所设计的JG-ODNs的结构(Jing等人，2000)，并在Dell计算机工作站上用INSIGHTII/DISCOVER程序进行了优化(图5)。T40214的结构与JG-ODNs例如JG243的结构之间的差异在于G-四合体的顶部环结构域。T40214形成对称的四重体(quadruplex)，类似于圆筒状。但是，预计JG-ODNs会形成不对称的椅状四重体。证明椅状G-四合体结构是JG-ODNs结合入HIF-1α的活性位点中以阻断HIF-1α和p300/CBP蛋白相互作用的关键结构。
(ii)非变性DNA凝胶。为测定所设计的富含G的ODN是否能形成G-四合体结构，进行非变性凝胶电泳。首先，在50mM KCl溶液中将32P标记的JG-ODNs在90℃加热10分钟，然后在4℃冷却30分钟。在1×TBA缓冲液中，将包含1×TBE、10％AP和30μl TEMED的20％非变性聚丙烯酰胺凝胶在4℃冷室中预冷1小时。制备的样品在4℃冷室中在20％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳6小时。
图6显示，JG243和JG244的条带具有相比T40214而言相同的迁移。T40214作为对照，因为它的分子结构已被证实为分子内G-四合体结构(Jing和Hogan，1998；Jing等人，2002)。在非变性凝胶中的迁移率取决于G-四合体寡核苷酸的分子结构。JG243、JG244和T40214的相同的迁移表明，它们形成具有相似大小的相同分子结构。因此，JG243和JG244显然形成了分子内G-四合体结构。但是，JG246看上去形成两种不同的G-四合体结构，一种结构与JG243或JG244相同，另一种看上去形成与JG249相似的结构，JG249被预期形成二聚体G-四合体结构，因为其迁移率比T40214的慢。此外，JG240和JG241形成与JG244相同的结构；JG242具有与JG246相同的结构；JG247和JG248分别形成与JG249相同的结构。
在人类癌细胞中测定所设计的JG-ODNs对HIF-1α活化的抑制(IC50)
(i)Western印迹法。为在癌细胞中测定JG-ODNs的药物活性，进行以下研究：(1)在添加有10％胎牛血清、100IU/ml青霉素和10μg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Life Technologies，Inc.Grand Island，NY)中培养癌细胞系(例如胰腺癌细胞PANC-1)，并在含5％ CO2的37℃培养箱中维持。(2)由化学合成公司Midland Certified Reagent Co.(Midland，TX)合成JG-ODNs。JG-ODNs以4∶1的比例与PEI(聚氮丙啶，25K Aldrich Chemical，WI)混合。PEI用作药物载体。然后，在接种细胞后向6孔平板中加入混合的JG-ODN/PEI(约6-9×105细胞/孔)。加入6孔平板中的JG-ODNs的浓度是：0、0.5、1.0、2.5和5.0μM。在CO2培养箱中孵育5小时后，用新鲜培养基洗涤细胞3次，并在提取前放入低氧室(BioSpherix，Redfield，NY)中以在1％ O2、5％ CO2和94％ N2条件下继续孵育16小时。(3)进行Western印迹分析来确定药物活性。
(ii)JG-ODNs对HIF-1α的抑制的IC50。JG-ODNs的药物活性结果如图7和表2中所示。
表2.JG-ODNs的药物活性
  Oligos   IC50(μM)
  T40214   N/A
  JG240   4.55
  JG241   2.46
  JG242   2.59
  JG243   1.56
  JG244   2.07
  JG246   2.76
  JG247   N/A
  JG248   4.46
  JG249   5.72
图7显示，Western印迹法表明，在常氧条件下(泳道1)，HIF-1α没有活化，因为HIF-1α具有短的半衰期(～5分钟)，很快就被泛素-蛋白酶体系统降解。但是，在低氧条件下，HIF-1α未被羟基化，因为不能获得双氧这一主要底物。未被修饰的HIF-1α蛋白逃脱了VHL-结合、泛素化和降解，然后二聚体化，从而刺激其靶基因的转录。当N803未被天冬酰胺酰-羟基化的时候，p300和CBP能够结合HIF-1α，允许HIF-1靶基因的转录活化。Western印迹法显示，在低氧条件下，所设计的JG-ODNs显著抑制HIF-1α的表达。用未加JG-ODNs的HIF-1α的条带的强度作为对照(泳道2)，通过分析Western印迹法中HIF-1α的条带的强度来确定IC50(50％抑制的浓度)。
根据这些结果，发现9个所设计的JG-ODNs在低氧条件下具有很强的抑制癌细胞中HIF-1α活化的能力，并且IC50小于5μM。JG243和JG244被选为活性最高的候选物，以用于进一步的体内测试，因为它们有最好的IC50，并且同样地形成分子内G-四合体结构。还要注意，作为对照的T40214没有抑制HIF-1α活化的药物活性。
JG-ODNs抑制HIF-1α活化的机制
利用分子建模和计算机分析来推测JG-ODNs抑制HIF-1α活化的机制。这种方法基于两个假设：(i)HIF-1α的C-末端结构域的NMR结构(Dames等人，2002)包含p300/CBP结合位点的合理分子形状；和(ii)由分子对接(docking)而获得的HIF-1α/JG-ODN复合物是寻找有效抑制剂的有用起点。
(i)计算机研究。在该研究中使用GRAMM程序(Katchalski-Katzir等人，1992；Ritchie和Kemp，2000)。GRAMM进行彻底的基于网格的对于受体-配体复合物的表面互补性的搜索。这个程序根据基于几何学的算法，以用于预测已知结构的分子间可能的复合物的结构。它可提供涉及分子间接触性质的定量数据。分子间能量计算依赖于已为大家认可的相关性和在模式识别领域中所使用的傅立叶变换技术。通过使用它们的原子坐标，通过GRAMM进行的对接计算预测了两个组成分子之间形成的复合物的结构，在这之前对它们的结合位点一无所知。该计算方法在装有SYBYL程序的De l l计算机工作站上进行。
(ii)JG-ODNs抑制HIF-1α活化的机制。为确定JG-ODN抑制HIF-1α活化的机制，本发明者不设任何限制地随机将JG244对接到HIF-1α的C-末端结构域的结构上1000次，并分析JG244和HIF-1α的C-末端结构域之间形成的氢键的分布。氢键分布的直方图显示，JG244和HIF-1α的C-末端结构域之间的相互作用高度集中在由氨基酸796到806组成的区域上(全部氢键的47.8％)，包括N803的残基(图8)。
计算的结果显示，JG244和HIF-1α之间形成的全部氢键的47.8％分布于氨基酸796到806的区域中，表明JG-ODNs通过结合入由残基796到806组成的位点中而与HIF-1α强烈地相互作用。在低氧情况下，N803不被天冬酰胺酰-羟基化，p300和CBP能够结合HIF-1α，允许HIF-1靶基因的转录活化。HIF-1α的活化参与许多细胞过程，例如血管生成、抗凋亡、新陈代谢、转移及其他。综合Western印迹法和分子对接的结果可以推断，在低氧条件下JG-ODNs显著抑制HIF-1α的活化，因为JG-ODNs牢固地结合至HIF-1α的残基796到806的位点中，并阻断了低氧情况下p300/CBP与HIF-1α的N803之间的相互作用(图8)。因此，JG-ODNs是HIF-1α的有效抑制剂。
JG-ODNs减少癌细胞中的血管生成
HIF-1是受氧调节的基因表达的主要调节因子。已经鉴定了超过60个公认的HIF-1靶基因(Semenza，2003)。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是主要靶基因之一，而且是关键的血管生成因子。VEGF直接参与血管生成，它特异地将内皮细胞募集到低氧和无血管的区域中并刺激它们增殖(Harris，2002；Bicknell和Harris，2004)。低氧通过上调VEGF的表达来促进血管生成的刺激因素。VEGF表达的抑制是低氧情况下减少血管生成的重要因素。
实验按照此处其他地方的描述进行。分析Western印迹以检测低氧情况下HIF-1α及其下游蛋白质VEGF的表达水平。结果(图9)显示，在低氧情况下，当JG-ODNs浓度增加时，HIF-1α和VEGF的蛋白表达水平极大降低。当JG-ODN浓度超过2μM时，VEGF的表达被完全阻断。显然，JG243和JG244抑制HIF-1α及其下游蛋白质VEGF的活化，并显著减少癌症中的血管生成。此外，在相似的测定法中显示，JG243和JG244抑制HIF-2α。但是，p53的表达不被JG-ODNs破坏。因此，结果表明，HIF-1α是在低氧情况下在胰腺癌细胞中被活化的主要HIF蛋白，并且JG-ODNs选择性地抑制HIF-1α的活化并阻断其转录蛋白的活化。
JG-ODNs极大增加人类癌细胞的凋亡
HIF-1通过上调其靶基因而在肿瘤进展中扮演关键性的角色，所述靶基因参与新陈代谢、血管生成、细胞存活、细胞侵入和药物抗性(Hirota和Semenza，1996；Gatenby等人，1988)。
HIF-1α活化的抑制不仅减少血管生成，而且诱导导致肿瘤细胞死亡的凋亡，这是癌症治疗中所需的结果。
采用流式细胞术分析来证明循环细胞中的凋亡。简单来说，将胰腺癌细胞(1百万)在4℃下于5ml冰冷的80％(v/v)乙醇中固定过夜。然后将细胞离心，用1ml PBS洗涤，重悬于1ml PBS中。加入无DNA酶的RNA酶，然后加入100μl PI(碘化丙锭；50μg/ml)。重悬的细胞在暗处于37℃孵育1小时，并覆盖直至使用。在FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)上用10×104个细胞测量细胞的荧光。从细胞DNA含量估计出处在每个细胞周期阶段中或正在凋亡的细胞的比例。结果显示在用碘化丙锭(PI)/流式细胞术测定的在癌细胞(MIA PANC-2)中的细胞周期分布直方图中(图10A)。SG1期与导致细胞死亡的细胞核中损伤的DNA对应。细胞周期结果显示，用JG244/PEI处理的细胞的SG1从所有细胞的3％(仅用PEI处理)增加到18％，相应于人类癌细胞中凋亡的显著增加。
图10B中，我们采用流式细胞术分析来证明细胞周期中的凋亡。简单地说，将胰腺(和前列腺)癌细胞(1百万)在4℃下于5ml冰冷的80％(v/v)乙醇中固定过夜。然后将细胞离心，用1ml PBS洗涤，重悬于1ml PBS中。加入无DNA酶的RNA酶，然后加入100μl PI(碘化丙锭；50μg/ml)。重悬的细胞在暗处于37℃孵育1小时，并覆盖直至使用。在FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA，USA)上用10×104个细胞测量细胞的荧光。从细胞DNA含量估计出处在每个细胞周期阶段中或正在凋亡的细胞的比例。结果显示在用碘化丙锭(PI)/流式细胞术测定的在癌细胞(PANC-1和PC3)中的细胞周期分布直方图中。亚-G1(SG1)期与导致细胞死亡的细胞核中损伤的DNA对应。直方图(图10C)显示，与未处理的癌细胞(对照)相比较，用PEI(0.5μM)或ns-ODN/PEI(1μM+0.5μM)进行处理没有改变癌细胞中SG1的百分比，表明作为药物载体的PEI和作为对照ODN的ns-ODN不诱导细胞的凋亡。但是，用JG243/PEI和JG-244/PEI(1μM+0.5μM)处理的PANC1细胞的SG1分别从5.8％增加到30.1％和37.6％；用JG243和JG-244处理的PC3细胞的SG1分别从0.8％增加到20.4％和21.2％。由此可见，JG-ODNs显著促进癌细胞中的凋亡。JG-ODNs用于癌症治疗的药效
确定JG-ODNs用于癌症治疗的药效。
(i)建立具有人类癌症的动物异种移植物。对新设计的抗癌药物来说药效是一个重要因素。在此，在人类癌症异种移植模型中对JG-ODNs进行体内药物测试。简单地说，通过用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理细胞5分钟，然后将收获的细胞在室温下以2000rpm离心5分钟，来制备人类癌细胞悬浮液(例如前列腺癌PC3和胰腺癌PANC-1)以用于皮下注射。获得的细胞沉淀重悬于2ml PBS中，并计数细胞数量。每只无胸腺裸鼠(Balb/nu/nu，28天龄，～20g体重)皮下注射200微升肿瘤细胞悬浮液(约5×106细胞)，所述裸鼠来自NCI-CharlesRvier Labs(Frederick，Maryland)。每天监控注射了前列腺癌或胰腺癌细胞的小鼠的肿瘤生长，当肿瘤大小达到10-50mm3时进行测试。
(ii)递送JG-ODNs到裸鼠肿瘤内。将JG-ODNs有效递送到裸鼠肿瘤内是癌症治疗成功的关键。已建立了新的用于G-四合体ODN的递送系统(Jing等人，2002)(Jing等人，美国专利号7,119,078)，这显著增加了在细胞中和体内的药物活性。在本发明中，利用在裸鼠中生长的人类肿瘤异种移植物来测定递送到裸鼠肿瘤中的G-四合体ODN的量。首先，通过腹膜内(IP)注射施用5′-荧光标记的G-四合体ODN(10mg/kg)，加上PEI(2.5mg/kg)作为细胞内载体。在这些注射后，在24、48和72小时收集肿瘤，然后在荧光显微镜下观察肿瘤。在48和72小时，肿瘤中G-四合体ODN的水平分别大概是在24小时时的水平的60％和20％(图11)。结果清楚地显示，JG-ODN被有效递送到肿瘤内，而且在肿瘤中JG-ODN的结构构型延长了药物功能，因此例如可至少用作胰腺癌的治疗方法。这也表明，在特定实施方案中，该DNA递送系统在体内是成功的。
(iii)体内测定JG-ODNs的药物活性。采用以下步骤测定JG-ODNs(JG243和JG244)的抗肿瘤活性。将具有形成的肿瘤的无胸腺裸鼠随机分配到测试和对照组(每组4-5只小鼠)中，抗肿瘤活性测试在下列组中同时进行：(i)安慰剂组，其仅用被用作药物递送载体的PEI(2.5mg/kg)进行治疗；(ii)两个药物测试组，其分别用JG243/PEI(10mg/kg+2.5mg/kg)和JG244/PEI(10mg/kg+2.5mg/kg)进行治疗。具有肿瘤异种移植物的裸鼠通过腹膜内(IP)注射进行治疗。每隔一天注射一剂，持续2-3周。通常根据安慰剂治疗组中肿瘤的生长速率和肿瘤对小鼠健康的影响来确定药物治疗的时间。
(iv)对前列腺癌的体内药物活性。在22天期间，在用PEI治疗的小鼠中前列腺肿瘤的平均大小从5.4增加到759.5(mm3)，而在用JG243和JG244治疗的小鼠中前列腺肿瘤的平均大小只是分别从11.3增加到103.0(mm3)和从12.4增加到97.6(mm3)(图12和13A)。个体相对肿瘤体积(RTV)对药物治疗天数的图(图13B)显示，与用PEI治疗的肿瘤相比，肿瘤生长速率被JG-ODN治疗显著抑制。RTV按以下方式计算：RTV＝Vt/V0，其中Vt是测量过程中每一天的体积，而V0是开始治疗那天的体积。此外，还发现用PEI治疗的小鼠的平均肿瘤重量是0.58±0.16g，而用JG243和JG244治疗的小鼠的平均肿瘤重量分别是0.15±0.07g和0.12±0.03g，这显示JG-ODNs显著抑制前列腺肿瘤生长。这些结果表明，所设计的作为抗癌剂的JG-ODNs，例如JG243和JG244，对前列腺癌具有明显的功效。
(v)对胰腺癌的体内药物活性。在14天期间，在用PEI治疗的小鼠中胰腺肿瘤(PANC-1)的平均大小从34.8增加到532.1(mm3)。在用JG243和JG244治疗的小鼠中胰腺肿瘤的平均大小分别从37.7减小到2.4(mm3)和从25.6减小到21.0(mm3)(图14和15A)。RTV对药物治疗天数的图(图15B)显示，JG-ODNs诱导负的胰腺肿瘤生长速率，并且治疗两周后再也检测不到肿瘤。此外，一些经PEI治疗的肿瘤作为异种移植物生长于小鼠体内，并且在用PEI治疗的小鼠中平均肿瘤重量是0.36±0.10g。用JG243和JG244治疗的小鼠的平均肿瘤重量分别只有0.02±0.007g和0.07±0.03g。这些体内结果显示，JG243和JG244是人类癌症治疗中用来抑制胰腺癌肿瘤的可能有效的抗癌药物，特别是JG243，在使用其进行治疗的情况下在两周治疗期间所有4只小鼠中均检测不到肿瘤。
(v)药物活性总结。表3中显示了体内药物测试的总结。在这些研究中，数据显示，JG243和JG244均是有效的抗癌剂，它们在裸鼠中抑制肿瘤生长，并且JG-ODNs是一类新的有前途的用于人类癌症治疗的抗癌药物，包括前列腺癌、胰腺癌和其他癌症。在前列腺癌治疗中JG243的药效与JG244相同，但在胰腺癌治疗中JG243的药效好于JG244。JG-ODNs抑制肿瘤的机制被认为是JG-ODNs抑制HIF1α及其靶蛋白VEGF的活化。因此，JG-ODNs减少血管生成并增加肿瘤中的凋亡，从而显著抑制肿瘤生长。
Figure A20071014212800491
实施例2
肺癌实施方案
在这个特定实施方案中，示例性的JG244强烈抑制非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤异种移植物的生长。
肺癌是最常见的癌症之一，在全世界范围内是癌症死亡率的主要原因。大部分肺癌都是NSCLC。仅在2004年就诊断出1,500,000例肺癌。在美国，每年大约170,000人被诊断出具有肺癌，在这些患者中，大概85％死于该疾病；每年肺癌死亡人数超过乳腺癌、前列腺癌和结肠癌的死亡总数。
在这些研究中，在裸鼠中生长的预先形成的NSCLC肿瘤异种移植物用JG244进行治疗，肿瘤平均体积在开始时为226.2(mm3)。在三周的药物治疗期间，对照(未治疗的)肿瘤和用PEI治疗的肿瘤的平均体积分别增加12倍和7.2倍；用对照ODN(非特异性ODN)治疗的肿瘤的平均体积增加6.1倍；但是，用JG244治疗的肿瘤的平均体积只增加3.3倍(表4以及图18和19)。
Figure A20071014212800511
未治疗的和用JG244治疗的肿瘤之间的P值小于0.01，而用PEI治疗的和用JG244治疗的肿瘤之间的P值小于0.03，这显示了显著的药效。因此，作为有效抗癌剂的JG-ODNs不仅显著抑制胰腺和前列腺癌的肿瘤生长(见上)，而且强烈地延缓在裸鼠异种移植物中NSCLC肿瘤的生长。
实施例3
为新的药物设计建立的结构-活性关系(SAR)
结构-活性关系(SAR)可用于合理的药物设计，并且还可用于设计HIF-1α活性的有效抑制剂。典型的SAR基于两个关键研究：(1)已经定位JG-ODNs所靶向的HIF-1α的活性位点；和(2)已经测定JG-ODNs抑制HIF-1α活化的IC50(表5)。然后，将每种所设计的JG-ODN(JG240到JG249)对接到HIF-1α的活性位点中，并计算JG-ODN和HIF-1α之间的结合能。在SYBYL7.3中用DOCK模块计算结合能。(i)构建JG-ODNs的三维结构，并从Protein Data Bank下载HIF-1α。(ii)利用GRAMM和HEX对接技术来获得JG-ODN/HIF-1α复合物的合理的结合模型。利用具有Gasteiger-Huckel电荷和距离依赖性介电功能的Tripos力场进行计算。(iii)通过从复合物的能量中减去游离HIF-1α和JG-ODN的能量来计算结合能(E结合＝E复合物-EHIF-EODN)，结果列于表5中。
线性回归分析表明，IC50和结合能之间存在线性SAR(R2＝0.91)(图20)。该线性关系表明，具有较低结合能的JG-ODN相应于较高的药物活性。这种定量SAR可用于优化和预测新JG-ODNs的活性。例如，当设计另一种JG-ODN时，可首先计算其结合能，然后根据SAR估计IC50，并确定该新药物对于在体内和体外使用是否有效。该所建立的SAR有助于鉴定和优化新的有效的抗癌剂。
实施例4
本发明的重要性
开发用于癌症治疗的新HIF-1抑制剂非常重要。(i)在2005年，在美国，(例如)前列腺癌估计总计约有190,000新发癌症病例，死亡人数超过30,000。前列腺癌是最通常被诊断出的癌症之一，是美国男性中癌症死亡的第二位主要原因。针对不依赖雄激素的前列腺癌的目前治疗方法在存活率方面没有明确的提高。晚期和转移前列腺癌症患者的治疗选择是受限制的。(ii)胰腺癌在男性和女性中都是癌症死亡率的第四位主要原因，它仍是最可怕的恶性肿瘤。在美国，每年诊断出约32,000个新的胰腺癌病例，并且每年死亡率很接近于新发病例数。由于胰腺癌通常到晚期才能诊断，因而其特征在于倾向于侵略性地侵入周围组织，早且广泛地转移，并且拮抗传统的化学放射治疗策略。
人类癌症治疗急需采用新试剂的创新的治疗方法，这些试剂具有不同的作用机制和新的分子靶标。不断增加的证据显示，正在生长的肿瘤细胞团必须募集自己的血液供应以维持氧气和营养物，这称为肿瘤血管生成。在肿瘤中，低氧对于生理和病理性血管生成来说都是关键性的因素。为了对肿瘤内的低氧状态作出响应，肿瘤细胞产生的血管生成刺激因子对于在恶劣微环境中肿瘤细胞的存活和增殖非常重要。因此，低氧诱导因子-1(HIF-1)在许多人类癌症的进展和治疗抗性方面起着重要作用。
JG-ODNs抑制HIF-1α活化的机制已被阐明。HIF-1α已被鉴定为癌症治疗的重要分子靶标，因为HIF-1α激活基因的转录，这些基因参与癌症生物学的重要方面，包括血管生成、细胞存活、葡萄糖代谢和侵入。因此，以HIF-1α为靶标构成了一种新的且有效的人类癌症治疗方法。在低氧条件下，因为不能获得双氧这一主要底物，所以合成的HIF-1α不被羟基化。未修饰的蛋白质逃脱了与VHL的结合、泛素化及降解，然后二聚体化HIF-1α并刺激其靶基因的转录。当N803未被天冬酰胺酰-羟基化的时候，p300和CBP能够结合HIF-1α，从而允许HIF-1靶基因的转录活化，这涉及许多细胞过程：血管生成、抗凋亡、新陈代谢、转移及其他。通过PEI递送的G-四合体ODNs结合到HIF-1α的残基796到806的区域中，从而抑制了在低氧条件下p300/CBP与HIF-1α的N803之间的相互作用，并阻断了其的转录活化(图16)。利用裸鼠异种移植物在体内检测了JG243和JG244的药效。结果显示，JG243和JG244都能显著抑制肿瘤块，并极大降低胰腺和前列腺肿瘤生长的速率，这是因为减少了血管生成和增加了凋亡。还应注意到，JG243诱导了负的胰腺肿瘤生长速率，并在两周期间在所有接受治疗的小鼠中完全杀死胰腺肿瘤，显示了非常强的药物活性。因此，JG-ODNs具有成为有效HIF-1α抑制剂的强大能力，并且代表了在胰腺肿瘤治疗中一类新的有前途的抗癌药物。
综上所述，本发明提供了以下针对JG-ODNs的实施方案，JG-ODNs是以HIF-1α为靶标的对于人类癌症治疗来说新的且有效的抗癌剂：
(1)根据HIF-1α的C-末端的NMR结构构建了合理的模型(Dames等人，2002)，并且建立了JG-ODNs与HIF-1α之间的结构-活性关系(SAR)以用于合理的药物设计。还建立了药物优化程序以在未来临床试验中增加JG-ODN的成功几率。
(2)作为先导化合物，形成分子内G-四合体结构的JG243和JG244是人类癌细胞(包括胰腺和前列腺癌)中HIF-1α活化的有效抑制剂。JG-ODNs还阻断HIF-1α下游蛋白质VEGF的表达，并在人类癌症中显著减少血管生成和增加凋亡。体内药物测试显示，JG243和JG244显著抑制肿瘤块，并极大地降低肿瘤生长速率，包括胰腺和前列腺癌。尤其是，JG243诱导负的胰腺肿瘤生长速率，并在两周期间在所有接受治疗的小鼠中完全杀死胰腺肿瘤，显示了非常强的药物活性。
(3)稳定的G-四合体基序是这些寡核苷酸的显著的核酸酶抗性和长期生物学效用的主要决定因素。分子内G-四合体结构阻止单链核酸内切酶接近它们的切割位点，导致在血清和细胞中较长的寡核苷酸半衰期(Bishop等人，1996)。
(4)开发了新的且有效的用于G-四合体ODNs的细胞内递送系统(Jing等人，2002)。将JQ-ODNs有效递送到癌细胞内是癌症治疗成功的关键。这个系统极大提高了递送效率和JG-ODNs在细胞中的药物活性。这个系统还证明了G-四合体ODN递送到动物组织中的能力(Jing等人，2005)，这表明这些试剂在未来用于治疗转移性癌症方面具有十分良好前景。
(5)富含G的ODNs是具有低毒性的试剂。JG-ODNs的类似物，富含G的ODN T30177(或AR177)的毒性研究已经公开(Wallace等人，2000)。富含G的ODNs在三种不同的诱变实验中不显示遗传毒性：Ames/沙门氏菌(Salmonella)诱变实验，CHO/HGPRT哺乳动物细胞诱变实验，和小鼠微核实验。小鼠中的急性毒性研究显示，富含G的ODN的LD50(50％的致死剂量)是＞1.5g/kg体重，这比体内治疗水平高150倍。小鼠中的多剂毒性研究显示，剂量达到600mg/kg前，富含G的ODN不会造成雄性特异性的死亡率或者血清化学、血液学和组织学的改变，600mg/kg的剂量比治疗水平高＞60倍。剂量为600mg/kg时，临床化学发现包括肝功能的改变和红细胞值的降低。
参考文献
本说明书中提及的所有专利和出版物都是为了表明本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物在此引入作为参考，就像具体地和单独地指明每一个单个的出版物在此引入作为参考一样。
专利和专利申请
美国专利号4,162,282
美国专利号4,310,505
美国专利号4,533,254
美国专利号4,728,575
美国专利号4,728,578
美国专利号4,737,323
美国专利号4,921,706
美国专利号5,401,511
美国专利号5,603,872
美国专利号5,879,703
国际申请PCT/US85/01161
国际申请PCT/US89/05040
英国专利申请GB 2193095 A
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尽管已详细描述了本发明及其优点，但是应该知道此处可以进行各种变化、替换和改变，但不脱离所附权利要求书所定义的本发明的精神和范围。此外，本申请的范围不限于说明书中描述的过程、仪器、制备、物质组合物、手段、方法和步骤的特定实施方案。正如本领域普通技术人员可以从本发明的公开内容容易地得知的，根据本发明可以使用现在存在的或以后开发出的、与此处描述的相应实施方案相比起基本相同功能或达到基本相同效果的过程、仪器、制备、物质组合物、手段、方法或步骤。因此，所附的权利要求书将这样的过程、仪器、制备、物质组合物、手段、方法或步骤包括在其范围内。
序列表
<110>Jing，Naijie
Guan，Yongli
<120>以低氧诱导因子1-α(HIF1α)作为靶标的G-四合体寡核苷酸
<130>HO-P03426CN0
<140>Not Assigned
<141>2007-05-09
<160>13
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>13
ggtaggtagg tagg                                        14

Claims (28)

1.治疗和/或预防个体中过度增生疾病的方法，包括向所述个体递送治疗有效量的一种或多种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含G-四合体并且抑制HIF1α。
2.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸被进一步定义为包含选自SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID N0：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13及其组合的序列。
3.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO：8。
4.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQ ID NO：9。
5.权利要求1的方法，其中所述过度增生疾病是癌症，并且所述个体还接受其他癌症疗法。
6.权利要求5的方法，其中所述其他癌症疗法包括化疗、免疫疗法、放疗、手术或其组合。
7.权利要求1的方法，其中所述过度增生疾病是胰腺癌。
8.权利要求1的方法，其中所述过度增生疾病是前列腺癌。
9.分离的寡核苷酸，包含选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13及其组合的序列。
10.包含一种或多种寡核苷酸的试剂盒，其中所述寡核苷酸包含选自SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13及其组合的序列。
11.权利要求10的试剂盒，其中试剂盒还包括其他抗癌剂。
12.胞内递送富含G的寡核苷酸的方法，包括以下步骤：
将所述寡核苷酸变性，其中所述寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：1，SEQID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13及其组合的序列；
将所述寡核苷酸与脂质混合以形成寡核苷酸-脂质复合物；和
将所述寡核苷酸-脂质复合物与细胞一起孵育，其中所述寡核苷酸被内化入细胞中。
13.权利要求12的方法，所述方法在内化的寡核苷酸被诱导而形成G-四合体结构的条件下进行。
14.权利要求13的方法，其中G-四合体结构进入细胞核。
15.权利要求13的方法，其中G-四合体结构抑制HIF1α的表达和/或活性。
16.SEQ ID NO：1所示的分离的寡核苷酸。
17.SEQ ID NO：2所示的分离的寡核苷酸。
18.SEQ ID NO：3所示的分离的寡核苷酸。
19.SEQ ID NO：4所示的分离的寡核苷酸。
20.SEQ ID NO：5所示的分离的寡核苷酸。
21.SEQ ID NO：6所示的分离的寡核苷酸。
22.SEQ ID NO：7所示的分离的寡核苷酸。
23.SEQ ID NO：8所示的分离的寡核苷酸。
24.SEQ ID NO：9所示的分离的寡核苷酸。
25.SEQ ID NO：10所示的分离的寡核苷酸。
26.SEQ ID NO：11所示的分离的寡核苷酸。
27.SEQ ID NO：12所示的分离的寡核苷酸。
28.SEQ ID NO：13所示的分离的寡核苷酸。
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PB01 Publication
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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