CN105381464A - 一种针对肿瘤治疗的dna超晶格纳米载药分子的制备方法 - Google Patents

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何丹农
王萍
刘婷
夏智伟
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Abstract

本发明涉及一种针对肿瘤治疗的新型DNA网状纳米载药分子的构建方法，通过DNA四面体与纳米金的复合形成一种纳米网状结构，包括DNA四面体（TDN）结构的制备、粒径为4nm的纳米金粒子的制备、DNA四面体（TDN）与金纳米粒子的结合。本发明中的DNA四面体大小和开关精确可控且性质极其稳定。本发明创造性地使用DNA与金纳米粒子将DNA四面体连接起来，形成了一个大型的网状结构。本发明主要以DNA为原料，对人体无害。因而本发明将有望在肿瘤的研究与治疗领域有极大的应用。

Description

一种针对肿瘤治疗的DNA超晶格纳米载药分子的制备方法
技术领域
本发明公开了一种针对肿瘤治疗的DNA超晶格纳米载药分子的制备方法。所述超晶格结构的纳米载药分子是由DNA四面体折纸结构通过巯基与纳米金结合成四面体-纳米金复合物，并由另一条单链连接这些复合物从而形成一种超晶格结构。本发明属于纳米生物医药领域。
背景技术
恶性肿瘤是当前危害人类健康，威胁人类生命安全的重要疾病之一。近年来，世界范围内死于肿瘤的人数一直呈上升趋势。因此，研究治疗肿瘤的药物载体也成了当今世界迫切需要的解决问题。金纳米粒子由于其良好的生物相容性、粒径容易掌控和表面容易修饰等优点被认为是一种很有潜力的纳米药物载体。目前，对金纳米粒子的合成工艺已经十分成熟，不仅可以实现其在1-100纳米范围内大小和形状的可控，还可以通过表面修饰对其表面的物理、化学性质进行控制。在生物医药领域中，金纳米粒子已成为最活跃的材料之一并在肿瘤的热疗、造影以及载药方面有了新的突破。然而，令人们担忧的是，由于其生物的不可降解性，在体内循环时间过长容易团聚，形成有害代谢产物并被运输到肝脏等重要器官，从而引发其他的疾病。
DNA由于其精准的碱基配对结构以及良好的生物相容性一直以来受到了人们的广泛关注。DNA折纸结构更是进一步推动了DNA的研究并大大拓宽了其应用领域。尤其在生物医药方面，DNA折纸结构在肿瘤的治疗、分子检测方面已有突出贡献。受益于碱基互补配对原则，本发明通过DNA四面体折纸结构来控制金纳米粒子，使其在微观上形成一种超晶格结构，这种结构将使其在循环过程中不易团聚从而通过肾脏排出体外。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种针对肿瘤治疗的DNA超晶格纳米载药分子的制备方法。该方法将四条特定的DNA单链自组装成带有一段i-motif链并持有三个巯基的DNA四面体，再通过巯基与金纳米粒子结合，最后引入与i-motif链特异性互补的二倍长的单链将四面体相互连接起来形成一个超晶格结构。本发明在肿瘤研究治疗领域具有潜在的应用前景。
一种针对肿瘤治疗的DNA超晶格纳米载药分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）DNA四面体（TDN）结构的制备：
将四条单链（50μM）分别取2μL加入到42μLTris-MgCl2（Tris10mM,MgCl250mM,pH8）溶液中并置于PCR仪内，将温度迅速升到95℃稳定10分钟再冷却至4℃稳定30分钟便可得到高产率的DNA四面体（2uM）；
（2）粒径为4nm的纳米金粒子的制备：
取10ml浓度为2.5*10-4M的柠檬酸钠溶液放入50ml圆底烧瓶中，加入28ul高氯酸（30mg/ml），最后在搅拌下加入0.3ml新配制的硼氢化钠（0.1M）溶液，即得到粒径为4nm的纳米金溶液；
（3）DNA四面体（TDN）与金纳米粒子的结合：
取将400ul金纳米粒子离心用30K超滤管滤去多余的溶剂，取沉淀用100ulPBS（10mMpH7.4）溶解，然后加入2ulTDN(2uM），静置过夜；
（4）DNA超晶格结构的合成：
取1μLi-motif的互补链加入上述溶液中，混匀并在PCR中60度反应10分钟并迅速降至37度保持2小时。
通过改变DNA四面体与金纳米粒子的摩尔比，改变超晶格结构的大小程度。
最终退火温度选择迅速降温，或选择逐步缓慢降温。
本发明中用到的DNA链序列如序列表所示，带有i-motif的单链用TDN-1表示、带有巯基的单链分别用SH-TDN-2、SH-TDN-3、SH-TDN-4表示。
本发明的优点在于：
本发明以带有i-motif的DNA四面体为连接体，创造性地合成了DNA、纳米金超晶格结构，其原料性质稳定，生物安全性好。
本发明中合成的DNA四面体由于精准的碱基配对原则，其大小和形状精确可控，三维构型有利于超晶格结构的形成。
本发明使用DNA和纳米金粒子为原材料，生物相容性好。
附图说明
图1为TDN-Au复合物粒度图。
图2为TDN-Au复合物紫外吸收图（吸收波的红移表示溶液中的颗粒粒径变大）。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1：
将四条单链（50μM）i-motif-TDN-1,SH-TDN-2,SH-TDN-3,SH-TDN-4分别取2μL加入到42μLTris-MgCl2（Tris10mM,MgCl250mM,pH8）溶液中并置于PCR仪内，将温度迅速升到95℃稳定10分钟再冷却至4℃稳定30分钟便可得到高产率的DNA四面体（2uM）。
取10ml浓度为2.5*10-4M的柠檬酸钠溶液放入50ml圆底烧瓶中，加入28ul高氯酸（30mg/ml），最后在搅拌下加入0.3ml新配制的硼氢化钠（0.1M）溶液，即得到粒径为4nm的纳米金溶液。
将100ul金纳米粒子离心用30K超滤管滤去多余的溶剂，取沉淀用100ulPBS·Mg2+（PBS10mM,MgCl25Mm,pH7.4)溶解，然后加入2ulTDN(200nM），静置过夜。
取1μli-motif的互补链加入上述溶液中，混匀并在PCR中60度反应10分钟并迅速降至37度保持2小时。
实施例2：
将四条单链（50μM）i-motif-TDN-1,SH-TDN-2,SH-TDN-3,SH-TDN-4-Cy3分别取2μL加入到42μLTris-MgCl2（Tris10mM,MgCl250mM,pH8）溶液中并置于PCR仪内，将温度迅速升到95℃稳定10分钟再冷却至4℃稳定30分钟便可得到高产率带荧光的DNA四面体（2uM）。
取10ml浓度为2.5*10-4M的柠檬酸钠溶液放入50ml圆底烧瓶中，加入28ul高氯酸（30mg/ml），最后在搅拌下加入0.3ml新配制的硼氢化钠（0.1M）溶液，即得到粒径为4nm的纳米金溶液。
将200ul金纳米粒子离心用30K超滤管滤去多余的溶剂，取沉淀用100ulPBS·Mg2+（PBS10mM,MgCl25Mm,pH7.4)溶解，然后加入2ulTDN(200nM），静置过夜。
取1μli-motif的互补链加入上述溶液中，混匀并在PCR中60度反应10分钟并迅速降至37度保持2小时。
实施例3：
将四条单链（50μM）i-motif-TDN-1,SH-TDN-2,SH-TDN-3,SH-TDN-4分别取2μL加入到42μLTris-MgCl2（Tris10mM,MgCl250mM,pH8）溶液中并置于PCR仪内，将温度迅速升到95℃稳定10分钟再冷却至4℃稳定30分钟便可得到高产率的DNA四面体（2uM）。
取10ml浓度为2.5*10-4M的柠檬酸钠溶液放入50ml圆底烧瓶中，加入28ul高氯酸（30mg/ml），最后在搅拌下加入0.3ml新配制的硼氢化钠（0.1M）溶液，即得到粒径为4nm的纳米金溶液。
将200ul金纳米粒子离心用30K超滤管滤去多余的溶剂，取沉淀用100ulPBS·Mg2+（PBS10mM,MgCl25Mm,pH7.4)溶解，然后加入2ulTDN(200nM），静置过夜。
取1μli-motif的互补链加入上述溶液中，混匀并在PCR中60度反应10分钟并以0.1℃/10min的速率降至37度保持2小时。

Claims (3)

1.一种针对肿瘤治疗的DNA超晶格纳米载药分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）DNA四面体（TDN）结构的制备：
将四条单链（50μM）分别取2μL加入到42μLTris-MgCl2（Tris10mM,MgCl250mM,pH8）溶液中并置于PCR仪内，将温度迅速升到95℃稳定10分钟再冷却至4℃稳定30分钟便可得到高产率的DNA四面体（2uM）；
（2）粒径为4nm的纳米金粒子的制备：
取10ml浓度为2.5*10-4M的柠檬酸钠溶液放入50ml圆底烧瓶中，加入28ul高氯酸（30mg/ml），最后在搅拌下加入0.3ml新配制的硼氢化钠（0.1M）溶液，即得到粒径为4nm的纳米金溶液；
（3）DNA四面体（TDN）与金纳米粒子的结合：
取将400ul金纳米粒子离心用30K超滤管滤去多余的溶剂，取沉淀用100ulPBS（10mMpH7.4）溶解，然后加入2ulTDN(2uM），静置过夜；
（4）DNA超晶格结构的合成：
取1μLi-motif的互补链加入上述溶液中，混匀并在PCR中60度反应10分钟并迅速降至37度保持2小时。
2.根据权利要求1所述一种针对肿瘤治疗的DNA超晶格纳米载药分子的制备方法，其特征在于，通过改变DNA四面体与金纳米粒子的摩尔比，改变超晶格结构的大小程度。
3.根据权利要求1所述一种针对肿瘤治疗的DNA超晶格纳米载药分子的制备方法，其特征在于，最终退火温度选择迅速降温，或选择逐步缓慢降温。
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