CN113308473B - 一种超级增强子相关的长链非编码rna及其在治疗肝癌中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种长链非编码RNAs为HSAL3，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，或其DNA全长序列如SEQ ID NO:2所示。并通过实验证明该基因在肝细胞癌中与肝细胞癌的恶性程度有关，该基因具有肝细胞癌基因治疗的用途。本发明还提供了该基因的siRNA靶序列，具有抑制该基因表达的作用，具有肝细胞癌的基因治疗的用途。此外，使用脂质纳米材料包裹所述siRNA可作为治疗肝细胞癌的一种新的治疗药物。

Description

一种超级增强子相关的长链非编码RNA及其在治疗肝癌中的 用途
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学与纳米领域，具体涉及一种超级增强子相关的长链非编码RNA及其在治疗肝癌中的用途。
背景技术
根据GLOBOCAN对全球185个国家36种癌症的统计发现，全球在2020 年肝癌的发病率位居全球第六(830,180；8.3％)，死亡率位居第三(905,677； 4.7％)。而中国的2018年统计数据显示，肝癌的发病率位居第四(392,868例；9.2％)，癌症相关死亡位居第三(368,960例；12.9％)。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)约占肝癌病例的90％，是肝癌最常见的形式。目前，HCC的治疗方法包括切除、局部消融治疗、肝移植、经肝动脉化疗栓塞(transhepatic arterial chemoembolization，TACE)、肝动脉灌注化疗(hepatic arteryinfusion chemotherapy，HAIC)和全身疗法。得益于治疗技术的巨大进步，HCC患者的总体生存率和生活质量显着提高。但HCC患者的临床预后仍然很差。因此，进一步探索HCC新的治疗方法并阐述其分子机制迫在眉睫。
超级增强子(Super-enhancers，SEs)是来源于基因组DNA的顺式作用元件，由一系列活性调节性增强子组成。超级增强子通过控制细胞/组织类型特异性基因调控，在识别细胞身份和命运方面起着至关重要的作用，从而加速疾病的进展和严重程度。据报道，编码基因表达的上调经常与超级增强子有关。先前的研究已鉴定出HCC中超级增强子的特征，并将编码基因SPHK1鉴定为与超级增强子相关的编码癌基因。然而，对于肝细胞癌中超级增强子相关的长链非编码RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)鲜少报道。在本发明中，我们鉴定了肝细胞癌特异性超级增强子相关致癌新lncRNA，我们将其命名为HSAL3(英文全称是HCC-specific SE-associated oncogenic lncRNA RP13-890H12.2，中文全称是肝细胞癌特异性超级增强子相关lncRNA 3)，目前尚无关于该lncRNA的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长链非编码RNAs，所述长链非编码RNAs为肝细胞癌特异性超级增强子相关促癌性lncRNA，我们将其命名为HSAL3，(即 HCC-specific SE-associated oncogenic lncRNA RP13-890H12.2，也称肝细胞癌特异性超级增强子相关lncRNA3)具有一定促进癌症的功能，超级增强子可通过转录驱动HSAL3的表达，从而促进肝细胞癌细胞的增殖和迁移。
本发明使用以下技术方案实现本发明的目的：
第一个方面提供一种长链非编码RNAs，所述长链非编码RNAs为HSAL3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明人发现HSAL3(HCC-specific SE-associated oncogeniclncRNA RP13-890H12.2，肝细胞癌特异性超级增强子相关促癌性lncRNA3)具有一定促进癌症的作用，超级增强子通过转录驱动HSAL3 的表达，从而促进肝细胞癌细胞的增殖和迁移，加速癌症的进展和严重程度。
第二个方面提供检测如上所述的长链非编码RNAs表达量的试剂在制备肝癌诊断试剂中的应用。由于HSAL3在肝癌细胞中高表达，在正常组织中低表达。因此，可通过检测其表达含量从而诊断检测对象是否患有肝癌。
优选地，所述检测表达量的试剂包括扩增引物，所述引物序列如SEQ ID NO：9～10所示。可通过引物检测PCR扩增产物检测出HSAL3的表达量。
第三个方面提供了抑制HSAL3的表达量的试剂在制备肝癌治疗试剂或药物中的应用。经试验证实通过抑制肝癌细胞中HSAL3的表达量可抑制肝癌细胞 HepG2、LM3的生长、增殖和迁移，以及加速肝癌细胞的凋亡。因此，抑制HSAL3 的表达量的试剂有望治疗肝癌。
优选地，所述抑制HSAL3表达量的试剂为抑制HSAL3的siRNA，所述 siRNA的核心序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示。优选地，所述siRNA 的核心序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的siRNA。通过本发明针对 HSAL3设计的siRNA能沉默HSAL3的表达，从而降低HSAL3的表达量。进一步地，为了增加其稳定性，在SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示的siRNA 加了TT。
第四个方面提供了一种用于治疗肝癌的药物，所述药物包含抑制肝癌细胞中HSAL3表达量的活性成分。由于抑制HSAL3的表达能够抑制肝癌细胞 HepG2、LM3的生长、增殖和迁移，以及加速肝癌细胞的凋亡，因此，能够成功抑制HSAL3表达的活性成分有望成为治疗癌症的新药物。
优选地，所述活性成分为抑制HSAL3表达的siRNA，所述siRNA的序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。本发明针对HSAL3设计的siRNA能成功抑制HSAL3的表达，因此，这些siRNA 可作为治疗肝癌药物的活性成分。
优选地，所述药物为纳米颗粒，所述纳米颗粒包含序列如SEQ ID NO：4 或SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的siRNA。使用纳米颗粒包裹所述siRNA，可以有效地进入肿瘤部分，进而发挥对肿瘤发挥作用。
优选地，所述纳米颗粒为脂质纳米颗粒(货号：RNA-1002，广州科蓝生物科技有限公司)。脂质纳米颗粒(LNP)模拟细胞膜形成细胞，直径不到100纳米，LNP和肝细胞表面受体结合后被内吞释放siRNA，起到靶向肝细胞HSAL3 的目的。
本发明的有益效果为：本发明首次发现了一个超级增强子相关的长链非编码RNA基因，HSAL3，并通过实验证明该基因在肝细胞癌中与肝细胞癌的恶性程度有关，该基因具有肝细胞癌基因治疗的用途。本发明还提供了该基因的 siRNA靶序列，具有抑制该基因表达的能力，具有肝细胞癌的基因治疗的用途。此外，使用脂质纳米材料包裹所述siRNA可作为治疗肝细胞癌的一种新的治疗药物。
附图说明
图1为鉴定HSAL3作为一个新的超级增强子的驱动lncRNA示意图；图1A： HepG2细胞中HCFC1、HSF1、pol2、组蛋白H3K4me1、H3K4me3及H3K27ac 的ChIP-seq图谱。将超增强子区域从左往右三个峰分别划分成三个组成性增强子(E1-E3)，分别将其克隆到荧光素酶报告载体pGL3-promoter上。图1B： ChIA-PET数据显示了在HepG2细胞中HSAL3启动子与超级增强子之间的空间相互作用。图1A和图1B是根据来自Encode项目(https://www.encodeproject.org/) HepG2细胞的ChIP-seq和ChIA-PET数据重新分析的结果。图1C：双荧光素酶报告基因试验检测HepG2中的这三个增强子元件的荧光素酶活性。图1D：双荧光素酶报告基因试验检测LM3中的这三个增强子元件的荧光素酶活性。
图2为检测siRNA干扰HSAL3后的干扰效果示意图。图2A：qRT-PCR检测HepG2细胞中siHSAL3的干扰效果。图2B：qRT-PCR检测LM3细胞中 siHSAL3的干扰效果。
图3为HSAL3干扰后抑制HCC细胞的生长和转移示意图。图3A：CCK8 实验检测HSAL3干扰后对HepG2细胞生长的影响。图3 B：CCK8实验检测HSAL3 干扰后对LM3细胞生长的影响。图3C：EdU试验检测HSAL3干扰后对HepG2 细胞增殖的影响。图3D：EdU试验检测HSAL3干扰后对LM3细胞增殖的影响。图3E：Transwell实验检测HSAL3干扰后对HepG2和LM3细胞迁移的影响。
图4为HSAL3干扰后促进HCC细胞的细胞凋亡。图4A：Annexin V凋亡检测试剂盒测定HSAL3干扰后对HepG2细胞凋亡的影响的流式结果图。图4B： Annexin V凋亡检测试剂盒测定HSAL3干扰后对LM3细胞凋亡的影响的流式结果图。图4C：Annexin V凋亡检测试剂盒测定HSAL3干扰后对HepG2细胞凋亡的影响的统计图。图4D：Annexin V凋亡检测试剂盒测定HSAL3干扰后对 LM3细胞凋亡的影响的统计图。
图5为siHSAL3负载的纳米颗粒的合成与表征。图5A：空纳米颗粒NPs 的直径。图5B：纳米颗粒NPs_siNC的直径。图5C：纳米颗粒NPs_siHSAL3#2 的直径。图5D：纳米颗粒NPs_siHSAL3#3的直径。图5E：空纳米颗粒NPs的 Zeta电位。图5F：纳米颗粒NPs_siNC的Zeta电位。图5G：纳米颗粒 NPs_siHSAL3#2的Zeta电位。图5H：纳米颗粒NPs_siHSAL3#3的Zeta电位。图5I：qRT-PCR检测HepG2细胞中纳米介导的HSAL3干扰(NPs_siHSAL3) 的干扰效果。图5J：qRT-PCR检测LM3细胞中纳米介导的HSAL3干扰(NPs_siHSAL3)的干扰效果。图5K：HepG2细胞中NPs_siNC和NPs_siHSAL3 的IC50曲线。图5L：LM3细胞中NPs_siNC和NPs_siHSAL3的IC50曲线。
图6为纳米颗粒介导的siHSAL3减少体外HCC细胞的生长。图6A：CCK8 实验检测NPs_siHSAL3对HepG2细胞生长的影响。图6B：CCK8实验检测 NPs_siHSAL3对LM3细胞生长的影响。图6C：细胞计数法检测NPs_siHSAL3 对HepG2细胞增殖的影响。图6D：细胞计数法检测NPs_siHSAL3对LM3细胞生长的影响。图6E：EdU试验检测NPs_siHSAL3对HepG2细胞增殖的影响。图6F：EdU试验检测NPs_siHSAL3对LM3细胞生长的影响。
图7为纳米颗粒介导的siHSAL3减少体内HCC细胞移植瘤的生长。图7A：荷瘤LM3裸鼠中肿瘤接种和静脉内注射的给药说明图。图7B：NPs_siHSAL3 治疗HCC细胞移植瘤的肿瘤拍照。PBS和空纳米颗粒NPs作为介质对照， NPs_siNC作为阴性对照，化疗药物奥沙利铂作为阳性对照。图7C：NPs_siHSAL3 治疗HCC细胞移植瘤的肿瘤生长曲线。PBS和空纳米颗粒NPs作为介质对照， NPs_siNC作为阴性对照，奥沙利铂作为阳性对照。图7D：NPs_siHSAL3治疗 HCC细胞移植瘤的肿瘤重量。PBS和空纳米颗粒NPs作为介质对照，NPs_siNC 作为阴性对照，奥沙利铂作为阳性对照。图7E：NPs_siHSAL3治疗HCC细胞移植瘤对小鼠体重的影响。PBS和空纳米颗粒NPs作为介质对照，NPs_siNC作为阴性对照，奥沙利铂作为阳性对照。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1：超级增强子驱动lncRNA HSAL3的表达
(1)ChIP-seq鉴定HSAL3附近存在超级增强子
使用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation sequencing， ChIP-seq)检测超级增强子的组蛋白标记物H3K4me1、H3K27ac；启动子标记物H3K4me3及转录相关因子RNA聚合酶RNA(RNA polymerase II，Pol II/pol2)，发现肝细胞癌特异性超级增强子相关促癌性lncRNA(HCC-specific SE-associated oncogenic lncRNA 3，HSAL3)存在一个超级增强子(图1A)。且该超级增强子可能受到转录因子HCFC1和HSF1的调控。
(2)ChIA-PET发现HSAL3的超级增强子与其启动子之间相互作用
挖掘encode数据库中HepG2细胞的ChIA-PET发现HSAL3的超级增强子与其启动子之间存在直接的相互作用(图1B)。
(3)双荧光素酶报告基因试验鉴定HSAL3的活性
将超增强子区域从左往右的三个峰依次划分成三个组成性增强子(E1-E3)，分别将其克隆到荧光素酶报告载体pGL3-promoter上。双荧光素酶报告基因试验分别检测HepG2和HCC-LM3(LM3)中的这三个增强子元件的荧光素酶活性 (图1C，D)。结果显示，E2的活性最强。
实施例2：HSAL3的RNA干扰靶点序列设计
使用UCSC比对出HSAL3的全长(序列表中SEQ ID NO.1)及其对应的 DNA序列全长(序列表中SEQ ID NO.2)，应用RNAi设计软件，寻找该HSAL3 的最佳的靶点，得到3个最佳干扰靶点序列(序列表中SEQ ID NO.3、4和5)，实际合成siRNA序列时，为了增加其稳定性，在干扰靶点序列后边加了TT(序列表中SEQ ID NO.6、7和8)见表1：
表1
HSAL3的siRNA靶序列 SEQ ID NO： SEQ ID NO：
siRNA#1 3 加TT后6
siRNA#2 4 加TT后7
siRNA#3 5 加TT后8
按照以上靶点合成siRNA，使用转染试剂转染至肝细胞癌细胞系HepG2和 LM3细胞。设计HSAL3的引物(表2)，qPCR筛选有效的干扰靶点，最后确认siRNA#2和siRNA#3均为有效干扰位点(图2A，B)。
表2
HSAL3的引物名称 SEQ ID NO：
正向引物 9
反向引物 10
实施例3：抑制HSAL3表达后对肝细胞癌细胞的影响
将合成的HSAL3的siRNA转染至生长状态良好的肝细胞癌细胞HepG2和 LM3。将HepG2和LM3细胞分别接种于6孔板中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中，24小时内培养细胞生长至30％融合度即可开始转染。
a.CCK-8实验检测HSAL3对肝细胞癌细胞生长的影响
取转染有siHSAL3#2、siHSAL3#3及其阴性对照siNC的肝细胞癌HepG2 和LM3细胞分别种入96孔板中，使用含有1％血清的完全培养基培养。每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育2h后测定450nm处的各孔吸光度，分别检测第1、 3、5天，并进行统计。
CCK-8实验分析发现可通过抑制HSAL3的表达降低肝细胞癌细胞HepG2 和LM3的生长速度(图3A、B)。
b.EdU实验检测HSAL3对肝细胞癌细胞增殖的影响
取转染有siHSAL3#2、siHSAL3#3及其阴性对照siNC的肝细胞癌HepG2 和LM3细胞分别种入共聚焦皿中，培养48小时以内，加入含千分之一EdU的完全培养基，37℃孵育两小时，然后使用EdU试剂盒分别对EdU阳性细胞和细胞核进行染色，共聚焦荧光显微镜进行随机拍照。
通过EdU实验分析发现抑制HSAL3的表达显著减低肝细胞癌细胞HepG2 和LM3的增殖细胞比例，表明抑制HSAL3的表达能抑制肝癌细胞增殖(图3C、 D)。
c.Transwell实验检测HSAL3对肝细胞癌细胞迁移的影响
1)细胞迁移实验：取转染有siHSAL3#2、siHSAL3#3及其阴性对照siNC 的肝细胞癌HepG2细胞和LM3细胞分别悬浮于无血清培养基中，加至Transwell 小室中，下室24孔板每孔加入500μL的20％血清的完全培养基，连续培养 24小时后染色观察细胞穿过Transwell小室的情况，随机多个视野下计数统计。
Transwell实验明确显示抑制HSAL3的表达后肝细胞癌细胞的转移能力明显降低(图3E)。
d.细胞凋亡实验检测HSAL3抑制后对肝细胞癌细胞凋亡的影响
转染siHSAL3#2、siHSAL3#3及其阴性对照siNC至6孔板中的肝细胞癌 HepG2和LM3细胞24小时内，加入肝癌的化疗药奥沙利铂诱导凋亡，48小时后使用Annexin V凋亡试剂盒进行细胞凋亡检测。取分别培养上清、洗细胞的 PBS及胰酶消化下来的细胞一起离心，PBS洗一遍，1×binding buffer充分重悬成单个细胞，分别加入Annexin V-FITC避光孵育15分钟，再加入PI染料，流式细胞术检测活细胞、早期凋亡、晚期凋亡及坏死细胞比例。此实验按照惯例把早期凋亡与晚期凋亡的比例之和视为细胞凋亡比例。
细胞凋亡实验分析发现抑制HSAL3的表达后肝细胞癌细胞的细胞凋亡比例明显升高(图4A-D)。
本实施例实验数据显示，抑制HSAL3的表达后能够抑制肝癌细胞的生长、增殖和迁移，促进肝癌细胞的凋亡。表明HSAL3可以作为肝细胞癌的基因治疗靶点。
实施例4：HSAL3干扰的纳米颗粒的特征及干扰效果
上一实施例中显示HSAL3的siRNA能显著抑制HSAL3的表达，且其表达抑制后能够显著抑制肿瘤的恶性表型。然而，siRNA不能直接靶向肿瘤。因此，我们进一步使用脂质纳米颗粒包裹HSAL3的siRNA(NPs_siHSAL3)，这样可以有效地进入肿瘤部分，进而发挥对肿瘤发挥作用。
为了让结果更加可信，我们同时还设计了多种对照组，包含空纳米组(NPs) 和纳米颗粒包裹的阴性对照组(NPs_siNC)；在后续的体内体外实验还设计了介质对照(Vehicle)。首先，我们检测了这些纳米颗粒的大小和Zeta电位，结果显示全部为单峰，表明纳米颗粒制备成功(图5A-H)。
将生长状态良好的肝细胞癌细胞HepG2和LM3接种于6孔板中，置于37℃， 5％CO2细胞培养箱中。分别加入介质(Vehicle)、空纳米颗粒(nanoparticles， NPs)、阴性对照的纳米颗粒(NPs_siNC)、HSAL3干扰的纳米颗粒 (NPs_siHSAL3#2和NPs_siHSAL3#3)，48小时后，提取RNA并逆转录成cDNA， qPCR检测HSAL3干扰的纳米颗粒(NPs_siHSAL3#2和NPs_siHSAL3#3)对 HSAL3表达的影响，发现NPs_siHSAL3#2和NPs_siHSAL3#3均能有效干扰HSAL3的表达，但NPs_siHSAL3#3的效果更佳(图5I、J)。
NPs_siHSAL3#3的干扰效果更佳，因此更有成为治疗肝细胞癌的药物。故我们进一步把HSAL3干扰的纳米颗粒(NPs_siHSAL3#3)进行药物的IC50实验。结果显示NPs_siHSAL3的IC50(HepG2为501.5nM和LM3细胞为506.1nM) 远大于其有效抑制浓度(HepG2和LM3细胞均为150nM；图5K、L)。
实施例5：HSAL3干扰的纳米颗粒对肝细胞癌细胞的影响
a.CCK-8实验检测HSAL3干扰的纳米颗粒对肝细胞癌细胞生长的影响
以下HSAL3干扰的纳米颗粒对肝细胞癌细胞的影响实验同实施例3中所列实验a，CCK-8实验证明HSAL3干扰的纳米颗粒抑制肝细胞癌的增殖能力。结果显示纳米材料抑制HSAL3表达后CCK-8实验显示细胞生长减慢(图6A、B)。
b.细胞计数法检测HSAL3干扰的纳米颗粒对肝细胞癌细胞生长的影响
将生长状态良好的肝细胞癌细胞HepG2和LM3接种于6孔板中，置于37℃， 5％CO2细胞培养箱中。待细胞长至一定的融合度，分别加入介质(Vehicle)、空纳米颗粒(nanoparticles，NPs)、阴性对照的纳米颗粒(NPs_siNC)、HSAL3 干扰的纳米颗粒(NPs_siHSAL3)，48小时后，使用胰酶将每组的细胞消化下来，并使用countstar进行计数和统计分析。
通过细胞计数法发现HSAL3干扰的纳米颗粒显著减少肝细胞癌细胞HepG2 和LM3的细胞数量(图3C、D)。
c.EdU实验检测HSAL3干扰的纳米颗粒对肝细胞癌细胞增殖的影响
以下HSAL3干扰的纳米颗粒对肝细胞癌细胞的影响实验同实施例3中所列实验b，EdU实验证明HSAL3干扰的纳米颗粒抑制肝细胞癌的增殖能力。结果显示纳米材料抑制HSAL3表达后，EdU实验显示细胞增殖细胞比例降低(图 6E、F)。
在该实施例中，纳米材料抑制HSAL3表达后，利用CCK-8实验、细胞计数法及EdU实验研究抑制HSAL3表达的纳米材料对肝细胞癌细胞增殖的影响，进而探讨以lncRNA为突破口、以纳米材料为工具进行基因治疗的可行性。数据显示，使用纳米材料包裹HSAL3的siRNA能够抑制肝细胞癌细胞的肿瘤恶性程度，有作为临床治疗的应用前景。
实施例6：动物实验进一步研究HSAL3干扰的纳米颗粒对肝细胞癌细胞成瘤能力的影响
将30只3周龄的雄性BALB/c Nude小鼠分别通过皮下注射100μL含2× 106个肝细胞癌细胞LM3的细胞悬液溶液种植至小鼠皮下。每天观察裸鼠，每三天测量肿瘤大小。待肿瘤长至50-100mm3，随机平均分为5组，分别为介质组(Vehicle)、空纳米组(nanoparticles，NPs)、包裹阴性对照的纳米颗粒组 (NPs_siNC)、HSAL3干扰的纳米颗粒组(NPs_siHSAL3)以及阳性对照组(用于治疗肝癌的化疗药奥沙利铂作为阳性对照)。继续每天观察裸鼠，每三天测量肿瘤大小。按照上述分组每三天静脉注射一次，共注射5次后(给药方案具体见示意图7A)，观察组织结构变化及成瘤情况，通过动物实验进一步研究以 lncRNA HSAL3作为基因治疗靶点的可行性。
结果如示，与阴性对照组(NPs_siNC)相比，HSAL3干扰的纳米颗粒 (NPs_siHSAL3)组肿瘤生长速度明显减慢，尺寸明显减小(图7B-D)。与预期相一致的是，阳性对照组奥沙利铂也能显著减慢肿瘤的生长速度并抑制肿瘤大小。值得注意的是，与阳性对照奥沙利铂治疗组相比，HSAL3干扰的纳米颗粒组(NPs_siHSAL3)组在抑制生长速度和大小上并无显著差异(图7B-D)。而奥沙利铂目前是治疗肝癌的上市化疗药，这些实验充分显示我们的HSAL3干扰的纳米颗粒(NPs_siHSAL3)可以有潜力作为肝细胞癌的基因治疗的有效方法。此外，与阴性对照(NPs_siNC)比，HSAL3干扰的纳米颗粒组(NPs_siHSAL3) 也无显著差异；同时，与阳性对照奥沙利铂治疗组比，HSAL3干扰的纳米颗粒组(NPs_siHSAL3)的体重也无显著差异(图7E)。这些结果表明HSAL3干扰的纳米颗粒(NPs_siHSAL3)对小鼠无明显毒性。以上结果进一步表明HSAL3 干扰的纳米颗粒(NPs_siHSAL3)作为肝细胞癌有效且安全的基因治疗方法。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学孙逸仙纪念医院
<120> 一种超级增强子相关的长链非编码RNA 及其在治疗肝癌中的用途
<130> 5.25
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2686
<212> RNA
<213> human
<400> 1
uuccugcucu caccaugagu uuacuugggg aagguugggg gacagacagu agacaggucu 60
cuuuguaaac aaaugguucc aaaagguuga ggggcuaaga gugaccaagu uagcugagug 120
uaggaaggua ggcuucaggc uagguagaga gggaaagguu ccaccuccaa ggacaggcug 180
ucugauccau ccuucuuccu ccucccucuc uuuagaccuc uggugccccg gggagccccc 240
aaacaccccc ugagcgucau gacucuggug guucccugcc ccugacaccg cggauggaga 300
gccacucaga ggaugaagau cuugcugggg cugucggugg ccugggcugg aacaguagga 360
guccccggac ccagagccca gggggcugcu cagcggaggc ugugcuggcc cggaagaaac 420
accgucggcg gccaucgaag cgcaaaaggc acuggcgacc cuaccuggag cugagcuggg 480
cugagaaaca acagcgggau gagaggcaga gccagagggc cucccggguc cgcgaagaga 540
uguucgccaa aggccagccc guggcccccu acaacaccac ccaguuccug augaaugaca 600
gggacccgga ggagcccaac uuggaugugc cccaugggau cucccaccca gguuccagug 660
gggagaguga ggccggggac agugaugggc ggggccgagc gcacggugag uuccagcgga 720
aggacuucuc ugagacuuac gaacgcuucc acaccgagag ccugcagggc cgcagcaagc 780
aggagcuggu gcgagacuac cuggagcugg agaagcggcu gucgcaggcg gaggaggaga 840
cuaggaggcu gcagcagcug caggcgugca ccggccagca guccugccgc cagguggagg 900
agcuggcugc cgagguccag aggcuccgga ccgaaaacca gcggcuucgu caggagaacc 960
agauguggaa ccgagagggc ugccgcugug augaggagcc ggguaccuag gggugccucc 1020
cagccuggug gacccaagga gaagguccca uuucgugcac acucaggcca gcugggucuc 1080
aaggaggcag guggcagaug aaaaccaccg ucaacacccu gugcgcccug agaacagcua 1140
aaucgguuca gacucccacc ucaccguuuc cauaguuggc ucuuuugugu caucuuaccc 1200
uuuacagaga aauuaaaugg ccuugguggg accaaauggg aguaucuagg auugauuuca 1260
cuagggcugu ugugagaacc aaaacauuug ccccagagag gucugagugg ggucccaguc 1320
ccugcugccc caagccuggc aggacagcag accucuggau ggggaccucc caaggucucc 1380
gggauaccug aauccugcuc uguggguguu ggagcaauca gacugcacag aagguuuucu 1440
aggugggagg gaguucaguc aggagccccc aguuucggcc agaaacugac gcucaagaua 1500
ccagaucgcu gugaggaguu gugagcuuuc ccuggaggag agaacggggg uuuucggaga 1560
agacccaggc ccagggguuc cuucagaguu ugcuccugag cucccuguau ucuccccaca 1620
guuuaaaggc uggacuagac ggguucuggg ugccuugugc cuccuuguuc uugacagccc 1680
ccaacccuga ccccucucug caggggguug ggccugaggu uagucaucau guguuugugu 1740
uugucccuua ccucccaagg guaauaaggg aggcgcucuc cugauggaaa auaaagucaa 1800
gagacagagg gggacagcac auggaucgcc agcagagcag agcagccugg cucuccuggu 1860
gccugccaug ugucugugcg uccugcuccu cucagccuca ucaugugggu gugaauucuc 1920
ugaagugugu gaggcccucg ccugucugca ucagagagag cugggucagc cuggguaacg 1980
cagauaccac cagccagcgu caggcucuga gacaagcuca cccacccccu cgcacucaga 2040
cccacccuuc cccagacacc cugucucuuc cauccccucc uggugcccuu gcagacuggu 2100
guuggguguc aggcagcaau gaacauggac aacuaauggu ggcggaggaa auuagucaac 2160
ucaccaguga gccagugcug gcugugccac caggcaaggg gaggggcaga ggccuggcug 2220
cccagucugg cuucucuucc aggccgucau cuugacaggc cacacugggc aagaugaggc 2280
uuggcccagg agcugcuggg gauggaaaug uugaugaaau cuuguguguu gccaggacaa 2340
cuuucauuuc uauccugcca cacccaggcc uggccagagc cuccuacaau gaaacacaga 2400
acagauucua ggaacgcaug gguuucaaga gaaagcaaaa ucucauccug ggagaccugc 2460
cccuggaacc cuggguccuc agacagcuca gucaggaagg gcagcaggaa ugaucaucgc 2520
cacuuugcag acgggaaacc ggaggcuuag cgaggaagug gcuuuuugga uuccaggaga 2580
gccucuggag gccugccugc cccugugggg ugcugugggg ugcuagccug ggacccagag 2640
gccccuuggc auuugcuggc agccucccag cugcauuccu cagcau 2686
<210> 2
<211> 2686
<212> DNA
<213> human
<400> 2
ttcctgctct caccatgagt ttacttgggg aaggttgggg gacagacagt agacaggtct 60
ctttgtaaac aaatggttcc aaaaggttga ggggctaaga gtgaccaagt tagctgagtg 120
taggaaggta ggcttcaggc taggtagaga gggaaaggtt ccacctccaa ggacaggctg 180
tctgatccat ccttcttcct cctccctctc tttagacctc tggtgccccg gggagccccc 240
aaacaccccc tgagcgtcat gactctggtg gttccctgcc cctgacaccg cggatggaga 300
gccactcaga ggatgaagat cttgctgggg ctgtcggtgg cctgggctgg aacagtagga 360
gtccccggac ccagagccca gggggctgct cagcggaggc tgtgctggcc cggaagaaac 420
accgtcggcg gccatcgaag cgcaaaaggc actggcgacc ctacctggag ctgagctggg 480
ctgagaaaca acagcgggat gagaggcaga gccagagggc ctcccgggtc cgcgaagaga 540
tgttcgccaa aggccagccc gtggccccct acaacaccac ccagttcctg atgaatgaca 600
gggacccgga ggagcccaac ttggatgtgc cccatgggat ctcccaccca ggttccagtg 660
gggagagtga ggccggggac agtgatgggc ggggccgagc gcacggtgag ttccagcgga 720
aggacttctc tgagacttac gaacgcttcc acaccgagag cctgcagggc cgcagcaagc 780
aggagctggt gcgagactac ctggagctgg agaagcggct gtcgcaggcg gaggaggaga 840
ctaggaggct gcagcagctg caggcgtgca ccggccagca gtcctgccgc caggtggagg 900
agctggctgc cgaggtccag aggctccgga ccgaaaacca gcggcttcgt caggagaacc 960
agatgtggaa ccgagagggc tgccgctgtg atgaggagcc gggtacctag gggtgcctcc 1020
cagcctggtg gacccaagga gaaggtccca tttcgtgcac actcaggcca gctgggtctc 1080
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aatcggttca gactcccacc tcaccgtttc catagttggc tcttttgtgt catcttaccc 1200
tttacagaga aattaaatgg ccttggtggg accaaatggg agtatctagg attgatttca 1260
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cctgctgccc caagcctggc aggacagcag acctctggat ggggacctcc caaggtctcc 1380
gggatacctg aatcctgctc tgtgggtgtt ggagcaatca gactgcacag aaggttttct 1440
aggtgggagg gagttcagtc aggagccccc agtttcggcc agaaactgac gctcaagata 1500
ccagatcgct gtgaggagtt gtgagctttc cctggaggag agaacggggg ttttcggaga 1560
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gtttaaaggc tggactagac gggttctggg tgccttgtgc ctccttgttc ttgacagccc 1680
ccaaccctga cccctctctg cagggggttg ggcctgaggt tagtcatcat gtgtttgtgt 1740
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cccacccttc cccagacacc ctgtctcttc catcccctcc tggtgccctt gcagactggt 2100
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tcaccagtga gccagtgctg gctgtgccac caggcaaggg gaggggcaga ggcctggctg 2220
cccagtctgg cttctcttcc aggccgtcat cttgacaggc cacactgggc aagatgaggc 2280
ttggcccagg agctgctggg gatggaaatg ttgatgaaat cttgtgtgtt gccaggacaa 2340
ctttcatttc tatcctgcca cacccaggcc tggccagagc ctcctacaat gaaacacaga 2400
acagattcta ggaacgcatg ggtttcaaga gaaagcaaaa tctcatcctg ggagacctgc 2460
ccctggaacc ctgggtcctc agacagctca gtcaggaagg gcagcaggaa tgatcatcgc 2520
cactttgcag acgggaaacc ggaggcttag cgaggaagtg gctttttgga ttccaggaga 2580
gcctctggag gcctgcctgc ccctgtgggg tgctgtgggg tgctagcctg ggacccagag 2640
gccccttggc atttgctggc agcctcccag ctgcattcct cagcat 2686
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 合成
<400> 3
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<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 合成
<400> 4
ccucacagcg aucugguau 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 合成
<400> 5
gcagucugau ugcuccaac 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成
<400> 6
gccucaucuu gcccagugut t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成
<400> 7
ccucacagcg aucugguaut t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成
<400> 8
gcagucugau ugcuccaact t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成
<400> 9
tgtcctggca acacacaaga t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成
<400> 10
cgctcaagat accagatcgc t 21

Claims (10)

1.一种长链非编码RNAs，其特征在于，所述长链非编码RNAs为HSAL3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其DNA全长序列如SEQ ID NO:2所示。
2.检测如权利要求1所述的长链非编码RNAs表达量的试剂在制备肝癌诊断试剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测HSAL3表达量的试剂包括扩增引物，所述引物序列如SEQ ID NO：9~10所示。
4.抑制如权利要求1所述的长链非编码RNAs表达量的试剂在制备肝癌治疗试剂或药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制HSAL3表达量的试剂为抑制HSAL3的siRNA，所述siRNA的核心序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示 。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制HSAL3表达量的试剂为抑制HSAL3的siRNA，所述siRNA的核心序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。
7.一种用于治疗肝癌的药物，其特征在于，所述药物包含抑制肝癌细胞中HSAL3表达量的活性成分；所述HSAL3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其DNA全长序列如SEQ ID NO:2所示。
8.如权利要求7所述的药物，其特征在于，所述活性成分为抑制HSAL3表达的siRNA，所述siRNA的序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物为纳米颗粒，所述纳米颗粒包含序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的siRNA。
10.如权利要求9所述的药物，其特征在于，所述纳米颗粒为脂质纳米颗粒。
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Long noncoding RNA UPK1A-AS1 indicates poor prognosis of hepatocellular carcinoma and promotes cell proliferation through interaction with EZH2;Dong-Yan Zhang等;《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》;20201029;第1-18页 *

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